1223002 A7 B7 五、發明説明（巧） 本發明的範圍 本發明關於植酸酶之製備方法及配方法以及它們在製 備用於動物飼料中之飼料酶顆粒上的用途。 本發明的背景 在動物（如：家畜）飼料中使用不同的酶（如：植酸 酶）已是愈來愈普遍了。飼料中含有這些酶可以用來改良 養分或使動物能自飼料中攝取礦物質，並且也可幫助消化 。它們通常是由工業上的酶製造廠在大型發酵器中培養微 生物而製造出的。在發酵結束後，所產生的、、肉湯〃通常 再繼續進行一連串的過濾步驟以自所需要的酶（於溶液中 )中分離出生物團（該微生物）。然後，該酶溶液或者以 一種液體型態（通常是在加入不同的穩定劑之後）販售或 者製成乾燥配方後再販售。 酶的液體配方及乾燥配方通常是用於動物飼料工廠之 商業生產中。液體配方可在飼料做成小粒後再加入飼料中 以避免酶受熱而去活化，此種因受熱而去液化的作用可能 會在製做小粒的過程中發生。 乾燥配方通常會牽涉到蒸汽粒化的過程，在此過彳呈φ ’飼料是先進f了蒸汽注入再被粒化。接下去，在粒化步驟 中，飼料被強制通過一個鑄模或是印模，然後，將所產生 的條形物切成不同長度之合適的小九。在此過程中濃度胃 能會上升至6 0〜9 。 植酸酶是一群將植酸鹽（肌肉-肌醇六磷酸鹽）水解 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -4- 1223002 A7 B7 五、發明説明（2 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 成肌醇及無機磷酸鹽的酶（至少部分是）。這些酶可在麥 麩、植物種子、動物小腸中發現，且可以由微生物製造。 由於植酸酶可降解植酸鹽，因此，將它們添加於動物飼料 中可以增加動物對磷及其它養分的利用率。植酸酶也可增 加鈣的可消化性。 磷爲一種有機物生長的必須元素。對家畜而言，飼料 中常添加無機磷以使單胃動物的生長較好。然而，在反舞 動物之飼料中通常不需添加磷，這是因爲：在瘤胃中的微 生物可製造一種酶’此酶能催化植酸鹽轉化成肌醇及無機 磷酸鹽的反應。植酸鹽的分解通常是有需要的，因爲當植 酸與有用的礦物質螯合（如鈣、鋅、鎂及鐵）時會發生抗 養分的作用，而且可以與蛋白質逆反應因而降低了動物對 這些蛋白質的利用率。加入植酸酶也可降低必須加入之無 機飼料的量，如此在肥料中含有較少的磷排出，也因此對 環境較有利。 經濟部智慧財產局8工消費合作社印製 不问植酸酶的基因已被克隆化並且被表現出來。在 E P — A — 0，4 2 0，3 5 8 (吉斯特—布洛卡德）中 說明了微生物植酸酶的表現。 在一篇稍晚的申請案EP— A—0 6 8 4，313 ( 霍夫曼一拉洛克）中說明了一段D N A序列，比序列負責 編碼帶有植酸酶活性的不同的多核苷酸。 EP— A — 0，758，018 (吉斯特—布洛卡德 )是有關於酶之穩定性的改良方法，尤其是那些可做爲動 物飼料的酶，並且也與植酸酶有關。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇><297公釐） -5- 1223002 經濟部智慧財產局8工消費合作社印製 A7 ______B7五、發明説明（3 ) W〇—A — 9 4 / 0 3 6 1 2 (艾爾可）說明在木黴 屬中植酸酶降解酶的製造，而W〇—A - 9 7 / 1 δ 〇 7 6 (諾瓦諾狄斯克）說明了含酶製品在製造含有 不同疏水性物質之動物飼料中的用途。 動物飼料是飼養家畜及其它動物最大的花費之一。還 有’添加劑如：植酸酶之類的酶，也會使動物飼料的花費 顯著增加。本發明的目的之一是提供製備起來較爲便宜的 植酸酶組成物。這可經由成功製造高活性或高度濃縮之植 酸酶組成物來達成。有許多因素使本申請者能製造這些高 活性組成物，而這些將在稍後加以討論。 本申請者也注意到成功製造高活性植酸酶組成物還有 一個附加利處亦即是··這些組成物之穩定性會明顯增加， 尤其是在製備動物飼料（小九）的粒化過程中，因此，此 種組成物也較先前技藝中之組成物可能保有較高的植酸酶 活性。 本發明的說明 本發明的第一個方向是提供一種製備方法以用來製備 含植酸酶之水溶性液體，此方法包括： (a )在水溶性培養基中培養一種麯黴菌屬或木黴屬 的微生物，此微生物具有一異種（如：對宿主而言爲外來 的）的植酸酶基因，而且，此培養是在能使植酸酶產生重 組表現的環境中，於葡萄糖澱粉酶（對麯黴屬而言）或纖 維雙水解酶）（對木黴屬而言）的控制下生長，其中所使 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -6 - 1223002 A7 __ B7 五、發明説明（4) 用之培養基（做爲微生物的飼料）含有一種可同化的碳源 及可同化的氮原； (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) (b )將水溶性培養基加以過以去除微生物得到一種 水溶性的過濾液；及 (c )將來自（b )的過濾液進行超濾作用以產生一 種水溶性液體’其植酸酶濃度至少爲1 4，0 0 0 F 丁 U /克。 此方法可在所產生的水溶性組成物中提供一種特別高 的植酸酶濃度。這使得其它的植酸酶組成物製劑也具有高 活性，這表示：此方法不僅較爲低廉（對每單位之酶的活 性而言），而且，所產生之含有較高濃度的植酸酶的組成 物也發現較它們較低濃度之相對物來得穩定。 較佳之微生物種爲：黑麯黴，米麯黴或Trichoderma 「eesei對麯黴菌屬生物而言，植酸酶基因適合在葡萄糖澱 粉酶（或澱粉解苷酶）啓動因子的控制下。對木黴屬生物 而言，使用纖維雙糖水解酶啓動因子較佳。 經濟部智慈財產局員工消費合作社印製 可同化的碳源可包含葡萄糖及/或麥芽糊精，且/或 可同化的氮源可包含銨離子。葡萄糖及銨離子在水溶性培 養基中可爲僅有的可同化的碳或氮源。也就是說，不必使 用複雜的碳或氮源。銨離子可以氨或一種銨鹽的方式提供 。較佳之銨鹽包括硝酸銨，硫酸銨及磷酸銨。 在發酵過程中，用來補充培養培養基營養的爲較佳的 碳及/或氮源。當微生物消耗此二種營養源時，補充此二 種營養源的速度大體上是相同時。