TW202424199A - 目標蛋白質之生產方法 - Google Patents
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Abstract
一種目標蛋白質之生產方法，其係生產藉由目標基因編碼之蛋白質之方法，
包括於伯克氏菌(Burkholderia)屬細菌中表現目標基因之步驟，該伯克氏菌屬細菌不具有選自由BSFP_068740、BSFP_068730及BSFP_068720所組成之群中之1個或複數個基因，或者該基因之表現或該基因編碼之蛋白質之表現受到抑制。
Description
本發明係關於一種於伯克氏菌(Burkholderia)屬細菌中生產目標蛋白質之方法等。
伯克氏菌屬細菌係分泌生產有用之脂肪酶之革蘭氏陰性細菌(專利文獻1)，可表現及分泌在大腸桿菌中難以活性型表現之細胞外分泌型之脂肪酶等，因此，有將其用作有用蛋白質表現系統之平台之報道(參照專利文獻2及3)。
然而，使用伯克氏菌屬細菌之重組蛋白生產量與大腸桿菌或酵母、絲狀真菌等宿主載體系統相比較少，因此利用例較少，亦存在以下例：為了生產源自伯克氏菌屬之脂肪酶，使用利用大腸桿菌而並非伯克氏菌屬細菌之宿主載體系統(專利文獻4及非專利文獻1)。
[先前技術文獻]
[專利文獻]
專利文獻1：日本專利特開平11-253157號公報
專利文獻2：日本專利特表2008-543294號公報
專利文獻3：日本專利特開2019-205402號公報
專利文獻4：日本專利第5993229號公報
[非專利文獻]
非專利文獻1：M El Khattabi et al., J. Bio Chem., 275(35), 26885-91(2000)
[發明所欲解決之問題]
本發明之課題在於，提供一種可於用作有用蛋白質表現系統之平台之例較少之伯克氏菌屬細菌中大量表現重組蛋白之新方法。
[解決問題之技術手段]
本發明人等發現，藉由抑制位於伯克氏菌屬細菌所具有之特定染色體上之基因之功能，於伯克氏菌屬細菌中表現載體穩定，該細菌被賦予對蛋白質之穩定製造更佳之性質。亦新發現可增加目標蛋白質之表現量之新啟動子。
即，本案包含以下發明。
[1]
一種目標蛋白質之生產方法，其係生產藉由目標基因編碼之蛋白質之方法，
包括於伯克氏菌(Burkholderia)屬細菌中表現目標基因之步驟，該伯克氏菌屬細菌不具有選自由BSFP_068740、BSFP_068730及BSFP_068720所組成之群中之1個或複數個基因，或者該基因之表現或該基因編碼之蛋白質之表現受到抑制。
[2]
如[1]所記載之方法，其中基因BSFP_068740包含以下(i)～(viii)中之任一DNA(Deoxyribonucleic Acid，去氧核糖核酸)：
(i)包含序列編號1之鹼基序列之DNA；
(ii)可與包含與序列編號1之鹼基序列互補之鹼基序列之DNA於嚴格之條件下雜交之DNA，藉由該DNA編碼之蛋白質具有減少伯克氏菌屬細菌中之表現構建物之拷貝數、或降低表現構建物之穩定性之功能；
(iii)包含序列編號1之鹼基序列中1個或數個鹼基缺失、置換或附加而成之鹼基序列之DNA，藉由該DNA編碼之蛋白質具有減少伯克氏菌屬細菌中之表現構建物之拷貝數、或降低表現構建物之穩定性之功能；
(iv)包含與序列編號1具有至少80%以上之序列同一性之鹼基序列之DNA，藉由該DNA編碼之蛋白質具有減少伯克氏菌屬細菌中之表現構建物之拷貝數、或降低表現構建物之穩定性之功能；
(v)包含編碼蛋白質之鹼基序列之DNA，該蛋白質包含序列編號2之胺基酸序列；
(vi)可與包含編碼蛋白質之鹼基序列之DNA於嚴格之條件下雜交之DNA，該蛋白質包含序列編號2之胺基酸序列，藉由該DNA編碼之蛋白質具有減少伯克氏菌屬細菌中之表現構建物之拷貝數、或降低表現構建物之穩定性之功能；
(vii)包含編碼蛋白質之鹼基序列之DNA，該蛋白質包含序列編號2之胺基酸序列中1個或數個胺基酸缺失、置換或附加而成之胺基酸序列，且具有減少伯克氏菌屬細菌中之表現構建物之拷貝數、或降低表現構建物之穩定性之功能；或，
(viii)包含編碼蛋白質之鹼基序列之DNA，該蛋白質包含與序列編號2具有至少80%以上之序列同一性之胺基酸序列，且具有減少伯克氏菌屬細菌中之表現構建物之拷貝數、或降低表現構建物之穩定性之功能。
[3]
如[1]或[2]所記載之方法，其中基因BSFP_068730包含以下(i)～(viii)中之任一DNA：
(i)包含序列編號3之鹼基序列之DNA；
(ii)可與包含與序列編號3之鹼基序列互補之鹼基序列之DNA於嚴格之條件下雜交之DNA，藉由該DNA編碼之蛋白質具有減少伯克氏菌屬細菌中之表現構建物之拷貝數、或降低表現構建物之穩定性之功能；
(iii)包含序列編號3之鹼基序列中1個或數個鹼基缺失、置換或附加而成之鹼基序列之DNA，藉由該DNA編碼之蛋白質具有減少伯克氏菌屬細菌中之表現構建物之拷貝數、或降低表現構建物之穩定性之功能；
(iv)包含與序列編號3具有至少80%以上之序列同一性之鹼基序列之DNA，藉由該DNA編碼之蛋白質具有減少伯克氏菌屬細菌中之表現構建物之拷貝數、或降低表現構建物之穩定性之功能；
(v)包含編碼蛋白質之鹼基序列之DNA，該蛋白質包含序列編號4之胺基酸序列；
(vi)可與包含編碼蛋白質之鹼基序列之DNA於嚴格之條件下雜交之DNA，該蛋白質包含序列編號4之胺基酸序列，藉由該DNA編碼之蛋白質具有減少伯克氏菌屬細菌中之表現構建物之拷貝數、或降低表現構建物之穩定性之功能；
(vii)包含編碼蛋白質之鹼基序列之DNA，該蛋白質包含序列編號4之胺基酸序列中1個或數個胺基酸缺失、置換或附加而成之胺基酸序列，且具有減少伯克氏菌屬細菌中之表現構建物之拷貝數、或降低表現構建物之穩定性之功能；或，
(viii)包含編碼蛋白質之鹼基序列之DNA，該蛋白質包含與序列編號4具有至少80%以上之序列同一性之胺基酸序列，且具有減少伯克氏菌屬細菌中之表現構建物之拷貝數、或降低表現構建物之穩定性之功能。
[4]
如[1]至[3]中任一項所記載之方法，其中基因BSFP_068720包含以下(i)～(viii)中之任一DNA：
(i)包含序列編號5之鹼基序列之DNA；
(ii)可與包含與序列編號5之鹼基序列互補之鹼基序列之DNA於嚴格之條件下雜交之DNA，藉由該DNA編碼之蛋白質具有減少伯克氏菌屬細菌中之表現構建物之拷貝數、或降低表現構建物之穩定性之功能；
(iii)包含序列編號5之鹼基序列中1個或數個鹼基缺失、置換或附加而成之鹼基序列之DNA，藉由該DNA編碼之蛋白質具有減少伯克氏菌屬細菌中之表現構建物之拷貝數、或降低表現構建物之穩定性之功能；
(iv)包含與序列編號5具有至少80%以上之序列同一性之鹼基序列之DNA，藉由該DNA編碼之蛋白質具有減少伯克氏菌屬細菌中之表現構建物之拷貝數、或降低表現構建物之穩定性之功能；
(v)包含編碼蛋白質之鹼基序列之DNA，該蛋白質包含序列編號6之胺基酸序列；
(vi)可與包含編碼蛋白質之鹼基序列之DNA於嚴格之條件下雜交之DNA，該蛋白質包含序列編號6之胺基酸序列，藉由該DNA編碼之蛋白質具有減少伯克氏菌屬細菌中之表現構建物之拷貝數、或降低表現構建物之穩定性之功能；
(vii)包含編碼蛋白質之鹼基序列之DNA，該蛋白質包含序列編號6之胺基酸序列中1個或數個胺基酸缺失、置換或附加而成之胺基酸序列，且具有減少伯克氏菌屬細菌中之表現構建物之拷貝數、或降低表現構建物之穩定性之功能；或，
(viii)包含編碼蛋白質之鹼基序列之DNA，該蛋白質包含與序列編號6具有至少80%以上之序列同一性之胺基酸序列，且具有減少伯克氏菌屬細菌中之表現構建物之拷貝數、或降低表現構建物之穩定性之功能。
[5]
如[1]至[4]中任一項所記載之方法，其中目標基因以可表現之方式連結於表現構建物。
[6]
如[2]至[5]中任一項所記載之方法，其中表現構建物係表現載體。
[7]
如[6]所記載之方法，其中表現構建物係可於伯克氏菌屬細菌中複製之質體。
[8]
如[7]所記載之方法，其中質體係廣泛宿主載體。
[9]
如[8]所記載之方法，其中廣泛宿主載體係pBBR122、pSa或RK2。
[10]
如[2]至[9]中任一項所記載之方法，其中表現構建物包含控制目標基因之表現之啟動子。
[11]
如[10]所記載之方法，其中啟動子源自伯克氏菌屬細菌。
[12]
如[1]至[11]中任一項所記載之方法，其中啟動子包含以下(i)～(iv)中之任一DNA：
(i)包含序列編號7之鹼基序列中連續的超過80個鹼基之序列且具有啟動子活性之DNA；
(ii)可與包含與序列編號7之鹼基序列中連續的超過80個鹼基之序列互補之鹼基序列之DNA於嚴格之條件下雜交且具有啟動子活性之DNA；
(iii)包含序列編號7之鹼基序列中連續的超過80個鹼基之序列之1個或數個鹼基缺失、置換或附加而成之鹼基序列且具有啟動子活性之DNA；或，
(iv)包含與序列編號7中連續的超過80個鹼基之序列具有至少80%以上之序列同一性之鹼基序列且具有啟動子活性之DNA。
[13]
如[12]所記載之方法，其中上述啟動子包含以下(i)～(iv)中之任一DNA：
(i)包含序列編號8之鹼基序列之DNA；
(ii)可與包含與序列編號8之鹼基序列互補之鹼基序列之DNA於嚴格之條件下雜交且具有啟動子活性之DNA；
(iii)包含序列編號8之鹼基序列中1個或數個鹼基缺失、置換或附加而成之鹼基序列且具有啟動子活性之DNA；
(iv)包含與序列編號8具有至少80%以上之序列同一性之鹼基序列且具有啟動子活性之DNA。
[14]
如[1]至[13]中任一項所記載之方法，其中啟動子包含以下(i)～(iv)中之任一DNA：
(i)包含序列編號9之鹼基序列中連續的超過100個鹼基之序列且具有啟動子活性之DNA；
(ii)可與包含與序列編號9之鹼基序列中連續的超過100個鹼基之序列互補之鹼基序列之DNA於嚴格之條件下雜交且具有啟動子活性之DNA；
(iii)包含序列編號9之鹼基序列中連續的超過100個鹼基之序列之1個或數個鹼基缺失、置換或附加而成之鹼基序列且具有啟動子活性之DNA；或，
(iv)包含與序列編號9中連續的超過100個鹼基之序列具有至少80%以上之序列同一性之鹼基序列且具有啟動子活性之DNA。
[15]
如[14]所記載之方法，其中上述啟動子包含以下(i)～(iv)中之任一DNA：
(i)包含序列編號10之鹼基序列之DNA；
(ii)可與包含與序列編號10之鹼基序列互補之鹼基序列之DNA於嚴格之條件下雜交且具有啟動子活性之DNA；
(iii)包含序列編號10之鹼基序列中1個或數個鹼基缺失、置換或附加而成之鹼基序列且具有啟動子活性之DNA；
(iv)包含與序列編號10具有至少80%以上之序列同一性之鹼基序列且具有啟動子活性之DNA。
[16]
如[1]至[15]中任一項所記載之方法，其中目標基因編碼酯酶。
[17]
如[16]所記載之方法，其中編碼酯酶之基因包含以下(i)～(iv)中之任一DNA：
(i)包含序列編號11～13之任一鹼基序列之DNA；
(ii)可與包含與序列編號11～13之任一鹼基序列互補之鹼基序列之DNA於嚴格之條件下雜交之DNA，藉由該DNA編碼之蛋白質具有酯酶活性；
(iii)包含序列編號11～13之任一鹼基序列中1個或數個鹼基缺失、置換或附加而成之鹼基序列之DNA，藉由該DNA編碼之蛋白質具有酯酶活性；或，
(iv)包含與序列編號11～13之任一鹼基序列具有至少80%以上之序列同一性之鹼基序列之DNA，藉由該DNA編碼之蛋白質具有酯酶活性。
[18]
如[1]至[17]中任一項所記載之方法，其中表現構建物包含編碼摺疊酶之DNA。
[19]
如[18]所記載之方法，其中編碼摺疊酶之DNA包含以下(i)～(iv)中之任一DNA：
(i)包含序列編號14～16之任一鹼基序列之DNA；
(ii)可與包含與序列編號14～16之任一鹼基序列互補之鹼基序列之DNA於嚴格之條件下雜交之DNA，藉由該DNA編碼之蛋白質具有摺疊酶活性；
(iii)包含序列編號14～16之任一鹼基序列中1個或數個鹼基缺失、置換或附加而成之鹼基序列之DNA，藉由該DNA編碼之蛋白質具有摺疊酶活性；或，
(iv)包含與序列編號14～16之任一鹼基序列具有至少80%以上之序列同一性之鹼基序列之DNA，藉由該DNA編碼之蛋白質具有摺疊酶活性。
[20]
如[1]至[19]中任一項所記載之方法，其中目標基因進而編碼訊息序列。
[21]
如[1]至[20]中任一項所記載之方法，其中伯克氏菌屬細菌係伯克霍爾德氏菌(Burkholderia stabilis)。
[22]
一種啟動子，其包含以下(i)～(iv)中之任一DNA：
(i)包含序列編號7之鹼基序列中連續的超過80個鹼基之序列且具有啟動子活性之DNA；
(ii)可與包含與序列編號7之鹼基序列中連續的超過80個鹼基之序列互補之鹼基序列之DNA於嚴格之條件下雜交且具有啟動子活性之DNA；
(iii)包含序列編號7之鹼基序列中連續的超過80個鹼基之序列之1個或數個鹼基缺失、置換或附加而成之鹼基序列且具有啟動子活性之DNA；或，
(iv)包含與序列編號7中連續的超過80個鹼基之序列具有至少80%以上之序列同一性之鹼基序列且具有啟動子活性之DNA。
[23]
如[22]所記載之啟動子，其中上述啟動子包含以下(i)～(iv)中之任一DNA：
(i)包含序列編號8之鹼基序列之DNA；
(ii)可與包含與序列編號8之鹼基序列互補之鹼基序列之DNA於嚴格之條件下雜交且具有啟動子活性之DNA；
(iii)包含序列編號8之鹼基序列中1個或數個鹼基缺失、置換或附加而成之鹼基序列且具有啟動子活性之DNA；
(iv)包含與序列編號8具有至少80%以上之序列同一性之鹼基序列且具有啟動子活性之DNA。
[24]
一種啟動子，其包含以下(i)～(iv)中之任一DNA：
(i)包含序列編號9之鹼基序列中連續的超過100個鹼基之序列且具有啟動子活性之DNA；
(ii)可與包含與序列編號9之鹼基序列中連續的超過100個鹼基之序列互補之鹼基序列之DNA於嚴格之條件下雜交且具有啟動子活性之DNA；
(iii)包含序列編號9之鹼基序列中連續的超過100個鹼基之序列之1個或數個鹼基缺失、置換或附加而成之鹼基序列且具有啟動子活性之DNA；或，
(iv)包含與序列編號9中連續的超過100個鹼基之序列具有至少80%以上之序列同一性之鹼基序列且具有啟動子活性之DNA。
[25]
如[24]所記載之啟動子，其中上述啟動子包含以下(i)～(iv)中之任一DNA：
(i)包含序列編號10之鹼基序列之DNA；
(ii)可與包含與序列編號10之鹼基序列互補之鹼基序列之DNA於嚴格之條件下雜交且具有啟動子活性之DNA；
(iii)包含序列編號10之鹼基序列中1個或數個鹼基缺失、置換或附加而成之鹼基序列且具有啟動子活性之DNA；
(iv)包含與序列編號10具有至少80%以上之序列同一性之鹼基序列且具有啟動子活性之DNA。
[26]
一種伯克氏菌屬細菌之變異株，其以選自由BSFP_068740、BSFP_068730及BSFP_068720所組成之群中之1個或複數個基因之表現或該基因編碼之蛋白質之表現受到抑制之方式修飾。
[27]
如[26]所記載之變異株，其中變異株包含表現構建物，表現構建物包含控制目標基因之表現之啟動子。
[28]
如[27]所記載之變異株，其中啟動子係如[22]至[25]中任一項所記載之啟動子。
[29]
一種表現構建物之維持方法，其係於伯克氏菌屬細菌中維持表現構建物之方法，
包括培養包含表現構建物之伯克氏菌屬細菌之步驟，該伯克氏菌屬細菌不具有選自由BSFP_068740、BSFP_068730及BSFP_068720所組成之群中之1個或複數個基因，或者該基因之表現或該基因編碼之蛋白質之表現受到抑制。
[30]
如[29]所記載之方法，其中於培養後之伯克氏菌屬細菌中，表現構建物之拷貝數增大，或表現構建物之穩定性增大。
[發明之效果]
根據本發明，與位於特定染色體上之基因之功能未受到抑制之伯克氏菌屬細菌相比，可實現目標蛋白質之高生產，又，伯克氏菌屬細菌中之表現載體之穩定性可增大。
於第一實施方式中，提供一種目標蛋白質之生產方法，其係生產藉由目標基因編碼之蛋白質之方法，包括於伯克氏菌屬細菌中表現目標基因之步驟，該伯克氏菌屬細菌不具有例如選自由BSFP_068740、BSFP_068730及BSFP_068720所組成之群中之1個或複數個基因，或者該基因之表現或該基因編碼之蛋白質之表現受到抑制，該基因位於伯克氏菌(Burkholderia)屬細菌上之特定染色體上，例如於伯克霍爾德氏菌之情形時，位於染色體3上。
作為編碼蛋白質之鹼基序列，並無特別限定，例如，可為匹配例如伯克霍爾德氏菌等伯克氏菌屬細菌等宿主之密碼子使用頻度來改變序列編號1、3或5之鹼基序列所得之鹼基序列。又，於上述蛋白質中，若分別為具有減少表現構建物之拷貝數或降低表現構建物之穩定性之功能之蛋白質，則可為編碼與各蛋白質實質上均等之胺基酸序列之鹼基序列，亦可為編碼胺基酸序列之均等物之鹼基序列，該胺基酸序列例如為使各蛋白質之胺基酸序列中之不參與上述功能之一部分胺基酸發生變異所得者，例如1個或複數個胺基酸缺失、置換或附加而成者。較佳為包含序列編號1、3或5之鹼基序列之全部或一部分尤佳。
作為革蘭氏陰性好氧桿菌之伯克氏菌屬細菌係有時用作有用蛋白質表現系統之平台之革蘭氏陰性好氧桿菌，登記有伯克霍爾德氏菌(Burkholderia stabilis)等60以上之種類。伯克氏菌屬細菌之中，例如伯克霍爾德氏菌FERMP-21014(Genome Announcements Volume 5 Issue 29 e00636-17)具有3條染色體即染色體1(3.6 Mbp)、染色體2(3.2 Mbp)、染色體3(0.9 Mbp)，於最小之染色體3上存在849個基因。藉由使伯克氏菌屬細菌之特定染色體欠缺，與不欠缺之該細菌相比，可增大目標蛋白質之生產量。並非意欲受理論束縛，但認為藉由抑制存在於上述特定染色體上之具有使質體等表現載體之穩定性喪失之功能之基因的功能，表現載體之穩定性增大，其結果，蛋白質之生產量增大。
於本說明書中使用之情形時，「伯克氏菌屬細菌」意指伯克氏菌屬之任意細菌。伯克氏菌屬細菌可為天然存在者，亦可為人為作出者，只要抑制具有使質體等表現載體之穩定性喪失之功能之基因的功能即可。伯克氏菌屬細菌之中，較佳為伯克霍爾德氏菌或斯沃蘭提卡伯克霍爾德氏菌。
伯克霍爾德氏菌FERMP-21014之基因組序列係公知者(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/45559?genome_assembly_id=331877)，例如構成染色體3之基因序列亦係公知者(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AP018113.1)。作為具有使質體等表現載體之穩定性喪失之功能之基因之例，有伯克霍爾德氏菌FERMP-21014之BSFP_068740、BSFP_068730或BSFP_068720，存在於染色體3上。BSFP_068740、BSFP_068730及BSFP_068720之功能可均不同，亦可相同，藉由抑制各基因之1種或複數種功能，可提高表現載體之穩定性。BSFP編號係表示根據NCBI(National Center for Biotechnology Information，國家生物技術資訊中心)之基因座標籤。
於較佳之形態中，基因BSFP_068740可包含以下(i)～(viii)中之任一DNA：
(i)包含序列編號1之鹼基序列之DNA；
(ii)可與包含與序列編號1之鹼基序列互補之鹼基序列之DNA於嚴格之條件下雜交之DNA，藉由該DNA編碼之蛋白質具有減少伯克氏菌屬細菌中之表現構建物之拷貝數、或降低表現構建物之穩定性之功能；
(iii)包含序列編號1之鹼基序列中1個或複數個、較佳為1個或數個鹼基缺失、置換或附加而成之鹼基序列之DNA，藉由該DNA編碼之蛋白質具有減少伯克氏菌屬細菌中之表現構建物之拷貝數、或降低表現構建物之穩定性之功能；
(iv)包含與序列編號1具有至少80%以上、較佳為90%以上之序列同源性、較佳為序列同一性之鹼基序列之DNA，藉由該DNA編碼之蛋白質具有減少伯克氏菌屬細菌中之表現構建物之拷貝數、或降低表現構建物之穩定性之功能；
(v)包含編碼蛋白質之鹼基序列之DNA，該蛋白質包含序列編號2之胺基酸序列；
(vi)可與包含編碼蛋白質之鹼基序列之DNA於嚴格之條件下雜交之DNA，該蛋白質包含序列編號2之胺基酸序列，藉由該DNA編碼之蛋白質具有減少伯克氏菌屬細菌中之表現構建物之拷貝數、或降低表現構建物之穩定性之功能；
(vii)包含編碼蛋白質之鹼基序列之DNA，該蛋白質包含序列編號2之胺基酸序列中1個或數個胺基酸缺失、置換或附加而成之胺基酸序列，且具有減少伯克氏菌屬細菌中之表現構建物之拷貝數、或降低表現構建物之穩定性之功能；或，
(viii)包含編碼蛋白質之鹼基序列之DNA，該蛋白質包含與序列編號2具有至少80%以上、較佳為90%以上之序列同源性、較佳為序列同一性之胺基酸序列，且具有減少伯克氏菌屬細菌中之表現構建物之拷貝數、或降低表現構建物之穩定性之功能。
於較佳之形態中，基因BSFP_068730可包含以下(i)～(viii)中之任一DNA：
(i)包含序列編號3之鹼基序列之DNA；
(ii)可與包含與序列編號3之鹼基序列互補之鹼基序列之DNA於嚴格之條件下雜交之DNA，藉由該DNA編碼之蛋白質具有減少伯克氏菌屬細菌中之表現構建物之拷貝數、或降低表現構建物之穩定性之功能；
