TW202408550A - 腫瘤之預防及/或治療劑 - Google Patents
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Abstract
本發明開發出一種新穎之腫瘤之預防、治療藥。
本發明提供一種腫瘤之預防及/或治療劑、以及用於對其等進行篩選之方法，該腫瘤之預防及/或治療劑含有作為於Ikzf1中外顯子5之一部分或全部缺失之缺失體的Ikzf1ΔE5蛋白、或者Ikzf1ΔE5基因相關物質等。
Description
相關申請之相互參照
本專利申請案主張基於日本專利申請案2022-112660號(於2022年7月13日提出申請)之巴黎公約上之優先權及利益，藉由引用於本說明書中，而將上述申請案中所記載之全部內容併入本說明書中。
本發明係關於一種腫瘤之預防及/或治療劑。詳細而言，本發明係關於一種含有Ikzf(IKAROS family zinc finger protein，IKAROS家族鋅指蛋白)1ΔE5蛋白、或Ikzf1ΔE5基因相關物質之腫瘤之預防及/或治療劑、以及用於對其等進行篩選之方法。
近年來，一直在進行著眼於癌症免疫療法之研究。例如，作為抗CTLA(cytotoxic T-lymphocyte associated protein，細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白)-4抗體之免疫檢查點抑制劑伊匹單株抗體係藉由去除調節性T細胞(Treg細胞)來增強抗腫瘤免疫之藥劑。
IKAROS家族鋅指1(Ikzf1)係於哺乳動物中發現之5個IKAROS家族轉錄因子之一，亦簡稱為「IKAROS」。Ikzf1係於胎兒及成人之造血系統中表現之與染色質重塑相關之分子，於胎兒及成人之造血系統中表現，作為淋巴細胞分化之調節因子發揮作用。Ikzf1中之功能喪失型突變及缺失係於B淋巴母細胞性白血病(B-Acute lymphoblastic leukemia，B-ALL)中可見，據報告稱與預後不良有關聯。又，據報告稱，生殖細胞系之Ikzf1突變與自體免疫疾病有關聯(非專利文獻1)。
非專利文獻2中記載有藉由製作B細胞特異性地表現於Ikzf1中外顯子5缺失之缺失體之小鼠，對其進行解析，而發現於自preB細胞之分化中Ikzf較為重要，因分化受到抑制之preB細胞產生B淋巴母細胞性白血病(B-ALL)。這表示於B細胞之分化及B-ALL之產生中Ikzf1 Exon5較為重要。又，於專利文獻1中記載有一種含有藉由抑制細胞中Ikzf1之表現來增強細胞溶解活性之T細胞之組合物及方法。
[先前技術文獻]
[專利文獻]
[專利文獻1]WO2014/138348公報
[非專利文獻]
[非專利文獻1]Journal of Allergy and Clinical Immunology Volume 140, Issue 1, Pages 223-231(2017)
[非專利文獻2]Nat Immunol. 2014 Mar; 15(3): 294-304. doi: 10.1038/ni. 2821. Epub 2014 Feb 9.
[發明所欲解決之問題]
本發明之課題在於開發一種新穎之腫瘤之預防、治療藥。
[解決問題之技術手段]
本發明人等為了開發免疫療法之新穎之預防或治療方法而進行了銳意研究，結果發現，若表現藉由於調節性T細胞(Treg細胞)中使Ikzf1之外顯子5之一部分或全部缺失而使Ikzf1中外顯子5之一部分或全部缺失的缺失體(以下有時稱為「Ikzf1ΔE5」。又，有時將編碼Ikzf1ΔE5之基因稱為「Ikzf1ΔE5基因」，將由Ikzf1ΔE5基因編碼之蛋白稱為「Ikzf1ΔE5蛋白」)，則由調節性T細胞之干擾素γ之產生顯著亢進，及可預防及/或治療腫瘤。本發明人等基於該見解進而反覆進行研究，從而完成了本發明。
即，本發明包含以下態樣。
＜腫瘤之預防及/或治療劑之1＞
[1]
一種腫瘤之預防及/或治療劑，其含有Ikzf1ΔE5蛋白、或Ikzf1ΔE5基因相關物質。
[2]
如[1]記載之腫瘤之預防及/或治療劑，其以T細胞為靶。
[3]
如[2]記載之腫瘤之預防及/或治療劑，其中T細胞係CD(cluster of differentiation，分化群)4陽性T細胞。
[4]
如[2]記載之腫瘤之預防及/或治療劑，其中T細胞係調節性T細胞及/或初始T細胞。
[5]
如[1]至[4]中任一項記載之腫瘤之預防及/或治療劑，其中Ikzf1ΔE5基因相關物質係編碼Ikzf1ΔE5蛋白之核酸分子。
[6]
如[1]至[4]中任一項記載之腫瘤之預防及/或治療劑，其中Ikzf1ΔE5基因相關物質係Ikzf1基因之外顯子5部分之一部分或全部缺失之物質。
[7]
如[6]記載之腫瘤之預防及/或治療劑，其中Ikzf1基因之外顯子5部分之一部分或全部缺失之物質選自由針對Ikzf1基因之外顯子5之外顯子跳躍劑及CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，規律間隔成簇短回文重複序列)/Cas(CRISPR associated proteins，CRISPR關聯蛋白)等基因治療載體所組成之群。