因此碳及/或氮源可以 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 1223002 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明説明（5 ) 連續方式來提供。碳及氮源可以分開提供也可以一同補充 〇 所產生之水溶性液體’其植酸酶濃度至少爲 16000FTU /克，而且可能爲18，000或更多。 在這些情況下，藉著這些特別的生物，該過濾液可以 變成相當的濃。這使得過濾液可進行超濾作用在某些先前 技藝的方法中，所產生的過濾液含有太多碎片及其它物質 以致於不能進行超濾作用（過濾器阻塞故障）。然而，在 本發明的方法中，過濾液非常的 ''乾淨〃，這使得過濾液 可進行超濾作用，而不需將它做任何進一步的處理，而且 ，藉著超濾作用可得到特別高濃度的水溶性組成物。 先前技藝中的方法曾討論到將過濾液或水溶性組成物 進行結晶化作用及/或除色步驟，例如：木炭過濾法。然 而，這二種附加步驟（此步驟會增加製備植酸酶的花費） 在本發明中可以免除。 較適合的情況爲：使用的微生物不具有，或者是至少 不會表現出葡萄糖澱粉酶基因。這表示該微生物可提供較 多能量於植酸酶的製備過程中。 該微生物可能具有多重複製的植酸酶基因，而這可增 加植酸酶的製造量，因爲它可表現出較多的植酸酶基因。 水溶性組成物大體上可不含高峰澱粉酶。 在本發明的方法中，較佳的情況：（大體上）所有的 碳及/或氮源在過濾作用前已被微生物消耗完畢，這種情 況可在最後一次補充碳及/或氮源後，使發酵作用再繼續 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) •訂 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -8- 1223002 A7 B7 五、發明説明（6) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 一段時間來達到。或者，可在所有的碳及/或氮源加入後 ’使發酵作用繼續進行至不再發酵。此種情況的好處理是 :該水溶液組成物可（大體上）不含碳及/或氮源（如： 葡萄糖及/或銨離子）。再重覆一次，此種情況可得到一 種較乾浮的水溶性液體，此液體可能含有較少的副產品。 藉著減少副產品的數目便可將處理步驟的數目降至最少， 而這些步驟是爲了能夠使用水溶液液體或得到所需要之較 高的植酸酶活性時所必需的。 最佳生物爲黑麯黴，而較佳之情況是：其植酸酶在是 表現在帶有一個葡萄糖澱粉酶信號序列的微生物上。 然後，所產生之水溶性含植酸酶液體可用於許多目的 中，雖然，將它加入動物飼料中爲本發明最特別的目的。 本發明的第二個方向是關於此水溶性液體（如：可由第一 個方向的方法製備的液體）中含有：至少爲1 4，000 F Τ ϋ /克的植酸酶飼料濃度。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 所述之ν'植酸酶〃一詞，不僅是指天然的植酸酶酵素 ’還包括了具有植酸酶活性的任何酶，此植酸酶活性是指 如：可催化無機磷（磷酸）自肌肉-肌醇磷酸鹽（myoinositol phosphate) 中移除或釋出之相 關反應 的能力 。較 合適的情況爲：該植酸酶係屬於E C 3 · 1 · 3 · 8的群 體。植酸酶本身最好是一種黴菌植酸酶，如：自麵黴菌種 或木黴菌種中衍生出的植酸酶。 本發明也提供用來製備顆粒形式之植酸酶配方的方法 ’此方法是利用一種可食用的糖類聚合物做爲載媒劑。此 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -9- 1223002 經濟部智慧財產局員工消f合作社印製 Α7 Β7 五、發明説明（7 ) 載媒劑可以爲小顆粒或粉末的形式。含植酸酶的水溶性液 體（如一種溶液或泥漿）可以與固體載媒劑混合並吸附在 載媒劑上，在混合時或混合後，含植酸酶的液體及載媒劑 被製成顆粒然後再將它們加以乾燥。糖類載媒劑可使大量 組成物吸附於其上（因此，植酸酶也可吸附於上）。該混 合物可用來形成一種塑性糊或非彈性糰塊以直接製成顆粒 (如：這些糊狀物及糰塊可被揉擠）。合適的載媒劑爲非 纖維性的，如此較易進行顆粒化作用，而纖維性物質則會 阻礙經由揉擠來製作顆粒。 先前技藝的文件中有許多是關於含不同種酶的小九， 但這些小九的甩途是做爲淸潔劑，通常是含於淸用的組成 物中。相對的，本申請案找到在動物飮食中的用途且因此 緣故，本發明的顆粒是可食用的（由動物食物）並且最好 也能被消化。因此，本發明之小粒，顆粒及組成物當然不 含有肥皂’淸潔劑，及漂白劑或漂白劑化合物，沸石、連 結劑、塡充劑（T i 0 2，高嶺土，矽酸鹽，滑石粉，等2 )等許多物品不勝枚舉。 該可食用的糖聚合物應該要選擇動物所欲食用的種類 並且最好同時爲可消化的糖聚合物。該聚合物以含有葡萄 糖（如··一種含葡萄糖的聚合物），或（C 6 H i 〇〇5 ) η 單位較佳。較合適的情況爲：該糖聚合物含有α - D -吡 喃葡糖單位，直鏈澱粉（一種直鏈型（1 -> 4 ) α 一 D -葡聚糖）及/或枝鏈澱粉（一種側鏈型的D -蔔聚糖，它 帶有 α — D — 1 -（ 1 -> 4 )及 α — D ( 1 — 6 )側鏈） 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ---------Φ------1、玎_ --------#1 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -10- 1223002 Α7 Β7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明説明（8 ) 。澱粉爲較佳之糖聚合物。其它可以取代或者是除了澱粉 以外之較合適的含葡萄糖聚合物包括：α -葡聚糖，沒一 葡聚糖，果膠質（如：果膠）及肝醣。這些糖聚合物的衍 生物（如：醚類及/或酯類）也可以使用，但凝膠化澱粉 則通常避免之。適合的糖聚合物是那些不溶於水的聚合物 〇 在此處所說明的實施例中，所使用於爲玉米一、馬鈴 薯-及稻米-澱粉。