(iii)包含序列編號3之鹼基序列中1個或複數個、較佳為1個或數個鹼基缺失、置換或附加而成之鹼基序列之DNA，藉由該DNA編碼之蛋白質具有減少伯克氏菌屬細菌中之表現構建物之拷貝數、或降低表現構建物之穩定性之功能；
(iv)包含與序列編號3具有至少80%以上、較佳為90%以上之序列同源性、較佳為序列同一性之鹼基序列之DNA，藉由該DNA編碼之蛋白質具有減少伯克氏菌屬細菌中之表現構建物之拷貝數、或降低表現構建物之穩定性之功能；
(v)包含編碼蛋白質之鹼基序列之DNA，該蛋白質包含序列編號4之胺基酸序列；
(vi)可與包含編碼蛋白質之鹼基序列之DNA於嚴格之條件下雜交之DNA，該蛋白質包含序列編號4之胺基酸序列，藉由該DNA編碼之蛋白質具有減少伯克氏菌屬細菌中之表現構建物之拷貝數、或降低表現構建物之穩定性之功能；
(vii)包含編碼蛋白質之鹼基序列之DNA，該蛋白質包含序列編號4之胺基酸序列中1個或數個胺基酸缺失、置換或附加而成之胺基酸序列，且具有減少伯克氏菌屬細菌中之表現構建物之拷貝數、或降低表現構建物之穩定性之功能；或，
(viii)包含編碼蛋白質之鹼基序列之DNA，該蛋白質包含與序列編號4具有至少80%以上、較佳為90%以上之序列同源性、較佳為序列同一性之胺基酸序列，且具有減少伯克氏菌屬細菌中之表現構建物之拷貝數、或降低表現構建物之穩定性之功能。
於較佳之形態中，基因BSFP_068720可包含以下(i)～(viii)中之任一DNA：
(i)包含序列編號5之鹼基序列之DNA；
(ii)可與包含與序列編號5之鹼基序列互補之鹼基序列之DNA於嚴格之條件下雜交之DNA，藉由該DNA編碼之蛋白質具有減少伯克氏菌屬細菌中之表現構建物之拷貝數、或降低表現構建物之穩定性之功能；
(iii)包含序列編號5之鹼基序列中1個或複數個、較佳為1個或數個鹼基缺失、置換或附加而成之鹼基序列之DNA，藉由該DNA編碼之蛋白質具有減少伯克氏菌屬細菌中之表現構建物之拷貝數、或降低表現構建物之穩定性之功能；
(iv)包含與序列編號5具有至少80%以上、較佳為90%以上之序列同源性、較佳為序列同一性之鹼基序列之DNA，藉由該DNA編碼之蛋白質具有減少伯克氏菌屬細菌中之表現構建物之拷貝數、或降低表現構建物之穩定性之功能；
(v)包含編碼蛋白質之鹼基序列之DNA，該蛋白質包含序列編號6之胺基酸序列；
(vi)可與包含編碼蛋白質之鹼基序列之DNA於嚴格之條件下雜交之DNA，該蛋白質包含序列編號6之胺基酸序列，藉由該DNA編碼之蛋白質具有減少伯克氏菌屬細菌中之表現構建物之拷貝數、或降低表現構建物之穩定性之功能；
(vii)包含編碼蛋白質之鹼基序列之DNA，該蛋白質包含序列編號6之胺基酸序列中1個或數個胺基酸缺失、置換或附加而成之胺基酸序列，且具有減少伯克氏菌屬細菌中之表現構建物之拷貝數、或降低表現構建物之穩定性之功能；或，
(viii)包含編碼蛋白質之鹼基序列之DNA，該蛋白質包含與序列編號6具有至少80%以上、較佳為90%以上之序列同源性、較佳為序列同一性之胺基酸序列，且具有減少伯克氏菌屬細菌中之表現構建物之拷貝數、或降低表現構建物之穩定性之功能。
於本說明書中使用之情形時，「嚴格之條件」例如為「1×SSC(saline sodium citrate，檸檬酸鈉)、0.1% SDS(Sodium Dodecyl Sulfate，十二烷基硫酸鈉)、37℃」程度之條件，更嚴格之條件為「0.5×SSC、0.1% SDS、42℃」程度之條件，進而嚴格之條件為「0.2×SSC、0.1% SDS、65℃」程度之條件。如此雜交之條件越嚴格，則越可期待與探針序列具有較高之同源性、較佳為較高之同一性之DNA之單離。然而，上述SSC、SDS及溫度之條件之組合係例示性者，業者可藉由將決定雜交之嚴格度之上述要素或其他要素(例如探針濃度、探針之長度、雜交之反應時間等)適當組合，而實現與上述相同之嚴格度。於此種嚴格之條件下雜交之DNA一般具有較高之序列同一性。較高之序列同一性係指具有至少60%以上、較佳為70%以上、進而較佳為80%以上、尤佳為90%以上、最佳為95%以上之同源性。
於本說明書中使用之情形時，「1個或複數個鹼基」意指鹼基之數根據實施缺失、置換或附加之基準序列之全長而不同，例如對於包含100個鹼基之鹼基序列，為1～30個、較佳為1～20個、更佳為1～10個鹼基。「1個或數個鹼基」亦同樣如此，例如對於包含100個鹼基之鹼基序列，為1～10個、較佳為1～5個、更佳為4個、3個、2個或1個鹼基。
於本說明書中使用之情形時，「1個或複數個胺基酸」意指胺基酸之數根據實施缺失、置換或附加之基準序列之全長而不同，例如對於包含100個胺基酸之胺基酸序列，為1～30個、較佳為1～20個、更佳為1～10個胺基酸。「1個或數個胺基酸」亦同樣如此，例如對於包含100個胺基酸之胺基酸序列，為1～10個、較佳為1～5個、更佳為4個、3個、2個或1個胺基酸。
序列同源性或序列同一性於使用BLAST(Basic Local Alignment Search Tool，基本局部比對搜索工具)等(例如使用預設值即初始設定之參數)計算時，對於特定序列為至少80%以上，較佳為90%以上，更佳為95%以上，進而較佳為98%以上。
將意欲於伯克氏菌屬細菌中生產之藉由目標基因編碼之蛋白質亦稱為「目標蛋白質」。目標蛋白質若為可於伯克氏菌屬細菌中生產之蛋白質，則並無特別限定。目標蛋白質較佳為於大腸桿菌或酵母、絲狀真菌等先前公知之宿主載體系統之情形時表現困難之細胞外分泌型蛋白質。作為此種蛋白質，包括酶，例如，可例舉酯酶、脂肪酶、澱粉酶、葡糖澱粉酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、甘露糖苷酶、異構酶、轉化酶、轉移酶、核糖核酸酶、去氧核糖核酸酶、殼質酶、觸酶、蟲漆酶、酚氧化酶、氧化酶、氧化還原酶、纖維素酶、木聚糖酶、過氧化酶、水解酶、角質酶、蛋白酶、植酸酶、解離酶、果膠酶、胺肽酶、羧肽酶。該等酶之中，較佳為分類為EC 3.1.1羧酸酯水解酶之酯酶，更佳為分類為EC 3.1.1.1脫羧醣酯酶之酯酶，進而較佳為分類為EC 3.1.1.13-固醇酯酶之固醇酯酶、分類為EC 3.1.1.3之三醯甘油脂肪酶(脂肪酶)，尤佳為膽固醇酯酶。
作為膽固醇酯酶之例，有源自伯克霍爾德氏菌之固醇酯水解酶(EC3.1.1.13)等。作為脂肪酶之例，有莢殼伯克霍爾德氏菌之脂肪酶(L G Frenken et al., Mol Microbiol. 9(3), 591-9 (1993))等。目標蛋白質可包含訊息肽，不包含亦可。目標蛋白質較佳為進而包含訊息肽。訊息肽亦可使用例如大腸桿菌之訊息肽。亦可使用論文等報道者(Tullman-Ercek et al., J Bio Chem. 16, 282(11), 8309-16 (2007))、或於作為蛋白質資料庫之Uniprot(http://www.uniprot.org/)中檢索胺基酸序列所得之訊息肽。若使用後者之方法，則可獲得例如大腸桿菌之所謂BsmA之蛋白質之訊息肽(https://www.uniprot.org/uniprot/P39297)、所謂YafY之蛋白質之訊息肽(https://www.uniprot.org/uniprot/P77365)、所謂YnjE之蛋白質之訊息肽(https://www.uniprot.org/uniprot/P78067)之序列資訊。
作為編碼酯酶之鹼基序列，並無特別限定，例如，可為匹配宿主例如伯克霍爾德氏菌等伯克氏菌屬細菌等之密碼子使用頻度來改變序列編號11～13之任一鹼基序列所得之鹼基序列。又，若為具有酯酶之作用之蛋白質，則可為編碼實質上均等之胺基酸序列之鹼基序列，亦可為編碼胺基酸序列之均等物之鹼基序列，該胺基酸序列例如為使酯酶之胺基酸序列中之不參與酯酶之作用之一部分胺基酸發生變異所得者，例如1個或複數個胺基酸缺失、置換或附加而成者。
於較佳之形態中，編碼酯酶之基因例如可包含以下(i)～(iv)中之任一DNA：
(i)包含序列編號11～13之任一鹼基序列之DNA；
(ii)可與包含與序列編號11～13之任一鹼基序列互補之鹼基序列之DNA於嚴格之條件下雜交之DNA，藉由該DNA編碼之蛋白質具有酯酶活性；
(iii)包含序列編號11～13之任一鹼基序列中1個或複數個、較佳為1個或數個鹼基缺失、置換或附加而成之鹼基序列之DNA，藉由該DNA編碼之蛋白質具有酯酶活性；或，
(iv)包含與序列編號11～13之任一鹼基序列具有至少80%以上之序列同一性之鹼基序列之DNA，藉由該DNA編碼之蛋白質具有酯酶活性。
編碼目標蛋白質之目標基因較佳為以可於伯克氏菌屬細菌中表現之方式連結於質體等表現構建物。表現構建物為可於伯克氏菌屬細菌中複製者即可，例如可例舉表現載體，較佳為自主複製之質體載體。作為表現載體，有可於伯克氏菌屬細菌中複製之質體載體，例如pBBR122、pSa、pRK2等廣泛宿主載體。
表現構建物較佳為包含控制目標基因之表現之啟動子。啟動子可源自伯克氏菌屬細菌。藉由選擇具有適當之啟動子活性之啟動子，目標基因之轉錄量變多，生產之蛋白質量亦增加。作為此種啟動子，有以下啟動子：編碼甘油-3-磷酸去氫酶之BSFP_015180基因之啟動子，其於位於該基因之起始密碼子之上游之約80 bp或80 bp以上之連續之區域具有啟動子活性(以下亦稱為「14020啟動子」)；編碼功能未知之蛋白質之BSFP_052240基因之啟動子，其於位於該基因之起始密碼子之上游之約100 bp或100 bp以上之連續之區域具有啟動子活性(以下亦稱為「48230啟動子」)。
表現構建物可由業者構建，例如，可藉由將啟動子併入於伯克氏菌屬細菌中自主複製之質體載體之任意位置，於啟動子序列之下游配置有助於表現目標基因之導入之多選殖位點或用於終止轉錄之終止子，而構建表現構建物。
表現構建物於宿主內自複製起點複製。由此，較佳為使用具有可於宿主內複製之複製起點之表現構建物。於伯克氏菌屬細菌等革蘭氏陰性細菌之情形時，較佳為具有可於革蘭氏陰性細菌中複製之複製起點之表現構建物。作為具有可於革蘭氏陰性細菌中複製之複製起點之質體載體，可例舉pBBR122載體。又，亦可使用具有與pBBR122不同之複製起點之pSa(Datta, American society for Microbiology, Washington, DC, pp9-15(1975)、Gorai et al., Plasmid 2 489-492 (1979)、Ward and Grinsted, Plasmid 7 239-250 (1982)、Tait et al., Mol. Gen. Genet. 186 10-15(1982))、或具有RK2ori之質體(T. J. Schmidhauser et al., Plasmid. 9(3) 325-30(1983))。
表現構建物進而可包含選擇標記、接合傳遞起點。表現構建物向伯克氏菌屬細菌之導入可藉由業者公知之方法進行。例如，可例舉接合傳遞法或電穿孔法等(Kim et al., Applied Biochemistry and Biotechnology, Vol.73, 81-88(1998))。
將於構建之表現構建物之啟動子之下游導入有目標基因之質體載體轉形為宿主細胞，可期待目標蛋白質於按照表現構建物所具有之選擇標記而選擇之轉形體中恆常表現。使用之穿梭載體、多選殖位點、及終止子並無特別限定。表現構建物亦包含導入有此種表現目標基因者。
目標基因可於啟動子序列之控制下配置於啟動子序列之下游，例如距啟動子序列30個鹼基以下，較佳為15個鹼基以下，更佳為6個鹼基以下，尤佳為直接連結。目標基因例如於編碼之蛋白質為分泌型之情形時，可具有訊息序列。
於目標基因之下游，例如可不配置終止子序列，較佳為配置終止子序列。終止子序列係使RNA(Ribonucleic acid，核糖核酸)聚合酶自DNA背離、終止轉錄之序列，通常可配置於基因之下游。作為終止子序列，並無特別限定，可使用公知之各種終止子序列。於表現目標基因編碼膽固醇酯酶之情形時，使用最初附著於該基因之天然之終止子序列亦較簡便，故而較佳。
關於目標蛋白質，為了其表現或活化等，摺疊酶或伴侶可與目標蛋白質同時表現。藉此，形成正確之立體結構之多肽鏈，進而生成具有正確之功能之蛋白質。於生產蛋白質之情形時，若需要摺疊酶或伴侶，則較佳為將蛋白質與摺疊酶或伴侶同時表現。
作為編碼伴侶之鹼基序列，並無特別限定，例如可為匹配宿主例如伯克霍爾德氏菌等伯克氏菌屬細菌等之密碼子使用頻度來改變公知之鹼基序列所得之鹼基序列。又，若為具有作為伴侶之功能之蛋白質，則可為編碼實質上均等之胺基酸序列之鹼基序列，亦可為編碼胺基酸序列之均等物之鹼基序列，該胺基酸序列例如為使伴侶之胺基酸序列中之不參與伴侶之功能之一部分胺基酸發生變異所得者，例如1個或複數個胺基酸缺失、置換或附加而成者。
若將摺疊酶或伴侶與目標蛋白質同時表現，則可配置於序列上互相遠離之位置，較佳為位於轉錄之起始所需之啟動子之下游。
為了將摺疊酶或伴侶與表現目標基因同時表現，可將摺疊酶序列或伴侶序列插入表現目標基因與終止子之間，將摺疊酶或伴侶藉由表現目標基因之啟動子表現。
於摺疊酶或伴侶於特定位置發揮功能之情形時，編碼其等之序列較佳為包含訊息序列。
於較佳之形態中，編碼摺疊酶之DNA可包含以下(i)～(iv)中之任一DNA：
(i)包含序列編號14～16之任一鹼基序列之DNA；
(ii)可與包含與序列編號14～16之任一鹼基序列互補之鹼基序列之DNA於嚴格之條件下雜交之DNA，藉由該DNA編碼之蛋白質具有摺疊酶活性；
(iii)包含序列編號14～16之任一鹼基序列中1個或複數個、較佳為1個或數個鹼基缺失、置換或附加而成之鹼基序列之DNA，藉由該DNA編碼之蛋白質具有摺疊酶活性；或，
(iv)包含與序列編號14～16之任一鹼基序列具有至少80%以上、較佳為90%以上之序列同源性、較佳為序列同一性之鹼基序列之DNA，藉由該DNA編碼之蛋白質具有摺疊酶活性。
目標蛋白質之生產可藉由於伯克氏菌屬細菌中表現目標基因而進行。較佳為可藉由培養藉由包含編碼目標基因之基因之表現構建物轉形之伯克氏菌屬細菌(轉形體)，自培養物單離純化目標基因編碼之蛋白質，而生產目標蛋白質。其中，培養物意指培養菌所得之菌體及固體或液體狀之培養液之混合物，轉形體可使用適合使用之宿主之培養基，藉由靜置培養法、利用轉瓶之培養法等進行培養。培養可藉由公知之方法進行，可根據使用之伯克氏菌屬細菌株之種類，適當決定使用之培養基或培養條件。
於目標蛋白質於菌體內生產之情形時，可藉由使伯克氏菌屬細菌破碎而採集蛋白質。又，於目標蛋白質於菌體外生產之情形時，直接使用培養液，或者藉由離心分離等去除宿主細胞。其後，可藉由將使用用於蛋白質之單離純化之各種層析法之一般生化方法單獨使用或適當組合使用，而自上述培養物中單離純化目標蛋白質。
於第二實施方式中，提供14020啟動子或48230啟動子。
14020啟動子或48230啟動子可廣泛用於任意伯克氏菌屬細菌中之目標基因之表現，於在特定染色體上之基因之功能受到抑制之伯克氏菌屬細菌中使用之情形時，與用於野生株之情形時相比，顯示出明顯較高之啟動子活性。
14020啟動子可包含以下(i)～(iv)中之任一DNA：
(i)包含序列編號7之鹼基序列中連續約超過80個、例如90個以上、100個以上之鹼基序列且具有啟動子活性之DNA；
(ii)可與包含序列編號7之鹼基序列中連續約超過80個、例如90個以上、100個以上之互補之鹼基序列之DNA於嚴格之條件下雜交且具有啟動子活性之DNA；
(iii)包含序列編號7之鹼基序列中連續約超過80個、例如90個以上、100個以上之鹼基序列之1個或複數個、較佳為1個或數個鹼基缺失、置換或附加而成之鹼基序列且具有啟動子活性之DNA；或，
(iv)包含與序列編號7中連續約超過80個、例如90個以上、100個以上之鹼基序列具有至少80%以上、較佳為90%以上之序列同源性、尤佳為序列同一性之鹼基序列且具有啟動子活性之DNA。
於較佳之形態中，14020啟動子例如可包含以下(i)～(iv)中之任一DNA：
(i)包含序列編號8之鹼基序列之DNA；
(ii)可與包含與序列編號8之鹼基序列互補之鹼基序列之DNA於嚴格之條件下雜交且具有啟動子活性之DNA；
(iii)包含序列編號8之鹼基序列中1個或數個鹼基缺失、置換或附加而成之鹼基序列且具有啟動子活性之DNA；
(iv)包含與序列編號8具有至少80%以上、較佳為90%以上之序列同源性、較佳為序列同一性之鹼基序列且具有啟動子活性之DNA。
48230啟動子可包含以下(i)～(iv)中之任一DNA：
(i)包含序列編號9之鹼基序列中連續約超過100個、例如110個以上、120個以上之鹼基序列且具有啟動子活性之DNA；
(ii)可與包含序列編號9之鹼基序列中連續約超過100個、例如110個以上、120個以上之互補之鹼基序列之DNA於嚴格之條件下雜交且具有啟動子活性之DNA；
(iii)包含序列編號9之鹼基序列中連續約超過100個、例如110個以上、120個以上之鹼基序列之1個或複數個、較佳為1個或數個鹼基缺失、置換或附加而成之鹼基序列且具有啟動子活性之DNA；或，
(iv)包含與序列編號9中連續約超過100個、例如110個以上、120個以上之鹼基序列具有至少80%以上、較佳為90%以上之序列同源性、較佳為序列同一性之鹼基序列且具有啟動子活性之DNA。
於較佳之形態中，48230啟動子例如可包含以下(i)～(iv)中之任一DNA：
(i)包含序列編號10之鹼基序列之DNA；
(ii)可與包含與序列編號10之鹼基序列互補之鹼基序列之DNA於嚴格之條件下雜交且具有啟動子活性之DNA；
(iii)包含序列編號10之鹼基序列中1個或數個鹼基缺失、置換或附加而成之鹼基序列且具有啟動子活性之DNA；
(iv)包含與序列編號10具有至少80%以上、較佳為90%以上之序列同源性、較佳為序列同一性之鹼基序列且具有啟動子活性之DNA。
於第三實施方式中，提供一種伯克氏菌屬細菌之變異株，其以例如選自由BSFP_068740、BSFP_068730及BSFP_068720所組成之群中之1個或複數個基因之表現或該基因編碼之蛋白質之表現受到抑制之方式修飾，該基因位於特定染色體上。
使用之伯克氏菌屬細菌可為天然存在者，亦可為人為作出者，只要抑制存在於特定染色體上之具有使質體等表現載體之穩定性喪失之功能之基因的功能即可。
於較佳之形態中，特定染色體上之基因以受到破壞、或者該基因之表現或該基因編碼之蛋白質之表現受到抑制之方式修飾。
該抑制可使用使目標基因之功能欠缺之公知之方法，例如，可例舉利用基因重組法之基因破壞、利用突然變異法之功能欠缺之誘導等。對於已經存在之天然或變異型之伯克氏菌屬細菌，可藉由亞硝基胍等變異劑處理、或紫外線、X射線或γ射線之照射等物理處理，引起所需之變異。又，可藉由使目標基因上游之啟動子區域欠缺、或使啟動子之功能欠缺，而抑制目標基因之表現。
作為使染色體自身缺失之方法，可使用於新洋蔥伯克霍爾德氏菌(Burkholderia cenocepacia)中實施之方法(Agnoli et al., Mol Microbiol., 83(2), 362-378(2012))、或於烏本伯克霍爾德氏菌(Burkholderia ubonensis)中實施之方法(Price et al., PLoS Negl Trop Dis.. 11(9): e0005928 (2017))。
作為分類為伯克氏菌屬之微生物，除上述伯克霍爾德氏菌以外，可例舉多噬伯克霍爾德氏菌(Burkholderia multivorans)、洋蔥伯克霍爾德氏菌、鼻疽伯克霍爾德氏菌(Burkholderia mallei)、莢殼伯克霍爾德氏菌(Burkholderia glumae)、雙向伯克霍爾德氏菌(Burkholderia ambifaria)、杜氏伯克霍爾德氏菌(Burkholderia dolosa)、唐菖蒲伯克霍爾德氏菌(Burkholderia gladioli)、植物伯克霍爾德氏菌(AZEGAMI et al., Int J Syst Evol Microbiol, 37(2): 144-152(1987)；Seo et al., BMC Genomics, 16: 346(2015))等。較佳為伯克霍爾德氏菌或斯沃蘭提卡伯克霍爾德氏菌。
由於伯克氏菌屬細菌存在於各種自然生態系統，故而培養伯克氏菌屬細菌之培養基或條件各不相同。例如為了培養伯克霍爾德氏菌，可於LB培養基(1% Bacto(商標)胰化蛋白、0.5% Bacto(商標)酵母萃取物、0.5%氯化鈉)中於30℃下培養。又，對於可於DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen，德國微生物菌種保藏中心)購入之菌株，DSMZ推薦之培養基及條件已作為培養條件公佈，可參照該培養條件。
於第四實施方式中，提供一種表現構建物之維持方法，其係於伯克氏菌屬細菌中維持表現構建物之方法，包括培養包含表現構建物之伯克氏菌屬細菌之步驟，該伯克氏菌屬細菌不具有例如選自由BSFP_068740、BSFP_068730及BSFP_068720所組成之群中之1個或複數個基因，或者該基因之表現或該基因編碼之蛋白質之表現受到抑制，該基因位於特定染色體上。
於較佳之形態中，培養後之伯克氏菌屬細菌中之表現構建物之拷貝數與特定染色體上之基因之功能未受到抑制之伯克氏菌屬細菌相比增大，及/或表現構建物之穩定性可增大。
