TW490468B - PCR primers for specific detection of Salmonella typhimurium - Google Patents

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490468 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 發明說明（I) 發明領域 本發明係有關新穎引子其係利用分 克雷伯氏循環(Kreb，s cycle)中的生物體白具有的 之差異，而設計出二酶之基因序列 ㈣—）檢測用之聚合酶鏈反應用子(^ ® (制所· =r=方:_使用本二== 菌感染疾病的主要沙門氏菌屬。 技術背景 沙門氏菌引起的食物中毒及沙門氏菌感染(Sal_eii0sis infection )中’重要的沙門氏菌屬有，鼠傷寒沙門氏菌(仏 妙/^η·麵）、傷寒沙門氏菌⑻/w _〇、腸炎沙門氏菌卿肌 ⑼妙/似的，這些血清型的沙門氏菌，在世界各國的主要病原 菌中皆佔重要地位。 / 、 上述寒4門氏囷之傳統檢測方法，包括有預培養， 選擇性培養基培養，選擇性洋菜膠培養基畫線培養與區分，<可 疑®落之生化鑑定，以及血清學試驗等步驟，所需時間至少5_ 7天；在食物中毒及沙門氏菌引起的食物中毒及感染時，對致 病菌的瞭解上緩不濟急。 一般聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction ) (PCR)，應 用於不同樣品中細菌及病毒的檢測，極為快速可靠。在所有血 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 裝--------訂--- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 五、發明說明（>0 清型沙門氏菌(秘猜心serovars)中，傷寒沙門氏菌，以 炎沙門氏菌已有ΡΟΓ引子見諸文獻，但是鼠傷寒沙門氏菌之 PCR檢測㈣子（piWs)酶少見敎獻與專利。 目岫的技術水平，相關的文獻與專利報告，敘述如下： a:沙門氏菌檢測相關專利報告；⑴美國專利568侧（撕) 其PCR引子應用於所有沙門氏菌血清型的檢測，·卩）美國 專利5824795 (1998)係關於PCR檢測腸炎沙門氏菌及s· bongon二（3)美國專利57M321 (腫）係發展所有血清型 沙門氏菌檢測狀核賊探針；（4)美國專利58〇4378 (1988)為相關沙門氏菌屬檢測用之核苷酸序列；（习美國 專利568Π16 (1997)為傷寒沙門氏菌檢測用之核苷酸序 如以上所述專利，雖然相關於沙門氏菌及鼠傷寒沙門氏 囟除外之其他沙門氏菌的DNA探針與PCR方法已有專利； 但相關於鼠傷寒沙門氏菌PCR檢測者則幾未見。 b:=究報告方面··⑴〇lsen et al (1995)曾發表對沙門氏菌及 鼠傷寒沙門氏菌檢測用之募核苷酸探針(〇lig〇nude〇ti如 probe)，此探針係源自一段選殖出的2JKb DNA片段的序列 而a又计’但此探針係利用於鼠傷寒沙門氏菌的dna_dna雜 父之檢測用；（2) Rahn et ai (1992)曾以鼠傷寒沙門氏菌的 invA基因序列發展所有血清型沙門氏菌之檢測用pCR方 法；（3)C〇c〇linetal(1998)曾發展PCR方法，可檢測33種 血α型的沙門氏菌；若配合限制酶水解分析，則可檢測其中 的鼠傷寒沙門氏菌；（4) Miyamoto等人（1998)則曾利用 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 州468 A7 ^ S---—--~___________ 五、發明說明（1 ) RAPD的方法，檢測沙門氏菌，包括袁傷寒沙門氏菌菌株； (5)C〇henetal(1996)曾利用鼠傷寒沙門氏菌的厂以八基因序 列ό又e十出PCR方法’用以檢測所有血清型的沙門氏菌菌株， 並用於食品之檢測；（6) Stone et al (1995)則曾利用PCR-雜 交方法檢測鼠傷寒沙門氏菌，但亦非直接使用pCR檢測之 法；（7) Tuchili et al (1995)利用InvA基因之PCR方法檢測 感染雞沙門氏菌(&z/m· ga//z>7an/m)或鼠傷寒沙門氏菌的雞 隻，但二種沙門氏菌血清型皆可檢出；（8) Nastasim及 Mammina(1995)，則利用PCR核糖定型法(pCR-诎〇帥_) 研九卷;^門氏囷的流行病株等；（9) way等人(1993)則 利用multiplex PCR的方法檢測沙門氏菌屬以及志贺氏菌屬 (Shigella)、大腸埃希氏菌(五⑺")、檸檬酸桿菌屬(伽—_ spp)等；（10)此外，免疫-PCR的方法，亦已被發展來檢測 所有血清型沙門氏菌種.