然而，由其它來源（如：植物，如·· 蔬菜或榖物）而來的澱粉，如：木薯澱粉、木薯、麥子、 玉米、西米、裸麥、燕麥、大麥、山芋、帚蜀黍或葛粉都 一樣可用。類似地，天然型澱粉或改良型（如：糊精）澱 粉也都可用於本發明中。較合適的情形是：所使用的糖（ 如：潑粉）最好僅含少量或不含蛋白質，如：少於5 % ( W/W)(如：少於2% (W/W))以少於1 % ( w/W )較佳。 至少有1 5 % ( w/ w )的固體載媒劑可含有該糖聚 合物（如：澱粉）。然而，較合適的情形是少3 0 %之固 體載媒劑含有糖聚合物，理想情況是至少4 0 % ( w/w )。較有利的情況是，固體載媒劑的主要成分爲糖聚合物 (如：澱粉），例如··超過5 0 % ( w/w )，以至少 6 0 % ( w /w )較合適，以至少7 0 %較佳，而以至少 8 0 % ( w / w )較爲理想。這些重量百分比是以最後乾 燥顆粒中的非酵素成分的全部重量爲根據。 可被吸附在載媒劑上之含植酸酶液體的量通常受限於 可被吸附的水量。對天然，顆粒狀之澱粉而言，此纛在不 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ 297公釐） 1223002 A7 _ B7 五、發明説明（9 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 提升溫度（這會使澱粉膨脹）的情況下是介於2 5〜3 0 % ( w/ w )之間。在操作中，加入糖中的酶液體的百分 比通常會較此數値高很多，這是因爲含酶液體通常會含有 多量的固體。該植酸酶溶液可含有約2 5 % ( w / w )固 體，因此，該糖類（如：澱粉）及植酸酶溶液可以以糖： 植酸酶溶液比爲0 · 5 ·· 1至2 : 1 (如1 · 2 : 1至 1 · 6 : 1 )的比例混合，如：各以約6 0 % ( w/w ) :4 0 % ( w / w )的比例混合。較適合於加入此固體載 媒劑中的液體量（大體上）是在（水溶性）液體中的全部 水都能被存在於固體載媒劑中的醣所吸收的量。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 於提高溫度的環境下，澱粉及其它糖聚合物可在未膨 脹的情形下吸附較多量的水。因此，糖聚合物較適合用來 吸收水份（或含酶的水溶液液體）。例如··玉米粉可在 6 0 °C下，吸收約其水重之三倍的量，並且在9 0 °C時， 可達1 0倍。因此，本發明預期可利用較高的溫度來吸附 更多量之含酶液體，並且這在處理熱穩定之植酸酶時確實 有較佳的效果。因此，對這些酶而言，可在提高的溫度（ 如：高於周圍溫度）下將固體載媒劑及液體進行混合，如 :高於3 0 °C的溫度，以高於4 0 °C較佳且理想狀況爲高 於5 0 °C。或者是或另外地，可以此種溫度來提供該液體 〇 然而，一般而言，較低的溫度（如：周圍溫度）所具 有的非-膨脹狀況是較好的，因爲這可將（熱敏感）植酸 酶在較高溫度下之不穩定性所產生的活性損失降到最低。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -12- 1223002 A7 B7 五、發明説明（10) 較合適的情況爲：酶與液體混合時的溫度是介於2 〇至 2 5 °C 間。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本發明中’將含植酸酶液體與固體載媒劑之混合物成 顆粒（換言之即爲、、顆粒化〃作用）的機械過程可藉著經 常用於食物、飼料及酶製劑過程中所使用的已知方法來進 行。這過程包括：膨脹、擠出、球形化、粒化、高速修剪 之顆粒化作用，鼓形顆粒化作用，流體床的凝聚作用或這 些作用的組合。這些方法的特徵通常是機械能的輸入（如 :螺旋推進），一種混合用的機械的旋轉，一種製九儀器 之滾動機械裝置的壓力，流體床凝聚器之旋轉底盤所造成 的顆粒移動或由氣流所造成的顆粒移動，或是這些機械作 用的組合。這些過程使固體載媒劑（如：在粉末的狀態中 )與含植酸酶的液體（一種水溶性溶液或泥狀液）混合， 然後再進行顆粒化。 經濟部智慧財產局8工消費合作社印製 本發明還有另一個體系是將含植酸酶的液體噴霧在載 媒劑上或包膜在載媒劑上，如：在一個流體床凝聚器內以 形成顆粒（團塊）。如此，所產生的顆粒可包含一塊如流 體床凝聚器所製造的團塊。 含植酸酶之液體與固體顆粒混合時最好還能將混合物 加以揉搓。這個動作可增進混合物的塑性以幫助顆粒化作 用的進行（如：擠出）。 如果是以擠出法來形成顆粒’最好是在低壓下進行。 這可使正被擠出之混合物的溫度不會或僅僅稍微增加。低 壓擠出法包括··在一個、、富士保杜（Fuji Paudal)的籃形 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210x297公釐） 1223002 A7 ______ B7 五、發明説明（Μ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 或圓頂形擠出器內進行擠出作用。較佳的情況是：擠出作 用不會使被擠出的物質的溫度上升至4 0 °C以上。擠出作 用可自然形成顆粒（顆粒在通過鑄鏡時可自行斷裂）或是 利用剪刀來製成顆粒。 較合適的顆粒約含3 0〜4 0 %的水含量（如：3 3 〜3 7 % )。酶含量則以3至1 0 % (如：5至9 % )較 合適。 所得的顆粒再繼續於一個球形器中（如： 、1\/1八卩01\/^尺13£81^〃儀器）進行_化（如：球形化）及 /或壓緊。這些顆粒可在乾燥前先球形化，因爲這樣可減 少在最後顆粒化時所形成的塵粉及/或可幫助任何顆粒的 色膜作用。 這些顆粒可在如：流體床乾燥器或是流體床凝聚器上 迅速乾燥（在凝聚器）以得到（固體、乾燥）顆粒。其它 在食品、飼料或酶工業中所已知用來乾燥顆粒的方法可以 由內行人士來進行。顆粒最好是可流動的。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 乾燥作用以在2 5〜6 0 t間（如：3 0至5 0 t ) 進行較佳。此處的乾燥作用可持續1 0分至數小時（如： 1 5至3 0分鐘）。