TW202421099A - 環形混合型奈米粒子、其製備方法及其用於多功能傳遞之方法 - Google Patents
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Abstract
本揭露係提供一種環形混合型奈米粒子,其包括第一聚合物及與該第一聚合物相互作用之第二聚合物。本揭露亦提供一種用於製備該環形混合型奈米粒子的方法,其包括將該第一聚合物及具有可裂解疏水性基團的該第二聚合物混合,以形成混合型奈米粒子;以及從該第二聚合物中移除部分可裂解疏水性基團,以使該第二聚合物帶電並形成該環形混合型奈米粒子。本揭露進一步提供一種用於向有需要的個體傳遞藥物或生物活性劑的方法,其包括向該個體投予醫藥組成物,該醫藥組成物包括共軛到有效量的藥物或生物活性劑的環形混合型奈米粒子,以及其醫藥上可接受的賦形劑。
Description
本揭露係關於奈米技術,特別係關於使用混合奈米粒子的多功能傳遞系統。
預期壽命已顯著地增加。因此,諸如癌症、血壓、糖尿病、高血脂症、心臟病、中風、骨質疏鬆症、及退化性關節炎等各種與年齡有關的疾病的發病率已增加且受到高度關注。然而,一些藥物顯現出低特異性及脫靶效應。例如,抗癌藥物的使用可能伴隨著諸如嘔吐、噁心、疲勞、及白血球減少症等副作用。因此,迫切需要開發具高特異性、良好穿透性、及有靈活性的藥物傳遞系統。
儘管本領域已經開發許多藥物傳遞系統,但仍有許多問題需要解決。例如,一些藥物傳遞系統顯現出低穩定性、不足的彈性(穿透能力差)。此外,一些藥物傳遞系統對腫瘤及血管只展現微小的穿透效應,表明
藥物無法到達以及累積在腫瘤損傷中。此外,一些藥物傳遞系統缺乏根據實際需要共軛藥物或生物製劑的靈活性。進一步以微胞(micelle)為例,這些系統已經以不同程度成功被使用,例如,在臨床前模型中,在水溶性溶劑中的溶解度差,且相對較高的臨界微胞濃度導致微胞在體內使用時迅速散開。
因此,本領域存在未滿足的需求,即開發用於多功能傳遞的奈米粒子、以及構建一種能夠攜帶藥物或生物製劑的使用該奈米粒子的系統,從而解決該領域中的上述問題以及滿足臨床需求。
鑒於上述情況,本揭露提供一種環形混合型奈米粒子,包括第一聚合物以及與該第一聚合物相互作用的第二聚合物。
在本揭露的至少一個實施態樣中,該環形混合型奈米粒子為環形混合型微胞。
在本揭露的至少一個實施態樣中,該環形混合型奈米粒子具有約50nm至約1200nm的直徑,例如約50nm、100nm、200nm、300nm、400nm、500nm、600nm、700nm、800nm、900nm、1000nm、1100nm或1200nm,但本申請不限於此。在一些實施態樣中,該環形混合型奈米粒子具有約50nm至約500nm、50nm至220nm、或100nm至200nm的直徑。
在本揭露的至少一個實施態樣中,該環形混合型奈米粒子具有彈性。
在本揭露的至少一個實施態樣中,該第一聚合物及該第二聚合物之間的相互作用係電性質、親水性或疏水性。在一些實施態樣中,該第一聚合物係兩性聚合物,且該第二聚合物係疏水性聚合物,例如兩性聚合物係d-α-生育酚聚乙二醇琥珀酸酯,且該第二聚合物係聚γ-苄基-l-麩胺酸酯,但本揭露不限於此。在一些實施態樣中,該第一聚合物包含聚乙二醇。
在本揭露的至少一個實施態樣中,該環形混合型奈米粒子係與藥物或生物活性劑共軛。在一些實施態樣中,該藥物或生物活性劑係選自由鉑衍生物、喜樹鹼、多柔比星(doxorubicin)、胺甲喋呤、17-(烯丙基胺基)-17去甲氧基格爾德黴素(17-AAG)、塞來昔布(celecoxib)、卡培他濱(capecitabine)、多烯紫杉醇(docetaxel)、埃博黴素B(epothilone B)、厄洛替尼(Erlotinib)、依託泊苷(Etoposide)、GDC0941、吉非替尼(Gefitinib)、格爾德黴素(Geldanamycin)、伊馬替尼(Imatinib)、尼達尼布(Intedanib)、拉帕替尼(lapatinib)、來那替尼(Neratinib)、NVP-AUY922、NVP-BEZ235、帕比司他(Panobinostat)、帕唑帕尼(Pazopanib)、魯索替尼(Ruxolitinib)、沙拉卡替尼(Saracatinib)、司美替尼(Selumetinib)、索拉非尼(Sorafenib)、舒尼替尼(Sunitinib)、坦度替尼(Tandutinib)、替西羅莫司(Temsirolimus)、替比法尼(Tipifarnib)、替沃扎尼(Tivozanib)、拓普替康(Topotecan)、陶扎色替(Tozasertib)、凡德他尼(Vandetanib)、瓦他拉尼(Vatalanib)、維莫非尼(Vemurafenib)、長春瑞濱(Vinorelbine)、維莫德吉(Vismodegib)、伏立諾他(Vorinostat)、ZSTK474、及其任意組合所組成之群組,但本揭露不限於
此。在本揭露的一些實施態樣中,該鉑衍生物可為二氯(1,2-二胺基環己烷)鉑(II)(DACHPt),但本揭露不限於此。
本揭露亦提供一種用於製備上述環形混合型奈米粒子的方法,包括混合第一聚合物及第二聚合物以形成混合型奈米粒子,其中,該第二聚合物具有可裂解疏水性基團;以及從該第二聚合物中移除一部分可裂解疏水性基團,以使該第二聚合物帶電並形成該環形混合型奈米粒子。
在本揭露的至少一個實施態樣中,該可裂解的疏水性基團可為苄基、茀基甲氧基羰基保護基團(Fmoc)、叔丁氧羰基保護基團(Boc)、或其任意組合,但本揭露不限於此。
在本揭露的至少一個實施態樣中,該第一聚合物及該第二聚合物溶解在溶液中,且藉由溶劑交換方法形成混合型奈米粒子。
在本申請的至少一個實施態樣中,該混合型奈米粒子係與酸或鹼反應,以從該第二聚合物中移除部分的可裂解疏水性基團。在一些實施態樣中,該混合型奈米粒子係與鹼反應,例如NaOH。
在本申請的至少一個實施態樣中,該混合型奈米粒子係與酸或鹼反應約2小時至約72小時,例如約2小時、4小時、8小時、12小時、16小時、20小時、24小時、28小時、32小時、36小時、40小時、44小時、48小時、52小時、56小時、60小時、64小時、68小時、或72小時,但本申請不限於此。在一些實施態樣中,該混合型奈米粒子係與鹼反應約2至72小時、24至72小時、或24至36小時。
在本揭露的至少一個實施態樣中,從該第二聚合物中移除約10%至約50%(例如,約10%、12%、14%、16%、18%、20%、25%、30%、
35%、40%、45%、或50%)、約20%至約50%、或約25%至約35%的可裂解疏水性基團,但本申請不限於此。
本揭露亦提供一種用於向有需要的個體傳遞藥物或生物活性劑的方法,包含提供醫藥組成物,其包括上述環形混合型奈米粒子、與該環形混合型奈米粒子共軛的有效量的藥物或生物活性劑、以及醫藥上可接受的賦形劑;以及向該個體投予該醫藥組成物。在本案的至少一個實施態樣中,個體患有癌症。
總結上述,本揭露提供一種使用環形混合型奈米粒子的新穎且多功能傳遞系統。該多功能傳遞系統易於使用,且顯示出高穩定性及生物安全性。憑藉非凡的彈性,本揭露中所使用的環形奈米粒子可以穿透血管以及累積至腫瘤損傷。本文在此提供的多功能傳遞系統顯示用於選擇藥物或生物製劑(諸如抗癌藥物)的靈活性,以及其協同增強治療效應。
本專利或本申請檔案包含至少一張彩圖。主管機關將根據要求及必要費用的支付,提供帶有彩色圖式的本專利或專利申請的公告副本。
藉由參考以下結合附圖的說明,將更容易地理解本揭露。
圖1係說明根據本揭露之實施態樣製備負載二氯(1,2-二胺基環己烷)鉑(II)(DACHPt)之環形微胞的示意圖。
圖2A至2D顯示環形奈米粒子的製備及表徵。環形奈米粒子是藉由球體至環形轉換(sphere-to-toroid transition)所製備的。將聚合混合型微胞在各種培育期間以鹼處理。記錄鹼處理時的粒徑及ζ電位(顯示於圖
