TWI239336B - Process for producing hydrazinomonosaccharide derivatives and use thereof - Google Patents
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Description
Ϊ239336 五 發明説明( A7 B7
發明之技術領域 本發明是有關在為了單醣類分析中有用之肼基單醣類衍 生物 < 製造方法以及其用途。更詳細的說,本發明係有關 胼基單醣類衍生物之製造及為了決定定位在醣類還原末端 <醛式醣及酮式醣單醣類構造的肼類之使用。 先前技術 、都稱為醣類之醣或碳水化合物,是生物系的主要成分。 醣類占形成植物之乾燥重量中的近8〇%,因此單醣類,或 是由共有鍵結單醣類所成之寡醣類的任一個,在高等動物 中為新陳代謝中不可欠缺的成分。再者,醣類再三被發現 是更大生物學的大分子(包含蛋白質、脂質及核酸)之一部 刀在此廣範圍種類之形悲中,醣類在天然中具有非常多 之重要機能。 在生物系中因醣類之重要性,鑑定做為遊離單醣類及寡 醣2之單醣成分的單醣類手段是非常有用的。再者,鑑定 在寡醣類之還原末端位置的單醣類手段,在解析寡醣類構 造上很重要。 最近’做為寡酷類構造之解析方法,在w〇96/l7824號 (特表平11-501901號)中已有揭示,在寡醣類還原末端存在 之單醣類做成立Ν,Ν·_二乙醯肼基單醣類衍生物,將此衍 生物藉由氣體層析質量分析(GC/MS)等鑑定之方法,依此 ^法的話,原理上可以鑑定全部在寡_還原末端存在之 單醣類之種類。 然而,上叙万法存在著只有單離之醣類才能使用的問 -4- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐)
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線 1239336 A7 B7 五、發明説明(2 ) 題,雖在數種類醣類混合物中採用此方法時,能得到數種 類之肼基單醣類衍生物,但是不能決定各個是從那個醣類 而來。因此,用此方法分析天然存在之醣類時,有必要事 先單離出St類。 例如,在蛋白質或核酸中因各有本身之紫外線吸收,在 分離精製操作中,可以以此吸收為基準來追蹤其存在之位 置,然而醣類並無此種吸收,所以為了容易分離精製,希 望能標識醣類。為了此目的,例如可用螢光色素來適度標 識。由天然供給源中所得來之其它混合物(例如,蛋白 質、核酸等)與醣類共存之場合,所標識之醣類就可以很 容易與其它混合物區別,因此,在此情況下,必須以不標 識混在醣類以外成分之方式,針對醣類進行選擇性之標識 不標示由天然供應源來之其它成分,做為醣類選擇性標 識之方法,例如有標識醣類之還原性烴基之方法。做為還 原性烴基者,例如,可列舉如定位於醣類還原末端之羰 基、遊離之醛基。做為醣類還原性烴基中之反應者,可以 列舉如還原胺化反應、酸肼化反應等。此等反應為不可逆 之反應。做為用還原胺化反應的醣類標識化方法者,例 如,使用2-胺ρ比淀之方法(S.Hase,T. Ibuki及T. Ikenaka, Journal of Biochemistry,95,197-203 (1984)),而做為使用 醯肼化反應的醣類標識化方法者,例如,可列舉如使用 Biotin-x-hydrazide (Calbiochem 公司)之方法(B. Ridley,D. Mohnen 們,Analytical Biochemistry,249,10-19(1997))。後 -5- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1239336 A7 B7 五、發明説明(3 ) 者的方法,是由還原末端有醋類,和Biotin-x-hydrazide之 反應形成醯肼後,藉由再進行還原反應,插入醯肼键結調 製醋類之生物標識化物之方法。 W096/17824號所揭示的方法因是利用醣類之遊離還原末 端,將依上述方法標識醣類還原末端所單離之單醣類,不 能使用此原來種類之定同方式。 再者,為了詳細決定位在醣類還原末端之單醣類構造, 在單醣類種類鑑定之外,期望能決定與鄰接單醣類之键結 位置(以下,也稱為「取代位置」)(即,決定與位在還原 末端單醣類鄰接之單St類的還原性經基鍵結是介入那個位 置之羥基)。上述W096/17824號中,只揭示鑑定位在醣類 還原末端之單醣類種類的技術,不能說是具有決定取代位 置之技術。 做為決定構成醋類之各單醣鍵結位置的方法己知的有甲 基化分析。一般甲基化分析是依寡醣之甲基化、甲基化寡 醣之加水分解、遊離甲基化單醣之還原、甲基化醣醇之乙 酿化、部分甲基化/乙酸化醋醇(partially methylated alditol acetates,PMAA)之川員序進行。在部分甲基化/乙酿化醣醇 之質量分析中,開裂型式和其法則性很早就被詳細調查過 了,由此開裂型式可以進行乙醯基位置之鑑定(B. Lindberg, Methods in Enzymology,Vol. 28,ppl78-195 (1972))。在一般 之甲基化分析中,構成寡醣之單St是完全生成ΡΜΑΑ。此 等,通常是以氣體層析/質量分析裝置(GC/MS)來分析。雖 然乙酸基位置可以由質量分析之開裂型式來鑑定,但單醋 -6 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1239336 A7 B7 五、發明説明( ) 種類之鑑定在氣體層析上不能依賴與標準物質之比較鑑定 而得,為此構成寡醣之單醣有必要準備全部之PMAA做為 標準物質。有關自然界存在之全部單醣中,要花很大的勞 力來調製可能之PMAA,再者事實上不可能進行自然界存 在之全部單醣,可分離之全部PMAA的氣體層析鑑定。 ,發明所欲解決之課題 本發明之主要目的是提供,即使不單離醣類也可以決定 定位在還原末端之單醣類的種類及取代位置之手段。 課題之解決手段 為了達成上述目的,本發明人經銳意研究結果,發現由 醣類做成肼基單醣類衍生物,即使不單離醣類,用與 W096/17824號相同之方法,也可以決定其在還原末端定位 之單醣類種類,而完成了本發明。 即,本發明是提供 (1) 一種製造肼基單醣類衍生物之方法,其特徵為至少 也含有下述步騾 (a)有還原末端醣類和,式(I): NH2-NR1(R2) (I) [式中,R1是有可檢出標識及/或有做為固定支持體之一部 分,或是在可檢出標識及/或在固定支持體鍵結,κΛν間 之键結,為由可分解醣苷键結之反應可分解之鍵結、氫以 外之基,R2是氫原子或碳原子1〜8之烷基] 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210 X 297公釐) 1239336 A7 ____B7 五、發明説明( ) 所示之肼類反應,製造踪之步騾: (b) 將步驟⑷中所得之腙還原成胼基衍生物之步驟;以 及 (c) 將步騾(b)所得之肼基衍生物藉由醣芬鍵結行分解反 應分解,得到胼基單醣類衍生物之步驟。 (2) 在上述⑴所述方法中,將步驟⑻所得肼基衍生物在 進行步驟(c)之前’進行該耕基衍生物之&乙醯化。 (3) 在上述(1)或(2)所述方法中,步驟⑻所得肼基衍生物 或N-乙醯化肼基衍生物在步驟⑷之前,進行該肼基衍生 物之羥基甲基化。 (4) 在上述(1)〜(3)所述之任一方法中,其中…是醯基。 (5) 在上述(1)〜(4)所述之任一方法中,是紫外或是可視 吸光物質、螢光色素或是做為其一部分固定支持體之基。 (6) 鑑定在有還原末端醣類中之還原末端單醣類及/或決 定和還原末端單醣類之鄰接單醣類的鍵結位置之方法,其 特徵是至少包含有下述步騾: (a)這原末端有酷類和,式⑴: 肌视加2) ⑴ [式中,R1是氫以外之基,有可檢出之標識及/或有做為固 定支持體之一邵分’或是在可能檢出之標識及/或在固定 支持體鍵結,rLn間之鍵結,為由可能分解醣甞键結之反 應可分解之鍵結,R2是氫原子或碳數卜8之烷基] 本紙用中國國家標準(CNS) A4規格(⑽x 297公豐) 1239336 A7 B7 五、發明說明( 所不之胼類反應,製造腙之步驟; (b)將步驟(a)中所得之腙還原成肼基衍生物之步騾;以 及 (c) 將步驟(b)所得之肼基衍生物由醣甞鍵結行分解反應 分解’得到肼基單醣類衍生物之步驟; (d) 將步驟⑷所得之肼基單醣類衍生物完全乙醯化之步 驟;以及 (e) 鑑定步騾(句所得之完全乙醯化肼基單醣類衍生物。 (7)在上述(6)所述方法中,將步驟(b)所得胼基衍生物在 步驟⑷之前,進行該胼基衍生物之队乙醯化。 ⑻在上述⑹或⑺所述方法中,步驟⑼所得耕基衍生物 右是N-乙醞化肼基衍生物是在步驟⑷之前進行,則該 衍生物之羥基甲基化’在步驟⑷中決定和還/ 早醣 < 鄰接單醣類的鍵結位置。 (9)在上述(6)〜(8)所述任一方法中, m ^ ^ r 步騍(e) <鐘定是# 用氣體層析/質量分析(GC/MS)來進行。 疋疋便 驟 ⑽有還原末端醣類之標識法’其包含至少有下述之步 (a) 原末^有類和,式(!) NH2-NR1(R2) [式中,R1是氫以外之基,有可檢出之 '9- 本紙張尺度適财_家標準(CMS) A4規格(21〇X2^Jy 1239336
口疋支持體之一部分,或是在有可能檢出之標識及/或在 口走支持體鍵結,R丨_ N間之鍵結,為由可分解醣甞鍵結 、化予反應可分解之鍵結,R 2是氫原子或碳數丨〜8之烷基] 所不之肼類反應,製造腙之步驟; (b) 將步驟(a)中所得之腙還原成肼基衍生物之步驟;以 及 (c) 知步驟(b)所得之肼基衍生物行N-乙醯化之步騾。 01)在上述(1)〜(10)所述之任一方法中,所使用式G): NHyNR^R2) ⑴ [式中,R1是氫以外之基,有可檢出之標識及/或有做為固 疋支持體之一部分,或是在有可能檢之標識及/或在固定 支持體鍵結,RLN間之鍵結,為由可分解醣甞鍵結之反應 可分解之鍵結,R2是氫原子或碳數丨〜8之烷基] 〜 所表7F之耕類。 (12) 製造肼基單醣類衍生物用套組,其特徵是含有上述 (11)所述之肼類。 (13) 鑑定在醣類中之還原末端單醣類及/或決定和還原末 端單醣類之鄰接單醣類的鍵結位置用套組,其特徵是含有 上述(11)所述之肼類。 (14) 有還原末端醣類之標識用套組,其特徵是含有上述 (11)所述之肼類。 (15) 式(III)所示醣類: -10- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公 1239336 A7 B7 五、發明説明( R^NCA^-NHR1 (III) [式中,Ac是乙醯基,R1是氫以外之基,有可檢出之標識 及/或做為固定支持體之一部分,或是在有可能檢出標識 及/或在固定支持體鍵結,κΛν間之鍵結,為由可能分解 醣甞键結之反應可分解之鍵結,R4為可與醣類具有醣芸键 結,且在1-脫氧醛式醣之C-1位鍵結之氫被除去之基或是 與2-脫氧酮式醣之C_2碳原子鍵結之氫被除去1個之基,但 是不包含下述情況:R1為乙醯基,並且R4不具有與醣類之 醣甞鍵結且在1-脫氧醛式醣之C-1位鍵結之氫被除去之基 或是與2-脫氧酮式醣之C-2碳原子鍵結之氫被除去1個之基 者]。及 (16)在上述(15)所述之醣類,其特徵為R1為乙醯基者。 依本發明的話,即使沒有單離醣類,也可以鑑定還原末 端單醣之種類,又,如上述(7),甲基化肼基衍生物之羥 基時,可以決定與鄰接單醣類之鍵結位置。使用有做為固 定支持體之一部分或在固定支持體含可鍵結基之肼類時, 不需要反應生成物和反應液分離操作,可以進行上述之鑑 定/決定。 圖式說明(元件符號說明) 圖1 :表示在各種條件下放置之N-Acetyl lactosamine之苯 醯肼衍生物,及將展開N-乙醯化物之薄層層析圖。 發明之詳細說明 -11 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1239336 A7 B7
類衍生物乙醯化做成N,N,-二乙醯肼基單醣類衍生物,將 此以GC/MS之方法鑑定。 依本發明所製造之肼基單醣類衍生物,是使 獨則7824號(特表平i “〇_號)(援用在本發明書中^ 出典故之出處)所述的鑑定還原末端單醣 、 。 乃〉中。依 W096/17824號所述鑑定方法的話,將所單離之有還原末端 醣類與胼類反應製造腙,將腙還原成肼基衍生物,在此^ 必須因應自寡聚合醣分解肼基單醣類衍生物,將肼基單醋 在本發明的肼基單醣類衍生物製造方法之步驟⑷中, 做成有還原末端醣類者並無特別之限定,做為還原末端醣 類之鐘定及/或決定和還原末端醣類之鄰接單醣類鍵結位 置之對象’可以為任何一種醣類,包括單醣類、寡醣類、 多醣類、此等之混合物。包含在本發明方法中所使用之醣 類試料,也可以包含如由天然供給源之外的其它成分(蛋 白質、核酸等),含有在本發明之方法中所使用醣類之試 料因為是由天然供給源所得其方法是,如社團法人日本生 化學編「生化學實驗講座4醣類之化學(上)」( 1976年4月 12曰發行,株式會社東京化學同人)所述。 在此所用之「還原末端醣類」語詞,是指定位在酸式醣 之C-1位或酮式醣之c-2位沒接受取代醣類之末端(「還原 末端」),有還原性單醣類者。又,「醛式醣」是指在C-1 位有醛基、任一種遊離之單醣類或是寡聚醣類之還原末端 單醣類。「酮式醣」是指沿著單醣類骨幹之任一個内部碳 原子中有酮基、任一種遊離之單酷類或是寡聚膽類之這原 -12- 本紙張尺度適财關冢鮮(CNS) a4_21QX297公董)
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末端單醣類者。 在本發明之肼類單醣類衍生物之製造方法 购⑽π824號所述方法中所用之肼類或相異構造之=用 依此,能排除需事前單離分析醣類之必要性。 颁, 類」表示一般的以有機基取代胼之氫原子之化八2, 「胼 本發明之肼類單醣類衍生物之製造方法中,所:,但在 類」是,式⑴ 斤使用之「胼 (I) NH2-NR1(R2) [式中,R1是有可檢出之標識及/或有做為固定支持触、一 ==在有可能檢出之標識及/或在固定支::鍵 ° 間疋鍵結,為由可分解醣甞鍵結之反應可分解之 鍵結、氫以外之基’ R2是氫原子或碳原子卜8之烷基]所 周知的或是新穎之任何一種化合物。在W096/17824號 所述之方法中所使用之耕類,月井中4個氫原子中只有^ 被1〜8個碳原子之烷基所取代者。 、可檢出標識」是為了容易精製肼基衍生物、該領域周 知 < 任一種標識,例如包含紫外、可視吸光標識(例如苯 =其衍生物)、螢光標識(例如螢光素、嵌二莕、蔥及此 等之衍生物)、放射性標識(例如放射性氫原子、放射性 碳三放射性碘)及生物素標識或異羥基洋地黃毒甘配基標 識等在所期望之製造肼基衍生物後所鍵結之可檢出標識 處%合,也可以在可檢出標識處分別存在含可鍵結基之肼 -13-