當然，所需時間長度是根據需乾燥的 顆粒量所決定的，但通常是每公斤顆粒約1至2秒。 將顆粒乾燥之後，所產生的小顆粒以水含纛在3〜 1 0 %較佳（如··含5〜9 % )。 在顆粒下外加包膜可以給予顆粒附加的（如··有·利j白勺 特徵或性質，如：低塵粉含量、顏色、保護g每不受周圍環 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇><297公釐） -14 - 1223002 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 _ B7五、發明説明（12) 境影響，在圖一顆粒中的不同酶的活性，或上述之組合。 這些顆粒可以利用脂肪、蠟、聚合物、鹽、軟膏及/或油 膏包膜或以含有一（第二種）酶的外膜（如：液體）加以 包膜或以上述的組合進行包膜。所需要的數層（不同的） 包膜是否可以覆上是很容易知道的。有許多已知的方法都 可以甩來將包膜覆在顆粒上，這些方法包括使用下列機械 裝置：流體化的床、高速修剪製粒器，混合機製粒器，或 >諾塔"(Nauta)—混合器。 在另一個體系中還可將附加成分倂入顆粒中如··做爲 製作時的輔助品以進一步改良顆粒在小柱粒化時的穩定性 及/或保存時的穩定性。幾種這類之較佳的添加劑說明於 下。 鹽類也可包含於顆粒中（如：隨著固體載媒劑或液體 )，而以加入無機鹽類較爲合適（如：E P - A — 0, 7 5 8, 0 1 8中所建議的）此無機鹽類可用來改良 乾燥植酸酶製劑之製作過程及貯存時的穩定性。較佳的無 機鹽含有一個二價的陽離子，如：鋅、鎂、及鈣，硫酸鹽 爲最佳之陰離子，而其它可產生水溶解性的陰離子也都可 使用。該鹽類可以固體型式加入（如：加至混合物中）。 然而，這些鹽在與固體載媒劑混合前可先溶於水中或含酶 的液體中。所提供之鹽量以至少1 5 % ( w / w以酶爲根 據）較爲合適，如··至少3 0 %。然而，也可高到至少爲 6 0%或者其至爲7 〇% (同樣的，w/w以酶爲根據） 。這些量適用於小顆粒或粒狀物。因此，這些粒狀物可包 $紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） " -15- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1223002 A7 —____B7 五、發明説明（13) 含至少少於1 2 %的鹽，例如：從2 · 5至7 · 5 %，如 :從4至6 %。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 如果鹽是以含於水中的形式提供，則它的含量可在5 至30% (w/w)之間如：1 5至25%。 粒化時的穩定性還可藉著倂入下列化合物來做進一步 改良：疏水性、凝膠形成的或慢速溶解的（如：在水中） 化合物。這些化合物的含量可佔重量的1 %〜1 〇 % (以 水和固體載媒劑中的重量爲根據），如：2〜8 %，以4 〜6 %較佳。合適的物質包括：衍生的纖維素，如： HPMC (羥基一丙基—甲基一纖維素）CMC (羧基一甲基 一纖維素），Η E C (羥基一乙基—纖維素）；聚乙烯醇 (PVA);及/或可食用的油。可食用的油（如：大豆 油或ca η ο丨a 〇 i I )可以加入其中，以做爲製作的輔助劑，雖 然製作守則中有一條是最好不要有疏水性物質（如：棕櫚 油）的存在。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 這些顆粒的大小，分佈以較窄的範圍較佳（如··它們 爲單一分散的），如此可促使顆粒中的植酸酶及/或動物 飼料中的酶顆粒均勻分佈。本發明的方法傾向製造出帶有 窄範圍之大小分佈的顆粒。然而，如需要的，可在方法中 加入一個附加步驟以進一步窄化顆粒大小的分佈，如：篩 選。顆粒大小的分佈以介於1 0 0 // m及2 0 0 0 // m之 間較爲合適，以2 0 0 // m至1 8 0 0 // m之間較佳且以 3 ◦ 0 # m至1 6 0 0 v m之間較理想。這些顆粒可能爲 不規則形（但以規則形較佳），例如：接近於球形。 本紙張尺度適用中.國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -16- 1223002 A7 B7 五、發明説明（14) 其它適合的酶也可含於動物飼料（包括：寵物食物） 中。這些酶的功能通常是用來改良飼料的轉化率，如：藉 著降低某些飼料化合物的黏稠度或抗營養作用來改良$車專 化率。也可使用飼料酶，如：減少肥料中對環境有害的化 合物。用於适些目的之較佳的酶爲：糖酶，如：g粉分角军 酶及植物細胞壁降解酶，追些植物細胞壁降解酶包括：纖 維酶如：>5 -葡聚糖酶，半纖維素酶，如：木聚糖酶，或 半乳聚糖酶；肽酶，半乳糖苷酶，果膠酶，酯酶；蛋白酶 ，以帶有一中性及/或酸性的p Η値較理想；及脂肪酶， 以磷脂酶較佳，如：哺乳類胰憐脂酶A 2。較佳的情況爲 :這些酶不包含澱粉降解酶（如：澱粉酶）。在某些體系 中可能會排除蛋白酶，因爲這些酶在食入後可能引起傷害 。如果此酶爲一種植物細胞壁降解酶，例如··纖維素酶， 且尤其是一種半纖維素酶，如：木聚糖酶，則最後的顆粒 可具有3 ，〇00至100 ，000EXU/克的酶活性 ，以5000至80000EXU/克較佳，且以 8 0 0 0至7 0 0 0 0 EXU/克較理想。如果此酶爲一 種纖維素酶，如：/? -葡聚糖酶，則最後的顆粒可具有 500至15000BGU/克的酶活性，以1〇〇〇至 10000BGU/克較佳，而以1500至7000 B G U /克較爲理想。 這些顆粒可能含有5〜20%，如：7〜1 5%之酶 。此酶可爲天然的或重組的酶。 因此，根據本發明，一種較佳的方法包括： 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