2A及2B)。這些值表示為平均值±S.D.。培育期間的形態也藉由穿透式電子顯微鏡(TEM)及原子力顯微鏡(AFM)觀察(顯示於圖2C)。此外,藉由傅里葉轉換紅外光譜儀(FT-IR)監測組成聚合物的化學結構(顯示於圖2D)。
圖3表示為以鹼處理24小時的環形奈米粒子的1H-N核磁共振光譜。將鹼處理24小時後的環形奈米粒子冷凍乾燥,以及將粉末溶解到二甲基亞碸-d6(DMSO-d6)溶劑中,用於核磁共振(NMR)的測量。
圖4A及4B顯示環形奈米粒子的載藥量。將DACHPt水性複合物與環形奈米粒子培育24、48及72小時。在培育期間監測粒徑及ζ電位(顯示於圖4A)。在將負載DACHPt的環形混合型微胞冷凍乾燥後,亦測量藥物含量及負載效率(顯示於圖4B)。將粉末分散在20%鹽水中,並用鄰苯二胺(OPDA)方法測定鉑的量。
圖4C至4F顯示負載DACHPt的混合型環形微胞的表徵。用掃描式電子顯微鏡(SEM)及AFM分析負載DACHPt的環形混合型微胞,以分別觀察負載DACHPt的環形混合型微胞的形態(顯示於圖4C)及斷層掃描、以及負載DACHPt的環形混合型微胞的橫截面高度(顯示於圖4D)。負載DACHPt的環形微胞亦藉由TEM觀察來進行形態觀察,以及用能量散射X射線光譜儀(EDS)分析來觀察及分析負載DACHPt的環形微胞中鉑元素的分佈(顯示於圖4E)。圖4F顯示穩定性測試。將環形奈米粒子(TNs)及負載DACHPt的環形混合型微胞在37℃下培育1及6小時。採用動態光散射法(DLS)測定粒徑,且統計分析係與37℃下0小時的粒徑進行比較。
圖5A至5E顯示靜態狀態下的內化。圖5A顯示HCT116人
類結腸癌細胞中FITC標記的負載DACHPt的球形聚合及環形混合型微胞的即時監測圖像。對細胞膜預先進行染色,染色的細胞膜以紅色表示;FITC標記的混合型微胞以綠色表示。這些照片是從即時影片中拍攝及收集的。示意性地說明負載DACHPt的環形混合型微胞與細胞的接觸方向(顯示於圖5B)。固定後藉由SEM圖像觀察HCT116人類結腸癌細胞中負載DACHPt的環形微胞的形態(顯示於圖5C-1及5C-2)。隨時間之內化係藉由流式細胞儀進行,以分析與人類結腸癌細胞株HCT116在37℃下培育1、3及6小時後,FITC標記的負載DACHPt的球形聚合混合型微胞及負載DACHPt的環形混合型微胞的相對螢光強度(顯示於圖5D)。來自影片中的RAW264.7小鼠的巨噬細胞株中FITC標記的負載DACHPt的環形混合型微胞的即時監測圖像(顯示於圖5E)。細胞膜係預先染色且以紅色表示。FITC標記的顆粒以綠色顯示。
圖6A至6D表示流動條件下的體外行為。FITC標記的負載DACHPt的球形聚合及環形混合型微胞以0.1mL/分鐘的速度通過微流體通道(顯示於圖6A)。FITC標記的負載DACHPt的球形聚合混合型微胞及環形混合型微胞以0.1mL/分鐘的流速通過220nm截止多孔膜30分鐘(顯示於圖6B)。測量擠出的螢光。將FITC標記的負載DACHPt的聚合球形及環形混合型微胞在0.1mL/分鐘的速度下穩定注入50mm長,5mm寬及200μm高的通道中,其中小鼠巨噬細胞RAW264.7係預先接種及附著(顯示於圖6C)。在0.1mL/分鐘的速度下通過接種RAW264.7細胞的通道30分鐘的FITC標記的負載DACHPt的球形聚合混合型微胞及環形混合型微胞的細胞黏附(顯示於圖6D)。使用流式細胞儀測定黏附微胞的FITC螢光。
圖7A至7C揭示在靜止狀態下穿透到人類結腸癌細胞HCT116球體中。將人類結腸癌細胞株HCT116培育到生物惰性培養皿上。在培育後3天,將細胞與FITC標記的DACHPt聚合球形及負載的環形混合型微胞一起培育(顯示於圖7A及7B)。使用共軛焦雷射掃描顯微(CLSM)系統觀察細胞球體及混合型微胞的螢光。觀察到負載DACHPt的環形混合型微胞以點狀(顯示於圖7A)或細長形狀(顯示於圖7B)接觸。隨著時間的推移,亦使用Incucyte®活細胞分析系統評估腫瘤穿透率。將FITC標記的負載DACHPt的環形混合型微胞與HCT116腫瘤球體一起培育,HCT116腫瘤球體已用細胞追蹤螢光染料染色(顯示於圖7C)。
圖8A至8E表示接種HCT116細胞的裸鼠在靜脈注射花青5.5標記的負載DACHPt的聚合球形及混合型微胞24小時後的體內光學螢光圖像。顏色表示在用靜脈投予花青5.5標記的負載DACHPt的環形混合型微胞24小時後,小鼠及器官中累積的螢光強度(顯示於圖8A)。感興趣區域(ROI)比係由腫瘤中的螢光強度對全身的螢光強度來決定(顯示於圖8B)。靜脈注射24小時後,在HCT116人類結腸癌細胞異種移植之Balb-c/裸鼠中花青5.5標記的負載DACHPt的球形聚合及環形混合型微胞的生物分佈(顯示於圖8C)。使用共軛焦系統觀察花青5.5標記的負載DACHPt的聚合球形及環形混合型微胞對血管的穿透情況(顯示於圖8D)。血管被染色且其螢光呈現為綠色。螢光花青5.5以紅色表示,且細胞核以藍色表示。觀察肝臟巨噬細胞對花青5.5標記的負載DACHPt的聚合球形及環形混合型微胞的吸收情況(顯示於圖8E)。將巨噬細胞染色,其螢光呈綠色;螢光花青5.5及細胞核分別以紅色及藍色表現。
圖9顯示DACHPt及負載DACHPt的環形混合型微胞對HCT116人類結腸癌細胞的細胞毒性。藉由MTT檢定測定細胞毒性效應。誤差槓為生物性三重複的平均±S.D.。
圖10顯示體內抗腫瘤試驗。在第0、2及4天靜脈內投予PBS、DACHPt分子、及負載DACHPt的環形混合型微胞後,用HCT116人類結腸癌細胞異種移植的Balb-c/裸鼠的腫瘤生長抑制。對結果進行統計分析;顯著差異用星號表示(*,p<0.05;**,p<0.01;及***,p<0.001)。
圖11顯示處理後第16天負載DACHPt的環形混合型微胞的腫瘤生長。在治療後第16天,對攜帶人類結腸癌細胞HCT116的小鼠實施安樂死以及收集腫瘤組織。在排除腫瘤的極端大小後,對其他腫瘤組織進行拍照。
以下提供實施態樣以詳細說明本揭露。所屬領域中具有通常知識者在閱讀本說明書的揭露內容後可以容易地理解本揭露的優缺點及效果,且亦可以在其他不同的實施態樣中實現或應用。因此,可在不違反其針對不同態樣及應用的範圍的情況下修改及/或變更下述實施態樣以進行本揭露,且本文揭露的本揭露範圍內的任何其他元素或方法都可以與本揭露的任何實施態樣中所揭露的任何其他元素或方法相結合。
定義
冠詞「一(a、an)」及「該(the)」在本文中意指一個或多於一個(即至少一個)文章的文法上受詞。術語「或(or)」可與術語「及/或(and/or)」
互換使用,除非上下文另有明確說明。
如本文所述,術語「約(about)」通常意指數值意欲包含來自給定值或範圍的±20%、±10%、±5%、±1%、±0.5%、或±0.1%的變異值。數值的這種變異可能係由例如實驗誤差、用於製造化合物、組成物、濃縮物、或調配物的測量或處理程序的典型誤差、本揭露中使用的起始材料或成分的來源、製造或純度的差異、或類似的考慮因素而發生。或者,術語「約」是指當由所屬領域具有通常知識者考慮時平均值的可接受的標準誤差。除非另有明確規定,否則本文所揭露之所有數目範圍、數量、值及百分比,諸如材料數量、時間之持續時間、溫度、操作條件、數量比率、及諸如此類,在所有情況下應理解為由術語「約」所修飾。
本文中使用的數目範圍是包括性及可組合的,任何落在此數目範圍內的數值都可以作為最大值或最小值來衍生出其子範圍。例如,應當理解,數目範圍「10-50%」包含介於最小值10%到最大值50%之間的任何子範圍,諸如從10%到25%、從25%到50%、或從22.5%到37.5%的子範圍。此外,本文中使用的複數個數值可以任選地作為最大值及最小值來衍生出數目範圍。例如,50nm至500nm、50nm至1200nm、及500nm至1200nm的數目範圍可自50nm、500nm及1200nm的數值衍生出來。