藉由表現構建物之拷貝數或穩定性增大，可實現目標蛋白質之高表現。表現構建物之穩定性可將宿主中之表現構建物之穩定性、例如相對於在不含有抗生素之培養基上增殖之菌落數之在含有抗生素之培養基上增殖之菌落數(表現構建物攜帶率)作為指標，進行評價。
於第五實施方式中，提供一種表現構建物之穩定性之增大方法，其係於伯克氏菌屬細菌中增大表現構建物之穩定性之方法，包括培養包含表現構建物之伯克氏菌屬細菌之步驟，該伯克氏菌屬細菌不具有例如選自由BSFP_068740、BSFP_068730及BSFP_068720所組成之群中之1個或複數個基因，或者該基因之表現或該基因編碼之蛋白質之表現受到抑制，該基因位於特定染色體上。
[實施例]
以下，基於實施例等對本發明進行說明，但本發明之範圍並未限定於以下實施例等來解釋。又，關於以下所示之測定值等，根據測定之條件或使用設備之精度等，其值可發生變化。再者，於實施例中之瓊脂糖凝膠電泳中，使用GeneDireX公司製造之1Kb plus DNA梯狀標記RTU(Ready To Use，即用)作為分子量標記。該標記包含13個片段，分子量由小到大為100 bp、250 bp、500 bp、750 bp、1000 bp、1500 bp、2000 bp、3000 bp、4000 bp、5000 bp、6000 bp、8000 bp、10000 bp。
實施例 1 基因破壞株之製作 ( 同源重組 )於LB培養基(1% Bacto(商標)胰化蛋白、0.5% Bacto(商標)酵母萃取物、0.5%氯化鈉)中於30℃下對伯克霍爾德氏菌(寄存編號：NITE BP-02704)進行振盪培養，使其增殖至靜止期，將藉此所得之菌液500 μL分別添加於10 mL之LB培養基中，於30℃下培養12小時。
培養後，藉由離心分離(3,000 g，10分鐘，室溫)而對菌進行回收，藉由DNeasy(註冊商標)血液與組織套組(Blood＆Tissue Kit)(QIAGEN公司製造)提取全DNA。
將所得之伯克霍爾德氏菌之全DNA作為模板，使用序列編號17及18之合成寡去氧核糖核苷酸引子(以下簡寫為引子)，藉由聚合酶鏈反應法(以下簡寫為PCR：Saiki et al., Science、239 487-491(1988))進行DNA之擴增。再者，所使用之PCR用酶係KOD FX Neo(Toyobo公司製造)。其結果，獲得包含序列編號19之DNA。將藉由PCR反應擴增之該等DNA片段用於瓊脂糖凝膠電泳，自凝膠中切出，使用QIA快速凝膠提取套組(QIAGEN公司製造)進行純化。
又，將pK18mobsacB(SCHAFER et al., Gene、145(1) 69-73(1994))作為模板，同樣地使用序列編號20及序列編號21之引子，藉由PCR進行DNA之擴增。其結果，獲得包含約4.1 kb之DNA。對藉由PCR反應擴增之DNA片段同樣地藉由瓊脂糖凝膠電泳進行純化。
使用In-Fusion(註冊商標)HD選殖套組(TaKaRa公司製造)，將包含序列編號19與約4.1 kb之分別完成純化之DNA片段連結，轉形為大腸桿菌DH5α後，塗佈於包含50 μg/mL之康黴素之LB瓊脂培養基。於30℃下培養24小時後，將所得之菌落於包含50 μg/mL之康黴素之LB培養基中繼代培養，於37℃下培養12小時後，使用QIAprep質體小提套組(Spin Miniprep Kit)(QIAGEN公司製造)自培養液提取質體，獲得破壞株製作用之pK18mobsacB-P0205(圖1)。
將伯克霍爾德氏菌之全DNA作為模板，使用序列編號22與序列編號23、序列編號24與序列編號25、序列編號26與序列編號27、序列編號28與序列編號29、序列編號30與序列編號31、序列編號32與序列編號33之引子，藉由PCR進行DNA之擴增。對藉由PCR反應擴增之DNA片段同樣地藉由瓊脂糖凝膠電泳進行純化，獲得各DNA序列。分別設為BSFP_068720A、BSFP_068720B、BSFP_068730A、BSFP_068730B、BSFP_068740A、BSFP_068740B。
藉由EcoRI及HindIII(Takara Bio公司製造)對pK18mobsacB-P0205進行切割，並藉由瓊脂糖凝膠電泳進行純化。使用In-Fusion(註冊商標)HD選殖套組(Takara Bio公司製造)，將3個片段即所得之pK18mobsacB-P0205片段、BSFP_068720A及BSFP_068720B連結，轉形為大腸桿菌DH5α。同樣地，使用In-Fusion(註冊商標)HD選殖套組(Takara Bio公司製造)，將3個片段即pK18mobsacB-P0205片段、BSFP_068730A及BSFP_068730B、以及3個片段即pK18mobsacB-P0205片段、BSFP_068740A及BSFP_068740B亦連結，轉形為大腸桿菌DH5α。將所得之包含3個轉形體之大腸桿菌塗佈於包含50 μg/mL之康黴素之LB瓊脂培養基。於30℃下培養24小時後，將所得之菌落於包含50 μg/mL之康黴素之LB培養基中繼代培養，於37℃下培養12小時後，自培養液提取質體，獲得作為破壞用載體之pK18mobsacB-P0205-BSFP_068720、pK18mobsacB-P0205-BSFP_068730、pK18mobsacB-P0205-BSFP_068740。
將所得之各載體轉形為大腸桿菌DH5α，獲得DH5α(pK18mobsacB-P0205-BSFP_068720)、DH5α(pK18mobsacB-P0205-BSFP_068730)、DH5α(pK18mobsacB-P0205-BSFP_068740)。將作為輔助質體之pRK2013(ATCC37159)轉形為大腸桿菌HB101，獲得HB101(pRK2013)。
將伯克霍爾德氏菌接種於5 mL之LB培養基，於30℃下培養12小時，獲得伯克霍爾德氏菌培養液。又，將DH5α(pK18mobsacB-P0205-BSFP_068720)、DH5α(pK18mobsacB-P0205-BSFP_068730)、DH5α(pK18mobsacB-P0205-BSFP_068740)、HB101(pRK2013)接種於包含20 μg/mL之康黴素之10 mL之LB培養基，於37℃下培養12小時，獲得各大腸桿菌培養液。
對伯克霍爾德氏菌培養液1.5 mL進行離心分離(15,000 g，1分鐘，4℃)，獲得伯克霍爾德氏菌菌體。
又，對DH5α(pK18mobsacB-P0205-BSFP_068720)、DH5α(pK18mobsacB-P0205-BSFP_068730)、DH5α(pK18mobsacB-P0205-BSFP_068740)、HB101(pRK2013)培養液2 mL進行離心分離(15,000 g，1分鐘，4℃)，去除上清液，添加2 mL之LB培養基使其懸浮，再次對菌體進行離心分離(15,000 g，1分鐘，4℃)，獲得DH5α(pK18mobsacB-P0205-BSFP_068720)、DH5α(pK18mobsacB-P0205-BSFP_068730)、DH5α(pK18mobsacB-P0205-BSFP_068740)、HB101(pRK2013)菌體。
使伯克霍爾德氏菌菌體、DH5α(pK18mobsacB-P0205-BSFP_068720)菌體、HB101(pRK2013)菌體於100 μL之LB培養基中懸浮並混合，塗佈於LB瓊脂培養基。同樣地，使伯克霍爾德氏菌菌體、DH5α(pK18mobsacB-P0205-BSFP_068730)菌體、HB101(pRK2013)菌體懸浮，使伯克霍爾德氏菌菌體、DH5α(pK18mobsacB-P0205-BSFP_068740)菌體、HB101(pRK2013)菌體懸浮，分別塗佈於LB瓊脂培養基。將各瓊脂培養基於30℃下培養一晩。
過一晩後，使用細胞鋪展器刮取各生長之菌體，使其懸浮於1 mL之10 mM硫酸鎂溶液。將懸浮液稀釋10倍，將稀釋液100 μL接種於包含200 μg/mL之康黴素及50 μg/mL之安比西林之營養肉汁(Becton, Dickinson and Company公司製造)瓊脂培養基，於30℃下培養2日，獲得BSFP_068720、BSFP_068730、BSFP_068740破壞用一次重組體。
繼而，將各一次重組體接種於5 mL之LB培養基，於30℃下培養12小時。將所得之培養液使用LB培養基稀釋10
3～10
5倍，接種於包含0.33% Bacto(商標)胰化蛋白、0.17% Bacto(商標)酵母萃取物、0.5%氯化鈉、10%蔗糖、1.5%瓊脂之瓊脂培養基，於30℃下培養2日。
將所得之菌落接種於營養肉汁瓊脂培養基及包含200 μg/mL之康黴素之營養肉汁瓊脂培養基，選擇失去耐康黴素性之菌落，對於源自BSFP_068720一次重組之菌落使用序列編號34及序列編號35所記載之引子，對於源自BSFP_068730一次重組之菌落使用序列編號36及序列編號37所記載之引子，對於源自BSFP_068740一次重組之菌落使用序列編號38及序列編號39所記載之引子，實施PCR，並實施瓊脂糖凝膠電泳，長度與野生株相比變短(圖2)，由此，確認各基因變短，無法發揮功能。將該等株分別設為BSFP_068720破壞株、BSFP_068730破壞株、BSFP_068740破壞株。
實施例 2 基因破壞株之製作 ( 變異誘導 )將伯克霍爾德氏菌接種於100 mL之LB培養基，於28℃下培養20小時。對培養液30 mL進行離心分離，去除上清液，獲得菌體。於菌體中添加30 mL之0.85%氯化鈉水溶液，使其懸浮。於懸浮之菌體9.5 mL中添加0.5 mL三羥甲基胺基甲烷-馬來酸緩衝液(2 M三羥甲基胺基甲烷、2 M馬來酸，pH值6.2)後，添加50 mg/mL之1-甲基-3-硝基-1-亞硝基胍、1 mL之N,N-二甲基甲醯胺，於28℃下以200 rpm振盪60分鐘。振盪後，進行離心分離，去除上清液，於所得之菌體中添加10 mL之0.85%氯化鈉水溶液，使其懸浮。同樣地進行離心分離，去除上清液，於所得之菌體中添加10 mL之0.85%氯化鈉水溶液，使其懸浮，再次進行離心分離，獲得菌體。於菌體中添加10 mL之LB培養基，於28℃下以200 rpm振盪培養2小時。改變稀釋濃度以各100 μL接種於LB瓊脂培養基，於28℃下培養48小時。
使所得之菌落懸浮於20 μL之QIAprep質體小提套組(QIAGEN公司製造)之P1緩衝液，添加20 μL之P2緩衝液。將所得之溶液作為模板，使用序列編號40及41之引子，藉由PCR進行DNA之擴增。再者，所使用之PCR用酶係KOD FX Neo(Toyobo公司製造)。對於將未藉由該等引子組擴增之株於LB培養基中於30℃下振盪培養使其增殖至靜止期所得之菌液500 μL，將其添加於10 mL之LB培養基，於30℃下培養12小時。培養後，藉由離心分離回收菌體，藉由500 μL三羥甲基胺基甲烷-EDTA(Ethylenediaminetetraacetic acid，乙二胺四乙酸)(Tris- EDTA，TE)緩衝液進行再懸浮，添加50 μL蛋白酶K(20 mg/mL)及25 μL之10%SDS(Sodium dodecyl sulfonate，十二烷基磺酸鈉)，於55℃下培育30分鐘。反應後，添加600 μL苯酚、氯仿、異戊醇混合溶液(50：49：1)，攪拌後，進行離心分離。將所得之上清液移至其他管，藉由苯酚、氯仿、異戊醇混合液進行再提取後，於所得之上清液中添加50 μL之3 M乙酸鈉及350 μL異丙醇，使DNA沈澱，回收DNA，對於回收之DNA，藉由500 μL之70%乙醇洗淨2次。將DNA於室溫下風乾10分鐘，使其溶解於200 μL之去離子水。對於所得之DNA，按照TruSeq DNA PCR-Free Library Prep Kit(Illumina公司製造)之標準操作說明(350 bp Insert)進行序列庫製備。繼而，使用下一代定序儀HiSEq，於雙端(Paired end)、100鹼基/讀取進行DNAseq。確認輸出之讀取序列不包含染色體3。將進行DNAseq之該株作為染色體3缺失株。
實施例 3 膽固醇酯酶表現載體之製作藉由以下記載之方法，製作日本專利特開2019-205402號公報(前述)中記載之膽固醇酯酶表現載體。將實施例1中所得之伯克霍爾德氏菌之全DNA作為模板，使用序列編號42與序列編號43、序列編號44與序列編號45、序列編號46與序列編號47之引子，藉由PCR進行DNA之擴增。其結果，獲得2種終止子(序列編號48及49)、多選殖位點(BglII、NheI、SnaBI、SacI、KpnI、SpeI、BamHI、XbaI、NdeI)片段(序列編號50)。同樣地，將pBBR122質體(MoBiTec公司製造)作為模板，使用序列編號51、52之引子，進行DNA之擴增。將藉由PCR反應擴增之該等DNA片段用於瓊脂糖凝膠電泳，自凝膠中切出，使用QIA快速凝膠提取套組(QIAGEN公司製造)進行純化。使用In-Fusion(註冊商標)HD選殖套組(Takara Bio公司製造)，將完成純化之DNA片段連結，轉形為大腸桿菌DH5α後，塗佈於包含50 μg/mL之康黴素之LB瓊脂培養基。於30℃下培養24小時後，將所得之菌落於包含50 μg/mL之康黴素之LB培養基中繼代培養，於37℃下培養12小時後，使用QIAprep質體小提套組(QIAGEN公司製造)自培養液提取質體，獲得pBBR122-T-MCS-T。
將實施例1中所得之伯克霍爾德氏菌之全DNA作為模板，使用序列表中之序列編號53與54、55與56之引子，藉由PCR進行DNA之擴增。其結果，獲得編碼膽固醇酯酶及其伴侶之基因之DNA片段、及啟動子區域之DNA片段。將所得之DNA片段用於瓊脂糖凝膠電泳，自凝膠中切出，使用QIA快速凝膠提取套組(QIAGEN公司製造)進行純化。將pBBR122-T-MCS-T作為模板，使用序列表中之序列編號57、58之引子，進行DNA之擴增，對表現載體之DNA片段進行擴增。使用In-Fusion(註冊商標)HD選殖套組(Takara Bio公司製造)，將包含所得之表現載體DNA片段、之前獲得之編碼膽固醇酯酶及其伴侶之基因之DNA片段、及啟動子區域之DNA片段之純化DNA連結。將連結之DNA轉形為大腸桿菌DH5α後，塗佈於包含50 μg/mL之康黴素之LB瓊脂培養基。於30℃下培養24小時後，將所得之菌落於包含50 μg/mL之康黴素之LB培養基中繼代培養，於37℃下培養12小時後，使用QIAprep質體小提套組(QIAGEN公司製造)自培養液提取質體，獲得pBBR122-182(圖3)。
實施例 4 重組體之製作將伯克霍爾德氏菌野生株及實施例1、實施例2中所得之BSFP_068720破壞株、BSFP_068730破壞株、BSFP_068740破壞株、染色體3缺失株分別於LB培養基100 mL中於30℃下進行振盪培養直至對數增殖期後，藉由離心分離回收菌體。於回收之菌體中添加100 mL冰浴冷卻殺菌水，使其懸浮後，再次進行離心分離，回收菌體。再次重複該操作後，於回收之菌體中添加5 mL冷卻10%甘油溶液，使其充分懸浮，藉由離心分離回收菌體。
於回收之菌體中添加5 mL冰浴冷卻10%甘油溶液，使其懸浮，按各40 μL分注，於-80℃下冷凍，獲得野生株、BSFP_068720破壞株、BSFP_068730破壞株、BSFP_068740破壞株、染色體3缺失株各者之勝任細胞。將所得之勝任細胞於冰上融解，將pBBR122及實施例3中所得之pBBR122-182分別各添加約200～400 ng，並混合。將該混合液移至0.2 cm寬電穿孔比色管(Bio-Rad公司製造)，使用基因導入裝置基因脈衝儀II，以電場強度12.5 kV/cm、電容25 μF、外部電阻200 Ω分別施加電氣脈衝。將經電氣脈衝處理之菌體及DNA之混合液混合於1 mL之LB培養基中，於30℃下培養1小時後，將200 μL菌液塗佈於包含50 μg/mL之康黴素之LB培養基，於30℃下培養1日，獲得作為各表現載體之轉形體之野生株-pBBR122、野生株-pBBR122-182、BSFP_068720破壞株-pBBR122、BSFP_068720破壞株-pBBR122-182、BSFP_068730破壞株-pBBR122、BSFP_068730破壞株-pBBR122-182、BSFP_068740破壞株-pBBR122、BSFP_068740破壞株-pBBR122-182、染色體3缺失株-pBBR122、染色體3缺失株-pBBR122-182。
實施例 5 質體之拷貝數之確認將實施例4中所得之作為轉形體之野生株-pBBR122、BSFP_068720破壞株-pBBR122、BSFP_068730破壞株-pBBR122、BSFP_068740破壞株-pBBR122、染色體3缺失株-pBBR122接種於包含100 μg/mL康黴素之5 mL之LB培養基，於28℃下培養12小時。將該菌液以菌體濁度OD＝0.2之方式添加於包含100 μg/mL康黴素之5 mL之LB培養基，於28℃下培養24小時及48小時，分別獲得培養時間不同之菌體。分別藉由離心分離(3,000 g，10分鐘，室溫)回收培養24小時之菌體及培養48小時之菌體。
對於培養24小時之菌體，使用QIAamp DNA迷你套組(QIAGEN公司製造)提取全DNA。
為了確認質體之拷貝數，對於所得之各全DNA，藉由Choi KH et.al., Appl. Environ. Microbiol., 74(4) 1064-75 (2008)中記載之方法實施即時PCR。即，使用序列編號59及序列編號60之引子組，對作為染色體上之基因的天冬胺酸半醛去氫酶(aspartate-semialdehyde dehydrogenase)基因進行擴增。將所得之DNA片段用於瓊脂糖凝膠電泳，自凝膠中切出，使用QIA快速凝膠提取套組(QIAGEN公司製造)進行純化，獲得DNA片段。使用In-Fusion(註冊商標)HD選殖套組(Takara Bio公司製造)，將該DNA片段與藉由SmaI(Takara Bio公司製造)切割pBBR122所得之DNA片段連結。將連結之DNA轉形為大腸桿菌DH5α後，塗佈於包含50 μg/mL氯黴素之LB瓊脂培養基。於30℃下培養24小時後，將所得之菌落於包含50 μg/mL氯黴素之LB培養基中繼代培養，於37℃下培養12小時後，使用QIAprep質體小提套組(QIAGEN公司製造)自培養液提取質體，獲得pBBR122-asd。按照LightCycler FastStart DNA Master Plus SYBR Green I(Roche公司製造)之操作說明，將全DNA、pBBR122-asd、各引子組(用於算出染色體之拷貝數之序列編號61及序列編號62之引子組，用於算出質體之拷貝數之序列編號63及序列編號64之引子組)混合，製備樣品，使用LightCycler 480(Roche公司製造)，實施即時PCR。關於PCR條件，於改性95℃、10秒、退火60℃、30秒、延伸72℃、1秒之條件下實施。對於各基因，輸出藉由二次求導法(2nd Derivative Maximum)算出之Cp值。使用pBBR122-asd之Cp值繪製校準曲線，算出各株之質體之拷貝數(圖4)。其結果，野生株中之pBBR122約為30個拷貝，但BSFP_068720破壞株、BSFP_068730破壞株、BSFP_068740破壞株、染色體3缺失株中之pBBR122約為300～400個拷貝。由此表明，藉由使BSFP_068720、BSFP_068730、BSFP_068740之至少一者喪失功能，質體之拷貝數增加。
對於培養48小時之菌體，使用QIAprep質體小提套組(QIAGEN公司製造)提取質體。將所得之質體藉由XhoI(Takara Bio公司製造)切割，進行瓊脂糖凝膠電泳(圖5)。其結果，可見源自質體之單一訊息，與於野生株-pBBR122中相比，訊息於BSFP_068720破壞株-pBBR122、BSFP_068730破壞株-pBBR122、BSFP_068740破壞株-pBBR122、染色體3缺失株-pBBR122中較強。
以上結果表明，與向野生株導入pBBR122所得之株相比，向BSFP_068720、BSFP_068730、BSFP_068740分別被破壞之株導入pBBR122所得之株之利用瓊脂糖電泳所得之訊息較強，又，即時PCR結果表明，質體之拷貝數較多。又，表明與向野生株導入pBBR122所得之株相比，於向使包含BSFP_068720、BSFP_068730、BSFP_068740之染色體3缺失而成之株導入pBBR122所得之株中，質體之拷貝數亦較多。此亦表明，藉由使BSFP_068720、BSFP_068730、BSFP_068740之至少一者喪失功能，質體之拷貝數增加。
實施例 6 質體之穩定性之確認將實施例4中所得之作為轉形體之野生株-pBBR122-182、BSFP_068720破壞株-pBBR122-182、BSFP_068730破壞株-pBBR122-182、BSFP_068740破壞株-pBBR122-182、染色體3缺失株-pBBR122-182接種於5 mL之LB培養基，於28℃下培養24小時。將24小時後之培養液作為第一代，將第一代培養液2 μL接種於5 mL新LB培養基，於28℃下培養24小時。將所得之培養液作為第二代，將第二代培養液2 μL接種於5 mL新LB培養基，於28℃下培養24小時。將所得之培養液作為第三代。將第一代培養液、第三代培養液分別藉由LB培養基稀釋10