[8]
如[7]記載之腫瘤之預防及/或治療劑，其中外顯子跳躍劑係核酸。
[9]
如[1]記載之腫瘤之預防及/或治療劑，其含有表現Ikzf1ΔE5之T細胞。
[10]
一種腫瘤之預防及/或治療方法，其包括投予如[1]至[9]中任一項記載之腫瘤之預防及/或治療劑。
本發明進而包含以下之其他態樣。
＜干擾素γ調整劑＞
[21]
一種干擾素γ產生調整劑，其含有Ikzf1ΔE5蛋白、或Ikzf1ΔE5基因相關物質。
[22]
如[21]記載之干擾素γ產生調整劑，其以T細胞為靶。
[23]
如[22]記載之干擾素γ產生調整劑，其中T細胞係CD4陽性T細胞。
[24]
如[22]記載之干擾素γ產生調整劑，其中T細胞係調節性T細胞及/或初始T細胞。
[25]
如[21]至[24]中任一項記載之干擾素γ產生調整劑，其中Ikzf1ΔE5基因相關物質係編碼Ikzf1ΔE5蛋白之核酸分子。
[26]
如[21]至[24]中任一項記載之干擾素γ產生調整劑，其中Ikzf1ΔE5基因相關物質係Ikzf1基因之外顯子5部分缺失之物質。
[27]
如[26]記載之干擾素γ產生調整劑，其中Ikzf1基因之外顯子5部分缺失之物質選自由針對Ikzf1基因之外顯子5之外顯子跳躍劑及CRISPR/Cas等基因治療載體所組成之群。
[28]
如[27]記載之干擾素γ產生調整劑，其中外顯子跳躍劑係核酸。
[29]
如[21]記載之干擾素γ產生調整劑，其含有表現Ikzf1ΔE5之T細胞。
＜T細胞調整劑＞
[31]
一種T細胞調整劑，其含有Ikzf1ΔE5蛋白、或Ikzf1ΔE5基因相關物質。
[32]
如[31]記載之T細胞調整劑，其以T細胞為靶。
[33]
如[32]記載之T細胞調整劑，其中T細胞係CD4陽性T細胞。
[34]
如[32]記載之T細胞調整劑，其中T細胞係調節性T細胞及/或初始T細胞。
[35]
如[31]至[34]中任一項記載之T細胞調整劑，其中Ikzf1ΔE5基因相關物質係編碼Ikzf1ΔE5蛋白之核酸分子。
[36]
如[31]至[34]中任一項記載之T細胞調整劑，其中Ikzf1ΔE5基因相關物質係Ikzf1基因之外顯子5部分缺失之物質。
[37]
如[36]記載之T細胞調整劑，其中Ikzf1基因之外顯子5部分缺失之物質選自由針對Ikzf1基因之外顯子5之外顯子跳躍劑及CRISPR/Cas等基因治療載體所組成之群。
[38]
如[37]記載之T細胞調整劑，其中外顯子跳躍劑係核酸。
[39]
如[31]記載之T細胞調整劑，其含有表現Ikzf1ΔE5之T細胞。
又，本發明進而包含以下之其他態樣。
[41]
一種腫瘤之預防及/或治療劑，其含有包含Ikzf1蛋白以及Foxp(forkhead box protein，叉頭框蛋白)3蛋白、CHD(Chromodomain Helicase DNA Binding Protein，染色質域解旋酶DNA結合蛋白)4蛋白及/或HDAC(histone deacetylase，組蛋白去乙醯酶)1蛋白的Ikzf1複合體之形成抑制物質及/或形成促進物質。
[42]
一種干擾素γ產生調整劑，其含有包含Ikzf1蛋白、以及Foxp3蛋白、CHD4蛋白及/或HDAC1蛋白的Ikzf1複合體之形成抑制物質及/或形成促進物質。
[43]
一種T細胞調整劑，其含有包含Ikzf1蛋白、以及Foxp3蛋白、CHD4蛋白及/或HDAC1蛋白的Ikzf1複合體之形成抑制物質及/或形成促進物質。
[44]
如[43]記載之T細胞調整劑，其中T細胞係CD4陽性T細胞。
[45]
如[43]記載之T細胞調整劑，其中T細胞係調節性T細胞及/或初始T細胞。
[46]
如[41]至[45]中任一項記載之劑，其中Ikzf1複合體含有Ikzf1蛋白及Foxp3蛋白。
[47]
如[41]至[46]中任一項記載之劑，其中Ikzf1複合體之形成抑制物質含有Ikzf1蛋白之外顯子5片段之一部分或全部。
[48]
如[41]至[47]中任一項記載之劑，其中Ikzf1複合體之形成抑制物質含有編碼Ikzf1蛋白之外顯子5片段之一部分或全部之核酸。
[49]
如[41]至[48]中任一項記載之劑，其中Ikzf1複合體之形成抑制物質係與包含Ikzf1蛋白之外顯子5片段之一部分或全部之區域結合。
[50]
如[41]至[46]中任一項記載之劑，其中Ikzf1複合體之形成抑制物質含有Foxp3蛋白之FHD(Forkhead domain，叉頭結構域)之一部分或全部。
[51]
如[41]至[46]中任一項記載之劑，其中Ikzf1複合體之形成抑制物質含有編碼Foxp3蛋白之FHD之一部分或全部之核酸。
[52]
如[41]至[46]中任一項記載之劑，其中Ikzf1複合體之形成抑制物質係與包含Foxp3蛋白之FHD之一部分或全部之區域結合。
[53]
如[41]至[46]中任一項記載之劑，其中Ikzf1複合體之形成抑制物質含有FHD之一部分或全部經缺失之Foxp3蛋白。
[54]