(Fluit 以 a/ 1993; Widj〇j(DatmQdj() etal. 1992) ’ （11) Kong et al (1995)及 Chary et al (1993)則曾利 用鼠傷寒沙門氏菌的腸毒素基因及芳香酶(Ar〇matase)(AR〇_ A)基因檢測水中的鼠傷寒沙門氏菌，但其特異性未進一步確 認。 本發明係根據生物體内克雷伯氏循環所必需的蘋果酸脫氫 酶(malic acid dehydrogenase)之基因(mdh)，其 DNA 序列與鼠傷 寒沙門氏菌具有的特定DNA序列，發展出二段pCR引子，可 成功的用於臨床樣品，如人類糞便檢體及食品，如豬肉、雞肉、 牛肉及牛乳類與蛋類中傷寒沙門氏菌之快速檢測。其dna序 列如下： 本紙張尺度適用中國國家標準（_CNS)A4規格（210 χ 297公^)------ — — — — — — — — — — I . I — 广請先間讀背面之注意事項再填寫本頁) 二π· 谓468 A7 B7 五 發明說明（f) MDH 31: 5，- T(3C CAA CGG AAG TTG AAG TG ， MDH2: 5'CGC ATT CCA CCA CGC CCT TC - 3， 本發明另提出一段檢測PCR產物之探針，其序列如下： STM 1 ·· 5，- GTC GCA GAT TCC AGG CGT AAG - 3， 本發明也提出一種鼠傷寒沙門氏菌之快速PCR檢測方法· 其包括使用上文所述引子對檢驗樣品實施之PCR反應。 圖式之簡略說明 以下所述為對本發明配合圖示之相關說明；其中 第一圖：（A)用PCR引子MDH31和MDH2偵檢鼠傷宸沙門氏 菌：（B)對得自(A)的PCR產物用32P_標幟探針8丁河1進行南方氏 點潰雜交。A道：100 bp階梯；b-i道：用表1中所示8種鼠傷 寒沙門氏S擴增出之PCR產物。j道：用大腸埃希氏賴株 的陰輯照。b’-z’道：圖A中的b_j道所得南方氏點漬雜交結果。 (請先閱讀背面之注咅P事i ▼4 ”填寫本頁) ------------ #- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 第二圖：訂CR引子MDHM和MDH2倾鼠絲沙門氏菌以 外的沙門氏菌株。a道：100 bp階梯；b_q道：用表丨中所示沙 門氏菌株擴增的PCR產物，亦即分別域株ST93(陽性對昭')’， SA04.1〇.1252〇.27.28.29；SB〇5,〇8)2〇,〇64；scl4, 15 ， 16 ， 25 〇 5 490468 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 五、發明說明（f) 第三圖：對於鼠傷寒沙Η氏菌⑻ST93株(ATCC 13311)和出)灯94 株(ATCC 19585)的PCR偵檢敏感度。實驗條件為，，方法，，中所述 者。a道：100 bp階梯；b-h道：用1〇5_1〇。和〇 cfii/檢定的鼠 寒沙門氏菌ST93(A)或ST94(B)擴增所得PCR產物。 另 第四圖：在用CTET肉湯預培養8小時後，對㈧經高溫殺菌過 的完全牛乳與(B)生完全牛乳進行鼠傷寒沙門氏菌之偵檢。&道： 100 bp階梯；}>h道：從1〇5-1〇。和〇也目標細菌每毫升牛 增所得PCR產物。 5 第五圖·對於用CTET肉湯預培養8小時後的雞肉樣品進行产 ，寒沙門氏菌(atcc mil)之偵檢。^ : 100bp階梯；b_h道^ 從10M0Q和〇 cfo目標細菌每毫升食物勻化物，亦即，每〇.1 食物樣品擴增的PCR產物。 · 圖·人類糞便樣品内的傷寒沙門氏菌(ATCC⑶⑴之代又

，測。㈧沒有預培養；⑻將目標細菌用CTET肉湯預培養8小 日"。實驗條件為，，方法，，中所述者。對於(A)，a道：_ bp DNA =梯；b-g道：從1〇M〇〇和〇(對照組响目標細菌每pcR檢定， =1〇Μ〇0和0 cfb目標細菌每〇1克糞便樣品擴增所得pcR :。對於⑻’ a道：觸bp DNA階梯；b_h道：從1〇5_1〇〇和 W照組)咖目標細菌每αι克糞便樣品擴增所得pcR產物。 