TWI288778B - Process for producing dust mite allergen - Google Patents

Description

1288778 玖、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明主要係關於製造塵蟎過敏原之方法。 【先前技術】 過敏意指對正常無害之物質，發展出有害免疫調解反應 的後天可能性。過敏反應會引起之症狀如癢、咳嗷、哮喘、 打喷嚏、淚眼、發炎和疲勞。許多過敏疾病是藉著對引起 該疾病之抗原的敏化作用而發展出數種症狀。過敏性疾病 中，在血漿和組織中會產生對過敏原（例如花粉和塵蟎）專一 的IgE抗體’而當抗體再度與抗原接觸時，每個組織中的抗 體便與抗原產生反應。一般咸信過敏反應包括早期專一的 免疫反應，以及晚期的炎症反應。已有報告指出過敏原藉 著刺激高親和力免疫球蛋白（IgE)受體而調解過敏的早期階 段。當被過敏原刺激時，肥大細胞和嗜驗細胞將釋放出組 織胺和細胞素。然後，從肥大細胞和嗜鹼細胞中釋放出的 細胞素，藉著招募炎症細胞而調解過敏的晚期階段。 已有報告指出過敏性疾病，如支氣管氣喘、兒童氣喘、 異位性皮膚炎及其類似者，主要是由來自生活在室内灰塵 中的蟎類所引起。已經確認出數種蟎類過敏原的蛋白質， 如Der p 1、Der p 2和Der p 5。雖然僅有60%蜗過敏兒童對 Der p 5起反應，但在台灣，其IgE反應性似乎比對〇^ p i 和Dei* p 2的更強。此外，在許多過敏性疾病中，患有氣喘 的兒童群比僅患有鼻炎之群具有明顯更多的反應性。因 此，Der p 5在蟎過敏中係為臨床上重要的過敏原。

O:\89\89276.DOC 1288778 目前已發展出各種治療和預防過敏的方法。供給蛋白質 抗原以便向下調節全身性免疫反應，是公認之誘導耐受性 方法（Weiner HL. 口服耐受性：自體免疫疾病之免疫機制和 >台療。(Oral tolerance: immune mechanisms and treatment of autoimmune disease·) Immunol Today 1997; 18:335-42)，其具有 調節自體免疫、炎症和過敏性病症的能力。僅管在經口服 耐受性誘導的腸道中可發現大量之免疫抑制性細胞素，如 轉化生長因子β、介白素-10，但其實際發生的機制目前仍 無定論（Friedman Α，Weiner HL.藉著抗原劑量判定在口服 耐受性之後的無反應性誘導和主動壓抑。（Induction of anergy or active suppression following oral tolerance is determined by antigen dosage.) Proc Natl Acad Sci USA 1994; 91:6688-92)。對罹患過敏性鼻炎和氣喘患者而言，皮下或皮 内注射吸入性過敏原萃取物以激起局部或全身性反應為一 種有效的免疫療法，但其偶爾會產生過敏性休克，甚至有 時引起死亡（Passalacqua G，Albano M，Fregonese L，Riccio A，Pronato C，Canonica GW·在虫高-引起之鼻結膜炎中，局部 類過敏原（allergoid)免疫療法對過敏性炎症的隨機控制試 驗 。 (Randomised controlled trial of local allergoid immunotherapy on allergic inflammation in mite-induced rhino conjunctivitis·) Lancet 1998; 351:629_32)0 口月艮或舌下 免疫療法已被證實是較有效安全的，舌下吞嚥路徑亦已被 報導可使用較高的劑量，並引起部分的「口服耐受性」機 制（Marth T，Strober W，Kelsall BL·在卵清蛋白 TCR-基因轉

O:\89\89276.DOC 1288778 殖老鼠中的高劑量口服耐受性。（High dose oral tolerance in ovalbumin TCR-transgenic mice.) J Immunol 1996; 157:2348-57; Gutgemann I, Fatrer AM, Altman JD, Davis MM，Chien YH.藉著口服投與抗原之全身提供，誘導快速T 細胞激活和耐受性。（Induction of rapid T cell activation and tolerance by systemic presentation of an orally administered antigen.) Immunity 1998; 8:667-73) o 然而，口服投與抗原以誘導血清或黏膜抗體產生反應仍 有下述問題，由於可確實吸收並能夠誘發免疫反應的抗原 量通常很低，通常這類口服投藥需要相對上較大量的抗 原。故口服投藥所需的抗原量通常遠超過經腸投藥所需的 量。此外，過敏原的純化困難且昂貴，使其應用受到限制。 最近，由 Mason 等人，1992 (Mason，H·，D· Lam和 C. Arntzen· 1992.B型肝炎表面抗原在基因轉殖之植物中的表現。 (Expression of hepatitis B surface antigen in transgenic plants.) PNAS. 89:11745-11749)揭示藉著基因轉殖植物以產生過敏 原。在植物中表現異源蛋白質有兩種類型，其為··（1)在基 因轉殖植物中表現異源蛋白質，該植物可穩定地產生並累 積蛋白質；以及（2)在藉著病毒轉移感染的植物中表現異源 蛋白質，該病毒在植物中複製、繁殖、散播並產生所欲之 蛋白質。使用植物來產製過敏原，在成本、安全性和利用 性上有許多優點，並可廣泛地應用在口服疫苗上。此外， 在可食用之基因轉殖楂物中產生的口服疫苗，具有低成本 和高安全性之優點，並可以便宜簡單的方式達成遞送、儲

O:\89\89276.DOC 1288778 存和投藥。更重要的，可將可食用疫苗的銷售價格降低至 在低開發國家中亦可輕易地購買之程度。 目前已進行研究製造表現細菌和病毒抗原之基因轉殖植 物（Carrillo，C·，A. Wigdorovitz，J.C. Oliveros，P.I.