如[41]至[46]中任一項記載之劑，其中Ikzf1複合體之形成抑制物質含有編碼FHD之一部分或全部經缺失之Foxp3蛋白之核酸。
[55]
一種腫瘤之預防及/或治療方法，其包括投予如[41]及[47]至[54]中任一項記載之腫瘤之預防及/或治療劑。
＜「Ikzf1複合體之形成調節物質」之篩選方法＞
[61]
一種對Ikzf1複合體之形成調節物質進行篩選之方法，該Ikzf1複合體含有Ikzf1蛋白、以及Foxp3蛋白、CHD4蛋白及/或HDAC1蛋白，該方法包括以下步驟：
(a)使含有Ikzf1蛋白或其片段、以及Foxp3蛋白或其片段、CHD4蛋白或其片段及/或HDAC1蛋白或其片段之系統與Ikzf1複合體之形成調節物質之候選化合物接觸；
(b)調查上述候選化合物是否抑制或促進Ikzf1蛋白或其片段與Foxp3蛋白或其片段之締合、是否抑制或促進Ikzf1蛋白或其片段與CHD4蛋白或其片段之締合、是否抑制或促進Ikzf1蛋白或其片段與HDAC1蛋白或其片段之締合、是否抑制或促進Foxp3蛋白或其片段與CHD4蛋白或其片段之締合、以及/或者是否抑制或促進Foxp3蛋白或其片段與HDAC1蛋白或其片段之締合；
(c)若上述候選化合物抑制或促進任一締合，則鑑定為Ikzf1複合體之形成調節物質。
[62]
如[61]中記載之對Ikzf1複合體之形成調節物質進行篩選之方法，其包括以下步驟：
(a)使T細胞與Ikzf1複合體之形成調節物質之候選化合物於體外接觸；
(b)調查上述候選化合物是否抑制或促進Ikzf1蛋白與Foxp3蛋白之締合、是否抑制或促進Ikzf1蛋白與CHD4蛋白之締合、是否抑制或促進Ikzf1蛋白與HDAC1蛋白之締合、是否抑制或促進Foxp3蛋白與CHD4蛋白之締合、以及/或者是否抑制或促進Foxp3蛋白與HDAC1蛋白之締合；
(c)若上述候選化合物抑制或促進任一締合，則鑑定為Ikzf1複合體之形成調節物質。
[63]
如[61]中記載之對Ikzf1複合體之形成調節物質進行篩選之方法，其包括以下步驟：
(a)使強制表現Ikzf1蛋白或其片段、以及Foxp3蛋白或其片段、CHD4蛋白或其片段及/或HDAC1蛋白或其片段之培養細胞或T細胞與Ikzf1複合體之形成調節物質之候選化合物於體外接觸；
(b)調查上述候選化合物是否抑制或促進Ikzf1蛋白或其片段與Foxp3蛋白或其片段之締合、是否抑制或促進Ikzf1蛋白或其片段與CHD4蛋白或其片段之締合、是否抑制或促進Ikzf1蛋白或其片段與HDAC1蛋白或其片段之締合、是否抑制或促進Foxp3蛋白或其片段與CHD4蛋白或其片段之締合、以及/或者是否抑制或促進Foxp3蛋白或其片段與HDAC1蛋白或其片段之締合；
(c)若上述候選化合物抑制或促進任一締合，則鑑定為Ikzf1複合體之形成調節物質。
[64]
如[61]中記載之對Ikzf1複合體之形成調節物質進行篩選之方法，其包括以下步驟：
(a)使純化Ikzf1蛋白或其片段、以及純化Foxp3蛋白或其片段、純化CHD4蛋白或其片段及/或純化HDAC1蛋白或其片段與Ikzf1複合體之形成調節物質之候選化合物於體外接觸；
(b)調查上述候選化合物是否抑制或促進Ikzf1蛋白或其片段與Foxp3蛋白或其片段之締合、是否抑制或促進Ikzf1蛋白或其片段與CHD4蛋白或其片段之締合、是否抑制或促進Ikzf1蛋白或其片段與HDAC1蛋白或其片段之締合、是否抑制或促進Foxp3蛋白或其片段與CHD4蛋白或其片段之締合、以及/或者是否抑制或促進Foxp3蛋白或其片段與HDAC1蛋白或其片段之締合；
(c)若上述候選化合物抑制或促進任一締合，則鑑定為Ikzf1複合體之形成調節物質。
[65]
如[61]至[64]中任一項記載之方法，其中Ikzf1複合體之形成調節物質係抑制或促進Ikzf1蛋白或其片段與Foxp3蛋白或其片段之締合之物質。
[66]
如[61]至[65]中任一項記載之方法，其中Ikzf1複合體之形成調節物質係腫瘤之預防及/或治療劑、干擾素γ產生調整劑、或者T細胞調整劑。
＜腫瘤之預防及/或治療劑之2＞
[71]
一種腫瘤之預防及/或治療劑，其含有CHD4蛋白之活性抑制物質。
[72]
一種干擾素γ產生調整劑，其含有CHD4蛋白之活性抑制物質。
[73]
一種T細胞調整劑，其含有CHD4蛋白之活性抑制物質。
[74]
如[73]記載之T細胞調整劑，其中T細胞係CD4陽性T細胞。
[75]
如[73]記載之T細胞調整劑，其中T細胞係調節性T細胞及/或初始T細胞。
[76]
一種腫瘤之預防及/或治療方法，其包括投予如[71]中記載之腫瘤之預防及/或治療劑。
＜腫瘤之預防及/或治療劑之3＞
[81]
一種腫瘤之預防及/或治療劑，其含有HDAC1蛋白之活性抑制物質。
[82]
一種干擾素γ產生調整劑，其含有HDAC1蛋白之活性抑制物質。
[83]
一種T細胞調整劑，其含有HDAC1蛋白之活性抑制物質。
[84]
如[83]記載之T細胞調整劑，其中T細胞係CD4陽性T細胞。
[85]
如[83]記載之T細胞調整劑，其中T細胞係調節性T細胞及/或初始T細胞。
[86]