1239336 A7 _ —_B7 明説明-- 读’和可檢出基,但若不如此則也可使用有一部分做為可 檢出標識基,有一部分做為可檢出標識基之例子,可列舉 有金光色素做為一部分之乙醯基。例如M〇lecular pr〇bes公 司所出售之使用附加1-嵌二莕酪酸肼之嵌二莕所發出之螢 光做為指標者,如使用該領域所周知之順向高速液體層析 方法’可以很容易精製胼基衍生物,其它,做為有可檢出 基足乙酸胼醯者,有生物素肼醯(同人化學社製)、苯酸肼 (東永化成社製)、栅格青月井(Molecular Probes公司製)等, 可以得到許多種化合物。 又,可檢出標識之肼化合物,該業者可以很容易合成製 得,例如,做為有功能基之羧酸化合物之肼,以合成肽所 用 <手法「泉屋們,(肽合成之基礎和實驗)(1985)丸善株 式會社」鍵結的話,可以容易得到乙醯肼醯。又,做為功 能基之有胺基化合物,例如由無水琥珀酸將功能基變更為 叙Sai後,在上述方法中有可能和肼縮合。再者又,做為功 能基之有羥基化合物,化後,與碳醯胼(carbhydrazide, H2N_NH-CO-NH-NH2)反應時可以將胼導入。 同時,以上所揭示之肼化合物合成手法,是不限制在可 檢出之標識化合物之場合,在具有固定支持體之場合也同 樣可以。 、、在本發明之方法中任一個或全部之反應步驟,也可以在 液相中進行’也可以在固相中進行。「固定支持體」是在 相對於肼基衍生物為了以固相實施各種反應而使用二,例 如在以下之詳細說明,在本發明之鑑定還原末端酷類及/ -14- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公爱 1 1239336 A7 B7 --^- 五、發明説明( ) 或決定和還原末端醣類之鄰接單醣類鍵結位置之方法中, 在步驟(b)所得肼基衍生物在進行步騾(c)前,由羥基甲基 化肼基衍生物,可以在步驟(e)中決定和還原末端醣類鄰 接單醣類之键結位置。一般,在此甲基化反應中,含有數 階段之反應/洗淨步騾。由對固定支持體鍵結肼基衍生 物,可以省略每個反應生成物和反應液之分離操作。 固定支持體是所键結之肼基衍生物所精製而得之場合,所 使用之醣類沒有必要單離,但一般,含有固定支持體做為 一部分或是在固定支持體中可鍵結之基的肼類,是針對所 單離之St類來使用。對不單離之it類,也能標識含標識檢 出醣類混合物之肼化合物,其次精製標識成目標的肼基衍 生物化醣,精製肼基衍生物化醣也可能在固定支持體上键 結。例如,醣和過量之4-胺基苯肼反應時,醣優先與肼基 縮合形成腙。還原後,醣胼基衍生物可用苯環之紫外吸收 做指標精製。精製之肼基衍生物是介入此衍生物之胺基, 例如,可以在做為功能基之N-羥丁亞胺基酯之固定支持體 上鍵結。固定支持體是包含玻璃球、聚合矩型、燒結玻璃 圓盤、纖維玻璃膜,或聚合膜等,在固定支持體上,通常 期望有為了固定化肼類或醣肼基衍生物之功能基,做為功 能基者,可以列舉如胺基、羧基、羥基、鹵化烷基等.。如 此,做為有功能基之固定支持體例子者,可以列舉如Nova Biochem 公司所出售之 NovaSyn TG bromo Resin 及 Bio-Rad 公 司所出售之Bio-Rex 70 Resin。如此含有固定支持體之一部 分基的肼類,例如以實施例2所述之順序來製造。所得之 -15- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1239336 A7 B7 — 五、發明説明( ) 同時,即使步驟(a)及(b)做為分離步驟之外,同時也可 進行之步驟,若是該業者的話也應周知。 再者,必要的話於還原反應後也可以進行肼基衍生物之 N-乙醯化,做為肼基衍生物之N-乙醯化之效果者,是期 待電荷之消滅及化學的安定化。 在步騾(c)中,由可分解配醣键結之反應分解肼基衍生 物,而得肼基單醣類衍生物。此時,在步驟(a)中,所使 用之肼類中所含之κΛν間鍵結也同時被分解。該業者周知 的,可以使用可分解配醣鍵結之任一種反應(例如,參考 Biermann,C.J.著 Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry,Vol· 46, 251-271 )。R1 是由該業者適當選擇, 在選擇性反應條件下可分解Ri-N間之键結。在1個實施態 樣中,R1是乙酸基。在別的實施態樣中,R1是做為可檢出 標識之螢光色素或是有固定支持體做為一部分之乙醯基。 分解之步驟是在水、醇或是羧酸般之各種溶劑中進行,由 使用酸性條件而達成。做為適當之.分解劑者,可以列舉如 水中之鹽酸或三氟醋酸溶液、無水甲醇中之鹽酸、及無水 醋酸溶液中之硫酸,一般分解是在50〜110 °C 、進行1〜10小時,例如,分解是在5%鹽酸-甲醇中於 90°C加熱4小時,或在4 Μ鹽酸中,於100°C加熱4小時來實 施。 由包含步騾(a)〜(c)之方法所得之肼基單醣類衍生物,是 式(II): -17- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1239336
(Π) R3-nh-nh_r2 =不:式中,R3是在式中之N共有键結之1-脫氧醛醣部或 是脫氧酮醣部。汉3是丨_脫氧醛醣部之場合,產生對N之共 有鍵結疋介入在Cq位。R3是脫氧酮醣部之場合,產生對 N〈共有鍵結是介人㈣骨幹巾之脫氧碳原子(此為在酉同 基原來存在之碳原子)。在全部場合中,R2是氫原子或是 奴原子數為1〜8之燒基。 在式(II)之肼基單醣類衍生物中,將R3所示之^脫氧醛 醣部或是脫氧酮醣部之羥基之全部或其中一部分為有γ基 化構造之肼基單醣類衍生物。特別稱之為「〇_甲基化肼基 早膽衍生物」。 構成R3所示基之醛式醣及酮式醣,也可以是任一遊離之 單醣或疋暴醣之還原末端單醣,例如做為醛式醣者,可以 列舉如6個碳原子之己醛醣(例如D_葡萄醣、l_葡萄醣、 D-阿洛醣、D-阿卓醣、D·半乳醣、D_古羅醣、d-艾杜 醣、D-甘露醣、及D_塔羅醣)、5個碳原子之戊醛醣(例如 D-阿拉伯醣、D-來蘇醣、D-核醣及D_木酮醣)、4個碳原 子之醛式丁醣(例如D-赤蘚醣及〇_薄醣)、碳原子3個之醛 式三醣(例如D-甘油醛)。做為酮式醣者,可以列舉如6個 碳原子之己酮醣(例如D_果醣、D-假果醣、D_山梨醣、及 D-塔格醣)。 使用上述方法所得之肼基單醣類衍生物,如下般,用來 進行鑑定有還原末端之醣類之還原末端單醣及/或決定和 -18 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1239336 A7 B7 五、發明説明( ) 還原末端單酷之鄰接單St類键結位置。 在步騾(d)中,將肼基單醣類衍生物完全乙醯化,語詞 「乙醯化」是說將1個或更多之乙醯基在分子中使共有键 結之意,「完全乙醯化」分子是全部遊離之羥基及氮原子 被乙酿化之分子。 將該領域周知之任一個適當之0-乙醯化反應,因能將衍 生物完全乙醯化之故所以可以使用。在此雖無特別限制, 但含有醋酸Sf / ρ比淀混合物、酷酸gf、氯化鋅、錯酸鈉、 或硫酸、或P比淀溶液中之和乙酸氯之反應(例如,參考 Horton D. IA、 「The Amino Sugars」、3-211 頁(R, W.