賴g株包括鼠縣沙門氏菌8株，臨床鼠傷寒 "門氏困囷株45株（來自預防醫學研究所，ISMM5 )，其它 ----^----‘----裝---- C請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁) 有---------· 木紙張尺度翻中規格⑵0_ χ 297公茇） A7 A7 五 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 發明說明（G) 血清型之沙門氏菌菌株45株，以及桿菌屬(5acz7/奶)，檸檬酸桿 菌屬（Citrobacter)·，陽桿菌屬（Enierobacter)，歐文氏菌屬 (Erwinia)，哈矢尼镜餍（Ηαβήα)，免雪伯氏菌屬（KkbsieUa)， 尤/吵徽从微球菌屬（摩根氏菌屬（變 形菌屬（Pro伽4沙雷氏菌屬（志贺菌屬⑽扭//α),葡 萄球菌屬⑶印/^/〇c〇cci/4弧菌屬（附咖)，耶爾森氏菌屬 (等腸内菌或非腸内菌共28株（如表一、二）。 本發明所用的藥品：漠化乙錠(Ethidiumbromide)，十二：)：完基 硫酸鈉（Sodium dodecyl sulfate) ( SDS )，EDTA，Ficoll，聚乙烯基 吡咯酮（Polyvinylpyrolidone)及礦油係購自 Sigma (Sigma Chemical Company，St” Louis，Missuouri) ; 100 bp ladder marker 購自 GenSura(GenSura Laboratories，Inc·); Tris-驗，牛血清白蛋 白（BSA )，dATP，dTTP，dCTP 以及 dGTP 購自 Boeheringer Mannhein GmbH Biochemia ( Postfach, Mannheim, Germany ) ； T4 多核苷酸激酶（polynucleotide kinase)購自 Bio-Labs ( New England Bio Labs，Beverly，Massachusetts );尼龍膜（Nylon membrane)，τ -32P-ATP，X-射線底片（Hyper-film- /3 max )購自 Amersham ( Amersham International Inc.? UK );顯影劑及固定 劑購自 Kodak ;蛋白酶(Proteinase) K 購自 Merck ( Darmstadt, Germany );經超音波處理,1圭魚精子(Sonicated salmon sperm) DNA 購自 Stratagene ( UK ) ; Dynazyme DNA 聚合酶購自 FinnzymOy ( Riihitontuntie，Finland );瓊脂糖購自 Promega (Promega Corporation，Madison，Wisconsin，U. S· A·)。以上所列 藥品皆為試藥一級或分生級。 7 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -----1---、----裝---- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂---------線0· 490468 A7 B7 五、發明說明（ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本發明所用的培養基，分別説明如下： 1· Luria-Bertani 肉湯（broth) (LB) 酵母萃取物(Yeast extract) 5 g Tryptone 10 克 氣化鈉10克 蒸餾水1000毫升 2. CTET ( Combined Tetrathionate )肉湯 乳糖肉湯13克 硫代硫酸鈉30克 碳酸鈣10克 膽鹽1克 蒸餾水1000毫升 加熱至沸騰，冷卻至60°c，加入碘溶液（2毫升峨溶液每 100毫升肉湯） 酵母萃取物，Tryptone，乳糖肉湯，膽鹽，Peptone以及板計 數璦脂(Plate count agar) (PCA)購自 Difco ( Detroit，Michigan， U· S· A·);硫代硫酸鈉及碘購自Sigma ( Sigma Chemical Company，St·，Louis，Missuouri，U· S. A·);碳酸妈購自日本和光 株式會社。 本發明所用的〇丫1^2}〇1^?01131^£1*(10\:10〇111]\1丁1^-HC1? pH 8.8 at 25〇C 5 15 mM MgCl2? 500 mM KC1? 1 % Triton X- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -ΙΓ, 裝------ 訂---- #

