TW202409562A - 用於偵測分析物的弱酸免疫分析 - Google Patents

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約書亞 齊爾斯特拉
吉安 奧利維拉薩姆納
麥可 帕瑞奇
陳繼華
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Abstract

本發明提供用於減少干擾對分析物之偵測及定量之影響的免疫分析，分析物包括但不限於細胞介素、酶、抗體及其他，其藉由使樣品酸化且允許酸化樣品中之分析物與相應捕捉試劑結合而不中和來達成。

Description

用於偵測分析物的弱酸免疫分析
本發明係關於用於偵測及定量分析物(包括但不限於細胞介素、酶、抗體等)的免疫分析。
免疫分析為廣泛使用的生物分析方法，其基於分析物與抗體的相互作用來量測溶液中之自小分子至大分子範圍內之分析物的存在或濃度。免疫分析在生命科學研究及醫藥學分析(諸如疾病診斷、治療藥物監測以及臨床藥物動力學及生物等效性)中發揮重要作用。
干擾分析的特定內源組分會影響對複雜基質(諸如血清)進行的配位體結合分析之效能(Zhong, Z. D.等人, AAPS J, 19:1564 (2017))。對免疫分析的干擾會導致實驗室對患者結果產生曲解且導致醫師提供錯誤的治療過程(Tate, J.等人, Clin Biochem Rev. 2004, 25(2): 105-120)。對於一些分析物而言，由於分析物的固有特徵以及生物樣品中之內源組分與外源組分的複雜相互作用，因此挑戰甚至更大。市售方法受到程序複雜、不耐受干擾及靈敏度低的限制。
因此，此項技術中需要一種更靈敏、更可靠及更有效的分析及方法來偵測及定量分析物，同時避免或最小化干擾。
已使用酸性緩衝液(詳言之，具有極低pH的緩衝液)自複合物中解離分子。舉例而言，通常使用pH約2.0的溶離緩衝液自純化管柱溶離親和標記抗體。然而，低pH條件可改變蛋白質的構形且消除其功能，即使在含有蛋白質的緩衝液被中和之後。本揭示案中的發明係基於如下驚人的發現：弱酸性條件可使樣品中的所關注分析物與其他干擾分子解離，且捕捉試劑(例如抗體)在弱酸性條件下仍可結合至分析物，從而允許在分析中偵測分析物而不必中和樣品(換言之，將鹼性溶液添加至酸化樣品中以使樣品的pH提高至例如中性pH)。
在一些範疇內，本發明提供偵測樣品中之分析物的方法，包括以下步驟：(i)用弱酸稀釋包含該分析物的樣品以產生酸化樣品；(ii)將酸化樣品直接添加至固體載體中而不中和酸化樣品，其中該固體載體經可結合至該分析物的捕捉試劑塗覆；(iii)在第一培育時段之後自固體載體移除酸化樣品；(iv)將偵測試劑直接添加至固體載體中；(v)在第二培育時段之後自固體載體移除偵測試劑；以及(vi)偵測結合至被捕捉試劑捕捉之分析物的偵測試劑，其中所偵測之偵測試劑的數量與樣品中之分析物的數量相關。此等方法使用固體載體，其中該固體載體經捕捉試劑預塗覆。
方法可進一步包括在自固體載體移除酸化樣品之後，洗滌固體載體。方法可包括在自固體載體移除偵測試劑之後，洗滌固體載體。
在一些範疇內，本發明提供偵測樣品中之分析物的方法，包括以下步驟：(i)用弱酸稀釋包含該分析物的樣品以產生酸化樣品；(ii)將捕捉試劑添加至酸化樣品中而不中和酸化樣品，其中該捕捉試劑特異性結合至該分析物；(iii)將包含酸化樣品及捕捉試劑的混合物添加至固體載體中，其中該固體載體特異性結合至該捕捉試劑；(iv)在第一培育時段之後，自固體載體移除酸化樣品與捕捉試劑的混合物；(vi)將偵測試劑直接添加至固體載體中；(vii)在第二培育時段之後，自固體載體移除偵測試劑；以及(viii)偵測結合至被捕捉試劑捕捉之分析物的偵測試劑，其中所偵測之偵測試劑的數量與樣品中之分析物的數量相關。此等方法使用固體載體，其中固體載體未經捕捉試劑預塗覆且其中捕捉試劑在與酸化樣品中的分析物結合之後，結合至固體載體。
分析物可為IL2Rγ、EGFR、對利尿鈉肽受體1 (NPR1)具有特異性之人類IgG4抗體(AbA)、針對抗NPR1抗體AbA (AbB)之人類單價單株抗體，或因子XI。
樣品可為選自由以下組成之群的生物體液：血液、血清、血漿、腦脊髓液(CSF)、尿液及唾液。
樣品來自患有疾病或病症之個體。樣品可來自疑似患有疾病或病症之個體。
樣品可來自被投予藥物及/或藥品的個體。
樣品可稀釋至少3倍。
酸化樣品可具有約3.0至6.5之pH。酸化樣品可具有約4.1、約4.4或約4.5之pH。
弱酸可為在水溶液中不能完全解離成其離子的酸，其選自由乙酸、檸檬酸、甲酸、乳酸、磷酸及PIPES組成之群。
樣品可酸化5至120分鐘。
捕捉試劑可為抗體。捕捉試劑抗體可選自由以下組成之群：多株抗體、單株抗體、雙特異性抗體、Fab片段、F(ab')2片段、單特異性F(ab')2片段、雙特異性F(ab')2、三特異性F(ab')2、單價抗體、scFv片段、雙功能抗體、雙特異性雙功能抗體、三特異性雙功能抗體、scFv-Fc、微型抗體、IgNAR、v-NAR、hcIgG及vhH。
捕捉試劑可以≤1μM、≤100 nM、≤50 nM、≤25 nM、≤20 nM、≤15 nM、≤10 nM、≤5 nM、≤2 nM、≤1 nM、≤0.1 nM、≤0.01 nM或≤0.001 nM之解離常數(K D)值結合分析物。
方法可進一步包括鑑別捕捉試劑的步驟，該捕捉試劑可在酸化樣品的pH下結合至分析物。
捕捉試劑可經生物素標記且固體載體經鏈黴抗生物素蛋白或抗生物素蛋白塗覆。
捕捉試劑可直接結合至固體載體。
偵測試劑可為抗體。偵測試劑抗體可為多株抗體、單株抗體、雙特異性抗體、Fab片段、F(ab')2片段、單特異性F(ab')2片段、雙特異性F(ab')2、三特異性F(ab')2、單價抗體、scFv片段、雙功能抗體、雙特異性雙功能抗體、三特異性雙功能抗體、scFv-Fc、微型抗體、IgNAR、v-NAR、hcIgG或vhH。
偵測試劑可與可偵測標記結合。
可偵測標記可選自由以下組成之群：稀有過渡金屬粒子、螢光團、發色團、酶、量子點及貴金屬奈米粒子。
可偵測標記可為辣根過氧化酶。
可偵測標記可為釕。
固體載體可為電致化學發光平台。
樣品可包含結合至分析物之干擾劑。
方法可進一步包括在干擾劑與分析物部分或完全解離時測定酸化樣品之工作pH的步驟。
相較於不包含干擾劑的樣品，方法可恢復包含干擾劑之樣品中的至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%分析物信號。可藉由使所偵測之偵測試劑之量與預定的參考標準關聯來測定分析物的數量。
在其他範疇內，本發明提供用於偵測樣品中之分析物的套組，其中該套組包含捕捉試劑、偵測試劑及包含弱酸的稀釋緩衝液。
在某些範疇內，本發明亦提供偵測樣品中之IL2Rγ的方法，包括以下步驟：(i)用弱酸稀釋包含IL2Rγ的樣品以產生酸化樣品；(ii)將酸化樣品直接添加至固體載體中而不中和酸化樣品，其中該固體載體經可結合至IL2Rγ的捕捉試劑塗覆；(iii)在第一培育時段之後自固體載體移除酸化樣品；(iv)將偵測試劑直接添加至固體載體中；(v)在第二培育時段之後自固體載體移除偵測試劑；以及(vi)偵測結合至被捕捉試劑捕捉之IL2Rγ的偵測試劑，其中所偵測之偵測試劑的數量與樣品中之IL2Rγ的數量相關。
方法可進一步包括在自固體載體移除酸化樣品之後，洗滌固體載體。方法可包括在自固體載體移除偵測試劑之後，洗滌固體載體。
樣品可為生物體液，諸如血液、血清、血漿、CSF、尿液或唾液。在一些實施例中，樣品來自被投予IL2Rγ藥品的個體。
IL2Rγ藥品可包含結合至IL2Rγ的抗體。
樣品可來自經診斷或疑似患有IL2Rγ相關疾病或病症的個體。
IL2Rγ可非共價結合至樣品中的干擾劑。干擾劑可為人類抗IL2Rγ抗體(例如Int-IL2Rγ-Ab1)。干擾抗體可為其IL2Rγ結合片段。
酸化樣品可具有約3.4至4.5之pH，例如4.4或4.5。
弱酸可為在水溶液中不能完全解離成其離子的酸，包括但不限於乙酸、檸檬酸、甲酸、乳酸、磷酸及PIPES。
樣品可酸化5至120分鐘。
捕捉試劑可為IL2Rγ特異性抗體。捕捉試劑抗體為多株抗體、單株抗體、雙特異性抗體、Fab片段、F(ab')2片段、單特異性F(ab')2片段、雙特異性F(ab')2、三特異性F(ab')2、單價抗體、scFv片段、雙功能抗體、雙特異性雙功能抗體、三特異性雙功能抗體、scFv-Fc、微型抗體、IgNAR、v-NAR、hcIgG或vhH。捕捉試劑經生物素標記，且固體載體經鏈黴抗生物素蛋白塗覆。捕捉試劑可直接結合至固體載體。
偵測試劑可為抗體。偵測試劑抗體可為多株抗體、單株抗體、雙特異性抗體、Fab片段、F(ab')2片段、單特異性F(ab')2片段、雙特異性F(ab')2、三特異性F(ab')2、單價抗體、scFv片段、雙功能抗體、雙特異性雙功能抗體、三特異性雙功能抗體、scFv-Fc、微型抗體、IgNAR、v-NAR、hcIgG或vhH。
偵測試劑可與可偵測標記結合。可偵測標記可選自由以下組成之群：稀有過渡金屬粒子、螢光團、發色團、酶、量子點及貴金屬奈米粒子。
可偵測標記可為辣根過氧化酶。可偵測標記可為釕。
固體載體可為電致化學發光平台。
捕捉試劑及/或偵測試劑可選自人類抗IL2Rγ單株抗體(抗IL2Rγ-Ab2及抗IL2Rγ-Ab1)。
相較於不包含干擾劑的樣品，方法可恢復包含干擾劑之樣品中的至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%分析物信號。相較於不包含干擾劑的樣品，方法可恢復包含干擾劑之樣品中的至少70%至100%分析物信號。
可藉由使所偵測之偵測試劑之量與預定的參考標準關聯來測定分析物的數量。
在其他範疇內，本發明提供用於偵測樣品中之IL2Rγ的套組，其中該套組包含捕捉試劑、偵測試劑及包含弱酸的稀釋緩衝液。
在一些範疇內，用於偵測樣品中之IL2Rγ的方法包括以下步驟：(i)用弱酸稀釋包含IL2Rγ的樣品以產生酸化樣品；(ii)將酸化樣品直接添加至固體載體中而不中和酸化樣品，其中該固體載體經捕捉試劑塗覆，其中該捕捉試劑為第一IL2Rγ特異性抗體；(iii)在第一培育時段之後自固體載體移除酸化樣品；(iv)將偵測試劑直接添加至固體載體中，其中該偵測試劑為第二IL2Rγ特異性抗體；(v)在第二培育時段之後自固體載體移除偵測試劑；以及(vi)偵測結合至被捕捉試劑捕捉之IL2Rγ的偵測試劑，其中所偵測之偵測試劑的數量與樣品中之IL2Rγ的數量相關。
套組中的捕捉試劑及/或偵測試劑可選自人類抗IL2Rγ單株抗體(抗IL2Rγ-Ab2及抗IL2Rγ-Ab1)。
酸化樣品可具有約3.4至4.5之pH，例如4.4或4.5。
在100至1000 µg/mL干擾劑(例如人類單株抗IL2Rγ抗體Int-IL2Rγ-Ab1)存在下，分析可具有至少約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%的分析物恢復率。
在某些範疇內，本發明提供偵測樣品中之EGFR的方法，包括以下步驟：(i)用弱酸稀釋包含EGFR的樣品以產生酸化樣品；(ii)將酸化樣品直接添加至固體載體中而不中和酸化樣品，其中該固體載體經可結合至EGFR的捕捉試劑塗覆；(iii)在第一培育時段之後自固體載體移除酸化樣品；(iv)將偵測試劑直接添加至固體載體中；(v)在第二培育時段之後自固體載體移除偵測試劑；以及(vi)偵測結合至被捕捉試劑捕捉之EGFR的偵測試劑，其中所偵測之偵測試劑的數量與樣品中之EGFR的數量相關。
方法可進一步包括在自固體載體移除酸化樣品之後，洗滌固體載體。方法可包括在自固體載體移除偵測試劑之後，洗滌固體載體。
樣品可為生物體液，諸如血液、血清、血漿、CSF、尿液或唾液。
樣品可來自被投予EGFR藥品的個體。
EGFR藥品可包含結合至EGFR的抗體。
樣品可來自經診斷或疑似患有EGFR相關疾病或病症的個體。
EGFR可非共價結合至樣品中的干擾劑，其中該干擾劑為抗體。
干擾抗體可為Int-EGFR-Ab1或其EGFR結合片段。
酸化樣品可具有約4.0至6.0之pH，例如4.5或5.0。
弱酸可為在水溶液中不能完全解離成其離子的酸，包括但不限於乙酸、檸檬酸、甲酸、乳酸、磷酸及PIPES。
樣品可酸化5至120分鐘。
捕捉試劑可為EGFR特異性抗體。捕捉試劑抗體可為多株抗體、單株抗體、雙特異性抗體、Fab片段、F(ab')2片段、單特異性F(ab')2片段、雙特異性F(ab')2、三特異性F(ab')2、單價抗體、scFv片段、雙功能抗體、雙特異性雙功能抗體、三特異性雙功能抗體、scFv-Fc、微型抗體、IgNAR、v-NAR、hcIgG或vhH。
捕捉試劑可經生物素標記且固體載體經鏈黴抗生物素蛋白塗覆。捕捉試劑可直接結合至固體載體。