Jeanloz編、Academic Press 1969 )(援用本發明書所標示之出 處)。 N-乙醯化是比0-乙醯化更容易產生,因此,脫氧肼基 醣醇及脫氧-(Ν’-烷基肼基)醣醇之完全乙醯化,是在上述 「0-乙醯化」之相關條件下產生,在此等分子之氮基上及 完全之遊離經基上產生乙醯基。 0-乙醯化例如是在試料中添加吡啶:醋酸酐之2 : 1混合 液,於37°C中保溫16小時來進行。 另一方面,不進行0-乙醯化而選擇性的進行N-乙醯化 之情形,例如,在弱驗性緩衝液中和酷酸混合進行.。做 為弱驗性緩衝液者,最好使用飽和碳酸氫鈉,同時,在本 發明說明書中「N-乙醯化」者,是指並無特定限制上述, 而選擇氮原子的乙醯化之意。 在本發明之方法中,步驟(b)所得肼基衍生物也可以在 -19 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1239336 A7 B7 五、發明説明( ) 步驟(C)之前甲基化胼基衍生物之羥基。依此甲基化中, 在步驟(e)中可以決定和還原末端單St鄰接單醣類之鍵結 位置或「取代位置」。 決定構成醣類之各單醣類間之鍵結位置的「甲基化分 析」,是一種為了決定和還原末端單醣鄰接單醣類的鍵結 位置之有用方法。在此方法中,首先將還原醣之遊離羥基 完全甲基化,分解所得之甲基化醣類,只有和鄭接單醣類 的鍵結位置之羥基產生遊離部分之甲基化單醣類,將其甲 基化,再鑑定被乙醯化之位置。甲基化是用該領域周知之 任一種方法來進行。例如,甲基化是可以使用,箱守法 [S. Hakomori, J. Biochem. (Toyo), Vol. 55, 205-208 (1964)]-DMSO-NaOH 法[I. Ciucanu and F· Kerek,Carbohydrate Research, VoL 131,209-217 (1984)],或 DMSO-NaOH 法之改良法的 Amimula 們之方法[Anumula,K. R. and Taylor, P.B., Anal. Biochem.,Vol. 203,101-108 (1992)](援用本發明書所標示之 出處)來實施。 同時,在本發明之決定和還原末端單醣之鄰接單醣類的 键結位置之方法中,心為乙醯基,甲基化手段是用DMSO-NaOH法,或是使用Anumula們之方法的場合,在肼基衍生 物醣直接鍵結之氮原子(N)為在甲基化前不乙醯化的話, 在後面之步騾(e)中不能完全乙醯化肼基單醣類衍生物。 在此場合,乙醯化也可以用N-乙醯化來完全乙醯化,何以 如此,這由完全乙醯化導入之0-乙醯基是使用甲基化之強 鹼條件下迅速脫離,而導入替代的甲基之故。而在該條件 -20- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1239336 A7 B7 - 五、發明説明( ) 中殘存N-乙醯基。 肼基衍生物之N-乙醯化,是該領域者很容易可以實施 的,例如胼基寡醣衍生物可以用W096/17824號(特表平11-501901 )所述之方法進行。或是將肼基寡醣衍生物以該領 域周知方法,例如也可以在p比淀•醋酸肝之2對1混液 中,於37°C放置一個晚上來完全乙醯化。 另一方面,肼基衍生物之,在由醣來之碳原子上直接键 結之氮原子(N)上乙醯化,發現完全無預期的其它效果產 生。即,肼基衍生物之,在由醣來之碳原子上直接键結之 氮原子(N)乙醯化,能增強肼基衍生物之化學安定性。相 對於醣肼基衍生物,在酸溶液中為不安定者,而觀察出胼 基衍生物之N-乙醯化物則為極安定之現象。再者,肼基衍 生物之N-乙醯化物是因由氮原子之質子化而無電荷,為了 精製或分析之層析中不會與擔體相作用,與不N-乙醯化之 肼基衍生物相比,可以得到尖的♦或寬的付加優點。 在步驟(e)中,由鑑定上述所得之完全乙醯化肼基單醣 類衍生物,可以在有還原末端醣類中鑑定還原末端單醣, 再者,如上述般,甲基化肼基衍生物之經基時,可以決定 和還原末端單醣之鄰接單醣類的键結位置。 本發明之衍生物,也可以在分析前精製,又,例如由在 氣體層析-質量分析(GC/MS)及液體層析-質量分析(LC/MS) 等中,層析是使用連結在分析裝置系(總稱連線質量光譜 分析)之場合,也可以不必要精製。完全乙醯化之胼基單 醣類衍生物之精製,也可以在乙醯化前實施或也可以在乙 -21 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1239336 A7 B7 五、發明説明( ) 醯化後實施。衍生物以層析較適宜,更好是使用高速液體 層析來精製。 完全乙醯化之肼基單醣類衍生物,是在決定單醣類之構 造中使用。構造決定之方法,以層析分離及質量分析較適 宜,此分離最好是由氣體層析分離(GC/MS)。 衍生物之檢出可用該領域者周知之任一適當技術來進行 而得,適當之檢出,是使用代表的200 nm紫外吸收、或使 用質量分析(MS)來進行。使用如GC/MS及LC/MS之連線質 量光譜分析(即,為了由層析所分離化合物之分析而直接 導入質量分析計内)衍生物之檢出為特別好。 在質量分析中,於真空中氣體狀之試料由如電子衝擊化 (E I)或化學離子化(C I)之方法來離子化,檢出此結果所生 成之離子。連線質量光譜分析之場合,將由層析所分離之 分子,藉由電子衝擊化或化學離子化來離子化。分析必要 之試料量通常為不足1 pmol。有關基礎之裝置的總說明可 參考 Cooks,R.G·,Glish,G.L·,McLucky,S.A.及 Kaiser,R.E., Chemical and Engineering News,1991 年 3 月 25 日,26-41 頁(援 用本發明書所標示之出處)。 同時,在本發明中醋之鍵結位置的決定方法,是與上述 技術項所述之一般甲基化分析不同,只在還原末端單醣進 行甲基化為目的。還原末端單醣種類之鑑定,是將寡醣肼 基衍生物化,將所得胼基寡膽衍生物配酸鍵結由可分解反 應分解,得到肼基單衍生物之後完全乙驢化,可以由 GC/MS 來進行(Bendiak,B. and Fang,T.T·,Carbohydr. Res. 327, • 22- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1239336 A7 B7 : · 五、發明説明( ) 463-481 (2000))。決定和還原末端單醣之鄰接單醣類的鍵 結位置是可以和一般之甲基化分析大致相同之順序進行, 即,將寡醣肼基衍生物化,將所得之肼基寡醣衍生物完全 甲基化,由可分解配醣键結反應來分解完全甲基化之肼基 寡醣衍生物,得到部分甲基化肼基單醣衍生物後再完全乙 醯化,由GC/MS來分析部分甲基化/乙醯化肼基單醣衍生 物(partially methylated 1-deoxy-l-hydrazino alditol acetates 或是 partially methylated 2-deoxy-2-hydrazino alditol acetates , PMHAA ) 〇此時,還原末端以夕卜之醣也做成部分甲基化/ 乙醯化醣而被檢出,但與部分甲基化/乙醯化肼基單醣衍 生物之區別是藉由GC保留時間或質量光譜來區分。尤其 以由質量光譜來區別較有效。例如,由具有異丁烷之化學 離子化法測定正離子質量光譜的話,可以檢出PMHAA之分 子質量。用還原末端分析鑑定還原末端單醣之種類的話, 所期待之PMHAA可能分子質量因至多也有6通絞在一起, 由此等之質量檢測層析的話,可以很容易鑑定PMHAA之 »1^· 〇 再者,測定所檢出之分子離子之MS/MS光譜的話,由其 開裂型式可以鑑定PMHAA之乙醯基位置。 由PMHAA之MS/MS光譜開裂之型式,基本上比以往更詳 細檢討PMAA之質量分析中開裂型式時,可以適用此之法 則性。然而,PMHAA到目前為止所取得之報告是非質量分 析中PMHAA特有之開裂型式及無進行此法則性之仔細全面 檢討。 -23- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1239336 A7 B7 _ 五、發明説明( ) PMHAA是N,Nf-二乙醯化肼基寡醣類、例如可以用1-脫 氧-1-( N,N’-二乙醯化肼基)乳醣醇等做原料來製造,N,N’-二乙醯化肼基寡醣類之製造方法可以使用W096/17824號 (特表平11-501901 )所述之方法。完全甲基化N,N’·二乙醯 化肼基寡醣類後,其次例如甲醇分解般由分解配醣鍵結反 應而得到甲基化肼基單醣。將所得部分甲基化肼基單醣由 完全乙醯化可得PMHAA。雖可以就所得PMHAA原樣來使 用,但是,也可以用由逆相高速液態層析等之層析來精 製。 又,PMHAA之特長之一者為有不易揮發之性質。依此性 質如PMAA之場合般,由吸付氮氣而無必要蒸館除去飽和 之溶媒,即使以濃縮離心機進行減壓乾涸,對試樣之損失 也完全看不到。 本發明同時是有關,如上述本發明之方法中所使用之肼 類,及將此肼類做為必要之構成成分之含肼基單醣類衍生 物之製造用或在醣類中鑑定還原末端單醣及/或是決定和 還原末端單醣之鄰接單醣類的鍵結位置組件(Kit),組件是 更含在各步驟之反應中所使用之其它試藥、反應容器及使 用說明書等之中。 實施例 — 以下,列舉實施例來更詳細說明本發明,但本發明範圍 並不限定只有此而己。 實施例1 肼基葡萄醣衍生物之調製及解析 -24- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 22 1239336 A7 B7 五、發明説明( ) (a) 腙之調製 360微克葡萄醣經過充分乾燥後,添加20微升之二甲基 亞颯(DMSO)中有4μΜ之1-後二蓁丁酸ϊ蠢肼(Molecular Probes公司)溶液,藉由超音波處理來充分溶解葡萄醣,在 此添加2微升之醋酸充分攪捽後,將反應液在90°C加熱1小 時。 (b) 腙之還原 將⑷所得之反應液在離心濃縮機中乾涸後,在殘渣中 添加20微升之DMSO中含有2·5Μ硼烷二甲基胺螯合體及 30%醋酸之溶液,藉由超音波處理充分溶解殘渣後,在80 °C下加熱1小時。反應液以離心濃縮機乾涸後,將此再溶 解到50%之乙腈中,在順相高速液體層析中精製。嵌二萘 化葡萄醣之存在,是以精製物之分子量4重極3連離子噴 射質量分析裝置的API-300 (Perkin-Elmer Sciex公司製)測 定,由檢出正分子離子(467.0)而得以確定。 (c) 嵌二莕化葡萄醣之甲醇分析 將(b)中所得之精製嵌二莕化葡萄醣(10微毫莫爾),放 入玻璃試驗管中,乾涸之,在試驗管中添加100微升之5% 鹽酸-甲醇(Nakalitex公司),封管後在90°C加熱4小時,打 開試驗管,在離心濃縮機中乾涸試料可得分解產物。 (d) GC/MS 分析 在(c)中所得之嵌二莕化葡萄醣經甲醇分析後之殘渣 中,將I3c6-D-葡萄( Aldrich公司)做為出發材料以周知的 方法(特表平11-501901 )(援用本發明書所標示之出處)來調 -25- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1239336 A7 B7 — 五、發明説明( ) 製,添加1-脫氧-1-(N,NL二乙醯肼基)-13C6-D-葡萄醣醇10 微毫莫爾當作内部標準物質,再度乾涸之。所得殘渣中添 加吡啶:醋酸酐為2 : 1混合液100微升,充分攪拌後,在 37°C保溫16小時,試料以離心濃縮機乾涸後,殘渣中添加 200微升之氯仿使溶解,取其中1微升在GC/MS中導入分程 範圍内分析之,GC/MS分析條件如下所示。 系統:GCQ (Finnigan MAT) 管柱:DB-5 ( 5%聯苯-95%二甲基聚矽氧烷,0.25 mm内徑 χ30 m,0·25 微米薄膜厚度)(J&W Scientific) 載體:氦氣(流速40 cm/sec )
離子化:EI 注射溫度:300°C 管柱起始溫度:90°C
時間程式:90°C 2 分鐘,90°C -24°C / 分-210 °C,與 210°C-4°C / 分-300°C 注射量:1微升(不分割注射) 在總離子質量層析中,觀察到在16.04分及21.21分有主 要峰(peak)。在完全乙醯化1-脫氧-1-( N,N’-二乙醯肼基)-12C6-D·葡萄醣醇之特異離子([M-42]+)、m/z=448之單質量層 析中是觀察到16.04分之峰,此峰是和由内部標準來之完 全乙醯化1-脫氧-1-(N,N’-二乙醯肼基)-13C6-D-葡萄醣醇之 特異離子([M-42]+)、m/z=454之單質量層析的峰一致。 21.21分之峰是有做為主離子之m/z=3 02,此是與1-後二審 丁酸甲酯之分子離子一致。 -26- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1239336 A7 B7 _ 24 五、發明説明( ) 實施例2 胼固定支持體 (a) 碳化醯胼(carbonhydrazite)固定化 Novasyn TG Resin 之調製 將 360毫克 NovaSyn TG bromo Resin (Nova Biochem 公司) 懸濁在 DMSO 内有 0.5M 碳化酸肼(Carbonhydrazite,Aldrich 公司製)之溶液中,在室溫振動16小時。樹脂用充分量之 DMSO、水、乙醇洗淨後,以15毫克/毫升之醋酸铯/ N,N-二甲基甲醯胺(DMF)溶液處理,之後用充分量之DMF、 水、乙醇洗淨,而得碳化醯肼固定化Novasyn TG Resin,所 導入之碳化酸胼之還原力,以Park · Johnson法(Park,J· Ί\及 Johnson,M.J.,J· Biol. Chem·,181,149-151 (1949))測定時,每 1毫克有相當於1.1微毫莫爾之‘甲氧基苯肼鹽酸鹽之還原 力。 (b) 肼固定化Bio-Rex 70樹脂之調整 將離子型變換成質子型之Bio-Rex 70樹脂(Bio-Rad公 司)200毫克懸濁在5毫升之N,N -二甲基甲醯胺(DMF)中, 在此添加0·5克之1-乙基-3-(3二甲基胺丙基)碳化二亞胺鹽 酸鹽(EDC) (Nakalitex公司),在室溫振動16小時。樹脂用20 毫升之DMF洗淨後、添加5毫升DMF中之10%肼(Nakalitex 公司)溶液,再振動5小時。。樹脂用充分量之DMF、水、 1M鹽酸、水、甲醇洗淨,可得肼固定化Bio-Rex 70樹脂。 所導入之肼還原力,以Park · Johnson法(Park,J. T.及Johnson, Μ·J·, J· Biol. Chem·,181,149-151 (1949))測定時’每 1 毫克樹 脂顯示有相當於27.6微毫莫爾之4-甲氧基苯胼鹽酸鹽之還 -27- 本紙張尺度適用中國國家檩準(CNS) Α4規格(210X 297公釐) 1239336 A7 B7 — 五、發明説明( ) 原力。 (c) 醣之樹脂键結 在(b)所得之各10毫克肼固定化Bio-Rex 70樹脂中,添加 100微升DMSO内含有100mM葡萄醣及10%醋酸之溶液,在 90°C中加熱1小時,樹脂以50毫升之DMSO洗淨,其次,在 樹脂中添加1毫升之1 Μ氫化鋼水溶液,在室溫中放置16 小時。樹脂用充分量之水、0.1Μ鹽酸、水、乙醇之順序洗 淨後,乾燥。 (d) 醣鍵結樹脂之酸加水分解 將在(c)所得之各乾燥醣鍵結樹脂移入玻璃試驗管内, 加入100微升之4M鹽酸後封管,在100°C中加熱4小時。打 開管子後,回收上面澄清液,減壓乾涸,得到加水分解產 物。 (e) GC/MS 分析 在(d)所得之加水分解後之各殘渣中添加吡啶:醋酸酐 之2 : 1混合液100微升,充分攪拌後,在室溫中放置16小 時,試料以離心濃縮機乾涸後,殘渣中添加200微升之乙 腈使溶解,之後取其中1微升在GC/MS中導入分程範圍, 分析之,GC/MS分析條件如下所示。 系統:GCQ (Finnigan MAT) 管柱:DB-5 ( 5%聯苯-95%二甲基聚矽氧烷,0.25 mm内徑 X 30 m,0.25 微米薄膜厚度)(J&W Scientific) 載體:氦氣(流速40 cm/sec )
離子化:E I -28- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1239336 A7 B7 五、發明説明( )