7倍，接種於LB瓊脂培養基及包含100 μg/mL康黴素之LB瓊脂培養基。於30℃下培養2日，測量生長之菌落數，作為菌落形成單元(CFU)。於LB瓊脂培養基中生長之菌落表示總菌數，於包含康黴素之LB培養基中生長之菌落表示攜帶質體之菌數，由此，由下述式計算質體攜帶率。
(式)質體攜帶率(%)＝包含康黴素之LB瓊脂培養基中之CFU/LB瓊脂培養基中之CFU×100
[表1]
| 第一代 | 第三代 | |||||
| Km(-) | Km(+) | 質體攜帶率(%) | Km(-) | Km(+) | 質體攜帶率(%) | |
| 野生株-pBBR122-182 | 145 | 0 | 0 | 138 | 0 | 0 |
| ΔBSFP_068720-pBBR122-182 | 92 | 111 | 121 | 91 | 89 | 98 |
| ΔBSFP_068730-pBBR122-182 | 103 | 81 | 79 | 90 | 85 | 94 |
| ΔBSFP_068740-pBBR122-182 | 88 | 97 | 110 | 104 | 76 | 73 |
| 染色體3缺失株-pBBR122-182 | 100 | 90 | 90 | 88 | 82 | 93 |
表中之數值表示稀釋10
7倍之培養液之CFU。又，表中之Km(-)表示LB瓊脂培養基中之CFU，Km(+)表示包含100 μg/mL康黴素之LB瓊脂培養基中之CFU。
如表1所示，於野生株中加入表現載體之株之情形時，若於不包含康黴素之LB液體培養基中培養一次，則質體脫落。另一方面，於BSFP_068720、BSFP_068730、BSFP_068740之任一者被破壞之株、或者使包含該等3個基因之染色體3缺失而成之株之情形時，即便於不包含康黴素之LB培養基中繼代三次，質體亦不易脫落。以上結果表明，藉由使BSFP_068720、BSFP_068730、BSFP_068740之至少一者喪失功能，於菌體內穩定地攜帶質體。
實施例 7 膽固醇酯酶生產性之確認將實施例4中所得之轉形體中之野生株-pBBR122-182、BSFP_068720破壞株-pBBR122-182、BSFP_068730破壞株-pBBR122-182、BSFP_068740破壞株-pBBR122-182、染色體3缺失株-pBBR122-182分別接種於包含100 μg/mL康黴素之5 mL之YSO培養基(3%酵母萃取物、3%山梨醇、3%油酸甲酯，pH值7.0)，於28℃下培養72小時。培養後，使用以下酵素活性測定法，對各株生產之膽固醇酯酶之量進行評價。
＜酵素活性測定法＞
製備以如下所述之濃度含有下述試劑之反應試劑。
[反應試劑]
40 mM 磷酸鉀緩衝液(pH值6.8)
0.02% TODB(N,N-Bis(4-sulfobutyl)-3-methylaniline, disodium salt，N,N-雙(4-磺丁基)-3-甲基苯胺二鈉鹽)(同仁化學研究所)
10 U/mL 過氧化酶
0.3% Triton X-100
2.5 U/mL 膽固醇氧化酶
10% 胎牛血清液
0.035% 4-胺基安替比林
將反應試劑於37℃下預加溫10分鐘，使用日立7080自動分析裝置(日立製作所(股)製造)，於150 μL反應試劑中添加3 μL重組型膽固醇酯酶溶液，於37℃下進行反應。對添加後76.69秒至119.53秒之主波長546 nm、副波長660 nm時之吸光度進行測定，獲得每單位時間之吸光度變化量(ΔA/min)。將由下述式所得之值定義為膽固醇酯酶活性，算出膽固醇酯酶活性。
(式)
膽固醇酯酶活性(U/mL)＝ΔA/min÷18×(150＋3)÷3÷1000
{式中，ΔA/min表示對添加上述反應試劑後76.69秒至119.53秒之主波長546 nm、副波長660 nm時之吸光度進行測定所得之每單位時間之吸光度變化量。18意指TODB與4-胺基安替比林之氧化縮合反應物之550 nm時之毫莫耳分子吸光係數，150＋3意指反應總體積(反應試劑之體積＋重組型脂肪酶溶液之體積)，3意指上述重組型膽固醇酯酶溶液之體積}
分別獨立培養3次，對各株生產之膽固醇酯酶之活性進行測定(圖6)。
如圖6所示，表明與向野生株導入膽固醇酯酶表現載體所得之株相比，於向BSFP_068720、BSFP_068730、BSFP_068740分別被破壞之株導入膽固醇酯酶表現載體所得之株中，膽固醇酯酶活性較高，膽固醇酯酶生產量提高。又，與向野生株導入膽固醇酯酶表現載體所得之株相比，於向使包含BSFP_068720、BSFP_068730、BSFP_068740之染色體3缺失而成之株導入膽固醇酯酶表現載體所得之株中，膽固醇酯酶活性亦較高，膽固醇酯酶生產量亦提高。由此可知，若BSFP_068720、BSFP_068730、BSFP_068740之至少一者受到破壞而喪失功能，則即便除上述3個基因以外之基因受到破壞而喪失功能，膽固醇酯酶生產量亦提高。認為藉由於實施例5及實施例6中質體之拷貝數增加，穩定性增加，從而膽固醇酯酶生產量提高。
實施例 8 其他質體之情形時之效果之確認為了確認除pBBR122以外之質體之情形時之BSFP_068720、BSFP_068730、BSFP_068740破壞之效果，使用具有與pBBR122不同之複製起點之質體pSa(Datta, American society for Microbiology, Washington, DC, pp9-15(1975)、Gorai et al., Plasmid 2 489-492 (1979)、Ward and Grinsted, Plasmid 7 239-250 (1982)、Tait et al., Mol. Gen. Genet. 186 10-15(1982))，確認質體之穩定性。藉由基因全合成製作包含pSa之起點(origin)且包含與pBBR122相同之耐康黴素性基因及耐氯黴素性基因之區域，獲得序列編號65所表示之pSa質體。
與實施例4同樣地，藉由電穿孔法將pSa質體導入至野生株、BSFP_068720破壞株、BSFP_068730破壞株、BSFP_068740破壞株、染色體3缺失株各者之勝任細胞，獲得作為轉形體之野生株-pSa、BSFP_068720破壞株-pSa、BSFP_068730破壞株-pSa、BSFP_068740破壞株-pSa、染色體3缺失株-pSa。
將該等轉形體接種於包含100 μg/mL康黴素之5 mL之LB培養基，於28℃下培養12小時。將該菌液以菌體濁度OD＝0.2之方式添加於包含100 μg/mL康黴素之5 mL之LB培養基，於28℃下培養24小時及48小時，分別獲得培養時間不同之菌體。對於培養24小時及48小時之菌體，使用QIAprep質體小提套組(QIAGEN公司製造)提取質體。將所得之質體藉由XhoI(Takara Bio公司製造)切割，進行瓊脂糖凝膠電泳(圖7)。其結果，於野生株-pSa中未見源自質體之訊息，但於BSFP_068720破壞株-pSa、BSFP_068730破壞株-pSa、BSFP_068740破壞株-pSa、染色體3缺失株-pSa中可見源自質體之單一訊息。
以上結果表明，與向野生株導入pSa所得之株相比，向BSFP_068720、BSFP_068730、BSFP_068740分別被破壞之株導入pSa所得之株之利用瓊脂糖電泳之訊息較強。又，表明與向野生株導入pSa所得之株相比，於向使包含BSFP_068720、BSFP_068730、BSFP_068740之染色體3缺失而成之株導入pSa所得之株中，質體之拷貝數亦較多。由此表明，不僅於pBBR122中，於pSa質體中亦是藉由使BSFP_068720、BSFP_068730、BSFP_068740之至少一者喪失功能，質體之拷貝數增加。
又，為了進而確認其他質體之情形時之效果，使用具有與pBBR122不同之複製起點即RK2ori之質體(T. J. Schmidhauser et al., Plasmid. 9(3) 325-30(1983))，確認膽固醇酯酶活性。對具有RK2ori之質體所需之區域即包含RK2ori、trpA之區域、及包含pBBR122之耐康黴素性基因之區域、182啟動子、膽固醇酯酶及其摺疊酶、及終止子區域進行基因全合成，獲得序列編號66所表示之pRK2-182質體。與實施例4同樣地轉形為各破壞株，與實施例7同樣地確認於28℃下培養72小時後之膽固醇酯酶活性。如圖8所示，表明與向野生株導入膽固醇酯酶表現載體所得之株相比，於向BSFP_068720、BSFP_068730、BSFP_068740分別被破壞之株導入膽固醇酯酶表現載體所得之株中，膽固醇酯酶活性較高，膽固醇酯酶生產量提高。又，與向野生株導入膽固醇酯酶表現載體所得之株相比，於向使包含BSFP_068720、BSFP_068730、BSFP_068740之染色體3缺失而成之株導入膽固醇酯酶表現載體所得之株中，膽固醇酯酶活性較高，膽固醇酯酶生產量提高。由此可知，若BSFP_068720、BSFP_068730、BSFP_068740之至少一者受到破壞而喪失功能，則即便除上述3個基因以外之基因受到破壞而喪失功能，膽固醇酯酶生產量亦提高。由此表明，不僅於pBBR122中，於pRK2質體中亦是藉由使BSFP_068720、BSFP_068730、BSFP_068740之至少一者喪失功能，膽固醇酯酶生產性提高。
以上結果表明，於作為除pBBR122以外之質體之pSa、pRK2中，亦可見相同之拷貝數增加，藉此膽固醇酯酶生產性提高。
實施例 9 其他蛋白質表現之效果之確認為了確認除膽固醇酯酶以外之蛋白質表現中之BSFP_068720、BSFP_068730、BSFP_068740破壞之效果，對序列編號67所表示之包含源自植物伯克霍爾德氏菌(Burkholderia plantarii)(ATCC43733)之脂肪酶基因及其伴侶基因之DNA序列進行全合成。將全合成基因作為模板，使用序列編號68及序列編號69所表示之引子，進行PCR，藉由瓊脂糖凝膠電泳切出擴增片段，使用QIA快速凝膠提取套組(QIAGEN公司製造)進行純化，獲得BpLip(Burkholderia plantarii之脂肪酶)片段。將pBBR122-182作為模板，使用序列編號70及序列編號71所表示之引子，進行PCR，同樣地進行瓊脂糖凝膠電泳、使用QIA快速凝膠提取套組(QIAGEN公司製造)之純化。使用In-Fusion(註冊商標)HD選殖套組(Takara Bio公司製造)，將所得之序列及BpLip片段連結，轉形為大腸桿菌DH5α後，塗佈於包含50 μg/mL之康黴素之LB瓊脂培養基。於30℃下培養24小時後，將所得之菌落於包含50 μg/mL之康黴素之LB培養基中繼代培養，於37℃下培養12小時後，使用QIAprep質體小提套組(QIAGEN公司製造)自培養液提取質體，獲得pBBR122-BpLip。
又，對序列編號72所表示之包含源自洋蔥伯克霍爾德氏菌(Burkholderia cepacia)之脂肪酶基因之DNA序列進行全合成。將全合成基因作為模板，使用序列編號73及序列編號74所表示之引子，進行PCR，藉由瓊脂糖凝膠電泳切出擴增片段，使用QIA快速凝膠提取套組(QIAGEN公司製造)進行純化，獲得BcLip(Burkholderia cepacia之脂肪酶)片段。將pBBR122-182作為模板，使用序列編號70及序列編號75所表示之引子，進行PCR，同樣地進行瓊脂糖凝膠電泳、使用QIA快速凝膠提取套組(QIAGEN公司製造)之純化。使用In-Fusion(註冊商標)HD選殖套組(Takara Bio公司製造)，將所得之序列及BcLip片段連結，轉形為大腸桿菌DH5α後，塗佈於包含50 μg/mL之康黴素之LB瓊脂培養基。於30℃下培養24小時後，將所得之菌落於包含50 μg/mL之康黴素之LB培養基中繼代培養，於37℃下培養12小時後，使用QIAprep質體小提套組(QIAGEN公司製造)自培養液提取質體，獲得pBBR122-BcLip。
與實施例4同樣地，藉由電穿孔法將pBBR122-BpLip或pBBR122-BcLip導入至野生株及染色體3缺失株各者之勝任細胞，獲得作為轉形體之野生株-pBBR122-BpLip、染色體3缺失株-pBBR122-BpLip、野生株-pBBR122-BcLip、染色體3缺失株-pBBR122-BcLip。將各轉形體接種於包含100 μg/mL康黴素之5 mL之YS培養基(3%酵母萃取物、3%山梨醇，pH值7.0)，於28℃下培養72小時。培養後，使用T.Yamaguchi et al., Agr. Biol. Chem. 37 (1973)中記載之酵素活性測定法，對各株生產之脂肪酶之量進行評價，測定各株生產之脂肪酶之活性(圖9、圖10)。
如圖9、圖10所示，與向野生株導入包含源自植物伯克霍爾德氏菌之脂肪酶、或源自洋蔥伯克霍爾德氏菌之脂肪酶之表現載體所得之株相比，於向使包含BSFP_068720、BSFP_068730、BSFP_068740之染色體3缺失而成之株導入該表現載體所得之株中，脂肪酶活性較高，脂肪酶之生產量提高。由此可知，若BSFP_068720、BSFP_068730、BSFP_068740之至少一者受到破壞而喪失功能，則即便除上述3個基因以外之基因受到破壞而喪失功能，脂肪酶生產量亦提高。以上結果表明，藉由使BSFP_068720、BSFP_068730、BSFP_068740之至少一者喪失功能，導入至表現載體之目標蛋白質之生產量提高。
實施例 10 使用新啟動子之表現載體之製作將實施例1中所得之伯克霍爾德氏菌之全DNA作為模板，使用序列表中之序列編號76與77、78與79之引子，藉由PCR進行DNA之擴增。其結果，分別獲得作為啟動子區域之DNA片段之14020啟動子DNA片段及48230啟動子DNA片段。將所得之DNA片段用於瓊脂糖凝膠電泳，自凝膠中切出，使用QIA快速凝膠提取套組(QIAGEN公司製造)進行純化。將pBBR122-182作為模板，使用序列編號80及81之引子，進行DNA之擴增，對表現載體之DNA片段進行擴增。使用In-Fusion(註冊商標)HD選殖套組(Takara Bio公司製造)，將所得之表現載體DNA片段與14020啟動子DNA片段、表現載體DNA片段與48230啟動子DNA片段分別連結。將連結之各DNA轉形為大腸桿菌DH5α後，塗佈於包含50 μg/mL之康黴素之LB瓊脂培養基。於30℃下培養24小時後，將所得之菌落於包含50 μg/mL之康黴素之LB培養基中繼代培養，於37℃下培養12小時後，使用QIAprep質體小提套組(QIAGEN公司製造)自培養液提取質體，分別獲得膽固醇酯酶基因之上游之啟動子替換成新啟動子之表現載體即pBBR122-14020及pBBR122-48230。
實施例 11 藉由新啟動子生產之膽固醇酯酶活性之確認將實施例4中製作之染色體3缺失株之勝任細胞於冰上融解，將實施例10中所得之pBBR122-14020或pBBR122-48230分別各添加約200～400 ng，並混合。將該混合液移至0.2 cm寬電穿孔比色管(Bio-Rad公司製造)，使用基因導入裝置基因脈衝儀II，以電場強度12.5 kV/cm、電容25 μF、外部電阻200 Ω分別施加電氣脈衝。將經電氣脈衝處理之菌體及DNA之混合液混合於1 mL之LB培養基中，於30℃下培養1小時後，將200 μL菌液塗佈於包含50 μg/mL之康黴素之LB培養基，於30℃下培養1日，獲得作為轉形體之染色體3缺失株-pBBR122-14020、染色體3缺失株-pBBR122-48230。
將該等轉形體及實施例4中所得之染色體3缺失株-pBBR122-182分別接種於包含100 μg/mL之康黴素之5 mL培養基(4%酵母萃取物、1.5%山梨醇、1.5%甘油、5%油酸甲酯，pH值6.5)，於28℃下培養72小時。培養後，使用實施例7中記載之酵素活性測定法，對各株生產之膽固醇酯酶之量進行評價。
[表2]
| 膽固醇酯酶活性(U/mL) | |
| 染色體3缺失株-pBBR122-182 | 111.0 |
| 染色體3缺失株-pBBR122-14020 | 146.4 |
| 染色體3缺失株-pBBR122-48230 | 145.2 |
如表2所示，使用14020啟動子、48230啟動子作為啟動子之轉形體之膽固醇酯酶生產量高於使用日本專利特開2019-205402號公報(前述)中記載之膽固醇酯酶表現載體即pBBR122-182作為啟動子之轉形體。由此表明，14020啟動子、48230啟動子對目標蛋白質表現非常有用。
實施例 12 由新啟動子之長度之不同引起之表現量之確認藉由以下方法製作新啟動子之長度縮短之表現載體。將實施例1中所得之伯克霍爾德氏菌之全DNA作為模板，與實施例10同樣地使用序列編號82與77、83與77、84與77、85與77、86與77、87與77、88與77、89與77、90與77、91與77、92與77、93與77、94與77、95與77、96與77、97與77之引子組，進行利用PCR之DNA擴增、瓊脂糖電泳、及自凝膠之提取，獲得DNA片段。將各DNA片段設為14020-250、14020-200、14020-150、14020-100、14020-90、14020-80、14020-70、14020-60、14020-50、48230-250、48230-200、48230-150、48230-140、48230-130、48230-120、48230-110。各者表示「啟動子名稱-啟動子之長度」，例如14020-250係用於製作14020啟動子之長度設為250 bp者之DNA片段。
與實施例10同樣地操作，將各DNA片段即14020-250、14020-200、14020-150、14020-100、14020-90、14020-80、14020-70、14020-60、14020-50、48230-250、48230-200、48230-150、48230-140、48230-130、48230-120、48230-110、及實施例10中製作之pBBR122-182作為模板，使用序列編號80及81之引子，進行DNA擴增，使用In-Fusion(註冊商標)HD選殖套組(Takara Bio公司製造)將藉此所得之表現載體之DNA片段連結，與實施例10同樣地進行向大腸桿菌之轉形、培養、質體之提取，獲得作為表現載體之pBBR122-14020-250、pBBR122-14020-200、pBBR122-14020-150、pBBR122-14020-100、pBBR122-14020-90、pBBR122-14020-80、pBBR122-14020-70、pBBR122-14020-60、pBBR122-14020-50、pBBR122-48230-250、pBBR122-48230-200、pBBR122-48230-150、pBBR122-48230-140、pBBR122-48230-130、pBBR122-48230-120、pBBR122-48230-110。
與實施例11同樣地將該等表現載體轉形為染色體3缺失株之勝任細胞，獲得各啟動子長度縮短之轉形體即染色體3缺失株-pBBR122-14020-250、染色體3缺失株-pBBR122-14020-200、染色體3缺失株-pBBR122-14020-150、染色體3缺失株-pBBR122-14020-100、染色體3缺失株-pBBR122-14020-90、染色體3缺失株-pBBR122-14020-80、染色體3缺失株-pBBR122-14020-70、染色體3缺失株-pBBR122-14020-60、染色體3缺失株-pBBR122-14020-50、染色體3缺失株-pBBR122-48230-250、染色體3缺失株-pBBR122-48230-200、染色體3缺失株-pBBR122-48230-150、染色體3缺失株-pBBR122-48230-140、染色體3缺失株-pBBR122-48230-130、染色體3缺失株-pBBR122-48230-120、染色體3缺失株-pBBR122-48230-110。藉由與實施例11相同之方法，分別對該等轉形體、實施例10中所得之染色體3缺失株-pBBR122-14020、染色體3缺失株-pBBR122-48230進行培養，使用實施例7中記載之酵素活性測定法，對各株生產之膽固醇酯酶之量進行評價。對於14020啟動子，使用下述式求出針對300 bp長之啟動子之相對膽固醇酯酶活性(圖11)。
(式)(上述轉形體生產之膽固醇酯酶活性)÷(染色體3缺失株-pBBR122-14020生產之膽固醇酯酶活性)×100
同樣地，對於48230啟動子，使用下式求出針對300 bp長之啟動子之相對膽固醇酯酶活性。
(式)(上述轉形體生產之膽固醇酯酶活性)÷(染色體3缺失株-pBBR122-48230生產之膽固醇酯酶活性)×100
如圖11所示，14020啟動子及48230啟動子即便短於300 bp，亦可生產膽固醇酯酶。