偵測試劑可為抗體。偵測試劑抗體可為多株抗體、單株抗體、雙特異性抗體、Fab片段、F(ab')2片段、單特異性F(ab')2片段、雙特異性F(ab')2、三特異性F(ab')2、單價抗體、scFv片段、雙功能抗體、雙特異性雙功能抗體、三特異性雙功能抗體、scFv-Fc、微型抗體、IgNAR、v-NAR、hcIgG或vhH。
偵測試劑可與可偵測標記結合。可偵測標記可選自由以下組成之群：稀有過渡金屬粒子、螢光團、發色團、酶、量子點及貴金屬奈米粒子。
可偵測標記可為辣根過氧化酶。可偵測標記可為釕。
固體載體可為電致化學發光平台。
捕捉試劑及/或偵測試劑可選自WO 2014/004427中所揭示的EGFR抗體及R&D Systems Human EGFR Quantikine套組DEGFR0中的EGFR抗體。
相較於不包含干擾劑的樣品，方法可恢復包含干擾劑之樣品中的至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%分析物信號。
可藉由使所偵測之偵測試劑之量與預定的參考標準關聯來測定分析物的數量。
在其他範疇內，本發明提供用於偵測樣品中之EGFR的套組，其中該套組包含捕捉試劑、偵測試劑及包含弱酸的稀釋緩衝液。
在一些範疇內，用於偵測樣品中之EGFR的方法包括以下步驟：(i)用弱酸稀釋包含EGFR的樣品以產生酸化樣品；(ii)將酸化樣品直接添加至固體載體中而不中和酸化樣品，其中該固體載體經捕捉試劑塗覆，其中該捕捉試劑為第一EGFR特異性抗體；(iii)在第一培育時段之後自固體載體移除酸化樣品；(iv)將偵測試劑直接添加至固體載體中，其中該偵測試劑為第二EGFR特異性抗體；(v)在第二培育時段之後自固體載體移除偵測試劑；以及(vi)偵測結合至被捕捉試劑捕捉之EGFR的偵測試劑，其中所偵測之偵測試劑的數量與樣品中之EGFR的數量相關。
捕捉試劑及/或偵測試劑可選自WO 2014/004427中所揭示的EGFR抗體及R&D Systems Human EGFR Quantikine套組DEGFR0中的EGFR抗體。
酸化樣品可具有約4.0至6.0之pH，例如4.5或5.0。
在至少0至2000 µg/mL干擾劑(例如Int-EGFR-Ab1)存在下，分析可具有至少55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%的分析物恢復率。
在2%人類血清存在下，分析可偵測低至0.31 ng/mL濃度的EGFR，或在未經稀釋之人類血清中可偵測15.6 ng/mL濃度之EGFR。
在某些範疇內，本發明提供偵測樣品中之AbA (對利尿鈉肽受體1具有特異性之IgG4亞類的人類單株抗體)的方法，包括以下步驟：(i)用弱酸稀釋包含AbA的樣品以產生酸化樣品；(ii)將酸化樣品直接添加至固體載體中而不中和酸化樣品，其中該固體載體經可結合至AbA的捕捉試劑塗覆；(iii)在第一培育時段之後自固體載體移除酸化樣品；(iv)將偵測試劑直接添加至固體載體中；(v)在第二培育時段之後自固體載體移除偵測試劑；以及(vi)偵測結合至被捕捉試劑捕捉之AbA的偵測試劑，其中所偵測之偵測試劑的數量與樣品中之AbA的數量相關。
方法可進一步包括在自固體載體移除酸化樣品之後，洗滌固體載體。方法可包括在自固體載體移除偵測試劑之後，洗滌固體載體。
樣品可為生物體液，諸如血液、血清、血漿、CSF、尿液或唾液。
樣品可來自經診斷或疑似患有利尿鈉肽受體1相關疾病或病症的個體。
樣品可來自被投予AbA的個體。
AbA可非共價結合至樣品中的干擾劑。
干擾劑可為抗體。干擾抗體可包括一種或多種AbA逆轉劑，該等AbA逆轉劑為人類抗AbA單株抗體(Int-AbA-Ab1、Int-AbA-Ab2、AbB、Int-AbA-Ab3)或其抗原結合片段。
酸化樣品可具有約4.0至6.0之pH，例如約4.5或5.0。
弱酸可為在水溶液中不能完全解離成其離子的酸，包括但不限於乙酸、檸檬酸、甲酸、乳酸、磷酸及PIPES。
樣品可酸化5至120分鐘。
捕捉試劑可為AbA特異性抗體。捕捉試劑抗體可為多株抗體、單株抗體、雙特異性抗體、Fab片段、F(ab')2片段、單特異性F(ab')2片段、雙特異性F(ab')2、三特異性F(ab')2、單價抗體、scFv片段、雙功能抗體、雙特異性雙功能抗體、三特異性雙功能抗體、scFv-Fc、微型抗體、IgNAR、v-NAR、hcIgG或vhH。
捕捉試劑可經生物素標記且固體載體經抗生物素蛋白或鏈黴抗生物素蛋白塗覆。捕捉試劑可直接結合至固體載體。
偵測試劑可為抗體。偵測試劑抗體可為多株抗體、單株抗體、雙特異性抗體、Fab片段、F(ab')2片段、單特異性F(ab')2片段、雙特異性F(ab')2、三特異性F(ab')2、單價抗體、scFv片段、雙功能抗體、雙特異性雙功能抗體、三特異性雙功能抗體、scFv-Fc、微型抗體、IgNAR、v-NAR、hcIgG或vhH。
偵測試劑可與可偵測標記結合。
可偵測標記可選自由以下組成之群：稀有過渡金屬粒子、螢光團、發色團、酶、量子點及貴金屬奈米粒子。
可偵測標記可為辣根過氧化酶。可偵測標記可為釕。
固體載體可為電致化學發光平台。
捕捉試劑可為小鼠抗AbA單株抗體(抗AbA-Ab1)且/或偵測試劑係選自小鼠抗AbA抗體(抗AbA-Ab2)及小鼠抗人類IgG4 Fc特異性單株抗體(抗hIgG4Fc)。
相較於不包含干擾劑的樣品，方法可恢復包含干擾劑之樣品中的至少50%、55%、60%、65%、75%、80%、85%、90%、95%或100%分析物信號。
可藉由使所偵測之偵測試劑之量與預定的參考標準關聯來測定分析物的數量。
在其他範疇內，本發明提供用於偵測樣品中之AbA的套組，其中該套組包含捕捉試劑、偵測試劑及包含弱酸的稀釋緩衝液。
在一些範疇內，用於偵測樣品中之AbA的方法包括以下步驟：(i)用弱酸稀釋包含AbA的樣品以產生酸化樣品；(ii)將酸化樣品直接添加至固體載體中而不中和酸化樣品，其中該固體載體經捕捉試劑塗覆，其中該捕捉試劑為第一AbA特異性抗體；(iii)在第一培育時段之後自固體載體移除酸化樣品；(iv)將偵測試劑直接添加至固體載體中，其中該偵測試劑為第二AbA特異性抗體；(v)在第二培育時段之後自固體載體移除偵測試劑；以及(vi)偵測結合至被捕捉試劑捕捉之AbA的偵測試劑，其中所偵測之偵測試劑的數量與樣品中之AbA的數量相關。
在至少0至2 mg/mL干擾劑(例如針對AbA的人類單株抗體)存在下，分析可具有至少約50%、55%、60%、65%、75%、80%、85%、90%、95%或100%的分析物恢復率。
在2%人類血清存在下，分析可偵測低至0.27 ng/mL濃度的AbA，或在未經稀釋之人類血清中可偵測13.7 ng/mL濃度之AbA。
在某些範疇內，本發明提供用於偵測樣品中之AbB (針對AbA的人類單株抗體)的方法，包括以下步驟：(i)用弱酸稀釋包含AbB的樣品以產生酸化樣品；(ii)將酸化樣品直接添加至固體載體中而不中和酸化樣品，其中該固體載體經可結合至AbB的捕捉試劑塗覆；(iii)在第一培育時段之後自固體載體移除酸化樣品；(iv)將偵測試劑直接添加至固體載體中；(v)在第二培育時段之後自固體載體移除偵測試劑；以及(vi)偵測結合至被捕捉試劑捕捉之AbB的偵測試劑，其中所偵測之偵測試劑的數量與樣品中之AbB的數量相關。
方法可進一步包括在自固體載體移除酸化樣品之後，洗滌固體載體。方法可包括在自固體載體移除偵測試劑之後，洗滌固體載體。
樣品可為生物體液，諸如血液、血清、血漿、CSF、尿液或唾液。
樣品可來自被投予AbB藥品的個體。
AbB藥品可包含結合至AbB的抗體。
樣品可來自經診斷或疑似患有疾病或病症的個體。
AbB可非共價結合至樣品中的干擾劑。
干擾劑可為抗體。
干擾抗體可為AbA或其AbB結合片段。
酸化樣品可具有約4.0至6.0之pH，例如約4.5或5.0。
弱酸可為在水溶液中不能完全解離成其離子的酸，包括但不限於乙酸、檸檬酸、甲酸、乳酸、磷酸及PIPES。
樣品可酸化5至120分鐘。
捕捉試劑可為AbB特異性抗體。
捕捉試劑抗體可為多株抗體、單株抗體、雙特異性抗體、Fab片段、F(ab')2片段、單特異性F(ab')2片段、雙特異性F(ab')2、三特異性F(ab')2、單價抗體、scFv片段、雙功能抗體、雙特異性雙功能抗體、三特異性雙功能抗體、scFv-Fc、微型抗體、IgNAR、v-NAR、hcIgG或vhH。
捕捉試劑可經生物素標記且固體載體經鏈黴抗生物素蛋白塗覆。
捕捉試劑可直接結合至固體載體。
偵測試劑可為抗體。
偵測試劑抗體可為多株抗體、單株抗體、雙特異性抗體、Fab片段、F(ab')2片段、單特異性F(ab')2片段、雙特異性F(ab')2、三特異性F(ab')2、單價抗體、scFv片段、雙功能抗體、雙特異性雙功能抗體、三特異性雙功能抗體、scFv-Fc、微型抗體、IgNAR、v-NAR、hcIgG或vhH。
偵測試劑可與可偵測標記結合。
可偵測標記可選自由以下組成之群：稀有過渡金屬粒子、螢光團、發色團、酶、量子點及貴金屬奈米粒子。
可偵測標記可為辣根過氧化酶。可偵測標記可為釕。
固體載體可為電致化學發光平台。
捕捉試劑及/或偵測試劑可選自小鼠抗AbB抗體(例如抗AbB-Ab1及抗AbB-Ab2)。
相較於不包含干擾劑的樣品，方法可恢復包含干擾劑之樣品中的至少50%、55%、60%、65%、75%、80%、85%、90%、95%或100%分析物信號。
可藉由使所偵測之偵測試劑之量與預定的參考標準關聯來測定分析物的數量。
在其他範疇內，本發明提供用於偵測樣品中之AbB的套組，其中該套組包含捕捉試劑、偵測試劑及包含弱酸的稀釋緩衝液。
在一些範疇內，用於偵測樣品中之AbB的方法包括以下步驟：(i)用弱酸稀釋包含AbB的樣品以產生酸化樣品；(ii)將酸化樣品直接添加至固體載體中而不中和酸化樣品，其中該固體載體經捕捉試劑塗覆，其中該捕捉試劑為第一AbB特異性抗體；(iii)在第一培育時段之後自固體載體移除酸化樣品；(iv)將偵測試劑直接添加至固體載體中，其中該偵測試劑為第二AbB特異性抗體；(v)在第二培育時段之後自固體載體移除偵測試劑；以及(vi)偵測結合至被捕捉試劑捕捉之AbB的偵測試劑，其中所偵測之偵測試劑的數量與樣品中之AbB的數量相關。
捕捉試劑及/或偵測試劑可選自小鼠抗AbB抗體(抗AbB-Ab1及抗AbB-Ab2)。
在至少0至2000 µg/mL干擾劑(例如AbA)存在下，分析可具有至少約75%、80%、85%、90%或95%的分析物恢復率。
在2%人類血清中，分析可偵測低至1.56 ng/mL濃度的AbB，或在純淨的人類血清中，分析可偵測78 ng/mL濃度的AbB。
在某些範疇內，本發明提供偵測樣品中之因子XI的方法，包括以下步驟：(i)用弱酸稀釋包含因子XI的樣品以產生酸化樣品；(ii)將酸化樣品直接添加至固體載體中而不中和酸化樣品，其中該固體載體經可結合至因子XI的捕捉試劑塗覆；(iii)在第一培育時段之後自固體載體移除酸化樣品；(iv)將偵測試劑直接添加至固體載體中；(v)在第二培育時段之後自固體載體移除偵測試劑；以及(vi)偵測結合至被捕捉試劑捕捉之因子XI的偵測試劑，其中所偵測之偵測試劑的數量與樣品中之因子XI的數量相關。
方法可進一步包括在自固體載體移除酸化樣品之後，洗滌固體載體。方法可包括在自固體載體移除偵測試劑之後，洗滌固體載體。
樣品可為生物體液，諸如血液、血清、血漿、CSF、尿液或唾液。
樣品可來自被投予因子XI藥品的個體。
因子XI藥品可包含結合至因子XI的抗體。
樣品可來自經診斷或疑似患有因子XI相關疾病或病症的個體。
因子XI可非共價結合至樣品中的干擾劑。
干擾劑可為抗體。
干擾抗體可人類抗因子XI抗體(例如Int-FXI-Ab1)或其因子XI結合片段。
酸化樣品可具有約3.0至5.0之pH，例如約4.1。
弱酸可為在水溶液中不能完全解離成其離子的酸，包括但不限於乙酸、檸檬酸、甲酸、乳酸、磷酸及PIPES。
樣品可酸化5至120分鐘。
捕捉試劑可為因子XI特異性抗體。
捕捉試劑抗體可為多株抗體、單株抗體、雙特異性抗體、Fab片段、F(ab')2片段、單特異性F(ab')2片段、雙特異性F(ab')2、三特異性F(ab')2、單價抗體、scFv片段、雙功能抗體、雙特異性雙功能抗體、三特異性雙功能抗體、scFv-Fc、微型抗體、IgNAR、v-NAR、hcIgG或vhH。
捕捉試劑可經生物素標記且固體載體經鏈黴抗生物素蛋白塗覆。
捕捉試劑可直接結合至固體載體。
偵測試劑可為抗體。
偵測試劑抗體可為多株抗體、單株抗體、雙特異性抗體、Fab片段、F(ab')2片段、單特異性F(ab')2片段、雙特異性F(ab')2、三特異性F(ab')2、單價抗體、scFv片段、雙功能抗體、雙特異性雙功能抗體、三特異性雙功能抗體、scFv-Fc、微型抗體、IgNAR、v-NAR、hcIgG或vhH。
偵測試劑可與可偵測標記結合。