如本文所述,「個體(subject)」用於意指任何脊椎動物,包括但不限於尋求改善狀況、病症或疾病的人類、哺乳動物,諸如鹿、騾子、麋鹿、騾鹿。然而,有利地,該個體是哺乳動物諸如人,或動物哺乳動物諸如馴養的哺乳動物,例如狗、貓、馬、大鼠、小鼠、或諸如此類,或生產型哺乳動物,例如牛、羊、豬、鹿、或諸如此類。
術語「包含(comprise、comprising)」、「包括(include、including)」、「具有(have、having)」、「含有(contain、containing)」、及其任何其他變體用於本文旨在涵蓋非排他性之包含。例如,當描述一個物件「包含」限制時,除非另有說明,否則其可以另外包括其它成分、元素、組分、結構、區域、部件、裝置、系統、步驟或連接等,且不應排除其它的限制。
如本文所用,「投予(administer、administration)」、「治療(treatment)」、「補充(supplementation)」、「注射(injection)」或「提供(provide)」是指用於將物質(亦即幹細胞)全身性、或局部性、或其任何組合地傳遞到體內的技術。當腸胃外或靜脈內投予治療有效量的本發明時,其通常以單位劑型式配製(例如,乳劑、丸劑及軟膏)。
術語「治療(treating或treatment)」是指向有需要的個體、患有該疾病或症狀或易於患有這種疾病者投予有效量的治療劑,目的是治癒、減輕、緩解、補救或改善疾病、其症狀、或患有該疾病的傾向。這樣的個體可以由醫療保健專業人員根據任何合適的診斷方法的結果來識別。
如本文所用,術語「兩性的(amphiphilic)」在本文中用於指含有親水性或極性(水-可溶性)及疏水性(水-不溶性)基團兩者的物質。
術語「親水的(hydrophilic)」是指材料在水性介質中自由分散的趨勢。如果材料較喜歡與其他親水材料相互作用且避免與疏水材料相互作用,則認為該材料是親水的。本文所用之「親水性(Hydrophilicity)」可為一個相對術語,亦即,同一分子可以被描述為親水的或不這麼描述,取決於它所比較的內容。在本申請的至少一個實施態樣中,聚合物具有可裂
解的親水基團,其可以藉由諸如酸或鹼處理的化學反應來移除,且當部分的親水基團從聚合物移除時該聚合物之親水性降低;然而,該聚合物仍然屬於本文定義的親水化合物。在一些實施態樣中,親水分子是極性的及/或帶電的且具有良好的水溶性,例如,以高達0.1mg/ml或更高可溶,但本揭露不限於此。
本文中使用的術語「疏水的(hydrophobic)」指物質避免與水接觸的趨勢。如果材料較喜歡與其他疏水材料相互作用且避免與親水材料相互作用,則被認為是疏水的。本文所用之「疏水性(Hydrophobicity)」可為一個相對術語,亦即,同一分子可以被描述為疏水的或不這麼描述,取決於它所比較的內容。在本申請的至少一個實施態樣中,聚合物具有可裂解的疏水基團,其可以藉由諸如酸或鹼處理的化學反應來移除,且當部分的疏水基團從聚合物移除時,該聚合物的疏水性降低;然而,該聚合物仍然屬於本文定義的疏水化合物。在一些實施態樣中,疏水分子是非極性的及/或不帶電的且具有差的水溶性,例如,以低至0.1mg/mL或更低不溶,但本揭露不限於此。
術語「傳遞系統(delivery system)」是指投予醫藥化合物或生物活性劑以在有需要之個體中達到其治療效果的方法或程序。
術語「粒子(particle)」是指包含分子組合的奈米或微米尺寸的超分子結構。例如,在一些實施態樣中,兩性的嵌段聚合物在水溶液中形成顆粒。在一些實施態樣中,藉由兩性嵌段聚合物形成的顆粒取決於pH或溫度。
實施例
材料及動物
聚合物,包含d-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯(TPGS)及聚(γ-苄基-l-麩胺酸酯)(PBLG)及抗癌劑二氯(1,2-二胺基環己烷)鉑(II)(DACHPt),均從Sigma-Aldrich(St.Louis,M.O.,U.S.A.)購買。有機溶劑N,N-二甲基乙醯胺(DMAc)及二甲基甲醯胺(DMF)均從Duksan Pure Chemical Co.,LTD.(Gyeonggido,South Korea)獲得,且用於定量鉑試劑的鄰苯二胺(OPDA)試劑購自Alfa Aesar(Ward Hill,M.A.,U.S.A.)。透析袋購自Rainbow Biotechnology Co.,LTD.(Taipei City,Taiwan)。用於製備穿透式電子顯微鏡樣品的染色試劑磷鎢酸鈉(PTA)及分析試劑,包括用於氫核磁共振(1H-NMR)測量的二甲基亞碸(DMSO-d6)及用於傅里葉轉換紅外光譜(FT-IR)分析的溴化鉀(KBr),也從Sigma-Aldrich購買。用於奈米粒子製備的氫氧化鈉(NaOH)及用於穩定性測試及藥物釋放曲線的氯化鈉(NaCl)分別從Uniregion BioTech Inc.及Sigma-Aldrich的Vetec獲得。用於純化的透析袋及PD-10脫鹽管柱分別從Merck Millipore(Burlington,M.A.,U.S.A.)及GE Healthcare Life Science(Uppsala,Sweden)購得。螢光染料,包括5/6-羧基螢光素琥珀醯亞胺酯(FITC-NHS ESTER),Cellmask Orang及CellTrackerTM Red CMTPX染料是從Thermo Fisher Scientific Inc.(Waltham,M.A.,U.S.A.)獲得。用於細胞培養的細胞培養基,包括Dulbecco改良之Eagle培養基(DMEM)、McCoy’s 5a培養基,胎牛血清(FBS)及青黴素-鏈黴素溶液,是從Cytiva(Marlborough,M.A.,U.S.A.)購得。包含阿米洛利(amiloride)及甲基-β-環糊精(甲基-β-CD)在內的胞吞抑製劑是從Merck and Co.(Rahway,N.J.,U.S.A.)購得。以及蔗糖是從
J.T.Baker(Radnor,P.A.,U.S.A.)獲得。μ-Slide I Luer流道晶片、聚合物蓋玻片底部細胞培養皿及生物惰性細胞培養皿均購自ibidi GmbH(Gewerbehof,Gräfelfing,Germany)。用於培養腫瘤球體的96孔微孔盤購自Corning Inc.(Corning,N.Y.,U.S.A.)。用於生物TEM觀察的試劑,包含2.5%戊二醛、1%四氧化鋨、乙酸氧鈾及檸檬酸鉛,由Nautiagene(Taipei City,Taiwan,R.O.C.)慷慨提供。此外,用於H&E染色及石蠟包埋的試劑由Jiunn-Wang Liao教授慷慨提供。
動物試驗由中國醫藥大學的實驗動物照護及使用委員會(IACUC)批准(IACUC批准號:CMUIACUC-2020-058),且用於我們動物試驗的BALB/c裸鼠由國家實驗動物中心(Taipei City,Taiwan,R.O.C.)提供。我們動物試驗中的材料,包含基質膠及異氟醚,分別獲自Merck及Panion & BF Biotech.Inc.(Taiwan)。螢光染料花青5.5 NHS酯購自Lumiprobe(Wan Chai,Hong Kong)。
用於組織固定的福馬林是從Sigma-Aldrich購買。含有4',6-二甲脒基-2-苯基吲哚(DAPI)的封固劑、用於冷凍組織染色的抗體,包括抗-CD34及抗-45一級抗體及螢光二級抗體,包括Alexa Fluor® 488及555標記之抗兔IgG二級抗體均從Abcam PLC(Cambridge,U.K.)獲得。
負載DACHPt的環形混合型微胞的製備及表徵
將TPGS(2mg)及PBLG(6mg)聚合物溶解在DMAc(16mL)中,以及使用溶劑交換方法組合成聚合混合型微胞。將製備的混合型微胞使用3000RPM超濾(M.W.C.O.10K)濃縮10分鐘。將濃縮的混合型微胞溶液放入樣品瓶中,並將0.337mL的NaOH水溶液(0.5N)滴入樣品瓶中。