I -一口 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -17- 1223002 A7 _____ B7 五、發明説明（15) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) a ·將水溶性之含植酸酶的液體與含有至少1 5 % ( w / w )的可食用糖聚合物的固體載媒劑加以混合（例如 :將該固體載媒劑與水溶性含酶液體混合）； b·隨意地揉搓所產生的混合物； c .將混合物顆粒化（例如：經由機械製作）以得到 含酶的顆粒，例如··利用一種製粒器或經由擠出作用製作 7 d.隨意地球化該顆粒； e ·將所產生的顆粒加以乾燥以得到一種含酶的顆粒 〇 在全部的過程中必須將酶所暴露的環境中的最高溫維 持在8 0 °C以下。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本發明的顆粒適合用於製備動物飼料。就本發明這方 面最廣的定義來說：此顆粒含有一種植酸酶及一種可食用 的糖聚合物，此顆粒帶有至少6 0 0 0 F T U /克的活性 。在此種方法中，這些顆粒與飼料物質混合時，它們或者 以此種形態混合或者爲預先混合物的一部分。根據本發明 之顆粒的特徵在於：它們可做爲適合爲動物飼料之混合物 中的一種成分，尤其是如果該混合物是以蒸汽處理並接著 進行粒化時。乾燥的顆粒可能可在這類小九中看得見或可 分辨出來。 因此，本發明的第三方向是關於製備動物飼料的方法 ，或是關於製備一種動物飼料的預先混合物或先質的方法 ，此方法包括將第二個方向之組成物與一或多種動物飼料 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐) ' -18- 1223002 A 7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明説明（Ί6) 物質（如：種子）或成分混合在一起。然後，將物質加以 無菌化，如：進行熱處理。然後，所產生的小九子使適合 製備成小九。 本發明的第四個方向是關於一種含有第二個方向之顆 粒的組成物，此以一種可食用的飼料組成物較佳（如：動 物飼料）。此組成物以小九形較佳（每粒小九中可能含1 〜5，如：2至4顆乾燥顆粒）。 較合適的爲，該組成物中含〇 . 0 5至2 · 0 (如： 〇· 3至1 _ 0 ) F T U /克之植酸酶，以〇 _ 4至 0 · 6 F Τ ϋ /克較爲理想。木聚糖酶的存在量可從 0 · 5 至 50EXU/克（如：1 至 4 0EXU /克）。 或者是組成物中可含0 . 1至1 . 0 B U G /克（如： 0·2至0.4BGU/克）的纖維素酶，或者也可除了 木聚糖酶外再外加此含量的纖維素酶。 本組成物的含水量是從1 0至2 0 % (如：從1 2〜 1 5 % )。酶的含量較適合從0 · 0005至0 · 0012% (如 :至少 5 ρ p m )。 本發明的第五個方向是關於促進動物生長的方法，此 方法包含餵食動物一種含第二個方向之組成物或第四方向 之組成物。此處，該動物的飮食可包含顆粒本身，或存於 飼料中的顆粒。 本發明的第六個方向是關於該組成物在動物飼料中的 用途或是做爲動物飼料中之一種成分的用途或者是關於該 組成物於動物飮食中的用途。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -19- 1223002 A7 ____B7 五、發明説明（17) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本發明的第7個方向是關於一種下列說明之組成物的 用途：此組成物至少含有1 5 % ( w / w )之可食用的糖 聚合物來做爲植酸酶的載媒劑以改良植酸酶粒化時的穩定 性。 適合使用本發明組成物的動物包括：農場上的動物（ 豬，家禽，家畜），非一反芻動物或單胃動物（豬，雞， 家禽，水生動物，如：魚）反芻動物（牛或羊，如：母牛 ，綿羊，山羊，鹿，小牛，羊）。家禽包括：雞，母雞及 火雞。 本發明之某一個方向中的較佳特徵和特性都可應用在 另一個方向中。 下列實施例僅用來說明本發明而非用來限制本發明。 實施例 實施例1
Ift 黴（Aspergillus nicier)CBS51 3.88 之醱醆 依標準技術製備麯黴的黴菌孢子製劑。 經濟部智慧財產局Μ工消費合作社印製 先將孢子、然後將細胞移入★艾林梅爾〃（ Exlenmeyer)三角錐瓶中經過一系列之發酵作用而成爲 1 〇升的發酵物。在分批培養中生長後，將此發酵物用來做 爲最後爲5 0 0升之發酵物的接種物。 所使用的培養基包括：9 1克/升玉米粉（B D Η化 學公司）；銨38克/升葡萄糖：水；〇.6克/升 MgS〇4.7H2〇；0.6g/l KC1 ;〇.2 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210><297公釐） -20- 1223002 A7 B7 五、發明説明（18) 克/升F e S〇4 · 7 Η 2〇及1 2克/升K N〇3。將 Ρ Η値以4 Ν ν a〇Η或4 Ν Η 2 S〇4利用自動_疋機 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 維持在4 · 6 ± 0 . 3左右。 · 讓細胞在2 8 °C下生長’其中之空氣環境是在自動儀 器控制下將溶解的氧氣控制在2 5 %的空氣飽和度。植酸 酶產物在1 0天的發期後達到5〜1 0 U//毫升的最大濃 度。 以硫酸銨取代玉米澱粉（以產生等克當量之可同化的 氮含量）。 實施例2 植酸酶的純化和特徵化：植酸酶活性分析 將1 0 0 // z之肉湯過丨慮液（當需要時加以稀釋）或 上淸液或1 0 0 之半水做爲參考加入具有下列組成物 的溫育混合物中： —0 · 2 5 Μ之醋酸鈉緩衝液Ρ Η 5 · 5，或 一甘氨酸H C 1 -緩衝液；ρ Η 2 . 5 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 一 1 m Μ植酸，鈉鹽 —至多900//<的半水 將所產生的混合物在3 7 °C下溫育3 0分鐘。加入1 毫升之1 0 % T C A (三氯醋酸）以終止反應。在反應終 止後’加入2毫升之試劑（此試劑是5 0毫升之含 3 ·66克FeS〇4·7H2〇的鉬酸銨溶液（2 . 