可偵測標記可選自由以下組成之群：稀有過渡金屬粒子、螢光團、發色團、酶、量子點及貴金屬奈米粒子。
可偵測標記可為辣根過氧化酶。可偵測標記可為釕。
固體載體可為電致化學發光平台。
捕捉試劑及/或偵測試劑可為多株抗體。
相較於不包含干擾劑的樣品，方法可恢復包含干擾劑之樣品中的至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%分析物信號。
可藉由使所偵測之偵測試劑之量與預定的參考標準關聯來測定分析物的數量。
在其他範疇內，本發明提供用於偵測樣品中之因子XI的套組，其中套組包含捕捉試劑、偵測試劑及包含弱酸的稀釋緩衝液。
在一些範疇內，用於偵測樣品中之因子XI的方法包括以下步驟：(i)用弱酸稀釋包含因子XI的樣品以產生酸化樣品；(ii)將酸化樣品直接添加至固體載體中而不中和酸化樣品，其中該固體載體經捕捉試劑塗覆，其中該捕捉試劑為第一因子XI特異性抗體；(iii)在第一培育時段之後自固體載體移除酸化樣品；(iv)將偵測試劑直接添加至固體載體中，其中該偵測試劑為第二因子XI特異性抗體；(v)在第二培育時段之後自固體載體移除偵測試劑；以及(vi)偵測結合至被捕捉試劑捕捉之因子XI的偵測試劑，其中所偵測之偵測試劑的數量與樣品中之因子XI的數量相關。
在0至1500 µg/mL干擾劑(例如人類抗因子XI抗體，例如Int-FXI-Ab1)存在下，分析可具有至少70%、75%、80%、85%、90%或95%之分析物恢復率。
在2%猴血漿存在下，分析可偵測低至1.56 ng/mL濃度的因子XI，或在未經稀釋之猴血漿中可偵測0.078 µg/mL濃度的因子XI。
總之，由於分析物結合至捕捉試劑無需中和酸化樣品的步驟，因此本文所揭示之發明優於分析物偵測領域中當前使用的方法。另一優勢為，本發明之方法允許對受干擾之樣品中的所關注分析物進行充分的直接偵測及定量。
相關申請案之參照
本申請案主張2022年7月13日提申之美國臨時專利申請案第63/388,839號的權益，該美國臨時專利申請案的全部內容以引用之方式併入本文中。 A. 定義
除非另外定義，否則本文所用之所有技術及科學術語具有與一般熟習本發明所屬技術者通常所瞭解相同的含義。儘管如此，但類似或等效於本文所述之任何組合物、方法及材料可用於實施或測試本發明。所提及之所有出版物均以全文引用的方式併入本文中。
本文所闡述之所有數值限值及範圍包括該範圍或限值之數值周圍或其間的所有數值或值。本文所述之範圍及限值明確地指定且闡述由該範圍或限值定義且涵蓋之所有整數、小數及分數值。因此，除非本文另外指明，否則本文中敍述值範圍僅意欲充當個別提及屬於該範圍內之各獨立值之方式，且各獨立值併入本說明書中，如同其在本文中個別敍述一般。
自本文中所含之教示內容顯而易見，在數值及範圍之上下文中，術語「約」係指值或範圍近似或接近於所述值或範圍，因此本發明可如預期一般執行，諸如具有所需的速率、量、密度、程度、增加、降低、百分比、值、純度、pH、濃度、形式或變異體之存在、溫度或時間量。舉例而言，「約」可表示值高於或低於所述值，高或低的幅度在大約+/-10%或更大或更小之範圍內，此視實施能力而定。因此，此術語涵蓋超出僅由系統誤差引起之值的值。
如本文所用，術語「抗體」為結合分子之實例且係指免疫球蛋白，其典型地包含四條多肽鏈：兩條重(H)鏈與二條(L)輕鏈，其藉由二硫鍵互連。各重鏈包含重鏈可變區(HCVR或VH)及重鏈恆定區。重鏈恆定區包含三個域：CH1、CH2及CH3。各輕鏈含有輕鏈可變區(LCVR或VL)及輕鏈恆定區。輕鏈恆定區包含一個域(C L1)。VH及VL區域可進一步再分成高變區，稱為互補決定區(CDR)，其中散置有更保守的區域，稱為構架區(FR)。各VH及VL由三個CDR及四個FR構成，自胺基端至羧基端按以下順序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
如本文所用，術語抗體之「抗原結合部分」或「抗原結合片段」(或簡稱「抗體部分」或「抗體片段」)係指抗體之一個或多個片段，該等片段保持特異性地結合至抗原(例如IL2Rγ、EGFR、FXI)之能力。已表明抗體的抗原結合功能可由全長抗體之片段執行。術語抗體之「抗原結合部分」內所涵蓋之結合片段實例包括(i) Fab片段，一種包含VL、VH、CTl及Cn 1域的單價片段；(ii) F(ab')2片段，一種二價片段，其包含在鉸鏈區藉由二硫橋鍵連接的兩個F(ab)'片段；(iii) Fc片段，其包含VH及C 111域；(iv) Fv片段，其包含抗體之單一臂的VL及VH域；(v) dAb片段(Ward, E.S.等人, Nature 241 :544-546 (1989))，其包含VH域；以及(vi) CDR。此外，儘管Fv片段之兩個域(VL及VH)由各別基因編碼，然而其可使用重組方法、藉由合成連接子連接，該合成連接子能夠使其以鄰接單鏈形式產生，其中VL與VH區域成對形成單價分子(稱為單鏈Fv (scFv)；參見例如Bird等人, Bird, R.E.等人, Science 242:423-426 (1988)；及Huston, J.S.等人, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883 (1988))。此類單鏈抗體亦意欲涵蓋於術語抗體之「抗原結合部分」內。亦涵蓋單鏈抗體的其他形式，諸如雙功能抗體(參見例如Holliger, P.等人, Proc.Natl.Acad Sci.USA 90:6444-6448 (1993))。
如本文所用，術語「結合分子」意指與特定目標發生特異性相互作用且結合至特定目標的分子。目標可包含生物分子或小(化學)分子。目標分子可限定抗原或抗原部分。結合分子之實例包括但不限於抗體(包括多株抗體、單株抗體、雙特異性抗體以及抗體片段)、融合蛋白，及熟習此項技術者已知之其他抗原結合分子。在本發明之分析中，結合分子可用作捕捉試劑、偵測試劑或兩者。
「CDR」或互補決定區為散置於更保守之區域(稱為「構架區」(FR))內的高變區。FR可與人類生殖系序列一致，或可經天然或人工修飾。
術語「抗原決定基」為與抗體分子之可變區中稱為互補位之特異性抗原結合位點相互作用的抗原決定子。單一抗原可具有超過一個抗原決定基。抗原決定基可為構形或線性的。構形抗原決定基係由線性多肽鏈之不同鏈段之胺基酸在空間上並置而產生。線性抗原決定基為由多肽鏈中之相鄰胺基酸殘基產生的抗原決定基。在某些情形下，抗原決定基可包括抗原上之醣部分、磷醯基或磺醯基。
術語「個人」、「個體」及「患者」在本文中可互換使用，且係指哺乳動物，包括但不限於人類、嚙齒動物，諸如小鼠及大鼠，及其他實驗室動物。
術語「干擾劑」及「分析干擾」係指分析中阻斷或抑制分析物偵測的內源及/或外源組分，諸如IL2Rγ、EGFR、針對NPR1的人類單株抗體(例如AbA)、針對AbA的人類單價單株抗體(AbB)，及FXI，或抗IL2Rγ、EGFR、AbA、AbB及FXI抗體。改變分析物之可量測濃度或改變抗體結合的物質可潛在地引起免疫分析干擾。干擾劑可直接結合至分析物，或可為包含分析物之複合物的一部分。包含分析物及干擾劑的複合物在本文中稱為「干擾劑:分析物複合物」或「分析物:干擾劑複合物」。分析干擾可為分析物依賴性或非依賴性干擾。分析物非依賴性干擾係指溶血、脂血的常見干擾以及抗凝血劑與樣品儲存的影響，其不依賴於分析物濃度。免疫分析中的分析物依賴性干擾係指干擾劑與分析物之間直接或間接的相互作用，或干擾劑與分析物特異性抗體之間阻斷或抑制分析物偵測的相互作用。干擾劑可為與抗體交叉反應之具有化學差異、但結構相似的化合物。干擾性內源物質為天然的多反應性抗體或自體抗體(異嗜性)、人類抗動物抗體，或抗藥物抗體(ADA)以及個體獨有的其他無嫌疑結合蛋白，在免疫分析中可干擾分析物與試劑抗體之間的反應。
分析物的可溶性結合目標、分析物的內源配位體(包括但不限於分析物的可溶性受體、分析物的可溶性配位體、分析物的脫落受體)或血清因子(諸如類風濕性因子及生物素)可產生干擾。抗體可對分析物產生干擾。
術語「弱酸」係指在水溶液中不能完全解離成其離子的酸。大部分有機酸係弱酸。酸之強度可藉由其酸解離常數 K a 值定量。一些例示性弱酸為乙酸、抗壞血酸、苯甲酸、硼酸、檸檬酸、甲酸、醯肼酸、氫氰酸、氫氟酸、次氯酸、乳酸、亞硝酸、草酸、酚酸、丙酸、亞硫酸、尿酸、磷酸及PIPES (哌口井-N,N-雙(2-乙烷磺酸)。
術語「分析物(analyte)」或「分析物(analytes)」係指意欲定量分析其存在的物質。分析物可為特異性結合至或連接至固著之捕捉劑與偵測劑的配位體。分析物可為存在於生物體液中的物質，諸如肽、蛋白質、抗體及激素，其對生物學功能發揮重要作用。
術語「分析物恢復(%AR)」或「恢復率」係指在樣品(例如含有干擾劑的樣品)中偵測到之分析物相較於樣品中之分析物之實際量或濃度的分率。換言之，分析物恢復率為所量測之分析物濃度(濃度或平均濃度)的百分比，其為標稱(點樣)濃度之分率。 B. 偵測及定量分析、套組及其使用方法 a. 方法
本發明係關於用於偵測及定量分析物的分析及方法。所揭示之分析及方法可用於偵測及定量樣品中的蛋白質分析物(例如IL2Rγ、EGFR、針對NPR1的人類單株抗體(AbA)針對AbA的人類單價單株抗體(AbB)、FXI)。樣品可獲自經藥品治療的個體或經受醫學處理。
所揭示之分析存在的分析干擾相對於市售分析及/或對照分析減少。干擾可分析物依賴性干擾、分析物非依賴性干擾或兩者。方法可減少或抑制由存在於樣品中之內源可溶性分析物結合分子引起的分析干擾。內源可溶性分析物結合分子包括但不限於血清組分、抗目標分析物抗體，及目標分析物受體。
本發明的方法及分析係用於偵測樣品中的分析物，其藉由將樣品酸化至足以使樣品中之分析物自其複合物解離的pH來達成。特異性結合至分析物的捕捉試劑及偵測試劑係用於偵測及定量樣品中的分析物，例如測定樣品中之分析物的量或濃度。
本發明的方法及分析亦適用於減少分析干擾，其藉由將樣品酸化至足以使樣品中之分析物自其複合物解離的pH來達成。方法包括：將捕捉試劑與樣品混合物酸化至足以使干擾劑與分析物解離且能夠實現分析物與捕捉試劑結合的pH；使捕捉試劑固著至固體載體；添加偵測試劑，視情況其中該偵測試劑包含可偵測標記；以及允許偵測試劑結合至被所固著之捕捉試劑捕捉的分析物。偵測試劑的數量與樣品中之被捕捉分析物的數量相關。
在某些範疇內，本發明的方法及分析係為了減少樣品中的分析物干擾而提供，其藉由將樣品酸化至足以使樣品中之分析物自其複合物解離的pH來達成。方法包括：將酸化樣品添加至固著於固體載體的捕捉試劑；添加偵測試劑，視情況其中該偵測試劑包含可偵測標記；以及允許偵測試劑結合至被捕捉試劑捕捉的分析物，其中所偵測之可偵測標記的數量與樣品中之分析物的數量相關。
在某些範疇內，本發明的方法及分析係為了定量樣品中的分析物而提供，其藉由將樣品酸化至足以使樣品中之分析物自其複合物解離的pH來達成。方法包括：將酸化樣品添加至固著於固體載體的捕捉試劑；添加偵測試劑，視情況其中該偵測試劑包含可偵測標記；以及允許偵測試劑結合至被捕捉試劑捕捉的分析物，其中所偵測之可偵測標記的數量與樣品中之分析物的數量相關。
方法及分析可用於測定人類血清樣品中之分析物的濃度，該測定使用電致化學發光免疫分析。方法包括對血清樣品進行酸預處理以使存在於樣品中的可溶性分析物:干擾劑複合物解離且在干擾劑存在下改良分析物的偵測，從而對分析物的含量提供定量量測。
可將樣品中所偵測到之標記的量與參考標準進行比較，該參考標準經校準而具有已知濃度的分析物及對應於該等濃度之量的所偵測標記。可如下測定樣品中之分析物的量：將樣品中所偵測到之標記之量與參考標準進行比較且將所偵測到之標記之量與參考標準中針對所偵測到之標記之該量所示的濃度匹配。
方法及分析可使用經鏈黴抗生物素蛋白塗覆之盤，使用經生物素標記之抗體作為捕捉試劑，且使用重組分析物作為標準物。在含有乙酸的稀釋緩衝液中稀釋標準物、對照物及樣品。偵測試劑為經釕標記之抗體。當藉由讀盤器向培養盤施加電壓時，藉由釕標記產生的化學發光信號來量測培養盤上所捕捉的分析物。所得電化學發光信號(例如計數)與存在於樣品中之分析物的量成比例。
捕捉試劑可預塗覆於固體載體，例如點漬有鏈黴抗生物素蛋白的固體載體，以捕捉酸化樣品中的所關注之分析物。可將捕捉抗體首先與含有所關注之分析物的樣品混合且酸化一段時間，例如約1小時，隨後添加至阻斷型分析盤中用於進一步偵測。
分析物可用含有不同濃度之弱酸(例如20 mM、30 mM、60 mM、80 mM、100 mM、120 mM或150 mM乙酸)的分析稀釋緩衝液(ADB)處理，以使pH水平達到6.5至3.0，以便有效解離干擾劑:分析物複合物。
在樣品酸化之後，可使干擾劑完全地與分析物解離。在樣品酸化之後，可使干擾劑部分地與分析物解離。
樣品中約50%至100%的分析物可自干擾劑:分析物複合物解離。分析物中約至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%的分析物可自干擾劑:分析物複合物解離。