Zamorano, A.M. Sadir, N. Gomez； J. Salinas, J.M. Escribano, 和M.V. Borca. 1998.利用在基因轉殖之植物中表現的VP1， 對口蹄疫病毒的保護性免疫反應。（Protective immune respones to foot-and-mouth disease virus with VP 1 expressed in transgenic plants.) J. Virol· 72:1688-1690，以 及 Gilleland Jr，Η·Ε·，L.B. Gilleland，J. Staczek，R.N. Harty， A. Garcia-Sastre, P. Palese, F.R. Brennan, W.D.O. Hamilton, M. Bendahmane，和R.N. Beachy· 2000·喪合型動物和植物 病毒，表現外膜蛋白質F之抗原決定位，作為對抗綠膿桿菌 肺感染的混合疫苗。（Chimeric animal and plant viruses expressing epitopes of outer membrane protein F as combined vaccine against Pseudomonas aeruginosa lung infection.) FEMS Immunology and Medical Microbiology. 27:291-297)。然而，直到本發明人的研究為止，尚未在植 物中表現塵蟎抗原，如Der p 5和Der p 2。特定而言，直到 本發明人的研究為止，並沒有獲得這類的口服疫苗，可如 已經獲得的黏膜免疫原一樣，誘發免疫反應。 【發明内容】 本發明使用基因轉殖植物以產生塵蟎過敏原。根據本發 明之塵蟎過敏原較佳可成為抗原組合物。 O:\89\89276.DOC -9- 1288778 本發明之一目的在於提供一種製造塵蟎過敏原之方法， 匕括下列步驟： (a) 建構一載體，該載體包含編碼塵蟎過敏原之1)]^八序 列，該DNA序列係操作性連接至一植物專一性之啟 動子； (b) 以步驟（a)之載體轉型一植物細胞或組織；以及 (c) 從步驟（b)的植物細胞或組織中獲得塵蟎過敏原。 在另一方面，本發明提供一種製造包括塵蟎過敏原之抗 原組合物的方法，其中該塵蟎過敏原係由包括下列步驟之 方法所製備： (a) 建構一載體，該載體包含編碼塵蜗過敏原之DNA序 列，該DNA序列係操作性連接至一楂物專一性之啟 動子； (b) 以步驟（a)之載體轉型一植物細胞或組織；以及 (0從步驟（b)的植物細胞或組織中獲得塵蟎過敏原。 本發明之另一個目的在於提供一抗原組合物，其包括未 經純化或經部分純化之重組塵蟎過敏原，其在植物中之表 現量係以足以誘導免疫反應。 【實施方式】 本發明提供一種製造塵蜗過敏原之方法，包括下列步驟： (a) 建構一載體，該載體包含編碼塵蜗過敏原之dna序 列，該DNA序列係操作性連接至一楂物專一性之啟 動子； (b) 以步驟（a)之載體轉型一植物細胞或组織；以及 O:\89\89276DOC -10- 1288778 (c)從步驟（b)的楂物細胞或組織中獲得塵蟎過敏原。 本文中所使用之「過敏原」一詞，意指可誘發過敏性或 過敏反應的抗原。根據本發明，塵蟎過敏原包括但不限於 美洲室塵蜗（乃α(稱為Der f)和歐洲室 塵虫少以(稱為 Der ρ)過敏 原，或其混合物；且其中過敏原較佳係包括Derp 5和Dei* p 2過敏原。為了升高過敏原的表現量，該過敏原可進一步包 括内質網（ER)滞留信號肽，其可使重組過敏原堆積在ER上。 本文中所使用之「過敏」一詞，意指對正常無害之環境 抗原的全身性反應。其起因於在抗原和抗體或T細胞之間的 交互作用，該等抗體或T細胞係因先前暴露在相同抗原下所 產生。本文中所使用之「過敏性反應」一詞，意指對無害 之環境抗原或過敏原的反應，其歸因於預先存在的抗體或T 細胞。有過敏反應的免疫機制有多種，但最常見的一型是 過敏原與在肥大細胞上之IgE抗體的結合所引起之氣喘、乾 草熱和其他普遍的過敏反應。 根據本發明，用以轉型植物的載體包含編碼塵蟎過敏原 之DNA序列，該DNA序列係操作性連接至一植物專一性之 啟動子。 於本發明之一具體實施例中，用以轉型植物的載體係以 在植物中的傳統載體為基礎，例如一般的雙（binary)載體、 共同整合（cointegration)載體，或設計用來在植物中表現， 無T-DNA區的載體。 於本發明之另一具體實施例中，用以轉型植物的載體是 O:\89\89276.DOC -11- 1288778 l修飾的植物載體。為了此目的，本發明通常使用叙紋病 毒（p〇tyvirus)，且較佳的是矮南瓜黃化喪纹病毒（ZYMV)和 终草甘入、文病f (TMV)。^ 了轉^植物必須將過敏原基因 插入植物的基因體内。此外，過敏原基因於導人植物基因 體内之後’必須含有表現該基因所需的所有遺傳控制序 列。因此’必須建構提供調節序列的載體，使得它們在插 入想要的基因時可發揮功能。在本發明的-個具體實施例 中’調節序列包括以可操作性連接之可於植物中表現之啟 動子於轉β睪中止φ碼子的3，端加轉譯開始密碼子（ATg)和 植物功能性聚（Α)外加信號（ΑΑΤΑΑΑ)。此外，$ 了獲得較 高程度的表現，於被插人之基因提供不轉譯區5，和3,。當組 合表現載體/插入構築時，即可用以轉型植物細胞，其中該 細胞為成熟植物的部分，或具有再生成新植物的能力。這 些基因轉殖的植物，在表現載體/插人構築體中帶有病毒基 因。一旦病毒複製、繁殖和散播，便在植物中產生過敏原β 「操作性連接」-MS連接編碼特定遺傳訊息的核芬 西文區域，使侍核：y：酸區域是連續的，並保留該區域的功能 度，並相對於其他的區域執行其功能，以成為功能單位的 一部分。 在本發月令可使用已知或發現其在植物細胞中啟動外 來基因轉錄的啟動子。可從植物或病毒中獲得這類啟動 子’例如花椰菜花葉病毒（CaMV)的35S啟動子（於本文中使 用時’表現「CaMV 35S」啟動子包括CaMv 35S啟動基因 的變種，例如藉著與操縱子區域連接、隨機或經控制之突