五、發明說明（w _100 )’ T'polynucleotide kinase buffer 為 Bio-Labs (New England Bio Labs，Beverly，Massachusetts )所提供。其餘緩衝液和試 Maniatis等人（1卿）的方法配製。以下分別 之製備方法： 勺必後衝劑 n n n n I— n Hi n 一 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1· 50XTAE緩衝液 Tris 驗 242 克 冰醋酸57.1毫升 0.5MEDTA(pH8.0)l〇〇 毫升 加水至1000毫升 2· 6 X 裝載緩衝液(Loading buffer) 30%(W/V)甘油 0.25 % (W/V)漠紛藍(bromophenol blue) % (W/V) xylene cyanol 3.20XSSC緩衝液 氯化鈉175.3克 檸檬酸三鈉88.2克 以HC1調至pH 7.0，加水至1〇〇〇毫升 4. 10〇XDenhardt’s 溶液 Ficoll2 克 聚乙細基？嘻§同2克 BSA2 克 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱） C請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} 裝

T . ial I— emme l I V f ϋ t§ in n I ·ϋ I =D 490468 A7 B7

五、發明說明（q ) 加水至1000毫升，經無菌過濾後備用 5·南方氏轉印雜交反應液 (1)預雜交反應液（prehybridization solution ) ·· 6XSSC lOXDenhardt’s 溶液 〇.2°/〇 SDS 液） 經超聲波處理鮭魚精子DNA( 200微克每毫升預雜交反靡、 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (2)雜交反應液（hybridization solution) 6XSSC lOXDenhardt’s 溶液 02% SDS Τ-32Ρ-ΑΤΡ標幟之探針（20微微莫耳(pmole)每毫升雜交反 應液） 至於本發明所用的PCR引子組及募核苷酸探針，其中使 用之PCR引子組為自行設計的MDH 2 / MDH 31。而針對MDH 2 / MDH 31 PCR產物之檢測探針為STM卜其DNA序列如 下： MDH 2: 5，-CGC ATT CCA CCA CGC CCT TC-3， MDH 31: 5’-TGC CAA CGG AAG TTG AAG TG-3， STM 1 ·· 5，-GTC GCA GAT TCC AGG CGT AAG-3， 10 太紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4賴拔x 9Q7八巷 -------1----_ 裝--- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) . 490468

本發明所用的PCR熱循環器（PCr therm〇cyder)，係採 五、發明說明（〔〇) 用 Perkin Elmer Gene Amp PCR system 9600 ( perkin_Eimer Cooperation，Norwalk，CT·，U· S. A.)。 本务明所用的檢測樣品，係以實驗所用鮮乳購於台中市 生鮮超級市場；所用生乳來源為中興大學牧場之乳牛；實驗 所用牛肉、雞肉及雞蛋購於台中市第三市場；實驗所用嬰兒 糞便來源為仁愛醫院台中大里分院嬰兒房，取樣時間為87年 5月19日。 至於PCR引子組設計方面，本發明設計時所參考之所办 (malate dehydrogenase)基因序列，係利用電腦㈣誠網路 Gopher系統，連接生物分子資料庫（bi〇1〇gical議以以匕 datab—GenBank/EMBL/DDBJ所得。得到的序列資料利用 Genetic Computer Group ( GCG )所開發的 Wisc〇nsin Analysis Soft胃e Package，進行多條基因序列比對（腿丨如匕 sequence format )，找出基因之差異性，藉由此差異設計針對 鼠傷寒沙Η氏菌具檢測專-性之PCR引子組。設計出的引子 組再利用軟體中FASTA功能，將其與中興大學電算中心生 物分子資料庫（GenBank / EMBL Rdease 7〇〇 / 27〇 )中的 DNA序列進行比對，排除3,端及其他基因配對者。 