在樣品酸化之後，方法可進一步包括確定干擾劑是否與分析物解離的步驟。方法可包括測試不同的pH水平，以確定在弱酸性pH下干擾劑與分析物解離。方法可包括測試不同的pH水平，以確定在弱酸性pH下干擾劑與分析物解離。方法可包括測試不同的pH水平，以確定在弱酸性pH下干擾劑不結合至分析物，或相較於在樣品之原始pH下的結合，對分析物的結合減少。量測兩個分子之間相互作用的方法在此項技術中已熟知(例如表面電漿子共振)且可用於測定干擾劑與分析物在不同pH條件下的結合及解離。
適用於本發明之方法及分析的工作pH為干擾劑部分地或完全地與分析物解離時的pH水平。在樣品酸化之後，結合至未酸化樣品中之分析物的干擾劑至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%可與分析物解離。
方法可進一步包括鑑別捕捉劑的步驟，該捕捉劑可在酸化後之樣品的pH下結合至分析物。方法可包括篩選出可在干擾劑與分析物解離時或對分析物之結合減少時的pH下結合至分析物的捕捉劑。量測兩個分子之間相互作用的方法在此項技術中已熟知(例如表面電漿子共振)且可用於測定候選捕捉試劑與分析物在不同pH條件下的結合。
藉由分析物之定量下限(亦即，偵測下限)測定的分析靈敏度可在不同的樣品酸化條件下測定。亦可在不同的樣品酸化條件下測定分析物對一種或多種干擾劑的耐受性。
方法可具有0.5至20 pg/mL、1至50 pg/mL、5至200 pg/mL、20至400 pg/mL、0.1至0.5 ng/mL、0.2至0.8 ng/mL、0.1至1 ng/mL、0.5至2 ng/mL、1至10 ng/mL、5至50 ng/mL、20至60 ng/mL、40至100 ng/mL、50至150 ng/mL或100至200 ng/mL的定量下限(LLOQ)(亦即，樣品中之分析物的最低量，該最低量為可藉由該方法偵測所必需的)。方法可具有小於0.5 pg/mL、1 pg/mL、5 pg/mL、10 pg/mL、15 pg/mL、20 pg/mL、40 pg/mL、60 pg/mL、80 pg/mL、0.1 ng/mL、0.5 ng/ml、0.8 ng/mL、1 ng/mL、1.5 ng/mL、2 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL 15 ng/mL、20 ng/mL、30 ng/mL、40 ng/mL、50 ng/mL、60 ng/mL、70 ng/mL、80 ng/mL、90 ng/mL、100 ng/mL、150 ng/mL、200 ng/mL、300 ng/mL、500 ng/mL、750 ng/mL、1 µg/mL、2 µg/mL、3 µg/mL、4 µg/mL、5 µg/mL、6 µg/mL、7 µg/mL、8 µg/mL、9 µg/mL、10 µg/mL、15 µg/mL、20 µg/mL、25 µg/mL、30 µg/mL、35 µg/mL、40 µg/mL、45 µg/mL或50 µg/mL、60 µg/mL、70 µg/mL的定量下限(LLOQ)。
可在無血清條件下進行分析。可在血清(例如人類血清、牛血清、猴血清或馬血清)存在下進行分析。可在未經稀釋(例如純淨)血清中進行分析。
相較於不包含干擾劑的樣品，方法可恢復包含干擾劑之樣品中的至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%分析物信號。
方法可在約4至37℃下進行，例如在約4℃下進行。方法可在約20至37℃下，例如在20至25℃、25至30℃或30至37℃下進行。舉例而言，方法可在約20℃、25℃、30℃或37℃下進行。
酸化樣品可直接添加至捕捉試劑中而不用緩衝的鹼性溶液中和。
可進一步向樣品中添加阻斷劑，以在樣品酸化之後減少或防止干擾劑:分析物複合物再形成。 b. 樣品
所揭示之方法中使用的樣品典型地為生物樣品，諸如含有待偵測之分析物的生物體液。生物體液包括但不限於血液、血漿、血清、唾液、腦脊髓液(CSF)及尿液。
樣品可獲自患有或疑似患有病症或疾病之個體。
樣品可來自被投予藥品的個體。
樣品可來自藥物濫用或酒精及菸草產品成癮的個體。
樣品可來自暴露於或疑似已暴露於毒素、過敏原或刺激物的個體。
待偵測之分析物典型地為獲自個體(例如人類個體)之血清的組分。樣品中之待偵測及/或定量的代表性分析物包括但不限於細胞介素、蛋白質藥品及代謝物或其片段。
代表性蛋白質藥品包括但不限於重組蛋白、抗體及融合蛋白。抗體可為多反應性抗體或自體抗體(異嗜性)、人類抗動物抗體，或抗藥物抗體。 c. 樣品的酸化
所揭示之方法中的樣品可酸化1至120分鐘。樣品可酸化約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13,14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60分鐘。樣品可酸化約65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115或120分鐘。
可用於酸化步驟中的酸包括但不限於乙酸、檸檬酸、甲酸、乳酸、磷酸及PIPES。
樣品可酸化至使分析物與一種或多種干擾劑之複合物解離的pH，例如pH 3.0至6.5。pH可為約3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0.、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4或6.5。在酸化之後，分析物與干擾劑的複合物可在樣品pH下完全解離。分析物與干擾劑的複合物可在樣品酸化之後的pH下部分地解離。 d. 捕捉試劑
本文所述之捕捉試劑或捕捉劑包括結合至分析物的分子，例如分析物拮抗劑或抑制劑，諸如特異性結合至分析物的抗體或抗體之抗原結合片段。抗體可為單株、多株或人源化抗體。術語「特異性結合」或其類似術語意謂抗體或其抗原結合片段與抗原形成相對穩定的複合物。本發明的捕捉試劑在酸化樣品的pH下結合至其相應分析物，亦即，酸化樣品的pH不能顯著減少捕捉試劑對分析物的結合親和力。此等捕捉試劑可為不同動物物種中產生的單株或多株抗體。
捕捉試劑可經生物素標記。捕捉試劑可固定至或連接至固體載體。固體載體可為微定量盤，例如經鏈黴抗生物素蛋白塗覆之微定量盤。
捕捉試劑可以≤1 μM、≤100 nM、≤50 nM、≤25 nM、≤20 nM、≤15 nM、≤10 nM、≤5 nM、≤2 nM、≤1 nM、≤0.1 nM、≤0.01 nM或≤0.001 nM之解離常數( K D )值(例如10 -8M或更小，例如10 -8M至10 -13M，例如10 -9M至10 -13M)結合分析物。
捕捉試劑可結合至IL2Rγ、EGFR、針對NPR1的人類單株抗體(AbA)、針對AbA的人類單價單株抗體(AbB)，或FXI，以便用於分別量測樣品中之IL2Rγ、EGFR、AbA、AbB、FXI的方法或分析中。
所揭示之方法及分析中的捕捉試劑可為經生物素標記之抗AbA-Ab1 (一種小鼠抗AbA單株抗體)。捕捉試劑可為EGFR抗體或經生物素標記之抗EGFR抗體、小鼠抗AbB抗體(抗AbB-Ab2)，或山羊抗人類FXI多株抗體。 e. 偵測試劑
本文所述之偵測試劑及偵測劑包括結合至分析物的分子，例如分析物拮抗劑或抑制劑，例如特異性結合至分析物的分析物抗體或抗體之抗原結合片段。抗體可為單株、多株或人源化抗體。
偵測試劑可用可偵測標記進行標記。可偵測標記在此項技術中已知且包括但不限於稀有過渡金屬粒子、螢光團、發色團、量子點、貴金屬奈米粒子、放射性部分、酶、生物素/抗生物素蛋白標記及化學發光標記。偵測試劑可為釕化抗AbA-Ab2 (一種小鼠抗AbA單株抗體)。偵測試劑可為經生物素標記之小鼠抗AbB抗體(抗AbB-Ab1)、與過氧化酶(HRP)結合的山羊抗人類FXI多株抗體、與HRP結合的抗EGFR抗體，或釕標記的抗EGFR抗體。
偵測試劑可以≤1 μM、≤100 nM、≤50 nM、≤25 nM、≤20 nM、≤15 nM、≤10 nM、≤5 nM、≤2 nM、≤1 nM、≤0.1 nM、≤0.01 nM或≤0.001 nM之解離常數( K D )值(例如10 -8M或更小，例如10 -8M至10 -13M，例如10 -9M至10 -13M)結合分析物。
偵測試劑可結合至IL2Rγ、EGFR、AbA、AbB或FXI，其用於分別量測樣品中之IL2Rγ、EGFR、AbA、AbB或FXI的方法或分析。 f. 套組
亦提供用於分析測試樣品的套組，以獲知樣品中之分析物(或其片段)的存在、量或濃度。套組包括用於分析樣品中之分析物(或其片段)的至少一種組分及用於分析樣品中之分析物(或其片段)的說明書。
本發明之套組包括如上文所述的偵測試劑、如上文所述的捕捉試劑。
偵測試劑與捕捉試劑可為如上文所述的相同或不同分析物結合分子，諸如單株抗體(或片段、變異體、或其變異體之片段)、融合蛋白，或視情況固著於固相上的適體。
捕捉試劑結合至分析物之後，偵測試劑的結合位及抗原決定基仍可供偵測試劑結合至分析物使用。
捕捉試劑及偵測試劑可結合至分析物的不同抗原決定基。
捕捉試劑結合至分析物可不妨礙偵測試劑結合至分析物。舉例而言，捕捉試劑及偵測試劑之抗原決定基位於遠端且因此，一種試劑的結合在空間上不妨礙其他試劑的結合。
偵測試劑典型地用可偵測標記(諸如化學發光標記)進行標記。偵測試劑可合併如本文所述的可偵測標記，諸如螢光團、放射性部分、酶、生物素/抗生物素蛋白標記、發色團、化學發光標記或其類似物，或套組可包括用於進行可偵測標記的試劑。抗體、校準劑及/或對照物可提供於各別容器中或預分配於適當的分析格式中，例如微量滴定盤。分析物偵測試劑可用釕標記。偵測試劑可與HRP結合。
套組可含有經生物素標記的捕捉試劑及經鏈黴抗生物素蛋白塗覆的固體載體，例如微量滴定盤或電致化學發光平台。捕捉試劑及微量滴定盤或電致化學發光平台可提供於各別容器中。套組可含有經捕捉試劑塗覆的微量滴定盤或電致化學發光平台盤。
套組亦可含有如上文所述用於處理樣品的酸溶液及緩衝液。
套組可包括校準劑或對照物，例如分離的、天然的及/或重組的分析物。套組可包括至少一個用於執行分析的容器(例如管、微量滴定盤或條帶或電致化學發光平台)，及/或緩衝液，諸如分析緩衝液或洗滌緩衝液，其中之任一者可作為濃縮溶液、用於可偵測標記(例如酶標記)的受質溶液或終止溶液提供。較佳地，套組包括執行分析所必需的所有組分，亦即，試劑、標準物、緩衝液、稀釋劑等。說明書可呈紙形式或電腦可讀形式。
視情況，套組包括品質對照組分(例如靈敏度組、校準劑及陽性對照)。品質對照試劑的製備在此項技術中已熟知且描述於多種免疫診斷產品的說明書上。靈敏度組成員視情況用於確立分析效能特徵，且視情況進一步為免疫分析套組試劑之完整性及分析標準化的適用指標。
套組視情況亦可包括為了執行診斷分析或有助於品質對照評測而必需的其他試劑，諸如緩衝液、鹽、酶、酶輔因子、酶受質、偵測試劑及其類似物。套組中亦可包括其他組分，諸如用於分離及/或處理測試樣品的緩衝液及溶液(例如預處理試劑)。套組可另外包括一種或多種其他對照物。套組的一種或多種組分可凍乾，在此情況下，套組可進一步包含適用於將凍乾組分復原的試劑。
必要時，套組之各種組分視情況提供於適合容器中，例如微量滴定盤。套組可進一步包括用於固持或儲存樣品的容器(例如用於尿液樣品的容器或濾筒)。適當時，套組視情況亦可含有反應容器、混合容器，及有助於製備試劑或測試樣品的其他組件。套組亦可包括有助於獲得測試樣品的一種或多種儀器，諸如注射器、移液管、鉗子、量匙或其類似物。 C. 用於偵測及定量IL2Rγ的方法及分析 a. 介白素-2受體γ鏈
IL2Rγ或「介白素-2受體γ鏈」係指具有347個胺基酸的64 kDa IL2Rγ跨膜蛋白，其中84個胺基酸為細胞質胺基酸。IL2Rγ在形成成熟的IL-2受體方面起關鍵作用，成熟的IL-2受體對於T細胞分化、活化、擴增及存活具有重要作用。IL2Rγ連同β鏈一起參與IL-2結合親和力及胞內信號轉導的增加。IL2Rγ亦為細胞介素IL-2、IL-4、IL-7、IL-9及IL-15之受體複合物的共有組分。此等受體下游的多個路徑係T細胞及NK細胞之分化及生長所必需的，其共同發揮與控制癌症、自體免疫疾病及免疫缺乏有關的作用，且因此在臨床上受到顯著關注。IL2Rγ突變與人類的X性聯重度組合型免疫缺乏(一種以存在極少T細胞或不存在T細胞為特徵的疾病)相關。 b. 方法及套組
本文所述之方法及套組旨在用於定量測定樣品中的IL2Rγ或其片段，例如天然及/或重組IL2Rγ，其係藉由將樣品酸化至足以使樣品中之IL2Rγ自其複合物解離的pH來進行。在方法及套組中使用對IL2Rγ具有特異性之捕捉試劑及偵測試劑來偵測及測定樣品中之IL2Rγ的量或濃度。