5克 (ΝΗ4) 6Μ〇7〇24 · 4H2〇及8毫升之H2S〇4 ， 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -21 - 1223002 A7 B7 五、發明説明（19) 以半水稀釋成2 5 0毫升））° (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 在7 5 0 n m處以分光光度測定法測定藍色強度。此 測量結果是表示相關於磷校準線上（在〇〜1毫莫耳/升 的範圍中）的磷釋出量。 實施例3 A在經由表現介體轉化過之黑麯黴菌CBS5 1 3 · 86 中的植酸酶表現（該介體含有的無花果麯黴菌植酸酶基因 融合在黑麯黴菌澱粉葡萄糖苷酶（A G )基因的啓動因子 及/或信號序列上） 製備一種表現盒以取得黑麯黴菌中之植酸酶的過度表 現，在該表現盒中，無花果麯黴菌植酸酶基因是在合倂了 一段信號序列之黑麯黴菌澱粉葡萄糖苷酶（A G )啓動因 子的控制之下。在較長的領導序列中’該A G啓動因子序 列是融合在編碼植酸酶的序列上’此序列包括了該融合在 編碼成熟蛋白質之植酸酶基因片段的植酸酶領導序列（參 考 EP — A — 0，420，358 的實施例 10)。 經濟部智慧財產局g(工消費合作社印製 B ·在黑麯黴菌中，於A G啓動因子控制之下的植酸酶基 因的表現 藉著已知步驟，將黑麯黴菌CB513 · 88 (與 Centraalbureau Voor Schimmelcultures(CBS)於 1 9 8 8， 1 0 ，1 0 —同貯存，Osterstraatl Posthus 273，NL-3740AG，
巴恩，荷蘭）以10# g之DNA片段進行轉化（如：見E P — A 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -22- 1223002 A7 _______B7 五、發明説明（2〇) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 一 〇 ’ 4 2 0，3 5 8的實施例9 )。將由各表現盒而之單 一黑黴菌轉化株分離出來並將孢子在選擇性的乙醯胺一瓊 脂盤上劃線。自，在3 7 °C下，於0 _ 4 %馬鈴薯一右旋 糖（歐孛，英國）瓊脂盤中生長三天的細胞中收集各轉化 株的孢子。於下列情況下，在搖動的三角錐瓶中測試植酸 酶產品。 將約1 X 1 〇 8個孢子接種於1 〇 〇毫升的事先培養液 (每公升）中：1克KH2P〇4，30克麥芽糖，5克酶 萃取物；10克酪蛋白水解物；〇 · 5克MgS〇4. 7 Η 2〇及3克、、吐溫8 0 〃 。將ρ Η値調爲5 _ 5。 在一個旋轉搖動器中，於3 4 °C下生長一夜後，將1 毫升之生長中的培養接種於含下列物質的主要培養中（每 升）：2克KH2P〇4; 70克麥芽糊精（rnaldex MDCb， 艾米蘭（Amy lum) ; 12 · 5克之酵母萃取物；25克酪蛋 白水解；2克k2s〇4; 5克MgS〇4. 7H2〇； 0.03 克 ZnCl2;〇.〇2 克 cAcL2;〇.〇5 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 克Μη S〇4 · 4H2〇及F e S〇4，此pH値則調整爲 5.6° 讓該菌絲體至少生長1 4 0小時，再將植酸酶產物依 實施例2中的說明來進行測量。用等量之葡萄糖及硫酸銨 做爲碳及氮的來源以重覆進行發酵作用。將肉湯加以過濾 以得到與生物團開的濾液。利用表現盒P F Y T 3 ( A G -啓動因子/植酸酶領導）可得2 8 0 U /α之最大植酸 酶活性。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS「A4規格（210x297公釐） ~ -23 - 1223002 A7 B7 五、發明説明（21) 竇施例4 自過濾液中純化植酸酶 製備高度純化的植酸酶的步驟如下： 1 .在p Η 4 · 9處進行陽離子交換層析法 2 ·在ρ Η 3 · 8處進行陽離子交換層析法 3 ..在ρ Η 6 · 3處進行陰離子交換層析法 4 .超濾作用 1 ·以水將植酸酶過濾液稀釋2 0倍並將Ρ Η値定在 4 · 9。將物質通過S塞佛洛斯〃快速流動分析柱並以 2 0 m Μ檸檬酸/ N a〇Η ρ Η 4 · 9緩衝液平衡之。 將帶有植酸酶之未結合的物質收集起來以用於下一步驟。 2 .將ρ Η 4 · 9的物質調整爲Ρ Η 3 · 8，且該植酸酶 會結合在以2— mM檸檬酸/NaOH PH3 · 8緩衝 液平衡的、S塞佛洛斯〃 （S Sepharose )快速流動分析柱 上。以 20 m Μ N a Ρ 0 4 j 5 0 m Μ N a C 1 pH 7 · 6緩衝液將植酸酶洗提出。 3 .將從第二陽離子交換步驟中收集而來的植酸酶分液的 pH値調整爲6_3並以1〇ηιΜ ΚΡ〇4$ΡΗ6·3 緩衝液平衡'^0塞佛洛斯〃 （Q Sepharose)快速流動分析 柱，使植酸酶結合於上。在同種緩衝液中，利用至1 Μ N a C 1的梯度率將植酸酶洗提出。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNSM4規格（2丨0X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) --口 Γ 經濟部智慈財產局Μ工消費合作社印製 -24- 1223002 A7 B7 五、發明説明（22) 純化結果摘要 樣本 純化因子 起始過濾液 1 陽離子交換後pH4.9 1.07 陽離子交換後PH3.8 1.2 陰離子交換後 1.46 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 在3巴下，以一帶有、'卡利〃 （KalU ) E35膜的 ''艾 米庚攪拌的小室〃 'Amicon Strired cell〃（2升單位）來將含 1 0 m g蛋白質/毫升的最後產物（陰離子交換的）進行 超璩作用，以1 0倍濃縮此最後產物。 