注射溫度:300°C 管柱起始溫度:9(TC
時間程式:90°C2 分鐘,90°C-24°C/ 分-210°C,與 210°C-4°C / 分-300 °C 注射量:1微升(不分割注射) 觀察到完全乙醯化1-脫氧-1-(N,Nf-二乙醯胼基)-D-葡萄 醣醇之特異離子([M-42]+)、m/z=448之單質量層析中14.5分 的學,此峰之質量層析是和標準之完全乙酿化1-脫氧 -1-(Ν,Ν^二乙醯肼基)-D-葡萄醣醇之質量層析峰一致。 實施例3 甲基化分析 (a) 嵌二莕化乳醣之調製 50微毫莫爾乳醣經過適當之乾燥後,在此添加10微升二 甲基亞颯(DMSO)中有400微毫莫爾之1-嵌二莕丁酸醯胼 (Molecular Probes公司)溶液,藉由超音波處理充分溶解乳 醣,在此添加1微升之醋酸充分攪拌後,將反應液在 90°C加熱1小時。在離心濃縮機中乾涸反應液後,在殘渣 中添加10微升之DMS0中含有2.5M硼烷二甲基胺螯合體及 30%醋酸之溶液,藉由超音波處理充分溶解殘渣後,在80 °C下加熱1小時。反應液在離心濃縮機中乾涸後,再溶解 到50%之乙腈中,在順相高速液體層析中精製。精製嵌二 莕化乳醣之分子量以4重極3連離子噴射質量分析裝置的 API-300測定時,觀察到正分子離子(629.3)。 (b) 嵌二莕化乳醣之甲醇分析 -29- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1239336 A7 B7 — 五、發明説明( ) 將⑷中所得之精製嵌二莕化乳醣(20微毫莫爾),放入玻 璃試驗管中,乾涸之,在試管中添加100微升之5%鹽酸-甲 醇(Nakalitex公司),封管後在90°C加熱4小時,打開試驗 管,在離心濃縮機中乾涸試料可得分解產物。 (c) GC/MS 分析 嵌二莕化乳醣之甲醇分析後的殘〉'查中添加p比淀:酸奸(2 對1 )之混合液100微升,充分攪拌後,在37°C中加溫1 6小 時,試料以離心濃縮機乾涸後,殘渣中添加200毫升之乙 腈使溶解,取其中1微升在GC/MS中導入分程範圍,分析 之,GC/MS分析之條件如下所示。 系統:GCQ (Finnigan MAT) 管柱:DB-5 ( 5%聯苯-95%二甲基聚矽氧烷,0.25 mm内 徑· x30 m,0·25 微米薄膜厚度)(J&W Scientific) 載體:氦氣(流速40 cm/sec ) 離子化:C I (異丁烷)
注射溫度:300°C 管柱起始溫度:90°C
時間程式:90°C2 分鐘,90°C-24°C/分-210°C,與210°C-4 °C / 分-300 °C 注射置· 1微升(不分割注射) 在總離子質量層析中,觀察到在8.1分、14.6分和20.1分 有主峰,相當在完全乙醯化1-脫氧-1-(N,N’-二乙醯胼基)-D-葡萄醣醇之正分子離子([M+H]+),m/z=491之單質量層析 中觀察到14.6分的峰,停留時間、質量層析共同與標準之 -30- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1239336 A7 B7 五、發明説明( ) 完全乙醯化1-脫氧-1-(N,N’-二乙醯胼基)-D-葡萄醣醇的各 個一致。 (d) 嵌二莕化乳醣之甲基化 (a)中所得之精製嵌二莕化乳醣,將100微毫莫爾放入附 有螺旋帽之玻璃試驗管中,減壓乾涸。殘(查中添加p比淀: 酸酐(2對1 )之混合液200微升,充分攪拌後,在室溫中放 置16小時,試料以離心濃縮機乾涸後,殘渣中添加100微 升之甲醇再乾酒。此試料使用Amxmula們之方法(Anumula, Κ· R·及 Taylor,P. B.,Anal· Biochem·,203, 101-108 (1992))進行 嵌二蓁化乳醣之完全甲基化處理,在甲仿中萃取後減壓乾 酒。 (e) 甲基化嵌二莕化乳醣之甲醇分解 將(d)中所得之甲基化嵌二莕化乳醣(相當50微毫莫爾)在 試管中乾涸,在試管中添加100微升之5%鹽酸-甲醇 (Nakalitex公司),封管後在90°C加熱4小時,打開試驗管, 在離心濃縮機中乾涸試料,可得分解產物。 (f) GC/MS 分析 在(e)中所得甲基化嵌二莕化乳醣之甲醇分析後殘渣 中,添加吡啶:酸酐(2對1 )之混合液100微升,充分攪拌 後,在室溫中放置1 6小時,試料以離心濃縮機乾涸後, 殘渣中添加200微升之乙腈使溶解,之後取其中1微升在 GC/MS中導入分程範圍,分析之,GC/MS分析之條件如下 所示。 系統:GCQ (Finnigan MAT) -31 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 x 297公釐) 1239336 A7 B7 ------—1 五、發明説明( ) 管柱:DB-5 ( 5%聯苯-95%二甲基聚碎氧燒,0.25 mm内徑 x30 m,0.25 微米薄膜厚度)(J&W Scientific) 載體:氦氣(流速40cm/sec) 離子化:C I (異丁烷) 注射溫度:3〇〇°C 管柱起始溫度:90°c
時間程式:9〇°C2分鐘 ’ 90°C-24°C/分-210°C ’ 與 210°C-4 〇C/分-300 〇C 注射量:1微升(不分割注射) 取在11.3分所觀察之主峰的質量層析時,觀察到相當於 4-0-乙醯基-1-脫氧-2,3,5,6_0-四甲基-1-(N,N’-二乙醯基-Ν’ 甲基肼基)葡萄醣醇之正分子離子峰([Μ+Η]+), m/z=393 〇 實施例4 部分甲基化/乙酿化肼基單it衍生物(卩虹1^11)^11^1:11)^16(11-deoxy-l-hydrazino alditol acetates,PMHAA)之調製 各取乳醣(Galpl-4Glc)(Nakalitex 公司)、甘露二醣(Man al-2Man)(Dextranraporalis 公司)、甘露三酷(Manal-6 [Manal-3] Man)(Dextran raporalis 公司)、N-乙醯化乳酸胺 (Gaipi-4GlcNAc)(生化學工業公司)10微莫爾,依 W096/17824號(特表平11-501901 )所述方法Ν,Ν^二乙醯基 化肼基衍生物化,各取1微莫爾寡聚醣之N,N’-二乙醯基化 肼基衍生物,用已說明之Anumula們之方法完全甲基化。 將所得完全甲基化寡聚醣N,N’-二乙醯基化肼基衍生物在 -32- 本紙張尺度適用中國國家檩準(CNs) A4規格(210 X 297公釐) 1239336 A7 B7 五、發明説明( ) 玻璃試驗管中乾涸,在試驗管中添加500微升之5%鹽酸-甲 醇(Nakalitex公司),封管後在90°C加溫4小時,打開試驗 管,在離心濃縮機中乾涸試料,可得分解產物。在甲醇分 析後之殘渣中,添加吡啶:醋酸酐(2對1 )之混合液300微 升,充分攪拌後,在37°C中加熱2小時,試料以離心濃縮 機乾涸後,殘渣中添加1000微升之乙腈水溶液使溶解,回 收各PMHAA。 GC/MS分析 取各PMHAA溶液1微升(相當1微毫莫爾出發物質)在 GC/MS中導入分程範圍分析之,GC/MS分析之條件如下所 示。 系統:GCQ (Finnigan MAT) 管柱:DB-5 (5%聯苯-95%二甲基聚矽氧烷,0.25 mm内 徑· x30 m,0.25 微米薄膜厚度)(J&W Scientific) 載體··氦氣(流速40 cm/sec ) 離子化:C I (異丁烷)
注射溫度:300°C 管柱起始溫度:90°C