本文所述之方法及套組亦提供用於偵測及定量IL2Rγ的捕捉試劑與偵測試劑組合，其中在捕捉試劑結合至IL2Rγ之後，偵測試劑的結合位及抗原決定基可供偵測試劑用於結合至IL2Rγ。
捕捉試劑可為抗IL2Rγ抗體或其抗原結合片段。偵測試劑可為抗IL2Rγ抗體或其抗原結合片段。
抗IL2Rγ抗體以及製備抗IL2R抗體γ的方法可為此項技術中已知的。舉例而言，多種抗IL2Rγ抗體的描述可見於專利公開案US2020/0247894A1中。
捕捉試劑可為US2020/0247894 A1中所揭示之抗IL2Rγ抗體。捕捉試劑可為抗IL2Rγ-Ab2或抗IL2Rγ-Ab1。偵測試劑可為US2020/0247894 A1中所揭示之抗IL2Rγ抗體。偵測試劑可為抗IL2Rγ-Ab2或抗IL2Rγ-Ab1。
本文所揭示之方法可恢復至少70至100%的IL2Rγ之信號，亦即，具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%之恢復率。
樣品可酸化至約4.0至5.0之pH，例如約4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9或5.0之pH。
在一些例示性及非限制性分析中，如本文所述偵測及定量生物樣品中的IL2Rγ，該生物樣品包括血清、血漿、唾液、CSF及尿液。分析使用經作為捕捉劑的生物素標記之抗IL2Rγ抗體(bio-抗IL2Rγ-Ab1)塗覆的鏈黴抗生物素蛋白微定量盤，且使用IL2Rγ作為標準物。在添加至分析盤中之前，在分析稀釋緩衝液(ADB)中稀釋標準物、對照物及樣品。接著使用釕標記的IL2Rγ偵測抗體(Ru-抗IL2Rγ-Ab2)偵測被捕捉的IL2Rγ。接著當藉由讀取器向盤施加電壓時，由釕標記產生電致化學發光信號。所量測的電致化學發光(亦即，計數)與樣品中之總IL2Rγ的濃度成比例。樣品可含有干擾試劑，例如人類抗IL2Rγ抗體Int-IL2Rγ-Ab1。
本發明亦提供評測樣品酸化對定量IL2Rγ之分析靈敏度之影響的方法。該等方法包括：用中性或酸性分析稀釋緩衝液(ADB)培育含有IL2Rγ的樣品以使樣品酸化，例如將樣品之pH降低至4.4-4.0；使用如本揭示案中所述的本發明方法及分析來偵測IL2Rγ；以及將酸化樣品中之IL2Rγ的偵測值與中性樣品之該值進行比較。
本發明亦提供評估干擾劑(例如Int-IL2Rγ-Ab1)存在下之IL2Rγ信號恢復率的方法。將僅包含IL2Rγ或IL2Rγ及一種或多種干擾劑(例如Int-IL2Rγ-Ab1)的樣品用中性或酸性分析稀釋緩衝液(ADB)稀釋以使樣品酸化，例如將樣品之pH降低至4.4-4.0。將自包含干擾劑之樣品偵測到的IL2Rγ信號與自不包含干擾劑之樣品偵測到的信號進行比較，以測定分析物恢復率。 D. 用於偵測及定量EGFR的方法及分析 a. 表皮生長因子受體(EGFR)
EGFR或「人類表皮生長因子受體」或ErbB1或HER1係指由位於染色體7上之EGFR基因編碼的170 kDa 1型跨膜醣蛋白。EGFR在調控細胞增殖、存活、分化及遷移方面發揮基本作用。受體酪胺酸激酶(RTK)的人類表皮生長因子受體由四種成員組成：EGFR (HER1)、HER2、HER3、HER4。EGFR係藉由在其胞外域結合至其同源配位體(諸如EGF (表皮生長因子)及TGFα (轉型生長因子α))而被活化，從而引起EGFR二聚合，隨後發生細胞質域中之酪胺酸殘基的自體磷酸化。EGFR在某些殘基處發生的磷酸化係由Src非受體激酶介導。EGFR活化的信號傳導至多個下游信號級聯，包括有助於細胞生長及增殖的Ras/MARK、PLCƳ1/PCK、PI3K/AKT及STAT路徑。EGFR在Y1086處發生的磷酸化尤其允許轉接蛋白GRB2的結合，從而引起MAPK路徑活化。受體活化及信號傳導後，EGFR被內吞且靶向降解或循環。可溶性EGFR係由EGFR的胞外域組成，其可在生物體液(如血清或血漿)中直接量測。EGFR過度表現已與頭頸部、腦、膀胱、胃、乳房、肺、子宮內膜、子宮頸、外陰、卵巢、食道、胃及鱗狀細胞癌中的不可控之腫瘤生長相關。因此，諸如人類血清之樣品中之EGFR的偵測及量測為疾病診斷及治療藥物監測提供重要方法。 b. 方法
本文所述之分析旨在用於定量測定樣品中的可溶性EGFR或其片段，包括例如天然及/或重組EGFR，其藉由將樣品酸化至足以使樣品中之EGFR自其複合物解離的pH。對EGFR具有特異性之捕捉試劑及偵測試劑在方法及套組中用於偵測及測定樣品中之EGFR的量或濃度。
本文所述之方法及套組亦提供用於偵測及定量EGFR的捕捉試劑與偵測試劑組合，其中在捕捉試劑結合至EGFR之後，偵測試劑的結合位及抗原決定基可供偵測試劑結合至EGFR使用。
捕捉試劑可為抗EGFR抗體或其抗原結合片段。偵測試劑可為抗EGFR抗體或其抗原結合片段。
抗EGFR抗體及製備抗EGFR抗體的方法在此項技術中已知。舉例而言，多種抗EGFR抗體或其抗原結合片段的描述揭示於專利公開案WO 2014/004427及WO 2020/198009中。
樣品中可存在干擾劑。干擾劑可為作為靶向EGFR之藥物投予個體的分子，例如WO 2020/198009中所揭示之人類抗EGFR抗體。
方法可恢復EGFR的至少50%至100%信號，亦即，具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%的恢復率。
樣品可酸化至約4.0至5.0之pH，例如約4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9或5.0之pH。
可藉由添加包含30 mM、25 mM、20 mM、15 mM、10 mM或5 mM乙酸的分析稀釋緩衝液來完成樣品酸化。
在用於測定樣品中之總可溶性EGFR濃度的一些例示性及非限制性分析中，將EGFR捕捉抗體預塗覆於固體載體上以捕捉樣品中之可溶性EGFR。與HRP結合的EGFR偵測抗體係用於偵測被捕捉的EGFR，接著添加過氧化酶特異性受質以產生與樣品中之EGFR的量及濃度成比例的信號強度。
在其他例示性及非限制性分析中，鏈黴抗生物素蛋白微定量盤用經生物素標記之EGFR捕捉抗體塗覆，且使用釕標記的EGFR偵測抗體偵測盤上所捕捉的EGFR。重組EGFR用作標準物。在添加至分析盤中之前，在酸性緩衝液中稀釋標準物、對照物及樣品。當藉由讀取器向分析盤施加電壓時，由釕標記產生電致化學發光信號。所量測的電致化學發光(亦即，計數)與樣品中之EGFR量及濃度成比例。
應瞭解，一種或兩種分析格式可用於本文所揭示之任一實例。
可使用上述方法評測EGFR在中性或酸性分析稀釋緩衝液中、在干擾劑(例如雙特異性人類抗EGFR抗體，諸如Int-EGFR-Ab1)存在下的恢復率。
本發明亦提供評測樣品酸化對定量EGFR之分析靈敏度之影響的方法。方法包括：用中性或酸性分析稀釋緩衝液(ADB)培育含有EGFR的樣品以使樣品酸化，例如將樣品pH降低至4.4-4.0；使用如本揭示案中所述的本發明方法及分析偵測EGFR；以及將酸化樣品中之EGFR的偵測值與中性樣品(例如pH 7.4)之該值進行比較。
本發明亦提供在干擾劑(例如雙特異性人類抗EGFR抗體，諸如Int-EGFR-Ab1)存在下評估EGFR信號恢復率的方法。僅包含EGFR或包含EGFR及一種或多種干擾劑(例如Int-EGFR-Ab1)的樣品用中性或酸性分析稀釋緩衝液(ADB)稀釋以使樣品酸化，例如將樣品pH降低至4.4-4.0。將自包含干擾劑之樣品偵測到的EGFR信號與自不包含干擾劑之樣品偵測到的信號進行比較，以測定分析物恢復率。 E. 用於偵測及定量抗體的方法及分析，該抗體靶向對NPR1具有特異性之人類單株抗體(IgG4亞類)(AbA) a. 對NPR1具有特異性之人類單株抗體(IgG4亞類)(AbA)
利尿鈉肽受體1 (NPR1)為利尿鈉肽ANP及BNP的主要受體。ANP結合至胞外配位體結合域及ATP結合至胞內激酶同源域使細胞質鳥苷酸環化酶活化。AbA為對利尿鈉肽受體1 (NPR1)及候選藥物具有特異性之人類抗體(IgG4亞類)。 b. 方法
本文所述之分析旨在用於定量測定樣品中的AbA，其藉由將樣品酸化至足以使樣品中之AbA自其複合物解離的pH來達成。對AbA具有特異性之捕捉試劑及偵測試劑在方法及套組中用於偵測及測定樣品中之AbA的量或濃度。
本文所述之方法及套組亦提供用於偵測及定量AbA的捕捉試劑與偵測試劑組合，其中在捕捉試劑結合至AbA之後，偵測試劑的結合位及抗原決定基可供偵測試劑結合至AbA使用。
捕捉試劑可為抗AbA抗體或其抗原結合片段。偵測試劑可為抗AbA抗體或其抗原結合片段。
捕捉劑可為小鼠抗AbA單株抗體(例如_抗AbA-Ab1)。偵測試劑可選自抗人類IgG4 Fc單株抗體(例如抗hIgG4Fc)或小鼠抗AbA單株抗體(例如抗AbA-Ab2)。抗人類IgG4 Fc抗體之實例可見於 Mol Cancer Ther(2019) 18 (11):2051-2062。
分析中可存在一種或多種干擾劑，例如AbA逆轉劑，其為人類抗AbA單株抗體(Int-AbA-Ab1、Int-AbA-Ab2、AbB及Int-AbA-Ab3)。
樣品酸化可恢復分析物之至少50%、55%、60%、65%、70%至100%信號，亦即，具有至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%之恢復率。
樣品可酸化至約4.0至5.0之pH，例如約4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9或5.0之pH。
一些例示性及非限制性分析格式係關於藉由將經生物素標記之AbA捕捉試劑固著於經抗生物素蛋白塗覆之盤以捕捉總AbA來測定樣品中的總AbA濃度以及利用釕結合的抗人類IgG4 Fc抗體(抗hIgG4Fc)偵測被捕捉的AbA。接著當藉由讀取器向分析盤施加電壓時，由釕標記產生電致化學發光信號。所量測之電致化學發光與樣品中之總AbA濃度成比例。
在其他例示性及非限制性分析格式中，以經生物素標記之小鼠抗AbA單株抗體抗AbA-Ab1作為捕捉劑來塗覆鏈黴抗生物素蛋白微定量盤，且使用釕化小鼠抗AbA單株抗體REGN1049作為偵測劑。如上文所述測定AbA濃度。
應瞭解，本文所揭示之任一發明均可使用一種或多種分析格式。
本發明亦提供評測樣品酸化對定量AbA之分析靈敏度之影響的方法。方法包括：用中性或酸性分析稀釋緩衝液(ADB)培育含有AbA的樣品以使樣品酸化，例如將樣品pH降低至5.0-4.0；使用如本揭示案中所述的本發明方法及分析偵測AbA；以及將酸化樣品中之EGFR的偵測值與中性樣品(例如pH 7.4)之該值進行比較。
本發明亦提供用於在一種或多種干擾劑(Int-AbA-Ab1、Int-AbA-Ab2、AbB或Int-AbA-Ab3)存在下評估AbA信號恢復率的方法。僅包含AbA或包含AbA及一種或多種干擾劑(例如Int-AbA-Ab1、Int-AbA-Ab2、AbB或Int-AbA-Ab3)的樣品用中性或酸性分析稀釋緩衝液(ADB)稀釋以使樣品酸化，例如將樣品pH降低至5.0-4.0。將自包含干擾劑之樣品偵測到的AbA信號與自不包含干擾劑之樣品偵測到的信號進行比較，以測定分析物恢復率。
在一些例示性及非限制性實例中，在中性分析稀釋緩衝液與酸性分析稀釋緩衝液(例如含有30 mM乙酸的分析稀釋緩衝液)中、在一種或多種干擾劑(例如Int-AbA-Ab1、Int-AbA-Ab2、AbB及Int-AbA-Ab3)存在下量測AbA恢復率。藉由添加不同量的干擾劑以達到0至3,300:1範圍內之干擾劑:AbA之比來評估AbA對干擾劑的耐受性。
13.7 ng/mL至7.5 µg/mL (例如13.7 ng/mL及7.5 µg/mL)濃度之AbA在不同量之AbB存在下的恢復率可為至少55至100%，例如至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%。 F. 用於偵測及定量針對NPR1之人類單株IgG4抗體之逆轉劑的方法及分析 a. 針對NPR1之人類單株IgG4抗體的逆轉劑(AbB)
AbB為針對AbA (對NPR1具有特異性之人類單株抗體(IgG4亞類))的人類單價單株抗體。 b. 方法
本文所述之分析旨在用於定量測定樣品中的AbB，其藉由將樣品酸化至足以使樣品中之AbB自其複合物解離的pH來達成。對AbB具有特異性之捕捉試劑及偵測試劑在方法及套組中用於偵測及測定樣品中之AbB的量或濃度。
本文所述之方法及套組亦提供用於偵測及定量AbB的捕捉試劑與偵測試劑組合，其中在捕捉試劑結合至AbB之後，偵測試劑的結合位及抗原決定基可供偵測試劑結合至AbB使用。
捕捉試劑可為抗AbB抗體或其抗原結合片段。偵測試劑可為抗AbB抗體或其抗原結合片段。
