TW202410903A - 治療肌肉萎縮性脊髓側索硬化症之方法及組成物 - Google Patents

Abstract

本文提供一種治療已接受第一劑量BSEP抑制劑之受試者中至少一種ALS症狀之方法，該方法包括對該受試者投予包含膽汁酸或其醫藥上可接受之鹽及苯基丁酸鹽化合物之組成物，監測受試者對BSEP抑制劑之反應，及投予第二劑量BSEP抑制劑，其中第二劑量小於第一劑量。

Description

治療肌肉萎縮性脊髓側索硬化症之方法及組成物

相關申請案之交叉文獻

本申請案主張2022年5月12日申請之美國申請案案號17/742,707之優先權，其內容已以全文引用方式併入本文中。

本揭露一般係有關治療肌肉萎縮性脊髓側索硬化症之組成物及方法。

肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(Amyotrophic Lateral Sclerosis，ALS)為最常見的進行性運動神經元疾病。ALS會引發運動神經元進行性退化，造成快速演進成肌肉無力及萎縮，最後造成局部或全身癱瘓。從症狀發病起的中值存活期為2至3年，以呼吸衰竭為主要死因。目前ALS治療法著重於症狀處理。目前針對ALS僅有兩種FDA核准的醫藥：利魯唑(riluzole)與依達拉奉(edaravone)。因此，需要改進治療ALS的療法。

以不同藥物同時投藥可能產生不良效應，因為每種藥物的代謝及/或排泄可能降低或干擾其他藥物的代謝及/或排泄，因此彼等藥物的有效濃度要比其等單獨投藥時的有效濃度提高。然而，患有神經退化性疾病的患者，諸如： ALS患者，經常需要使用多種藥物治療，以致潛在藥物-藥物交互作用毒性即成為對此等患者有害的療效。因此，需要可以投予多重藥物的改良治療法。

本文提供一種治療受試者中至少一種肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)症狀之方法，該方法包括：(a)對已接受第一劑量膽鹽外排幫浦(bile salt efflux pump)(BSEP)之抑制劑之受試者投予組成物，組成物包含約1克牛磺二醇(Taurursodiol) (TURSO)與約3克苯基丁酸鈉，(b)在來自受試者之第一個生物樣本中測定或已測定血清轉胺酶及/或膽紅素的第一含量，及(c)對該受試者投予第二劑量BSEP之抑制劑，其中第二劑量低於第一劑量。

本文亦提供一種對已患有一或多種ALS症狀之受試者投予TURSO與苯基丁酸鈉之方法，該方法包括(a)對已接受第一劑量膽鹽外排幫浦(BSEP)之抑制劑之受試者投予組成物，組成物包含約1克牛磺二醇(TURSO)與約3克苯基丁酸鈉，(b)在來自受試者之第一個生物樣本中測定或已測定血清轉胺酶及/或膽紅素的第一含量，及(c)對該受試者投予第二劑量BSEP之抑制劑，其中第二劑量低於第一劑量。

有些實施例中，BSEP之抑制劑為環孢素(cyclosporine)。有些實施例中，環孢素之第一劑量為約0.5至約15 mg/kg/天。

有些實施例中，該方法進一步包括步驟(d)，在來自受試者之第二個生物樣本中測定或已測定血清轉胺酶及/或膽紅素之第二含量。

有些實施例中，血清轉胺酶及/或膽紅素之第二含量低於第一含量。有些實施例中，生物樣本為血漿或血清樣本。

有些實施例中，TURSO之投藥量為每天約1至約2克(含1克及2克)。有些實施例中，苯基丁酸鈉之投藥量為每天約3至約6克(含3克及6克)。有些實施例中，TURSO之投藥量為約1克，一天一次。有些實施例中，TURSO之投藥量為約1克，一天兩次。有些實施例中，苯基丁酸鈉之投藥量為約3克，一天一次。有些實施例中，苯基丁酸鈉之投藥量為約3克，一天兩次。

有些實施例中，組成物係經口或透過餵食管投予受試者。有些實施例中，受試者經診斷患有ALS。有些實施例中，受試者疑似患有ALS。有些實施例中，受試者為人類。

除非另有其他定義，否則本文所採用所有技術與科學術語均具有熟悉本發明相關技藝者咸了解的定義。雖然可採用本文所說明彼等類似或同等方法及材料來操作或試驗本發明，但下文中仍將說明合適的方法及材料。

咸了解，其等為了清楚說明而在分開的實施例內容中說明的本揭露某些特色，亦可在單一實施例中組合提供。反之，為了簡便而在單一實施例內容中說明的本揭露各種不同特色亦可分開提供或呈任何合適的次組合提供。所有與本揭露相關的實施例組合均明確涵括在本揭露中，並如同其各別及每一個組合係個別且明確揭示於本文中一般。另外，各種不同實施例及其元素的所有次組合亦明確涵括在本揭露中，並如同其各別及每一個此等次組合係個別且明確揭示於本文中一般。

本文所述及所有公告案、專利申請案、專利案、及其他參考文獻之內容均已以全文引用方式併入本文中。若有矛盾，則以本說明書(包括定義)為準。另外，材料、方法及實例僅供例示，無意加以限制。本發明其他特色及優點將可從下文詳細說明及申請專利範圍中了解。

本申請者已發現，膽汁酸(例如：牛磺二醇 (TURSO))與苯基丁酸鹽化合物(例如：苯基丁酸鈉)之組合可用於治療一或多種ALS症狀。本申請者亦意外發現，TURSO及其代謝物：熊去氧膽酸(ursodeoxycholic acid)及甘胺熊去氧膽酸(glycoursodeoxycholic acid)為BSEP之抑制劑。另外，苯基乙酸係苯基丁酸鈉之代謝物，亦驚人地發現可抑制BSEP。當BSEP之抑制劑與包含膽汁酸及苯基丁酸鹽化合物之組成物同時投藥時，藥物-藥物交互作用會使肝中接合的膽鹽累積惡化，造成不良事件。因此，本揭露提供一種為亦正接受BSEP抑制劑之受試者治療至少一種ALS症狀之方法。

本揭露提供一種治療受試者中至少一種ALS症狀之方法，或對患有一或多種ALS症狀之受試者投予TURSO及苯基丁酸鈉之方法，該方法包括(a)對已接受第一劑量BSEP抑制劑之受試者投予有效量之組成物，組成物包含約1克TURSO與約3克苯基丁酸鈉，(b)在來自受試者之第一個生物樣本中測定或已測定血清轉胺酶及/或膽紅素的第一含量，及(c)對該受試者投予第二劑量BSEP抑制劑，其中第二劑量低於第一劑量。

若提供一個數值範圍時，除非本文中另有其他指示，否則咸了解該範圍上限與下限之間每一個中間數值，直到下限值的十分之一單位及該所述範圍內任何其他所述數值及中間數值均涵括在本揭露中。針對所述範圍內任何明確排除的限值，此等較小範圍的上限值及下限值可分別獨立包括在較小範圍內，且亦涵括在本揭露中。若所述及範圍包括一或兩個限值時，排除彼等已包括在內的一或兩個限值的範圍亦包括在本揭露中。

本文中在某些範圍的數值前面加上術語「約」。本文採用術語「約」在字面上係支持後續的確實數字及接近或近似該術語後面的數字。在判斷數字是否接近或近似明確指明的數字時，本文內容所呈現該接近或近似的未指明數字可能為提供實質上等同該明確指明的數字。

除非另有其他定義，否則本文所採用所有技藝名詞、註釋、及其他科學名詞或術語均意味具有彼等熟悉本申請案相關技藝者習知之定義。有些例子中，本文中為了釐清及/或方便參考而為已習知意義之術語加以定義，且本文所涵括的此等定義不必要構成代表其與相關技藝習知定義之實質差異。 I. 肌肉萎縮性脊髓側索硬化症 (ALS)

術語「肌肉萎縮性脊髓側索硬化症」與「ALS」在本文中可交換使用，且包括相關技藝已知之所有ALS類別，包括(但不限於)：典型ALS(例如：同時影響上及下運動神經元之ALS)、原發性側索硬化症(Primary Lateral Sclerosis)(PLS，例如：彼等僅影響上運動神經元)、進行性延髓性癱瘓(Progressive Bulbar Palsy)(PBP或延髓發病型(Bulbar Onset)，一種通常從吞嚥、咀嚼、及說話困難開始的ALS型)及進行性肌肉萎縮(Progressive Muscular Atrophy)(PMA，通常僅影響下運動神經元)。該術語包括偶發性及家族性(遺傳性) ALS、依任何速率演進的ALS(例如：快速、不慢或慢慢演進)、及任何階段的ALS(例如：發病前、發病中、及晚期的ALS)。

本文所說明方法中之受試者可能出現一或多種與ALS相關之症狀，或已經診斷患有ALS。有些實施例中，受試者可能疑似患有ALS，及/或處於發展出ALS之風險。

本文所說明方法中之受試者可能出現一或多種與良性肌束顫動症候群(benign fasciculation syndrome)(BFS)或痙攣-肌束顫動症候群(cramp-fasciculation syndrome)(CFS)相關之症狀。

本文所說明任何方法之有些實施例可以進一步包括判斷受試者患有ALS或處於發展出ALS之風險、診斷受試者患有ALS或處於發展出ALS之風險、或選擇患有ALS或處於發展出ALS之風險之受試者。同樣地，本文所說明任何方法之有些實施例可以進一步包括判斷受試者患有良性肌束顫動症候群或痙攣肌束顫動症候群或處於發展出良性肌束顫動症候群或痙攣肌束顫動症候群之風險、診斷受試者患有BFS或CFS或處於發展出BFS或CFS之風險、或選擇患有BFS或CFS或處於發展出BFS或CFS之風險之受試者。

本文所說明任何方法之有些實施例中，受試者出現一或多種ALS症狀約24個月或更短(例如：約23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1個月、或1週或更短)。有些實施例中，受試者出現一或多種ALS症狀約36個月或更短(例如：約35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、或25個月或更短)。

受試者所展現ALS症狀之程度級數及型態可以依身體最先受損的運動神經元及造成身體最先受損的肌肉而定。例如：從延髓發病、從肢體發病、或從呼吸發病之ALS可能呈現類似或不同症狀。通常，ALS症狀可包括肌肉無力或患部肌肉之萎縮(例如：影響上半身、下半身、及/或言語)、肌肉肌束顫動(抽搐)、痙攣、或僵直。早期ALS症狀可能包括彼等出現臂或腿部的症狀、無法清楚說話、或吞噬困難(例如：從延髓發病之ALS)。其他症狀包括喪失舌頭運動力、呼吸困難、通氣困難或肺功能異常、咀嚼困難、及/或行走困難(例如：造成踉蹌)。受試者可能的ALS初始症狀可能出現呼吸肌肉無力。此等受試者的預後可能極差，有些例子從診斷起的中值存活時間為約兩個月。有些受試者中，可利用呼吸肌肉無力的發病時間作為預後因素。

ALS症狀亦可依退化的神經元系統部份來分類，亦即上運動神經元或下運動神經元。下運動神經元退化的徵兆為例如：在一或多個延髓、頸椎、胸椎、及/或腰薦椎區域出現無力或萎縮。上運動神經元退化可包括提高肌腱反射、痙攣、假性延髓症狀(pseudo bulbar features)、霍夫曼氏反射(Hoffmann reflex)、蹠伸張反應、及誇張反射(過度反射)，包括過度反應作嘔反射。神經元退化或肌肉無力的演進係該疾病的特徵。因此本揭露有些實施例提供一種緩解至少一種下運動神經元退化症狀、至少一種上運動神經元退化症狀、或至少一種分別來自下運動神經元退化及上運動神經元退化之症狀之方法。本文所說明任何方法之有些實施例中，可依據來自受試者及/或該受試者家族成員的資訊來判斷症狀的發病。有些實施例中，從症狀發病至診斷的中值時間為約12個月。

有些例子中，受試者已經診斷患有ALS。例如：受試者可能已經診斷罹患ALS約24個月或更短(例如：約23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、或1個月或更短)。例如：受試者可能已經診斷罹患ALS一週或更短，或在接受投予本揭示治療的同一天診斷。受試者可能已經診斷罹患ALS超過約24個月(例如：超過約28、32、36、40、44、48、52、56、60、64、68、72、76、或80個月)。診斷ALS之方法係相關技藝習知。例如：可以依據臨床病史、家族病史、身體或神經檢查(例如：下運動神經元或上運動神經元退化的徵兆)來診斷受試者。可以例如：藉由健康照護專家來證實或判定該受試者患有ALS。診斷過程可以包括多個部份。例如：若從受試者取得樣本作為診斷的一部份時，則第一部份可從受試者取得樣本，及第二部份可以檢驗該樣本。本文所說明任何人類受試者之有些實施例中，該受試者係經過執業醫師(例如：全科醫師)診斷、選擇、或轉介。

有些實施例中，受試者符合可能或確診ALS之EI愛斯科里奧標準(El Escorial criteria)，亦即受試者出現： 1. 經過臨床、電生理或神經病理檢查，出現下運動神經元(LMN)退化徵兆； 2. 經過臨床檢查，出現上運動神經元(UMN)退化徵兆；及 3.一個區域內的徵兆進行性擴散或擴散至其他區域，但沒有出現： 可能解釋LMN及/或UMN退化徵兆的其他疾病過程之電生理證據；及 可能解釋所觀察到的臨床與電生理徵兆的其他疾病過程之神經影像證據。

依據EI愛斯科里奧標準，在包括中樞神經系統的腦幹、頸椎、胸椎、及腰薦椎的四個區域評估LMN與UMN退化徵兆。可能判斷受試者屬下以下四大類別： A. 臨床上確診ALS，其單獨依據三個區域出現UMN及LMN徵兆的臨床證據來界定。 B. 臨床上可能ALS，其單獨依據至少兩個區域出現UMN及LMN徵兆及其中有些UMN徵兆必需要從吻部(rostral)至(超出)LMN的臨床證據來界定。 C. 臨床上可能ALS– 實驗室支持，其在適當採用神經影像及臨床實驗程序，在排除其他肇因下，當UMN及LMN功能障礙的臨床徵兆出現在僅一個區域時，或當單獨UMN徵兆出現在一個區域，及由EMG標準界定之LMN徵兆出現在至少兩個肢體上時來界定。 D. 臨床上可能ALS，其在當UMN及LMN功能障礙之臨床徵兆共同出現在僅一個區域或在兩個或更多個區域發現單獨UMN徵兆時；或在UMN徵兆吻部發現LMN徵兆且為臨床上可能-實驗室支持的診斷來界定。

有些實施例中，受試者患有臨床上確診ALS(例如：依據EI愛斯科里奧標準)。

可以利用修訂版之肌肉萎縮性脊髓側索硬化症功能評量表(Revised Amyotrophic Lateral Sclerosis Functional Rating Scale)(ALSFRS-R)評估及/或診斷受試者。ALSFRS-R為一種常用於判斷受試者在與ALS相關的12項功能活動上的能力及獨立性評估的量表(0至4級)。由診斷時計算的ALSFRS-R得分與一段時間的得分比較，來判斷演進速度。ALSFRS-R得分的變化會與隨時間的強度變化呈相關性，且會與生活品質量度及預估存活期相關。ALSFRS-R證實其為線性平均斜率，可用為預後指標(參見例如：Berry等人，Amyotroph Lateral Scler Frontotemporal Degener 15：1–8, 2014； Traynor等人，Neurology 63：1933–1935, 2004；Simon等人，Ann Neurol 76:643–657, 2014及Moore等人，Amyotroph Lateral Scler Other Motor Neuron Disord 4:42, 2003)。

在ALSFRS-R中，分別評估由頸椎、軀幹(trunk)、腰薦、及呼吸肌肉所介導之3項功能。每一項均從0至4評分，4分表示未涉及疾病，及0分表示涉及程度最大。項目得分加總後得到總得分。總得分表示ALS的影響，例舉分類如下： ＞40 (最小至輕度)；39-30 (輕度至中度)；＜ 30 (中度至重度)；＜ 20 (末期疾病)。

例如：受試者具有之ALSFRS-R得分(例如：基線ALSFRS-R得分)為40或更高(例如：至少41、42、43、44、45、46、47、或48)、30與39之間，含(例如：31、32、33、34、35、36、37、或38)、或30或更低(例如：21、22、23、24、25、26、27、28、或29)。本文所說明任何方法之有些實施例中，受試者具有之ALSFRS-R得分(例如：基線ALSFRS-R得分)為40或更低(例如：39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10或更低)。有些實施例中，受試者具有之ALSFRS-R得分(例如：基線ALSFRS-R得分)為20或更低 (例如：19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5或更低)。

由於ALS為進行性疾病，因此所有患者通常會隨時間演進。然而，受試者之間的演進速度有很大變異程度，因為有些受試者在幾個月內死亡或需要呼吸支持，而其他受試者卻有相對延長的存活期。本文所說明受試者可能具有快速演進的ALS或緩慢演進的ALS。患有ALS之受試者可藉由每個月的ALSFRS-R得分變化來量測功能下降速度。例如：每個月的得分可能下降約1.02 (±2.3)分。

預測患者演進的一項指標為患者過去的疾病演進速率(ΔFS)，其計算法為：ΔFS = (48 – 評估當時的ALSFRS-R得分)/從發病至評估當時的時間期(以月計)。ΔFS得分代表從症狀發病開始每個月減少的ALSFRS-R分數，且可成為患有ALS之受試者的演進及/或存活的顯著預測指標(參見例如：Labra等人，J Neurol Neurosurg Psychiatry 87:628–632, 2016，及Kimura等人，Neurology 66:265-267, 2006)。受試者具有的疾病演進速率(ΔFS)可能為約0.50或更低(例如：約0.45、0.40、0.35、0.30、0.25、0.20、0.15、或0.10或更低)；約0.50與約1.20之間，含(例如：約0.55、0.60、0.65、0.70、0.75、0.80、0.85、0.90、0.95、1.00、1.05、1.10、或1.15)；或約1.20或更高(例如：約1.25、1.30、1.35、1.40、1.45、1.50、1.55、1.60、1.75、1.80、1.85、1.90、1.95、或2.00或更高)。本文所說明任何方法之有些實施例中，受試者具有之ALS疾病演進速率(ΔFS)可為約0.50或更高(例如：約0.55、0.60、0.65、0.70、0.75、0.80、0.85、0.90、0.95、1.00、1.05、1.10、1.15、1.20、1.25、1.30、1.35、1.40、1.45、1.50、1.55、1.60、1.75、1.80、1.85、1.90、1.95、或2.00或更高)。然而，應注意ΔFS得分為患者演進的預測指標，在評估中可能高估或低估患者的演進。

有些實施例中，從初次評估開始，受試者歷經3至12個月的ALSFRS-R分數平均每個月減少約0.8至約2(例如：約0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、或1.9)。有些實施例中，從初次評估開始，受試者歷經3至12個月的ALSFRS-R分數平均每個月減少超過約1.2。從初次評估開始，受試者歷經3至12個月的ALSFRS-R分數可能減少至少3分(例如：至少4、6、8、10、12、14、16、20、24、28、或32分)。有些實施例中，受試者歷經先前3至12個月的ALSFRS-R分數平均每個月減少約0.8至約2(例如：約0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、或1.9)。有些實施例中，受試者歷經先前3至12個月的ALSFRS-R分數平均每個月減少超過約1.2(例如：超過約1.5、1.8、2.0、2.5、或3)。

本文所說明任何方法之有些實施例中，可採用得自受試者之樣本中標記物之存在或含量進行ALS診斷或預後、或追蹤疾病活性及治療反應。合適樣本包括例如：細胞、組織、或體液(例如：血液、尿液、或腦脊髓液(CSF)樣本)。例如：可採用CSF及/或血液中磷酸化神經元絲重鏈次單位(pNF-H)或神經元絲輕鏈(NfL)作為ALS診斷、預後、或追蹤疾病活性或治療療效之生物標記物。pNF-H為神經元細胞骨架之主要組份，在神經元受損時釋入CSF及血流中。pNF-H之含量可能與軸突喪失程度及/或運動神經元功能障礙之負荷相關(參見例如：De Schaepdryver等人，Journal of Neurology, Neurosurgery & Psychiatry 89:367-373, 2018)。

患有ALS之受試者之CSF及/或血液中pNF-H濃度可能在早期疾病階段顯著提高。血漿、血清及/或CSF中較高pNF-H含量可能與較快的ALS演進(例如：ALSFRS-R較快減少)、及/或較短的存活期有關。延髓發病的ALS受試者血漿中pNF-H濃度可能高於彼等脊柱發病者。有些例子中，可採用神經元絲重鏈與輕鏈次單位之間相對表現程度的失衡進行ALS診斷、預後、或追蹤疾病演進。

檢測(例如：腦脊髓液、血漿、或血清中)pNF-H及NfL之方法係相關技藝習知，且包括(但不限於)：ELISA及Simoa分析法(參見例如：Shaw等人，Biochemical and Biophysical Research Communications 336：1268-1277, 2005；Ganesalingam等人，Amyotroph Lateral Scler Frontotemporal Degener 14(2)：146-9, 2013；De Schaepdryver等人，AnnALSof Clinical and Translational Neurology 6(10): 1971–1979, 2019；Wilke等人，Clin Chem Lab Med 57(10)：1556-1564, 2019；Poesen等人，Front Neurol 9：1167, 2018；Pawlitzki等人，Front. Neurol. 9：1037, 2018；Gille等人，Neuropathol Appl Neurobiol 45(3):291-304, 2019)。亦可採用商業化的pNF-H檢測分析法，諸如彼等由EnCor Biotechnology、BioVendor、及Millipore-EMD所開發者。亦可採用以Simoa技術為主之商業用NfL分析套組，諸如彼等由Quanterix生產者(參見例如：Thouvenot等人，European Journal of Neurology 27:251-257, 2020)。在血清或血漿中影響與疾病過程有關之pNF-H與NfL含量或其檢測之因素可能與彼等在CSF中影響的因素不同。CSF與血清中之神經元絲(例如：pNF-H及/或NfL)含量可能有相關性(參見例如：Wilke等人，Clin Chem Lab Med 57(10)：1556-1564, 2019)。

本文所說明受試者具有之CSF或血液pNF-H含量為約300 pg/mL或更高(例如：約350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1550、1600、1650、1700、1750、1800、1850、1900、1950、2000、2050、2100、2150、2200、2250、2300、2350、2400、2450、2500、2550、2600、2650、2700、2750、2800、2850、2900、3000、3200、3500、3800、或4000 pg/mL或更高)。有些實施例中，血清pNF-H含量可為約70至約1200 pg/mL (例如：約70至約1000、約70至約800、約80至約600、或約90至約400 pg/mL)。有些實施例中，CSF pNF-H含量可為約1000至約5000 pg/mL (例如：約1500至約4000、或約2000至約3000 pg/mL)。