一種腫瘤之預防及/或治療方法，其包括投予如[81]中記載之腫瘤之預防及/或治療劑。
[發明之效果]
根據本發明，可提供一種新穎之腫瘤之預防、治療藥。
＜腫瘤之預防及/或治療劑＞
作為一個形態，本發明係關於一種腫瘤之預防及/或治療劑，其含有Ikzf1ΔE5蛋白、或Ikzf1ΔE5基因相關物質。此處，腫瘤意指實體癌、例如肺癌、乳腺癌、胃癌、大腸癌、肝癌、惡性黑色素瘤等上皮細胞癌；及骨肉瘤、軟骨肉瘤、橫紋肌肉瘤、平滑肌肉瘤等非上皮細胞癌；以及血癌、例如白血病、惡性淋巴瘤、多發性骨髓瘤等。
於本發明中，Ikzf1ΔE5基因相關物質不僅含有編碼Ikzf1ΔE5蛋白之核酸分子，還含有於靶細胞中使Ikzf1基因之外顯子5部分之一部分或全部缺失之物質。此處，Ikzf1基因之外顯子5部分之一部分可意指包含該部分之全長之95%以上、90%以上、85%以上、80%以上、75%以上、70%以上、65%以上、60%以上、55%以上、50%以上、45%以上、40%以上、35%以上、30%以上、25%以上、20%以上、15%以上、10%以上、或5%以上之片段。較佳為Ikzf1基因之外顯子5部分之一部分意指Ikzf1之包含鋅指結構域2(ZF2)之部分、Ikzf1之包含鋅指結構域3(ZF3)之部分、或包含ZF2及ZF3兩者之部分。作為靶細胞，可例舉T細胞，較佳為CD4陽性T細胞，進而較佳為調節性T細胞或初始T細胞。
於本發明中，於Ikzf1ΔE5基因相關物質係使Ikzf1基因之外顯子5部分之一部分或全部缺失之物質之情形時，作為其例示，可例舉針對Ikzf1基因之外顯子5之外顯子跳躍劑及CRISPR/Cas等基因治療載體。外顯子跳躍劑係於細胞之核內發揮作用，以不識別(跳過)與發生特定mRNA(messenger Ribonucleic acid，信使核糖核酸)前驅物之變異之位置相鄰之特定外顯子之方式促進，藉此將相鄰之外顯子彼此連接，製作目標缺失體之物質。於本發明中，外顯子跳躍劑較佳為核酸，進而較佳為反義核酸。
於本發明中，CRISPR/Cas等基因治療載體並無特別限定，只要為可藉由基因組編輯而使Ikzf1基因之外顯子5部分之一部分或全部缺失者即可，例如可應用WO2018/179578中記載之技術。
作為其他態樣，本發明係關於本發明之腫瘤之預防及/或治療劑，其含有表現Ikzf1ΔE5之T細胞。該態樣例如可應用於過繼T細胞療法。
作為其他形態，本發明係關於本發明之腫瘤之預防及/或治療劑，其含有包含Ikzf1蛋白、以及Foxp3蛋白、CHD4蛋白及/或HDAC1蛋白的Ikzf1複合體之形成抑制物質、或者CHD4蛋白及/或HDAC1蛋白之活性抑制物質。該形成抑制物質可藉由任意公知之方法進行篩選。較佳為該形成抑制物質抑制Ikzf1蛋白與Foxp3蛋白之締合。又，亦可將含有Ikzf1蛋白之外顯子5片段之一部分或全部之蛋白質、含有Foxp3蛋白之FHD之一部分或全部之蛋白質、FHD之一部分或全部經缺失之Foxp3蛋白、或者編碼其等之核酸用作該形成抑制物質。此處，Foxp3中之FHD意指Foxp3之DNA(Deoxyribonucleic Acid，去氧核糖核酸)結合域(Forkhead domain)。於本發明中，FHD較佳為意指序列編號4所表示之Foxp3蛋白之殘基編號279以後之C末端側區域。Ikzf1蛋白之外顯子5片段之一部分可意指包含該部分之全長之95%以上、90%以上、85%以上、80%以上、75%以上、70%以上、65%以上、60%以上、55%以上、50%以上、45%以上、40%以上、35%以上、30%以上、25%以上、20%以上、15%以上、10%以上、或5%以上之片段，較佳為意指Ikzf1之包含鋅指結構域2(ZF2)之部分、Ikzf1之包含鋅指結構域3(ZF3)之部分、或包含ZF2及ZF3兩者之部分。Foxp3蛋白之FHD之一部分可意指包含該部分之全長、較佳為序列編號4所表示之Foxp3蛋白之殘基編號279以後之C末端側區域之95%以上、90%以上、85%以上、80%以上、75%以上、70%以上、65%以上、60%以上、55%以上、50%以上、45%以上、40%以上、35%以上、30%以上、25%以上、20%以上、15%以上、10%以上、或5%以上之片段。又，於本說明書中，Ikzf1蛋白之外顯子5片段之一部分或全部包含對應之部分之胺基酸序列之95%以上、90%以上、85%以上、80%以上、75%以上、70%以上、65%以上、60%以上、55%以上一致之肽，Foxp3蛋白之FHD之一部分或全部包含對應之部分之胺基酸序列之95%以上、90%以上、85%以上、80%以上、75%以上、70%以上、65%以上、60%以上、55%以上、或50%以上一致之肽。
作為CHD4蛋白及/或HDAC1蛋白之活性抑制物質，例如可例舉CHD4蛋白及/或HDAC1蛋白之染色質重塑活性、ATPase(Adenosine Triphosphatase，腺苷三磷酸酶)活性、DNA結合活性、及/或脫乙醯化活性之抑制物質。CHD4蛋白及/或HDAC1蛋白之活性抑制物質可藉由公知之任意方法取得，例如，可藉由利用「單核小體破裂分析」(Nucleic Acids Res. 2001 Jun 15; 29(12): 2517-21.)測定染色質重塑活性，基於所測得之活性進行篩選而取得。