捕捉劑可為小鼠抗AbB抗體(抗AbB-Ab1或抗AbB-Ab2)。偵測試劑可為小鼠抗AbB抗體(抗AbB-Ab1或抗AbB-Ab2)。
分析中可存在干擾劑，例如AbA。
樣品酸化可恢復分析物之至少70%至100%信號，亦即，具有至少約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%之恢復率。
樣品可酸化至約4.0至5.0之pH，例如約4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9或5.0之pH。
可藉由添加包含30 mM乙酸之分析稀釋緩衝液來完成樣品酸化。
在一些例示性及非限制性分析中，藉由使用小鼠抗AbB抗體(抗AbB-Ab2)作為捕捉劑及不同的經生物素標記之小鼠抗AbB抗體(抗AbB-Ab1)作為偵測劑來定量生物樣品(諸如人類血清)中的AbB。AbB的量與藉由偵測劑偵測到的信號強度成比例。
本發明亦提供評測樣品酸化對定量AbB之分析靈敏度之影響的方法。方法包括：用中性或酸性分析稀釋緩衝液(ADB)培育含有AbB的樣品以使樣品酸化，例如將樣品pH降低至5.0-4.0；使用如本揭示案中所述的本發明方法及分析偵測AbB；以及將酸化樣品中之AbB的偵測值與中性樣品(例如pH 7.4)之該值進行比較。
本發明亦提供評估干擾劑(例如AbA)存在下之AbB信號恢復率的方法。僅包含AbB或包含AbB及一種或多種干擾劑(例如AbA)的樣品用中性或酸性分析稀釋緩衝液(ADB)稀釋以使樣品酸化，例如將樣品pH降低至5.0-4.0。將自包含干擾劑之樣品偵測到的AbB信號與自不包含干擾劑之樣品偵測到的信號進行比較，以測定分析物恢復率。
0.078 ng/mL AbB在不同量之AbA存在下的恢復率可為至少55至100%，例如至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%。 G. 用於偵測及定量因子XI的方法及分析 a. 因子XI
因子XI或FXI為607個胺基酸之相同亞單元的160 kDa經二硫鍵連接之二聚體，各亞單元含有四個90或91胺基酸重複序列及C端胰蛋白酶樣催化域。FXI編碼凝血因子XI，該凝血因子藉由活化因子IX蛋白來觸發凝血級聯之固有路徑的中間階段。因子XI缺乏(亦已知為血友病C、血漿凝血活酶前期缺乏或羅森塔爾症候群(Rosenthal syndrome))為可導致異常出血的病症，尤其是在創傷或手術之後。FXI缺乏為通常發生於德系猶太人(Ashkenazi Jewish)後裔患者中的常染色體隱性遺傳病。 b. 方法
本文所述之分析旨在用於定量測定樣品中的總因子XI抗原，例如天然及/或重組因子XI，其藉由將樣品酸化至足以使樣品中之FXI自其複合物解離的pH。對FXI具有特異性之捕捉試劑及偵測試劑在方法及套組中用於偵測及測定樣品中之FXI的量或濃度。
本文所述之方法及套組亦提供用於偵測及定量FXI的捕捉試劑與偵測試劑組合，其中在捕捉試劑結合至FXI之後，偵測試劑的結合位及抗原決定基可供偵測試劑結合至FXI使用。
捕捉試劑可為抗FXI抗體或其抗原結合片段。偵測試劑可為抗FXI抗體或其抗原結合片段。
抗FXI抗體以及製備抗FXI抗體的方法在此項技術中已知。抗FXI抗體亦可市購(例如Affinity Biologicals目錄號FXI-AG)。
分析中可存在干擾劑，例如人類抗EGFR單株抗體(例如Int-FXI-Ab1)。
樣品酸化可恢復FXI之至少70%至100%信號，亦即，具有至少約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%之恢復率。
樣品可酸化至約2.0至5.0之pH，例如約2.0、2.2、2.4、2.6、2.8、3.0、3.2、3.4、3.6、3.8、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9或5.0之pH。
可藉由添加包含30至90 mM乙酸(例如90 mM、60 mM、40 mM或30 mM乙酸)的分析稀釋緩衝液來完成樣品酸化。
在一些例示性及非限制性分析中，如本文所述偵測及定量樣品中的FXI，樣品包括血清、血漿、唾液、CSF及尿液。分析程序使用經山羊抗人類FXI多株抗體塗覆的微定量盤且使用重組的猴FXI作為標準物。用與過氧化酶(HPA)結合之山羊抗人類FXI多株抗體偵測培養盤上所捕捉之FXI。接著添加過氧化酶特異性受質以達成與總FXI濃度成比例的信號強度。
本發明亦提供評測樣品酸化對定量FXI之分析靈敏度之影響的方法。方法包括：用中性或酸性分析稀釋緩衝液(ADB)培育含有FXI的樣品以使樣品酸化，例如將樣品pH降低至5.0-2.0；使用如本揭示案中所述的本發明方法及分析偵測FXI；以及將酸化樣品中之FXI的偵測值與中性樣品(例如pH 7.4)之該值進行比較。
本發明亦提供在干擾劑(例如抗FXI抗體，例如Int-FXI-Ab1)存在下評估FXI信號恢復率的方法。僅包含FXI或包含FXI及一種或多種干擾劑(例如Int-FXI-Ab1)的樣品用中性或酸性分析稀釋緩衝液(ADB)稀釋以使樣品酸化，例如將樣品pH降低至5.0-2.0。將自包含干擾劑之樣品偵測到的FXI信號與自不包含干擾劑之樣品偵測到的信號進行比較，以測定分析物恢復率。
圖7描繪用於測定樣品中之因子XI (FXI)濃度之例示性分析方法的示意圖。抗FXI抗體結合至固體盤以捕捉FXI。HRP結合的抗因子XI抗體係用於偵測被捕捉的FXI。 表 A ：某些實例中使用的分析物、捕捉試劑、偵測試劑及干擾劑清單
名稱 一些實例中的描述及用途
AbA 針對NPR1的人類IgG4單株抗體 分析物 AbB之干擾劑
抗AbA-Ab1 小鼠抗AbA單株抗體 捕捉試劑
抗AbA-Ab2 第二小鼠抗AbA單株抗體 偵測試劑
抗hIgG4Fc 小鼠抗人類IgG4 Fc特異性單株抗體 偵測試劑
Int-AbA-Ab1 針對AbA的人類單株抗體 干擾劑
Int-AbA-Ab2 針對AbA的第二人類單株抗體 干擾劑
Int-AbA-Ab3 針對AbA的第三人類單價單株抗體 干擾劑
AbB 針對AbA的人類單價單株抗體 分析物 AbA之干擾劑
抗AbB-Ab1 小鼠抗AbB抗體
抗AbB-Ab2 第二小鼠抗AbB抗體
抗IL2Rγ-Ab1 人類抗IL2Rγ gamma單株抗體 針對IL2Rγ的捕捉或偵測試劑
抗IL2Rγ-Ab2 第二人類抗IL2Rγ gamma單株抗體 針對IL2Rγ的捕捉或偵測試劑
Int-IL2Rγ-Ab1 人類抗IL2Rγ gamma單株抗體 針對IL2Rγ的干擾劑
Int-EGFR-Ab1 針對EGFR的雙特異性人類單株抗體 干擾試劑
Int-FXI-Ab1 抗因子XI抗體 干擾劑
VII. 實例
藉由以下實例進一步描述本發明，該等實例不以任何方式限制本發明。熟習此項技術者可結合本文所含的教示內容及資料來決定改變或組合以下實例的實施順序。 實例1：用於偵測IL2Rγ的分析
此研究係為了改良IL2Rγ偵測及定量的分析靈敏度而進行，該改良係藉由最佳化程序及pH條件，從而將樣品中的潛在藥物干擾最小化而實現。此研究亦檢查中和酸化樣品是否為捕捉試劑捕捉樣品中之IL2Rγ所必需的。簡言之，經生物素標記之人類抗IL2Rγ抗體，即抗IL2Rγ-Ab1結合至固體載體，該固體載體點漬有鏈黴抗生物素蛋白以捕捉IL2Rγ，且釕標記的人類抗IL2Rγ抗體，即抗IL2Rγ-Ab2用於偵測被捕捉的人類IL2Rγ。使用MSD讀取緩衝液產生與樣品中之總IL2Rγ濃度成比例的釕標記信號強度(圖1A)。樣品中可存在干擾劑，例如人類抗IL2Rγ抗體Int-IL2Rγ-Ab1。 材料、方法及結果
藉由每孔添加300 µL 5% BSA阻斷緩衝液且在室溫下培育1至4小時來阻斷經鏈黴抗生物素蛋白塗覆的微定量盤。將2 µg/mL濃度的經生物素標記之抗IL2Rγ抗體(Bio-抗IL2Rγ-Ab1)添加至微定量盤中且培育約1小時。樣品在中性分析稀釋緩衝液(ADB)或含有80 mM至150 mM乙酸的ADB中以1:4之比稀釋，其中兩種緩衝液均含有5%牛血清白蛋白(BSA)。在不中和的情況下，50 µL經稀釋的樣品在抗體塗覆的微定量盤中培育1小時。在自各孔移出經稀釋的樣品之後，將200 ng/ml濃度之50 µL經釕標記之抗IL2Rγ抗體(Ru-抗IL2Rγ-Ab2)添加至微定量盤中且培育約1小時。在實驗結束時，向分析盤中每孔添加150 µL 2X MSD GOLD讀取緩衝液。在添加讀取緩衝液之後的10分鐘內，用MSD讀盤器獲得OD450-540 nm資料。 資料分析
使用4PLV方程式，基於各校準劑的標稱濃度，將各樣品之由釕標記產生且藉由MSD讀取器讀取的信號計數相對於經擬合的校準劑曲線作圖。基於與IL2Rγ標準物之已知濃度對應的計數值來外推IL2Rγ的濃度。 結果
當樣品用含有80至150 mM乙酸的ADB稀釋，使樣品pH自7.4降低至4.4至4.0之範圍時，總信號減少(參見圖1B)。信號減少導致定量下限(LLOQ)升高，比中性pH之基線樣品高約5至10倍。換言之，當樣品酸化時，分析之靈敏度降低。
在干擾劑Int-IL2Rγ-Ab1 (Int-IL2Rγ-Ab1)存在下，中性分析稀釋緩衝液中之來自IL2Rγ的信號減少至低於60%。藉由添加pH降低之ADB來降低樣品pH可使信號恢復率增加，且約4.2之pH值使得對干擾劑的耐受性可接受(參見圖1C)。
驚人的是，儘管酸化引起Int-IL2Rγ-Ab1與IL2Rγ解離且減少來自Int-IL2Rγ-Ab1的干擾，但在低至4.0的pH下，酸化不影響Bio-抗IL2Rγ-Ab1與IL2Rγ之結合效率，此由高達90至100%的信號恢復率證明。此表明無需在將樣品與捕捉劑一起培育之前對酸化樣品進行中和，從而簡化分析。 實例2：用於偵測EGFR的分析
在用於測定樣品中之總可溶性EGFR濃度的例示性分析中，將EGFR捕捉抗體預塗覆於固體載體上以捕捉樣品中之可溶性EGFR。使用與HRP結合的EGFR偵測抗體偵測被捕捉的EGFR (圖2A)。 材料、方法及結果
製備50X EGFR參考標準物：在實驗之前，在校準劑稀釋液中如下製備用於標準曲線的50X EGFR標準物：以1:2稀釋度連續稀釋1000 ng/ml EGFR溶液，以獲得含有1000、500、250、125、62.5、31.3、15.6及0 ng/mL EGFR的標準物。
製備50X EGFR品質對照：使用含有已知濃度之EGFR的樣品作為品質對照來驗證分析的效能。在校準劑稀釋液中製備濃度為750 ng/mL、120 ng/mL及45 ng/mL的50X高品質對照(HQC)、中品質對照(MQC)、低品質對照(LQC)。
在分析緩衝液中製備標準物、品質對照及樣品：將50個標準物、50X QC及樣品中之各者在含有20 mM乙酸的校準劑稀釋液中以1:50稀釋。
分析盤製備：經抗EGFR多株抗體及偵測抗體塗覆的微定量盤為人類EGFR Quantikine ELISA套組(R&D Systems Quantikine套組目錄號DEGFR0)之一部分。在將每孔100 µl酸性分析稀釋液添加至經抗EGFR抗體塗覆的抗EGFR微定量盤(R&D Systems，目錄號/零件號893730)之後，向該微定量盤中一式兩份地添加另外每孔50 µl校準劑、QC及研究的酸化樣品(未經中和)。將盤覆蓋且在室溫下培育120±10分鐘，同時以200 rpm搖振。在每孔使用300 µl 1X洗滌緩衝液洗滌5次之後，以每孔200 µL向微定量盤中添加偵測抗體(辣根過氧化酶結合的抗EGFR多株抗體，R&D Systems，目錄號/零件號893731)。將盤覆蓋且在室溫下、在暗處培育另外120±10分鐘，同時以200 rpm搖振。在實驗結束時，向微定量盤中每孔添加50 µl終止溶液，且在添加終止溶液之後30分鐘內使用微定量盤讀取器量測OD450 – 540nm吸光度。 資料分析
使用4PLV方程式，基於各校準劑的標稱濃度，將各樣品的平均光學密度(OD)相對於經擬合的校準劑曲線作圖。基於與EGFR標準物之已知濃度對應的OD值來外推EGFR的濃度。 結果
使用本文所揭示之方法評測樣品酸化對Int-EGFR-Ab1藥物耐受性的影響。更具體而言，將0至2 mg/mL干擾劑Int-EGFR-Ab1摻加至含有EGFR的樣品中，以測試pH對Int-EGFR-Ab1:EGFR解離的影響。樣品在含有或不含有30 mM乙酸的RD5L分析緩衝液中以1:50稀釋。將100 μl的RD1-72套組分析緩衝稀釋液添加至經塗覆之微定量盤的各孔中，且將50 μl的經稀釋樣品與RD1-72稀釋液混合於各孔中。經稀釋的樣品在孔中培育約2小時，隨後將與HRP結合的抗EGFR抗體培育約2小時。用洗滌緩衝液洗滌5次之後，向各孔中添加200 μl TMB受質且在暗處培育約25分鐘，且添加50 μl終止溶液(2 N硫酸)以終止顯色。使用微定量盤讀取器量測OD 450-540吸光度(參見圖2A中的分析示意圖)。