受試者可能具有之CSF或血液NfL含量為約50 pg/mL或更高(例如：約60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、或250 pg/mL或更高)。有些實施例中，血清NfL含量可為約50至約300 pg/mL(例如：約50至約280、約50至約250、約50至約200、約50至約150、約50至約100、約100至約300、約100至約250、約100至約200、約100至約150、約150至約300、約150至約250、約150至約200、約200至約300、約200至約250、或約250至約300 pg/mL)。有些實施例中，CSF NfL含量可為約2000至約40,000 pg/mL (例如：約2000至約35,000、約2000至約30,000、約2000至約25,000、約2000至約20,000、約2000至約15,000、約2000至約10,000、約2000至約8000、約2000至約6000、約2000至約4000、約4000至約40,000、約4000至約35,000、約4000至約30,000、約4000至約25,000、約4000至約20,000、約4000至約15,000、約4000至約10,000、約4000至約8000、約4000至約6000、約6000至約40,000、約6000至約35,000、約6000至約30,000、約6000至約25,000、約6000至約20,000、約6000至約15,000、約6000至約10,000、約6000至約8000、約8000至約40,000、約8000至約35,000、約8000至約30,000、約8000至約25,000、約8000至約20,000、約8000至約15,000、約8000至約10,000、約10,000至約40,000、約10,000 至約35,000、約10,000至約30,000、約10,000 至約25,000、約10,000 至約20,000、約10,000至約15,000、約15,000至約40,000、約15,000至約35,000、約15,000 至約30,000、約15,000 至約25,000、約15,000至約20,000、約20,000至約40,000、約20,000至約35,000、約20,000至約30,000、約20,000至約25,000、約25,000至約40,000、約25,000 至約35,000、約25,000至約30,000、約30,000至約40,000、約30,000至約35,000、或約35,000至約40,000 pg/mL)。

本文考慮適用於ALS診斷、預後、及追蹤疾病演進之其他生物標記物包括(但不限於)：CSF之S100-β、胱蛋白C(cystatin C)、及幾丁三糖酶(chitotriosidase)(CHIT)含量(參見例如：Chen等人，BMC Neurol 16：173, 2016)。血清尿酸含量可以用為ALS預後之生物標記物(參見例如：Atassi等人，Neurology 83(19)：1719-1725, 2014)。Akt磷酸化亦可用為ALS預後之生物標記物(參見例如：WO2012/160563)。尿液中p75ECD及酮體含量可用為診斷ALS之生物標記物(參見例如：Shepheard等人，Neurology 88：1137-1143, 2017)。血清與尿液中肌酸酐含量亦可用為生物標記物。其他適用於ALS之血液、CSF、神經生理性及神經放射性生物標記物說明於例如：Turner等人，Lancet Neurol 8:94-109, 2009。本文所說明任何標記物均可用於診斷患有ALS之受試者，或判斷處於發展出ALS風險之受試者。

亦可依據遺傳分析來判定受試者罹患ALS或處於發展出ALS風險。與ALS相關之遺傳變異係相關技藝習知(參見例如：Taylor等人，Nature 539：197-206, 2016；Brown與Al-Chalabi N Engl J Med 377：162-72, 2017；及http://alsod.iop.kcl.ac.uk)。本文所說明受試者可以在與家族性及/或偶發性ALS相關之一或多個基因上帶有突變。與ALS相關之基因實例包括(但不限於)：ANG、TARDBP、VCP、VAPB、SQSTM1、DCTN1、FUS、UNC13A、ATXN2、HNRNPA1、CHCHD10、MOBP、C21ORF2、NEK1、TUBA4A、TBK1、MATR3、PFN1、UBQLN2、TAF15、OPTN、TDP-43、及DAO。與ALS相關之基因之其他說明可參見Therrien等人之Curr Neurol Neurosci Rep 16:59-71、2016；Peters等人之J Clin Invest 125:2548、2015；及Pottier等人之J Neurochem、138:Suppl 1:32-53、2016。與ALS相關之遺傳變異會影響受試者中ALS演進速率、所投予化合物在受試者中之藥物動力學、及/或所投予化合物對受試者之效力。

受試者可能在編碼CuZn-超氧化物歧化酶(SOD1)之基因上出現突變。該突變造成SOD1蛋白質更容易凝集，造成包含錯誤折疊之SOD1凝集物之細胞包涵體沉積(參見例如：Andersen等人，Nature Reviews Neurology 7:603-615、2011)。SOD1中超過100種不同突變與遺傳性ALS相關聯，其中許多種造成蛋白質中單一胺基酸取代。有些實施例中，SOD1突變為A4V(亦即以纈胺酸取代位置4之丙胺酸)。SOD1突變進一步說明於例如：Rosen等人，Hum. Mol. Genet. 3, 981-987, 1994；及Rosen等人，Nature 362:59-62, 1993。有些實施例中，受試者在C9ORF72基因上具有突變。C9ORF72基因中之重覆序列擴增為ALS之常見肇因，其造成C9ORF72之功能喪失及使涉及ALS之重覆序列產生毒性功能(參見例如：Balendra與Isaacs, Nature Reviews Neurology 14:544-558, 2018)。本文所說明方法包括在投予膽汁酸及苯基丁酸鹽化合物之前檢測受試者中SOD1突變及/或 C9ORF72突變。篩檢突變的方法係相關技藝習知。合適方法包括(但不限於)：基因定序。參見例如：Hou等人，Scientific Reports 6:32478, 2016；及Vajda等人，Neurology 88：1-9, 2017。

習此相關技藝者咸了解，某些因素可能影響所投予化合物對受試者之生體可用性及代謝性，並可因而隨之調整。此等因素包括(但不限於)：肝功能(例如：肝臟酵素含量)、腎功能、及膽囊功能(例如：離子吸收及分泌、膽固醇轉運蛋白質含量)。每位受試者對所投予化合物(例如：膽汁酸及苯基丁酸鹽化合物)之曝露程度有變異性，使化合物在接受治療之受試者中有不同之排泄程度及藥物動力學。本文所說明任何因素均可能影響受試者之藥物曝露程度。例如：化合物之清除率下降可提高藥物曝露量，而改善腎功能則可降低實際藥物曝露量。藥物曝露程度可能與受試者對所投予化合物之反應及治療結果呈相關性。

受試者的年齡可為例如：大於約18歲(例如：介於18-100、18-90、18-80、18-70、18-60、18-50、18-40、18-30、18-25、25-100、25-90、25-80、25-70、25-60、25-50、25-40、25-30、30-100、30-90、30-80、30-70、30-60、30-50、30-40、40-100、40-90、40-80、40-70、40-60、40-50、50-100、50-90、50-80、50-70、50-60、60-100、60-90、60-80、60-70、70-100、70-90、70-80、80-100、80-90、或90-100歲之間)。受試者可具有的BMI為約18.5-30 kg/m ²之間(例如：介於18.5-28、18.5-26、18.5-24、18.5-22、18.5-20、20-30、20-28、20-26、20-24、20-22、22-30、22-28、22-26、22-24、24-30、24-28、24-26、26-30、26-28、或28-30 kg/m ²之間)。本文所說明任何ALS相關基因出現突變或呈現本文所說明任何生物標記物時，可能表示受試者處於發展出ALS之風險。此等受試者可以針對預防及防治的目的接受本文所說明之方法治療。

有些實施例中，受試者具有良性肌束顫動症候群 (BFS)或痙攣-肌束顫動症候群(CFS)之一或多種症狀。BFS與CFS為周邊神經興奮過度病變，會導致肌束顫動、痙攣、疼痛、疲勞、肌肉僵直、及感覺異常。判定罹患此等病變之受試者之方法係相關技藝習知，諸如：採用臨床檢查及肌電圖。 II. 組成物

本揭露提供一種治療受試者中至少一種ALS症狀之方法，該方法包括對該受試者投予膽汁酸或其醫藥上可接受之鹽及苯基丁酸鹽化合物。有些實施例中，該方法包括對受試者投予包含TURSO與苯基丁酸鈉之組成物。 膽汁酸

本文所採用「膽汁酸」係指天然存在之界面活性劑，其具有一個衍生自膽烷酸(cholanic acid)的核心，經3α-羥基取代，可視需要亦經其他羥基取代，通常取代在固醇核心的C6、C7或C12位置。膽汁酸衍生物(例如：水溶性膽汁酸衍生物)及與胺接合之膽汁酸亦涵括在術語「膽汁酸」內。膽汁酸衍生物包括(但不限於)：在膽汁酸之羥基及羧酸根所附接之碳原子上具有其他官能基(包括(但不限於)：鹵素及胺基)所形成之衍生物。可溶性膽汁酸可包括由膽汁酸之游離酸型與HCl、磷酸、檸檬酸、乙酸、氨或精胺酸其中之一組合成之水性製劑。合適膽汁酸包括(但不限於)：牛磺二醇 (TURSO)、熊去氧膽酸(ursodeoxycholic acid)(UDCA)、鵝去氧膽酸(chenodeoxycholic acid)(亦稱為「鵝二醇(chenodiol)」或「鵝酸(chenic acid)」)、膽酸、豬去氧膽酸(hyodeoxycholic acid)、去氧膽酸、7-氧代石膽酸、石膽酸、碘去氧膽酸、離膽酸(iocholic acid)、牛磺鵝去氧膽酸(taurochenodeoxycholic acid)、牛磺去氧膽酸(taurodeoxycholic acid)、甘胺熊去氧膽酸(glycoursodeoxycholic acid)、牛磺膽酸、甘胺膽酸、或其類似物、衍生物、或前藥。

有些實施例中，本揭露之膽汁酸為親水性膽汁酸。親水性膽汁酸包括(但不限於)：TURSO、UDCA、鵝去氧膽酸、膽酸、豬去氧膽酸、石膽酸、及甘胺熊去氧膽酸。亦考慮本文所揭示任何膽汁酸之醫藥上可接受之鹽類或溶劑合物。有些實施例中，常用於形成本揭露膽汁酸之醫藥上可接受之鹽類之鹼類包括鹼金屬之氫氧化物，包括鈉、鉀、及鋰；鹼土金屬之氫氧化物，如：鈣及鎂；其他金屬之氫氧化物，如：鋁及鋅；氨、有機胺，如：未取代或經羥基取代之單-、二-、或三-烷基胺、二環己基胺；三丁基胺；吡啶；N-甲基、N-乙基胺；二乙基胺、三乙基胺；單-、雙-、或參-(2-OH-(C1-C6)-烷基胺)，如：N,N-二甲基-N-(2-羥乙基)胺或三-(2-羥乙基)胺；N-甲基-D-葡糖胺；嗎啉；硫代嗎啉；哌啶；吡咯啶；及胺基酸，如：精胺酸、離胺酸，及類似物。

術語「牛磺熊去氧膽酸」 (TUDCA)與「牛磺二醇」 (TURSO) 在本文中可交換使用。

本文所說明膽汁酸可為TURSO，如式 I 所示(所標記的碳係協助了解可進行取代之位置) ， 或其醫藥上可接受之鹽。

本文所說明膽汁酸可為UDCA，如式II 所示(所標記的碳係協助了解可進行取代之位置) ， 或其醫藥上可接受之鹽。

本揭露膽汁酸之衍生物可為生理上相關之膽汁酸衍生物。例如：TURSO或UDCA之化學式中位置3或7之氫上任何取代之組合、位置3或7上羥基之立體化學中之位移(shift)均適用於本組成物。

「膽汁酸」亦可為與胺基酸接合之膽汁酸。接合物中之胺基酸可為(但不限於)：牛磺酸、甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、甲硫胺酸、或羧甲基半胱胺酸(carbocysteine)。可與本揭露膽汁酸接合之其他胺基酸包括精胺酸、組胺酸、離胺酸、天冬胺酸、麩胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、半胱胺酸、脯胺酸、丙胺酸、纈胺酸、異白胺酸、白胺酸、苯基丙胺酸、酪胺酸、與色胺酸，及β-丙胺酸、與γ-胺基丁酸。一項此等膽汁酸實例為式III化合物： III， 其中 R 為-H或C ₁-C ₄烷基； R ₁為-CH ₂-SO ₃R ₃、CH ₂COOH、或CH ₂CH ₂COOH，及R ₂為-H； 或R ₁為-COOH，及R ₂為-CH ₂-CH ₂-CONH ₂、-CH ₂-CONH ₂、-CH ₂-CH ₂-SCH ₃、CH ₂CH ₂CH ₂NH(C=NH)NH ₂、CH ₂(咪唑基)、CH ₂CH ₂CH ₂CH ₂NH ₂、CH ₂COOH、CH ₂CH ₂COOH、CH ₂OH、CH(OH)CH ₃、CH ₂SH、吡咯啶-2-基、CH ₃、2-丙基、2-丁基、2-甲基丁基、CH ₂(苯基)、CH ₂(4-OH-苯基)、或-CH ₂-S-CH ₂-COOH；及 R ₃為-H或胺基酸之殘基，或其醫藥上可接受之類似物、衍生物、前藥、或其混合物。一項胺基酸實例為為鹼性胺基酸。胺基酸包括甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、甲硫胺酸、羧甲基半胱胺酸(carbocysteine)、精胺酸、組胺酸、離胺酸、天冬胺酸、麩胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、半胱胺酸、脯胺酸、丙胺酸、纈胺酸、異白胺酸、白胺酸、苯基丙胺酸、酪胺酸、與色胺酸，及β-丙胺酸、與γ-胺基丁酸。

本揭露膽汁酸之另一項實例為式IV化合物： IV 其中 R 為-H或C ₁-C ₄烷基； R ₁為-CH ₂-SO ₃R ₃，及R ₂為-H； 或R ₁為-COOH及R ₂為-CH ₂-CH ₂-CONH ₂、-CH ₂-CONH ₂、-CH ₂-CH ₂-SCH ₃、或-CH ₂-S-CH ₂-COOH；及 R ₃為-H或鹼性胺基酸之殘基，或其醫藥上可接受之類似物、衍生物、前藥，或其混合物。鹼性胺基酸實例包括離胺酸、組胺酸、及精胺酸。

有些實施例中，膽汁酸為TURSO。TURSO為兩親性膽汁酸，係UDCA之牛磺酸接合物型。TURSO透過進入粒線體膜中，減少Bax轉位至粒線體膜，降低粒線體通透性，及提高細胞之凋亡閥值，以回復粒線體的生物能量缺陷(Rodrigues等人，Biochemistry 42, 10: 3070-3080, 2003)。其用於治療膽固醇膽結石，其中通常需要長期治療(例如：1至2年)才可以完全解除。其已用於治療膽汁滯留型肝臟疾病，包括原發性肝硬化、兒科家族性肝內膽汁滯留、及因膽囊纖維化造成之原發性硬化性膽管炎及膽汁滯留症。TURSO 在受試者內之禁忌症為膽道感染、頻繁的膽絞痛、或無法吸收膽汁酸的受試者(例如：迴腸疾病或切除)。藥物交互作用可能包括與抑制膽汁酸吸收的物質，如：銷膽胺(cholestyramine)，及與提高消除膽汁中膽固醇之藥物(TURSO會減少膽源性膽固醇含量)。依據類似的生理化學特徵，TURSO與UDCA之間存在類似的藥物毒性與交互作用。使用TURSO時最常通報的不良反應(≥1%)為：腹部不適、腹部疼痛、下痢、噁心、搔癢、及起疹。其中有些搔癢病例及有限病例數的肝臟酵素升高。

有些實施例中，膽汁酸為UDCA。UDCA或熊二醇(ursodiol)已用於治療膽結石，其係由肝臟內因性產生及分泌牛磺酸(TURSO)或甘胺酸(GUDCA)接合物。接合牛磺酸會藉由提高其親水性而增加UDCA之溶解度。TURSO在主動運輸下被遠端迴腸吸收，因此在腸內的停留時間容易比被較近端迴腸吸收的UDCA更長。熊二醇療法未曾與肝損傷有關。肝臟酵素異常未曾與Actigall® (Ursodiol USP膠囊)療法有關，且Actigall®已顯示在肝臟疾病中降低肝臟酵素含量。然而，由特定臨床環境所指示，接受Actigall®之受試者應在療法開始時及之後量測SGOT (AST)與SGPT (ALT)。過去的研究顯示，膽汁酸螯合劑，如：銷膽胺與膽利泊(colestipol)可能降低熊二醇的吸收而干擾其作用。基於鋁之制酸劑已於活體外顯示會吸附膽汁酸，可預期其會依膽汁酸螯合劑的相同方式干擾熊二醇。雌激素、口服避孕藥、及克氯吩貝(clofibrate)(及可能其他降脂藥物)會增加肝臟膽固醇分泌，促進形成膽固醇膽結石，因此牴觸熊二醇的有效性。 苯基丁酸鹽化合物

本文所定義苯基丁酸鹽化合物包括呈游離酸之苯基丁酸鹽(一種低分子量芳香系羧酸) (4-苯基丁酸鹽(4-PBA)、4-苯基丁酸、或苯基丁酸)，及其醫藥上可接受之鹽類、共晶體、多形物、水合物、溶劑合物、接合物、衍生物或前藥。本文所說明苯基丁酸鹽化合物亦涵括4-PBA之類似物，包括(但不限於)：甘胺醯基三-(4-苯基丁酸酯)、苯基乙酸(其係PBA之活性代謝物)、2-(4-甲氧基苯氧基)乙酸(2-POAA-OMe)、2-(4-硝基苯氧基)乙酸(2-POAA-NO2)、及2-(2-萘基氧)乙酸(2-NOAA)，及其醫藥上可接受之鹽類。苯基丁酸鹽化合物亦涵括生理上相關之4-PBA物質，如(但不限於)：4-PBA之結構中任何氫被氘之取代。本文中考慮以其他HDAC2抑制劑替代苯基丁酸鹽化合物。

苯基丁酸鹽之生理上可接受之鹽類包括例如：鈉、鉀、鎂、或鈣鹽。其他鹽類實例包括銨、鋅、或鋰鹽，或苯基丁酸與諸如：離胺酸或精胺酸等有機胺之鹽類。

本文所說明任何方法之有些實施例中，苯基丁酸鹽化合物為苯基丁酸鈉。苯基丁酸鈉具有下式： 。

苯基丁酸鹽為一種泛-HDAC抑制劑，可以透過上調主要伴護蛋白調節物(master chaperone regulator) DJ-1及透過募集其他伴護蛋白來改善ER壓力(參見例如：Zhou等人，J Biol Chem. 286: 14941-14951, 2011與Suaud等人，JBC. 286:21239-21253, 2011)。大量增加產生伴護蛋白會降低典型ER壓力途徑的活化，並對錯誤折疊的蛋白質進行折疊，並已在包括ALS之G93A SOD1小鼠模式的活體內模式中顯示提高存活率(參見例如：Ryu, H等人，J Neurochem. 93：1087-1098, 2005)。

有些實施例中，膽汁酸(例如：TURSO)或其醫藥上可接受之鹽，與苯基丁酸鹽化合物(例如：苯基丁酸鈉)之組合當依特定比例(例如：本文所說明任何比例)投藥時，在治療與ALS相關之一或多種症狀上具有協同效應。該組合可以例如：藉由線性建模，在強力氧化衝擊模式(oxidative insult model)(H ₂O ₂-介導之毒性)中，透過同時抑制內質網壓力及粒線體壓力，在數學上協同性提高神經元活力(參見例如：美國專利案案號9,872,865及美國專利案案號10,251,896)。 調配物

本文所說明膽汁酸與苯基丁酸鹽化合物可以調配成醫藥組成物使用或用於醫藥組成物中。例如：本文所說明方法可包括投予有效量之包含TURSO與苯基丁酸鈉之組成物。本文所使用術語「有效量」係指在一段時間內的一或多種藥物的用量或濃度(包括急性或慢性投藥及定期或連續投藥)，其在投藥產生所計畫效力或生理性結果的背景下為有效量。組成物可包括約5%至約15% w/w (例如：約6%至約14%、約7%至約13 %、約8%至約12%、約8%至約11%、約9%至約10%、或約9.7% w/w)之TURSO及15%至約45% w/w (例如：約20%至約40%、約25%至約35%、約28%至約32%、或約29%至約30%，例如：約29.2% w/w)之苯基丁酸鈉。有些實施例中，組成物包括約9.7% w/w TURSO與29.2% w/w 苯基丁酸鈉。

苯基丁酸鈉及TURSO可依約1：1至約4：1之間之重量比(例如：約2：1或約3：1)存在於組成物中。有些實施例中，苯基丁酸鈉與TURSO之間比例為約3：1。

本文所說明組成物可包括任何醫藥上可接受之載劑、佐劑、及/或媒劑。術語「醫藥上可接受之載劑或佐劑」係指可與本文所揭示化合物一起投予患者之載劑或佐劑，其等當依足以遞送醫療量化合物之劑量投予時，不會破壞其醫藥活性且無毒性。本文採用的用語「醫藥上可接受之載劑」包括與醫藥投藥法相容之生理鹽水、溶劑、勻散介質、包衣、抗細菌劑與抗真菌劑、等滲劑與延遲吸收劑，及類似物。醫藥組成物可包含任何常用之無毒性醫藥上可接受之載劑、佐劑或媒劑。有些例子中，可以使用醫藥上可接受之酸、鹼或緩衝劑調整調配物之pH值，以加強所調配化合物或其遞送型式之穩定性。

本揭露組成物可包括約8%至約24%w/w之葡聚糖結合劑(dextrates) (例如：約9%至約23%、約10%至約22%、約10%至約20%、約11%至約21%、約12%至約20%、約13%至約19%、約14%至約18%、約14%至約17%、約15%至約16%、或約15.6%w/w之葡聚糖結合劑)。本文考慮使用無水及水合兩種葡聚糖結合劑。本揭露葡聚糖結合劑可包括從澱粉之控制酵素水解產生之醣類混合物。任何本文所說明組成物之有些實施例包括水合葡聚糖結合劑(例如：NF級，得自JRS Pharma、Colonial Scientific、或Quadra)。

本揭露組成物可包括約1%至約6% w/w之糖醇(例如：約2%至約5%、約3%至約4%、或約3.9% w/w之糖醇)。糖醇可衍生自糖類，且包含附接在每一個碳原子上之一個羥基(-OH)。雙糖及單糖均可形成糖醇。糖醇可為天然物或由糖經過氫化產生。糖醇實例包括(但不限於)：山梨糖醇、木糖醇、與甘露糖醇。有些實施例中，組成物包含約1%至約6%之w/w (例如：約2%至約5%、約3%至約4%、或約3.9% w/w)之山梨糖醇。

本揭露組成物可包括約22%至約35% w/w之麥芽糊精(例如：約22%至約33%、約24%至約31%、約25%至約32%、約26%至約30%、或約28%至約29% w/w，例如：約28.3% w/w之麥芽糊精)。麥芽糊精當溶解成溶液時，可形成撓性螺旋，可以捕捉活性成份(例如：本文所說明任何苯基丁酸鹽化合物及膽汁酸)，藉以遮蔽活性成份的味道。本文考慮使用從任何合適來源產生的麥芽糊精，包括(但不限於)：豌豆、米、木薯、玉米、及馬鈴薯。有些實施例中，麥芽糊精為豌豆麥芽糊精。有些實施例中，組成物包括約28.3% w/w豌豆麥芽糊精。例如：可使用得自Roquette之豌豆麥芽糊精(KLEPTOSE® LINECAPS)。