實施例 13 其他伯克氏菌屬細菌之情形時之效果之確認為了確認本發明亦可應用於其他伯克氏菌屬細菌，對除伯克霍爾德氏菌以外之伯克氏菌屬細菌是否攜帶BSFP_068720、BSFP_068730、BSFP_068740進行研究。與實施例1同樣地操作，自斯沃蘭提卡伯克霍爾德氏菌(NBRC106337)提取全DNA。將所得之斯沃蘭提卡伯克霍爾德氏菌之全DNA或實施例1中所得之伯克霍爾德氏菌之全DNA作為模板，使用可對包含BSFP_068720、BSFP_068730、BSFP_068740之區域進行擴增之序列編號98及99之引子，藉由PCR進行DNA之擴增。將所得之DNA片段用於瓊脂糖凝膠電泳，其結果，與伯克霍爾德氏菌同樣地，於斯沃蘭提卡伯克霍爾德氏菌中亦可見DNA擴增(圖12)。根據該結果，斯沃蘭提卡伯克霍爾德氏菌攜帶BSFP_068720、BSFP_068730、BSFP_068740之同源基因，藉由將該等基因破壞，可期待高生產化或表現構建物之拷貝數之增加。
圖1表示基因破壞用載體之製作過程。
圖2表示野生株(1)與基因破壞株之破壞基因部分(2)之PCR(polymerase chain reaction，聚合酶鏈反應)產物之電泳結果(下側)、及野生株之基因與破壞之基因之模式圖(上側)。
圖3表示膽固醇酯酶表現載體。
圖4表示自導入pBBR122之野生株、BSFP_068720破壞株、BSFP_068730破壞株、BSFP_068740破壞株、染色體3缺失株提取之pBBR122於各細菌中之拷貝數。
圖5表示自導入pBBR122之野生株、BSFP_068720破壞株、BSFP_068730破壞株、BSFP_068740破壞株、染色體3缺失株提取之pBBR122之電泳結果。
圖6表示導入不包含膽固醇酯酶基因之pBBR122或包含膽固醇酯酶基因之pBBR122-182之野生株、BSFP_068720破壞株、BSFP_068730破壞株、BSFP_068740破壞株、染色體3缺失株中之膽固醇酯酶活性。
圖7表示自導入pSa之野生株、BSFP_068720破壞株、BSFP_068730破壞株、BSFP_068740破壞株、染色體3缺失株提取之pSa之電泳結果。
圖8表示導入pRK2-182之野生株、BSFP_068720破壞株、BSFP_068730破壞株、BSFP_068740破壞株、染色體3缺失株中之膽固醇酯酶活性。
圖9表示導入包含源自洋蔥伯克霍爾德氏菌(Burkholderia cepacia)之脂肪酶之載體之野生株、BSFP_068720破壞株、BSFP_068730破壞株、BSFP_068740破壞株、染色體3缺失株中之脂肪酶活性。
圖10表示導入包含源自植物伯克霍爾德氏菌(Burkholderia plantarii)之脂肪酶之載體之野生株、BSFP_068720破壞株、BSFP_068730破壞株、BSFP_068740破壞株、染色體3缺失株中之脂肪酶活性。
圖11表示縮短14020啟動子及48230啟動子時之膽固醇酯酶之表現量。
圖12表示將斯沃蘭提卡伯克霍爾德氏菌(Burkholderia silvatlantica)之全DNA及伯克霍爾德氏菌之全DNA作為模板、使用序列編號98及99之引子並藉由PCR所得之擴增產物之電泳結果。
<![CDATA[<110> 國立研究開發法人產業技術總合研究所(National Institute of Advanced Industrial Science and Technology)]]>
日商旭化成製藥股份有限公司(Asahi Kasei Pharma Corporation)
<![CDATA[<120> 目標蛋白質之生產方法]]>
<![CDATA[<130> 201027WO01]]>
<![CDATA[<150> JP2021-025664]]>
<![CDATA[<151> 2021-02-19]]>
<![CDATA[<160> 99 ]]>
<![CDATA[<170> PatentIn第3.5版]]>
<![CDATA[<210> 1]]>
<![CDATA[<211> 864]]>
<![CDATA[<212> DNA]]>
<![CDATA[<213> 伯克氏菌屬細菌]]>
<![CDATA[<400> 1]]>
atgacctcga ttagcaaacg tcatagccgc caacccgtct tccggcggat tggcagcggg 60
accgaatttc ggacaggcac agcggacgcg atagacgacg cgcccgaggc gtacgcccca 120
gacaggaggg aggaactgct tgacgaaggg gacgatgagt cccgtcgtcc agtggactgc 180
ggccaggaga aggcgctttt cgaaggcgac tcgtcgacgc taccgtatga cgtgcgccgg 240
gcgtacgcgc tgcttcttcg cggtccatcc attgacgaac gtcacagcaa actctggcca 300
gtcctgatcg atcatgaact gcgattgcga cagttgctac acgcggcctt cctcgatctc 360
gtcatcgatc gggagcaaaa aatcgcattt gcacgcccgg tcgatgctcc ggagctcgac 420
gtgccgcaac ttctgcggga ggtccggctt actttcgttg attccgctct ggtgcttttc 480
ctgaggatgg agctgactct ggctgaggcc gaaggccgcc gtgcaacggt ttcccggtcc 540
gaaatggtcg atcatctcaa agcgtatgaa gctagcgata atgttgaccg agcccgcttt 600
agcaggcagg tcgaggcggc gattgaaaag gccaagaaat acaacttcct tcgcctgatt 660
cgtaatagcg gagatcgctt cgaggtgtcg ccagcgctca agctggtgtt ctcacatgag 720
cagataagcg aactgtcgcg aacctatcgg cgtatcaggg aacaggcgga cggaagacca 780
gcagaggtcg atggcgcggg gagttttccg ggcgtcgacg agccggacga atttgacgaa 840
gacagtgtga tggacgggga gtga 864
<![CDATA[<210> 2]]>
<![CDATA[<211> 287]]>
<![CDATA[<212> PRT]]>
<![CDATA[<213> 伯克氏菌屬細菌]]>
<![CDATA[<400> 2]]>
Met Thr Ser Ile Ser Lys Arg His Ser Arg Gln Pro Ala Phe Arg Arg
1 5 10 15
Met Gly Gly Gly Thr Glu Phe Arg Thr Gly Ile Ala Asp Val Ile Asp
20 25 30
Asp Ala Pro Glu Val Ser Asp Leu Asp Gly Arg Glu Glu Leu Phe Asp
35 40 45
Glu Arg Asp Asp Glu Pro His Arg Pro Val Asp Gly Gly Gln Glu Arg
50 55 60
Ala Leu Phe Glu Gly Asp Ser Ser Thr Leu Pro Tyr Asp Val Arg Arg
65 70 75 80
Ala Tyr Ala Leu Leu Leu Arg Gly Pro Ser Ile Asp Glu Arg His Ser
85 90 95
Arg Leu Trp Pro Val Leu Ile Asp His Glu Leu Arg Leu Arg Gln Leu
100 105 110
Leu His Ala Ala Phe Leu Asp Leu Val Ile Asp Arg Glu Gln Lys Ile
115 120 125
Ala Phe Ala Arg Pro Val Tyr Ala Pro Glu Leu Asp Val Pro Gln Leu
130 135 140
Leu Arg Glu Val Arg Leu Thr Phe Val Asp Ser Ala Leu Val Leu Phe
145 150 155 160
Leu Arg Met Glu Leu Thr Leu Ala Glu Ala Glu Gly Arg Arg Ala Thr
165 170 175
Ile Ser Arg Ser Glu Met Val Asp His Leu Lys Ala Tyr Glu Ala Ser
180 185 190
Asp Asn Val Asp Arg Ala Arg Phe Ser Arg Gln Val Glu Ala Ala Ile
195 200 205
Glu Lys Ala Lys Lys Tyr Asn Phe Leu Arg Leu Ile Arg Asn Ser Gly
210 215 220
Asp Arg Phe Glu Val Ser Pro Ala Leu Lys Leu Val Phe Ser His Glu
225 230 235 240
Gln Ile Ser Glu Leu Ser Leu Thr Tyr Arg Arg Ile Arg Glu Gln Ala
245 250 255
Asp Gly Arg Pro Ala Val Asp Asp Gly Ala Gly Ser Met Pro Ser Val
260 265 270
Asp Glu Pro Asp Glu Phe Asp Glu Asp Ser Val Thr Asp Gly Glu
275 280 285
<![CDATA[<210> 3]]>
<![CDATA[<211> 3450]]>
<![CDATA[<212> DNA]]>
<![CDATA[<213> 伯克氏菌屬細菌]]>
<![CDATA[<400> 3]]>
gtggagacag cccagctatt cgaggatccg gaattgtcgc cggcagcggc ggacgagacg 60
gcgcataggg gagaggatca tcgcccgaca tggagcgatt acgatctcga agaagcgggg 120
caacagcagt tcaggctgcg gcaaatgcag gtcatgaact gggggacgtt tagcaagctc 180
cacgtattcg atatctcgcc gcgcggacac ttgctcgttg ggccgtccgg atcgggcaag 240
tcgaccattc tcgatgcgca ttcggcgttg atggcgccgc cgaattcaga gttcaatgcc 300
gccgcccggg gtaacgataa agtcacccgc gatcggacga tggtcactta tgtgcgcggg 360
gcttgggcta cgcaggaatc ggaggaaggg atcatcgctg cgcagtacct gcggcctgac 420
accaccctta gtgcagtcgc cgaggtgtat gcaaacgcac aggggcagat gctgacgctg 480
gtcggcatgt ggtggatcaa gggtaagtcg acactcgcaa aggacgtgcg acactgtttc 540
ttcgtgatcg aacgggaatt cagtctcaag gaactgtcgt tcttcatgca ggccgactac 600
aatctgcgct cgtttgcaaa gcatcttccg gaagtcaaac ctttcgatac gcacgcgtcc 660
ttccgtgaac gcttcaaggc gcgcctcggt atcgaccacg acctggcgtt gcgactgctt 720
cacaggacgc agtcgtcgaa gaatctgggt gatatcaacg cgttcatgcg tgacaatatg 780
ctggacgagc cccaaacgtt cagcctcgcc aaagcgctct gcgacgactt caacacgctg 840
gcagcggccc accaggacgt cgtggaggcc cgtaagcagc gggacctgct gaacctcgca 900
cgtttgcatc atgagctgta tcaggagcat cacacggagg tcgccagggt cgacgaactg 960
ctgaagcagc tggaccatca ccgcgaatat ctgcaataca cgttgcgtgg caggcgtgtg 1020
gacgagttga agattgtgct caaagggctg caccagagcg tcgatgcatt ggcccggaag 1080
gcgaacgacg agcagaccga actccagcga ttgatgacgc agcgtgccgg catgaacgac 1140
ggcaatgtcg caggactaca gtcgcagttg gccacgaagg aaacgcaact gaagcaggtt 1200
cgccgtgcac gtgcacgggt gtcagtctgg ctccagacgc tcgggtggcc tgagccgcaa 1260
gatgctggcc attttggcga atgtgtcggc cgcgctgggg tgctgcggga tcgtggtcag 1320
ggcgaagaag gcgaggcaaa ggccgaggaa ctgcgccaga agagatttga ggcagagcgg 1380
caactcaagg agctgctcgc tgatgcggca tcgcttgaac agagaaaatc gaacttgccg 1440
cgagaactgg tcaatgtccg tgaccagatt gcacttgccc tgaatctgga tcccgcttcg 1500
cttccattcg gcggtgaact gctcgacata tccgagaaat tcaaacggtg gcaaggtgtt 1560
cttgagcgtt tgctggctcc tcttacccgc tcgtttctcg tgccggaaga acactatccg 1620
ggagttgtga actggctcga gtcaaatcat acgggacagc atgtgcttta cctgcgtatg 1680
cgcccgcatc agaagcgttt cgataatggt ccgaaggctc cgggcaggat gctggattcg 1740
tcggcggatg aatacggcga ctggctgcgc gacgagatag ccgtgcatta cggcgacttt 1800
gtgtgcgcag aaacgactga agagtttcgc aattcgccac gcgccgtcag tctgcatggt 1860
cagatcaagc ggggaggtgc acggcatgag aaaaatgacc gtacccgcct tgatgaacgc 1920
cggggctggg cgattggctt ttccaacgag cagaaaaaac ttgagcttct ccatgaaatt 1980
cacgctcagc agaaggtgga aagcgaagct agtcgggagt tagccgaact cctggtgacg 2040
cagaacaagg aacgggagaa gctgaacgca gcggcggaat tgacgcaggt ggtctgggag 2100
gacatcgacg acgtctcggt ggccgatgag gtgcagcgtt tgctgaacca gatagaagag 2160
gcgcaacggt cacacccgga gatacaggaa ctcgatgggc aaatcaaggc gcagggggta 2220
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cctgtagatg gggataagct tcagttattg tttggccacc tggacggcct gacgctggag 2400
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gataaggctc aagcaaatga ccggagcctg cttgaggaag tactccgtac gtttcagcgt 2520
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cggctgttag ccaaaatcga ggaggacgat ctgccccgat tcgaggagcg gtttttcagg 2640
cttctcaacg agcagagcga tcgccatctg gccagactgc ggcagcgtct cgttaccgag 2700
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ttcctggccg aactcaagaa ctgccttgag cgcaatatca aaccagatgc gacccgcgaa 2880
gagcgcgagg agcagtttaa ggcgctcaat acaatcgtcc agcggttaca cagtgacaag 2940
ccggaggacg agcgttggaa agcactcgtc ctcgacgtac ggcaacacgt cgaatttgtg 3000
gcgaaggaat ttgatgctga tggtcgtgtg cgcgacattt ttcagtccgg cgccggtaag 3060
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<![CDATA[<212> PRT]]>
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Met Glu Thr Ala Gln Leu Phe Glu Asp Pro Glu Leu Ser Pro Val Ala
1 5 10 15
Thr Asp Gly Ala Ala Arg Arg Glu Gly Glu Pro Arg Pro Thr Trp Ser
20 25 30
Asp Arg Asn Leu Glu Glu Ala Gly Gln Gln Gln Phe Arg Leu Arg Gln
35 40 45
Met Gln Val Met Asn Trp Gly Thr Phe Ser Lys Leu His Val Phe Asp
50 55 60
Ile Ser Pro Arg Gly His Leu Leu Val Gly Pro Ser Gly Ser Gly Lys
65 70 75 80
Ser Thr Ile Leu Asp Ala His Ser Ala Leu Met Ala Pro Pro Asn Ser
85 90 95
Glu Phe Asn Ala Ala Ala Arg Gly Asn Asp Lys Val Thr Arg Asp Arg
100 105 110
Thr Met Val Thr Tyr Val Arg Gly Ala Trp Ala Thr Gln Glu Ser Glu
115 120 125
Glu Gly Ile Ile Ala Ala Gln Tyr Leu Arg Pro Asp Thr Thr Leu Ser
130 135 140
Ala Val Ala Glu Val Tyr Ala Asn Ala Gln Gly Gln Met Leu Thr Leu
145 150 155 160
Val Gly Met Trp Trp Ile Lys Gly Lys Ser Thr Leu Ala Lys Asp Val
165 170 175
Arg His Cys Phe Phe Val Ile Glu Arg Ala Phe Ser Leu Lys Glu Leu
180 185 190
Ser Phe Phe Met Gln Ala Asp Tyr Asn Leu Arg Ser Phe Ala Lys His
195 200 205
Leu Pro Glu Val Lys Pro Phe Asp Thr His Ala Ser Phe Arg Glu Arg
210 215 220
Phe Lys Ala Arg Leu Gly Ile Asp His Asp Leu Ala Leu Arg Leu Leu
225 230 235 240
His Arg Thr Gln Ser Ser Lys Asn Leu Gly Asp Ile Asn Ala Phe Met
245 250 255
Arg Asp Asn Met Leu Asp Glu Pro Gln Thr Phe Gly Leu Ala Lys Ala