O:\89\89276.DOC -12- 1288778 變生成作用等等衍生的啟動子）。此外，根據本發明之啟動 子可於可食用的植物部分中調節高表現。 於本發明之一較佳具體實施例中，載體包括可選擇標記 基因的基因，如抗生素抗藥性基因（例如康黴素（kanamycin) 抗藥性基因）、除草劑抗藥性基因、與代謝路徑有關之基 因、與物理特性有關之基因、編碼蟲螢光素酶之基因（如 gfp)、編碼&尿:y：酸酶（GUS)之基因等等。一旦選出宿主植 物，並已決定將基因運送至植物内的方法，即可選擇持續 表現調節或組織專一的啟動子而得以在植物的想要之部分 表現該過敏原。 較佳地，該載體是ZYMV。根據本發明，在一年的觀察 内，經20次轉移之後，表現自由形式之Derp 5的ZYMV-Der p 5仍是高度穩定的，且沒有注意到有刪除變體。因此，以 ZYMV為基礎之載體可系統性散播，並有效穩定地表現外來 蛋白質。一般認為此穩定性可能相當依賴核甞酸序列，以 及插入的長度而定（Gal-On A，Canto T，Palukaitis P.定出 表現附加組胺酸-標籤之la和2a蛋白質的經遺傳修改之小 黃瓜後紋病毒的特徵。（Characterization of genetically modified Cucumber mosaic virus expressing histidine-tagged la and 2a proteins.) Arch Virol 2000; 145(1):37-50) ° 根據本發明，所使用之植物包括任何雙子葉植物和單子 葉植物。於較佳的具體實施例中，根據本發明之部份或整 個植物為可食用的，該植物包括但不限於菸草、馬鈴薯、 義大利瓜（zucchini squash)、番茄、萵苣、白葡萄、香蕉、 O:\89\89276.DOC -13- 1288778 稻米、蘿蔔、胡蘿蔔、蘋果、大豆、玉米和漿果。更佳地， 根據本毛明之植物包括馬鈴薯的肯納貝克（Kennebec)變 種、於草（Nicotiana benthamiana)和矮南瓜（Cucurbita pepo L. var· Zucchini) 〇 用來轉型的楂物細胞或組織之選擇係依據宿主植物的性 質和轉型的方式而定。於本發明之一具體實施例中，該組 織是可再生的，其在轉型後保留再生整個具有繁殖力植物 之能力。例如，該等植物組織包括癒傷組織、懸浮培養細 胞、原生質體、葉片的碎片、莖的碎片、纓、花粉、胚芽、 胚轴、塊莖的碎片、分生區及其類似者。於本發明之另一 具體實施例中，該組織為成熟植物的一部分。較佳地，該 組織是可食用的，或具有大量地表現及/或純化根據本發明 之過敏原的能力。例如，該組織包括葉、果實、莖、塊莖， 及其類似物。 根據本發明，以載體轉型植物細胞或組織的步驟，包括 (1) 土壤桿菌調解之基因轉移；（2)直接的DNA攝入；或（3) 植物病毒感染。 在創造基因轉殖之雙子葉植物時，土壤桿菌系統是特別 可實行的。於本發明之一較佳具體實施例中，其係利用土 壤桿菌-Ti質體系統。根癌土壤桿菌（儿仏之腫瘤β 誘導（Ti)質體含有轉型之DNA(T-DNA),可將其轉移至植物 細胞，然後藉著土壤桿菌之可誘導毒力（vir)基因的幫助， 整合至植物宿主基因體内。含有過敏原基因、T-DNA區和 可選擇標§己基因的載體可在大腸桿菌中建構，並藉著接合 O:\89\89276.DOC -14- 1288778 交配轉移至土壤桿菌内，或由土壤桿菌直接攝入。熟諸此 藝者可使用許多土壤桿菌品系，如根癌土壤桿菌和發根土 壤桿菌（A. rhk〇genes)，以及質體建構，使植物的遣傳轉型 .發揮最大效用。根據本發明，熟諳此藝者可依據植物物種 和土壤桿菌遞送系、統，來選擇接種的方法；例如葉圓盤 disc)方法或在活體外轉型再生原生質體。 根據本發明，亦可應用直接物理方法，將外來DNA導入 植物細胞内。在電穿透作用中，將原生質體短暫地暴露在 強電場下；在顯微注射中，使用微量吸移管，以機械方式 將DNA直接注射到細胞内；在微顆粒撞擊中，將dna吸附 到微彈丸上，如硫酸鎂結晶或鎢顆粒。亦包括直接以 培育萌芽的花粉。 根據本發明，當使用經過修飾之植物病毒作為載體時。 可利用該病毒在創傷部位感染植物。 根據本毛明之方法，可視需要在步驟（〇)之前，進一步包 括從植物細胞或組織中再生基因轉殖植物的步驟。經過轉 型的植物細胞或組織，苒生形成基因轉殖的植物。於本文 中所使用之再生」一詞，意指從植物細胞、一群植物細 胞或植物部分中長出整個植物。植物再生的方法為熟諳此 藝者所熟知。當轉型的是器官部分時，可從植物癒傷組織、 移植物器g或部分中再生。這類的再生方法亦為熟請此 藝者已知的。 有數個彳欠植物細胞或整個植物中，獲得塵蟎過敏原之方 法。在-個具體實施例中，其係藉著獲得植物細胞或整個

O:\89\89276.DOC -15 - 1288778 植物或其部分，如果 + 賞、葉、莖和塊莖、或並萃取物，達 成獲得根據本發明之過、広 二Ί、卒取物運 , σ敏原的方法。在另一個具體實施例 中，精著進一 + , 个物中純化過敏原以提供塵蟎過敏 在另-個具體實施例令，主要藉著收穫基因轉殖植物 —部分’如果實或種子，獲得㈣過敏原。在另- 個具體實施例中，以| 土因轉殖植物本身的形式，提供塵蟎 過敏原。 本卷月的3目標是提供一種製造包括塵蟎過敏原之抗 原、、且口物的方法’其係藉著包括下列步驟的方法以製備塵 蟎過敏原： (a)建構一載體，該載體包含編碼塵蟎過敏原之序 列，該DNA序列係操作性連接至一植物專一性之啟 動子； (b) 以步驟（a)之載體轉型一植物細胞或組織；以及 (c) 從步驟（b)之植物細胞或組織中獲得塵蟎過敏原。 在本發明中亦提出一抗原組合物，其包括未經純化或經 部分純化的塵_過敏原，其在植物之表現量係足以誘導免 疫原性反應。 在動物模式中，根據本發明之抗原組合物在老鼠肺臟紐 織的組織學檢查中，對治療以塵蟎過敏原敏化之老鼠有相 當大的影響，其中塵蜗專一之IgE的含量是較低的，其顯示 過敏反應受到調節。此外，在口服投與抗原組合物之後， 亦恢復老鼠的肺臟功能。 本發明克服了在基因轉殖植物的一或多個組織（如可食

O:\89\89276.DOC -16- 1288778 用的果實、果汁、穀物、葉、塊莖、莖、種子、根或其他 植物部分）中，製造抗原組合物之先前技藝的缺點。本發明 提供製造和投與抗原組合物的廉價方法。並藉此避免純化 的費用和不利的反應。此外，從可食用之基因轉殖植物中 產生的抗原產物具有其他的優點；例如以便宜、簡單和安 全的方式，完成遞送、儲存和投藥。此外，根據本發明之 抗原組合物在抑制塵蜗專一之IgE含量上的效力，比傳統組 合物，如包括由大腸桿菌產生之塵蜗過敏原的抗原組合物 更好。 茲以下列實例予以詳細說明本發明，唯並不意味本發明 僅侷限於此等實例所揭示之内容。 實例1 :在基因轉殖植物中表現塵蟎過敏原 ZYMV-Derp 5重組植物病毒之製造：ZYMV氧後的發I， 係以先前建構的傳染性純種系，P35SZYMV2-26為基礎（Lin SS，Hou RF，Yeh SD.在活體外和在活體内建構矮南瓜黃化 後紋病毒之台灣品系的傳染性轉錄本。（Construction of in vitro and in vivo infectious transcripts of Taiwan strain of Zucchini yellow mosaic virus.) Bot Bull Acad Sin 2002; 43:261-269)，其由花椰菜花葉病毒（CaMV)35S啟動基因所 驅動，以在活體内產生傳染性轉錄本，在ZYMV的P1和 HC-Pro密碼區之間插入GFP之〇RF(Clontech)。在GFP密碼 區之N-和C-終端的兩端，藉著聚合酶連鎖反應（pCR)，利用 經過設計的引子，創造多重選殖位置丨、办办I、j、 M/w I、尺；I和心c II)。亦藉著pcr，在GFP ORF的C'終端 O:\89\89276.DOC -17- 1288778 上，創造TW-TN3(S-V-R-L-Q/S)的六組胺酸（組胺酸標籤）和 NIa蛋白酶區域。將新的病毒載體命名為 p35ZYMVGFPhis(圖1)，其具有報告者基因GFP、多重選殖 位置、組胺酸標籤和NIa蛋白酶切開區域。 使用逆轉錄酶-聚合酶連鎖反應（RT-PCR)，從蟎天然萃取 物的總RNA中，擴大Der p 5 cDNA，並分別在Der p 5〇RF 之5’-和3’-端的兩端，創造Spk I和]ζρη I位豎。以Sph I和Κρη I消化該RT-PCR產物，然後與經/z Up I消化過之 p35SZYMVGFPhis連接，產生p35ZYMVDerp5(圖 1)〇 禮##禮··測定在兩個子葉期的全身宿主植物矮南瓜， 以及具有四片完全展開葉子之奎藜