然後將樣品瓶在攪拌下在25℃下培育適當的反應期間。之後,將溶液放入透析袋(M.W.C.O.6-8k)中,並在去離子水中透析過夜。從透析袋中移除溶液,加入0.272mL DACHPt水性複合物。將溶液在攪拌下在25℃下進一步反應一段期間。一旦反應終止,用3000RPM超濾(M.W.C.O.30k)移除過量的DACHPt水性複合物10分鐘。用動態光散射(DLS)(ZS 90,Malvern,U.K.)測量粒徑及ζ電位。
用穿透式電子顯微鏡(TEM)(JEM-2100F,JEOL Ltd.,Japan)及原子力顯微鏡(AFM)(Dimension Icon,Bruker,M.A.,U.S.A.)觀察負載DACHPt的環形混合型微胞的形態。針對TEM觀察,將10μL樣品溶液滴到碳塗覆之銅網格上,幾分鐘後,將溶液從網格中移除。之後,將含有1%磷鎢酸鈉(10μL)的染色染料滴到網格上1分鐘。移除多餘的染色染料後,將網格乾燥以及儲存在25℃下進行觀察。使用場發射穿透式電子顯微鏡(FE-TEM)在200kV的加速電壓下進行觀測。同時,藉由能量散射X射線光譜儀(EDS)及INCA軟體分析負載DACHPt的環形混合型微胞的元素分佈。
奈米結構也用AFM表徵,並用Nanoscope Analysis軟體進行分析。將樣品溶液滴到矽晶片上,該矽晶片預先經空氣沖洗以及用血漿表面處理1分鐘。在真空烘箱中乾燥後,將矽晶片移至AFM進行拓撲觀察及定量奈米力學(QNM)測量。選擇標稱彈簧常數(kN)為0.7N/m的單晶矽尖端(Brucker,Bruker,M.A.,U.S.A.)作為懸臂。在粒子中每10個點分析楊氏模量以及使用赫茲接觸模型進行計算。
載藥量、效率及穩定性,釋放曲線
為評估負載DACHPt的環形混合型微胞的藥物含量及負載效率,將所製備的負載DACHPt的環形混合型微胞進行了冷凍乾燥。然後稱量它們以及重新分散到1mL的20% NaCl溶液中。反應24小時後,藉由OPDA方法(Zhang,Weiqi,and Ching-Hsuan Tung.“Redox-responsive cisplatin nanogels for anticancer drug delivery.”Chemical Communications 54.60(2018):8367-8370)偵測以及定量釋放的鉑。簡而言之,將等體積的負載DACHPt的TM及OPDA溶液(1.2mg/mL的DMF溶液)均勻混合,並將混合物在80℃下水浴10分鐘。當混合溶液冷卻至25℃時,用紫外光-可見分光光度計(Lambda 265,PerkinElmer,M.A.,U.S.A.)在703nm下偵測鉑濃度。
進行穩定性測試及藥物釋放曲線來比較負載DACHPt的聚合球形微胞及環形混合型微胞。事先,負載DACHPt的球形聚合混合型微胞係如下製備:將包括TPGS(2mg)及PBLG(6mg)的聚合物與2mg DACHPt試劑一起溶解到DMAc(16mL)中。以去離子水透析後,過濾負載DACHPt的球形聚合混合型微胞以移除過量的DACHPt,並儲存在4℃直到使用。使用穿透式電子顯微鏡觀察它們的形態,以及按照負載DACHPt的環形混合型微胞的方法測量其物理性質,包括粒徑、分佈及其機械性質(楊氏模量)。然後如下進行穩定性測試:將負載DACHPt的球形聚合混合型微胞(0.5mL)及負載DACHPt的環形混合型微胞(0.5mL)與等體積的去離子水混合。然後將負載DACHPt的環形混合型微胞(0.5mL)與等體積的磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)(0.5mL)另外混合。在預定時間,使用DLS分析負載DACHPt的球形聚合混合型微胞及環形混合型微胞的尺寸,以研究其穩定
性。當在模擬生理環境中培育時,還測定了負載DACHPt的球形聚合混合型微胞及環形混合型微胞的釋放曲線。首先將負載DACHPt的球形聚合混合型微胞及環形混合型微胞與等體積的去離子水或PBS混合,以及將溶液放入透析袋(MWCO 6-8k)中。然後將透析袋置於37℃的去離子水或PBS中並搖動。如上所述,在預定時間使用OPDA方法收集以及定量釋放的DACHPt溶液。
內化、靜態腫瘤穿透評估及細胞毒性
為評估及比較負載DACHPt的球形聚合混合型微胞及負載DACHPt的環形混合型微胞的內化,將螢光染料(FITC)分別共軛到這兩個奈米粒子上。簡而言之,胺基封端TPGS首先藉由酯鍵與半胱胺酸反應進行修飾。然後稱取經修飾的TPGS-NH2(2mg)、PBLG(6mg)及抗癌強效試劑DACHPt(2mg),並溶解在DMAc(16mL)中。以去離子水透析後,過濾負載DACHPt的聚合混合型微胞以移除過量的DACHPt。之後,將螢光染料FITC-NHS ESTER溶解在DMSO(1mg/mL)中,並將溶液與負載DACHPt的球形聚合混合型微胞在25℃下混合。二十四小時後,溶液通過PD-10脫鹽管柱以消除過量的螢光染料,形成FITC標記的負載DACHPt的球形聚合混合型微胞。FITC標記的負載DACHPt的環形混合型微胞也按照相同的程序製備。經修飾的TPGS-NH2參與上述環形混合型微胞的製備,且環形混合型微胞上的TPGS-NH2的胺基進一步與螢光染料FITC反應。通過PD-10脫鹽管柱後,完成FITC標記的負載DACHPt環形混合型微胞。
用小鼠巨噬細胞株RAW264.6及HCT116人類結腸癌細胞評
估FITC標記的負載DACHPt的球形聚合混合型微胞及環形混合型微胞的內化。將RAW264.7及HCT116細胞(每孔1x105個細胞)接種在6孔盤上,並分別與DMEM及McCoy’s 5a細胞培養基在37℃及5%CO2供應下培育。當細胞附著時,用細胞獨立地處理FITC標記的負載DACHPt的球形聚合混合型微胞及環形混合型微胞。在經過1、3及6小時的培育後,移除FITC標記的負載DACHPt的球形聚合混合型微胞及環形混合型微胞,並用PBS洗滌細胞兩次。藉由流式細胞儀(BD FACSCanto,Becton,Dickinson and Company,East Rutherford,N.J.,U.S.A.)分析這些細胞的內部螢光。內化也藉由高速共軛焦系統(Andor Dragonfly,Oxford Instrument plc,Oxfordshire,U.K.)即時觀察。將小鼠巨噬細胞RAW264.7細胞及HCT116人類結腸癌細胞(1x105細胞)接種在蓋玻片底部培養皿上(Ibidi GmbH,Gräfelfing,Germany)。將細胞附著在培養皿上後,將它們與CellMask Orange(1μM)培育10分鐘以染色細胞膜。之後,用RAW264.7及HCT116細胞獨立地處理FITC標記的負載DACHPt的球形聚合混合型微胞及環形混合型微胞,並用共軛焦系統同時觀察細胞2分鐘。在488及554nm的激發波長及520及567nm的發射波長下分別偵測到FITC標記的負載DACHPt的球形聚合混合型微胞或環形混合型微胞及細胞膜的螢光。為了確認HCT116細胞表面之負載DACHPt的環形混合型微胞的形態,藉由一系列脫水固定與負載DACHPt的環形混合型微胞培育1小時之後的細胞。使用SEM觀察細胞及負載DACHPt的環形混合型微胞。
此外,還採用流式細胞儀測定了負載DACHPt的球形聚合混合型微胞及環形混合型微胞進入人類結腸癌細胞HCT116的胞吞途徑。將
HCT116細胞(每孔1x105個細胞)接種到6孔盤上的每個孔上。用HCT116細胞處理各種胞吞抑製劑,包括阿米洛利鹽酸鹽(1mM),甲基-β-環糊精(20mM)及高滲蔗糖(0.25M)30分鐘;之後,用PBS洗滌細胞三次,並與FITC標記的負載DACHPt的球形聚合混合型微胞及環形混合型微胞共培養。兩小時後,用PBS洗滌細胞,用流式細胞儀收集並分析細胞。將細胞的螢光與僅用FITC標記的負載DACHPt的球形聚合混合型微胞及環形混合型微胞處理2小時的細胞的螢光進行比較。