於一態樣中，與包含Ikzf1蛋白之外顯子5部分之一部分或全部之區域結合的物質、或與包含Foxp3蛋白之FHD之一部分或全部之區域結合的物質亦可用作Ikzf1複合體之形成抑制物質。此處，作為該物質，可例示以該區域為表位之抗體。可作為Ikzf1複合體之形成抑制物質使用之抗體例如可將含有Ikzf1蛋白之外顯子5部分之一部分或全部、或者Foxp3蛋白之FHD之一部分或全部之肽或蛋白質作為抗原，藉由常規方法來製作。該抗體可直接作為抗體製劑投予，亦可以mRNA或AAV(adeno-associated virus，腺相關病毒)等基因治療載體之形式投予。
本發明係以如下發現為基礎，即，藉由於T細胞中抑制含有Ikzf1蛋白、以及Foxp3蛋白、CHD4蛋白及/或HDAC1蛋白之Ikzf1複合體之形成，而對細胞進行重編程，使干擾素γ之產生亢進。因此，本發明之腫瘤之預防及/或治療劑只要為可抑制該含有Ikzf1蛋白、以及Foxp3(例如，FHD)蛋白、CHD4蛋白及/或HDAC1蛋白之Ikzf1複合體形成之態樣即可，以任意態樣包含其全部。
與該態樣相關聯，本發明係關於一種干擾素γ產生調整劑，其含有Ikzf1ΔE5蛋白、Ikzf1ΔE5基因相關物質、上述Ikzf1複合體之形成抑制物質、上述Ikzf1複合體之形成促進物質(以下，有時將上述Ikzf1複合體之形成抑制物質及形成促進物質統稱為「Ikzf1複合體之形成調節物質」)、或者CHD4蛋白及/或HDAC1蛋白之活性抑制物質。於本發明中，干擾素γ產生調整包括產生之增加及產生之減少。此處，產生之增加可意指於藉由干擾素γ產生調整劑進行處置後干擾素γ產生增加5%以上、10%以上、15%以上、20%以上、25%以上、30%以上、35%以上、40%以上、45%以上、或50%以上，產生之減少可意指於藉由干擾素γ產生調整劑進行處置後干擾素γ產生減少5%以上、10%以上、15%以上、20%以上、25%以上、30%以上、35%以上、40%以上、45%以上、或50%以上。
已知干擾素γ具有抗病毒、免疫調節、及抗腫瘤作用，作為干擾素γ相關疾病，可例舉以腫瘤為代表之自體免疫疾病、炎症、結腸炎、特發性肺纖維化症(IPF)等。本發明可用於預防及/或治療該等干擾素γ相關疾病。作為此處之腫瘤，可例示以上所例舉者。又，作為自體免疫疾病，可例示：類風濕性關節炎、全身性紅斑狼瘡、潰瘍性結腸炎、狼瘡性腎炎、克隆氏病等。
如上所述，本發明所靶向之細胞可例舉T細胞，較佳為CD4陽性T細胞，進而較佳為調節性T細胞或初始T細胞。於該態樣中，本發明係關於一種T細胞調整劑，其含有Ikzf1ΔE5蛋白、Ikzf1ΔE5基因相關物質、上述Ikzf1複合體之形成調節物質、或者CHD4蛋白及/或HDAC1蛋白之活性抑制物質。於本發明中，T細胞調整劑意指：使T細胞、較佳為CD4陽性T細胞、進而較佳為調節性T細胞或初始T細胞、更佳為調節性T細胞變化為產生干擾素γ之T細胞之劑；或抑制T細胞、較佳為CD4陽性T細胞、進而較佳為調節性T細胞或初始T細胞、更佳為調節性T細胞變化為產生干擾素γ之T細胞之劑；或變化為Foxp3之表現得到降低之T細胞(exTreg)之劑；或減少調節性T細胞之劑；或調整調節性T細胞與exTreg之比率之劑。
於本說明書中，「治療」意指目的如下之方法或製程：(1)使腫瘤、其他干擾素γ相關疾病延遲發生；(2)減速或停止腫瘤、其他干擾素γ相關疾病之症狀之發展、加重或惡化；(3)緩解腫瘤、其他干擾素γ相關疾病之症狀；或者(4)治癒腫瘤、其他干擾素γ相關疾病。治療可作為預防性措施於疾病或狀態之發生前實施，或者，又，治療亦可於疾病開始後實施。
於本說明書中，「預防」意指預防腫瘤、其他干擾素γ相關疾病發生。
於本發明中，劑或醫藥組合物通常意指用於治療或預防、或者檢查、診斷疾病之藥劑。
本發明之醫藥組合物可藉由業者公知之方法進行製劑化。例如，可以與水或除此以外之藥學上可容許之液體之無菌性溶液、或者懸浮液劑之注射劑之形式非經口使用。例如，考慮藉由如下方式進行製劑化：與藥理學上所容許之載體或介質、具體而言為殺菌水或生理鹽水、植物油、乳化劑、懸浮劑、界面活性劑、穩定劑、香味劑、賦形劑、媒劑、防腐劑、結合劑等適當組合，以一般認可之製藥實施所要求之單位劑量形態進行溶混。該等製劑中之有效成分量係以可獲得所指示之範圍之適當容量之方式進行設定。
用於注射之無菌組合物可使用注射用蒸餾水之類的媒劑，按照通常之調劑進行配方。
作為注射用水溶液，例如可例舉含有生理鹽水、葡萄糖或其他輔助藥(例如D-山梨醇、D-甘露糖、D-甘露醇、氯化鈉)之等張液。亦可併用適當之增溶劑、例如醇(乙醇等)、多元醇(丙二醇、聚乙二醇等)、非離子性界面活性劑(聚山梨醇酯80(TM)、HCO-50等)。
作為油性液，可例舉芝麻油、大豆油，作為增溶劑，可併用苯甲酸苄酯及/或苄醇。又，亦可與緩衝劑(例如，磷酸鹽緩衝液及乙酸鈉緩衝液)、鎮痛劑(例如，鹽酸普魯卡因)、穩定劑(例如，苄醇及苯酚)、抗氧化劑進行調配。所製備之注射液通常填充於適當之安瓿中。