本文所說明組成物可以進一步包括糖替代物(例如：蔗糖素(sucralose))。例如：組成物可包括約0.5%至約5% w/w蔗糖素 (例如：約1%至約4%、約1%至約3%、或約1%至約2%，例如：約1.9% w/w蔗糖素)。本文考慮的其他糖替代物包括(但不限於)：阿斯巴甜、紐甜(neotame)、乙醯磺胺酸鉀(acesulfame potassium)、糖精、及愛得萬甜(advantame)。

有些實施例中，組成物包括一或多種調味劑。組成物可包括約2%至約15% w/w調味劑 (例如：約3%至約13%、約3%至約12%、約4%至約9%、約5%至約10%、或約5%至約8%，例如：約7.3% w/w)。調味劑可包括提供另一種物質風味，或藉由影響其口味來改變組成物特性之物質。調味劑可在不影響物理及化學穩定性下用於遮蔽不宜人的口味，並可依據所納入藥物的口味來選擇。合適調味劑包括(但不限於)：天然調味物質、人工調味物質、及模擬調味物。亦可使用摻合的調味劑。例如：本文所說明組成物可包括兩種或更多種(例如：2、3、4、5種或更多種)調味劑。調味劑可於水中溶解且穩定。可依據要測試的口味來選擇合適的調味劑。例如：可以分開添加多種不同調味劑至組成物中，以進行口味測試。調味劑實例包括任何水果風味粉末(例如：桃、草莓、芒果、柳橙、蘋果、葡萄、覆盆子、櫻桃或混合莓果風味粉末)。本文所說明組成物可包括約0.5%至約1.5% w/w (例如：約1% w/w)之混合莓果風味粉末及/或約5%至約7% w/w (例如：約6.3% w/w)之遮蔽風味物。合適之遮蔽風味物可得自例如：芬美意(Firmenich)。

本文所說明組成物可以進一步包括二氧化矽(或矽石)。添加矽石至組成物中可以防止或減少組成物之組份凝集。矽石可以作為抗結塊劑、吸附劑、崩解劑、或助滑劑。有些實施例中，本文所說明組成物包括約0.1%至約2% w/w多孔矽石 (例如：約0.3%至約1.5%、約0.5%至約1.2%、或約0.8%至約1%，例如：0.9% w/w)。在相對濕度約20%或更高(例如：約25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、或95%或更高)下，多孔矽石可比氣相式矽石具有更高的H ₂O吸收能力及/或更高的孔隙率。在相對濕度約50%下，多孔矽石可具有之H ₂O 吸收能力為約5%至約40%(例如：約20%至約40%、或約30%至約40%)重量比。在相對濕度約20%或更高(例如：約30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更高)下，多孔矽石比氣相式矽石具有更高的孔隙率。有些實施例中，多孔矽石具有之平均粒度為約2 µm至約10 µm (例如：約3 µm至約9 µm、約4 µm至約8 µm、約5 µm至約8 µm、或約7.5 µm)。有些實施例中，多孔矽石具有之平均孔體積為約0.1 cc/gm至約2.0 cc/gm (例如：約0.1 cc/gm至約1.5 cc/gm、約0.1 cc/gm至約1 cc/gm、約0.2 cc/gm至約0.8 cc/gm、約0.3 cc/gm至約0.6 cc/gm、或約0.4 cc/gm)。有些實施例中，多孔矽石之容積密度為約50 g/L至約700 g/L (例如：約100 g/L至約600 g/L、約200 g/L至約600 g/L、約400 g/L至約600 g/L、約500 g/L至約600 g/L、約540 g/L至約580 g/L、或約560 g/L)。有些實施例中，本文所說明組成物包括約0.05%至約2% w/w (例如：本文所說明此範圍內之任何次範圍)之Syloid® 63FP (WR Grace)。

本文所說明組成物可進一步包括一或多種緩衝劑。例如：組成物可包括約0.5%至約5% w/w緩衝劑(例如：約1%至約4% w/w、約1.5%至約3.5% w/w、或約2%至約3% w/w，例如：約2.7% w/w緩衝劑)。緩衝劑可包括弱酸或鹼，其在添加另一種酸或鹼之後維持組成物之酸度或pH在接近所選的數值。合適之緩衝劑係相關技藝習知者。有些實施例中，本文所提供組成物中之緩衝劑為磷酸鹽，如：磷酸鈉(例如：二鹼價磷酸鈉無水物)。例如：組成物可包括約2.7% w/w二鹼價磷酸鈉。

組成物亦可包括一或多種潤滑劑。例如：組成物可包括約0.05%至約1% w/w 潤滑劑 (例如：約0.1%至約0.9%、約0.2%至約0.8 %、約0.3%至約0.7%、或約0.4%至約0.6%，例如：約0.5% w/w 潤滑劑)。潤滑劑實例包括(但不限於)：硬脂基富馬酸鈉、硬脂酸鎂、硬脂酸、硬脂酸金屬鹽、滑石、蠟類及高熔點甘油酯、膠體矽石、聚乙二醇、烷基硫酸酯、山萮酸甘油酯、及氫化油。其他潤滑劑係相關技藝習知。有些實施例中，組成物包括約0.05%至約1% w/w (例如：本文所說明此範圍內任何次範圍)之硬脂基富馬酸鈉。例如：組成物可包括約0.5% w/w硬脂基富馬酸鈉。

有些實施例中，組成物包括約29.2% w/w 苯基丁酸鈉、約9.7% w/w TURSO、約15.6% w/w葡聚糖結合劑、約3.9% w/w山梨糖醇、約1.9% w/w蔗糖素、約28.3% w/w麥芽糊精、約7.3% w/w調味劑、約0.9% w/w二氧化矽、約2.7% w/w磷酸鈉(例如：二鹼價磷酸鈉)、及約0.5% w/w硬脂基富馬酸鈉。

組成物可包括約3000 mg 苯基丁酸鈉、約1000 mg TURSO、約1600 mg葡聚糖結合劑、約400 mg山梨糖醇、約200 mg蔗糖素、約97.2 mg二氧化矽、約2916 mg麥芽糊精、約746 mg調味劑 (例如：約102 mg 混合莓果風味物及約644 mg遮蔽風味物)、約280 mg磷酸鈉(例如：二鹼價磷酸鈉)、及約48.6 mg硬脂基富馬酸鈉。

組成物中亦可包括額外的合適甜味劑或掩味劑，諸如(但不限於)：木糖、核糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖、果糖、右旋糖、蔗糖、麥芽糖、甜菊糖苷、部份水解澱粉、及固態玉米糖漿。本文中涵括水溶性人工甜味劑，如：可溶性糖精鹽類(例如：糖精鈉或鈣鹽)、環己烷胺基磺酸鹽(cyclamate)鹽、乙醯磺胺酸鉀(acesulfam potassium)(acesulfame K)、及基於游離酸型糖精與阿斯巴甜(aspartame)之甜味劑，如：L-天冬胺醯基-苯基丙胺酸甲酯、Alitame®或Neotame®。甜味劑或掩味劑之用量可以隨特定最終組成物所選擇甜味劑或掩味劑之需要量來變化。

除了彼等上述以外，亦涵括醫藥上可接受之結合劑。其實例包括纖維素衍生物，包括微晶纖維素、低取代度羥丙基纖維素(例如：LH 22、LH 21、LH 20、LH 32、LH 31、LH30)；澱粉，包括馬鈴薯澱粉；交聯羧甲基纖維素鈉(croscarmellose sodium，亦即交聯羧甲基纖維素鈉鹽；例如：Ac-Di-Sol®)；藻酸或藻酸鹽；不可溶性聚乙烯吡咯烷酮(例如：Polyvidon® CL、Polyvidon® CL-M、Kollidon® CL、Polyplasdone® XL、Polyplasdone® XL-10)；及羧甲基鈉澱粉(例如：Primogel®與Explotab®)。

可以納入額外填料、稀釋劑或結合劑，如：多元醇、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、Erythritol®、Tagatose®、乳糖(例如：噴霧乾燥乳糖、α-乳糖、β-乳糖、Tabletose®、各種不同等級Pharmatose®、Microtose或Fast-Floc®)、微晶纖維素(例如：各種不同等級Avicel®，如：Avicel® PH101、Avicel® PH102或Avicel® PH105、Elcema® P100、Emcocel®、Vivacel®、Ming Tai®與Solka-Floc®)、羥丙基纖維素、L-羥丙基纖維素(低取代度) (例如：L-HPC-CH31、L-HPC-LH11、LH 22、LH 21、LH 20、LH 32、LH 31、LH30)、糊精、麥芽糊精(例如：Lodex® 5與Lodex® 10)、澱粉或改質澱粉(包括馬鈴薯澱粉、玉米澱粉與米澱粉)、氯化鈉、磷酸鈉、硫酸鈣、及碳酸鈣。

本文所說明組成物可調配或調適用於透過任何途徑(例如：由食品與藥物管理局(Food and Drug Administration，FDA)核准的途徑)投予受試者。例舉的方法說明於FDA的CDER Data Standards Manual，第004版(可從fda.give/cder/dsm/DRG/drg00301.html取得)。

醫藥組成物通常調配成與其計畫投藥途徑相容者。投藥途徑實例包括非經腸式(皮下、皮膚內(intracutaneous)、靜脈內、皮內(intradermal)、肌內、關節內、動脈內、胸骨內、鞘內、病灶內及顱內注射、或輸注技術)、經口(例如：吸入或通過餵食管)、穿皮式(局部表面)、穿黏膜式、及經直腸投藥。

醫藥組成物可呈供吸入及/或鼻投藥之溶液或粉末型式。有些實施例中，醫藥組成物係調配成填裝粉末的藥囊。合適粉末可包括彼等實質上可溶於水者。醫藥組成物可依據相關技藝習知技術，使用合適勻散劑或濕化劑(如，例如：Tween 80)及懸浮劑調配。無菌注射製劑亦可為含於無毒性非經腸式可接受之稀釋劑或溶劑中之無菌注射溶液或懸浮液，例如：呈含於1,3-丁二醇中之溶液。可使用之可接受之媒劑與溶劑為甘露糖醇、水、林格氏液(Ringer's solution)及等滲氯化鈉溶液。另外常使用無菌之不揮發性油作為溶劑或懸浮介質。針對此目的，任何溫和的不揮發性油均可使用，包括合成性單酸-或二酸甘油酯。脂肪酸，如：油酸及其甘油酯衍生物均適用於製造注射劑，亦可使用天然之醫藥上可接受之油類，如：橄欖油或蓖麻油，尤指其聚氧乙基化型。此等油溶液或懸浮液亦可包括長鏈醇稀釋劑或勻散劑、或羧甲基纖維素，或常用於調配醫藥上可接受之劑型(如：乳液及/或懸浮液)之類似勻散劑。其他常用界面活性劑，如：Tweens或Spans及/或常用於製造醫藥上可接受之固體、液體、或其他劑型之其他類似乳化劑或生物可用性加強劑亦可用於調配目的。

組成物可呈任何經口可接受劑型經口投予，包括(但不限於)：粉末、膠囊、錠劑、乳液、及水性懸浮液、勻散液、及溶液。以經口投予之粉末為例，粉末可在投藥前實質上先溶於水。以口服用之錠劑為例，常用之載劑包括乳糖及玉米澱粉。可以添加潤滑劑，如：硬脂酸鎂。呈膠囊型式經口投藥時，適用之稀釋劑包括乳糖及乾燥之玉米澱粉。當經口投予水性懸浮液及/或乳液時，活性成份可以懸浮或溶解於油相中，與乳化劑及/或懸浮劑組合。若需要時，可以添加某些甜味劑及/或調味劑及/或著色劑。

或者或另外，組成物可經鼻噴霧或吸入投藥。此等組成物可依據醫藥調配技藝習知之技術製備，且可於生理鹽水中，使用苯甲醇或其他合適防腐劑、加強生體可用率之吸收促進劑、氟碳化物、及/或相關技藝習知之其他溶解或勻散劑製成溶液。

有些實施例中，可以調配本文所揭示醫療組成物，於美國販售、輸入至美國、及/或從美國輸出。醫藥組成物可以連同投藥説明書一起包括在容器、包裝、或配送器中。有些實施例中，本發明提供包括膽汁酸與苯基丁酸鹽化合物之套組。該套組亦可包括供醫師及/或患者用之說明書、針筒、針頭、盒子、瓶子、小瓶，等等。 III. 治療方法

本申請者已發現，膽汁酸(例如：TURSO)與苯基丁酸鹽化合物(例如：苯基丁酸鈉)之組合可用於治療一或多種ALS症狀。本申請者已發現TURSO及其代謝物：熊去氧膽酸與甘胺熊去氧膽酸為BSEP之抑制劑。亦已驚人地發現，苯基乙酸(係苯基丁酸鈉之代謝物)會抑制BSEP。因此，當BSEP之抑制劑與包含膽汁酸及苯基丁酸鹽化合物之組成物同時投藥時，藥物-藥物交互作用會造成接合之膽鹽在肝臟中加重累積，導致不良效應。因此，當BSEP之抑制劑與包含例如：TURSO與苯基丁酸鈉之組成物 同時投予需要這兩種治療之受試者時，可以監測藥物-藥物交互作用之徵兆，並隨之調整BSEP抑制劑之劑量。例如：當BSEP抑制劑與包含TURSO及苯基丁酸鈉之組成物同時投予時，血清轉胺酶及膽紅素之含量會提高，表示肝臟毒性。監測血清轉胺酶及膽紅素，並調整BSEP抑制劑之劑量可因此防止或減少與藥物-藥物交互作用相關之不良效應。

因此，本揭露提供一種藉由調整BSEP抑制劑之劑量，為正接受BSEP抑制劑之受試者治療至少一種ALS症狀之方法。此等調整可提供類似的血漿中BSEP抑制劑濃度，其與沒有膽汁酸及苯基丁酸鹽化合物時所投予BSEP抑制劑之劑量一樣有效。

本申請者在本文中揭示一種為已接受第一劑量BSEP抑制劑之受試者治療至少一種ALS症狀之方法或對具有至少一種ALS症狀且已接受第一劑BSEP抑制劑之受試者投予TURSO及苯基丁酸鈉之方法，該方法包括對該受試者投予包含約1克TURSO及約3克苯基丁酸鈉之組成物，監測受試者對BSEP抑制劑之反應，及投予第二劑量BSEP抑制劑，其中第二劑量小於第一劑量。監測受試者對BSEP抑制劑之反應，其可包括在來自受試者之生物樣本中測定血清轉胺酶及/或膽紅素之第一含量，監測已知之不良事件、及/或與抑制BSEP相關之投藥過量症狀或副作用、或升高之血清轉胺酶含量或膽紅素含量。

本文所說明任何方法之有些實施例中，BSEP抑制劑之第一及/或第二劑量可依每天(每天一次、兩次、或三次)、每兩天一次、一週三次、或每週的劑量、或依有些其他基準的劑量。BSEP抑制劑之第二劑量可以比第一劑量低約1%至約95% (例如：約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、或90%)。有些例子中，第二劑量涉及每次投藥係投予相同量或類似量，但頻率低於第一劑量。有些例子中，停止投予BSEP抑制劑，亦即沒有第二劑量。

本文所說明任何方法之有些實施例中，該方法包括在來自受試者之第二個生物樣本中測定或已測定血清轉胺酶及/或膽紅素之第二含量之步驟。有些實施例中，第二含量低於第一含量。

本文所說明任何方法之有些實施例中，第一個生物樣本可以得自接受投予包含TURSO與苯基丁酸鹽之組成物後約1小時至約72小時(例如：約2、4、6、8、10、16、24、32、48、或56小時)之受試者。第二個生物樣本可以得自接受投予第二劑量BSEP抑制劑後約1小時至約72小時(例如：約2、4、6、8、10、16、24、32、48、或56小時)之受試者。

本文所說明任何方法之有些實施例中，該第一及/或第二個生物樣本可為血清、血漿、尿液、或唾液樣本。量測生物樣本中血清轉胺酶及/或膽紅素含量之方法係相關技藝習知者。 BSEP 抑制劑

轉運蛋白可以分成(i)屬於ATP-結合匣(ATP-binding cassette) (ABC)家族之外排轉運蛋白及(ii)屬於溶質載體(solute carrier)(SLC)家族之吸收轉運蛋白，其介導通過細胞膜之流入或雙向運動。外排轉運蛋白在穿越頂端細胞膜(亦即血液側)時，將化合物泵壓回血液中，且亦將細胞外的化合物泵壓至腦中底端側上。

膽汁的形成為哺乳肝臟的關鍵功能之一。其涉及膽汁酸之載體分泌(vectorial secretion)及其他親膽汁性化合物通過肝細胞，從血竇血漿分泌至膽小管。膽汁酸或膽鹽藉此在膽汁中濃縮比在血漿中超過500倍。此濃縮過程依賴ATP，主要由膽小管膽鹽輸出幫浦(BSEP)驅動。BSEP為ATP結合匣(ABC)轉運蛋白超級家族之B-家族成員之一，分類為ABCB11。

抑制BSEP會造成減少膽鹽分泌，降低膽汁流動，係一種會造成膽汁滯留症的過程。膽汁滯留症為一種肝臟疾病。彼等膽汁滯留症患者會經歷：腹部疼痛、脹氣、脂肪糞便、噁心、或淺色糞便、沒有食慾或萎靡、深色尿液、生長遲緩、搔癢、或黃色皮膚及眼睛、膽紅素含量異常、及/或肝臟酵素含量異常。

許多已知藥物為BSEP抑制劑。此等藥物可能在感受性人類中造成後天性膽汁滯留，在停止藥物後迅速回復。BSEP抑制劑實例包括(但不限於)：環孢素、格列苯脲(glybenclamide)、雷福黴素(rifamycin)、波生坦(bosentan)、曲格列酮(troglitazone)、氟伐他汀(fluvastatin)、酮康唑(ketoconazole)。

如上述，本申請者已發現TURSO及其代謝物：熊去氧膽酸及甘胺熊去氧膽酸，為BSEP之抑制劑。亦已驚人地發現苯基乙酸(係苯基丁酸鈉之代謝物)可抑制BSEP。同時使用BSEP抑制劑與包含膽汁酸及苯基丁酸鹽化合物之組成物會造成藥物-藥物交互作用，導致接合之膽鹽在肝臟中加重累積，導致不良事件，例如：血清轉胺酶及膽紅素之含量會提高，造成毒性效應。

因此，本文有些態樣提供治療受試者中至少一種ALS症狀之方法，包括(a) 對已接受第一劑量BSEP抑制劑之受試者投予有效量之組成物，組成物包含約1克TURSO與約3克苯基丁酸鈉；(b)在來自受試者之第一個生物樣本中測定或已測定血清轉胺酶及/或膽紅素的第一含量；及(c)對該受試者投予第二劑量BSEP抑制劑，其中第二劑量低於第一劑量。該方法可以進一步包括步驟(d)，在來自受試者之第二個生物樣本中測定或已測定血清轉胺酶及/或膽紅素之第二含量。

有些實施例中，BSEP抑制劑為環孢素。環孢素(亦稱為環孢素 A)可用在同種異體腎臟、肝臟及心臟移植時預防器官排斥，或防止骨髓移植排斥。環孢素係用於治療患有嚴重活性類風濕關節炎(RA)、或嚴重頑固性斑塊性乾癬之患者。環孢素之眼科用溶液係用在罹患結膜乾燥症之患者增加產生淚液。另外，環孢素已核准用於治療因腎小球疾病引起之類固醇依賴性及類固醇抗性腎病症候群，其可包括最小變化的腎病、局部性與節段性腎小球硬化症、或膜狀腎絲球腎炎。環孢素亦常用於治療各種不同自體免疫與發炎病症，如：異位性皮膚炎、水疱性病症、潰瘍性大腸炎、幼年型類風濕關節炎、葡萄膜炎、結締組織疾病、及特發性血小板減少性紫斑。受試者可以接受環孢素之第一劑量約0.5至約15 mg/kg/天體重(例如：約0.5至約5 mg/kg/天、約1至約4 mg/kg/天、約2.5 mg/kg/天、或約12至約15 mg/kg/天)。環孢素之第二劑量可以比第一劑量低約0.1至約14 mg/kg/天 (例如：約0.5至約2.5 mg/kg/天、約1至約5 mg/kg/天)。

另外或改在來自受試者的生物樣本中測定BSEP抑制劑之第一及/或第二含量，本文亦考慮監測受試者對第一劑量BSEP抑制劑之反應的其他方法。例如：可監測與BSEP抑制劑相關之不良事件、副作用、或投藥過量症狀。例如：有些實施例中，監測受試者之膽汁滯留。如上述，膽汁滯留症症狀包括：腹部疼痛、脹氣、脂肪糞便、噁心、或淺色糞便、沒有食慾或萎靡、深色尿液、生長遲緩、搔癢、或黃色皮膚及眼睛。環孢素投藥過量症狀可包括肝毒性及腎毒性。 量測肝功能

藥物代謝作用會影響肝功能。肝功能試驗係檢測血液中某些酵素及蛋白質之含量。高於或低於正常值的含量即表示肝臟有問題。例如：檢測以下一或多種含量：丙胺酸轉胺酶、天冬胺酸轉胺酶、鹼性磷酸鹽、白蛋白及總蛋白質、膽紅素、γ-麩胺醯基轉肽酶、L-乳酸脫氫酶及凝血酶原時間(量測凝血因子)。        血清轉胺酶

血清轉胺酶包括丙胺酸轉胺酶(ALT)及天冬胺酸轉胺酶(AST)。血清轉胺酶(亦稱為胺基轉移酶)為一群會藉由轉移胺基來催化胺基酸與含氧酸之間轉換之酵素。ALT與AST為肝細胞損傷或壞死時最可靠的兩種標記物。其等含量會在多種不同肝臟病變中升高。

ALT與AST之正常範圍會隨性別、年齡、及實驗室變化。血清轉胺酶含量升高的個體可以分類為「輕度」 (＜ 5倍正常值)，「中度」 (5–10倍正常值)或「顯著」 (＞ 10倍正常值)。因此，本文所說明方法之有些實施例中，該方法包括測定受試者樣本中ALT或AST之第一含量。有些例子中，ALT或AST之第一個含量會比ALT或AST之正常值高約5倍、高約5-10倍、或超過5倍正常值。

量測血清轉胺酶含量之方法係相關技藝習知者。通常，從患者血液樣本中量測ALT與AST含量且經常測試血液中其他肝臟酵素及化合物。可採用例如：免疫/酵素-免疫分析法或液相層析法/串聯質譜法(LC/MS)。 膽紅素

膽紅素(BR)為一種出現在正常分解代謝途徑中之黃橙色化合物，其會分解脊椎動物肝臟中之血基質。膽紅素含量升高表示有肝臟疾病。膽紅素有三種：未接合型、接合型、及總和型(未接合型與接合型二者之組合)。未接合型(亦稱為「間接型」)膽紅素為從紅血球分解產生之膽紅素。其在血液中運行到肝臟。接合型(亦稱為「直接型」)膽紅素為一旦抵達肝臟即進行化學變化的膽紅素。其移動至腸部後才透過尿液及糞便排出。膽紅素檢測可檢查膽紅素之未接合型、接合型、及總和型的量。例如：18歲以上的成人，血液中正常總膽紅素可達每分升1.2毫克(mg/dl)。彼等18歲以下者，正常含量可為約1 mg/dl。接合(直接)型膽紅素之正常結果可低於0.3 mg/dl。