260 265 270
Leu Cys Asp Asp Phe Asn Thr Leu Ala Ala Ala His Gln Asp Val Val
275 280 285
Glu Ala Arg Glu Gln Arg Asp Leu Leu Asn Leu Ala Arg Ser His His
290 295 300
Glu Arg Tyr Arg Ala His His Ala Glu Val Ala Arg Val Asp Glu Leu
305 310 315 320
Leu Thr Gln Leu Asp His His Arg Glu Tyr Leu Gln Tyr Thr Leu Arg
325 330 335
Gly Arg Arg Val Asp Glu Leu Lys Ile Val Leu Glu Gly Leu Arg Gln
340 345 350
Ser Val Asp Ala Leu Ala Arg Lys Ala Asn Asp Asp Gln Thr Glu Leu
355 360 365
Gln Arg Leu Met Thr Gln Arg Ala Gly Met Asn Asp Gly Asn Val Ala
370 375 380
Gly Leu Gln Ser Gln Leu Val Thr Lys Glu Thr Gln Leu Lys Gln Val
385 390 395 400
Arg Arg Ala Arg Ala Arg Val Ser Val Trp Leu Gln Thr Leu Gly Trp
405 410 415
Pro Glu Pro Gln Asp Ala Gly His Phe Gly Glu Cys Val Gly Arg Ala
420 425 430
Gly Val Leu Arg Asp Arg Gly Pro Gly Glu Glu Ala Glu Val Lys Ala
435 440 445
Glu Glu Leu Arg Gln Lys Arg Phe Glu Ala Glu Arg Gln Leu Lys Glu
450 455 460
Leu Leu Ala Asp Ala Ala Ser Leu Glu Gln Arg Lys Ser Asn Leu Pro
465 470 475 480
Arg Glu Leu Val Asn Val Arg Asp Gln Ile Ala Leu Ala Leu Asn Leu
485 490 495
Asp Pro Ala Ser Leu Pro Phe Gly Gly Glu Leu Leu Asp Met Pro Glu
500 505 510
Lys Phe Arg Gln Trp Gln Gly Ala Leu Glu Arg Leu Leu Ala Pro Leu
515 520 525
Thr Arg Ser Phe Leu Val Pro Glu Glu Tyr Tyr Pro Gly Val Val Asn
530 535 540
Trp Leu Glu Ser Asn His Thr Gly Gln His Val Leu Tyr Leu Arg Met
545 550 555 560
Arg Pro His Gln Lys Arg Phe Asp Asn Gly Pro Lys Ala Pro Gly Arg
565 570 575
Met Leu Asp Ser Ser Ala Asp Glu Tyr Gly Gly Trp Leu Arg Asn Glu
580 585 590
Ile Ala Ser His Tyr Gly Glu Phe Val Cys Ala Glu Thr Ala Glu Glu
595 600 605
Phe Arg Asn Ser Pro Arg Ala Ile Ser Leu His Gly Gln Ile Lys Arg
610 615 620
Gly Gly Ala Arg His Glu Lys Asn Asp Arg Thr Arg Leu Asp Glu Arg
625 630 635 640
Arg His Trp Val Ile Gly Phe Ser Asn Glu Gln Lys Lys Leu Glu Leu
645 650 655
Leu Asp Glu Ile His Ala Gln Gln Lys Val Glu Arg Glu Ala Ser Arg
660 665 670
Ala Leu Ala Glu Leu Gln Ala Thr Gln Asn Lys Glu Arg Glu Lys Leu
675 680 685
Asn Ala Ala Ala Glu Leu Thr Gln Val Val Trp Glu Asp Ile Asp Asp
690 695 700
Val Ser Val Ala Asp Glu Val Gln His Leu Leu Asn Gln Ile Glu Glu
705 710 715 720
Ala Gln Arg Ser His Pro Glu Ile Gln Glu Leu Asp Gly Gln Ile Gln
725 730 735
Ala Gln Gly Val Lys Ala Ser Gln Ala Gly Ser Ala His Glu Thr Glu
740 745 750
Lys Lys Lys Phe Ala Asp Thr Glu Gln Gln Ile Asn Gly Leu Ile Arg
755 760 765
Asp Arg Glu Asn Thr Arg Asp Asp Val Arg Met Pro Pro Val Asp Gly
770 775 780
Asp Glu Ile Gln Leu Leu Phe Gly His Leu Asp Gly Leu Thr Leu Glu
785 790 795 800
Asn Leu Glu Gln Arg Arg Leu Ser Ala Arg Ser Glu Leu Lys Asp Arg
805 810 815
Arg Asn Asp Ala Asp Lys Ala Gln Ala Asn Asp Arg Ser Leu Leu Glu
820 825 830
Glu Val Leu Arg Thr Phe Gln Arg Glu His Lys Met Ala Ala Ala Asp
835 840 845
Met Gly Ala Thr Leu Asp Asp Trp Ser Asp Tyr Ala Gln Leu Leu Ala
850 855 860
Lys Ile Glu Glu Asp Asp Leu Pro Arg Phe Glu Glu Arg Phe Phe Arg
865 870 875 880
Leu Leu Asn Glu Gln Ser Asp Arg His Leu Ala Arg Leu Arg Gln Arg
885 890 895
Leu Ile Thr Glu Lys Asp Glu Ile Arg Gly Arg Met Asn Ile Val Asn
900 905 910
Asp Ala Leu Ser Gln Ser Glu Phe Asn Ala Gly Thr Tyr Leu Val Leu
915 920 925
Glu Asn Arg Pro Arg Thr Leu Pro Asp Val Thr Ala Phe Leu Ala Glu
930 935 940
Leu Lys Ser Cys Leu Glu Arg Asn Ile Arg Pro Glu Ala Thr Arg Glu
945 950 955 960
Glu Arg Glu Glu Gln Phe Lys Ala Leu Asn Thr Ile Val Gln Arg Leu
965 970 975
His Ser Asp Lys Pro Glu Asp Glu Arg Trp Lys Ala Leu Val Leu Asp
980 985 990
Val Arg Gln His Val Glu Phe Val Ala Lys Glu Phe Asp Ala Asp Gly
995 1000 1005
Arg Val Arg Asp Ile Phe Gln Ser Gly Ala Gly Lys Ser Gly Gly
1010 1015 1020
Gln Arg Gln Lys Leu Ala Ala Thr Cys Leu Ala Ala Ala Leu Arg
1025 1030 1035
Tyr Gln Leu Ala Gly Thr Gln Arg Pro Leu Pro Gln Phe Cys Thr
1040 1045 1050
Val Leu Met Asp Glu Ala Phe Asp Lys Ala Asp Ser Glu Phe Thr
1055 1060 1065
Ala Met Thr Leu Asn Ile Phe Asn Thr Phe Gly Phe Gln Met Leu
1070 1075 1080
Met Ala Thr Pro Met Lys Ala Val Arg Thr Leu Glu Pro Phe Ile
1085 1090 1095
Gly Gly Ala His Val Phe Ser Asn Lys Leu Arg Asn Ser Ser Gly
1100 1105 1110
Ala Val Ala Ile Glu Tyr Asp Met Ala His Arg Arg Leu Val Gly
1115 1120 1125
Leu Gly His Gln Arg Ser Glu Glu Arg Gly Asn Ala Gly Gly Glu
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Ile Pro Gln Ser Glu Asp
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atggaggata ttcagatccc cgtaggccag tggaaccatg tgtttcggta tccaccaaag 780
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Ser Asp Arg Gln Ala Ala Asn Ala Pro Gly Ala Met Arg Ala Trp Leu
50 55 60
Gly Ala Trp Asn Asp Phe Asp Arg Ile Ser Arg Asp Lys Gly Arg Arg
65 70 75 80
Ala Ala Ala Val Trp Arg Ser Val Asn Trp Arg Thr Met Gly Asn Val
85 90 95
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100 105 110
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Gly Arg Arg Gly Val Val Glu Pro Leu Val Arg Ile Leu Met Gly Lys
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Asp Gly Asp Ile Arg Glu Val Met Gly Leu Arg Arg Ser Pro Asp Thr
210 215 220
Val Arg Met Arg Leu Leu Asp Pro Gly Leu Arg Glu Gln Leu Leu Gly
225 230 235 240
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Tyr Pro Pro Lys Arg Leu Leu Ile Val Glu Asn Leu Glu Ser Gly Leu
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Leu Tyr Trp Gly Asp Ile Asp Thr Trp Gly Leu His Ile Leu Ser Arg
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Ala Arg Gly Ile Phe Pro His Leu Arg Ser Val Leu Met Thr Glu Gly
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Asp Leu Gln Ala Gly Arg Trp Gly Glu Arg Arg Arg Leu Glu Gln Glu
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<![CDATA[<400> 13]]>
atggcgagtg cgcccgtcga caactacgcg gcgacgcgtt atccgatcat tctcgtgcac 60
gggctcacgg gcaccgacaa atacgcaggt gtgctcgagt actggtatgg gatccaggag 120
gacctgcagc agcatggcgc gaccgtctat gtcgcgaacc tgtcgggctt ccagagcgac 180
gacggcccga acgggcgcgg cgaacagttg ctggcctacg tgaagacggt gctcgccgcg 240
acgggggcga ccaaggtcaa cctcgtcggt cacagccagg gcgggctgac gtcgcgttat 300
gtcgcggccg tcgcgcccga tctggtcgcg tcggtgacga cgatcggcac gccgcatcgc 360
ggctccgagt tcgccgactt cgtgcagggc gtactcgcgt acgatccgac cgggctgtcg 420
tcgacggtga tcgccgcgtt cgtcaatgtg ttcggaatcc tcacgagcag cagcaacaac 480
acgaaccagg acgcgctcgc tgcgctgaag acgctgacga ccgcgcaggc cgccacgtac 540
aaccagaact acccgagcgc gggcctcggt gcgccgggca gttgccagac cggcgcgccg 600
acggaaaccg tcggcggcaa cacgcatctg ttgtattcgt gggccggcac cgcgatccag 660
ccgacgatct ccgtgttcgg cgtcacgggt gcgacggata cgagcaccat tccgctcgtc 720
gatccggcga atgcactcga cccgtcgacg ctcgcgctgt tcggcaccgg cacggtgatg 780
atcaaccgcg gttcgggcca gaacgacgga gtcgtgtcga agtgcagcgc gttgtacggc 840
caggtgctga gcacgagcta caagtggaac catctcgacg agatcaacca gttgctcggc 900
gtgcgcggcg cgaatgcgga agatccggtc gcggtgatcc gcacgcatgc gaaccggctg 960
aagctcgcgg gcgtgtga 978
<![CDATA[<210> 14]]>
<![CDATA[<211> 1035]]>
<![CDATA[<212> DNA]]>
<![CDATA[<213> 伯克氏菌屬細菌]]>
<![CDATA[<400> 14]]>
atggcggcac gtgaagggcg cgcgccgctg gcgcggcgcg ctgcggtcta cggtgtcgtg 60
gggctggcgg caatcgccgg cgtcgcgatg tggagcgggg cgggatggca tcgcggtgcg 120
ggtagcgccg gcgaatcgcc cgacgcggcg gcggtgggcg gcgtggctgc ggcaccgccg 180
caggccgccg tgccggcgag cgcgggcctg ccgtcgtcgc tggccggttc cagcgcgccg 240
cggctgccgc tcgatgcggg cggccatctc gcgaaggtac gcgcggtgcg cgatttcttc 300
gactactgcc tgaccgcgca gagcgacctc agcgcggccg cgctcgacgc actcgtcgtg 360
cgcgagattg ccgcgcagct cgacggcacg gccgcgcacg ccgaggcgct cgacgtgtgg 420
catcgttatc gcgcgtatct cgacgcgctc gcgaaactgc gcgatgccgg cgcggtcgac 480
aagtccgatt tgggcgcgct gcaactcgcg ctcgaccagc gcgcatcgat cgcgtatcgc 540
acgcttggcg actggagcca gccgttcttc ggcgcggaac agtggcggca gcgctacgat 600
ctcgcgcggc tgaagatcgc gcaggatcgc acgctgaccg atgcgcagaa ggccgagcgg 660
ctcgcggcgc tggagcagca gctgccggcc gatgaacgcg ccgcgcagca gcgggtcgac 720
cggcagcggg ccgcgatcga ccagatcgcg cagttgcaga agaacggggc gacgcccgat 780
gcgatgcgcg cgcaactgac gcagacgctc gggcccgagg ccgccgcgcg cgtcgcgcag 840
atgcagcacg acgacgcatc gtggcagagc cgctacgcgg actatgcggc gcagcgtgcg 900
cagatcgaat cggccggcct gtcgccgcag gaccgcgacg cgcagatcgc cgcgttgcgg 960
cagcgcgtgt tcacgaaacc cggcgaagcg gtgcgcgcgg cgtcgctcga tcgcggggcg 1020
ggcagcgcgc agtaa 1035
<![CDATA[<210> 15]]>
<![CDATA[<211> 1062]]>
<![CDATA[<212> DNA]]>
<![CDATA[<213> 伯克氏菌屬細菌]]>
<![CDATA[<400> 15]]>
atggcgcagg ccgatcgtcc ggcgcgcggc gggctggccg cgcgcccgat gcgcggcgcg 60
tcgttcgcgc tggccgggct cgtcgcgtgt gccgcctgtg ccgcggtcgt gctgtggctt 120
cggcccgccg ccccgtcgcc cgcgccggcc ggcgccgtcg cgggcgggcc ggcggccggc 180
gtgcccgccg cggcaagcgg cgcggcggag gccgccatgc cgttgccggc ggcgctgccg 240
ggcgcgctgg ctggctcgca tgcgccgcgc ctgccgctgg ccgccggcgg ccggctcgcg 300
aggacgcgcg cggtgcgcga gttcttcgac tattgcctga ccgcgcaggg cgaactgacg 360
cccgccgcgc tcgatgcgct ggtgcggcgc gagatcgccg cgcagcttga cggcagcccc 420
gcgcaagcgg aggcgctcgg cgtctggcgc cgctatcgcg cctacttcga cgcgctcgcg 480
caattgcccg gcgacggcgc ggtgctcggc gacaagctcg atccggccgc catgcagctc 540
gcgctcgatc agcgcgcggc gctggccgac cgcacgctcg gcgagtgggc cgagccgttc 600
ttcggcgacg agcagcgccg gcagcgccat gacctcgaac ggatccggat cgccaacgac 660
accacgctga gccctgagca gaaggccgcg cggcttgccg cgctcgacgc gcagctgacg 720
ccggacgagc gcgcgcagca ggcggcgctg catgcgcagc aggacgcggt gacgaagatc 780