本發明之醫藥組合物較佳為藉由非經口投予進行投予。例如，可製成注射劑型、經鼻投予劑型、經肺投予劑型、經皮投予型之組合物。例如，可藉由靜脈內注射、肌內注射、腹腔內注射、皮下注射等而全身或局部投予。
投予方法可根據患者之年齡、症狀而適當選擇。含有多肽之醫藥組合物之投予量例如可設定為每次每1 kg體重為0.0001 mg至1000 mg之範圍。或者，例如，亦可設為每位患者0.001～100000 mg之投予量，但本發明不一定限制於該等數值。投予量及投予方法係根據患者之體重、年齡、症狀等進行變動，業者可考慮該等條件設定適當之投予量及投予方法。
＜篩選方法＞
於其他實施方式中，本發明係關於一種對Ikzf1複合體之形成調節物質進行篩選之方法，該Ikzf1複合體含有Ikzf1蛋白、以及Foxp3蛋白、CHD4蛋白及/或HDAC1蛋白，該方法包括以下步驟：
(a)使含有Ikzf1蛋白或其片段、以及Foxp3蛋白或其片段、CHD4蛋白或其片段及/或HDAC1蛋白或其片段之系統與Ikzf1複合體之形成調節物質之候選化合物接觸；
(b)調查上述候選化合物是否抑制或促進Ikzf1蛋白或其片段與Foxp3蛋白或其片段之締合、是否抑制或促進Ikzf1蛋白或其片段與CHD4蛋白或其片段之締合、是否抑制或促進Ikzf1蛋白或其片段與HDAC1蛋白或其片段之締合、是否抑制或促進Foxp3蛋白或其片段與CHD4蛋白或其片段之締合、以及/或者是否抑制或促進Foxp3蛋白或其片段與HDAC1蛋白或其片段之締合；
(c)若上述候選化合物抑制或促進任一締合，則鑑定為Ikzf1複合體之形成調節物質。
較佳為Ikzf1複合體之形成調節物質意指抑制或促進Ikzf1蛋白與Foxp3蛋白之締合之物質。又，較佳為Ikzf1複合體之形成調節物質含有腫瘤之預防及/或治療劑、干擾素γ產生調整劑、或者T細胞調整劑。
本實施方式之一形態係關於一種對Ikzf1複合體之形成調節物質進行篩選之方法，該Ikzf1複合體含有Ikzf1蛋白、以及Foxp3蛋白、CHD4蛋白及/或HDAC1蛋白，該方法包括以下步驟：
(a)使T細胞與Ikzf1複合體之形成調節物質之候選化合物於體外接觸；
(b)調查上述候選化合物是否抑制或促進Ikzf1蛋白與Foxp3蛋白之締合、是否抑制或促進Ikzf1蛋白與CHD4蛋白之締合、是否抑制或促進Ikzf1蛋白與HDAC1蛋白之締合、是否抑制或促進Foxp3蛋白與CHD4蛋白之締合、以及/或者是否抑制或促進Foxp3蛋白與HDAC1蛋白之締合；
(c)若上述候選化合物抑制或促進任一締合，則鑑定為Ikzf1複合體之形成調節物質。
本實施方式之其他形態係關於一種對Ikzf1複合體之形成調節物質進行篩選之方法，該Ikzf1複合體含有Ikzf1蛋白、以及Foxp3蛋白、CHD4蛋白及/或HDAC1蛋白，該方法包括以下步驟：
(a)使強制表現Ikzf1蛋白或其片段、以及Foxp3蛋白或其片段、CHD4蛋白或其片段及/或HDAC1蛋白或其片段之培養細胞或T細胞與Ikzf1複合體之形成調節物質之候選化合物於體外接觸；
(b)調查上述候選化合物是否抑制或促進Ikzf1蛋白或其片段與Foxp3蛋白或其片段之締合、是否抑制或促進Ikzf1蛋白或其片段與CHD4蛋白或其片段之締合、是否抑制或促進Ikzf1蛋白或其片段與HDAC1蛋白或其片段之締合、是否抑制或促進Foxp3蛋白或其片段與CHD4蛋白或其片段之締合、以及/或者是否抑制或促進Foxp3蛋白或其片段與HDAC1蛋白或其片段之締合；
(c)若上述候選化合物抑制或促進任一締合，則鑑定為Ikzf1複合體之形成調節物質。
於本形態中，Ikzf1蛋白之片段意指含有Ikzf1蛋白(序列編號3)之一部分之多肽、較佳為含有Ikzf1蛋白之外顯子5片段之一部分或全部之多肽，Foxp3蛋白之片段意指含有Foxp3蛋白(序列編號4)之一部分之多肽、較佳為含有序列編號4所表示之Foxp3蛋白之殘基編號279以後之C末端側區域之多肽。
於本形態中，蛋白質之締合可藉由任意公知之方法進行評估，可例示：NanoLuc(註冊商標)Binary Technology(NanoBiT)、生物發光共振能量轉移(BRET)、化學增幅型發光鄰近均相分析(Alpha)、TR-FRET(Time-Resolved Fluorescence Resonance Energy Transfer，時間分辨螢光共振能量轉移)等。
本實施方式中之Ikzf1複合體不僅促進本身之靶基因之表現，亦藉由與作為組織蛋白乙醯轉移酶(HAT)之p300、及負責活化T細胞中之細胞激素IL(Interleukin，介白素)-2之轉錄控制之NFAT1(nuclear factor of activated T cells 1，活化T細胞核因子1)等共活化因子進行競爭來抑制其靶基因之轉錄，該抑制係藉由抑制Ikzf1複合體之形成而消除(圖12)。因此，Ikzf1複合體之靶基因或相應之啟動子、或者p300或NFAT1之靶基因或相應之啟動子可用作用於對Ikzf1複合體之形成調節物質進行篩選之報導基因。