I I I I I 1Γ ^ I I I 11111 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) tr--------- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 11 490468 A7 —--------- B7------五、發明說明（^) 至於本發明所用的募核苷酸引子之合成方面，其中PCR 引子係由展陽科技公司（台中）委託美商珀金埃爾默公司台 灣分公司（台北）或由中興大學遺傳工程中心合成。 經 濟 部 智 慧 財 產 局 員 工 消 費 合 作 社 印 製 本發明所用之聚合酶鏈鎖反應（PCR)方面，其中： 1.MDH2/MDH31引子組之pcr特異性及靈敏度試驗 (1)特異性： 在〇·5毫升微量離心管先加入配製好的3〇微升的pCR緩 衝反應液（4 / 3X緩衝液），再加入1〇微升之稀釋目標菌或 非目標菌體懸浮液（約1〇5細胞每1〇微升），並加一滴礦物 油覆蓋反應液表面。而後將離心管置入PCr熱循環器，於95 C加熱30分鐘將菌體破碎，接著降溫至8〇艺，添加1〇微升 PCR緩衝液（lx緩衝液含〇·6單位之Dynazyme DNA聚合 酶），使反應液總體積為50微升（Mg2+離子終濃度15 mM)， 進行PCR反應，使用之pCR引子(5〇微微莫耳/檢定，％ 微升)及各dNTP 200_。反應之條件為先升溫至9化進行3 分鐘之熱起始反應’再以9代轉⑼減DNA分開 股，降溫至咖維持30秒進行引子黏合作用，再升溫至72 C進行3G秒的聚合延長的作用，如此進行35個 以7rc轉5分鐘。所有過程皆以程式連結。分析時取1〇微 升反應產物’以、3 % _旨糖於1χΤΑ£緩衝液巾進行電泳分 析’經/臭化乙叙染色’以UY箱觀察後拍照。 (2)靈敏度： 尺度_巾關家鮮（CNS)A4規格（2107 12 297^17 請 先 閱言i 背 面 之

注 1 意I 事I 項 I

490468 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 五、發明說明（β 目標菌經活化後，接一白金耳之菌液接種於5毫升之LB 肉湯，37°C培養8小時，取對數期(k)g phase)之菌液，經連續 稀釋後，取10微升之鼠傷寒沙門氏菌菌體懸浮液（約1〇5， 104，103，102，101，10。細胞每10微升）及一組空白組進行 PCR反應，PCR反應及分析條件同前述。 2.乳品之檢測應用 (1) 直接檢測： 全脂鮮乳或生乳搖勻後，取1毫升進行pCA平板計數， 另個別分裝1毫升於離心管中。分別接入序列稀釋 10 ^ 毫升乳液）；另-空白組不加肢。7()()()><克，離心5分鐘後 去上層液，再以1毫升無菌水復水，直接取1〇|11進行PCR反 應，或加入蛋白酶 K(PK) (Merck，Darmstadt，Germany) ( 〇 3 毫 克/笔升）於65 C作用30分鐘後，取1〇微升直接進行pCR 反應。反應液條件及程式與純菌同。 (2) CTET肉湯增菌培養： 全脂鮮乳或生乳搖勻，各加w毫升於裝有9毫升ctet 肉湯的培養瓶。分別接入序列稀釋之目標 :广。5，，⑹，1〇2，⑽，_FU 每毫 ^且不力撕。於37t培養8小時之後，取⑽微升之培養 J二水稀釋10倍，取10微升進行反應。反應 液备、件及程式與純菌同。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) --------« — — — — — — I— . ^紙張尺度適财関家辟（CNS)A4H^ (210 X 297 公爱）

(牛肉、雞肉及雞蛋）中目標菌之檢測 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (1) 直接檢測·· 速拍打碎片人25克與225毫升無菌水混合，以鐵胃高 別分襄1 =於=^後\，取1毫升進行平板計數，另分 微井離中。分別加人序列稀釋之目標菌菌液1。 二、、且不加囷液。混勻後，取10微升直接進行PCR反應， 二二ΡΚ(0·3 *克/毫升)於65。〇作用3〇分鐘後，取1〇微 升直接進行PCR反應，反應祕件及程式與純菌同。 (2) CTET肉湯增菌培養： 切取艮口口碎片25克與225毫升無菌水混合，以鐵胃高速 拍^ 2分鐘，食品拍碎後，取1毫升進行平板計數，分別加入 ,4升於裝有9耄升CTET肉湯的培養瓶。分別加入序列稀 釋之目標菌菌液 ΙΟΟμΙ(約 1〇6, 1〇5, 1〇4, 1〇3, 1〇2, 1〇1，1〇〇 細 胞每100微升）；另一空白組不加菌液。於37〇c培養8小時之 後，取100微升之培養液，以去離子水稀釋10倍，取10微 升進行PCR反應。反應液條件及程式與純菌同。 