純化的植酸酶，其最後濃度可達2 8 0〜3 0 0克/ 升（28〜30%)。此最後純化之產物帶有100FU /毫克蛋白質的特定活性，因此可得到2 8 0 0 0〜 3 0 0 0 0 F T U/克的植酸酶活性。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 實施例5 高活性植酸酶穩定性的測試 爲了證明較高濃度之酶（存在於以高活性植酸酶液體 製造的顆粒中）具有較高之粒化穩定性，製一些逐漸增加 酶濃度的顆粒並測試這些樣本的粒化穩定性。 比較性樣品A :以混合、揉搓、擠出、球形化及乾燥 等作用來製備以玉米澱粉爲基質的低活性酶顆粒。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇>< 297公釐） ~ -25- 1223002 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 \Ί Β7 五、發明説明（23) 將7 3 % ( w / w )玉米殿粉及低濃度4 % ( w / w )植酸酶超濾液和2 3 % ( w / w )水混合在一起並加以 揉搓。利用一個、、尼卡E - 2 2 0籃形擠出器"（Nica E-220 basket extruder)將混合物擠出以得利濕的擠出物，此 擠出物再於一個'、Fuji Paudal Mai.umeriserTM 〃中進行球形 化作用2分鐘以得到平均直徑爲6 0 0 // m的圓顆粒。然 後，將這些顆粒於Glatt GPCG1.1流體床乾燥器中加以乾燥 。這些顆粒的最後活性爲6 1 0 F T U /克。 比較性樣品B :以混合、揉搓、擠出、球形化及乾燥 等作用來製備以玉米澱粉爲基質之中度活性的酶顆粒。 將7 0 % ( w / w )玉米殿粉及1 7 % ( w / w )植 酸酶超濾液和1 3 % ( w / w )水混合在一起並加.以揉搓 以製備混合物。利用一個、、尼卡E — 2 2 0 〃 （ Nica E-220 )籃形擠出器將混合物擠出以得到濕的擠出物，此擠出物 再於一個F u j i P a u d a 1 M a r u m e r i s e r τ M "中進行球形化作用 2分鐘以得到平均直徑爲6 0 0 // m的圓形顆粒。接著， 將這些顆粒在AGlatt GPCGL1〃流體床乾燥器中加以乾燥 。此顆粒的最後活性爲4 1 7 0 F T U /克。
樣品C 以混合、揉搓、擠出、球形化及乾燥等作用來製備以 玉米澱粉爲基質的高活性酶顆粒。 將6 7% (w/w)玉米澱粉及3 0% (w/w)之 於實施例4中所製備的植酸酶超濾液（但將它稀釋成 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） •衣------^1—-----0— (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -26- 1223002 A7 B7 五、發明説明（24* 18， 400FTU/克）及3%(w/w)水混合在一 起並加以揉援以製備混合物。利用一個、、尼卡；g 一 2 2 0 〃 （Nica E-220 )籃形擠出器將混合物擠出以得到濕的擠出 物’再將之置於一個、、F u j i P a u d a 1 M a r u m e r i s e r τ M "中進行 球形化作用2分鐘以得到平均直徑爲6 〇 〇 // m的圓形顆 粒。接著，將這些顆粒於一個、、Glatt GPCG1.1〃流體床乾 燥器中加以乾燥。此顆粒的最後活性爲6 8 3 0 F T U / 克。 粒化穩定性的比較 然後，將不同的酶顆粒進行一個粒化試驗並比較它們 的粒化穩定性。此粒化試驗是由下列步驟所組成，將酶顆 粒與一種飼料先預先混合，其濃度各爲1 5 0 0 P P m， 3 2 0 p p m及2 0 0 p p m。以蒸汽噴射法將這些混合 物預先處理使溫度達到7 5 °C，再於一個粒化機器中進行 粒化’以得到8 2 C下的飼料小九，然後再加以乾燥。此 種型式的方法是飼料工業製備飼料小九的典型方法。 經 濟 部 智 慧 財 產 局 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 表1摘要粒化試驗的結果。很明顯的，最高的二種酶 濃度的顆粒具有較高的粒化穩定性。 消 費 合 作 社 印 製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -27- 1223002
7 B 五、發明説明（25) 表1 粒{ i試驗的結果 樣品號碼 顆粒活性 於FTU/克 飼料溫度 (°C ) 小九溫度 (°C ) 粒化後的酶 產量（％) 比較樣品（A) 610 75 82 <17 比較樣品（B) 4，170 75 82 37 (C) 6, 830 75 82 48 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 實施例6 以混合、揉提、粒化及乾燥等作用來製備含大豆油及 M g S〇4 ◦等添加物之馬鈴薯殿粉爲基質的酶顆粒 在一個混合器1揉搓器中加入馬鈴薯澱粉3 0公斤及 大豆油2 . 5公斤。然後，將含有MgS〇4 . 7H2 ◦之 衍生自麯黴菌屬的植酸酶超濾液（1 4公斤之超濾液中溶 有3 · 5公斤之MgS〇4〇· 7H2〇）加入其中。在一 個揉搓器中將此產物充分混合，然後，在一個流體床乾燥 器（如實施例1中的）中進行擠出及乾燥。如此，可得到 具有5 8 7 0 F T U /克活性之產物。 實施例7 以混合、揉搓、擠出、球形化及乾燥等作用來製備以稻米 澱粉爲基質的酶顆粒 將6 2%(w/w)稻米源粉與3 8% (w/w)之相同 於實施例6中所使用的植酸酶超濾液混合在一起並加以揉 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 、-tv 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -28- 1223002 A7 B7 立、發明説明（2δ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 搓以製成混合物。