時間程式:90°C2 分鐘,90°C-24°C/分-210°C,與 210°C-4 °C/分-300 〇C 注射量:1微升(不分割注射) 在各PMHAA試料和GC/MS分析中雖觀察到有多數個 峰,但由各之化學離子化質量層析所看到之分子正離子來 鑑定PMHAA之峰。 -33- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1239336 A7 B7 - - 五、發明説明( ) 由此結果,能確認分別自乳醣可得到4-0-乙醯基-1-脫 氧-2,3,5,6-0-四甲基-1-(N,N’-二乙醯基-Ν’-甲基肼基)_D-葡 萄醣醇(4-0-acetyM-deoxy-2,3,5,6-0-tetramethyl-l-(N,N’_ diacetyl-N’-metylhydrazino)-D-glucitol)、自甘露二醣得到 2-0-乙醯基-1-脫氧-3,4,5,6-0-四甲基-1-(N,N’-二乙醯基-Ν’-甲 基肼基)-D-甘.it.(2-0-acetyl-l-deoxy-3,4,5,6-0-tetrametyl-l-(N,N’-diacetyl-N’-metylhydrazino)-D-mannitol)、自甘露三醣 得到3,6-0-二乙醯基-1-脫氧-2,4,5-0-三甲基-1-(Ν,Ν^二乙 醯基-Ν’-甲基肼基)-D-甘露醣醇(3,6-0-出&〇6171-1-(16(^7-2,4,5-0-trimetyM -(N,N’-diacetyl-N’-metylhydrazino)-D-mannitol)、自 N-乙醯化乳酸胺可得到4-0-乙醯基-1,2-二脫氧-3,5,6-0-三 甲基-2-(N-甲基乙醯基醯胺)-1-(Ν,Ν’-二乙醯基-Ν’-甲基肼 基)-D-葡萄醋•G-O-acetyMJ-dideoxyJJj-O-trimetyU^N-methylacetoamido)-1 -(N,Nf-diacetyl-Nf-metylhydrazino)-D-glucitol) 〇 自乳醣所得之4-0-乙醯基-1-脫氧-2,3,5,6-0-四甲基-1-(N,N’·二乙醯基-N,-甲基肼基)-D-葡萄醣醇(4-0-&。61乂1-1-deoxy-2,3,5,6-0-tetrametyl-l-(N,N’-diacetyl-N’-metylhydrazino)-D-glucitol)的GC/MS分析中,可以檢出在11.4分之♦的化學 離子化質量層析正分子離子峰([M+H]+)、m/z=393。自甘露 二醣得到2-0-乙醯基-1-脫氧-3,4,5,6-0-四甲基-1-(N,N’-二 乙醯基-Nf-甲基肼基)-D-甘露醋醇(2-0-&〇61}4-1-(16〇\3^ 3,4,5,6-0-tetrametyl-l-(N,N’-diacetyl-N’-metylhydrazino)-D-mannitol)的GC/MS分析中,可以檢出在11 · 1分之峰的化學 -34- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1239336 A7 B7 五、發明説明( ) 離子化質量層析正分子離子峰([M+H]+)、m/z=393。自甘露 三醣所得之3、6-0-二乙醯基-1-脫氧-2,4,5-0-三甲基-1-(N,N*-二乙B盔基-Ν^甲基耕基)-D-甘露醣醇(3,6-0-(^〇6{}4-l-deoxy-2,4,5-0-trimetyl-l-(N,N’-diacetyl-N’-metylhydrazino)-D-mannitol)的GC/MS分析中,可以檢出在13.1分之峰在化學 離子化質量層析中之正分子離子峰([M+H]+)、m/z=421。自 N-乙醯化乳酸胺可得到4-0-乙醯基-1,2-二脫氧-3,5,6-0-三 甲基-2-(N-甲基乙醯基醯胺)-1-(Ν,Ν’-二乙醯基-Nf-甲基胼 基)-D-葡萄醋醇(4-0-&〇61}4-1,2-(11(16〇义3^3,5,6-0七111^{;/1-2-(]^-methylacetoamido)-l-(N,N’-diacetyl-N’-metylhydrazino)-D-glucitol) 的GC/MS分析中,可以檢出在14.5分之峰在化學離子化質 量層析的正分子離子峰([M+H]+)、m/z=434。 實施例5 紫外吸光標識肼基衍生物之調製和甲基化分析 將5微莫爾之葡萄醣(Nakalitex)、槐糖(Glc01-2Glc, Sigma公司)、昆布二It ( Glcpl-3Glc,生化學工業)、麥芽 醋(Glcal-4Glc,關東化學)、異麥芽醣(Glcal-6Glc,生化 學工業)分別充分乾燥,在其中添加25微升之含有2 5微莫 爾之苯甲酿胼(Benzoylhydrazine)(東京化成)之二甲基亞石風 (Dimethylsulfoxide,DMS0)溶液,藉由超音波處理充分溶 解醣類,在此加入2.5微升之醋酸充分攪捽後,反應液在 90°C中加溫1小時,以離心濃縮機乾涸反應液後,在殘渣 中添加50微升之含有2.5 Μ硼烷•二甲基胺螯合體(Borane-dimethylamine complex)、30% 醋酸之 DMS0 中溶液,藉由超 -35- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1239336 A7 B7 — 五、發明説明( ) 音波處理充分溶解殘渣後,在37°C下加溫16小時。反應液 以離心濃縮機乾涸後,重覆添加乙腈及乾涸操作。殘渣用 100微升之水溶解,將過剩之試藥以300微升之水飽和醋酸 乙酯萃取3次除去,依W096/17824號(特表平11-501901 )所 述方法進行N-乙醯基化,在Dowex 50W-X8 (室町化學)中脫 鹽後,再以HPLC精製可得N-乙醯基化苯甲醯肼醣衍生物 類。 同時,HPLC之條件如下述。 幫浦:LC6A (島津) 管柱:Asahipak NH2P-50 ( 4.6 厘米内徑 X 250 厘米)(Showa Denko)
溶劑A :乙腈/水,95 ·· 5 溶劑B :乙腈/水,1 : 1 流速:每分鐘1毫升 溫度:40°C 溶液梯度:30分鐘内溶劑B從0〜100% 測定:在270微毫米吸收 將N-乙醯基化苯甲醯肼醣衍生物類之中各取1微莫爾以 Anumula們之方法(已說明)完全甲基化,將所得完全甲基 化N-乙醯基化苯甲醯肼醣衍生物之20分之1量放入玻璃試 驗管中乾涸,在試驗管中添加100微升之含有0.5 Μ鹽酸 80%醋酸水溶液,封管後在100°C加溫6小時,打開試驗 管,在離心濃縮機中乾涸試料可得分解產物。殘渣中,添 加吡啶:醋酸酐(2對1 )之混合液200微升,充分攪拌後, -36- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1239336 A7 B7 . - 五、發明説明( ) 在37°C中加溫16小時,試料以離心濃縮機乾涸後,殘渣中 添加100微升之乙腈水溶液使溶解,回收PMHAA。 GC/MC分析 取PMHAA乙腈溶液1微升(相當1微毫莫爾出發物質)在 GC/MS中導入分程範圍分析之,GC/MS分析之條件如下所 示。 系統:GCQ (Finnigan MAT) 管柱:DB-5 ( 5%聯苯-95%二甲基聚矽氧烷,0.25 mm内 徑· x30 m,0.25 微米薄膜厚度)(J&W Scientific) 載體:氦氣(流速40 cm/sec ) 離子化:C I (異丁烷)
注射溫度:300°C 管柱起始溫度:9 0 °C
時間程式:90°C 2 分鐘,90°C -24°C / 分-210 °C,與210°C-12〇C / 分-300 〇C 注射量:1微升(不分割注射) 在任一個PMHAA之總質量層析中都觀察到有多數個峰, 由N-乙醯基化苯甲醯肼葡萄醣來之試樣所期待之PMHAA 正分子離子([M+H]+)、m/z=365之單質量層析中,可得9.2 分的單峰,剩下4個試樣的所期待PMHAA正分子離子 ([M+H]+)、m/z=393之單質量層析中,分另J得到由N-乙醯基 化苯甲醯肼槐醣來之試樣,是在9.4分,由N-乙醯基化苯 甲醯肼昆布二醣來之試樣,是在9.5分,由N-乙醯基化苯 甲醯肼麥芽醣來之試樣,是在9.6分,由N-乙醯基化苯甲 -37- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1239336 A7 B7 五、發明説明( 驢耕異麥茅糖來之試樣’是在10.2分的單+。各試才褒 PMHAA之峰·質望光譜是依試樣不同而異,可知此等質量光 譜,即由PMHAA之開裂型式之不同可以鑑定乙醯基之位 置。 實施例6 標識肼基衍生物之N-乙酿化物之調製和安定性試驗
線