本文所說明方法之有些實施例包括測定受試者樣本，等等中膽紅素的第一個含量。膽紅素的第一個含量會比膽紅素的正常範圍高約X。有些實施例中，受試者會具有升高之總膽紅素含量 ＞ 1.2 mg/dl，例如：1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0 mg/dl、或更高。有些實施例中，受試者會具有升高之直接型膽紅素含量 ＞ 0.3 mg/dl，例如：0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mg/dl、或更高。

量測膽紅素含量之方法係相關技藝習知者。通常，從患者血液樣本中量測膽紅素含量，且類似ALT及AST，經常測試血液中其他肝臟酵素及化合物。可採用膽紅素血液試驗來量測血液中總膽紅素含量。亦可測試尿液樣本中之膽紅素。尿液膽紅素試驗係量測尿液中是否含有膽紅素。類似ALT及AST，可採用例如：免疫/酵素-免疫分析法或液相層析法/串聯質譜法(LC/MS)來量測膽紅素含量。 TURSO 與苯基丁酸鈉之投藥法

本文所說明方法包括對受試者投予膽汁酸或其醫藥上可接受之鹽，及苯基丁酸鹽化合物。膽汁酸或其醫藥上可接受之鹽及苯基丁酸鹽化合物可以分開投予或同時投予，包括作為治療療程之一部份。該等化合物可以每天(例如：一天一次、一天兩次、或一天三次、或更多次)、每週、每月、或每季投藥。化合物可以連續投予數週、數個月、或數年的時間期。例如：化合物可以連續投予至少或約1週、2週、3週、1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月、7個月、8個月、9個月、10個月、11個月、1年、2年、3年、4年、或至少或約5年、或更長。化合物可以投予一天一次，或一天兩次連續60天或更短 (例如：55天、50天、45天、40天、35天、30天或更短)。或者，膽汁酸及苯基丁酸鹽化合物可以投予一天一次或一天兩次連續超過60天(例如：超過65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、130、140、150、160、180、200、250、300、400、500、600天)。

有些實施例中，本文所提供方法包括投予有效量之組成物，組成物包含約1克TURSO與約3克苯基丁酸鈉。TURSO之投藥量可為每天約0.5至約5克(例如：約0.5至約4.5、約0.5至約4、約0.5至約3.5、約0.5至約3、約0.5至約2.5、約0.5至約2、約0.5至約1.5、約0.5至約1、約1至約5、約1至約4.5、約1至約4、約1至約3.5、約1至約3、約1至約2.5、約1至約2、約1至約1.5、約1.5至約5、約1.5至約4.5、約1.5至約4、約1.5至約3.5、約1.5至約3、約1.5至約2.5、約1.5至約2、約2至約5、約2至約4.5、約2至約4、約2至約3.5、約2至約3、約2至約2.5、約2.5至約5、約2.5至約4.5、約2.5至約4、約2.5至約3.5、約2.5至約3、約3至約5、約3至約4.5、約3至約4、約3至約3.5、約3.5至約5、約3.5至約4.5、約3.5至約4、約4至約5、約4至約4.5、或約4.5至約5克)。有些實施例中，TURSO之投藥量為每天約1至約2克(含1克及2克)(例如：約1至約1.8克、約1至約1.6克、約1至約1.4克、約1至約1.2克、約1.2至約2.0克、約1.2至約1.8克、約1.2至約1.6克、約1.2至約1.4克、約1.4至約2.0克、約1.4至約1.8克、約1.4至約1.6克、約1.6至約2.0克、約1.6至約1.8克、約1.8至約2.0克)。有些實施例中，TURSO之投藥量為每天約1克。有些實施例中，TURSO之投藥量為每天約2克。例如：TURSO之投藥量為約1克，一天兩次。

苯基丁酸鈉之投藥量為每天約0.5至約10克(例如：每天約1至約10、約1至約9、約1至約8、約1至約7、約1至約6、約1至約5、約1至約4、約1至約3、約1至約2、約2至約10、約2至約9、約2至約8、約2至約7、約2至約6、約2至約5、約2至約4、約2.5至約9.5、約2.5至約8.5、約2.5至約7.5、約2.5至約6.5、約2.5至約5.5、約2.5至約4.5、約3至約10、約3至約9、約3至約8、約3至約7、約3至約6.5、約3至約6、約3至約5、約4至約10、約4至約9、約4至約8、約4至約7、約4至約6、約5至約10、約5至約9、約5至約8、約5至約7、約6至約10、約6至約9、約6至約8、約7至約10、約7至約9、約8至約10克)。有些實施例中，苯基丁酸鈉之投藥量為每天約3至約6克(含3克及6克)(例如：約3至約5.5克、約3至約5.0克、約3至約4.5克、約3至約4.0克、約3至約3.5克、約3.5至約6克、約3.5至約5.5克、約3.5至約5.0克、約3.5至約4.5克、約3.5至約4.0克、約4.0至約6克、約4.0至約5.5克、約4.0至約5.0克、約4.0至約4.5克、約4.5至約6克、約4.5至約5.5克、約4.5至約5.0克、約5.0至約6克、約5.0至約5.5克、或約5.5至約6.0克)。有些實施例中，苯基丁酸鈉之投藥量為每天約3克。有些實施例中，苯基丁酸鈉之投藥量為每天約6克。例如：苯基丁酸鈉之投藥量可為約3克，一天兩次。有些實施例中，膽汁酸與苯基丁酸鹽化合物之投藥重量比為約2.5：1至約3.5：1 (例如：約3：1)。

本文所說明方法可包括投予一天一次約1克TURSO及一天一次約3克苯基丁酸鈉，或一天兩次約1克TURSO 及一天兩次約3克苯基丁酸鈉。該方法可包括投予一天一次約1克TURSO及一天一次約3克苯基丁酸鈉連續至少14天 (例如：至少 15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、27、30、35、或40天)，接著投予一天兩次約 1克TURSO 及一天兩次約3克苯基丁酸鈉連續至少一天(例如：至少30、40、50、60、80、100、120、150、180、250、300、或400天)。例如：該方法可包括投予一天一次約 1克TURSO及一天一次約3克苯基丁酸鈉連續14至21天，接著投予一天兩次約1克TURSO及一天兩次約3克苯基丁酸鈉。

有些實施例中，本文所說明方法包括對受試者投予每天約10 mg/kg至約50 mg/kg體重之TURSO(例如：約10 mg/kg至約48 mg/kg、約10mg/kg至約46 mg/kg、約10mg/kg至約44 mg/kg、約10 mg/kg至約42 mg/kg、約10 mg/kg至約40 mg/kg、約10 mg/kg至約38 mg/kg、約10 mg/kg至約36 mg/kg、約10 mg/kg至約34 mg/kg、約10 mg/kg至約32 mg/kg、約10 mg/kg至約30 mg/kg、約10 mg/kg至約28 mg/kg、約10 mg/kg至約26 mg/kg、約10 mg/kg至約24 mg/kg、約10 mg/kg至約22 mg/kg、約10 mg/kg至約20 mg/kg、約10 mg/kg至約18 mg/kg、約10 mg/kg至約16 mg/kg、約10 mg/kg至約14 mg/kg、約10 mg/kg至約12 mg/kg、約12 mg/kg至約50 mg/kg、約12 mg/kg至約48 mg/kg、約12 mg/kg至約46 mg/kg、約12 mg/kg至約44 mg/kg、約12 mg/kg至約42 mg/kg、約12 mg/kg至約40 mg/kg、約12 mg/kg至約38 mg/kg、約12 mg/kg至約36 mg/kg、約12 mg/kg至約34 mg/kg、約12 mg/kg至約32 mg/kg、約12 mg/kg至約30 mg/kg、約12 mg/kg至約28 mg/kg、約12 mg/kg至約26 mg/kg、約12 mg/kg至約24 mg/kg、約12 mg/kg至約22 mg/kg、約12 mg/kg至約20 mg/kg、約12 mg/kg至約18 mg/kg、約12 mg/kg至約16 mg/kg、約12 mg/kg至約14 mg/kg、約14 mg/kg至約50 mg/kg、約14 mg/kg至約48 mg/kg、約14 mg/kg至約46 mg/kg、約14 mg/kg至約44 mg/kg、約14 mg/kg至約42 mg/kg、約14 mg/kg至約40 mg/kg、約14 mg/kg至約38 mg/kg、約14 mg/kg至約36 mg/kg、約14 mg/kg至約34 mg/kg、約14 mg/kg至約32 mg/kg、約14 mg/kg至約30 mg/kg、約14 mg/kg至約28 mg/kg、約14 mg/kg至約26 mg/kg、約14 mg/kg至約24 mg/kg、約14 mg/kg至約22 mg/kg、約14mg/kg至約20 mg/kg、約14 mg/kg至約18 mg/kg、約14 mg/kg至約16 mg/kg、約16 mg/kg至約50 mg/kg、約16 mg/kg至約48 mg/kg、約16 mg/kg至約46 mg/kg、約16 mg/kg至約44 mg/kg、約16 mg/kg至約42 mg/kg、約16 mg/kg至約40 mg/kg、約16 mg/kg至約38 mg/kg、約16 mg/kg至約36 mg/kg、約16 mg/kg至約34 mg/kg、約16 mg/kg至約32 mg/kg、約16 mg/kg至約30 mg/kg、約16 mg/kg至約28 mg/kg、約16 mg/kg至約26 mg/kg、約16 mg/kg至約24 mg/kg、約16 mg/kg至約22 mg/kg、約16 mg/kg至約20 mg/kg、約16 mg/kg至約18 mg/kg、約18 mg/kg至約50 mg/kg、約18 mg/kg至約48 mg/kg、約18 mg/kg至約46 mg/kg、約18 mg/kg至約44 mg/kg、約18 mg/kg至約42 mg/kg、約18 mg/kg至約40 mg/kg、約18 mg/kg至約38 mg/kg、約18 mg/kg至約36 mg/kg、約18 mg/kg至約34 mg/kg、約18 mg/kg至約32 mg/kg、約18 mg/kg至約30 mg/kg、約18 mg/kg至約28 mg/kg、約18 mg/kg至約26 mg/kg、約18 mg/kg至約24 mg/kg、約18 mg/kg至約22 mg/kg、約18 mg/kg至約20 mg/kg、約20 mg/kg至約50 mg/kg、約20 mg/kg至約48 mg/kg、約20 mg/kg至約46 mg/kg、約20 mg/kg至約44 mg/kg、約20 mg/kg至約42 mg/kg、約20 mg/kg至約40 mg/kg、約20 mg/kg至約38 mg/kg、約20 mg/kg至約36 mg/kg、約20 mg/kg至約34 mg/kg、約20 mg/kg至約32 mg/kg、約20 mg/kg至約30 mg/kg、約20 mg/kg至約28 mg/kg、約20 mg/kg至約26 mg/kg、約20 mg/kg至約24 mg/kg、約20 mg/kg至約22 mg/kg、約22 mg/kg至約50 mg/kg、約22 mg/kg至約48 mg/kg、約22 mg/kg至約46 mg/kg、約22 mg/kg至約44 mg/kg、約22 mg/kg至約42 mg/kg、約22 mg/kg至約40 mg/kg、約22 mg/kg至約38 mg/kg、約22 mg/kg至約36 mg/kg、約22 mg/kg至約34 mg/kg、約22 mg/kg至約32 mg/kg、約22 mg/kg至約30 mg/kg、約22 mg/kg至約28 mg/kg、約22 mg/kg至約26 mg/kg、約22 mg/kg至約24 mg/kg、約24 mg/kg至約50 mg/kg、約24 mg/kg至約48 mg/kg、約24 mg/kg至約46 mg/kg、約24 mg/kg至約44 mg/kg、約24 mg/kg至約42 mg/kg、約24 mg/kg至約40 mg/kg、約24 mg/kg至約38 mg/kg、約24 mg/kg至約36 mg/kg、約24 mg/kg至約34 mg/kg、約24 mg/kg至約32 mg/kg、約24 mg/kg至約30 mg/kg、約24 mg/kg至約28 mg/kg、約24 mg/kg至約26 mg/kg、約26 mg/kg至約50 mg/kg、約26 mg/kg至約48 mg/kg、約26 mg/kg至約46 mg/kg、約26 mg/kg至約44 mg/kg、約26 mg/kg至約42 mg/kg、約26 mg/kg至約40 mg/kg、約26 mg/kg至約38 mg/kg、約26 mg/kg至約36 mg/kg、約26 mg/kg至約34 mg/kg、約26 mg/kg至約32 mg/kg、約26 mg/kg至約30 mg/kg、約26 mg/kg至約28 mg/kg、約28 mg/kg至約50 mg/kg、約28 mg/kg至約48 mg/kg、約28 mg/kg至約46 mg/kg、約28 mg/kg至約44 mg/kg、約28 mg/kg至約42 mg/kg、約28 mg/kg至約40 mg/kg、約28 mg/kg至約38 mg/kg、約28 mg/kg至約36 mg/kg、約28 mg/kg至約34 mg/kg、約28 mg/kg至約32 mg/kg、約28 mg/kg至約30 mg/kg、約30 mg/kg至約50 mg/kg、約30 mg/kg至約48 mg/kg、約30 mg/kg至約46 mg/kg、約30 mg/kg至約44 mg/kg、約30 mg/kg至約42 mg/kg、約30 mg/kg至約40 mg/kg、約30 mg/kg至約38 mg/kg、約30 mg/kg至約36 mg/kg、約30 mg/kg至約34 mg/kg、約30 mg/kg至約32 mg/kg、約32 mg/kg至約50 mg/kg、約32 mg/kg至約48 mg/kg、約32 mg/kg至約46 mg/kg、約32 mg/kg至約44 mg/kg、約32 mg/kg至約42 mg/kg、約32 mg/kg至約40 mg/kg、約32 mg/kg至約38 mg/kg、約32 mg/kg至約36 mg/kg、約32 mg/kg至約34 mg/kg、約34 mg/kg至約50 mg/kg、約34 mg/kg至約48 mg/kg、約34 mg/kg至約46 mg/kg、約34 mg/kg至約44 mg/kg、約34 mg/kg至約42 mg/kg、約34 mg/kg至約40 mg/kg、約34 mg/kg至約38 mg/kg、約34 mg/kg至約36 mg/kg、約36 mg/kg至約50 mg/kg、約36 mg/kg至約48 mg/kg、約36 mg/kg至約46 mg/kg、約36 mg/kg至約44 mg/kg、約36 mg/kg至約42 mg/kg、約36 mg/kg至約40 mg/kg、約36 mg/kg至約38 mg/kg、約38 mg/kg至約50 mg/kg、約38 mg/kg至約48 mg/kg、約38 mg/kg至約46 mg/kg、約38 mg/kg至約44 mg/kg、約38 mg/kg至約42 mg/kg、約38 mg/kg至約40 mg/kg、約40 mg/kg至約50 mg/kg、約40 mg/kg至約48 mg/kg、約40 mg/kg至約46 mg/kg、約40 mg/kg至約44 mg/kg、約40 mg/kg至約42 mg/kg、約42 mg/kg至約50 mg/kg、約42 mg/kg至約48 mg/kg、約42 mg/kg至約46 mg/kg、約42 mg/kg至約44 mg/kg、約44 mg/kg至約50 mg/kg、約44 mg/kg至約48 mg/kg、約44 mg/kg至約46 mg/kg、約46 mg/kg至約50 mg/kg、約46 mg/kg至約48 mg/kg、或約46 mg/kg至約50 mg/kg)。

有些實施例中，本文所說明方法包括對受試者投予每天約10 mg/kg至約400 mg/kg體重之苯基丁酸鈉(例如：約10 mg/kg至約380 mg/kg、約10 mg/kg至約360 mg/kg、約10 mg/kg至約340 mg/kg、約10 mg/kg至約320 mg/kg、約10 mg/kg至約300 mg/kg、約10 mg/kg至約280 mg/kg、約10 mg/kg至約260 mg/kg、約10 mg/kg至約240 mg/kg、約10 mg/kg至約220 mg/kg、約10 mg/kg至約200 mg/kg、約10 mg/kg至約180 mg/kg、約10 mg/kg至約160 mg/kg、約10 mg/kg至約140 mg/kg、約10 mg/kg至約120 mg/kg、約10 mg/kg至約100 mg/kg、約10 mg/kg至約80 mg/kg、約10 mg/kg至約60 mg/kg、約10 mg/kg至約40 mg/kg、約10 mg/kg至約20 mg/kg、約20 mg/kg至約400 mg/kg、約20 mg/kg至約380 mg/kg、約20 mg/kg至約360 mg/kg、約20 mg/kg至約340 mg/kg、約20 mg/kg至約320 mg/kg、約20 mg/kg至約300 mg/kg、約20 mg/kg至約280 mg/kg、約20 mg/kg至約260 mg/kg、約20 mg/kg至約240 mg/kg、約20 mg/kg至約220 mg/kg、約20 mg/kg至約200 mg/kg、約20 mg/kg至約180 mg/kg、約20 mg/kg至約160 mg/kg、約20 mg/kg至約140 mg/kg、約20 mg/kg至約120 mg/kg、約20 mg/kg至約100 mg/kg、約20 mg/kg至約80 mg/kg、約20 mg/kg至約60 mg/kg、約20 mg/kg至約40 mg/kg、約40 mg/kg至約400 mg/kg、約40 mg/kg至約380 mg/kg、約40 mg/kg至約360 mg/kg、約40 mg/kg至約340 mg/kg、約40 mg/kg至約320 mg/kg、約40 mg/kg至約300 mg/kg、約40 mg/kg至約280 mg/kg、約40 mg/kg至約260 mg/kg、約40 mg/kg至約240 mg/kg、約40 mg/kg至約220 mg/kg、約40 mg/kg至約200 mg/kg、約40 mg/kg至約180 mg/kg、約40 mg/kg至約160 mg/kg、約40 mg/kg至約140 mg/kg、約40 mg/kg至約120 mg/kg、約40 mg/kg至約100 mg/kg、約40 mg/kg至約80 mg/kg、約40 mg/kg至約60 mg/kg、約60 mg/kg至約400 mg/kg、約60 mg/kg至約380 mg/kg、約60 mg/kg至約360 mg/kg、約60 mg/kg至約340 mg/kg、約60 mg/kg至約320 mg/kg、約60 mg/kg至約300 mg/kg、約60 mg/kg至約280 mg/kg、約60 mg/kg至約260 mg/kg、約60 mg/kg至約240 mg/kg、約60 mg/kg至約220 mg/kg、約60 mg/kg至約200 mg/kg、約60 mg/kg至約180 mg/kg、約60 mg/kg至約160 mg/kg、約60 mg/kg至約140 mg/kg、約60 mg/kg至約120 mg/kg、約60 mg/kg至約100 mg/kg、約60 mg/kg至約80 mg/kg、約80 mg/kg至約400 mg/kg、約80 mg/kg至約380 mg/kg、約80 mg/kg至約360 mg/kg、約80 mg/kg至約340 mg/kg、約80 mg/kg至約320 mg/kg、約80 mg/kg至約300 mg/kg、約80 mg/kg至約280 mg/kg、約80 mg/kg至約260 mg/kg、約80 mg/kg至約240 mg/kg、約80 mg/kg至約220 mg/kg、約80 mg/kg至約200 mg/kg、約80 mg/kg至約180 mg/kg、約80 mg/kg至約160 mg/kg、約80 mg/kg至約140 mg/kg、約80 mg/kg至約120 mg/kg、約80 mg/kg至約100 mg/kg、約100 mg/kg至約400 mg/kg、約100 mg/kg至約380 mg/kg、約100 mg/kg至約360 mg/kg、約100 mg/kg至約340 mg/kg、約100 mg/kg至約320 mg/kg、約100 mg/kg至約300 mg/kg、約100 mg/kg至約280 mg/kg、約100 mg/kg至約260 mg/kg、約100 mg/kg至約240 mg/kg、約100 mg/kg至約220 mg/kg、約100 mg/kg至約200 mg/kg、約100 mg/kg至約180 mg/kg、約100 mg/kg至約160 mg/kg、約100 mg/kg至約140 mg/kg、約100 mg/kg至約120 mg/kg、約120 mg/kg至約400 mg/kg、約120 mg/kg至約380 mg/kg、約120 mg/kg至約360 mg/kg、約120 mg/kg至約340 mg/kg、約120 mg/kg至約320 mg/kg、約120 mg/kg至約300 mg/kg、約120 mg/kg至約280 mg/kg、約120 mg/kg至約260 mg/kg、約120 mg/kg至約240 mg/kg、約120 mg/kg至約220 mg/kg、約120 mg/kg至約200 mg/kg、約120 mg/kg至約180 mg/kg、約120 mg/kg至約160 mg/kg、約120 mg/kg至約140 mg/kg、約140 mg/kg至約400 mg/kg、約140 mg/kg至約380 mg/kg、約140 mg/kg至約360 mg/kg、約140 mg/kg至約340 mg/kg、約140 mg/kg至約320 mg/kg、約140 mg/kg至約300 mg/kg、約140 mg/kg至約280 mg/kg、約140 mg/kg至約260 mg/kg、約140 mg/kg至約240 mg/kg、約140 mg/kg至約220 mg/kg、約140 mg/kg至約200 mg/kg、約140 mg/kg至約180 mg/kg、約140 mg/kg至約160 mg/kg、約160 mg/kg至約400 mg/kg、約160 mg/kg至約380 mg/kg、約160 mg/kg至約360 mg/kg、約160 mg/kg至約340 mg/kg、約160 mg/kg至約320 mg/kg、約160 mg/kg至約300 mg/kg、約160 mg/kg至約280 mg/kg、約160 mg/kg至約260 mg/kg、約160 mg/kg至約240 mg/kg、約160 mg/kg至約220 mg/kg、約160 mg/kg至約200 mg/kg、約160 mg/kg至約180 mg/kg、約180 mg/kg至約400 mg/kg、約180 mg/kg至約380 mg/kg、約180 mg/kg至約360 mg/kg、約180 mg/kg至約340 mg/kg、約180 mg/kg至約320 mg/kg、約180 mg/kg至約300 mg/kg、約180 mg/kg至約280 mg/kg、約180 mg/kg至約260 mg/kg、約180 mg/kg至約240 mg/kg、約180 mg/kg至約220 mg/kg、約180 mg/kg至約200 mg/kg、約200 mg/kg至約400 mg/kg、約200 mg/kg至約380 mg/kg、約200 mg/kg至約360 mg/kg、約200 mg/kg至約340 mg/kg、約200 mg/kg至約320 mg/kg、約200 mg/kg至約300 mg/kg、約200 mg/kg至約280 mg/kg、約200 mg/kg至約260 mg/kg、約200 mg/kg至約240 mg/kg、約200 mg/kg至約220 mg/kg、約220 mg/kg至約400 mg/kg、約220 mg/kg至約380 mg/kg、約220 mg/kg至約360 mg/kg、約220 mg/kg至約340 mg/kg、約220 mg/kg至約320 mg/kg、約220 mg/kg至約300 mg/kg、約220 mg/kg至約280 mg/kg、約220 mg/kg至約260 mg/kg、約220 mg/kg至約240 mg/kg、約240 mg/kg至約400 mg/kg、約240 mg/kg至約380 mg/kg、約240 mg/kg至約360 mg/kg、約240 mg/kg至約340 mg/kg、約240 mg/kg至約320 mg/kg、約240 mg/kg至約300 mg/kg、約240 mg/kg至約280 mg/kg、約240 mg/kg至約260 mg/kg、約260 mg/kg至約400 mg/kg、約260 mg/kg至約380 mg/kg、約260 mg/kg至約360 mg/kg、約260 mg/kg至約340 mg/kg、約260 mg/kg至約320 mg/kg、約260 mg/kg至約300 mg/kg、約260 mg/kg至約280 mg/kg、約280 mg/kg至約400 mg/kg、約280 mg/kg至約380 mg/kg、約280 mg/kg至約360 mg/kg、約280 mg/kg至約340 mg/kg、約280 mg/kg至約320 mg/kg、約280 mg/kg至約300 mg/kg、約300 mg/kg至約400 mg/kg、約300 mg/kg至約380 mg/kg、約300 mg/kg至約360 mg/kg、約300 mg/kg至約340 mg/kg、約300 mg/kg至約320 mg/kg、約320 mg/kg至約400 mg/kg、約320 mg/kg至約380 mg/kg、約320 mg/kg至約360 mg/kg、約320 mg/kg至約340 mg/kg、約340 mg/kg至約400 mg/kg、約340 mg/kg至約380 mg/kg、約340 mg/kg至約360 mg/kg、約360 mg/kg至約400 mg/kg、約360 mg/kg至約380 mg/kg、或約380 mg/kg至約400 mg/kg)。