還評估細胞黏附。將人類結腸癌細胞HCT116(1x105個細胞/mL)接種在6孔盤中的每個孔上。當細胞附著時,將細胞在4℃下培育30分鐘。預冷細胞後,將FITC標記的負載DACHPt的球形聚合混合型微胞及環形混合型微胞以細胞處理0.5小時,然後用PBS洗滌細胞兩次以及在37℃下培養。兩小時後,用PBS洗滌細胞兩次並收集。藉由流式細胞儀測定細胞螢光。
在靜止狀態下對癌細胞球體的穿透也在短期觀察中。將人類結腸癌細胞HCT116(1x106個細胞/mL)接種在生物惰性細胞培養皿上,並與McCoy’s 5a培養基在37℃下以5% CO2供應下培育。三天後,當細胞聚集在一起時,將細胞進一步與FITC標記的負載DACHPt的球形聚合混合型微胞或環形混合型微胞培育。藉由高速共軛焦系統即時觀察細胞及螢光。在488nm的激發波長及520nm的發射波長下偵測FITC標記的負載DACHPt的球形聚合混合型微胞或環形混合型微胞的螢光。此外,還追蹤腫瘤穿透6小時。首先,將人類結腸癌細胞HCT116(5x103個細胞)用CellTrackerTM紅色CMTPX染料染色,並接種在96孔超低附著盤上
(Corning Inc.,Corning,NY,USA)。三天後,隨著細胞球體的形成,處理FITC標記的負載DACHPt的球形聚合混合型微胞或環形混合型微胞。使用IncuCyteS3細胞追蹤系統(Essen BioScience Inc.,Ann Arbor,MI,USA)偵測細胞追蹤器及FITC的螢光。
用MTT測定法評估DACHPt及負載DACHPt的環形混合型微胞對HCT116人類結腸癌細胞的細胞毒性。用HCT116人類結腸癌細胞處理先前根據DACHPt濃度調整的各種濃度(0.16-20mg/mL)的DACHPt水性複合物及負載DACHPt的環形混合型微胞24小時。然後使用MTT測定法測定細胞活力。
流動條件下的體外行為
負載DACHPt的球形聚合混合型微胞及環形混合型微胞以0.1mL/分鐘的速度通過微流體通道。藉由高速共軛焦系統即時觀察混合型微胞的動態運動及形態。此外,還使用高速共軛焦系統觀察了流動條件下與巨噬細胞的相互作用,以及使用流式細胞儀進行了定量。將小鼠巨噬細胞RAW264.7(1x106個細胞/mL)接種在μ-Slide I0.2 Luer晶元上的5mm寬、50mm長及200μm高的通道中。當細胞附著時,藉由注射泵控制(Model Fusion 710,Chemyx Inc.,Stanford,TX,USA)以0.1mL/分鐘的速度穩定地將FITC標記的負載DACHPt的球形聚合混合型微胞及環形混合型微胞穩定地注入通道。同時,藉由共軛焦系統偵測當FITC標記的負載DACHPt的球形聚合混合型微胞及環形混合型微胞附著在細胞上時的螢光。30分鐘後,使用流式細胞儀收集細胞並分析細胞內的螢光強度。
將FITC標記的負載DACHPt的球形聚合混合型微胞及環形
混合型微胞(3mL)藉由注射泵控制以0.1mL/分鐘的流速通過0.22μm的聚(二氟亞乙烯)(PVDF)注射器。30分鐘後,收集經過濾的FITC標記的負載DACHPt的球形聚合混合型微胞及環形混合型微胞,以及分別用量筒測定其體積。測量過濾混合型微胞的螢光,並與過濾前的螢光進行比較,以測定擠出效應。
腫瘤累積及生物分佈
人類結腸癌細胞(1x107個細胞/mL)也皮下接種到4周齡雌性Balb-c/裸鼠中。使用卡尺測量腫瘤的長軸及短軸,且腫瘤體積(V)係計算為V=(ab2)/2,其中a及b分別表示腫瘤的最長及最短軸。當腫瘤尺寸達到500至1000mm3時,利用經腫瘤接種的小鼠研究負載DACHPt的球形聚合混合型微胞及環形混合型微胞的生物分佈或腫瘤累積。為了研究生物分佈,根據上述方法將螢光染料花青5.5-NHS酯(NHS ester)分別標記到胺基封端的負載DACHPt的球形聚合混合型微胞及環形混合型微胞上,以將FITC標記到負載DACHPt的混合型微胞上。以透析純化後,將花青5.5標記的負載DACHPt的球形聚合混合型微胞及環形混合型微胞藉由尾靜脈靜脈內投予到4周齡之經接種HCT116細胞的Balb-c/裸鼠中。在注射後6、24小時,藉由體內成像系統(IVIS Lumina LT Series III,PerkinElmer,M.A.,U.S.A)觀察小鼠。之後,在注射後24小時,對小鼠實施安樂死,以及切除其器官及腫瘤。使用相同的IVIS測定器官及腫瘤螢光。
此外,將自靜脈投予花青5.5標記的負載DACHPt的球形聚合混合型微胞及環形混合型微胞的小鼠所收穫的腫瘤組織包埋於Cryo-Gel中,並使用冷凍切片機(Leica CM3050S,Leica Biosystems,Wetzlar,
Germany)製備冷凍切片。使用內皮細胞標記重組抗-CD34一級抗體及Alexa Fluor® 488標記的抗-兔IgG二級抗體標記腫瘤冷凍切片中的血管。將冷凍切片及細胞核用含有DAPI的封固劑封固以及染色。使用共軛焦雷射掃描系統獨立地在405、488及640nm的激發波長以及適當的發射波長下偵測細胞核、Alexa Fluor®488標記之血管、及花青5.5標記的負載DACHPt的球形聚合混合型微胞、環形混合型微胞的螢光。
亦收穫肝臟切片,在Cryo-Gel中冷凍並使用冷凍切片機製備成片。使用重組抗-CD 45一級抗體及Alexa Fluor® 555標記的抗-兔IgG二級抗體標記肝臟中的巨噬細胞。冷凍切片用含有DAPI的封固劑封固,且同時用DAPI染色細胞核。使用共軛焦雷射掃描系統獨立地在405、561及640nm之激發波長及適當的發射波長下偵測細胞核、Alexa Fluor® 555標記之血管、及花青5.5標記的負載DACHPt的球形聚合混合型微胞及環形混合型微胞的螢光。
體內腫瘤抑制及毒性評估
為了研究腫瘤抑制的效果,將攜帶HCT116細胞之4周齡的雌性Balb-c/裸鼠(其腫瘤尺寸達500mm3)分為3組,每組包含5隻小鼠。在第0、2及4天將帶有腫瘤的小鼠分別靜脈內注射PBS、4mg/mL DACHPt水性複合物及4mg/mL負載DACHPt的環形混合型微胞(根據DACHPt濃度調整)。注射後16天中每2至3天監測腫瘤尺寸及重量。在注射後第16天,小鼠全部被安樂死,並收集它們的血液。同時,收集小鼠的腫瘤及肝臟。在排除極端者後,拍攝了腫瘤。將血液樣品在3000RPM下離心10分鐘,以獲得用於肝腎功能評估的血清樣品。藉由天門冬胺酸轉胺酶(AST)
及丙胺酸轉胺酶(ALT)值來評估肝功能;用血尿素氮(BUN)及肌酸酐指數評估腎臟的功能。
從小鼠身上收穫的腫瘤及肝臟在4%福馬林中保存過夜,並將腫瘤及肝臟包埋在石蠟中以形成石蠟組織塊。之後,使用切片機(Leica RM 2145,Leica,Wetzlar,Germany)將組織切成5μm厚的切片。這些切片用H&E染色。使用光學顯微鏡(Optiphot-2,Nikon,Tokyo,Japan)進行組織病理學分析。
統計分析
數據以平均值及標準偏差(平均值±SD)顯示。結果比較係用學生t檢驗(Excel,2010)進行分析。當p值小於0.05時,差異被認為是顯著的,如星號(*,p<0.05;**,p<0.01;及***,p<0.001)所示。
實施例1.負載DACHPt的環形混合型微胞的製備及表徵
將強效抗結腸癌劑二氯(1,2-二胺基環己烷)鉑(II)(DACHPt))安排共軛到這些羧酸鹽上,如圖1所示,形成負載DACHPt的環形混合型微胞(負載DACHPt的環形混合型微胞)。經由溶劑交換法製造含有兩性共聚物TPGS及疏水性聚合物PBLG的聚合混合型微胞(PMs)。藉由超速離心濃縮後,測定粒徑約為200nm,以及多分散指數(PDI)約為0.1。然後用鹼處理經濃縮的PMs,並逐漸移除PBLG的苄基。為了最佳化,測試不同的反應物週期(24、48及72小時),並在以去離子水透析以移除斷裂後評估所得之物理性質。如圖2A所示,反應24小時後,脫苄基化的奈米粒子粒徑增加到215.4±9.1nm;隨著脫苄基化持續48及72小時,粒徑增加到250及300nm以上,PDI值同時升高。鹼性溶液中奈米粒子的增大是由陰