Willd)的局部病變宿主植物之感染力。使用含有重組傳染性 純種系的個別質體（1微克），藉著機械塗擦在葉子上以感染 奎藜植物（Lin SS，Hou RF，Yeh SD.在活體外和在活體内建 構矮南瓜黃化嵌紋病毒之台灣品系的傳染性轉錄本。 (Construction of in vitro and in vivo infectious transcripts of Taiwan strain of Zucchini yellow mosaic virus.) Bot Bull Acad Sin 2002; 43:261-269)。在接種後 7 天（dpi7)，分離單 一病變，並以機械方式移至全身宿主義大利瓜的植物上。 將經過接種之植物保持在溫度控制的溫室（23-28°C)中，進 行觀察。 西才喜爲分# .·藉著pET36b(Novagen)表現GFP蛋白質（細 菌表現的GFP，bGFP)，並藉著凝膠-純化純化之。藉著GST-親和力管柱純化經pGEX_2T(Promega)表現Der p 5蛋白質 O:\89\89276.DOC -18- 1288778 (細菌表現的 Der p 5，bDer p 5)之（Hsu CH，Chua KY，Huang SK，Hsieh KH.過敏原-誘導之IgE合成的免疫預防，以及在 活體内藉著遺傳免疫的氣道反應性過高。 (Immunoprophylaxis of allergen-induced IgE synthesis and airway hyperresponsiveness in vivo by genetic immunization.) Nature Med 1996; 2:540-4)。在先前描述的方法之後，產生 對大腸桿菌表現之bGFP-和bDer p 5的多株抗血清（Lin SS， Hou RF，Yeh SD.在活體外和在活體内建構矮南瓜黃化嵌 紋病毒之台灣品系的傳染性轉錄本。（Construction of in vitro and in vivo infectious transcripts of Taiwan strain of Zucchini yellow mosaic virus.) Bot Bull Acad Sin 2002; 43:261-269)。以 1:5000之稀釋度，使用對ZYMV CP、bGFP 和bDer p 5的抗血清進行免疫墨點分析。藉著Image Gange 2.54軟體（Fuji Photo Film co·，Minat-Ku，Tokyo，Japan)，判 定在植物萃取物中的vGFP和vDer p 5蛋白質濃度，並使用 BSA蛋白質作為標準物。 從被感染的植物中分離附加組胺酸標籤的蛋白質：分别 以親和力管柱純化已經建構之ZYMV病毒載體 p3 5SZYMVGFPliis_ 或 p35SZYMVDerp5-表現附力口組胺酸標 籤之vGFP和vDer p 5蛋白質。在感染後8-10天收穫重組感染 南瓜的葉子，並以下述的方法（Hsu CH，Chua KY，Huang SK， Hsieh ΚΗ·過敏原-誘導之IgE合成的免疫預防，以及在活體 内藉著遺傳免疫的氣道反應性過高。（Immunoprophylaxis of allergen-induced IgE synthesis and airway hyperresponsiveness O:\89\89276.DOC -19- 1288778 in vivo by genetic immunization.) Nature Med 1996; 2:540-4) » 利用 Ni2+-NTA瓊脂糖（Qiagen Inc·，Stanford，Valencia，CA)，分 離標靶蛋白質。藉著SDS聚丙烯醯胺凝膠（12.5%)電泳，並 以考馬斯亮藍（Coomassie billiant blue) R-250(Sigma)染 色，或以免疫墨點分析經過純化的蛋白質。 以濃縮在南瓜萃取物中之vDer p 5蛋白質進行動物試 發··在感染後10天收穫以ZYMVDerp5重組病毒感染之南瓜 植物的葉子（1公斤），並以果汁機均質化在兩倍試樣體積的 水中每份含250克之組織。藉著以5,000g離心10分鐘，使該 勻漿澄清，通過Miracloth(Calbiochem，La Jolla，CA)過濾， 並再度以40,000g離心30分鐘。藉著ELISA，使用對bDerp 5 之抗血清，判定經萃取之vDer p 5的濃度。將上清液冷凍乾 燥，並使總蛋白質濃縮物分配到動物試驗的小瓶内。

Per p 5蛋白：T羚定.·在37°C下，以100毫升利用0.1M磷 酸鈉緩衝溶液（ρΗ9·6)連續稀釋的Der p 5(乾重濃度從20毫 克/毫升開始，最後至156.25毫克/毫升）塗覆96-孔培養盤 (Nunc®)2小時。以含有0.05%吐溫（Tween) 20的PBS沖洗培 養盤3次，並在37°C下，以1%在PBS中之BSA阻斷2小時。 加入100毫升以含有1%BSA之PBS稀釋至1:2000的兔子抗 •Derp5 IgG，並在37°C下培養2小時。在沖洗之後，在37°C 下將培養盤與山羊抗兔子IgG共轆之驗性填酸酶（1:200〇, ZyMax®8 1-6122) —起培養1小時。沖洗該培養盤，與 pNPP(Sigma®)受質一起培養30分鐘，並在405毫微克處測量 顏色反應。藉著BIO_RAD®進行蛋白質測定，判定重組Der O:\89\89276.DOC -20- 1288778 p5-6x-his蛋白質濃度，並可定出Der p5濃度校準曲線。 可藉著Ni-NTA管柱迅速地純化具有組胺酸-標籤之 GFP ’並在免疫墨點分析中由gfp-專一之多株抗體認出（圖 2B ’跑道2、3和4)。藉著image Gange軟體，估計藉著Ni-NTA 管柱’從感染後10天之南瓜萃取物中吸收經過純化的gfp 蛋白質’為每克葉片組織大約3.7微克。亦藉著Ni-NTA管 柱’從20克被感染的南瓜葉片中純化Der p 5蛋白質，並在 免疫墨點分析中，藉著Der p 5-專一之多株抗體迅速地辨認 (圖2B，跑道6、7和8)。估計從在感染後1〇天，被感染的南 瓜中純化的Der p 5蛋白質，為每克葉片組織ι·5微克。 實例2 :處理經過純化之Der ρ 5的動物模型 愈翁和砰宠享案··將獲自國立台灣大學醫學院（c〇llege of Medicine，National Taiwan University)之動物繁殖中心，年 齡在6-8週間的雌性BALB/C老鼠（起源自The Jackson Laboratory，Bar Harbor，ME)，分成四組（表1)。藉著腹腔内 注射10微克bDer ρ 5與4毫克氫氧化鋁（Wyeth