有些實施例中，TURSO之投藥量為每天約10 mg/kg、約15 mg/kg、約20 mg/kg、約25 mg/kg、約30 mg/kg、約35 mg/kg、約40 mg/kg、約45 mg/kg、約50 mg/kg、約55 mg/kg、約60 mg/kg、約65 mg/kg、或約70 mg/kg體重。有些實施例中，苯基丁酸鈉之投藥量為約10 mg/kg、約20 mg/kg、約30 mg/kg、約40 mg/kg、約50 mg/kg、約60 mg/kg、約70 mg/kg、約80 mg/kg、約90 mg/kg、約100 mg/kg、約120 mg/kg、約140 mg/kg、約160 mg/kg、約180 mg/kg、約200 mg/kg、約220 mg/kg、約240 mg/kg、約260 mg/kg、約280 mg/kg、約300 mg/kg、約320 mg/kg、約340 mg/kg、約360 mg/kg、約380 mg/kg、或約400 mg/kg體重。

本文所說明方法可用於治療或緩解受試者中至少一種ALS症狀、減慢ALS疾病演進、延長具有一或多種ALS症狀之受試者的存活時間、防止或減少與ALS或其治療相關之至少一種不良事件(例如：嚴重不良事件)，及減少惡化、維持或改善肌肉強度、呼吸肌肉/肺部功能及/或精細動作技能。該方法亦可用於預防性治療處於發展出ALS風險下之受試者(例如：有家族ALS病史之受試者)或疑似發展出ALS之受試者(例如：出現至少一種ALS症狀、上運動神經元退化症狀、及/或下運動神經元退化症狀，但當時的症狀不足以支持完全診斷為ALS之受試者)。該等方法適用於緩解至少一種下運動神經元退化或上運動神經元退化之症狀。

本文所揭示方法亦適用於預防或減少便秘(例如：與ALS相關之便秘)，及緩解良性肌束顫動症候群或痙攣肌束顫動症候群之至少一種症狀。

如本文所揭示，該等方法可用於治療診斷患有ALS、處於發展出ALS風險、或疑似患有ALS之受試者。該受試者可能例如：已經診斷患有ALS 24個月或更短(例如：本文所說明此範圍內任何次範圍)。例如：受試者可能已經診斷罹患ALS一週或更短，或在接受投予本揭示治療法的同一天診斷。受試者可能已出現一或多種ALS症狀24個月或更短(例如：本文所說明此範圍內任何次範圍)，具有之ALS疾病演進速率(ΔFS)為約0.50或更高(例如：本文所說明此範圍內任何次範圍)，具有之ALSFRS-R得分為40或更低 (例如：本文所說明此範圍內任何次範圍)，在過去3至12個月期間的ALSFRS-R得分平均每個月下降約0.8至約2分(例如：本文所說明此範圍內任何次範圍)，一或多個選自下列各物所組成群中之基因具有突變：SOD1、C9ORF72、ANG、TARDBP、VCP、VAPB、SQSTM1、DCTN1、FUS、UNC13A、ATXN2、HNRNPA1、CHCHD10、MOBP、C21ORF2、NEK1、TUBA4A、TBK1、MATR3、PFN1、UBQLN2、TAF15、OPTN、及TDP-43，及/或CSF或血液具有之pNF-H含量為約300 pg/mL或更高 (例如：約350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1550、1600、1650、1700、1750、1800、1850、1900、1950、2000、2050、2100、2150、2200、2250、2300、2350、2400、2450、2500、2550、2600、2650、2700、2750、2800、2850、2900、3000、3200、3500、3800、或4000 pg/mL或更高)。有些實施例中，本文所說明方法中受試者之血清 pNF-H含量可為約70至約1200 pg/mL (例如：約70至約1000、約70至約800、約80至約600、或約90至約400 pg/mL)。有些實施例中，本文所說明方法中受試者之CSF pNF-H含量可為約1000至約5000 pg/mL (例如：約1500至約4000、或約2000至約3000 pg/mL)。受試者可具有之CSF或血液NfL含量為約50 pg/mL或更高 (例如：約60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、或250 pg/mL或更高)。有些實施例中，本文所說明方法中受試者之血清 NfL含量可為約50至約300 pg/mL (例如：本文所說明此範圍內任何次範圍)。有些實施例中，本文所說明方法中受試者之CSF NfL含量可為約2000至約40,000 pg/mL (例如：本文所說明此範圍內任何次範圍)。

本揭露所說明方法可包括治療ALS本身，及治療一或多種ALS症狀。「治療」ALS不需要100%清除受試者之疾病或疾病症狀。該疾病之症狀或特徵之嚴重性的任何解除或降低均考慮在內。「治療」ALS亦指延緩症狀發病(例如：用於預防性治療)或延緩症狀演進或與疾病相關的功能喪失。「治療」ALS亦指消除或降低治療之一或多種副作用(例如：彼等由本文所揭示或相關技藝習知治療ALS之任何醫療劑所引起者)。「治療」ALS亦指消除或降低ALS疾病演進之一或多種直接或間接效應，如：跌倒次數增加、撕裂傷、或GI問題。受試者不一定出現ALS徵兆，但可能處於ALS風險。例如：受試者可能在ALS相關基因上帶有突變，具有罹患ALS之家族病史、或具有升高的生物標記物含量，表示有發展出ALS之風險。受試者可能出現早期疾病徵兆或出現已確立或進行性疾病之症狀。本揭露考慮症狀發病的任何延緩程度、一或多種疾病的減輕、或任何一或多種疾病症狀演進的延緩(例如：由ALSFRS-R所量測的任何改善、或維持ALSFRS-R等級(代表延緩疾病演進))。本文亦考慮良性肌束顫動症候群及痙攣-肌束顫動症候群之症狀或特徵嚴重性的任何解除或減輕。

本揭露所提供治療法可在疾病演進期間的任何階段開始。例如：可以在發病之前開始治療(例如：針對處於發展出ALS風險之受試者)、在症狀發病時或檢測到ALS症狀後立即、觀察到可能導致相關專業人士懷疑受試者可能發展出ALS之任何一或多種症狀(例如：肌肉無力、肌肉肌束顫動、及/或肌肉痙攣)時。治療法亦可在晚期階段開始。例如：治療法可能在疾病的漸進階段開始，例如：當肌肉無力及萎縮擴散到身體不同部位，且該受試者的行動問題增加時。在開始治療時及之前，受試者可能罹患緊繃及與僵直肌肉(痙攣)、過度反射(hyperreflexia)、肌肉無力及萎縮、肌肉痙攣、及/或可在皮膚下面看到短暫肌肉抽搐(肌束顫動)、吞嚥困難(吞嚥障礙)、說話或造詞困難(吶語症)。

治療方法可包括可依預防或治療ALS或至少一種ALS症狀所需，進行單次投藥、多次投藥及重覆投藥。預防治療法期間可為單次劑量或該治療法可以連續(例如：多次劑量)，例如：連續幾年或無限連續長達受試者的壽命。例如：處於ALS風險的受試者可以接受本文所提供方法治療數天、數週、數個月、或甚至數年，以防止疾病發生或爆發。有些實施例之治療方法可包括在治療前、治療期間、及/或治療後評估受試者的疾病程度。本文所提供治療法可以每天投藥一次或更多次，或其可以每週或每個月投藥。有些實施例中，治療法可以持續到受試者檢測到疾病程度下降為止。本文所提供方法可在有些實施例中，在初次投藥後短於60天(例如：短於50、45、40、35、30、25、20、15、或10天)，或在投藥少於60次(例如：投藥少於50、45、40、35、30、25、20、15、或10次)後，開始顯示效力(例如：減輕一或多種ALS症狀、改進ALSFRS-R之量測值、或維持ALSFRS-R等級)。

本文所採用術語「投予」、「投藥」或「投藥法」係指採用任何相關技藝習知方法，例如：口服食入、注射、植入、吸收、或吸入，對受試者投予本文所說明藥物，不論藥物型式。有些實施例中，可藉由口服食入及/或局部表面(例如：經鼻)對受試者投予本文所揭示一或多種化合物。例如：本文方法包括投予有效量之化合物或化合物組成物，以達成所需或所述之效力。針對任何特定受試者之明確劑量及治療療程將隨各種不同因素變化，包括所採用明確化合物之活性、年齡、體重、一般身體狀態、性別、飲食、投藥時間、排泄速率、藥物組合、疾病之嚴重性及病程、病症或症狀、受試者對疾病、病症或症狀的處置、及主治醫師的判斷。

繼投予膽汁酸或其醫藥上可接受之鹽及苯基丁酸鹽化合物之後，可以評估受試者，以檢測、分析、或測定其等ALS疾病程度。有些實施例中，治療法可以持續到所檢測受試者之疾病程度有變化(例如：減輕)為止。

當患者的病症改善(例如：受試者之疾病程度有變化(例如：下降))時，若必要時可投予維持劑量之本揭露化合物、組成物或組合。隨後，可以症狀為函數，降低劑量或投藥頻率、或二者，直到可維持所改善病症的程度。然而患者可能需要在長期基礎上，在出現任何復發疾病症狀時進行間歇性治療。 IV. 症狀 及療效量測

本揭示進一步提供一種評估ALS症狀、監測ALS演進、及評估受試者對治療之反應的方法。其無限制實例包括由醫師進行的身體檢查、體重、心電圖(ECG)、ALS功能評估量表(ALS functional Rating Scale)(ALSFRS或ALSFRS-R)得分、呼吸功能、肌肉強度、認知/行為功能、生活品質、及語音分析。

受試者的呼吸功能可以藉由例如：肺活量(包括用力肺活量及慢肺活量)、最大吐氣中期流速(MMERF)、用力肺活量(FVC)、及第1秒用力吐氣量(FEV ₁)來量測。肌肉強度可以藉由例如：手持測力器(HHD)、手持強度握力器、徒手肌力測試(MMT)、電阻抗肌動描記術(EIM)、最大自主等長收縮測試(MVICT)、運動單位數估測(MUNE)、肢體等長強度精確測試 (ATLIS)、或其組合來評估。認知/行為功能可藉由例如：ALS憂鬱症量表(ALSDepression Inventory)(ADI-12)、貝克憂鬱症量表(Beck Depression Inventory)(BDI)、及醫院焦慮憂鬱症量表(Hospital Anxiety Depression Scale)(HADS)問卷來評估。生活品質可以藉由例如：ALS分析問卷(ALSAssessment Questionnaire)(ALSAQ-40) 來評估。亦可採用Akt含量、Akt磷酸化及/或pAktdAkt比值來評估受試者的疾病演進及對治療的反應(參見例如：WO2012/160563)。

受試者之CSF或血液樣本中生物標記物含量亦適用為受試者之ALS演進及對本文所提供治療方法的反應之指標。針對此目的，可以分析生物標記物，如(但不限於)：磷酸化神經元絲重鏈(pNF-H)、神經元絲中鏈、神經元絲輕鏈(NFL)、S100-β、胱蛋白C(cystatin C)、幾丁三糖酶(chitotriosidase)、CRP、TDP-43、尿酸、及某些微小RNA。亦可採用尿液分析來評估受試者對治療的反應。可以分析尿液樣本中諸如(但不限於)： p75ECD與酮體之生物標記物的含量。可以量測尿液與血液樣本中之肌酸酐含量。有些實施例中，本文所提供方法造成受試者之尿液樣本中酮體含量上升或下降。亦可採用諸如：轉位蛋白(Translocator protein)(TSPO)之標記物之醫學影像，包括(但不限於)：MRI及PET之顯影。 肌肉強度

可採用相關技藝習知之方法分析受試者的肌肉強度。定量性強度量測值通常證實ALS患者內之線性、可預測的強度流失。可採用塔夫茨定量神經肌肉檢查(Tufts Quantitative Neuromuscular Examination)(TQNE)，利用固定的應變片(strain gauge)提供定量性量測值。TQNE量測20組肌肉的等長強度，並在強肌肉與弱肌肉二者中產生區間強度數據(參見例如：Andres等人，Neurology 36:937-941, 1986)。手持測力器(HHD)測試臂部及腿部特定肌肉的等長強度，並產生區間程度數據(參見例如：Shefne JM, Neurotherapeutics 14：154-160, 2017)。

可採用肢體等長強度精確測試法(ATLIS)，使用固定式無線測傳感器(load cell)量測強肌肉群及弱肌肉群二者(參見例如：Andres等人，Muscle Nerve 56(4):710-715, 2017)。在ATLIS測試法中分析12組肌肉群的力量，其反映受試者的下肢、上肢強度、及受試者的握力強度。有些實施例中，在觀察任何功能變化之前，先以ATLIS測試法檢測肌肉強度的變化。

本文所提供方法可能改善、維持、或減慢受試者肌肉強度(例如：下肢強度、上肢強度、或握力強度)的惡化，其係藉由本文所說明任何合適方法分析。該等方法可以讓受試者的上肢強度改善程度比其他肌肉群更顯著。例如：可在選自：四頭肌、二頭肌、大腿後肌、三頭肌、及脛前肌之一或多種肌肉群中反映對肌肉強度的影響。

可在投予膽汁酸或其醫藥上可接受之鹽及苯基丁酸鹽化合物之前、期間及/或之後，採用HHD、手持強度握力器、MMT、EIM、MVICT、MUNE、ATLIS、或其組合來分析肌肉強度。

有些實施例中，採用ATLIS分析肌肉強度。可以分析ATLIS總得分及上肢與下肢ATLIS得分。本揭露方法可以造成受試者ATLIS總得分的下降速率為約3.50 PPN/月或更低(例如：約3.45、3.40、3.35、3.30、3.25、3.20、3.15、3.10、3.05、3.00 PPN/月或更低)。相較於未接受投藥之對照組受試者，本揭露方法亦可以造成受試者ATLIS總得分的平均下降速率減少至少約0.2 PPN/月(例如：至少約0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、或0.50 PPN/月)。相較於未接受本文所說明投藥之對照組受試者，受試者之上肢ATLIS得分的平均下降速率減少至少約0.50 PPN/月(例如：至少約0.55、0.60、0.65、0.70、0.75、0.80、0.85、或0.90 PPN/月)。相較於未接受本文所說明投藥之對照組受試者，受試者之下肢ATLIS得分的平均下降速率可減少至少約0.20 PPN/月(例如：至少約0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50、0.55、或0.60 PPN/月)。有些實施例中，受試者可能在初次投藥後短於60天(例如：短於55、50、45、40、30、25、或20天)即改善或維持肌肉強度。PPN代表依據年齡、性別、體重及身高估測的正常強度百分比。 肺 功能

ALS為一種進行性神經退化性疾病，最後會造成呼吸衰竭及死亡。肺功能試驗，如：肺活量(VC)、最大吐氣中期流速(MMERF)、用力肺活量(FVC)、慢肺活量(SVC)、及第1秒用力吐氣量(FEV ₁)均可用於監測ALS演進及/或受試者對治療的反應。平均而言，ALS患者以肺活量(VC)量測的呼吸功能每個月下降速率可為預估值(±6.9)的約2.24%。有些實施例中，來自肺功能試驗的量測值係與存活相關(參見例如：Moufavi等人，Iran J Neurol 13(3): 131–137, 2014)。其他諸如：最大吸氣及吐氣壓力、動脈血液氣體量測值、及過夜血氧紀錄的量測值，均可作為早期的功能障礙證據。亦可比較站立與仰臥位置的肺活量，作為通氣肌肉強度弱化的早期指標。

本文所提供方法可以改善或維持受試者的呼吸肌肉及/或肺功能，或減慢受試者的呼吸肌肉及/或肺功能的惡化。亦可採用本文所說明或相關技藝習知之任何合適方法評估受試者的呼吸肌肉及/或肺功能。有些實施例中，依據受試者的SVC分析人類受試者的呼吸肌肉功能。本文所說明任何改善、維持、或減慢人類受試者呼吸肌肉功能惡化的方法之有些實施例中，該治療法使受試者之SVC平均下降速率為約3.50 PPN/月或更低 (例如：約3.45、3.40、3.35、3.30、3.25、3.20、3.15、3.10、3.05、或3.00 PPN/月或更低)。有些實施例中，相較於未接受治療之對照組受試者，該治療法使受試者之SVC 平均下降速率減少至少約0.5 PPN/月 (例如：至少約0.55、0.60、0.65、0.70、0.75、0.80、0.85、0.90、0.95、或1.00 PPN/月)。有些實施例中，受試者的肺功能在初次投藥後短於60天 (例如：短於55、50、45、40、30、25、或20天)開始出現改善或維持。有些實施例中，在初次投藥後少於60天，受試者的肺功能演進即低於預期。 不良事件

採用本文所提供任何方法治療的受試者可能比未接受治療的對照組受試者出現較少不良事件(例如：本文所揭示任何不良事件)、或出現較低程度的一或多種不良事件。不良事件實例包括胃腸相關的不良事件(例如：腹部疼痛、胃炎、噁心及嘔吐、便秘、直腸出血、胃潰瘍疾病、及胰臟炎)；血液不良事件(例如：再生障礙性貧血及瘀斑)；心血管不良事件(例如：心律不整及水腫)；腎臟不良事件(例如：腎小管性酸中毒)；精神病不良事件(例如：憂鬱症)；皮膚不良事件(例如：起疹)；及其他不良事件(例如：昏厥及體重增加)。有些實施例中，本文所提供方法不會造成或造成最小程度的便秘、頸部疼痛、頭痛、跌倒、口乾、肌肉無力、突然摔倒、撕裂傷、及丙胺酸胺基轉胺酶(ALT)上升。有些實施例中，不良事件為嚴重不良事件，如(但不限於)：呼吸不良事件、突然摔倒、或撕裂傷。

有些實施例中，相較於僅投予膽汁酸或苯基丁酸鹽化合物時，投予膽汁酸與苯基丁酸鹽化合物之組合可以導致較少的不良事件(例如：本文所揭示任何不良事件)、或較不嚴重的不良事件。

ALS患者的平均存活時間可能有變化。中值存活時間可為從症狀發病起約30至約32個月，或從診斷起約14至約20個月。延髓發病型ALS受試者之存活時間可為從症狀發病起約6個月至約84個月，中值為約27個月。本文所提供方法可能在有些實施例中，使患有ALS之受試者的存活時間延長至少一個月(例如：至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、28、32、36、40、50、60、70、80、或90個月)。本文所提供方法可能在有些實施例中，使依賴呼吸器或氣管切開術至少延後一個月(例如：至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、28、32、36、40、50、60、70、80、或90個月)才開始。

本文所提供方法可以降低疾病演進速率，其中相較於未接受治療的對照組受試者，受試者每個月下降的平均ALSFRS-R得分可以減少至少約0.2 (例如：至少約0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50、0.55、0.60、0.65、0.70、0.75、0.80、0.85、0.90、0.95、1.0、1.05、1.1、1.15、1.2、1.25、1.3、1.35、1.4、1.45或1.5)。本文所提供方法可以減慢由ALSFRS量表評估之一或多種類別的演進，包括：言語、流涎、吞嚥、手寫、切割食物及手持器具、穿衣及衛生盥洗、在床上轉身及調整床單、行走、爬樓梯、呼吸困難、端坐呼吸、換氣不足。有些實施例中，本文所提供方法可改善或減慢受試者的精細功能惡化，其係由ALSFRS-R量表的一或多個類別所評估(例如：手寫、切割食物及手持器具、或穿衣及衛生盥洗)。

有些實施例中，相較於50歲或更老(例如：55、60、65、70、75、或80歲或更老)的受試者，本文所提供方法係更有效治療約18至約50歲的受試者(例如：約18至約45、約18至約40、約18至約35、約18至約30、約18至約25、或約18至約22歲)。有些實施例中，相較於已經診斷患有ALS之受試者及/或已顯示ALS症狀發病超過約24個月(例如：超過約26、28、30、32、34、36、40、45、50、55、或60個月)的受試者，本文所提供方法係更有效治療已經診斷患有ALS之受試者及/或已顯示ALS症狀發病短於約24個月(例如：短於約22、20、18、16、14、12、10、8、6、4、2、或1個月)的受試者。有些實施例中，相較於已經診斷患有ALS之受試者及/或已顯示ALS症狀短於約24個月(例如：短於約22、20、18、16、14、12、10、8、6、4、2、或1個月)的受試者，本文所提供方法係更有效治療已經診斷患有ALS之受試者及/或已顯示ALS症狀發病超過約24個月(例如：超過約26、28、30、32、34、36、40、45、50、55、或60個月)之受試者。

有些實施例中，對本文所提供治療方法之反應性係與性別相關。本文所提供方法對女性受試者相較於對男性受試者的治療效力可能較高或較低。例如：當在類似的疾病演進階段治療時，女性受試者可能比男性受試者較早或較晚顯示改善(例如：由ALSFRS-R或本文所說明任何其他療效量測值所量測)。當在類似的疾病演進階段治療時，女性受試者可能在有些實施例中比男性受試者顯示較大或較小程度的改善(例如：由ALSFRS-R或本文所說明任何其他結果量測值所量測)。膽汁酸及苯基丁酸鹽化合物在女性與男性受試者的藥物動力學可能相同或不同。 V. 額外醫療劑