離子羧酸鹽所引起的,此由圖2B中所示的ζ電位證實。鹼處理前PMs的ζ電位為-0.29±0.13mV;在鹼中培育期間,奈米粒子的ζ電位負增加,如圖2B所示。在脫苄基化過程中,用穿透式電子顯微鏡(TEM)及原子力顯微鏡(AFM)調整及觀察奈米粒子的形態,如圖2C所示。在鹼處理之前,可以清楚地觀察到球形核殼PM結構。鹼處理24小時後,形成環形奈米粒子(TNs)。然而,隨著在基本條件中期間的增加,環形奈米粒子被變形或被驅使到斷裂(以圖2C中的黃色箭頭表示)。這可以解釋酯在兩性TPGS中的裂解,如圖2D所示的傅里葉轉換紅外光譜儀(FT-IR)所示。在FT-IR光譜中,從波數2850到2950cm-1的峰值,代表烷類C-H在TPGS中的拉伸在鹼培育期間逐漸減小,因為對於環形製造而言TPGS及奈米粒子的斷裂只能承受24小時的鹼處理。考慮到形態及化學結構,建議將24小時鹼處理作為環形奈米粒子的最佳製造時間。
鹼處理24小時後,1H-NMR光譜(顯示於支持資料中之圖3)表明PBLG中約20%的苄基被消除,暴露了羧酸鹽。這些羧酸鹽提供了在其中共軛強效抗癌藥物DACHPt水性複合物的位置,而TPGS及80%的疏水苄基則給予了環形的維持。DACHPt水性複合物與環形混合型微胞培育24小時後,負載DACHPt的環形混合型微胞的粒徑增加到336.0±27.3nm,ζ電位變為約-10mV,如支持資料中之圖4A所示。在超過48及72小時的培育期間,粒徑增加到1μm以上。支持資料中的圖4B顯示,用DACHPt水性複合物處理24小時後環形混合型微胞的藥物含量及負載效率分別為6.93%±1.22%及19.52%±3.43%,而用DACHPt培育超過48小時之環形混合型微胞的藥物含量及負載效率會增加。然而,考慮到粒徑及在生物醫
學中的進一步臨床應用,環形混合型微胞及DACHPt水性複合物的24小時培育時間對於DACHPt共軛至環形混合型微胞而言是可以接受的。
用穿透式電子顯微鏡圖像及AFM斷層掃描圖像所表徵之負載DACHPt的環形混合型微胞的環形架構及截面分別顯示於圖4C及4D。圖4C中所示的穿透式電子顯微鏡圖像確認了環形微胞及300nm左右的粒徑。值得注意的是,在圖4C至4E中也觀察到細長的環形微胞,暗示了變形能力。亦使用穿透式電子顯微鏡及能量散射X射線光譜儀(EDS)分析了環形混合型微胞內抗癌試劑DACHPt的鉑分佈,如圖4C所示。由於疏水性苄基的移除及用於DACHPt共軛的羧基暴露,DACHPt鉑在環形臂上被辨別出來,形成聚合物-金屬複合物。此外,圖4D中的AFM圖像顯示環形形狀及環形混合型微胞的直徑約為250nm,填充DACHPt之混合型微胞的高度約為5nm。為了確認水性環境中的環形奈米結構,如圖4E所示,使用SEM在水中觀察了負載DACHPt的環形混合型微胞。SEM圖像顯示細長的環形奈米粒子,在圖4C中也觀察到了這一點,表明我們的負載DACHPt的環形混合型微胞在形成金屬-聚合物複合物後仍保持其靈活性。
經由原子力顯微鏡奈米壓痕測定負載DACHPt的環形混合型微胞的機械性質,如表1所示。負載DACHPt的環形混合型微胞的楊氏模
量為32.458±8.340mPa,其在共軛DACHPt水性複合物後提高了1.77倍。楊氏模量的增加程度表明,負載DACHPt的混合型微胞在施加外力時能夠抵抗塌陷。如圖4F所表明,在培育6小時後,環形奈米粒子(TNs)經歷了圖4F中的巨大粒徑變化。對於負載DACHPt的環形混合型微胞,顯示出相對細微的粒徑變化。即使觀察到它們的形態變形,仍然可以看到負載DACHPt的環形混合型微胞的中空區域及該環形的冠狀結構。
實施例2.靜態狀態下的內化行為
由於引入的金屬複合物DACHPt是一種強效的抗結腸癌試劑,我們進行了初步評估,期望作為癌症治療的給藥系統的生物醫學應用。在所有用作藥物傳遞的奈米粒子中,球形奈米粒子很常見。在本文中,我們將DACHPt直接封裝到聚合混合型微胞中,包含TPGS及PBLG。使用TEM觀察負載DACHPt的聚合混合型微胞(負載DACHPt的球形聚合混合型微胞)為球形。DLS測定的粒徑為294.6±19.7nm,ζ電位為-8.68±1.37mV,其近似基於負載DACHPt的環形混合型微胞。然而,藉由原子力顯微鏡奈米壓痕測量之負載DACHPt的球形聚合混合型微胞的楊氏模量比負載DACHPt的環形混合型微胞高1.5倍。這可以解釋DACHPt分子主要聚集在球形混合型微胞的核心中,而這些分子分佈在環形混合型微胞的臂周圍。負載DACHPt的球形聚合混合型微胞的核殼結構可防止其自身在水或磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中隨著振蕩時間而劇烈地增加顆粒。相反地,負載DACHPt的環形混合型微胞的顆粒在H2O或PBS中隨時間逐漸增加。即使偵測到顆粒的增加,負載DACHPt的環形混合型微胞的藥物釋放曲線在水及PBS條件下也顯示出緩慢的釋放曲線,近似於負載DACHPt
的球形聚合混合型微胞所顯示的。粒徑的增加可歸因於環形混合型微胞的變形。此外,還比較了負載DACHPt的球形及環形混合型微胞作為藥物傳遞系統的體外行為。
由於鉑衍生物在臨床上對結直腸癌有強效,因此本揭露的環形混合型微胞旨在治療結直腸癌。首先,我們研究負載DACHPt的球形及環形混合型微胞在靜止狀態下對人類結腸癌HCT116細胞的相互作用,以模擬負載DACHPt的微胞轉運到腫瘤組織。在共軛上螢光染料之後,藉由替代胺衍生的TPGS,5/6-羧基螢光素琥珀醯亞胺酯(FITC-NHS ester)在胺官能化的球形聚合混合型微胞及環形混合型微胞上。我們獨立地培育了FITC標記的負載DACHPt的球形聚合混合微胞及環形混合型微胞與人類結腸癌細胞株HCT116,且在細胞膜染色後1小時,其相互作用係使用即時高速共軛焦雷射掃描顯微鏡系統(即時高速CLSM系統)追蹤。如圖5A所示,螢光環形微胞(以綠色表示)在與HCT116細胞培育期間顯示出其形狀或方向的動態改變,這是由於橡皮筋一樣的靈活性。FITC標記的負載DACHPt的環形混合型微胞的橡皮筋狀運動影響了它們相對於結腸癌細胞的方向及接觸表面。如圖5A所示,當FITC標記的負載DACHPt的環形混合型微胞附著在細胞膜上時,在負載DACHPt的環形混合型微胞邊緣具有圓形曲率,如圖5B中左圖所示意性說明,它們顯示為細胞膜上的螢光點(在圖5A中以「a」表示)。接著,它們沒有內化到癌細胞中,且很容易從細胞膜上分離。然而,當環形混合型微胞的線圈(coil)或細長的環形混合型微胞與細胞膜結合時,如圖5B中右圖所示意性說明,其形狀被觀察到為螢光棒(參見圖5A中的「b」),FITC標記的負載DACHPt的環形混合型微
胞傾向於經歷細胞結合及內化。藉由SEM圖像觀察以及證實負載DACHPt的環形混合型微胞的接觸方向效應,如圖5C-1及5C-2所示。當負載DACHPt的環形混合型微胞在細胞膜上呈球形時,如圖5C-1所示,內化還沒有開始;然而,當負載DACHPt的環形混合型微胞表現出變形或接近細長線圈時,顆粒被吞沒到細胞中,如圖5C-2所示。負載DACHPt的環形混合型微胞的這種接觸方向效應可以解釋與接觸面積及吸引力的關聯。負載DACHPt的環形混合型微胞以邊緣處的圓形曲率接觸細胞,並觀察到它們幾乎在一個點上佇立在細胞膜上;同時,它們狹窄的接觸表面導致最小的結合力。在短暫接觸後,負載DACHPt的環形混合型微胞最終自細胞分離。同時,當負載DACHPt的環形混合型微胞以細長線圈接觸癌細胞時,它們的接觸面積要大得多,驅動力也很大。因此,它們能夠在細胞表面停留更長時間,且基本上可內化到細胞中。