Pharmaceuticals，Punchbowl，Australia)，主動敏化老鼠。在 最初的敏化之後14和21天，將老鼠暴露在〇·ΐ%從大腸桿菌 中純化之bDer ρ 5的氣溶膠下20分鐘。以超音波霧化器 (Devilbiss，Somerset，PA)產生氣溶膠。氣溶膠的平均質量 直徑小於4微米。在最後的吸入攻毒之後8小時，收集支氣 管肺泡灌洗液（BALF)和血清。在敏化之後7天，以從被感染 10天之南瓜中濃縮的vDer ρ 5處理老鼠（低劑量組，1毫克/ 公斤/天；高劑量組，10毫克/公斤/天）口服1〇天。在ZYMV- O:\89\89276.DOC -21 - 1288778 感染南瓜之天然萃取物中vDer p 5的濃度等於25微克/克。 對照組僅以PBS處理。 表1 : 4個實驗組的特徵， 以及每組的進行程序 組別 編號 體重(克） 敏化作用 處理 氣溶膠攻毒 C 12 28土1.1 bDer p 5 PBS NT NC 12 30±1.5 bDer ρ 5 PBS bDer ρ 5 低劑量 18 29 土 1.2 bDer ρ 5 vDer p5 bDer ρ 5 (1毫克/公斤/天） 高劑量 18 32 土 1.4 bDer ρ 5 vDer ρ 5 bDer ρ 5 (10毫克/公斤/天）

Der;? 5-專一之/gG乃和/g五羚;C :藉著ELISA判定Der p 5-專一之IgG2a和IgE的量。以5微克/毫升的濃度，利用100微 升以塗覆緩衝溶液（0.1M NaHC03，ρΗ8·2)稀釋之經過純化 的bDer ρ 5或vDer ρ5，塗覆蛋白質高結合盤。在4°C下培養 過夜之後，沖洗該盤3次，並在25 °C下以3%(重量/體 積）BSA-PBS緩衝溶液阻斷2小時。關於IgG測量，使用1:100 稀釋的血清，至於IgE測量，則使用1:10稀釋，並以一式兩 份進行。在4°C下培養過夜之後，加入在0.05%明膠緩衝溶 液中稀釋的生物素基化之大鼠抗老鼠IgE單株抗體（R35-72, PharMingen)，或大鼠抗老鼠 IgG mAb(R12-4, PharMingen)， 並培養額外的1小時。然後加入抗生物素蛋白-鹼性填酸酶 共軛物（1:1000)，並在25°C下培養1小時。在6次沖洗之後， 利用加入磷酸酶受質磷酸對硝基苯酯（1毫克/毫升）二鈉鹽 O:\89\89276.DOC -22- 1288778 (Sigma)，開始呈色反應。在405毫微米處，以微量培養盤 自動讀取器（Metertech，Taiwan)讀取該培養盤。將讀值與標 準血清對照，該標準血清收集自6隻一開始以腹腔内注射工〇 微克bDer p 5與氫氧化|g，並在21天後以相同劑量補強的老 鼠。將標準企清當作1〇〇 ELISA單位/毫升來計算。 支氣管肺泡灌洗液和細胞計數：在澉i珣功氮参氮t 後，通過經由氣管切開術導入之聚乙烯管，以5χ〇·5毫升等 份的0.9%無菌生理鹽水灌洗老鼠。離心灌洗液（在4艺下以 500g離心1〇分鐘），並將細胞小球再懸浮於〇 5毫升漢克氏 (Hants)平衡鹽溶液中。藉著在9〇微升〇·4%錐蟲（tnypan)藍 中加入10微升細胞懸浮液，進行總細胞計數，並在光學顯 微鏡下，在Neubauer計算盤中計數。從藉著劉氏（Leu’s)染 色法染色的細胞離心製備物中，進行細胞分類計數。確認 細胞’並藉著標準形態學技術分成嗜曙紅細胞、淋巴細胞、 嗜中性白血球和巨噬細胞，在400-倍放大率下計算500個細 胞，並定出每種細胞類型的百分比和絕對數目。 .統#分舞··欲測定IgE和IgG含量的改變，以及在bDer p 5 攻毒之後在BALF中的細胞，進行變異數分析（ANOVA)的重 複測量’比較在各組之間的差異。在變異數分析之後，使 用鄧肯多元區間檢定（Duncan multiple range test)，辨別在 實驗組和對照組之間的差異。使用ρ<0·〇5之值，代表在統 計學上顯著的差異。 評估在活體内口服投與重組之Der ρ 5的效力，判定對吸 入過敏原攻毒的保護反應是否在功能上是顯著的。在腹腔 O:\89\89276.DOC -23· 1288778 内敏化作用之後2和3週，模仿處理和rDerp 5處理的老鼠兩 者均接受兩次利用過敏原Derp 5的吸入攻毒。在過敏原攻 毒之後3週，藉著ELISA測定在血清中抗p 5 igE的存 在。在模仿處理組中，Derp 5專一之IgE明顯地增加；相反 的，rDerp 5處理的老鼠顯示對Derp 5專一之丨找合成有超 過50%的抑制（圖3)。在口服餵食卬^ p 5的老鼠中，IgE產 製的抑制作用是對Derp 5專一的，因為rDerp2攻毒的老鼠 可產生Der P 2專一的IgE。因此，口服投與在南瓜中由ζγΜν 表現的rDer p 5，可在活體内有效地抑制過敏原專一之igE 的產生，並以過敏原專一之方式。在各組之間，在專一之 IgG含量上並無顯著差異（圖3)。 欲調查口服投與rDer p 5是否可壓抑過敏原專一之氣道 發炎，使用在支氣管肺泡灌洗液（BALF)中的細胞數目，作 為在氣道中細胞浸潤的測量值（圖4)。當與模仿處理組相比 較時，在rDer p 5處理之老鼠的BALF中，觀察到嗜曙紅細 胞和嗜中性白血球的數目明顯降低（p<0 05)。在各組之間， 巨噬細胞和淋巴細胞的數目並沒有差異。因此，Der p 5吸 入攻毒’在BALF中引起嗜曙紅細胞和嗜中性白血球的細胞 浸潤。可藉著口服投與rDer p 5抑制該炎症，但僅投與PBS 則不能。 實例3:處理得自表現Der p 5之基因轉殖植物之葉片的動物 模式 愈#和研兖草案··將獲自國立台灣大學醫學院（College of Medicine，National Taiwan University)之動物繁殖中心，年 O:\89\89276.DOC -24- 1288778 齡在6-8週間的雖性BALB/c老鼠（起源自The Jackson Laboratory，Bar Harbor，ME)，為在表2中出示的實驗分成6 組；其中C代表正常對照組；NC代表陰性對照組，其中敏 化老鼠，並餵以ZYMV葉片（2克/公斤）；pc代表陽性對照 組，其中敏化老鼠，並假以eN-Lac(副乾酪乳酸桿菌 (Lactobacillus paracasei)，已經證實其對治療過敏有影 響）1012/天；低劑量代表敏化老鼠，並健以ZYMV-Der p 5 葉片（200耄克/公斤/天），面劑量代表敏化老鼠，並健以 ZYMV-Der p 5葉片（2克/公斤/天）。藉著腹腔内注射1〇微克 純化自大腸桿菌的Der p 5與4毫克氫氧化鋁（Wyeth