根據圖2B的結果證明，EGFR偵測結果在中性ADB (pH=7.4)中受到抑制，而樣品酸化顯著增加EGFR複合物的解離及EGFR偵測結果。另外，含有30 mM乙酸的分析稀釋緩衝液(pH=4.5)顯著改良EGFR分析對Int-EGFR-Ab1的耐受性；且具體而言，在高達2 mg/mL之Int-EGFR-Ab1存在下，分析物恢復率為約100%。
在使用經生物素標記之EGFR抗體作為捕捉試劑及釕標記之EGFR抗體作為偵測試劑的類似分析中，觀測到分析物偵測結果出現類似改良(圖3A)。此等抗體來自MSD R-PLEX人類EGFR抗體組(目錄號F21N5)，且捕捉試劑與偵測試劑均為山羊多株抗體。在樣品酸化之後，在高達1 mg/mL的Int-EGFR-Ab1濃度下，分析物恢復率為約100%，且在2 mg/mL Int-EGFR-Ab1存在下，分析物恢復率高於75% (圖3B)。
弱酸性樣品中的EGFR偵測結果略低於中性ADB緩衝液(圖3C)，表明根據圖3A中之分析的EGFR與抗EGFR抗體之結合在某種程度上具有pH敏感性，且相較於經中性ADB處理的樣品，酸性ADB使EGFR偵測結果稍微降低。
在圖3D中，在摻加有0 µg/mL、31.3 µg/mL、250 µg/mL及2000 µg/mL純淨Int-EGFR-Ab1的含EGFR樣品中，利用R-PLEX酸滴定分析，評測各種pH之樣品酸化對EGFR恢復率的影響。資料表明，降低樣品pH使EGFR對干擾劑Int-EGFR-Ab1的耐受性增加。值得注意的是，在樣品稀釋緩衝液含有5至15 mM乙酸的情況下，高濃度的Int-EGFR-Ab1 (2000 µg/mL)對EGFR恢復率產生不利影響，而含有20至30 mM乙酸的ADB (樣品pH 5-4.5)使EGFR對至多2 mg/mL Int-EGFR-Ab1的耐受性穩定化且具有超過90%恢復率。總體資料亦顯示，即使不在捕捉抗體結合步驟之前對酸化樣品進行中和，該分析亦極有效地恢復酸化樣品中之EGFR的信號。
使用含有不同量之血清的樣品進行分析測試，以測定其偵測下限或定量下限。在約pH 5.0，在2%人類血清存在下，可偵測到低至0.31 ng/mL的EGFR。在未經稀釋之人類血清存在下，可偵測到低至15.6 ng/mL的EGFR。 實例3：用於偵測AbA的免疫分析
在用於測定樣品中之AbA (針對NPR1的人類IgG4單株抗體)濃度的例示性分析中，經生物素標記之小鼠抗AbA單株抗體(抗AbA-Ab1)作為捕捉劑固著於經抗生物素蛋白塗覆之盤，且使用與釕結合的小鼠抗人類IgG4 Fc抗體(抗hIgG4Fc)偵測被捕捉的AbA。接著當藉由MSD讀取器向盤施加電壓時，由釕標記產生電致化學發光信號(圖4A)。在另一種例示性分析中，使用釕化抗AbA-Ab2 (小鼠抗AbA單株抗體)作為偵測劑。(圖5A)。 材料及方法
製備50X AbA標準物：在實驗之前，在人類血清中如下製備用於標準曲線的50X AbA標準物：以1:3稀釋度連續稀釋1 mg/mL AbA安慰劑，以獲得含有10000、3333、1111、370、123、41.2、13.7及0 ng/mL AbA的標準物。冷凍的標準物可在儲存日期之後長達90天使用。
製備50X AbA品質對照：使用含有已知濃度之AbA的樣品作為品質對照來驗證分析的效能。在人類血清中製備濃度為7500 ng/mL、400 ng/mL及40 ng/mL的50X高品質對照(HQC)、中品質對照(MQC)、低品質對照(LQC)。
在分析緩衝液中製備標準物、品質對照及樣品：藉由用ADB稀釋300 mM乙酸來製備30 mM酸性分析稀釋緩衝液(ADB)，其接著用於製備含有10 µg/mL小鼠IgG的分析緩衝液。將50個標準物、50X QC及樣品各自在分析緩衝液中以1:50稀釋以用於分析程序。
分析盤製備：若在同一天使用，則藉由每孔添加300 µL 5% BSA阻斷緩衝液且在室溫下培育1至2小時來阻斷經鏈黴抗生物素蛋白塗覆的微定量盤。使用MSD_PLATE_3X洗滌程式，用每孔300 µL 1X洗滌緩衝液將經阻斷的微定量盤洗滌3次。在ADB中以1 µg/mL製備捕捉抗體(生物素-抗AbA-Ab1)且接著以每孔50 µL添加至微定量盤中。接著覆蓋微定量盤且在室溫下培育1至2小時，在培育期間以400 pm搖振。接著使用MSD_PLATE_3X洗滌程式，用每孔300 µL 1X洗滌緩衝液將微定量盤洗滌3次。
分析程序：將所製備的標準物、QC及樣品(未經中和)以每孔50 µL一式兩份地添加至微定量盤中，將微定量盤覆蓋且在室溫下培育60±10分鐘，在培育期間以400 rpm搖振。接著使用MSD_PLATE_3X洗滌程式，用每孔300 µL 1X洗滌緩衝液將微定量盤洗滌3次。在ADB中以400 ng/mL製備偵測抗體(Ru-抗AbA-Ab2)且以每孔50 µL添加至盤中，培育60±10分鐘，同時以400 rpm搖振。在使用MSD_PLATE_3X洗滌程式，用每孔300 μL 1X洗滌緩衝液洗滌3次之後，向分析盤中每孔添加150 µL MSD GOLD讀取緩衝液(MSD，目錄號R92TG)。在添加讀取緩衝液之後的10分鐘內，用MSD讀盤器獲得資料。 資料分析
使用4PLV方程式，基於各校準劑的標稱濃度，將各樣品的平均計數(信號)相對於經擬合的校準劑曲線作圖。基於與AbA標準物之已知濃度對應的計數值來外推AbA的濃度。 結果
圖5A至圖5B中所描繪的分析使用經生物素標記之抗AbA-Ab1作為捕捉劑，且使用釕標記的抗AbA-Ab2作為偵測劑。抗AbA-Ab1與抗AbA-Ab2均結合至AbA的CDR區(圖5A)。在中性(pH=7.4)與酸性(pH=4.5) ADB下評測不同含量之AbA對干擾劑AbB的耐受性。亦即，高品質對照樣品(HQC)含有7.5 µg/mL AbA，且定量下限樣品(LLOQ)含有13.7 ng/mL。各樣品在含有10 µg/mL小鼠IgG的中性緩衝液(pH 7.4)或含有30 mM乙酸及10 µg/mL小鼠IgG的弱酸性緩衝液中以1:50稀釋。在至多1 mg/mL之干擾劑AbB存在下量測AbA恢復率。
因此，在干擾劑AbB存在下，HQC與LLOQ樣品均具有高於95%的類似AbA恢復率(圖5B)。另外，樣品之弱酸化有效地解離AbB:AbA複合物，使得在pH 4.5下對至少1 mg/mL AbB的耐受性可接受。
在類似分析中，使用釕化的抗hIgG4Fc作為偵測劑。(圖4A)。為了評測樣品酸化對AbA恢復率及分析靈敏度的影響，將阻斷劑添加至含有AbA的樣品中以達到至多約3300:1的阻斷劑:AbA之比，該阻斷劑係選自干擾劑Int-AbA-Ab1、Int-AbA-Ab2、AbB及Int-AbA-Ab3 (AbA逆轉劑，其為人類抗AbA單株抗體)中之一者。藉由在含有10 µg/mL小鼠IgG的中性ADB (pH=7.4) (圖4B)或含有30 mM乙酸與10 µg/mL小鼠IgG的酸性ADB (pH=約4.5) (圖4C)中進行1:50樣品稀釋來評測AbA恢復率。用類似於上述的步驟進行夾心免疫分析。
根據圖4B的結果表明，在中性緩衝液中稀釋之後，干擾劑Int-AbA-Ab1、Int-AbA-Ab2、AbB及Int-AbA-Ab3的存在會抑制AbA的偵測。此反映為當干擾劑:AbA之比(阻斷劑:AbA之比)大於10:1時，AbA恢復率降低。更具體而言，當Int-AbA-Ab1:AbA及Int-AbA-Ab2:AbA的比大於10:1且AbB:AbA及Int-AbA-Ab3:AbA的比大於100:1時，AbA恢復率下降至低於75%。當Int-AbA-Ab1:AbA及Int-AbA-Ab2:AbA的比為100:1及更高時，AbA恢復率降低至小於10%。
圖4C表明，當阻斷劑:AbA之比大於10:1時，樣品酸化在AbA偵測中有效地阻止Int-AbA-Ab1及AbB的干擾，但不能有效地阻止Int-AbA-Ab2及Int-AbA-Ab3的干擾。在含有30 mM乙酸的分析稀釋緩衝液中，當Int-AbA-Ab1:AbA及AbB:AbA之比高達約3300:1時，AbA信號完全恢復。然而，當阻斷劑:AbA之比為約3300:1時，AbA的恢復率對於Int-AbA-Ab2而言仍低至6%且對於Int-AbA-Ab3而言為14%。
此等資料表明，在干擾劑存在下，樣品酸化選擇性地增加AbA的偵測。
圖4B、圖4C及圖5B中所展示的資料表明，在免疫分析中，樣品酸化有助於防止由Int-AbA-Ab1及AbB引起的藥物干擾，而不影響AbA定量靈敏度。總體資料亦顯示，即使未在捕捉抗體結合步驟之前對酸化樣品進行中和，該分析亦極有效地恢復酸化樣品中之AbA的信號。
使用含有不同量之血清的樣品進行分析測試，以測定其偵測下限或定量下限。在約pH 4.5，在2%人類血清存在下，可偵測到低至0.27 ng/mL的AbA。在未經稀釋之人類血清存在下，可偵測到低至13.7 ng/mL的AbA。 實例4：用於偵測針對NPR1之人類單株IgG4抗體之逆轉劑(AbB)的分析
此實驗係關於一種與上文所述之分析類似的分析，其係用於測定樣品中之總AbB濃度。在一項例示性分析中，使抗AbB抗體作為捕捉劑固著於固體盤，且使用不同的經生物素標記之小鼠抗AbB抗體(生物素-抗AbB-Ab1)偵測被捕捉的AbB。使用NeutrAvidin-HRP (ThermoFisher目錄號31001)及Pico化學發光受質產生讀數，該讀數係關於與被捕捉之AbB結合之偵測試劑之量以及AbB之量及濃度(圖6A)。樣品可含有干擾試劑AbA。 結果
為了評測樣品酸化對於AbB對干擾劑AbA的耐受性之影響，在pH=7.4及pH=4.5，在31.25 µg/mL至2 mg/mL AbA存在下量測0.078 µg/mL (LLOQ) AbB的恢復率(圖6B)。相較於中性分析結合緩衝液(ADB)，酸性ADB使恢復率顯著增強至97-105%，證明樣品酸化有效地改良AbB定量分析的靈敏度及其對AbA的耐受性(參見圖6B)。資料亦顯示，即使未在捕捉抗體結合步驟之前對酸化樣品進行中和，該分析亦極有效地恢復酸化樣品中之AbB的信號。
參照本段落之後所列舉的附圖描述本發明之非限制性範疇及實例。超過一個圖中出現的相同特徵通常在其出現的所有圖中用相同標號標記。
圖1A為用於測定樣品中之IL2Rγ濃度之例示性分析的示意圖。經生物素標記之人類抗IL2Rγ抗體(Bio-抗IL2Rγ-Ab1)結合至固體載體，該固體載體經捕捉IL2Rγ的鏈黴抗生物素蛋白塗覆。釕標記之人類抗IL2Rγ抗體(Ru-抗IL2Rγ-Ab2)用於偵測被捕捉的IL2Rγ。分析中可存在干擾劑(例如抗IL2Rγ抗體Int-IL2Rγ-Ab1)。
圖1B為曲線圖，其描繪經乙酸處理之IL2Rγ樣品的標準曲線信號(計數)。ADB：分析稀釋緩衝液。
圖1C為曲線圖，其描繪在用含有0 mM、80 mM、100 mM、120 mM及150 mM乙酸溶液的ADB稀釋樣品之後，在不同量之干擾劑Int-IL2Rγ-Ab1 (Int-IL2Rγ-Ab1)(針對IL2Rγ的另一種人類單株抗體)存在下，1 ng/mL IL2Rγ的信號恢復百分比。
圖2A為用於測定樣品中之人類EGFR濃度之例示性分析的示意圖。抗EGFR抗體(R&D Systems，目錄號/零件號893730)直接塗覆於固體載體上。辣根過氧化酶(HRP)結合的抗EGFR抗體(R&D Systems，目錄號/零件號893731)用於偵測被捕捉的EGFR。
圖2B為曲線圖，其描繪在用中性分析稀釋緩衝液(ADB)或含有30 mM乙酸溶液之ADB處理之後(如圖2A中所描繪)，在不同量之干擾劑Int-EGFR-Ab1存在下，兩個樣品(池1及池2)中的EGFR信號恢復百分比。
圖3A為用於測定樣品中之EGFR濃度之例示性分析的示意圖。經生物素標記之山羊多株抗EGFR抗體結合至固體載體，該固體載體點漬有捕捉EGFR的鏈黴抗生物素蛋白，且釕標記之山羊多株抗EGFR抗體係用於偵測被捕捉的EGFR (MSD R-PLEX人類EGFR抗體組，目錄號F21N5)。
圖3B為曲線圖，其描繪使用如圖3A中所描繪的分析，在用中性ADB或含有30 mM乙酸溶液之ADB處理之後，在不同濃度之干擾劑Int-EGFR-Ab1 (另一種抗EGFR抗體)存在下的EGFR信號恢復百分比。
圖3C為曲線圖，其描繪使用如圖3A中所描繪的分析、在分析稀釋緩衝液(ADB)或含有30 mM乙酸溶液之ADB中稀釋之人類EGFR樣品的信號(計數)。
圖3D為條形圖，其顯示在用含有0 mM、5 mM、10 mM、15 mM、20 mM、25 mM及30 mM乙酸(基於圖3A中所述的分析、使用R-PLEX酸滴定)之ADB處理之後，在0、31.3、250或2000 µg/ml干擾劑Int-EGFR-Ab1存在下的EGFR恢復率。