利用、、Fuji PaudaT籃形擠出器將混合物 擠出以得到濕的擠出物，再將之於、、MARUMERISER τ M " 中進行球形化一分鐘以得到平均直徑爲7 8 5 # m的圓形 顆粒。然後，將這些顆粒於一個如實施例1中的流體床乾 文架器中加以乾燥。此顆粒的最後活性爲7 2 8 0 F T U / 克。 實施例8 以混合、揉搓、擠出、球形化及乾燥等作用來製備含 Η P M C添加物之以玉米澱粉爲基質的酶顆粒 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 將含5 4% (w/w)之玉米澱粉，5%之HPMC (經基—丙基一甲基一纖維素）及4 1% (w/w)之於 實施例6中所使用的植酸酶超濾液的混合物加以揉搓以製 備酶的製劑。利用〜Fuji Paudal〃籃形擠出器將混合物擠出 以得到濕的擠出物，再將之於''marumerisertm〃中進行 球形化1分鐘以得到平均直徑爲7 8 0 // m的圓形顆粒。 然後，將這些顆粒於一個流體床乾燥器中，在床溫度爲 4 0 °C，入口溫度爲7 5 °C的情況下進行乾燥2 0分鐘。 如此，可得到具8 4 7 0 F T U /克活性之乾燥酶顆粒。 實施例9 以混合、揉搓、擠出、球形化及乾燥等作用來製備含 Η E C添加物之以玉米澱粉爲基質的酶顆粒 將5 4% (w/w)之玉米澱粉與帶5%HEC (羥 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210><297公釐） -29- 1223002 A7 __ _B7_ 五、發明説明（27) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 基一乙基—纖維素）之4 1 % ( w / w )的植酸酶超濾液（同 於實施例6中所使用之超濾液）混合在一起並加以揉搓以 製備一種酶的製劑。利用\、Fujl Paudal"籃形濟出器將混合 物擠出以得到濕的擠出物，並將之於、、MARUMERISER τ M 〃中進行球形化1分鐘以得到平均直徑爲7 8 0 // m的圓 形顆粒。然後’將這些顆粒於流體床乾燥器中，在床溫度 爲4 0 °C ’入口溫度爲7 5 °C的情況下乾燥2 0分鐘。如 此’可得到具有8 4 1 0 F T U /克活性的乾燥酶顆粒。 實施例1 0 使用並稀釋衍生自實施例4之超濾液的具1 8 0 〇 〇 F T U /克活性的超濾液。 樣品 3種已製備好之樣品的活性分別爲6 1 0 ( A，比較 經濟部智慧財產局K工消費合作社印製 性）；4 1 7 0 ( B，比較性）及 6 8 3 0 ( C ) F 丁 u /克。這三種樣品可分別製得活性各爲1 . 1 5 3， 1 . 685 ’ 及 1 · 745FTU/克之飼料。 將1 5 0克之第一種樣品與下列說明之2 0公斤飼料 混合在一起。然後，將此預先混合物與8 0公斤飼料混合 在一起並均分成二部分以用於二種不同溫度下的試驗。將 1 5 3 . 6克之第二種樣品與2 0公斤飼料混合再將它均 分成各爲10 · 076公斤之二等分。然後，將各份與 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） -30 1223002 A7 B7 五、發明説明（28)2 3 〇公斤的飼料混合均勻以獲得測試用的餐點。 將…… …一…,分成二部份，各爲1 〇 克之第三種顆粒樣品與2 0公斤飼料混合並均 3 0 公斤。將各部份與 爲6 0 0公 力w —部份，各爲1 〇 . 〇 4 8公斤。將谷卻 公斤飼料混合以得到測試用的餐點。粒化速度 斤/小時。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製
Siil混合物包含： 玉米 20.00% 麥 30.00% 大豆（加熱過的） 10.00% 大豆（粗食46.7/3.7) 18.20% 澱粉質食料（芡粉）（65%澱粉） 6.97% 動物餐點（56.5/10.9) 4.00% 魚餐點（70.6%re) 1.00% 鳥類餐點，h y d e. 1.00% 大豆油/玉濁黍油 1.30% 動物脂肪 4.00% 維生素/礦物質預先混合物（玉蜀黍） 1.00% 碳酸鈣 0.85% 磷酸-鈣 1.05% 鹽 0.26% 1-賴氨酸-HC1 0.16% DL·蛋氨酸 0.21% (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -31 - 1223002 A7 _B7 __ 五、發明説明（29) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 然後，將三種混合物進行粒化’將飼料送入調和器 此處會有直接氣流加入餐點中。溫度上升至7 5 °C後’使 該餐點離開粒化器，這是經由將餐點推送通過一個帶有5 毫米大小的洞及6 5毫米厚的模盤來達成的。在此處，飼 料溫度又上升了 4 °C達到了 7 · 9它。 該二種飼料之活性爲1 0 · 1 1 ( A ); 1 0 · 0 4 (B )及 9 . 8 1 ( C )。 此用來測試剩餘活性之測試的結果爲··相對於原來活 性爲6 1 0，4 1 7 0，6 8 3 0 F T U /克的樣品’其 剩餘活性分別爲6 3 ( A ) ; 6 6 ( B )及7 2 % ( C ) 。這顯示出：即使是帶有類似的活性（B及C ) ’但具有 最高活性的配方（本發明中的C，6 _ 8 3 〇 F T U /克） 仍具有高出很多的粒化穩定性。樣本C的剩餘活性比例較 (比較性）樣本B之剩餘活性比例高出6 % ’而樣本B僅 較A之剩餘活性比例高出3 %，但由樣本A至B卻有非常 大量的活性增加（6 1 0至4 1 7 0 F T U /克）。 經濟部智慧財產局K工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇>< 297公釐） -32-