此處，作為Ikzf1複合體之靶基因，可例舉J Biol Chem. 2001 Jul 20; 276(29): 27647-56中記載之基因，作為p300之靶基因，可例舉J Biol Chem. 2001 Jul 20; 276(29): 27647-56中記載之基因，作為NFAT1之靶基因，可例舉J Biol Chem. 2014 Sep 26; 289(39): 26752-26761中記載之基因。又，相應之啟動子係以與報導基因結合之載體之形式用於上述篩選。此處，作為報導基因，可例舉編碼β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、螢光素酶、綠色螢光蛋白(GFP)、tdTomato、細胞表面蛋白等公知之報導蛋白之基因。
本實施方式之其他形態係關於一種對Ikzf1複合體之形成調節物質進行篩選之方法，該Ikzf1複合體含有Ikzf1蛋白、以及Foxp3蛋白、CHD4蛋白及/或HDAC1蛋白，該方法包括以下步驟：
(a)使純化Ikzf1蛋白或其片段、以及純化Foxp3蛋白或其片段、純化CHD4蛋白或其片段及/或純化HDAC1蛋白或其片段與Ikzf1複合體之形成調節物質之候選化合物於體外接觸；
(b)調查上述候選化合物是否抑制或促進Ikzf1蛋白或其片段與Foxp3蛋白或其片段之締合、是否抑制或促進Ikzf1蛋白或其片段與CHD4蛋白或其片段之締合、是否抑制或促進Ikzf1蛋白或其片段與HDAC1蛋白或其片段之締合、是否抑制或促進Foxp3蛋白或其片段與CHD4蛋白或其片段之締合、以及/或者是否抑制或促進Foxp3蛋白或其片段與HDAC1蛋白或其片段之締合；
(c)若上述候選化合物抑制或促進任一締合，則鑑定為Ikzf1複合體之形成調節物質。
於本形態中，純化蛋白彼此之締合程度可使用任意公知之方法進行評估，例如可例舉：免疫沈澱法、拉下實驗法、西方墨點法、NMR(Nuclear Magnetic Resonance，核磁共振)、表面電漿子共振(SPR)、凝膠阻滯分析(gel shift assay)、凝膠過濾、微量熱泳動(MST，MicroScale Thermophoresis)等。一般而言，較佳為亦於候選化合物不存在之情況下進行相同之分析系統，測定候選化合物存在下之情形及候選化合物不存在下之情形兩種情形時之相互作用，對兩者進行比較，藉此辨別候選化合物是否抑制或促進作為對象之蛋白質之締合。
於本形態中，Ikzf1蛋白之片段意指含有Ikzf1蛋白(序列編號3)之一部分之多肽、較佳為含有Ikzf1蛋白之外顯子5片段之一部分或全部之多肽，Foxp3蛋白之片段意指含有Foxp3蛋白(序列編號4)之一部分之多肽、較佳為含有序列編號4所表示之Foxp3蛋白之殘基編號279以後之C末端側區域之多肽。
本發明之篩選方法中所使用之T細胞可利用本技術領域中周知之技術來製備，例如藉由自患者或健康者採血或藉由活組織檢查而獲得細胞，或者亦可自免疫及微生物供應商、例如American Type Culture Collection, Manassas, VA購買。
本發明中所使用之T細胞可按照標準細胞培養技術進行培養。例如，將細胞放入於適當之容器中含有加濕95%空氣-5%CO2之培養箱中並於37℃之無菌環境中進行增殖。容器可含有攪拌或靜置培養基。亦可使用各種細胞培養液，含有包含不明確之生物液(例如胎牛血清等)之培養基以及完全確定之培養基、例如293 SFM(Serum-Free Medium，無血清培養基)(Invitrogen Corp., Carlsbad, CA)。細胞培養技術係於本技術領域中所周知，可將已確立之方案用於多樣之細胞類型之培養中(例如，參照R.I. Freshney, "Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique", 2nd Edition, 1987, Alan R. Liss, Inc.)。
於特定之態樣中，本發明之篩選方法係使用多孔分析盤之複數個孔中所含之細胞來實施。此種分析盤例如有Strategene Corp.(La Jolla, CA)及Corning Inc.(Acton, MA)之市售品，例如包括48孔、96孔、384孔、及1536孔培養盤。
「於體外接觸」例如意指向多孔分析盤之複數個孔中所含之細胞中加入調整為規定濃度之候選化合物。繼而，對候選化合物調查作為對象之蛋白質彼此之締合抑制活性。此處，締合抑制活性可藉由任意公知之方法進行調查，例如可使用調查於對作為對象之蛋白質之一者進行免疫沈澱時另一蛋白質是否共沈澱之相互作用試驗、或者NanoBit或TR-FRET相關之技術進行調查。
CHD4蛋白及/或HDAC1蛋白之活性可藉由公知之任意方法進行測定，例如，染色質重塑活性可藉由「單核小體破裂分析」(Nucleic Acids Res. 2001 Jun 15; 29(12): 2517-21.)來測定。
[實施例]
以下，藉由實施例對本發明詳細地進行說明，但應留意其等並不限定本發明之範圍，僅為例示。