Pharmaceuticals⑧，Punchbowl，Australia)，主動敏化老鼠。 在敏化之後’以在實例1中獲得的ZYMV、ZYMV-Dp5或 eN-Lac餵食老鼠，每天一次持續4週。 判定Der p 5專一之IgG2a和IgE、支氣管肺泡灌洗液和細 應#教··按照在實例2中的描述，藉著ELIS a判定Der p 5專 一之IgG2、IgE的數目和支氣管肺泡細胞計數，並出示在表 2和圖5至9中。使結果接受克·瓦二氏（Kruskal-Wallis)H檢 定，其使用Dunnet檢定和N.C作為基準線。 O:\89\89276.DOC -25 - 1288778 表2 : N.C 對照組 P.C 低劑量 高劑量 Ρ值 IgE 2.00 土 0· 0.19±0. 0.74 土 0· 0.91 土 0· 0.96 土 0· 〇.〇261 2a 70 01 11 17 12 b，c，d IgG 1·51±0· 0.70 士 0· 1.73 土 0· 1.56土0· 1.66土0· 0.0003 06 006 06 18 05 a，b 巨噬細胞43.01 土 3 90.10士 7 37·45 土 3 43.32土 1 35.19 士 4 0.0003 .35 .20 •38 •84 •30 a 淋巴細胞6.11 土0. 9.85 土 7. 8.59 士 1· 4.88 土 0· 6.90士 1. 0.137 99 15 10 84 37 嗜中性 50.55士. 0.00土0· 60.76±3 52· 18 土2 8.72 土 5 0.0003 白血球 .19 00 •20 •31 •06 a，b 嗜曙紅 3·79 土 0· 0.00士0· 2.08 土 0· 2.11土0· 1.57土0· 〇.〇〇〇3 細胞 55 00 27 29 35 a，b，c a、b、e和d分別顯示在對照組、P.C、低劑量和高劑量組 中的顯著差異。 O:\89\89276.DOC -26- 1 Ρ<〇·1，2Ρ<〇·〇5，3Ρ<0.001 2 結果顯示以ZYMV-Dp5葉片處理組的Der ρ 5專一之IgE的 量，明顯地比對照組和劑量-依賴性的那些更低。相反的， 以ZYMV-Dp5葉片處理組的Der ρ 5專一之IgG的量則升 高。證實ZYMV-Dp5葉片可抑制產生與過敏有關的IgE抗體。 3 結果亦顯示以ZYMV-Dp5葉片處理組之嗜曙紅細胞的數 目降低。相反的，以ZYMV-Dp5葉片處理組之T細胞和單核 細胞明顯地增加，並為劑量依賴性的。 1288778 實例4:在過敏原誘導之氣喘老鼠模式中，比較ZYMV-Der P5與大腸桿菌-Der p5的IgE抑制活性 翁#和砑龙享素··從國家實驗動物中心（台北，台灣）購買 雌性7週齡的BALB/c老鼠。將所有的動物分別飼養在籠子 裡’控制溫度（24土2°C)和濕度（60土5%)，並在不含特定病原 的條件下維持12小時亮-暗週期。在本研究中進行5組··第1 組’正常老鼠；第2組，每天一次餵食1克ZYMV/公斤體重 的對照組；第3組，每天一次餵食1克ZYMV-Der p 5/公斤體 重’第4組，對照組；以及第5組，每天一次锻食12 · 8 3毫克 大腸桿菌-Der p5/公斤體重。容許動物自由接近食物和水。 在敏化21天之後，藉著口插管供應ZYMV、ZYMV-Der p 5 和大腸桿菌-Dei* p5。藉著腹腔内注射1〇微克重組的歐洲室 塵蟎過敏原Der p 5-6xhis標蕺融合蛋白質與4毫克氫氧化 链’敏化第1組以外的動物組別。在敏化之後丨4天，以與敏 化作用相同的劑量補強老鼠。在敏化之後2丨天，進行吸入 攻毋。簡言之’使第1組以外的動物暴露在以pBS稀釋之 0.1%Der p5-6xhis標籤的氣溶膠下。在18小時之後，藉著從 每隻老鼠的尾靜脈採血，收集血清，並藉著]£]^13人判定IgE、 IgGl和IgG2a的含量。 藉著ELISA判定在BALF中的血清專一之抗體和ΙΡΝ_γ #:藉著五1^八判定在血清中之£)61>1)5專一之1扣1、1§(52玨 和IgE的含量，或在BALF中之^厂7量。在4。〇下，以15〇微 升在碳酸鈉緩衝溶液（PH9.6)中之Derp5(10微克/毫升），或 在0.1M磷酸鈉緩衝溶液（pH9)中之抗_老鼠INF_7(2微克/毫 O:\89\89276.DOC •27- 1288778 升，Pharmingen，USA)塗覆96-孔培養盤（NUNC)。在塗覆步 驟之後，使用含有3%BSA之PBS阻斷非專一的結合，並在 室溫（RT)下培養2小時。以含有0.05%吐溫20的PBS沖洗培養 盤，在各孔中加入100微升經過稀釋的受試血清（對於 IgGl、IgG2a，以含有 1%BSA之PBS稀釋 1:10，至於IgE，以 1:5稀釋），或150微升BALF，並在室溫下培養2小時。沖洗 培養盤，並在室溫下與生物素共軛之抗老鼠IgGl、IgG2a、 IgE(l:2,000)和 INF-y(0.25 微克/毫升，Pharmingen，USA) — 起培養2小時。在沖洗培養盤之後，在各孔中加入200微升 鏈黴菌抗生物素蛋白共輛之驗性填酸酶（1:2,000)，並在室 溫下培養1小時。加入pNPP受質（磷酸對-硝基苯酯，二鈉， Sigma，USA)，並對每個試樣，在405毫微米處檢測光密度 之值。 潜耒：藉著ELISA測試在吸入攻毒之後，出現在血清中 的抗-Der p 5 IgE。與正常組相比較，在ZYMV處理組中的 Der P 5-專一之IgE明顯地增加（ρ<0·05);相反的，ZYMV_Der p5處理之老鼠顯示出Der p 5專一之IgE合成的明顯抑制 (ρ<0·05)(表2)。大腸桿菌-Derp5(其中劑量與ZYMV-Derp 5 的相同）亦在Der p 5專一的IgE中，顯示出明顯的抑制 (ρ<〇·〇5)，但與大腸桿菌-£)er p 5相比較，ZYMV-Der p 5在 抑制Der p 5專一之IgE產製上，顯示出改善的效力（ρ<〇.ι)。 再者’ ZYMV-Der p 5-處理之老鼠，在Thl型Der p 5專一之 IgG2a上，顯示出比大腸桿菌_Der p 5處理之老鼠更明顯的 增加（Ρ<0·1)(圖1〇)。因此，餵食ZYMV-Der p 5可能比大腸