4·糞便檢體之檢測應用 由於糞便樣品之複雜性，本實施例嘗試了二種檢測方式， 分述如下： (1)直接檢測· 參考Ramotar等學者之方法（1995)稍作修飾，以棉花棒 — — ——ill --------訂·----—------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 14 490468 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（(p 每次沾取約0·1克〜0.5克的糞便，各置入短試管中，加水稀 釋至0.1克糞便/毫升之濃度，振盪均勻。取丨毫升糞便稀 釋液進行平板計數。其他每管則分別接入序列稀釋之枵 〜5〇μ1(成為約 1〇7，1〇6，1〇5，10、1〇3，1〇2，1〇1，^目 標細菌/0.1克糞便）；另一空白組不加菌液。振盪均勻後取1〇〇

微升入微量試管中，稀釋10倍，取10微升無菌水直接進行pcR 反應，或加入ΡΚ(0·3毫克/毫升）於65t作用3〇分鐘後， 取10微升直接進行PCR反應，反舰條件及H之進行與純 菌同。 /、 (2)CTET肉湯增菌培養： 以棉花棒每次沾取約（H克〜〇.5克的糞便，各置入短試 管中’加水稀釋至αΐ克糞便/ ^升之濃度，振i均勻。各管 分別接入序列稀釋之目標菌液1G〜5G微升(成為約ΐ()7，ι〇6， 1〇5 ’ 104，1〇3，1〇2，1〇1 ’ 10〇 目標細菌 /〇a 克糞便）；另一空 白組不加聽。振«勻後m 1毫升於已配製之9毫 升CTET肉湯的培養瓶中。於37t下培養8小時後取出姻微 升，以去離子水稀釋10倍，取10微升進行pCR反應。反應 液條件及程式與純菌同。 對寡«酸片段之放射性標幟與南方氏(s〇她㈣雜交反 應’係依Maniatis等學者（Maniatis et al，1989 )所述方法，將 :核，段以r，P_ATP進行5,端標幟，以製備放射線探 =並進行南方氏轉印及探針STM1之#歧應。dna雜交 反應依Denhardt ( Denhardt，1966 )之方法修飾行之 交 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（21〇 X 297公h^ ---- ---*--I if----- lull — — ^-----I--- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣 490468 A7 -------— _ B7 五、發明說明（tf) 反應溫度為65t：，雜交反應溫度為53°C。 下面要以實施例具體說明本發明之技術内容： 實施例1 : MDH 2 / MDH 31 PCR引子組對鼠傷寒沙門氏菌 菌株之檢測特異性 以自行設計之MDH 2 / MDH 31 PCR引子組在黏合溫度67 °C時，針對目標基因進行PCR擴增時，所採用之8株鼠傷寒 沙門氏菌菌株皆會產生與預期片段大小相同之PCR產物（261 bp) ’如圖1(A)。而為了確認PCR產物之可靠性，本研究 進一步以探針 STM 1 (For* MDH 2 / MDH 31 PCR product)進 行南方氏DNA雜交，作為PCR產物之確認。結果顯示，8 株乳傷寒沙門氏菌菌株之PCR產物皆會與探針stm 1產生雜 父反應’如圖1(B)所示。 為了解MDH2/MDH31引子組之pcr檢測特異性，本 研究亦針對非鼠傷寒沙門氏菌之沙門氏菌菌株，挑選不同血清 型之沙門氏菌46株，和其他腸内菌，包括志贺氏菌屬，桿菌 屬，檸檬桿菌屬，耶爾森氏菌屬，副溶血弧菌（呦咖 等菌株作為測試菌株，進行 引子組之敗檢測，結絲示在齡溫/67^2,/其== 傷寒沙門氏菌菌株並無干擾。部份檢測結果如圖2所示。本研 究所採用的菌株的檢測結果整理於表1與2。 MDH31/MDH2引子組於67°C之;pCR黏合溫度及其他 .丨丨Ji「丨 — (請先閱讀背面之注意事項3U寫本頁)

----訂---------線I 16 A7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（丨诊） 條件的組合下（如表3)，進 針對不同鼠傷寒沙門氏_ 1又_式。結果顯示， 〇」、士土: 圆株（實驗室編號為ST 93及ST ^絲雜培養的條件下，其pcr 每檢定，如圖 3 ( A W R、μ - θ 1 ^ W CFU 组人下，針胸1 M 斤不。頌不此組引子組在特定條件 下十對純囷乳傷寒沙門氏菌之檢測靈敏度十分良好。 實施例2 :乳品中鼠傷寒沙門氏菌目標菌之檢測:九氏菌常見於牛隻中，因而常造成乳製品之污 乐，成為其感麵徑之-（MecMand et aL，1994 )。