靈活性及變形所導致的環形混合型微胞的接觸方向效應,也可以解釋其與球形混合型微胞不同的胞吞途徑。在加入甲基-β-環糊精或提前在高滲蔗糖中培育細胞後,細胞減少了對FITC標記的負載DACHPt的球形聚合混合型微胞的吸收;然而,當細胞用阿米洛利及高滲蔗糖預處理時,細胞減少了對負載DACHPt的環形混合型微胞的吸收。結果證明,球形及環形混合型微胞都可以經由網格蛋白依賴性途徑內化為HCT116細胞。此外,該球形混合微胞也可以透過格形蛋白依賴性途徑內化到HCT116細胞中。此外,球形混合型微胞也可以內化進其他格形蛋白依賴性途徑,例如胞膜窖依賴性途徑;環形混合型微胞可以經由巨胞飲作用內化進HCT116細胞。藉由環形混合型微胞引發的巨胞飲作用可歸因於接觸方向
效應。該環形混合型微胞在被HCT116細胞吸收之前必須拉伸及擴大其接觸表面以黏附在細胞上。
環形混合型微胞的接觸方向效應顯著地影響了進入癌細胞的內化。與球形混合型微胞相比,在培育相對較長的時間(1、3及6小時)後,較少的負載DACHPt的環形混合型微胞被吸收到HCT116癌細胞中。對於負載DACHPt的環形混合型微胞,接觸方向執行了它們對細胞吸收的啟動,而對於負載DACHPt的球形聚合混合型微胞,一旦它們與細胞接觸幾乎可以內化到細胞中。當細胞在4℃下培育以阻礙胞吞作用達30分鐘,HCT1116細胞內化較少的混合型微胞。值得注意的是,這些細胞減少了大約50%的負載DACHPt的球形聚合混合型微胞的吸收,而HCT116細胞僅減少了23.5%的環形混合型微胞的吸收。這一結果闡明對於球形混合型微胞,它們可以迅速地黏附到細胞上以及被吸收,而對於環形混合型微胞,由於它們的接觸方向效應,它們的內化主要取決於細胞黏附。
當與其他細胞株(諸如鼠巨噬細胞株RAW 264)培育時,也觀察到源自負載DACHPt的環形混合型微胞的靈活性及變形的接觸方向效應(顯示於圖5D)。如圖5E所示,比起環形微胞,巨噬細胞更積極地內化球形混合型微胞。負載DACHPt的環形混合型微胞進巨噬細胞的吸收量較低是由於接觸方向效應。接觸方向效應阻礙了那些負載DACHPt的環形混合型微胞(其附著在細胞的邊緣一個點上)被內化,因此培育時的總細胞吸收減少;而負載DACHPt的球形聚合混合型微胞將黏附在巨噬細胞上並在培育期間內化。值得注意的是,巨噬細胞的總吸收量高於癌細胞的總吸收量。巨噬細胞在培育期間內化的負載DACHPt的球形聚合混合型微胞比結腸癌
細胞多10倍,而巨噬細胞RAW 264.7細胞內化的負載DACHPt的環形混合型微胞僅比結腸癌HCT116細胞多2倍。此結果暗示,更多的球形混合型微胞在到達腫瘤組織之前可能內化進分佈在正常器官中的巨噬細胞中,而環形混合型微胞能夠減少巨噬細胞的吸收,從而增強其腫瘤沉積。
實施例3.流動條件下的體外行為
在真實的人體生理學中,在進入實體腫瘤組織之前,混合型微胞係在血管中運輸,且最重要的是在流動條件下運輸。本文研究了負載DACHPt的環形混合型微胞的行為,並與球形混合型微胞在流動作用下進行了比較。首先,使用高速雷射掃描顯微鏡在0.1mL/分鐘的速度下(這被認為是層流條件,以模擬它們在血液中的運輸)的微流體通道中觀察這些FITC標記的混合型微胞的即時形態。FITC標記的負載DACHPt的球形聚合混合型微胞在流動條件下表現出點狀形狀及細微形變。然而,負載DACHPt的環形混合型微胞在微流體通道中表現出動態變形,如圖6A所示。觀察到負載DACHPt的環形混合型微胞在層流下從點狀到細長的奈米粒子動態變形。這種動態運動可歸因於環形混合型微胞的靈活性及其在流動條件下的旋轉及翻滾效應。此外,如圖6B所示,環形混合型微胞的傑出靈活性及動態變形,使得它們在流動條件下通過較小的多孔膜(220nm截止值)時,具有更高的擠出功效。如上所述,球形及環形混合型微胞的粒徑約為300nm。然而,圖6B顯示只有46.7%的球形混合型微胞能夠以0.1mL/分鐘的速率擠過膜,而多1.5倍的環形混合型微胞由於其靈活性而可通過相同尺寸的多孔膜。這些結果表明,環形混合型微胞在流動下有更多的機會通過小孔,諸如從層流血液中血管生成血管的滲漏。
此外,我們研究了混合型微胞及巨噬細胞在流動條件下的相互作用,以模擬混合型微胞藉由富含巨噬細胞的器官的運輸及流動。將小鼠巨噬細胞RAW264.7接種在晶元上寬5mm、高200μm的通道中,然後將FITC標記的負載DACHPt的球形聚合混合型微胞及環形混合型微胞以0.1mL/分鐘的速度通過通道及細胞,計算後鑒定層流。首先,用高速雷射顯微鏡觀察混合型微胞與細胞之間的相互作用,如圖6C所示,負載DAHCPt的TM隨著時間的推移經歷了動態變形,隨後遠離細胞。然而,30分鐘後,與負載DACHPt的球形聚合混合型微胞相比,負載DACHPt的環形混合型微胞在流動條件下因避免巨噬細胞吸收而減少5%,如圖6D所示。這些結果暗示,負載DACHPt的環形混合型微胞能夠在血液運輸過程中從器官中的常駐巨噬細胞中逸出。
實施例4.體外腫瘤穿透行為
隨著混合型微胞從血管滲漏中外滲並到達腫瘤損傷,腫瘤穿透成為藥物傳遞的另一個問題。本文研究了對3D腫瘤穿透的效果。首先,將人類結腸癌HCT116細胞接種到生物惰性培養皿上,形成三維(3D)腫瘤球體。因此施用FITC標記的球形及環形混合型微胞,以及經由高速共軛焦雷射掃描顯微鏡分別觀察它們的行為,並記錄如圖7A至7C所示。負載DACHPt的球形聚合混合型微胞附著在外部細胞上,且由於細胞的緊密堆積及小間隙而被阻礙穿透。然而,如圖7A及7B所示,負載DACHPt的環形混合型微胞在其接觸方向上表現出兩種性能。如圖7A所示,當負載DACHPt的環形混合型微胞與具有微小表面的表層細胞球體接觸時,微胞可以直接穿過細胞間隙;然而,如圖7B所示,當負載DACHPt的環形混
合型微胞以它們的平底或細長表面與球體的表層細胞接觸,它們黏附在細胞表面並慢慢內化到細胞中。此結果再次驗證了環形混合型微胞的變形及接觸方向效應的意義。
在培育期間也監測腫瘤穿透,圖像表示於圖7C中。以螢光標記的人類結腸癌細胞HCT116球體(以紅色表示)處理FITC標記的負載DACHPt微胞(以綠色表示)。於圖7C中,綠色螢光(代表負載DACHPt的環形混合型微胞)被觀察到逐漸與細胞的紅色螢光重疊。培育6小時後,腫瘤球體的大部分區域甚至被綠色螢光佔據。結果清楚地證明,環形混合型微胞在腫瘤穿透方面比球形混合型微胞具有更好的效益。這歸因於環形混合型微胞能夠形變以及穿過球體內緊密的細胞-細胞空隙。
實施例5.體內腫瘤累積及生物分佈
在對負載DACHPt的環形混合型微胞的體外研究的基礎上,負載DACHPt的環形混合型微胞在靜態或流動條件下在其從血管外滲、腫瘤穿透、及低細胞吸收進巨噬細胞方面具有出色的能力。此外,首先對負載DACHPt的環形混合型微胞探索了生物分佈及組織沉積,與負載DACHPt的球形混合型微胞進行了比較,以驗證體外性質。在用螢光染料Cy5.5-NHS酯標記後,按照與上述標記FITC相同的過程,將Cy 5.5標記的負載DACHPt的球形聚合混合型微胞及環形混合型微胞分別靜脈內(i.v.)投予至人類結腸癌細胞HCT116-異種移植小鼠。在注射後24小時,使用體內成像系統(IVIS)光學觀察小鼠中的螢光,如圖8A所示。針對負載DACHPt的球形聚合混合型微胞所顯示的圖像,在腫瘤中發出強烈的螢光,說明腫瘤是負載DACHPt及環形混合型微胞的主要累積位點(圖8A)。然
而,如圖8B所示,負載DACHPt的環形混合型微胞在腫瘤中的累積率比負載DACHPt的球形聚合混合型微胞高約2倍,因為腫瘤不是負載DACHPt的球形聚合混合型微胞的唯一主要累積位點。值得注意的是,對於負載DACHPt的球形聚合混合型微胞,在肝臟中也偵測到強烈的螢光,證明肝臟也是負載DACHPt的球形聚合混合型微胞的另一個主要累積位點。如圖8C所示,對於負載DACHPt的球形聚合混合型微胞,肝臟中的螢光甚至高於腫瘤中的螢光,而對於負載DACHPt的環形混合型微胞,腫瘤中的累積率遠高於其他器官,包括腎臟、脾臟、心臟及大腦,以及與網狀內皮系統(RES)相關的器官-肝臟及肺臟。負載DACHPt的環形混合型微胞的這種高腫瘤累積傾向解釋了其靈活性。如圖8D所示,負載DACHPt的環形混合型微胞(以紅色顯示)從不論具有較大血管間隙或小滲漏的血管(以綠色顯示)外滲,表現出其對腫瘤有利的傾向。