O:\89\89276.DOC -28- 1288778 桿菌-Der p 5更有效地抑制過敏原專一之lgE產製。在吸入 攻毒之後，判定在支氣管肺泡（BALF)中之IFN-γ的濃度。當 與對照組（第2組）相比較時，在ZYMV-Der p 5中增加IFN-γ 的產生，在大腸桿菌-Der P 5中更明顯（ρ<〇·1)。 上述實施例僅為說明本發明之原理及其功效，而非限制 本發明。因此，習於此技術之人士對上述實施例所做之修 改及變化仍不違背本發明之精神。本發明之權利範圍應如 後述之申請專利範圍所列。 【圖式簡單說明】 圖1 :在衍生自矮南瓜黃化嵌紋病毒（ZYMV)之台灣品系 (TW-TN3)的病毒載體之病毒基因組的修改區中，核:y：酸和 胺基酸序列的圖解。顯示Z YMV非密碼區（粗黑線）、密碼區 (空心盒子）和插入外來基因（粗線）之基因組區域的相關部 分之圖解說明。以「/」表示ZYMV之NIa蛋白酶加工處裡的 蛋白酶切開位置。為了載體之建構，使用p35SZYMV2-26 , 其含有全長的cDNA至TW-TN3的基因組ss(+)RNA，由花椰 菜花葉病毒（CaMV)35S啟動基因驅動，在活體内產製傳染 性轉錄本。為了插入外來基因，在HC-Pro密碼序列的N-終 端第2和第3個胺基酸之間，創造〗位置。在 p35SZYMVGFPhis中，將GFP密碼序列插入价〇 I位置内， 並在GFP之C終端插入NIa蛋白酶切開位置（S-V-R-L-Q/S)， 產生自由形式的GFP。此外，在GFP和NIa蛋白酶切開位置 之間，設計數個限制酵素位置和六組胺酸（His標籤）。在 p35SZYMVDerp5中，將歐洲室塵蟎5(Derp 5)蛋白質之歐洲 O:\89\89276.DOC -29- 1288778 室塵蟎過敏原的密碼序列插入病毒載體内。在小括弧中顯 示由每個構築體產製之相對應的重組病毒。 圖2 :病毒-表現之vGFP和vDer p 5的西方墨點分析，以及 得自以ZYMV重組體感染之南瓜類植物的附加His標籤之蛋 白質的金屬親和力純化作用。A.)將得自等量（0.01克）在感 染後7天收集之葉片組織的萃取物裝載在凝膠（12.5%)上， 並分離，然後移至硝基纖維素膜上。分別使同時製備之墨 點與抗GFP血清（A，跑道1_5)、抗Der p 5血清（A，跑道6-8) 或ZYMVV CP抗血清反應。在膜的上方，顯示用來接種的 重組病毒（在圖1中描述的）。B.)得自分別以 ZYMV-GFPhis(B，跑道 2·4)和 ZYMV-Derp5(B，跑道 6-8)感 染之植物的附加His標籤之vGFP和vDer p 5的親和力純化作 用。跑道1和5，FT代表得自被感染植物之萃取物的Ni2+-NTA 管柱的流通；跑道2至4，El-3代表連續250微升的Der p 5 之洗脫溶離份，且Μ代表蛋白質標記。vGFP/HC- Pro和vDer p 5/HC-Pro分別代表vGFP和vDer p 5的融合形式。vGFP和 vDer p 5各自/分別代表vDer p 5的自由形式。CP代表ZYMV 外殼蛋白。分別以1:4000、1:4000和1:5000之稀釋度，使用 vGFP、vDer p 5和ZYMV CP專一的多株抗體。 圖3 :利用ELIS A判定在以吸入vDer p 5(0.1 %)攻毒Der p 5-敏化之BALB/c老鼠的血清中，Derp5專一之IgG(白色柱） 和IgE(黑色柱）的含量。以平均值土SEM來表示數值。在每個 實驗組中使用至少12隻老鼠。星號（*)意指與媒劑-處理的老 鼠相比較，ρ<〇.〇5。 O:\89\89276.DOC -30- 1288778 圖4 :在以媒劑、低劑量vDer p 5(1毫克/公斤/天，持續10 天）、高劑量vDer p 5(10毫克/公斤/天，持續10天）處理的Der P 5敏化之老鼠的支氣管肺泡灌洗液中，嗜曙紅細胞、嗜中 性白血球和單核細胞的數目。以平均值士SEM來表示數值。 在每個實驗組中使用12隻老鼠。星號（*)意指與媒劑處理的 Der p 5攻毒之老鼠相比較，p<〇 〇5。 圖5 :利用ELIS A判定在以吸入rDer p 5攻毒Der p 5敏化 之BALB/c老鼠的血清中，Der p 5專一之IgE的含量。*意指 與媒劑處理的老鼠相比較，ρ<〇·丨；**意指與媒劑處理的老 鼠相比較，ρ<〇·〇5 ; ***意指與媒劑處理的老鼠相比較， ρ<0·001 〇 圖ό ·利用ELIS Α判定在以吸入rDer ρ 5攻毒Der ρ 5敏化 之BALB/c老鼠的血清中，Der p 5專一之IgG的含量。*意指 與媒劑處理的老鼠相比較，ρ<〇·丨；**意指與媒劑處理的老 鼠相比較，ρ<〇·〇5 ; ***意指與媒劑處理的老鼠相比較， ρ<0.001 〇 圖7 ··在Der ρ 5敏化之老鼠的支氣管肺泡灌洗液中，巨噬 細胞的數目。*意指與媒劑處理的老鼠相比較，p<〇. 1 ; * * 意指與媒劑處理的老鼠相比較，p<〇 〇5 ; ***意指與媒劑處 理的老鼠相比較，。 圖8 ·在Der p 5敏化之老鼠的支氣管肺泡灌洗液中，嗜中 性白血球的數目。*意指與媒劑處理的老鼠相比較，; *忍指與媒劑處理的老鼠相比較，p<〇 〇5 ; ***意指與媒劑 處理的老鼠相比較，H 〇〇 1。