本文所說明方法可以進一步包括對受試者投予一或多種額外醫療劑，例如：其用量可有效治療或達成調控至少一種ALS症狀。相關技藝已知之任何已知ALS醫療劑均可用為額外醫療劑。醫療劑實例包括利魯唑(riluzole)(C ₈H ₅F ₃N ₂OS，例如：市售商品名稱Rilutek®與Tiglutik®)、依達拉奉(edaravone)(例如：市售商品名稱Radicava®與Radicut®)、右美沙芬(dextromethorphan)、 抗膽鹼激導性醫藥、及精神科用藥(例如：抗憂鬱劑、抗精神病藥、解焦慮劑/安眠劑、情緒安定劑、及興奮劑)。

Neudexta®為右美沙芬(dextromethorphan)與奎尼丁(quinidine)之組合，可用於治療假性延髓情緒(pseudobulbar affect)(不切時宜地笑或哭)。抗膽鹼激導性醫藥及抗憂鬱劑可用於治療過度流涎症。抗膽鹼激導性醫藥實例包括格比平(glycopyrrolate)、東莨菪鹼(scopolamine)、阿托品(atropine)(Atropen)、顛茄生物鹼(belladonna alkaloids)、苯扎托品甲磺酸鹽(benztropine mesylate)(Cogentin)、克利銨(clidinium)、環戊醇胺酯(cyclopentolate)(Cyclogyl)、達非那新(darifenacin)(Enablex)、待克明(dicylomine)、費索羅定(fesoterodine)(Toviaz)、拉沃塞特(flavoxate)(Urispas)、格比平(glycopyrrolate)、升阿托品氫溴酸鹽(homatropine hydrobromide)、莨菪鹼(hyoscyamine)(Levsinex)、異丙托溴銨(ipratropium)(Atrovent)、鄰甲苯海明(orphenadrine)、奧昔布寧(oxybutynin)(Ditropan XL)、丙硫啉(propantheline)(Pro-banthine)、東莨菪鹼(scopolamine)、甲基東莨菪鹼(methscopolamine)、索非那新(solifenacin)(VESIcare)、噻托溴銨(tiotropium)(Spiriva)、托特羅定(tolterodine)(Detrol)、苯海索(trihexyphenidyl)、托司銨(trospium)、及苯海拉明(diphenhydramine) (Benadryl)。抗憂鬱劑實例包括選擇性血清素抑制劑、血清素-正腎上腺素再吸收抑制劑、血清素調控劑及刺激劑、血清素拮抗劑及再吸收抑制劑、正腎上腺素再吸收抑制劑、正腎上腺素-多巴胺再吸收抑制劑、三環抗憂鬱劑、四環抗憂鬱劑、單元胺氧化酶抑制劑、及NMDA受體拮抗劑。

該(等)額外醫療劑可以在投予初次劑量之包含膽汁酸或其醫藥上可接受之鹽(例如：TURSO)與苯基丁酸鹽化合物(例如：苯基丁酸鈉)之組成物之前投予一段時間，及/或在投予最後一劑該組成物之後投予一段時間。有些實施例中，本文所說明方法中之受試者過去曾接受一或多種額外醫療劑(例如：本文所說明任何額外醫療劑，如：利魯唑(riluzole)與依達拉奉(edavarone))治療。有些實施例中，在投予本揭露組成物之前，受試者已接受投予穩定劑量之該(等)醫療劑(例如：利魯唑及/或依達拉奉)至少30天 (例如：至少40天、50天、60天、90天、或120天)。該(等)額外醫療劑之吸收、代謝、及/或排泄可能受到膽汁酸或其醫藥上可接受之鹽及/或苯基丁酸鹽化合物之影響。例如：由苯基丁酸鈉與利魯唑或依達拉奉共同投藥，可能提高受試者曝露到利魯唑或依達拉奉。相較於單獨投予利魯唑時，由利魯唑與膽汁酸或其醫藥上可接受之鹽及苯基丁酸鹽化合物共同投藥時，可以改善受試者對利魯唑之耐受性。

膽汁酸或其醫藥上可接受之鹽、苯基丁酸鹽化合物、與一或多種額外醫療劑之組合對治療ALS具有協同效應。額外醫療劑當與膽汁酸或其醫藥上可接受之鹽、及苯基丁酸鹽化合物組合投藥時，可能需要較小劑量即可得到相同的醫藥效力。有些實施例中，相較於該(等)額外醫療劑單獨投藥時使用之劑量，與膽汁酸或其醫藥上可接受之鹽及苯基丁酸鹽化合物組合之該(等)額外醫療劑之投藥量可以減少至少約10% (例如：至少約15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、或55%)。另外或或者，本揭露方法可以減低其他醫療劑(例如：其他ALS醫療劑)所需之投藥頻率，即可得到相同醫療效力。

膽汁酸或其醫藥上可接受之鹽與苯基丁酸鹽化合物可以在用餐後不久(例如：用餐後2小時內)或在空腹條件下投藥。受試者可能在投予膽汁酸或其醫藥上可接受之鹽及/或苯基丁酸鹽化合物之前短於2小時攝取食物(例如：固體食物或液體食物)；或在投予一或兩種化合物後短於2小時攝取食物。食物項目可能影響膽汁酸或其醫藥上可接受之鹽及/或苯基丁酸鹽化合物之吸收速率及程度。例如：食物可能因延緩胃排空、刺激膽汁流、改變胃腸pH、增加內臟血流、改變物質之管腔代謝、或與劑型或物質的物理或化學交互作用，而改變化合物之生體可用率。餐食的營養素及熱量、餐食體積、及餐食溫度均會在GI道中造成生理變化，此變化方式會影響藥物通過時間、管腔溶解、藥物通透性、及全身可用性。通常，高熱量及高脂肪量的餐食比較容易影響GI生理，藉以對藥物之生體可用率造成較大影響。本文所提供方法可以進一步包括在投予膽汁酸或其醫藥上可接受之鹽、及/或苯基丁酸鹽化合物之前或之後，例如：短於2小時(例如：短於1.5小時、1小時、或0.5小時)，對受試者投予複數個食物項目。 實例

下列實例進一步詳細揭示額外實施例，其等僅供例示說明，無意以任何方式限制本揭露或申請專利範圍之範疇。 實例 1 ：評估供治療 ALS 之 AMX0035( 苯基丁酸鹽 (PB) 與牛磺二醇 (TURSO) 之固定組合 ) 之安全性、可耐受性、效力及活性

執行多中心、隨機化、雙盲、以安慰劑為對照之24週研究，來評估AMX0035(一種由3g 苯基丁酸鈉與1g TURSO構成之組合療法)之安全性、可耐受性、效力、藥物動力學、及生物活性。參加者依2：1比例隨機分配至接受AMX0035(一天投藥一次連續3週後，一天投藥兩次)或安慰劑。

主要療效指標•安全性與可耐受性之定義為可以維持試驗藥物直到計畫停止時的受試者比例。 •ALS功能評估量表(ALSFRS-R)之下降速率(下降斜率)。

次要療效指標•分析AMX0035對等長肌肉強度下降速率的影響，其係由肢體等長強度精確測試(ATLIS)所量測； •分析AMX0035對疾病演進之影響，其係由慢肺活量(SVC)下降所量測； •分析AMX0035對存活、住院、及氣管切開術之影響； •分析AMX0035對生物標記物之影響，包括磷酸化軸突神經元絲H次單位(pNF-H)含量及18 kDa轉位蛋白(TSPO)吸收；及 •在每天兩次投予4克之AMX0035後，分析TUDCA與苯基丁酸鹽在穩定態下之濃度-效應模式

納入標準1. 男性或女性，年齡18-80歲 2. 依據世界神經病學聯合會(World Federation of Neurology)修訂的EI愛斯科里奧標準之定義，確診為偶發性或家族性ALS 3. 從ALS症狀發病起短於或等於18個月 4. 可以提供知情同意書及遵循試驗程序 5. 地理位置上可以抵達試驗地點 6. 在篩檢訪診時的慢肺活量(SVC)大於依性別、身高及年齡預估值的60% 7. 在篩檢訪診之前，受試者必需未服用利魯唑或穩定劑量之利魯唑至少30天。未曾接受過利魯唑之受試者才容許參與試驗。 8. 有懷孕可能的婦女(例如：未曾停經至少一年或手術不孕者)必需同意在試驗期間及最後一劑試驗藥物後3個月內採取適當控制生育 a. 婦女必需在試驗期間及最後一劑試驗藥物後3個月內沒有懷孕的計畫 9. 男性必需同意在試驗期間及最後一劑試驗藥物後3個月內採取避孕 a. 男性必需在試驗期間及最後一劑試驗藥物後3個月內沒有當父親或捐精子的計畫

排除標準1. 正呈現氣管切開 2. 在篩檢訪診之前3個月內曝露到PB、TUDCA或UDCA，或在試驗過程期間計畫使用此等醫藥 3. 已知對PB或膽鹽過敏的病史 4. 異常肝功能，其定義為AST及/或ALT ＞ 正常上限值的3倍 5. 腎功效衰竭，其定義為 eGFR ＜ 60 mL/min/1.73m ²6. 篩檢訪診時的動脈高血壓控制不良(SBP＞160mmHg或DBP＞100mmHg) 7. 懷孕婦女或哺乳中的婦女 8. 有膽囊切除術病史 9. 阻礙膽汁流動之膽囊疾病，包括活性膽囊發炎、原發性膽硬化、硬化性膽管炎、膽囊癌、膽囊息肉、膽囊壞疽、膽囊膿腫 10.第III/IV類心臟衰竭病史(依據紐約心臟學會(New York Heart Association)- NYHA) 11.可能改變TUDCA之腸肝循環及吸收之嚴重胰臟或腸部病變，包括膽囊感染、胰臟炎、及迴腸切除 12.依據試驗主持人(Site Investigator)判斷，出現可能損害受試者提供知情同意書能力的不穩定精神疾病、認知損傷、失智或物質上癮 13.患有癌症的患者，但以下除外：基底細胞癌瘤或治療成功的皮膚鱗狀細胞癌瘤；原位頸椎癌瘤；原位攝護腺癌瘤；或已治癒且沒有疾病復發證據連續至少3年的其他惡性病 14.若參與本試驗可能對受試者產生風險的臨床上顯著的不穩定醫學病症(ALS除外) 15.篩檢訪診30天內主動參與評估實驗性小分子之ALS臨床試驗 16.在研究患有ALS之受試者之治療(仿單標示外使用(off-label use)或研究用)下，在任何時間曝露到任何細胞療法及基因療法 17.在研究患有ALS之受試者之治療(仿單標示外使用或研究用)下，從篩檢起90天內，曝露到單株抗體。若過去曾在研究ALS之治療下曝露到單株抗體，則需要在篩檢前有90天洗清期 18.植入橫膈節律系統(Diaphragm Pacing System) (DPS) 19.依試驗主持人的意見，任何可能增加受試者風險或阻礙受試者可能完全順應或完成試驗的事件 20.曝露到以下所列任何不允許的醫藥 a. 針對所有受試者均不允許的醫藥包括：HDAC抑制劑，包括丙戊酸鹽Valproate)、伏立諾他(Vorinostat)(Zolinza)、羅醚酯肽(Romidepsin)、西達本胺(Chidamide)、帕比司他(Panobinostat)、鋰、丁酸鹽(Butyrate)、及蘇拉明(Suramin)；丙磺舒(Probenecid)；膽汁酸鰲合劑，包括銷膽胺(cholestyramine與cholestyramine Light)、貴舒醇(Questran與Questran  Light)、威扣(Welchol)、考來替泊(Colestid)與加味考來替泊(Colestid Flavored)、及普拉利特(Prevalite) 結果

在基線時，安慰劑組與AMX0035治療組兩者類似，在人口統計學(性別、年齡、人種及種族，體重、身高及體質指數)與疾病特徵(從ALS診斷發病起的時間、從ALS症狀發病起的時間、利魯唑的使用、依達拉奉在基線上的時間、利魯唑在基線上的時間、ALS的家族病史、ALS發病部位、預估SVC %、ALSFRS-R小量表與總得分、及ATLIS小量表與總得分)上沒有統計上顯著差異。然而，在進入試驗時或之前，相較於AMX0035 治療組患者(25.8%)，安慰劑組有較多患者(50%)正接受依達拉奉(p=0.0078)。   主要療效

使用AMX0035治療會減慢ALSFRS-R得分的下降速率，其係一種日常活動力功能的量測值。活性藥物組與安慰劑組在改良式意圖治療群體(modified intent-to-treat(mITT) population)中所估測ALSFRS-R總得分之平均斜率分別為-1.24分/月與-1.66分/月(差值= 0.42分/月；95%可信區間[CI]，0.03至0.81；P=0.03) (圖1)。24週後，治療組與安慰劑組之間最小平方平均 ALSFRS-R總得分中估測2.32分絕對差值(依據48分量表)。   次要療效

如圖1所示，活性治療組相對於安慰劑，ATLIS總得分之平均下降速率分別為-3.03 PPN/月相對於-3.54 PPN/月(差值 = 0.51 PPN/月；95% CI，-0.12至1.14)。上肢及下肢ATLIS得分之平均下降速率之組間差值(活性治療組減安慰劑組)分別為0.77 PPN/月 (95% CI，0.03至1.52)與0.38 PPN/月 (95% CI，-0.40至1.16)。活性治療組相對於安慰劑組，SVC之平均下降速率分別為 -3.10 PPN/月相對於-4.03 PPN/月(差值= 0.93 PPN/月；95% CI，-0.10至1.95)。

活性藥物組相對於安慰劑組，針對死亡、氣管切開術、或住院之累積風險比值為0.53 (95% CI，0.27至1.05) (圖1)。   開放標籤擴展研究

當完成24週、平行組試驗期時，參加者有資格登記參與開放標籤擴展研究(Open Label Extension)(OLE)，其中參加者與醫師均保留原始處理組的盲處理。

分析隨機分配到試驗初期(ITT分析)的所有受試者的整體存活率，並由原始隨機分配至AMX0035之參加者與彼等隨機分配至安慰劑之參加者比較。原始隨機分配至AMX0035之參加者接受AMX0035之時間比彼等原始隨機分配至安慰劑之參加者增加中值4.8個月。彼等原始隨機分配至AMX0035者之死亡風險比彼等原始隨機分配至安慰劑者降低36%(HR 0.64；95% CI 0.42至0.94；P=0.048)。先前隨機分配至AMX0035者之中值存活期為23.5個月(95% CI 19.5至26.2個月)，而先前隨機分配至安慰劑者則為18.7個月(95% CI 13.5至24.4個月)。 實例 2 至 7 ：評估人類藥物轉運蛋白與六種試驗物之交互作用

實例2至7之目的為評估人類藥物轉運蛋白與六種作為外排轉運蛋白膽鹽輸出幫浦(Bile Salt Export Pump)(BSEP)之受質及/或抑制劑之試驗物之交互作用。

用於判斷試驗物是否為外排轉運蛋白之受質之標準為外排比值為 ＞2，及被已知抑制劑抑制＞50%。用於判斷試驗物是否為外排轉運蛋白之抑制劑之標準為探針受質淨外排活性受抑制 ＞25%；該抑制性應與試驗物之濃度具相關性。若觀察到抑制性時，則依據每種試驗物所採用之劑量估算一半最大抑制濃度(IC ₅₀)值。採用來自FDA指引(FDA guidance) (Food and Drug Administration, 2020)之適當R公式計算每種試驗物之藥物-藥物交互作用(DDI)可能性。 材料及方法

實例2至7採用下列材料及方法。 囊泡吸收過程

膜囊泡係由得自Genomembrane (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts)之表現BSEP蛋白質之感染桿狀病毒昆蟲細胞(baculovirus-infected insect cells (Sf9))製備。

取BSEP-轉染之Sf9膜囊泡解凍，使用前先置於濕冰上。取分析吸收緩衝液及膜囊泡，適當地與適當受質( ³H-牛磺膽酸，TCA)、抑制劑(環孢素 A)、或試驗物溶液合併，混合物加至96孔過濾盤的適當孔中(50 μg/孔)。過濾盤與腺苷三磷酸(ATP)及腺苷單磷酸(AMP)溶液於37°C下預培養5分鐘。添加ATP至過濾盤的適當孔中以啟動反應；添加AMP至陰性對照孔中至終濃度各為5 mM。過濾盤於37°C下培養30分鐘。添加低溫的洗滌緩衝液終止反應，過濾盤維持在濕冰上直到過濾。添加低溫的阻斷緩衝液至過濾盤上，並施加正壓。隨後使用冰冷的洗滌緩衝液洗滌過濾盤，培養基轉移至經過前處理的過濾盤，施加溫和正壓。使用低溫洗滌緩衝液洗滌過濾盤4次，添加乙醇至過濾盤，在環境溫度下溶離樣本至深孔96孔盤中10分鐘。從過濾盤萃取囊泡供LC-MS定量。樣本適當存放在-20°C下直到分析為止。 作為 BSEP 受質之試驗物之分析法

依據囊泡吸收過程，在媒劑或已知抑制劑之存在下，進行轉運蛋白對試驗物(濃度示於下表1)之腺苷三磷酸(ATP)-依賴性吸收。 表 1 ：

試驗物濃度 (μM)	試驗物濃度 (μM)
苯基丁酸鈉	1與10
苯基乙酸	1與10
苯基乙醯基-L-麩醯胺酸	1與10
牛磺熊去氧膽酸	1與10
熊去氧膽酸	1與10
甘胺熊去氧膽酸	1與10

其中包括探針受質在已知抑制劑之存在或不存在下之吸收性作為對照組。探針受質及選擇性抑制劑資訊示於下表2。 表 2 ： 外排轉運蛋白受質及抑制劑

轉運蛋白	探針受質 (μM)	選擇性抑制劑 (μM)
BSEP	3H-牛磺膽酸 (1)	環孢素 A (20)

作為 BSEP 抑制劑之試驗物之分析法

依據囊泡吸收過程，在a) 媒劑、b) 選擇性抑制劑、及c) 試驗物(濃度示於下表3)之存在下，進行轉運蛋白對標記放射性之探針受質之吸收。探針受質與選擇性抑制劑資訊綜合說明於表2。 表 3 ：

試驗物濃度 (μM)	試驗物濃度 (μM)
苯基丁酸鈉	25與250
苯基乙酸	750與7500
苯基乙醯基-L-麩醯胺酸	50與500
牛磺熊去氧膽酸	5與50
熊去氧膽酸	50與500
甘胺熊去氧膽酸	10與100

樣本判別

由試管/孔編號或盤位置與試驗編號、轉運蛋白、培養時間、試驗物/受質/抑制劑濃度、及供體/接受體適當交叉比對，獨特判別出樣本。 計算

外排轉運蛋白 ( 膜囊泡分析法：囊泡吸收 )   吸收活性速率 吸收活性速率(pmol/min/mg) = 其中： 含量 _囊泡每個孔中囊泡中受質或試驗物含量(pmol) 時間      培養時間(分鐘) 蛋白質  每個孔中總蛋白質(mg) ATP- 依賴性吸收活性 ATP-依賴性吸收活性= 吸收 _ATP- 吸收 _AMP 訊噪比 (SNR) SNR= 其中： 吸收 _ATP在ATP存在下之吸收(pmol/min/mg) 吸收 _AMP在AMP存在下之吸收(pmol/min/mg) 對吸收之抑制 殘留吸收百分比= 其中： 吸收 _{+ 抑制}受質或試驗物在抑制劑存在下之ATP-依賴性吸收，或受質在試驗物存在下之ATP-依賴性吸收(pmol/min/mg) 吸收 _{- 抑制}僅受質或試驗物之ATP-依賴性吸收(pmol/min/mg) 數據分析

統計分析法適當時僅限於敘述統計，如：平均值、標準偏差、相對標準偏差、及迴歸分析。 數據接受準則

當ATP-依賴性吸收超過媒劑或載體對照組的倍數 ≥4且選擇性抑制劑證實對探針受質吸收之抑制＞50%時，則認為膜囊泡外排系統具有完整功能。

若當ATP-依賴性吸收超過媒劑對照組的倍數 ≥2且選擇性抑制劑之抑制＞50%時，則判定該試驗物為受質。若對探針受質吸收之抑制＞25%時，則判定該試驗物為抑制劑。 實例 2 - 苯基丁酸鈉 為 BSEP 之 受質及 / 或抑制劑 之分析法

進行實驗來分析苯基丁酸鈉是否為BSEP之受質及/或抑制劑。在吸收樣本中未檢測到所投予之1及10 μM之苯基丁酸鈉，表示苯基丁酸鈉不為BSEP之受質。苯基丁酸鈉(25與250 μM)不為BSEP之抑制劑。 苯基丁酸鈉 之 溶解性 、 穩定性 、及 非特異結合性 溶解性

在所有試驗濃度下，試驗物苯基丁酸鈉於甲醇中溶解至50,000 μM，於分析緩衝液中溶解至250 μM，甲醇含量(v：v) 最終為0.5%。 穩定性

由25及250 μM苯基丁酸鈉含在玻璃小瓶中，在冷凍之前與冷凍一次後，及在冷凍與解凍後，取等份溶液在分析盤中測定穩定性3次。試驗物係在單獨轉運緩衝液中或在含0.002% PS-80或1% HAS下測試，分析回收率。數據示於下表4。在單獨轉運緩衝液中，苯基丁酸鈉在冷凍一次後或三次冷凍-解凍循環後之回收率為≥98.9%。在含0.002% PS-80之緩衝液中，苯基丁酸鈉在冷凍一次後之回收率為≥91.6%，及在三次冷凍-解凍循環後之回收率為≥95.3%。在含1% HAS之轉運緩衝液中，苯基丁酸鈉在冷凍一次後之回收率為≥90.5%，及在三次冷凍-解凍循環後之回收率為94.8%。 表 4 ： 苯基丁酸鈉在含 10 mM HEPES 之 HBSS ， pH 7.4 中使用或不使用賦形劑下於玻璃小瓶中冷凍後或 3 次冷凍 - 解凍循環後於分析盤中之穩定性

			回收百分比a
	苯基丁酸鈉 (µM)	玻璃小瓶	分析盤b
緩衝劑	標稱	實際a	1次冷凍-解凍	3次冷凍-   解凍循環
sHBSS	25	21.4	102	105
sHBSS	250	223	98.9	99.4
sHBSS + PS-80	25	22.4	105	100
sHBSS + PS-80	250	244	91.6	95.3
sHBSS + HSA	25	22.0	103	103
sHBSS + HSA	250	222	90.5	94.8

HBSS        漢克氏平衡鹽溶液(Hank’s Balanced Salt Solution) HEPES     N-(2-羥基乙基)哌𠯤-N′-(2-乙磺酸) HSA         1%人類血清白蛋白 PS-80        0.002% 聚山梨酸酯-80 sHBSS      含10 mM HEPES之HBSS，pH 7.4 a               兩重覆之平均值，除非另有其他說明 b              三重覆之平均值 非特異性結合