圖4A為基於本發明之一實例之例示性分析的示意圖，其用於測定樣品中之對利尿鈉肽受體1 (NPR1)(AbA)具有特異性之人類單株抗體(IgG4亞類)的濃度。結合至AbA之可變CDR區的經生物素標記之小鼠單株抗體(Bio-抗AbA-Ab1)與固體載體結合，該固體載體點漬有捕捉AbA的鏈黴抗生物素蛋白。釕標記之抗hIgG4Fc抗體(Ru-抗hIgG4Fc)為抗人類IgG4 Fc特異性抗體，其用於偵測被捕捉的AbA。
圖4B為曲線圖，其描繪使用圖4A中所描繪之分析，在用中性ADB稀釋之後，在干擾劑(針對AbA的人類單株抗體：Int-AbA-Ab1，Int-AbA-Ab2；針對AbA的人類單價單株抗體：AbB及Int-AbA-Ab3)存在下的AbA信號恢復百分比，其中阻斷劑:AbA之比為至多約3,300:1。
圖4C為曲線圖，其描繪使用圖4A中所描繪之分析，在用含有30 mM乙酸的ADB稀釋之後，在干擾劑(Int-AbA-Ab1、Int-AbA-Ab2、AbB及Int-AbA-Ab3)存在下的AbA信號恢復百分比，其中阻斷劑:AbA之比為至多約3300:1。
圖5A為基於本發明之另一實例之例示性分析的示意圖，其用於測定樣品中之AbA濃度。經生物素標記之抗體(生物素-抗AbA-Ab1)結合至固體載體，該固體載體點漬有捕捉AbA的鏈黴抗生物素蛋白。釕標記之小鼠抗AbA單株抗體(抗AbA-Ab2)係用於偵測被捕捉的AbA。抗AbA-Ab1與抗AbA-Ab2均結合至AbA的可變CDR區。
圖5B為曲線圖，其描繪使用圖5A中所描繪之分析，在pH 4.5或pH 7.4，在15.6 µg/ml至1 mg/mL干擾劑AbB存在下，在定量下限(LLOQ)與高品質對照(HQC)水平下測試的AbA信號恢復百分比。
圖6A為例示性分析之示意圖，其用於測定樣品中之AbB (針對人類抗NPR1 IgG4抗體AbA的人類單價單株抗體)濃度。抗AbB抗體結合至固體載體以捕捉AbB。經生物素標記之小鼠抗AbB抗體(生物素-抗AbB-Ab1)係用於偵測被捕捉的AbB。
圖6B為曲線圖，其描繪使用圖6A中所描繪之分析，在pH 4.5或pH 7.4，在31.25 µg/ml至1 mg/mL AbA作為干擾劑存在下，在定量下限(LLOQ)水平下測試的AbB信號恢復百分比。
圖7為用於測定樣品中之因子XI (FXI)濃度之例示性分析方法的示意圖。抗FXI抗體結合至固體盤以捕捉FXI。HRP結合的抗因子XI抗體係用於偵測被捕捉的FXI。

Claims (64)

  1. 一種用於偵測樣品中之分析物的方法，包括以下步驟： (i)用弱酸稀釋包含該分析物的樣品以產生酸化樣品； (ii)將該酸化樣品直接添加至固體載體中而不中和該酸化樣品，其中該固體載體經可結合至該分析物的捕捉試劑塗覆； (iii)在第一培育時段之後，自該固體載體移除該酸化樣品； (iv)將偵測試劑直接添加至該固體載體中； (v)在第二培育時段之後，自該固體載體移除該偵測試劑；以及 (vi)偵測結合至被該捕捉試劑捕捉之該分析物的該偵測試劑，其中所偵測之該偵測試劑的數量與該樣品中之該分析物的數量相關。
  2. 如請求項1之方法，進一步包括在步驟(iii)之後洗滌該固體載體。
  3. 如請求項1至2中任一項之方法，進一步包括在步驟(v)之後，洗滌該固體載體。
  4. 如前述請求項中任一項之方法，其中該酸化樣品具有約3.0至6.5之pH。
  5. 如請求項4之方法，其中該酸化樣品具有約4.1、約4.4或約4.5之pH。
  6. 如前述請求項中任一項之方法，其中該分析物為IL2Rγ、EGFR、對利尿鈉肽受體1具有特異性之抗體、針對抗NPR1抗體之人類單價單株抗體，或因子XI。
  7. 如前述請求項中任一項之方法，其中該樣品為選自由以下組成之群的生物體液：血液、血清、血漿、腦脊髓液(CSF)、尿液及唾液。
  8. 如前述請求項中任一項之方法，其中該樣品來自患有疾病或病症的個體。
  9. 如請求項1至7中任一項之方法，其中該樣品來自疑似患有疾病或病症的個體。
  10. 如前述請求項中任一項之方法，其中該樣品來自被投予藥物及/或藥品的個體。
  11. 如前述請求項中任一項之方法，其中該樣品被稀釋至少3倍。
  12. 如前述請求項中任一項之方法，其中該弱酸為在水溶液中不完全解離成其離子、選自由以下組成之群的酸：乙酸、檸檬酸、甲酸、乳酸、磷酸及PIPES。
  13. 如前述請求項中任一項之方法，其中該樣品被酸化5至120分鐘。
  14. 如前述請求項中任一項之方法，其中該捕捉試劑為抗體。
  15. 如請求項14之方法，其中該捕捉試劑抗體選自由以下組成之群：多株抗體、單株抗體、雙特異性抗體、Fab片段、F(ab')2片段、單特異性F(ab')2片段、雙特異性F(ab')2、三特異性F(ab')2、單價抗體、scFv片段、雙功能抗體、雙特異性雙功能抗體、三特異性雙功能抗體、scFv-Fc、微型抗體、IgNAR、v-NAR、hcIgG及vhH。
  16. 如請求項14或15之方法，其中該捕捉試劑以≤1 μM、≤100 nM、≤50 nM、≤25 nM、≤20 nM、≤15 nM、≤10 nM、≤5 nM、≤2 nM、≤1 nM、≤0.1 nM、≤0.01 nM或≤0.001 nM的解離常數(K D)值結合該分析物。
  17. 如前述請求項中任一項之方法，進一步包括鑑別可在該酸化樣品之pH下結合至該分析物之捕捉試劑的步驟。
  18. 如前述請求項中任一項之方法，其中該捕捉試劑經生物素標記且該固體載體經鏈黴抗生物素蛋白或抗生物素蛋白塗覆。
  19. 如前述請求項中任一項之方法，其中該捕捉試劑直接結合至該固體載體。
  20. 如前述請求項中任一項之方法，其中該偵測試劑為抗體。
  21. 如請求項20之方法，其中該偵測試劑抗體為多株抗體、單株抗體、雙特異性抗體、Fab片段、F(ab')2片段、單特異性F(ab')2片段、雙特異性F(ab')2、三特異性F(ab')2、單價抗體、scFv片段、雙功能抗體、雙特異性雙功能抗體、三特異性雙功能抗體、scFv-Fc、微型抗體、IgNAR、v-NAR、hcIgG或vhH。
  22. 如前述請求項中任一項之方法，其中該偵測試劑與可偵測標記結合。
  23. 如請求項22之方法，其中該可偵測標記選自由以下組成之群：稀有過渡金屬粒子、螢光團、發色團、酶、量子點及貴金屬奈米粒子。
  24. 如請求項22之方法，其中該可偵測標記為辣根過氧化酶。
  25. 如請求項22之方法，其中該可偵測標記為釕。
  26. 如前述請求項中任一項之方法，其中該固體載體為電致化學發光平台。
  27. 如前述請求項中任一項之方法，其中該樣品包含結合至該分析物的干擾劑。
  28. 如請求項27之方法，進一步包括在該干擾劑部分地或完全地與該分析物解離時測定該酸化樣品之工作pH的步驟。
  29. 如請求項27至28之方法，其中相較於不包含該干擾劑的樣品，該方法恢復包含該干擾劑之樣品的至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%分析物信號。
  30. 如請求項29之方法，其中相較於不包含該干擾劑的樣品，該方法恢復包含該干擾劑之樣品的至少70%至100%分析物信號。
  31. 如前述請求項中任一項之方法，其中藉由使所偵測之偵測試劑的量與預定的參考標準關聯來測定該分析物的數量。
  32. 一種套組，其用於如前述請求項中任一項之方法，其中該套組包含該捕捉試劑、該偵測試劑及包含該弱酸的稀釋緩衝液。
  33. 一種用於偵測樣品中之分析物的方法，包括以下步驟： (i)用弱酸稀釋包含該分析物的樣品以產生酸化樣品； (ii)將捕捉試劑添加至該酸化樣品中而不中和該酸化樣品，其中該捕捉試劑特異性結合至該分析物， (iii)將包含該酸化樣品及該捕捉試劑的混合物添加至固體載體中，其中該固體載體特異性結合至該捕捉試劑； (iv)在第一培育時段之後，自該固體載體移除酸化樣品與捕捉試劑之該混合物； (vi)將偵測試劑直接添加至該固體載體中； (vii)在第二培育時段之後，自該固體載體移除該偵測試劑；以及 (viii)偵測結合至被該捕捉試劑捕捉之該分析物的該偵測試劑，其中所偵測之該偵測試劑的數量與該樣品中之該分析物的數量相關。
  34. 如請求項33之方法，進一步包括在步驟(iv)之後洗滌該固體載體。
  35. 如請求項33至34中任一項之方法，進一步包括在步驟(vi)之後，洗滌該固體載體。
  36. 如請求項33至34中任一項之方法，其中該酸化樣品具有約3.0至6.5之pH。
  37. 如請求項36之方法，其中該酸化樣品具有約4.1、約4.4或約4.5之pH。
  38. 如請求項33至37中任一項之方法，其中該分析物為IL2Rγ、EGFR、對利尿鈉肽受體1具有特異性之抗體(AbA)、針對抗NPR1抗體之人類單價單株抗體(AbB)，或因子XI。
  39. 如請求項33至38中任一項之方法，其中該樣品為選自由以下組成之群的生物體液：血液、血清、血漿、腦脊髓液(CSF)、尿液及唾液。
  40. 如請求項33至39中任一項之方法，其中該樣品來自患有疾病或病症的個體。
  41. 如請求項33至39中任一項之方法，其中該樣品來自疑似患有疾病或病症的個體。
  42. 如請求項33至41中任一項之方法，其中該樣品來自被投予藥物及/或藥品的個體。
  43. 如請求項33至42中任一項之方法，其中該樣品被稀釋至少3倍。
  44. 如請求項33至43中任一項之方法，其中該弱酸為在水溶液中不完全解離成其離子、選自由以下組成之群的酸：乙酸、檸檬酸、甲酸、乳酸、磷酸及PIPES。
  45. 如請求項33至44中任一項之方法，其中該樣品被酸化5至120分鐘。
  46. 如請求項33至45中任一項之方法，其中該捕捉試劑為抗體。
  47. 如請求項46之方法，其中該捕捉試劑抗體選自由以下組成之群：多株抗體、單株抗體、雙特異性抗體、Fab片段、F(ab')2片段、單特異性F(ab')2片段、雙特異性F(ab')2、三特異性F(ab')2、單價抗體、scFv片段、雙功能抗體、雙特異性雙功能抗體、三特異性雙功能抗體、scFv-Fc、微型抗體、IgNAR、v-NAR、hcIgG及vhH。
  48. 如請求項46或47之方法，其中該捕捉試劑以≤1 μM、≤100 nM、≤50 nM、≤25 nM、≤20 nM、≤15 nM、≤10 nM、≤5 nM、≤2 nM、≤1 nM、≤0.1 nM、≤0.01 nM或≤0.001 nM的解離常數(K D)值結合該分析物。
  49. 如請求項33至48中任一項之方法，進一步包括鑑別可在該酸化樣品之pH下結合至該分析物之捕捉試劑的步驟。
  50. 如請求項33至49中任一項之方法，其中該捕捉試劑經生物素標記且該固體載體經鏈黴抗生物素蛋白或抗生物素蛋白塗覆。
  51. 如請求項33至50中任一項之方法，其中該捕捉試劑直接結合至該固體載體。
  52. 如請求項33至51中任一項之方法，其中該偵測試劑為抗體。
  53. 如請求項52之方法，其中該偵測試劑抗體為多株抗體、單株抗體、雙特異性抗體、Fab片段、F(ab')2片段、單特異性F(ab')2片段、雙特異性F(ab')2、三特異性F(ab')2、單價抗體、scFv片段、雙功能抗體、雙特異性雙功能抗體、三特異性雙功能抗體、scFv-Fc、微型抗體、IgNAR、v-NAR、hcIgG或vhH。
  54. 如請求項33至53中任一項之方法，其中該偵測試劑與可偵測標記結合。
  55. 如請求項54之方法，其中該可偵測標記選自由以下組成之群：稀有過渡金屬粒子、螢光團、發色團、酶、量子點及貴金屬奈米粒子。
  56. 如請求項54之方法，其中該可偵測標記為辣根過氧化酶。
  57. 如請求項54之方法，其中該可偵測標記為釕。
  58. 如請求項33至57中任一項之方法，其中該固體載體為電致化學發光平台。
  59. 如請求項33至58中任一項之方法，其中該樣品包含結合至該分析物的干擾劑。
  60. 如請求項59之方法，進一步包括在該干擾劑部分地或完全地與該分析物解離時測定該酸化樣品之工作pH的步驟。
  61. 如請求項59至60之方法，其中相較於不包含該干擾劑的樣品，該方法恢復包含該干擾劑之樣品的至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%分析物信號。
  62. 如請求項61之方法，其中相較於不包含該干擾劑的樣品，該方法恢復包含該干擾劑之樣品的至少70%至100%分析物信號。
  63. 如請求項33至62中任一項之方法，其中藉由使所偵測之偵測試劑的量與預定的參考標準關聯來測定該分析物的數量。
  64. 一種套組，其用於如請求項33至63中任一項之方法，其中該套組包含該捕捉試劑、該偵測試劑及包含該弱酸的稀釋緩衝液。
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