O:\89\89276.DOC -31 · 1288778 圖9 :在Der p 5敏化之老鼠的支氣管肺泡灌洗液中，嗜曙 紅細胞的數目。*意指與媒劑處理的老鼠相比較，p<〇1 ; **意指與媒劑處理的老鼠相比較，ρ<0·05 ; ***意指與媒劑 處理的老鼠相比較，ρ<0.001。 圖10:在過敏原敏化之BALB/c老鼠中，比較藉著供給 ZYMV-Der p 5與大腸桿菌-Der p5的Der p-5專一之IgE含 量。老鼠每天口服投與蒸餾水、ZYMV-Der p5和大腸桿菌 -Derp 5，持續21天，並在敏化作用後21天，以〇.l%Der p 5 攻毒。在18小時之後，收集血清，判定Der p-5專一之IgE ; 1對於每組中的6隻老鼠，以平均值土SD來表示結果。在 ZYMV-Der p5或大腸桿菌-Der p 5與對照組之間，藉著 Mann-WhitneyU檢定，分別測試 *ρ<〇·ι 或 **p<〇.〇5〇 圖11 :在過敏原敏化之BALB/c老鼠中，比較藉著供給 ZYMV-Der p 5或大腸桿菌-Dei: p5，在BALF中之IFN-γ量的 提高。老鼠每天口服投與蒸餾水、ZYMV-Der p5和大腸桿 菌-Der p 5，持續21天，並在敏化作用後21天，以〇.i%Der p 5攻毒。在18小時之後，收集BALF，判定IFN-γ量；1對於每 組中的6隻老鼠，以平均值±SD來表示結果。在ZYMV-Derp5 或大腸桿菌-Der p 5與對照組之間，藉著Mann-Whitney U檢 定，分別測試*p<0.1。

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Claims (1)

1288綱1()。138號專利巾職 丨公告本| 中文申請專利範圍替換本(95年11月1 拾、申請專利範園

L 一種製造塵蟎過其中該塵蟎過敏原係選自 由Der ρ 5和Der ρ 2過敏原所組成之群，該方法包括下列 步驟： (a) 建構一載體，該載體包含編碼塵蟎過敏原之dna序 列，该DNA序列係操作性連接至一植物專一性之啟 動子，该載體係選自由矮南瓜黃化嵌紋病毒（ζγΜν) 和菸草嵌紋病毒（TMV)所組成之群；該植物專一之啟 動子為花椰菜花葉病毒3 5 S啟動子； (b) 以步驟⑷之載體轉型一植物細胞或組織；以及 (c) 從步驟⑻的植物細胞或組織中獲得該塵蜗過敏原。 2·根據申印專利範圍第丨項之方法，其中該塵蟎過敏原為 Der p 5過敏原。 3. 根據申請專利範圍第！項之方法，其中該塵蜗進一步包括 内質網（ER)滞留信號肽。 4. 根據申5月專利範圍第i項之方法，其中該載體是經過修飾 的植物病毒載體。 5. 根據申請專利範圍第旧之方法，其中該載體進一步包括 可選擇標記基因。 6·根據申請專利範圍第1項之方法，其中該植物的至少-部 分是可食用的。 7.根據申請專利範圍第旧之方法，其中該植物係選自由於 草、馬鈴¥和義大利瓜、番祐、萵苣、白葡萄、香蒸、 89276-951103.doc 1288778 稻米、蘿蔔、胡蘿蔔、蘋果 之群。 玉未和漿果所組成 8. 根據申請專利範圍第7頊 鈐薯的肯纳目古 、/、、中“植物係選自由馬 9. =月納貝克變種、終草和矮南瓜所組成之群。 根據申請專利範圍第㈣ 靖萨—友八甲在步驟（b)中藉著土 周解之基轉移、直接舰攝人或植 步驟，以轉型該植物細胞和組織。 毋感扣 1〇.根f申請專利範圍第1項之方法，更進-步包括在步驟η =剛’從步驟（b)之植物細胞或組織中，再 物的步驟。 口将殖植 11 •根據申請專利範圍第1 只心乃/云其中以基因轉殖植物本 f、植物的—部分、果實、葉片、莖、塊莖、種子或其 萃取物之形式，提供該塵蟎過敏原。 12 •一種製造用於治療過敏之醫藥組合物的方法，該醫藥組 合物包括塵蜗過敏原，該塵蜗過敏原係選自由Der p 5和 Der p 2過敏原所組成之群，其中該塵蜗過敏原係由包括 下列步驟之方法所製備·· (a)建構一載體，該載體包含編碼塵蟎過敏原2Dna序 列，該DNA序列係操作性連接至一植物專一性之啟 動子β亥載體係選自由矮南瓜黃化嵌紋病毒（ΖγΜν) 和菸草嵌紋病毒（TMV)所組成之群；該植物專一之啟 動子為花椰菜花葉病毒35S啟動子； (b) 以步驟（a)之載體轉型一植物細胞或組織；以及 (c) 從步驟（b)的植物細胞或組織中獲得該塵蟎過敏原。 89276-951103.doc 1288778 13.根據申料利範圍第12項之方法，纟中該塵蜗過敏原為 Der p 5過敏原。 14·根據申請專利範圍第12項之方法，其中該塵蟎進一步包 括内質網（ER)滯留信號肽。 15·根據中μ專利範圍第12項之方法，其中該載體是經過修 飾的植物病毒載體。 16. 根據申請專利範圍第12項之方法，其中該載體進一步更 包括可選擇標記基因。 17. 根據申請專利範圍第12項之方法，其中該植物的至少一 部分是可食用的。 18. ，據申請專利範圍第12項之方法，其中該植物係選自由 菸草、馬鈐薯和義大利瓜、番莊、萵苣、白葡萄、香焦、 稻米 '蘿蔔、胡蘿菌、蘋果、大豆、玉米和漿果所組成 之群。 19·根射請專利範圍第18項之方法，其中該植物係選自由 馬鈴薯的肯納貝克變種、菸草和矮南瓜所組成之群。 20.根射請專利範圍第12項之方法，其中在步驟⑻中藉著 2桿菌調解之基因轉移、直接舰攝入或植物病毒感 氷步驟，以轉型該植物細胞和組織。 21根據^專利*圍第12項之方法，更進—步包括在步驟 ⑷之則，從步驟⑻之植物細胞或 植物的步驟。 飞甲再生基因轉殖 89276-951103.doc 1288778 22.根據申請專利範圍第12項之方法，其1 本身、植物的一部分、果實、葉片、j 其萃取物之形式，提供該塵蟎過敏原。 以基因轉殖植物 、塊莖、種子或 89276-951103.doc 4-