gccgacttgc agaaggccgg cgcgacgccc gaccagatgc gcgcgcagat cgcgcagacg 840
ctcgggcccg aggcggccgc gcgcgccgcg cagatgcagc aggacgacga ggcgtggcag 900
acgcgctatc aagcctatgc ggccgagcgc gaccggatcg cggcgcaggg gctcgcgccg 960
caggatcgcg atgcgcggat cgcgcagctc aggcagcaga ctttcacggc gccgggggag 1020
gcgatccgcg cggcgtcgct cgatcgcggc gcgggcggtt ag 1062
<![CDATA[<210> 16]]>
<![CDATA[<211> 1035]]>
<![CDATA[<212> DNA]]>
<![CDATA[<213> 伯克氏菌屬細菌]]>
<![CDATA[<400> 16]]>
atgacggcac gtgaagggcg cgcgccgctg gcgcggcgcg ctgtggtcta cggtgtcgtg 60
gggctggcgg cgatcgccgg cgtcgcgatg tggagcggtg cgggatggca tcgcgggacg 120
ggcacggccg ccgagttgcc ggacgcggct gcggcaggcg gggcggctgc cgcgccgccg 180
cagggcgcca tgccggcgag cacgggcctg ccgtcgtcgc tggccggctc cagcgcgccg 240
cgactgccgc tcgatgccgg cggccatctt gcgaagtcgc gtgtggtgcg cgatttcttc 300
gactactgcc tgaccgcgca gagcgacctg agcgcggccg cgctcgatgc gttcgtcgta 360
cgcgagatcg ccgcgcagct cgacggcacg gttgcgcagg ccgaggcgct cgacgtctgg 420
caccggtacc gtgcgtatct cgacgcgctc gcgaagttgc gcgatgccgg cgcggtcgac 480
aagtccgacc tgggcgcgct gcagctcgcg ctcgaccagc gcgcgtcgat cgcataccgc 540
acgctcggcg actggagcca gccgtttttc ggcgcggagc agtggcggca gcgctacgat 600
ctcgcgcgat tgaagatcgc acaggatcgc acgctgacgg atgcgcagaa ggccgagcgg 660
ctcgcggcgc tcgagcagca gatgccggcc gacgagcgcg ccgcgcagca gcgggtcgac 720
cagcagcggg ccgcgatcga ccagatcgcg caattgcaga agggcggcgc gacgcccgat 780
gcgatgcgcg cgcaactgac gcagacgctc ggcccggaag ccgccgcgcg cgtcgcgcag 840
atgcagcagg acaacgcatc gtggcagagc cgctacgcgg actatgcggc gcagcgtgcg 900
cagatcgagt cggccggcct gtcgccgcag gatcgcgatg cacagatcgc cgcgttacga 960
cagcgcgtgt tcacgaaacc cggtgaggcc gtgcgggcgg catcgctcga tcgcggcgcg 1020
ggcagcgcgc agtga 1035
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<![CDATA[<212> DNA]]>
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gcaattccac gtctaccgat g 21
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<![CDATA[<212> DNA]]>
<![CDATA[<213> 人工序列]]>
<![CDATA[<220>]]>
<![CDATA[<223> 引子]]>
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tgctttacct ccgctaagtg gtgatgaac 29
<![CDATA[<210> 19]]>
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<![CDATA[<212> DNA]]>
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gcaattccac gtctaccgat ggctcgggtg gttctgacgg ctgcgcggaa acgggagcgg 60
aatggcagcc ccacccagga tggcaggcgc gtgacgaagt gcacgaagtg ttgcgcgact 120
tcaacgcggc cttgcgttgc gccaagatcc ggtgcacatt gatccgtcac ttttgttaca 180
ctcgacacgc actcgtttgc agtcgccaga caaaacggca acattcgggt tcatcaccac 240
ttagcggagg taaagca 257
<![CDATA[<210> 20]]>
<![CDATA[<211> 32]]>
<![CDATA[<212> DNA]]>
<![CDATA[<213> 人工序列]]>
<![CDATA[<220>]]>
<![CDATA[<223> 引子]]>
<![CDATA[<400> 20]]>
atgaacatca aaaagtttgc aaaacaagca ac 32
<![CDATA[<210> 21]]>
<![CDATA[<211> 29]]>
<![CDATA[<212> DNA]]>
<![CDATA[<213> 人工序列]]>
<![CDATA[<220>]]>
<![CDATA[<223> 引子]]>
<![CDATA[<400> 21]]>
atgggttaaa aaggatcgat cctctagcg 29
<![CDATA[<210> 22]]>
<![CDATA[<211> 35]]>
<![CDATA[<212> DNA]]>
<![CDATA[<213> 人工序列]]>
<![CDATA[<220>]]>
<![CDATA[<223> 擴增產物]]>
<![CDATA[<400> 22]]>
acatgattac gaattggcgc atgaatattg tcaac 35
<![CDATA[<210> 23]]>
<![CDATA[<211> 35]]>
<![CDATA[<212> DNA]]>
<![CDATA[<213> 人工序列]]>
<![CDATA[<220>]]>
<![CDATA[<223> 引子]]>
<![CDATA[<400> 23]]>
ccagccggcc tgatgacgct ccagctgacg ccggc 35
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<![CDATA[<212> DNA]]>
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<![CDATA[<220>]]>
<![CDATA[<223> 引子]]>
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catcaggccg gctggcgatg gggcgaacgc cgtcg 35
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<![CDATA[<212> DNA]]>
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<![CDATA[<223> 引子]]>
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ggccagtgcc aagcttccgc cgaagtcgtg gatac 35
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<![CDATA[<212> DNA]]>
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<![CDATA[<220>]]>
<![CDATA[<223> 引子]]>
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acatgattac gaattccgga caagatggcg ttgtg 35
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<![CDATA[<223> 引子]]>
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<![CDATA[<212> DNA]]>
<![CDATA[<213> 人工序列]]>
<![CDATA[<220>]]>
<![CDATA[<223> 引子]]>
<![CDATA[<400> 28]]>
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<![CDATA[<210> 29]]>
<![CDATA[<211> 35]]>
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<![CDATA[<213> 人工序列]]>
<![CDATA[<220>]]>
<![CDATA[<223> 引子]]>
<![CDATA[<400> 29]]>
ggccagtgcc aagctcgtag ggcagtcaca ttgtt 35
<![CDATA[<210> 30]]>
<![CDATA[<211> 35]]>
<![CDATA[<212> DNA]]>
<![CDATA[<213> 人工序列]]>
<![CDATA[<220>]]>
<![CDATA[<223> 引子]]>
<![CDATA[<400> 30]]>
acatgattac gaattgatga ctgaggcgat tgcag 35
<![CDATA[<210> 31]]>
<![CDATA[<211> 31]]>
<![CDATA[<212> DNA]]>
<![CDATA[<213> 人工序列]]>
<![CDATA[<220>]]>
<![CDATA[<223> 引子]]>
<![CDATA[<400> 31]]>
cgcgtccgct gtgcctgtcc gaaattcggt c 31
<![CDATA[<210> 32]]>
<![CDATA[<211> 35]]>
<![CDATA[<212> DNA]]>
<![CDATA[<213> 人工序列]]>
<![CDATA[<220>]]>
<![CDATA[<223> 引子]]>
<![CDATA[<400> 32]]>
ggcacagcgg acgcgagacc agcagaggtc gatgg 35
<![CDATA[<210> 33]]>
<![CDATA[<211> 3]]>5
<![CDATA[<212> DNA]]>
<![CDATA[<213> 人工序列]]>
<![CDATA[<220>]]>
<![CDATA[<223> 引子]]>
<![CDATA[<400> 33]]>
ggccagtgcc aagctccgtg tgatgctcct gatac 35
<![CDATA[<210> 34]]>
<![CDATA[<211> 20]]>
<![CDATA[<212> DNA]]>
<![CDATA[<213> 人工序列]]>
<![CDATA[<220>]]>
<![CDATA[<223> 引子]]>
<![CDATA[<400> 34]]>
ggcgcatgaa tattgtcaac 20
<![CDATA[<210> 35]]>
<![CDATA[<211> 20]]>
<![CDATA[<212> DNA]]>
<![CDATA[<213> 人工序列]]>
<![CDATA[<220>]]>
<![CDATA[<223> 引子]]>
<![CDATA[<400> 35]]>
tccgccgaag tcgtggatac 20
<![CDATA[<210> 36]]>
<![CDATA[<211> 20]]>
<![CDATA[<212> DNA]]>
<![CDATA[<213> 人工序列]]>
<![CDATA[<220>]]>
<![CDATA[<223> 引子]]>
<![CDATA[<400> 36]]>
ccggacaaga tggcgttgtg 20
<![CDATA[<210> 37]]>
<![CDATA[<211> 20]]>
<![CDATA[<212> DNA]]>
<![CDATA[<213> 人工序列]]>
<![CDATA[<220>]]>
<![CDATA[<223> 引子]]>
<![CDATA[<400> 37]]>
cgtagggcag tcacattgtt 20
<![CDATA[<210> 38]]>
<![CDATA[<211> 20]]>
<![CDATA[<212> DNA]]>
<![CDATA[<213> 人工]]>序列
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<![CDATA[<223> 引子]]>
<![CDATA[<400> 38]]>
gatgactgag gcgattgcag 20
<![CDATA[<210> 39]]>
<![CDATA[<211> 20]]>
<![CDATA[<212> DNA]]>
<![CDATA[<213> 人工序列]]>
<![CDATA[<220>]]>
<![CDATA[<223> 引子]]>
<![CDATA[<400> 39]]>
ccgtgtgatg ctcctgatac 20
<![CDATA[<210> 40]]>
<![CDATA[<211> 26]]>
<![CDATA[<212> DNA]]>
<![CDATA[<213> 人工序列]]>
<![CDATA[<220>]]>
<![CDATA[<223> 引子]]>
<![CDATA[<400> 40]]>
gctgaaagct tacctgagct taaaag 26
<![CDATA[<210> 41]]>
<![CDATA[<211> 26]]>
<![CDATA[<212> DNA]]>
<![CDATA[<213> 人工序列]]>
<![CDATA[<220>]]>
<![CDATA[<223> 引子]]>
<![CDATA[<400> 41]]>
cagcgtgttc agcattattc catttg 26
<![CDATA[<210> 42]]>
<![CDATA[<211> 32]]>
<![CDATA[<212> DNA]]>
<![CDATA[<213> 人工序列]]>
<![CDATA[<220>]]>
<![CDATA[<223> 引子]]>
<![CDATA[<400> 42]]>
cgttaaatat tgcagcatgc gcgcgcacga ac 32
<![CDATA[<210> 43]]>
<![CDATA[<211> 29]]>
<![CDATA[<212> DNA]]>
<![CDATA[<213> 人工序列]]>
<![CDATA[<220>]]>
<![CDATA[<223> 引子]]>
<![CDATA[<400> 43]]>
gcagatctgg ccaacgtttg cgccctgac 29
<![CDATA[<210> 44]]>
<![CDATA[<211> 50]]>
<![CDATA[<212> DNA]]>
<![CDATA[<213> 人工序列]]>
<![CDATA[<220>]]>
<![CDATA[<223> 引子]]>
<![CDATA[<400> 44]]>
caaacgttgg ccagatctgc tagctacgta gagctcggta ccactagtgg 50
<![CDATA[<210> 45]]>
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<![CDATA[<212> DNA]]>
<![CDATA[<213> 人工序列]]>
<![CDATA[<220>]]>
<![CDATA[<223> 引子]]>
<![CDATA[<400> 45]]>
aaaccgcggc catatgggtc tagaggatcc actagtggta ccgagct 47
<![CDATA[<210> 46]]>
<![CDATA[<211> 32]]>
<![CDATA[<212> DNA]]>
<![CDATA[<213> 人工序列]]>
<![CDATA[<220>]]>
<![CDATA[<223> 引子]]>
<![CDATA[<400> 46]]>
ccatatggcc gcggttttcg actgcttcaa ag 32
<![CDATA[<210> 47]]>
<![CDATA[<211> 31]]>
<![CDATA[<212> DNA]]>
<![CDATA[<213> 人工序列]]>
<![CDATA[<220>]]>
<![CDATA[<223> 引子]]>
<![CDATA[<400> 47]]>
cataagcggc cgggcgacga ggccagagag c 31
<![CDATA[<210> 48]]>
<![CDATA[<211> 87]]>
<![CDATA[<212> DNA]]>
<![CDATA[<213> 人工序列]]>
<![CDATA[<220>]]>
<![CDATA[<223> 終止子]]>
<![CDATA[<400> 48]]>
gccgcggttt tcgactgctt caaagccccg ctccggcggg gctttttcat tgatgcccgt 60
ccgggcgctc tctggcctcg tcgcccg 87
<![CDATA[<210> 49]]>
<![CDATA[<211> 97]]>
<![CDATA[<212> DNA]]>
<![CDATA[<213> 人工序列]]>
<![CDATA[<220>]]>
<![CDATA[<223> 終止子]]>
<![CDATA[<400> 49]]>
ttgcagcatg cgcgcgcacg aacgcggccc cgcccgaacg ggcggggcgc gtcaagcgat 60
tagagaaccg tgtctagtca gggcgcaaac gttggcc 97
<![CDATA[<210> 50]]>
<![CDATA[<211> 56]]>
<![CDATA[<212> DNA]]>
<![CDATA[<213> 人工序列]]>
<![CDATA[<220>]]>
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agatctgcta gctacgtaga gctcggtacc actagtggat cctctagacc catatg 56
<![CDATA[<210> 51]]>
<![CDATA[<211> 37]]>
<![CDATA[<212> DNA]]>
<![CDATA[<213> 人工序列]]>
<![CDATA[<220>]]>
<![CDATA[<223> 引子]]>
<![CDATA[<400> 51]]>
tcgtcgcccg gccgcttatg tctattgctg gtttacc 37
<![CDATA[<210> 52]]>
<![CDATA[<211> 36]]>
<![CDATA[<212> DNA]]>
<![CDATA[<213> 人工序列]]>
<![CDATA[<220>]]>
<![CDATA[<223> 引子]]>
<![CDATA[<400> 52]]>
gcatgctgca atatttaacg accctgccct gaaccg 36
<![CDATA[<210> 53]]>
<![CDATA[<211> 24]]>
<![CDATA[<212> DNA]]>
<![CDATA[<213> 人工序列]]>
<![CDATA[<220>]]>
<![CDATA[<223> 引子]]>