故本研丸中以市售全月曰鮮乳及生乳作為檢測樣品，進行pcR 組應用性之探討。 直接檢測乳品中之目標菌，結果顯示，經離心後覆水之樣 品，利用MDH 31 / MDH 2 PCR引子直接檢測鮮乳與生乳中鼠 傷寒沙門氏菌菌株ST93，靈敏度分別為l〇Q，1〇3CFU/檢定， 亦即10〜10 CFU母宅升樣品之目標菌數。而經離心與ρκ處 理之樣品，利用MDH 31 / MDH 2 PCR引子直接檢測鮮乳與生 乳中鼠傷寒沙門氏菌菌株ST93,靈敏度分別為10〇，1〇2CFU/ 檢定，亦即102〜l〇4CFU每毫升樣品之目標菌數。為提高檢測 靈敏度，因此，本發明利用選擇性培養基CTET肉湯(Sveum 及Kraft，1981 )增殖目標沙門氏菌，再配合細胞溶解(ceUlysis) 的方法進行PCR檢測。 經CTET肉湯（37°C，8-12小時）預培養後之pcR檢 测結果顯示，無論是應用在鮮乳或生乳中鼠傷寒沙門氏菌菌株 請 先 閱 讀 背 δ 之 注 意 事 項J 再( 填 f f -訂 # 17 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 490468 A7 五、發明說明 ST 93檢滷上，其靈敏度都可達到1〇GcFU/ 圖4(A)(B)所示。 毫升乳液。結果如 實施例3:牛肉、雞肉與雞蛋中目標菌之檢測 根據美國疾病控制與防預中心（Centers f〇r Di嫌c論〇ι t 在1973至1987年間調查顯示，有观 之沙門氏蚊麵食品所傳染。❿Teuxe等學者（測）報 告齡HIM及《分職州㈣巾毒食物傳染源之 一名口此R 口口中目標菌之檢測亦為本研究探討項 目之一。 iCTET肉湯（37C，8小時)預培養後，再以pCR檢測 之結果顯7F ’無論是應用在牛肖、抛或輕 菌菌株ST 93檢測上，其檢測靈敏度都可達到1〇〇 CFU每^ 樣品均質液之原菌數。以生雞肉為樣品之PCR檢測結果如^ 5 所示。 mmMm n ϋ ϋ I _ n n (請先閱讀背面之注意事項n寫本頁) ▲ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 實施例4 :嬰兒糞便檢體之檢測 腹瀉為鼠傷寒沙門氏菌感染的主要症狀之一（ al.，1989)，因此PCR應用於臨床糞便檢體的檢測有其必I。 而糞便檢體之成份相當複雜且含有之菌量相當高（約為1〇6〜 107CFU/0.1克糞便），極易影響PCR之檢測靈敏度與特異性。 在此部份之工作，本研究探討直接檢測方法中添加ρΚ'之^法， 以及經CTET預培養後之檢測方法。 18 490468 A7 五、發明說明（) 1.直接檢測： 將糞便檢體以無菌水稀釋成為0.1克糞便/毫升之濃 度，分別接入不同稀釋倍數之菌液，直接煮沸進行PCR。結果 顯示，無論加PK與否，MDH31/MDH2PCR引子組對鼠傷 寒沙門氏菌之檢測靈敏度皆可達l〇〇CFU/檢定，亦即1〇3〜1〇4 CFU/0.1克糞便樣品，如圖6A所示。 2· CTET肉湯增菌培養： 將含有序列稀釋菌液之糞便稀釋液1毫升，加入9毫升之 選擇性培養基CTET肉湯，經8-12小時之預培養增菌再進行 PCR之檢測。結果顯示，MDH 31 / MDH 2 PCR引子組之檢測 靈敏度可達10〇CFU/0.1克糞便，而沒有加菌液之空白組則沒 f產物產生，如圖6B所示。10〇CFU之鼠傷寒沙門氏菌目標 菌株鼠傷寒沙門氏菌在⑻CFU之雜_情況下，經選擇性培 ，基之預培養過程，可經由取被_，此錄頗讓人° :推/則可能之原因為目標菌於選擇性培養基ct£T br〇th 可與嬰兒糞便中之雜菌競爭而優勢生長；配合靈敏产其古 =H/1/MDH2PGR·，故難目標㈣ J原囷數104倍，而可被偵測。 ------U-----AVI --------訂--------- π請先閲讀背面厶浲意事頊再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣 本紙張尺度適用中 國國 19 豕標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱） 490468 A7 B7 五、發明說明（ 【參考文獻】 1· 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 中國國家標準類編：食品微生物之檢驗法·沙門氏桿菌之 驗，CNS總號10952類號N6212. 双 行政院衛生署.1987·食品衛生檢驗手冊·行政院衛生署印 行· 王添貝，冒燦璋，李日興，王文得，蔡金來，何淑琪， 潘子明· 1994·以相誘導法分析堂灣地區沙門氏菌&血清型 中華微免雜誌27(1) : 13-24. · 4.