亦評估苯基丁酸鈉在沒有細胞存在下，對transwell分析盤之非特異結合性。取苯基丁酸鈉溶液(25與250 μM)置於transwell盤之上室(250 μL)或下室(700 μL)(供體室)，三重覆孔，相反的接受體室則為對應的空白緩衝液，於37°C下培養2小時。數據示於下表5。在單獨轉運緩衝液中，以上室到下室方向之回收率為≥107%，及以下室到上室方向為≥82.8%。在含0.002% PS-80之轉運緩衝液中，以上室到下室方向之回收率為≥110%，及以下室到上室方向為≥86.9%。在含1% HAS之轉運緩衝液中，以上室到下室方向之回收率為≥107%，及以下室到上室方向為≥92.8%。所有測試的緩衝液系統之穩定性及非特異結合性結果均類似，具有可接受之回收率。其他試驗物在含0.002% PS-80之轉運緩衝液中具有最佳回收率；因此此緩衝液亦用於苯基丁酸鈉分析條件。 表 5 ： 苯基丁酸鈉 在 transwell 盤 中在 沒有 Caco-2 細胞存在下 在 37°C 下培養 2 小時 後之 回收率

		回收百分比
		A到B	B到A
緩衝劑	處理	平均值a	SD	平均值a	SD
sHBSS	SP (25 µM)	129	1.98	95.3	2.38
sHBSS	SP(250 µM)	107	1.80	82.8	5.69
sHBSS + PS-80	SP (25 µM)	120	5.08	92.6	0.930
sHBSS + PS-80	SP (250 µM)	110	1.98	86.9	2.12
sHBSS + HSA	SP (25 µM)	120	1.26	96.9	0.962
sHBSS + HSA	SP(250 µM))	107	4.65	92.8	2.41

A到B    上室到下室方向 B到A    下室到上室方向 HSA      1%人類血清白蛋白 PS-80    0.002% 聚山梨酸酯-80 SD         標準偏差 sHBSS 含10 mM HEPES之HBSS，pH 7.4 SP          苯基丁酸鈉 a            三重覆之平均值 苯基丁酸鈉 為 BSEP 之受質 及 抑制劑 之分析法 ( 使用 膜囊泡 )

在單獨BSEP-轉染之Sf9膜囊泡中測試或在含BSEP抑制劑環孢素 A(20 µM)下測試苯基丁酸鈉(1及10 µM)之ATP-依賴性吸收，數據示於下表6。苯基丁酸鈉之劑量為1及10 µM，未在實驗樣本中檢測到，表示沒有發生吸收。苯基丁酸鈉不為BSEP之受質。 表 6 ： BSEP 膜囊泡對苯基丁酸鈉之 ATP- 依賴性吸收

BSEP受質 ³H-牛磺膽酸 (TCA)在單獨BSEP 囊泡中或在含環孢素A(20µM)或苯基丁酸鈉(25與250µM)下之ATP-依賴性吸收示於下表7。 ³H-牛磺膽酸之ATP-依賴性吸收活性平均值為25.0 pmol/分鐘/mg蛋白質，訊噪比41.9。在BSEP抑制劑環孢素 A之存在下， ³H-TCA吸收下降至2.85%。苯基丁酸鈉稍微抑制 ³H-TCA吸收，在25 µM下殘留77.2%活性，但該抑制性不依賴濃度變化，不符合判定為抑制劑之標準。 表 7 ： BSEP 膜囊泡在苯基丁酸鈉及選擇性抑制劑之不存在及存在下對 3 H- 牛磺膽酸之 ATP- 依賴性吸收

	吸收活性 (pmol/分鐘/mg蛋白質)	訊噪比	ATP-依賴性吸收活性(pmol/分鐘/mg蛋白質)	對照組百分比
處理	樣本	平均值a	平均值a	SD	平均值a	SD
對照組	Mg-ATP	25.6	41.9	8.50	25.0	5.21	100
	Mg-AMP	0.613
環孢素 A (20 µM)	Mg-ATP	1.25	2.32	0.753	0.713	0.407	2.85
	Mg-AMP	0.540
SP (25 µM)	Mg-ATP	19.9	35.9	7.30	19.3	4.04	77.2
	Mg-AMP	0.554
SP (250 µM)	Mg-ATP	21.3	31.6	3.29	20.6	2.22	82.4
	Mg-AMP	0.673

Mg-AMP             鎂-腺苷5´-單磷酸 Mg-ATP            鎂-腺苷5´-三磷酸 SD                  標準偏差 SP                   苯基丁酸鈉 a                      三重覆之平均值 實例 3 - 苯基乙酸作為 BSEP 之受質及 / 或抑制劑之分析法

進行實驗來分析苯基乙酸是否為BSEP之受質及/或抑制劑。苯基乙酸在1及10 μM下觀察到之腺苷三磷酸(ATP)-依賴性BSEP 吸收活性為腺苷單磷酸(AMP)吸收的 ＞2倍，但不受環孢素A抑制，表示苯基乙酸不為BSEP之受質。苯基乙酸(750與7500 μM)在7500 μM 下強力抑制探針受質被BSEP吸收，估測IC50 ＜7500 μM。 苯基乙酸 之 溶解性 、 穩定性 、及 非特異結合性 溶解性

在所有試驗濃度下，試驗物苯基乙酸於甲醇中溶解至1500 mM，於分析緩衝液中溶解至7500 mM，最終甲醇含量為0.5% (v：v)。 穩定性

由250及2500 μM苯基乙酸含在玻璃小瓶中，在冷凍之前與冷凍一次後，及在冷凍與解凍後，取等份溶液在分析盤中測定穩定性3次。試驗物係在單獨轉運緩衝液中或在含0.002% PS-80或1% HAS下測試，分析回收率。數據示於下表8。在單獨轉運緩衝液中，苯基乙酸在冷凍一次後或三次冷凍-解凍循環後之回收率為≥90.8%。在含0.002% PS-80之緩衝液中，苯基乙酸在250與2500 µM下冷凍一次後之回收率分別為96.1與54.7%，及三次冷凍-解凍循環後分別為77.9與57.7%。在濃度≤250 µM之此緩衝液中為可接受之回收率。在含1% HAS之轉運緩衝液中，苯基乙酸冷凍一次後之回收率為≥99.5%，及三次冷凍-解凍循環後為 ≥26.6%。 表 8 ：苯基乙酸在含 10 mM HEPES 之 HBSS ， pH 7.4 中在使用或不使用賦形劑下於玻璃小瓶中冷凍後或 3 次冷凍 - 解凍循環後於分析盤中之穩定性 回收百分比a 苯基乙酸 (µM)             玻璃小瓶               分析盤b

緩衝劑	標稱	實際a	1次冷凍-解凍	3次冷凍- 解凍循環
sHBSS	250	190	114	95.1
sHBSS	2500	679	90.8	99.8
sHBSS + PS-80	250	230	96.1	77.9
sHBSS + PS-80	2500	701	54.7	57.7
sHBSS + HSA	250	226	103	60.1
sHBSS + HSA	2500	796	99.5	26.6

HBSS       漢克氏平衡鹽溶液 HEPES     N-(2-羥基乙基)哌𠯤-N′-(2-乙磺酸) HSA         1%人類血清白蛋白 PS-80       0.002% 聚山梨酸酯-80 sHBSS     含10 mM HEPES之HBSS，pH 7.4 a               兩重覆之平均值，除非另有其他說明 b              三重覆之平均值 非特異性結合

未進行苯基乙酸在沒有細胞存在下對transwell分析盤之非特異結合性。然而，在Caco-2外排分析法中，於細胞之存在下，測定試驗物(1及10 µM)之回收率，結果為可以接受的。

依據穩定性結果，由苯基乙酸於含0.002% PS-80之轉運緩衝液中進行轉運蛋白分析。 苯基乙酸 作為 BSEP 之 受質 及 抑制劑 之分析法 ( 使用膜囊泡 )

由苯基乙酸(1及10 µM)在單獨BSEP-轉染之Sf9膜囊泡中測試或在含BSEP抑制劑環孢素 A(20 µM)下測試ATP-依賴性吸收，數據示於下表9。苯基乙酸在1及10 µM觀察到之ATP-依賴性吸收分別為24.2及814 pmol/分鐘/mg蛋白質，訊噪比分別為9.95及12.6。然而，在1及10 µM下，在抑制劑存在下之活性分別為對照組之75.6及94.9%。該抑制性不依賴濃度變化；因此苯基乙酸不太可能為BSEP之受質。 表 9 ： BSEP 膜囊泡對苯基乙酸之 ATP- 依賴性吸收 吸收活性                                                        ATP-依賴性吸收活性 (pmol/ 分鐘/mg 蛋白質) 訊噪比                                          (pmol/ 分鐘/mg 蛋白質)對照組百分比

處理	樣本	平均值a	平均值a	SD	平均值a	SD
PA (1 µM) PA (1 µM)	Mg-ATP Mg-AMP Mg-ATP	26.9 2.71b 25.9	9.95 3.41	1.54 0.732	24.2 18.3	4.16  5.56	100 75.6
+ 環孢素 (20 µM)	Mg-AMP	7.60c
PA (10 µM)	Mg-ATP	884	12.6	21.1	814	1480	100
	Mg-AMP	70.3
PA (10 µM)	Mg-ATP	857	10.1	15.8	772	1340	94.9
+ 環孢素 (20 µM)	Mg-AMP	84.7

Mg-AMP               鎂-腺苷5´-單磷酸 Mg-ATP                        鎂-腺苷5´-三磷酸 PA                     苯基乙酸 SD                     標準偏差 a                                三重覆之平均值，除非另有其他說明 b                                      單一重覆 c                                       兩重覆之平均值

BSEP 受質 ³H-TCA在單獨BSEP 囊泡中或在含環孢素 A(20 µM)或苯基丁酸鈉 (750及7500 µM)下之 ATP-依賴性吸收，示於下表10。 ³H-TCA之ATP-依賴性吸收活性平均值為4.69 pmol/分鐘/mg蛋白質，訊噪比為9.97。在BSEP抑制劑環孢素A之存在下， ³H-TCA吸收下降至3.49%。苯基乙酸抑制 ³H-TCA吸收，在750 µM下殘留99.6%活性，但在7500 µM下則殘留0.00%活性，估測IC50 ＜7500 µM。因此判定苯基乙酸為BSEP之抑制劑。 表 10 ： BSEP 膜囊泡在苯基乙酸及選擇性抑制劑之存在及不存在下對 3 H- 牛磺膽酸之 ATP- 依賴性吸收

	吸收活性 (pmol/分鐘/mg蛋白質)	訊噪比	ATP-依賴性吸收活性(pmol/分鐘/mg蛋白質)	對照組百分比
處理	樣本	平均值a	平均值a	SD	平均值a	SD
對照組	Mg-ATP	5.21	9.97	0.683	4.69	0.357	100
	Mg-AMP	0.523
環孢素 A (20 µM)	Mg-ATP	0.419	1.64	0.727	0.164	0.186	3.49
	Mg-AMP	0.255
PA (750 µM)	Mg-ATP	4.96	17.2	1.04	4.68	0.300	99.6
	Mg-AMP	0.288
PA (7500 µM)	Mg-ATP	0.370	0.731	0.305	-0.136	0.155	0.00b
	Mg-AMP	0.506

Mg-AMP                           鎂-腺苷5´-單磷酸 Mg-ATP                           鎂-腺苷5´-三磷酸 PA                      苯基乙酸 SD                      標準偏差 ^a三重覆之平均值 ^b負百分比係以零報告 實例 4 - 苯基乙醯基 -L- 麩醯胺酸作為 BSEP 之受質及 / 或抑制劑之分析法

進行實驗來分析苯基乙醯基-L-麩醯胺酸是否為BSEP之受質及/或抑制劑。苯基乙醯基-L-麩醯胺酸在1及10 μM未觀察到ATP-依賴性BSEP吸收活性，表示苯基乙醯基-L-麩醯胺酸不為BSEP之受質。苯基乙醯基-L-麩醯胺酸(50與500 μM)不為BSEP之抑制劑。 苯基乙醯基 -L- 麩醯胺酸 之 溶解性 、 穩定性 、及 非特異結合性 溶解性

取試驗物苯基乙醯基-L-麩醯胺酸於DMSO中溶解至100,000 µM。母液進一步從DMSO母液使用甲醇稀釋。

在所有試驗濃度下，苯基乙醯基-L-麩醯胺酸於分析緩衝液中溶解至500 µM，最終為0.5%(v：v)有機含量。 穩定性

由50及500 μM苯基乙醯基-L-麩醯胺酸含在玻璃小瓶中，在冷凍之前與冷凍一次後，及在冷凍與解凍後，取等份溶液在分析盤中測定穩定性3次。試驗物係於單獨轉運緩衝液中或在含0.002% PS-80或1% HAS下測試，分析回收率。數據示於下表11。在單獨轉運緩衝液中，苯基乙醯基-L-麩醯胺酸在冷凍一次後或三次冷凍-解凍循環後之回收率為≥95.0%。在含0.002% PS-80之緩衝液中，苯基乙醯基-L-麩醯胺酸冷凍一次後之回收率為≥96.3%，及在三次冷凍-解凍循環後之回收率為≥98.8%。在含1% HAS之轉運緩衝液中，苯基乙醯基-L-麩醯胺酸冷凍一次後之回收率為≥96.9%，及在三次冷凍-解凍循環後之回收率為≥106%。 表 11 ： 苯基乙醯基 -L- 麩醯胺酸在含 10 mM HEPES 之 HBSS ， pH 7.4 中使用或不使用賦形劑下在玻璃小瓶中冷凍後或 3 次冷凍 - 解凍循環後於分析盤中之穩定性 回收百分比a                  苯基乙醯基-L-麩醯胺酸(µM)      玻璃小瓶                分析盤b

緩衝劑	標稱	實際a	1次冷凍-解凍	3次冷凍-解凍循環
sHBSS	50	45.1	95.0	101
sHBSS	500	429	96.2	98.3
sHBSS + PS-80	50	46.5	96.3	98.8
sHBSS + PS-80	500	453	98.9	100
sHBSS + HSA	50	47.1	96.9	114
sHBSS + HSA	500	459	104	106

HBSS       漢克氏平衡鹽溶液 HEPES     N-(2-羥基乙基)哌𠯤-N′-(2-乙磺酸) HSA         1%人類血清白蛋白 PS-80       0.002% 聚山梨酸酯-80 sHBSS     含10 mM HEPES之HBSS，pH 7.4 a               兩重覆之平均值，除非另有其他說明 b              三重覆之平均值 非特異性結合

亦評估苯基乙醯基-L-麩醯胺酸在沒有細胞存在下對transwell分析盤之非特異結合性。取苯基乙醯基-L-麩醯胺酸溶液(50與500 µM)置入transwell盤之上室(250 µL)或下室(700 µL)(供體室)，三重覆孔，接受體室中為對應的空白緩衝液，於37°C下培養2小時。數據示於下表12。在單獨轉運緩衝液中，上室到下室方向之回收率為≥107%，及下室到上室方向為≥103%。在含0.002% PS-80之轉運緩衝液中，上室到下室方向之回收率為≥105%，及下室到上室方向為≥98.6%。在含1% HAS之轉運緩衝液中，上室到下室方向之回收率為≥106%，及下室到上室方向為≥99.4%。 表 12 ：苯基乙醯基 -L- 麩醯胺酸在 transwell 盤中在沒有 Caco-2 細胞存在下在 37°C 下培養 2 小時後之回收率 回收百分比 A 到B                       B 到A

緩衝劑	處理	平均值a	SD	平均值a	SD
sHBSS	PG (50 µM)	107	1.62	104	1.89
sHBSS	PG (500 µM)	110	1.19	103	2.05
sHBSS + PS-80	PG (50 µM)	105	1.22	98.6	1.54
sHBSS + PS-80	PG (500 µM)	108	3.17	101	0.0649
sHBSS + HSA	PG (50 µM)	106	0.619	99.4	3.09
sHBSS + HSA	PG (500 µM)	115	2.00	105	4.95

A到B        上室到下室方向 B到A               下室到上室方向 HAS          1%人類血清白蛋白 PG            苯基乙醯基-L-麩醯胺酸 PS-80        0.002% 聚山梨酸酯-80 SD            標準偏差 sHBSS       含10 mM HEPES之HBSS，pH 7.4 a                 三重覆之平均值

所有測試之緩衝劑系統之穩定性與非特異結合性結果均類似具有可接受之回收率。其他試驗物在含0.002% PS-80之轉運緩衝液中具有最佳回收率；因此，此緩衝液亦用於苯基乙醯基-L-麩醯胺酸分析條件。 苯基乙醯基 -L- 麩醯胺酸 作為 BSEP 之受質 及 抑制劑 之分析法 ( 使用膜囊泡 )

由苯基乙醯基-L-麩醯胺酸(1及10 µM)在單獨BSEP-轉染之Sf9膜囊泡中測試或在含BSEP抑制劑環孢素 A(20 µM)下測試ATP-依賴性吸收，數據示於下表13。在1及10 µM苯基乙醯基-L-麩醯胺酸下沒有觀察到ATP-依賴性吸收活性。此等數據顯示苯基乙醯基-L-麩醯胺酸不為BSEP之受質。 表 13 ： BSEP 膜囊泡對苯基乙醯基 -L- 麩醯胺酸之 ATP- 依賴性吸收 SD                  標準偏差 a                            三重覆之平均值，除非另有其他說明。 b                                   單一重覆 c                                    負值係以0.00報告

BSEP受質 ³H-TCA在單獨BSEP囊泡中或在含環孢素 A (20 µM)或苯基乙醯基-L-麩醯胺酸(50與500 µM)下之ATP-依賴性吸收示於下表14。 ³H-TCA之ATP-依賴性吸收活性平均值為15.4 pmol/分鐘/mg蛋白質，訊噪比25.5。在BSEP抑制劑環孢素A之存在下， ³H-TCA吸收下降至2.09%。苯基乙醯基-L-麩醯胺酸不會抑制 ³H-TCA吸收，在500 µM下殘留86.4%活性。 表 14 ： BSEP 膜囊泡在有及沒有苯基乙醯基 -L- 麩醯胺酸及選擇性抑制劑存在下對 3 H- 牛磺膽酸之 ATP- 依賴性吸收

	吸收活性 (pmol/分鐘/mg蛋白質)	訊噪比	ATP-依賴性吸收活性(pmol/分鐘/mg蛋白質)	對照組百分比
處理	樣本	平均值a	平均值a	SD	平均值a	SD
對照組	Mg-ATP	16.0	25.5	3.83	15.4	2.41	100
	Mg-AMP	0.630
環孢素 A (20 µM)	Mg-ATP	0.910	1.55	0.912	0.322	0.536	2.09
	Mg-AMP	0.588
PG (50 µM)	Mg-ATP	18.8	28.1	1.41	18.1	0.941	117
	Mg-AMP	0.667
PG (500 µM)	Mg-ATP	14.1	18.6	8.78	13.3	6.65	86.4
	Mg-AMP	0.758

Mg-AMP             鎂-腺苷5´-單磷酸 Mg-ATP            鎂-腺苷5´-三磷酸 NA                  不適用 PG                  苯基乙醯基-L-麩醯胺酸 SD                  標準偏差 a                      三重覆之平均值 實例 5 – 牛磺熊去氧膽酸作為 BSEP 之受質及 / 或抑制劑之分析法

進行實驗來分析牛磺熊去氧膽酸是否為BSEP之受質及/或抑制劑。牛磺熊去氧膽酸在1及10 μM之ATP-依賴性BSEP 吸收活性為AMP吸收的＞2倍，且被環孢素 A抑制，判定牛磺熊去氧膽酸為BSEP之受質。牛磺熊去氧膽酸(5及50 μM)強力抑制探針受質被BSEP吸收，估測IC50 ＜5 μM。 牛磺熊去氧膽酸 之 溶解性 、 穩定性 、及 非特異結合性 溶解性

在所有試驗濃度下，試驗物牛磺熊去氧膽酸於甲醇中溶解至10,000 µM，於分析緩衝液中溶解至50 µM，最終甲醇含量為0.5% (v：v)。 穩定性

由1及10 µM 牛磺熊去氧膽酸含在玻璃小瓶中，在冷凍之前與冷凍一次後，及在冷凍與解凍後，取等份溶液在分析盤中測定穩定性3次。試驗物於單獨轉運緩衝液中測試或在含0.002% PS-80或1% HAS下測試，以分析回收率。數據示於下表15。牛磺熊去氧膽酸在單獨轉運緩衝液中，冷凍一次後或三次冷凍-解凍循環後之回收率為≥77.7%。牛磺熊去氧膽酸在含0.002% PS-80之緩衝液中，冷凍一次後之回收率為≥108%，及三次冷凍-解凍循環後為≥106%。在含1%HSA之轉運緩衝液中，牛磺熊去氧膽酸在冷凍一次後之回收率為≥102%，及三次冷凍-解凍循環後為≥82.7%。 表 15 ： 牛磺熊去氧膽酸於玻璃小瓶中在含 10 mM HEPES 之 HBSS ， pH 7.4 中在使用或不使用賦形劑下在冷凍後或 3 次冷凍 - 解凍循環後於分析盤中之穩定性 回收百分比a           牛磺熊去氧膽酸(µM)            玻璃小瓶             分析盤b

緩衝劑	標稱	實際a	1次冷凍-解凍	3次冷凍- 解凍循環
sHBSS	1	1.04	77.7	91.4
sHBSS	10	7.32	101	103
sHBSS + PS-80	1	0.967	108	106
sHBSS + PS-80	10	9.50	108	109
sHBSS + HSA	1	1.15	107	100
sHBSS + HSA	10	12.7	102	82.7

HBSS              漢克氏平衡鹽溶液 HEPES            N-(2-羥基乙基)哌𠯤-N′-(2-乙磺酸) HSA                1%人類血清白蛋白 PS-80              0.002% 聚山梨酸酯-80 sHBSS            含10 mM HEPES之HBSS，pH 7.4 a                      兩重覆之平均值，除非另有其他說明 b                     三重覆之平均值 非特異性結合

亦評估牛磺熊去氧膽酸在沒有細胞存在下時，對transwell分析盤之非特異結合性。取牛磺熊去氧膽酸溶液(1及10 µM) 置於transwell盤之上室(250 μL)或下室(700 μL)(供體室)，三重覆孔，接受體室中為對應的空白緩衝液，於37°C下培養2小時。數據示於下表16。在單獨轉運緩衝液中，以上室到下室方向之回收率為≥112%，及以下室到上室方向為≥74.4%，表示當使用沒有賦形劑之緩衝液時，有些黏著在沒有細胞之塑膠上。在含0.002% PS-80之轉運緩衝液中，以上室到下室方向之回收率為≥136%，及以下室到上室方向為≥95.3%。在含1% HSA之轉運緩衝液中，以上室到下室方向之回收率為≥124%，及以下室到上室方向為≥69.3%。

依據穩定性與非特異結合性結果，於含0.002% PS-80之轉運緩衝液中進行之轉運蛋白分析法使牛磺熊去氧膽酸在分析條件下具有最佳回收率。 表 16 ：牛磺熊去氧膽酸在 transwell 盤中在沒有 Caco-2 細胞存在下於 37°C 下培養 2 小時後之回收率 回收百分比 A 到B                     B 到A