此外,我們還研究了肝臟(其據稱具有大量的巨噬細胞)中在靜脈投予24小時後負載DACHPt的球形及環形混合型微胞的累積。肝臟中的巨噬細胞以CD45抗體識別,並在圖8E中以綠色顯示。如圖8E所示,在肝臟中發現的負載DACHPt的球形聚合混合型微胞比負載DACHPt的環形混合型微胞(以紅色顯示)更多。值得注意的是,在圖8E中觀察到負載DACHPt的球形聚合混合型微胞的紅色螢光幾乎與巨噬細胞的綠色螢光重疊,而負載DACHPt的環形混合型微胞的紅色螢光則被目擊到位於巨噬細胞的鄰近位置。該結果可以解釋環形混合型微胞的接觸方向效應。接觸方向效應延緩環形混合型微胞內化進巨噬細胞,因此環形混合型微胞返回血液循環。總結來說,腫瘤累積及生物分佈的結果確認了環形混合型微胞的
體外性質,以及進一步表明環形混合型微胞可能作為一種新穎藥物傳遞系統。
實施例6.體內抗癌評估
在體外觀察的基礎上,部分負載DACHPt的環形混合型微胞由於其接觸方向效應而未迅速內化到癌細胞中。雖然,與DACHPt分子相比,負載DACHPt的環形混合型微胞仍然引起相當大的體外細胞死亡,如圖9所示。另外,環形混合型微胞在腫瘤攜帶小鼠中具有巨大的腫瘤累積能力。此外,在接種HCT116細胞的裸鼠中評估了負載DACHPt的環形混合型微胞作為鉑衍生物藥物傳遞系統的體內抗腫瘤功效,如圖6A所示。分別給予接種HCT116細胞的裸鼠PBS(控制組)、DACHPt分子、及負載DACHPt環形混合型微胞,根據第0、2及4天的DACHPt濃度調整劑量為4mg/kg。圖10中的結果表明,負載DACHPt的環形混合型微胞顯示出優異的抗腫瘤功效。投予負載DACHPt的環形混合型微胞的小鼠的腫瘤體積在16天後減小,如圖11所示。在第16天,對小鼠實施安樂死,並收集其腫瘤/器官及血液樣本以分析長期治療後的毒性。如圖6B所示,來自所
有組別中小鼠的腫瘤H&E染色切片係用於可視化經歷有絲分裂的圓形到紡錘形腫瘤細胞。蘇木精及伊紅(H&E)染色切片進一步表明,從控制組小鼠收穫的肝臟、肺臟、及脾臟被發現具有衍生自結腸癌細胞的多灶性腫瘤轉移,如箭頭所示,然而腫瘤轉移僅在從用DACHPt分子及負載DACHPt的環形混合型微胞處理的小鼠所收穫的肺臟觀察到。來自控制組中小鼠的肝臟中的腫瘤轉移導致AST(天門冬胺酸轉胺酶)及ALT(丙胺酸轉胺酶)值(在臨床上評估肝功能)異常升高,如表2所示。發現僅用PBS治療的控制組中的小鼠具有極大增加的AST及ALT值,值分別為442±21及94±19U/L-遠高給予內容物為DACHPt分子及負載DACHPt的環形混合型微胞的小鼠。此外,分析從小鼠中收穫的腫瘤的壞死指數,其與預後表現呈負相關。從以負載DACHPt的環形混合型微胞處理之小鼠中收穫的腫瘤顯示出最低的腫瘤壞死分數。這可以解釋負載DACHPt的環形混合型微胞可有效地累積到腫瘤中以及抑制那些惡性癌細胞的進展。這些測試顯示,負載DACHPt的環形混合型微胞表現出優異的抗腫瘤效率,低細胞毒性、及卓越的預後表現,清楚地確認了其作為抗癌治療中藥物傳遞系統的可行性。
Claims (21)
- 一種環形混合型奈米粒子,包含:第一聚合物;及與該第一聚合物相互作用之第二聚合物。
- 如請求項1所述之環形混合型奈米粒子,其係環形混合型微胞。
- 如請求項1所述之環形混合型奈米粒子,其係具有約50nm至約1200nm的直徑。
- 如請求項1所述之環形混合型奈米粒子,其係具有彈性。
- 如請求項1所述之環形混合型奈米粒子,其中,該第一聚合物與該第二聚合物之間的相互作用係電性質、親水性或疏水性。
- 如請求項1所述之環形混合型奈米粒子,其中,該第一聚合物包含聚乙二醇。
- 如請求項1所述之環形混合型奈米粒子,其中,該第一聚合物係一兩性聚合物,且該第二聚合物係疏水性聚合物。
- 如請求項7所述之環形混合型奈米粒子,其中,該第一聚合物係d-α-生育酚聚乙二醇琥珀酸酯,且該第二聚合物係聚γ-苄基-l-麩胺酸酯。
- 如請求項1所述之環形混合型奈米粒子,其係與藥物或生物活性劑共軛。
- 如請求項9所述之環形混合型奈米粒子,其中,該藥物或該生物活性劑係選自由鉑衍生物、喜樹鹼、多柔比星(doxorubicin)、 胺甲喋呤、17-(烯丙基胺基)-17去甲氧基格爾德黴素(17-AAG)、塞來昔布(celecoxib)、卡培他濱(capecitabine)、多烯紫杉醇(docetaxel)、埃博黴素B(epothilone B)、厄洛替尼(Erlotinib)、依託泊苷(Etoposide)、GDC0941、吉非替尼(Gefitinib)、格爾德黴素(Geldanamycin)、伊馬替尼(Imatinib)、尼達尼布(Intedanib)、拉帕替尼(lapatinib)、來那替尼(Neratinib)、NVP-AUY922、NVP-BEZ235、帕比司他(Panobinostat)、帕唑帕尼(Pazopanib)、魯索替尼(Ruxolitinib)、沙拉卡替尼(Saracatinib)、司美替尼(Selumetinib)、索拉非尼(Sorafenib)、舒尼替尼(Sunitinib)、坦度替尼(Tandutinib)、替西羅莫司(Temsirolimus)、替比法尼(Tipifarnib)、替沃扎尼(Tivozanib)、拓普替康(Topotecan)、陶扎色替(Tozasertib)、凡德他尼(Vandetanib)、瓦他拉尼(Vatalanib)、維莫非尼(Vemurafenib)、長春瑞濱(Vinorelbine)、維莫德吉(Vismodegib)、伏立諾他(Vorinostat)、ZSTK474、及其任意組合所組成之群組。
- 一種用於製備一環形混合型奈米粒子的方法,包含:混合第一聚合物及第二聚合物以形成混合型奈米粒子,其中,該第二聚合物具有可裂解的疏水性基團;以及從該第二聚合物中移除部分該可裂解疏水性基團,以使該第二聚合物帶電並形成該環形混合型奈米粒子。
- 如請求項11所述之方法,其中,該環形混合型奈米粒子係環形混合型微胞。
- 如請求項11所述之方法,其中,將該第一聚合物及該第二聚合物係溶解在溶液中,並經由溶劑交換法形成該混合型奈米粒子。
- 如請求項13所述之方法,其中,該混合型奈米粒子係與酸或鹼反應,以從該第二聚合物中移除該部分可裂解疏水性基團。
- 如請求項14所述之方法,其中,該混合型奈米粒子係與鹼反應2至72小時。
- 如請求項11所述之方法,其中,從該第二聚合物中移除約10%至約50%的該可裂解疏水性基團。
- 如請求項11所述之方法,其中,該第一聚合物包含聚乙二醇。
- 如請求項11所述之方法,其中該第一聚合物係一兩性聚合物,且該第二聚合物係疏水性聚合物。
- 如請求項18所述方法,其中,該第一聚合物係d-α-生育酚聚乙二醇琥珀酸酯,且該第二聚合物係聚γ-苄基-l-麩胺酸酯。
- 一種向有需要的個體傳遞藥物或生物活性劑的方法,包含:提供醫藥組成物,包含:如請求項1所述之環形混合型奈米粒子;共軛到該環形混合型奈米粒子上的有效量的該藥物或該生物活性劑;以及醫藥上可接受的賦形劑;向該個體投予該醫藥組成物。
- 如請求項20所述之方法,其中,該個體患有癌症。
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Publication Number | Publication Date |
---|---|
TW202421099A true TW202421099A (zh) | 2024-06-01 |
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