行政院衛生署.1997.民國年86台灣地區食品中毒發生狀況 行政院衛生署印行. · Aabo, A.? O. F. Rasmussen, L. Rossen, P. D. Sorensen and J. E. Olsen. 1993. Salmonella identification by polymerase chain reaction. Molecular and Cellular Probes. 7: 171-178. Bej，A· K·，Μ· H· Mahbabani，M· J. Boyce and R. M. Atlas· 1994. Detection of Salmonella spp. in ogster by PCR. Applied and Environmental Microbiology 60:368-373. Chary P.? R. Prasad, A. K. Chopra and J. W. Peterson. 1993. Location of the enterotoxin gene from Salmonella typhimurium and characterization of the gene products. FEMS Microbiol. Lett. 111:89-92. Cocolin，L·，M. Manzano, C. Cantoni，G. Comi. 1998· Use of PCR and restric enzyme analysis to directly detect and identify Salm. typhimurium in food, J. Appl. Micro. 85: 673-677. 9. Cohen, H. J.3 S. M. Mechanda and W. Lin. 1996. PCR Amplification of the fimA Gene Sequence of Salmonella typhimurium, a Specific Method for Detection of Salmonella spp.. Applied and Environmental Microbiology. 62(12): 4303-4308. 10. Denhardt, D. T. 1966. A membrane-filter tenichque for detection of complementary DNA. Biochem. Biophys. Res. Commum. 23: 641-646. 11. Food and Drug Administration 1995. Bacteriological Analytical Manual, 8th edition. Arlington, V. A.? USA, Association of Analytical Chemists. 12. Hashimoto, Y.? Y. Itho, Y. Fujinaga, A. Q. Khan5 F. Sultana, M. 2. 3. 5. 7. 8. 20 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） <請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ri裝 訂--- 着- 經濟部智慧財產局員Η消費合作社印制衣 490468 A7 B7_ 五、發明說明（7〇)

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Claims (1)

1. 490468 A8 B8 C8 ， D8 六、申請專利範圍 1. 一種鼠傷寒沙門氏菌檢測用聚合酶鏈反應引子，其包括二段 聚合酶鏈反應PCR引子，其序列如下： PCR引子： MD 31: 5, - TGC CAA CGG AAG TTG AAG TG - 3,； MDH 2: 5, - CGC ATT CCA CCA CGC CCT TC - 3,。 2. —種檢測探針，其序列為 STM 1: 5, - GTC GCA GAT TCC AGG CGT AAG — 3,。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -:-2^- 本紙張尺度逋用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）