充分乾燥50微莫爾之N-乙醯乳胺(生化學工業;以下, 略稱LN ),在其中添加100微升之含有1〇〇微莫爾苯甲醯肼 (Benzoylhydrazine)(東京化成)之DMSO溶液,藉由超音波處 理充分溶解醣類,在此加入80微升之DMSO和20微升之醋 酸充分揽拌後,反應液在90°C加溫1小時,在加熱下,以 離心濃縮機乾涸反應液後,在殘渣中添加500微升之含有 2M氫棚化鈉(Nakalitex)的25%乙腈水溶液充分擺拌,在室 溫中放置一晚。在反應液中加入純水500微升後,滴下醋 酸使反應液溶液中和到pH在5附近為止。取試驗管中中和 之溶液800微升,再加入1毫升純水稀釋,以W096/17824號 (特表平11-501901 )所述方法進行N-乙酿基化,在Dowex 50W-X8 (室町化學)中脫鹽後,再以HPLC精製可得LN之苯 甲醯肼衍生物(以下,略稱為LN苯甲醯肼衍生物)之N -乙 醯化物。再者,同時進行無N-乙醯化之LN苯甲醯胼衍生 物之調製。將50微莫爾之LN (生化學工業)充分乾燥,在 其中添加100微升之含有1〇〇微莫爾苯甲醯肼(東京化成)之 DMSO溶液,藉由超音波處理充分溶解醣類。在此加入8〇 微升之DMSO和20微升之醋酸充分攪拌後,反應液在90°C -38 本紙張尺度適用中國國家檩準(CNS) A4規格(210X297公釐) 1239336 A7 B7 五、發明説明( ) 加溫1小時,在加熱下,以離心濃縮機乾涸反應液後,在 殘渣中添加500微升之含有2M氫硼化鈉的25%乙腈水溶液 充分攪拌,在室溫中放置一晚。在反應液中加入純水500 微升後,滴下醋酸使反應溶液中和到pH在5附近為止。取 試驗管中中和溶液200微升,以離心濃縮機乾涸後,以 HPLC精製可得LN苯甲醯胼衍生物。任一個之HPLC條件皆 如下。 幫浦:LC6A (島津) 管柱:Asahipak NH2P-50 (4.6 厘米内徑 X 250 厘米)(Showa Denko)
溶劑A :乙腈/水,95 : 5 溶劑B :乙腈/水,1 : 1 流速:每分鐘1毫升 溫度:40°C 溶液梯度:30分鐘内溶劑B從0〜100% 測定:在270微米吸收 將精製之LN苯甲醯肼衍生物及N-乙醯化物各25微毫莫 爾,分別以5微升含有10%醋酸之DMSO溶液、5微升含有 30%醋酸之DMSO溶液、以5微升含有50%醋酸之DMSO溶液 溶解,在37°C下加溫一個晚上,溶液乾涸後,以5微升純 水再溶解,此後將0.5微升點到HPTLC (Merk)中,用80%乙 腈水溶液展開後,以地衣齡硫酸法檢出中性St。 薄層層析之結果如圖1所示,同時圖1中,第1行是無處 理之L N苯甲醯肼衍生物、第2行是以含有10%醋酸之 -39- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1239336 A7 B7 五、發明説明( ) DMSO溶液中保溫之LN苯甲醯肼衍生物、第3行是以含有 30%醋酸之DMSO溶液中保溫之LN苯甲醯肼衍生物、第4行 是以含有50%醋酸之DMSO溶液中保溫之LN苯甲醯肼衍生 物、第5行是無處理之LN苯甲醯肼衍生物之N-乙醯化物、 第6行是以含有10%醋酸之DMSO溶液中保溫LN苯甲醯肼衍 生物的N-乙醯化物、第7行是以含有30%醋酸之DMSO溶液 中保溫LN苯甲醯肼衍生物的N-乙醯化物、第8行是以含有 50%醋酸之DMSO溶液中保溫LN苯甲醯肼衍生物的N-乙醯 化物之各個展開行列。 LN苯甲醯肼衍生物是於酸條件下的TLC上隨移動度之小 物質而變化,但LN苯甲醯胼衍生物的N-乙醯化物則完全 無變化,顯示出苯甲醯肼衍生物的N-乙醯化物之化學安定 性。 發明之效果 依本發明的話,是提供即使無單離之醣類,也可以決定 在其還原末端位置之單醣類的種類及取代位置之手段。 -40- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐)
Claims (1)
1239^=2—利_ ^ .一: 中文申°月專利範圍替換本(94年6月)| f '…力、更 六、申請專#~^ ~— 1· 一種肼基單醣類衍生物之製造方法,其特徵為至少包 含下述步驟: (a) 使具有還原末端之醣類與式⑴: NH2-NR1(R2) (I) [式中’ R是紫外或是可見吸光物質、螢光色素或是有 固定支持體做為其一部分之醯基,R2是氫原子] 所不之肼類反應而製造腙之步騾; (b) 將步驟⑷中所得之腙還原成胼基衍生物之步驟; 以及 (c) 藉由可分解醣甞鍵結之反應分解步驟⑼所得之 月井基衍生物’以得到胼基單醣類衍生物之步驟。 2·如申請專利範圍第1項之方法,在步驟(b)所得肼基衍生 物在進行步驟⑷之前,進行該肼基衍生物之N-乙醯 化° 3·如:請專利範圍第!項之方法,步驟⑼所得胼基衍生物 或疋N-乙醯化肼基衍生物在進行步驟⑷之前,使該肼 基衍生物之羥基甲基化。 4. -種鑑定在具有還原末端醋類中之還原末端單酷類及/ 或決定和還原末端單醣類之鄰接單醣類的鍵結位置之 方法’其特徵為至少包含下述步騾: (a)使具有還原末端之醣類與式⑴: 1239336 申請專利範圍 NH2-NR1(R2) (I) 古〜 R是紫外或是可見吸光物質、螢光色素或0 口 2支持體做為其一部分之醯基,R2是氫原子]弋有 斤示之胼類反應而製造腙之步騾; (b)將步騾(a)中所得之腙還原成肼基衍生物之步驟· ()知步驟(b )所得之肼基衍生物N -乙醯化之步驟· ()知步風(c )所得N -乙醯化之肼基衍生物的羥基甲 基化之步驟; ()藉由可分解_嘗鍵結之反應分解步驟(句所得之肼 基彳/T生物’以得到肼基單醣類衍生物之步驟; (f) 知步驟(e)所得之肼基單醣類衍生物完全乙醯化之 步騾;以及 (g) 鑑定步騾(f)所得之完全乙醯化肼基單醣類衍生物 、决足與逞原末端單醣之鄰接單醣類之鍵結位置。 5·,申請專利範圍第4項之方法,其步驟(e)之鑑定是使用 氣體層析/質量分析(GC/MS)進行者。 驟 種具有還原末端醣類之標識法,其至少包含下述步 ⑷使具具有還原末端之醣類與式⑴ NH2-NR1(R2) (I) [式中,R1是紫外或是可見吸光物質、螢光色素或是有 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規咯(210 X 297公釐)
申請專利範
支持體做為其一部分之醯基,r2是氫原子〗 不之肼類反應而製造腙之步驟; 以將步驟(a)中所得之腙還原成肼基衍生物之步驟; (0將步驟(b)所得之肼基衍生物N-乙酿化之步驟。 :種耕類·,其係、如中請專利範圍第^項之方法中所使 NHrNR» ⑴ [式、中R疋紫外或是可見吸光物質、螢光色素或是有 =疋支持體做為其一部分之醯基,r2是氫原子]所示 8.―種胼基單醣㈣生物之製造用套组,其特徵是含有 如申請專利範圍第7項所述之肼.類。 9_ 一::監定在醣類中之還原末端單醣類及/或決定和還原 末端早醣類之鄰接單醣類的鍵結位置用套組,其特徵 是含有如申請專利範圍第7項所述之肼類。 ίο. 一種具有還原末端醣類的標識用套组,其特徵是含有 如申請專利範圍第7項所述之胼類。 " 11. 一種式(in)所示醣類: (III) R4-N(Ac)-NHR1 -3- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 8 8 8 8 A BCD 1239336 六、申請專利範圍 [式中,Ac為乙醯基,R1是紫外或是可見吸光物質、螢 光色素或是有固定支持體做為其一部分之醯基,R4為 可與醣類具有醣苷鍵結且在1-脫氧醛式醣之C-1位鍵結 之氫被除去之基或是與2-脫氧酮式醣之C-2碳原子鍵結 之氫被除去1個之基,但是不包含下述情形:R1為乙醯 基,並且R4不具有與醣類之醣甞鍵結且在1-脫氧醛式醣 之C-1位鍵結之氫被除去之基或是與2-脫氧酮式醣之C-2碳原子键結之氫被除去1個之基者]。 -4 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐)
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