緩衝劑	處理	平均值a	SD	平均值a	SD
sHBSS	TA (1 µM)	112	2.44	74.4	9.21
sHBSS	TA (10 µM)	238	24.5	94.9	8.10
sHBSS + PS-80	TA (1 µM)	136	4.29	109	13.7
sHBSS + PS-80	TA (10 µM)	316	54.9	95.3	1.34
sHBSS + HSA	TA (1 µM)	137	2.50	84.4b	NA
sHBSS + HSA	TA (10 µM)	124	9.82	69.3	1.89

A到B         上室到下室方向 B到A         下室到上室方向 HSA           1%人類血清白蛋白 NA             不適用 PS-80         0.002% 聚山梨酸酯-80 SD            標準偏差 sHBSS       含10 mM HEPES之HBSS，pH 7.4 TA             牛磺熊去氧膽酸 a                三重覆之平均值 b                  單一可定量之重覆 牛磺熊去氧膽酸作為 BSEP 之受質及抑制劑之分析法 ( 使用膜囊泡 )

由牛磺熊去氧膽酸(1及10 µM)在BSEP-轉染之Sf9膜囊泡中單獨測試或在含BSEP抑制劑環孢素 A(20 µM)下測試ATP-依賴性吸收，數據示於下表17。牛磺熊去氧膽酸在1及10 µM下之ATP-依賴性吸收活性平均值分別為14.4與22.4 pmol/分鐘/mg蛋白質，訊噪比分別為AMP 對照組之3.94倍及10.6倍。環孢素 A 處理造成BSEP活性殘留≤12.6%。此等數據顯示牛磺熊去氧膽酸係主動轉運，且為BSEP之受質。 表 17 ： BSEP 膜囊泡對牛磺熊去氧膽酸之 ATP- 依賴性吸收 吸收活性                                                   ATP-依賴性吸收活性 (pmol/ 分鐘/mg 蛋白質) 訊噪比                                           (pmol/ 分鐘/mg 蛋白質)

處理	樣本	平均值a	平均值a	SD	平均值a	SD	對照組 百分比
TA (1 µM) TA (1 µM)	Mg-ATP Mg-AMP Mg-ATP	19.3b 4.90c BLQ	3.94 NA	NA NA	14.4 NA	10.5 NA	100 NA
+ 環孢素 (20 µM)	Mg-AMP	BLQ
TA (10 µM)	Mg-ATP	24.7	10.6	7.52	22.4	17.5	100
	Mg-AMP	2.33
TA (10 µM)	Mg-ATP	6.79	1.71	0.168	2.81	0.670	12.6
+ 環孢素 (20 µM)	Mg-AMP	3.98

BLQ                      低於定量限值 Mg-AMP              鎂-腺苷5´-單磷酸 Mg-ATP               鎂-腺苷5´-三磷酸 NA                        不適用 SD                        標準偏差 TA                        牛磺熊去氧膽酸 a                           三重覆之平均值，除非另有其他說明 b                          單一重覆 c                           兩重覆之平均值

BSEP受質 ³H-TCA於單獨BSEP囊泡中或在含環孢素 A (20 µM)或牛磺熊去氧膽酸(5及50 µM)下之ATP-依賴性吸收示於下表18。 ³H-TCA之ATP-依賴性吸收活性平均值為14.5 pmol/分鐘/mg蛋白質，訊噪比為28.3。在BSEP抑制劑環孢素A之存在下時， ³H-TCA 吸收下降至4.88%。牛磺熊去氧膽酸抑制 ³H-TCA吸收，在50 µM下殘留5.14%活性；估測IC ₅₀為 ＜5 µM。 表 18 ： BSEP 膜囊泡在有及沒有牛磺熊去氧膽酸及選擇性抑制劑存在下對 3 H- 牛磺膽酸之 ATP- 依賴性吸收

	吸收活性 (pmol/分鐘/mg蛋白質)	訊噪比	ATP-依賴性吸收活性(pmol/分鐘/mg蛋白質)
處理	樣本	平均值a	平均值a	SD	平均值a	SD	對照組百分比
對照組	Mg-ATP	15.1b	28.3b	NA	14.5b	NA	100
	Mg-AMP	0.531
環孢素 A (20 µM)	Mg-ATP	1.17b	2.55b	NA	0.708b	NA	4.88
	Mg-AMP	0.458
TA (5 µM)	Mg-ATP	7.45b	10.1b	NA	6.71	NA	46.2
	Mg-AMP	0.737
TA (50 µM)	Mg-ATP	1.30	2.34	0.709	0.747	0.394	5.14
	Mg-AMP	0.556

Mg-AMP             鎂-腺苷5´-單磷酸 Mg-ATP            鎂-腺苷5´-三磷酸 NA                  不適用 SD                  標準偏差 TA                  牛磺熊去氧膽酸 a                      三重覆之平均值，除非另有其他說明 b                     兩重覆之平均值 實例 6 – 熊去氧膽酸作為 BSEP 之受質及 / 或抑制劑之分析法

進行實驗來分析熊去氧膽酸是否為BSEP之受質及/或抑制劑。熊去氧膽酸在1及10 μM下之ATP-依賴性BSEP吸收比AMP樣本之吸收高＜2倍，其顯示該試驗物不為BSEP之受質。熊去氧膽酸(50及500 μM)抑制探針受質被BSEP吸收，估測IC50 ＜500 μM。 熊去氧膽酸之溶解性、穩定性、及非特異結合性 溶解性

在所有試驗濃度下，試驗物熊去氧膽酸於甲醇中溶解至100,000 µM及於分析緩衝液中溶解至500 µM，最終甲醇含量為0.5% (v：v)。 穩定性

由1及10 µM 熊去氧膽酸含在玻璃小瓶中，在冷凍之前與冷凍一次後，及在冷凍與解凍後，取等份溶液在分析盤中測定穩定性3次。試驗物於單獨轉運緩衝液中測試或在含0.002% PS-80或1% HAS下測試，以分析回收率。數據示於下表19。在單獨轉運緩衝液中，熊去氧膽酸在冷凍一次後或三次冷凍-解凍循環後之回收率為≥85.8%。在含0.002% PS-80之緩衝液中，熊去氧膽酸冷凍一次後之回收率為110%，及三次冷凍-解凍循環後為≥98.4%。在含1% HSA之轉運緩衝液中，熊去氧膽酸冷凍一次後之回收率為≥95.0%，及三次冷凍-解凍循環後為≥89.8%。 表 19 ：熊去氧膽酸於玻璃小瓶中在含 10 mM HEPES 之 HBSS ， pH 7.4 中在使用或不使用賦形劑下在冷凍後或 3 次冷凍 - 解凍循環後於分析盤中之穩定性 回收百分比a

	熊去氧膽酸	(µM)	玻璃小瓶	分析盤b
緩衝劑	標稱	實際a	1 次冷凍-解凍	3次冷凍- 解凍循環
sHBSS	1	1.15	96.1	85.8
sHBSS	10	10.3	92.9	95.5
sHBSS + PS-80	1	0.884	110	98.4
sHBSS + PS-80	10	8.45	110	101
sHBSS + HSA	1	0.935	95.0	98.6
sHBSS + HSA	10	7.88	98.1	89.8

HBSS             漢克氏平衡鹽溶液 HEPES           N-(2-羥基乙基)哌𠯤-N′-(2-乙磺酸) HSA               1%人類血清白蛋白 PS-80             0.002% 聚山梨酸酯-80 sHBSS           含10 mM HEPES之HBSS，pH 7.4 a                     兩重覆之平均值，除非另有其他說明 b                    三重覆之平均值 非特異性結合

亦評估熊去氧膽酸在沒有細胞存在下對transwell分析盤之非特異結合性。取熊去氧膽酸溶液(1及10 µM)置於transwell盤之上室(250 μL)或下室(700 μL)(供體室)，三重覆孔。接受體室中為對應的空白緩衝液，於37°C下培養2小時。數據示於下表20。在單獨轉運緩衝液中，以上室到下室方向之回收率為≥118%，及以下室到上室方向為≥84.8%。在含0.002% PS-80之轉運緩衝液中，以上室到下室方向之回收率為≥104%，及以下室到上室方向為≥96.9%。在含1% HSA之轉運緩衝液中，以上室到下室方向之回收率為≥107%，但以下室到上室方向的上室中檢測不到試驗物。 表 20 ：熊去氧膽酸於 transwell 盤中在沒有 Caco-2 細胞存在下在 37°C 下培養 2 小時後之回收率 回收百分比 A 到B                       B 到A

緩衝劑	處理	平均值a	SD	平均值a	SD
sHBSS	UA (1 µM)	118	9.07	84.8	2.02
sHBSS	UA (10 µM)	126	10.6	93.5	2.32
sHBSS + PS-80	UA (1 µM)	121	19.7	96.9	11.5
sHBSS + PS-80	UA (10 µM)	104	6.49	106	11.8
sHBSS + HSA	UA (1 µM)	107b	NA	NAc	NA
sHBSS + HSA	UA (10 µM)	117b	NA	NAc	NA

A到B        上室到下室方向 B到A        下室到上室方向 HAS         1%人類血清白蛋白 NA           不適用 PS-80       0.002% 聚山梨酸酯-80 SD            標準偏差 sHBSS      含10 mM HEPES之HBSS，pH 7.4 UA           熊去氧膽酸 a             三重覆之平均值，除非另有其他說明b             兩重覆之平均值 c             無法計算Papp值，因為接受體室樣本低於定量限值

依據穩定性及非特異結合性結果，在含0.002% PS-80之轉運緩衝液中進行之轉運蛋白分析法使熊去氧膽酸在分析條件下具有最佳回收率。 熊去氧膽酸作為 BSEP 之受質及抑制劑之分析法 ( 使用膜囊泡 )

熊去氧膽酸(1及10 µM)在單獨BSEP-轉染之Sf9膜囊泡中測試或在含BSEP抑制劑環孢素A(20 µM)下測試ATP-依賴性吸收，數據示於下表21。熊去氧膽酸在1 µM下未檢測到ATP-依賴性吸收活性平均值。來自單一重覆之10 µM下ATP-依賴性吸收活性為0.792 pmol/分鐘/mg蛋白質，訊噪比僅為AMP 對照組之1.26倍。此等數據顯示熊去氧膽酸不為BSEP之受質。 表 21 ： BSEP 膜囊泡對熊去氧膽酸之 ATP- 依賴性吸收

BSEP受質 ³H-TCA在單獨BSEP囊泡中或含環孢素 A(20 µM)或熊去氧膽酸(50與500 µM)下之ATP-依賴性吸收示於下表22。 ³H-TCA之ATP-依賴性吸收活性平均值為9.43 pmol/分鐘/mg蛋白質，訊噪比為21.0。在BSEP抑制劑環孢素A之存在下， ³H-TCA吸收下降至4.39%。熊去氧膽酸抑制 ³H-TCA吸收，在50 µM下殘留64.0%活性，及在500 µM下殘留4.50%，估測IC ₅₀＜500 µM。 表 22 ： BSEP 膜囊泡在有及沒有熊去氧膽酸及選擇性抑制劑存在下對 3 H- 牛磺膽酸之 ATP- 依賴性吸收

	吸收活性 (pmol/分鐘/mg蛋白質)	訊噪比	ATP-依賴性吸收活性(pmol/分鐘/mg蛋白質)
處理	樣本	平均值a	平均值a	SD	平均值a	SD	對照組百分比
對照組	Mg-ATP	9.90	21.0	4.15	9.43	1.95	100
	Mg-AMP	0.470
環孢素 A (20 µM)	Mg-ATP	0.820	2.02	0.434	0.414	0.176	4.39
	Mg-AMP	0.406
UA (50 µM)	Mg-ATP	6.73	9.66	0.653	6.04	0.455	64.0
	Mg-AMP	0.697
UA (500 µM)	Mg-ATP	0.873	1.95	0.231	0.425	0.104	4.50
	Mg-AMP	0.449

Mg-AMP             鎂-腺苷5´-單磷酸 Mg-ATP            鎂-腺苷5´-三磷酸 SD                  標準偏差 UA                  熊去氧膽酸 a                      三重覆之平均值 實例 7 - 甘胺熊去氧膽酸作為 BSEP 之受質及 / 或抑制劑之分析法

進行實驗來分析甘胺熊去氧膽酸是否作為BSEP之受質及/或抑制劑。甘胺熊去氧膽酸在1及10 μM下之ATP-依賴性BSEP 吸收活性為AMP吸收之＞2倍，且被環孢素A抑制，判定甘胺熊去氧膽酸為BSEP之受質。甘胺熊去氧膽酸(10及100 μM)強力抑制探針受質被BSEP吸收，估測IC50 ＜10 μM。 甘胺熊去氧膽酸之溶解性、穩定性、及非特異結合性 溶解性

在所有試驗濃度下，試驗物甘胺熊去氧膽酸於甲醇中溶解至50,000 µM，及於分析緩衝液中溶解至100 µM，最終甲醇含量為0.5% (v：v)。 穩定性

由1及10 µM 甘胺熊去氧膽酸含在玻璃小瓶中，在冷凍之前與冷凍一次後，及在冷凍與解凍後，取等份溶液在分析盤中測定穩定性三次。試驗物於單獨轉運緩衝液中測試或在含0.002% PS-80或1% HAS下測試，以分析回收率。數據示於下表23。在單獨轉運緩衝液中，甘胺熊去氧膽酸在冷凍一次後或三次冷凍-解凍循環後之回收率為≥84.1%。在含0.002% PS-80之緩衝液中，甘胺熊去氧膽酸冷凍一次後之回收率為≥99.8%，及三次冷凍-解凍循環後為≥107%。在含1% HSA之轉運緩衝液中，添加的溶液為預期濃度的大約兩倍；由此使甘胺熊去氧膽酸在冷凍一次後之回收率為≥94.8%，及三次冷凍-解凍循環後為≥98.4%。 表 23 ：甘胺熊去氧膽酸於玻璃小瓶中在含 10 mM HEPES 之 HBSS ， pH 7.4 中在使用或不使用賦形劑下在冷凍後或 3 次冷凍 - 解凍循環後於分析盤中之穩定性 回收百分比a                                  甘胺熊去氧膽酸(µM)            玻璃小瓶             分析盤b

緩衝劑	標稱	實際a	1 次冷凍-解凍	3 次冷凍- 解凍循環
sHBSS	1	0.765	84.1	93.8
sHBSS	10	9.67	111	132
sHBSS + PS-80	1	0.818	99.8	107
sHBSS + PS-80	10	7.49	120	137
sHBSS + HSA	1	1.96	101	100
sHBSS + HSA	10	21.3	94.8	98.4

HBSS       漢克氏平衡鹽溶液 HEPES     N-(2-羥基乙基)哌𠯤-N′-(2-乙磺酸) HSA         1%人類血清白蛋白 PS-80       0.002% 聚山梨酸酯-80 sHBSS     含10 mM HEPES之HBSS，pH 7.4 a               兩重覆之平均值，除非另有其他說明 b              三重覆之平均值 非特異性結合

亦評估甘胺熊去氧膽酸在沒有細胞存在下對transwell分析盤之非特異結合性。取甘胺熊去氧膽酸溶液(1及10 µM)置於transwell盤之上室(250 μL)或下室(700 μL)(供體室)，三重覆孔，接受體室中為對應的空白緩衝液，於37°C下培養2小時。數據示於下表24。在單獨轉運緩衝液中，以上室到下室方向之回收率為≥138%，及以下室到上室方向為≥85.3%。在含0.002% PS-80之轉運緩衝液中，以上室到下室方向之回收率為≥81.7%，及以下室到上室方向為≥99.1%。在含1% HSA之轉運緩衝液中，以上室到下室方向之回收率為≥140%，及以下室到上室方向為≥68.4%。 表 24 ： 甘胺熊去氧膽酸 在 transwell 盤 中在沒有 Caco-2 細胞存在下於 37°C 下培養 2 小時 後之 回收率 回收百分比 A 到B                       B 到A

緩衝劑	處理	平均值a	SD	平均值a	SD
sHBSS	GA (1 µM)	138	1.27	102	9.23
sHBSS	GA (10 µM)	169	18.6	85.3	1.88
sHBSS + PS-80	GA (1 µM)	81.7	50.5	110	0.993
sHBSS + PS-80	GA (10 µM)	170	11.9	99.1	1.51
sHBSS + HSA	GA (1 µM)	150	4.00	116	3.67
sHBSS + HSA	GA (10 µM)	140	15.2	68.4	1.35

A到B                  上室到下室方向 B到A                  下室到上室方向 GA                     甘胺熊去氧膽酸 HSA             1%人類血清白蛋白 PS-80           0.002% 聚山梨酸酯-80 SD                標準偏差 sHBSS          含10 mM HEPES之HBSS，pH 7.4 a                    三重覆之平均值

依據穩定性與非特異結合性結果，在含0.002% PS-80之轉運緩衝液中進行之轉運蛋白分析法使甘胺熊去氧膽酸在分析條件下具有最佳回收率。 甘胺熊去氧膽酸作為 BSEP 之受質及抑制劑之分析法 ( 使用膜囊泡 )

由甘胺熊去氧膽酸(1及10 µM)在單獨BSEP-轉染之Sf9膜囊泡中測試或在含BSEP抑制劑環孢素A (20 µM)下測試ATP-依賴性吸收，數據示於下表25。甘胺熊去氧膽酸在1及10 µM下之ATP-依賴性吸收活性平均值分別為11.2及14.2 pmol/分鐘/mg蛋白質。因為AMP培養低於定量限值，無法測得訊噪比。在經過環孢素 A 處理後發現，沒有殘留的BSEP活性。此等數據顯示甘胺熊去氧膽酸為主動轉運，且為BSEP之受質。 表 25 ： BSEP 膜囊泡對甘胺熊去氧膽酸之 ATP- 依賴性吸收

BSEP受質 ³H-TCA在單獨BSEP囊泡中或在含環孢素 A (20 µM)或甘胺熊去氧膽酸(10及100 µM)下之ATP-依賴性吸收示於下表26。 ³H-TCA之ATP-依賴性吸收活性平均值為17.7 pmol/分鐘/mg蛋白質，訊噪比為19.2。在BSEP抑制劑環孢素A之存在下， ³H-TCA吸收下降至3.64%。甘胺熊去氧膽酸抑制 ³H-TCA吸收，在100 µM下殘留10.4%活性；估測IC ₅₀為＜10 µM。 表 26 ： BSEP 膜囊泡在有及沒有甘胺熊去氧膽酸及選擇性抑制劑存在下對 3 H- 牛磺膽酸之 ATP- 依賴性吸收

	吸收活性 (pmol/分鐘/mg蛋白質)	訊噪比	ATP-依賴性吸收活性(pmol/分鐘/mg蛋白質)
處理	樣本	平均值a	平均值a	SD	平均值a	SD	對照組百分比
對照組	Mg-ATP	18.7	19.2	1.80	17.7	1.75	100
	Mg-AMP	0.972
環孢素 A (20 µM)	Mg-ATP	1.29	2.00	1.12	0.645	0.728	3.64
	Mg-AMP	0.648
GA (10 µM)	Mg-ATP	9.35	11.9	1.20	8.56	0.944	48.3
	Mg-AMP	0.788
GA (100 µM)	Mg-ATP	2.81	2.89	0.346	1.84	0.337	10.4
	Mg-AMP	0.974

GA                         甘胺熊去氧膽酸 Mg-AMP                    鎂-腺苷5´-單磷酸 Mg-ATP                    鎂-腺苷5´-三磷酸 SD                         標準偏差 a                             三重覆之平均值 結論

如上述實例所示，苯基丁酸鈉不被判定為BSEP轉運蛋白之受質。苯基丁酸鈉 (25及250 µM)不會抑制BSEP轉運蛋白。苯基乙酸(1及10 µM)不被判定為BSEP轉運蛋白之受質。苯基乙酸(750及7500 µM)會抑制BSEP，顯示有可能產生藥物-藥物交互作用。苯基乙醯基-L-麩醯胺酸不為BSEP轉運蛋白之受質(1及10 µM)，亦不為抑制劑(50及500 µM)。牛磺熊去氧膽酸(1及10 µM)為BSEP轉運蛋白之受質。牛磺熊去氧膽酸(5及50 µM)會抑制BSEP。BSEP抑制性交互作用可能產生藥物-藥物交互作用。熊去氧膽酸(1及10 µM)不為BSEP轉運蛋白之受質。熊去氧膽酸(50及500 µM)會抑制探針受質被BSEP吸收。甘胺熊去氧膽酸(1及10 µM)為BSEP轉運蛋白之受質。甘胺熊去氧膽酸(10及100 µM)會抑制BSEP轉運蛋白，顯示有可能產生藥物-藥物交互作用。

無

圖1為綜合說明主要及次要療效的圖示及表格。

無

Claims (16)

1. 一種治療受試者中至少一種肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(Amyotrophic Lateral Sclerosis，ALS)症狀之方法，該方法包括： (a)     對已接受第一劑量膽鹽外排幫浦(bile salt efflux pump，BSEP)之抑制劑之受試者投予組成物，該組成物包含約1克牛磺二醇(TURSO)及約3克苯基丁酸鈉， (b)     在來自該受試者之第一個生物樣本中測定或已測定血清轉胺酶及/或膽紅素之第一含量，及 (c)      對該受試者投予第二劑量BSEP之抑制劑，其中該第二劑量低於該第一劑量。
2. 如請求項1之方法，其中該BSEP之抑制劑為環孢素。
3. 如請求項2之方法，其中該環孢素之該第一劑量為約0.5至約15 mg/kg/天。
4. 如請求項1至3中任一項之方法，其進一步包括步驟(d)，在來自該受試者之第二個生物樣本中測定或已測定血清轉胺酶及/或膽紅素之第二含量。
5. 如請求項4之方法，其中該血清轉胺酶及/或膽紅素之該第二含量低於該第一含量。
6. 如請求項1至5中任一項之方法，其中該生物樣本為血漿或血清樣本。
7. 如請求項1至6中任一項之方法，其中該TURSO之投藥量為每天約1至約2克(含1克及2克)。
8. 如請求項1至7中任一項之方法，其中該苯基丁酸鈉之投藥量為每天約3至約6克(含3克及6克)。
9. 如請求項1至8中任一項之方法，其中該TURSO之投藥量為約1克，一天一次。
10. 如請求項1至8中任一項之方法，其中該TURSO之投藥量為約1克，一天兩次。
11. 如請求項1至10中任一項之方法，其中該苯基丁酸鈉之投藥量為約3克，一天一次。
12. 如請求項1至10中任一項之方法，其中該苯基丁酸鈉之投藥量為約3克，一天兩次。
13. 如請求項1至12中任一項之方法，其中該組成物係經口或透過餵食管投予該受試者。
14. 如請求項1至13中任一項之方法，其中該受試者經診斷患有ALS。
15. 如請求項1至13中任一項之方法，其中該受試者疑似患有ALS。
16. 如請求項1至15中任一項之方法，其中該受試者為人類。