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gccagatcga tgcgttccag ggtg 24
<![CDATA[<210> 54]]>
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<![CDATA[<212> DNA]]>
<![CDATA[<213> 人工序列]]>
<![CDATA[<220>]]>
<![CDATA[<223> 引子]]>
<![CDATA[<400> 54]]>
cataagcggc ttactgcgcg ctgcccgccc 30
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<![CDATA[<211> 40]]>
<![CDATA[<212> DNA]]>
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<![CDATA[<220>]]>
<![CDATA[<223> 引子]]>
<![CDATA[<400> 55]]>
acgttggcca gatctgcaat tccacgtcta ccgatggctc 40
<![CDATA[<210> 56]]>
<![CDATA[<211> 44]]>
<![CDATA[<212> DNA]]>
<![CDATA[<213> 人工序列]]>
<![CDATA[<220>]]>
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acgcatcgat ctggccattg ctttacctcc gctaagtggt gatg 44
<![CDATA[<210> 57]]>
<![CDATA[<211> 32]]>
<![CDATA[<212> DNA]]>
<![CDATA[<213> 人工序列]]>
<![CDATA[<220>]]>
<![CDATA[<223> 引子]]>
<![CDATA[<400> 57]]>
gcagtaagcc gcggttttcg actgcttcaa ag 32
<![CDATA[<210> 58]]>
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<![CDATA[<212> DNA]]>
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<![CDATA[<220>]]>
<![CDATA[<223> 引子]]>
<![CDATA[<400> 58]]>
agatctggcc aacgtttgcg ccctg 25
<![CDATA[<210> 59]]>
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<![CDATA[<212> DNA]]>
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<![CDATA[<220>]]>
<![CDATA[<223> 引子]]>
<![CDATA[<400> 59]]>
accactgcga tccccactgg atgacggcga tgacc 35
<![CDATA[<210> 60]]>
<![CDATA[<211> 35]]>
<![CDATA[<212> DNA]]>
<![CDATA[<213> 人工序列]]>
<![CDATA[<220>]]>
<![CDATA[<223> 引子]]>
<![CDATA[<400> 60]]>
gaatgctgtt ttcccgtcga tgtcgaggat ggcgg 35
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aaagccacgt tgtgtctcaa aatctctgat gttacattgc acaagataaa aatatatcat 60
catgaacaat aaaactgtct gcttacataa acagtaatac aaggggtgtt atgagccata 120
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gcgatccagc cgacgctttc cgtgttcggt gtcacgggcg cgacggacac tagcacgatt 5040
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<![CDATA[<212> DNA]]>
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atggtcagat cgatgcgttc cagggtggcg gcgagggcgg tggcatgggc gttggcggtg 60
atgccgctgg ccggcgcggc cgggttgacg atggccgcgt cgcccgcggc cgtcgcggcg 120
gacacctacg cggcgacgcg ctatccggtg atcctcgtcc acggcctcgc gggcaccgac 180
aagttcgcga acgtggtgga ctattggtac ggaatccaga gtgatctgca atcgcatggc 240
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ggcgtgaccg gcgcgaccga caccagcacc ggcacgctcg acgtcgcgaa cgtgaccgac 840
ccgtccacgc tcgcgctgct cgccaccggc gcggtgatga tcaatcgcgc ctcggggcag 900
aacgacgggc tcgtctcgcg ctgcagctcg ctgttcgggc aggtgatcag caccagctac 960
cactggaacc atctcgacga gatcaaccag ctgctcggcg tgcgcggcgc caacgcggaa 1020
gatccggtcg cggtgatccg cacgcacgtg aaccggctca agctgcaggg cgtgtgatgg 1080
cgcaggccga tcgtccggcg cgcggcgggc tggccgcgcg cccgatgcgc ggcgcgtcgt 1140
tcgcgctggc cgggctcgtc gcgtgtgccg cctgtgccgc ggtcgtgctg tggcttcggc 1200
ccgccgcccc gtcgcccgcg ccggccggtg ccgtcgcggg cgggccggcg gccggcgtgc 1260
ccgccgcggc aagcggcgcg gcggaggccg ccatgccgtt gccggcggcg ctgccgggcg 1320
cgctggccgg ctcgcatgcg ccgcgcctgc cgctggccgc cggcggcggg ctcgcgagga 1380
cgcgcgcggt gcgcgagttc ttcgactatt gcctgaccgc gcagggcgaa ctgacgcccg 1440
ccgcgctcga tgcgctggtg cggcgcgaga tcgccgcgca gcttgacggc agccccgcgc 1500
aagcggaggc gctcggcgtc tggcgccgct atcgcgccta cttcgacgcg ctcgcgcaat 1560
tgcccggcga cggcgcggtg ctcggcgaca agctcgatcc ggccgccatg cagctcgcgc 1620
tcgatcagcg cgcggcgctg gccgaccgca cgctcggcga gtgggccgag ccgttcttcg 1680
gcgacgagca gcgccggcag cgccatgacc tcgaacggat ccggatcgcc aacgacacca 1740
cgctgagccc cgagcagaag gccgcgcggc ttgccgcgct cgacgcgcag ctgacgccgg 1800
acgagcgcgc gcagcaggcg gcgctgcatg cgcagcagga cgcggtgacg aagatcgccg 1860
acctgcagaa ggccggcgcg acgcccgacc agatgcgcgc gcagatcgcg cagacgctcg 1920
ggcccgaggc ggccgcgcgc gccgcgcaga tgcagcagga cgacgaggcg tggcagacgc 1980
gctatcaagc ctatgcggcc gagcgcgacc ggatcgcggc gcaggggctc gcgccgcagg 2040
atcgcgatgc gcggatcgcg cagctcaggc agcagacttt tacggcgccg ggggaggcga 2100
tccgcgcggc gtcgctcgat cgcggcgcgg gcggttag 2138
<![CDATA[<210> 68]]>
<![CDATA[<211> 35]]>
<![CDATA[<212> DNA]]>
<![CDATA[<213> 人工序列]]>
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<![CDATA[<223> 引子]]>
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agcggaggta aagcaatggt cagatcgatg cgttc 35
<![CDATA[<210> 69]]>
<![CDATA[<211> 35]]>
<![CDATA[<212> DNA]]>
<![CDATA[<213> 人工序列]]>
<![CDATA[<220>]]>
<![CDATA[<223> 引子]]>
<![CDATA[<400> 69]]>
gtcgaaaacc gcggcctaac cgcccgcgcc gcgat 35
<![CDATA[<210> 70]]>
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<![CDATA[<212> DNA]]>
<![CDATA[<213> 人工序列]]>
<![CDATA[<220>]]>
<![CDATA[<223> 引子]]>
<![CDATA[<400> 70]]>
tgctttacct ccgctaagtg gtgatgaac 29
<![CDATA[<210> 71]]>
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<![CDATA[<212> DNA]]>
<![CDATA[<213> 人工序列]]>
<![CDATA[<220>]]>
<![CDATA[<223> 引子]]>
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gccgcggttt tcgactgctt caaag 25
<![CDATA[<210> 72]]>
<![CDATA[<211> 1095]]>
<![CDATA[<212> DNA]]>
<![CDATA[<213> 洋蔥伯克霍爾德氏菌]]>
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atggccagat cgatgcgttc cagggtggtg gcaggggcag tggcatgcgc gatgagcgtc 60
gcgccgttcg cggggacgac cgcggtgatg acgctcgcga cgacgcacgc ggcgatggcg 120
gcgaccgcgc ccgccgacaa ctacgcggcg acgcgttatc cgatcatcct cgtgcacggg 180
ctcacgggca ccgacaagta cgcgggcgtg ctcgagtact ggtacggcat ccaggaagac 240
ctgcagcagc gcggcgcgac cgtctacgtc gcgaacctgt cgggcttcca gagcgacgac 300
ggcccgaacg ggcgcggcga acagttgctc gcgtacgtga agacggtgct tgccgcgacg 360
ggcgcgacca aggtcaatct cgtcggccac agccagggcg ggctcacgtc gcgttacgtc 420
gcggctgtcg cgccggatct cgtcgcgtcg gtgacgacga tcggcacgcc gcatcgcggc 480
tccgagttcg ccgacttcgt gcagggcgtg ctcgcatacg atccgaccgg gctttcgtca 540
acggtgatcg cggcgttcgt caatgtgttc ggaatcctca cgagcagcag caacaacacg 600
aaccaggacg cgctcgcggc gctgaagacg ctgacgaccg cccaggccgc cacgtacaac 660
cagaactatc cgagcgcggg ccttggcgcg ccgggcagtt gccagaccgg cgcgccgacg 720
gaaaccgtcg gcggcaacac gcatctgctg tattcgtggg ccggcacggc gatccagccg 780
acgatctccg tgttcggtgt cacgggcgcg acggacacta gcacgattcc gctcgtcgat 840
ccggcgaacg cgctcgaccc gtcgacgctt gcgctgttcg gcacgggcac ggtgatggtc 900
aaccgcggct cgggccagaa cgacggggtc gtgtcgaaat gcagcgcgct gtacggccag 960
gtgctgagca cgagctacaa gtggaaccat ctggacgaga tcaaccagtt gctcggcgtg 1020
cgcggcgcga acgcggaaga tccggtcgcg gtgatccgca cgcatgcgaa ccgtctgaag 1080
ctggcgggcg tgtaa 1095
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acgttggcca gatctaggac ggcgcacacg ccggc 35
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<![CDATA[<220>]]>
<![CDATA[<223> 引子]]>
<![CDATA[<400> 84]]>
acgttggcca gatctgaaac ggtcgattcc gccag 35
<![CDATA[<210> 85]]>
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<![CDATA[<220>]]>
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acgttggcca gatctgcccc gctttttcga acttt 35
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<![CDATA[<220>]]>
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acgttggcca gatctttcga actttacttt ttcga 35
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acgttggcca gatcttaaat ttcgaattcg aacat 35
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<![CDATA[<211> 35]]>
<![CDATA[<212> DNA]]>
<![CDATA[<213> 人工序列]]>
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acgttggcca gatctattcg aacatttcgt gttca 35
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<![CDATA[<223> 引子]]>
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acgttggcca gatctccgcc tcgcgggggc agcat 35
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<![CDATA[<223> 引子]]>
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acgttggcca gatctcattg ttggctccgg ggaaa 35
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acgttggcca gatctcagtg ttttcgctct ttcat 35
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<![CDATA[<400> 98]]>
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<![CDATA[<220>]]>
<![CDATA[<223> 引子]]>
<![CDATA[<400> 99]]>
ttggccagtg tattcgctcc tgttccag 28
Claims (4)
- 一種啟動子，其包含以下(i)～(iv)中之任一DNA： (i)包含序列編號7之鹼基序列中連續的超過80個鹼基之序列且具有啟動子活性之DNA； (ii)可與包含與序列編號7之鹼基序列中連續的超過80個鹼基之序列互補之鹼基序列之DNA於嚴格之條件下雜交且具有啟動子活性之DNA； (iii)包含序列編號7之鹼基序列中連續的超過80個鹼基之序列之1個或數個鹼基缺失、置換或附加而成之鹼基序列且具有啟動子活性之DNA；或， (iv)包含與序列編號7中連續的超過80個鹼基之序列具有至少80%以上之序列同一性之鹼基序列且具有啟動子活性之DNA。
- 如請求項1之啟動子，其中上述啟動子包含以下(i)～(iv)中之任一DNA： (i)包含序列編號8之鹼基序列之DNA； (ii)可與包含與序列編號8之鹼基序列互補之鹼基序列之DNA於嚴格之條件下雜交且具有啟動子活性之DNA； (iii)包含序列編號8之鹼基序列中1個或數個鹼基缺失、置換或附加而成之鹼基序列且具有啟動子活性之DNA； (iv)包含與序列編號8具有至少80%以上之序列同一性之鹼基序列且具有啟動子活性之DNA。
- 一種啟動子，其包含以下(i)～(iv)中之任一DNA： (i)包含序列編號9之鹼基序列中連續的超過100個鹼基之序列且具有啟動子活性之DNA； (ii)可與包含與序列編號9之鹼基序列中連續的超過100個鹼基之序列互補之鹼基序列之DNA於嚴格之條件下雜交且具有啟動子活性之DNA； (iii)包含序列編號9之鹼基序列中連續的超過100個鹼基之序列之1個或數個鹼基缺失、置換或附加而成之鹼基序列且具有啟動子活性之DNA；或， (iv)包含與序列編號9中連續的超過100個鹼基之序列具有至少80%以上之序列同一性之鹼基序列且具有啟動子活性之DNA。
- 如請求項3之啟動子，其中上述啟動子包含以下(i)～(iv)中之任一DNA： (i)包含序列編號10之鹼基序列之DNA； (ii)可與包含與序列編號10之鹼基序列互補之鹼基序列之DNA於嚴格之條件下雜交且具有啟動子活性之DNA； (iii)包含序列編號10之鹼基序列中1個或數個鹼基缺失、置換或附加而成之鹼基序列且具有啟動子活性之DNA； (iv)包含與序列編號10具有至少80%以上之序列同一性之鹼基序列且具有啟動子活性之DNA。
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2021-025664 | 2021-02-19 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| TW202424199A true TW202424199A (zh) | 2024-06-16 |
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