實施例中所使用之抗體如下。
表1
[表1]
| 小鼠 | 商品名稱 | 製造商 |
| IP | 小鼠中產生之單株抗FLAG M2抗體 | Sigma-Aldrich |
| Myc-Tag(71D10)兔子 | Cell Signaling Technology | |
| 正常小鼠IgG | Sigma-Aldrich | |
| FOXP3單株抗體(150D/E4) | eBioscience | |
| IB | 抗CHD4抗體[EPR22953-38]-ChIP級 | Abcam |
| ICS | V450大鼠抗小鼠IFN-g | BD Horizon |
| 培養 | 純化NA/LE倉鼠抗小鼠CD3e | BD Pharmingen |
| 純化NA/LE倉鼠抗小鼠CD28 | BD Pharmingen | |
| 人類 | 商品名稱 | 製造商 |
| IP | FOXP3單株抗體(PCH101) | eBioscience |
| 大鼠IgG2a kappa同型對照(eBR2a) | eBioscience | |
| IB | Ikaros(D6N9Y)兔單株抗體 | CST |
| Helios(D8W4X)XP®兔單株抗體 | CST | |
| Aiolos(D1C1E)兔單株抗體 | CST | |
| 兔抗ZNFNlA4 pAb | Novus | |
| β-肌動蛋白單株抗體(AC-15) | Invitrogen | |
| ICS | PE小鼠抗人CD25 | BD Biosciences |
| PerCP/花青5.5抗人CD4抗體 | Biolegend | |
| 亮紫605 ™抗人CD45RA抗體 | Biolegend | |
| 亮紫421 ™抗人IFN-γ抗體 | Biolegend | |
| APC抗小鼠/人Helios抗體 | Biolegend | |
| PE/花青7抗人Ikaros抗體 | Biolegend | |
| KIRAVIA Blue 520 ™抗人FOXP3抗體 | Biolegend |
實施例1
Ikzf1-Foxp3之締合解析
如Nat Immunol. 2012 Oct; 13(10): 1010-9.中所記載，Foxp3及Ikzf1相互作用。因此，以如下方式進行Foxp3及Ikzf1之相互作用所需之各區域之縮小。
實施例1-1：Foxp3-Ikzf1複合體形成中之Foxp3及Ikzf1之各區域之鑑定
首先，鑑定Ikzf1中之Foxp3結合域。
詳細而言，使用FuGENE HD轉染試劑(FuGENE HDTransfection Reagent(Promega))將Myc-Foxp3以及Flag-Ikzf1突變體：Flag-Ikzf1(Ik1)、Flag-IkΔN、Flag-IkΔC、Flag-IkΔE4、Flag-IkΔE6及Flag-IkΔE5之各表現載體基因導入至HEK293T細胞(人類胚胎腎臟細胞)中。基因導入48小時後，藉由免疫沈澱細胞溶解緩衝液(IP lysis buffer)回收細胞。關於免疫沈澱，使用抗Flag-M2抗體於4℃下反應一夜，使蛋白質量一致之細胞溶解液(Input)及免疫沈澱樣品(IP)泳動，藉由抗Flag-M2抗體或抗c-Myc抗體進行西方墨點法(Western Blot)並進行解析。
再者，用於製作Flag-Ikzf1突變體之DNA結合蛋白Ikaros轉錄變異體7[Mus musculus]之胺基酸序列如下。
MDVDEGQDMSQVSGKESPPVSDTPDEGDEPMPVPEDLSTTSGAQQNSKSDRGMVAYGADGFRDFHAIIPKSFSPSNVKVETQSDEENGRACEMNGEECAEDLRMLDASGEKMNGSHRDQGSSALSGVGGIRLPNGKLKCDICGIVCIGPNVLMVHKRSHTGERPFQCNQCGASFTQKGNLLRHIKLHSGEKPFKCHLCNYACRRRDALTGHLRTHSVGKPHKCGYCGRSYKQRSSLEEHKERCHNYLESMGLPGMYPVIKEETNHNEMAEDLCKIGAERSLVLDRLASNVAKRKSSMPQKFLGDKCLSDMPYDSANYEKEDMMTSHVMDQAINNAINYLGAESLRPLVQTPPGSSEVVPVISSMYQLHKPPSDGPPRSNHSAQDAVDNLLLLSKAKSVSSEREASPSNSCQDSTDTESNAEEQRSGLIYLTNHINPHARNGLALKEEQRAYEVLRAASENSQDAFRVVSTSGEQLKVYKCEHCRVLFLDHVMYTIHMGCHGFRDPFECNMCGYHSQDRYEFSSHITRGEHRYHLS(序列編號1)
將所獲得之結果示於圖1中。圖1係確認於藉由抗Flag-M2抗體對各Ikzf1突變體進行免疫沈澱時，Foxp3是否共沈澱之圖，顯示於ΔN、ΔE5變異體中Foxp3不共沈澱。藉此，發現由Ikzf1之外顯子5編碼之區域與Foxp3相互作用。
其次，對Foxp3中之Ikzf1結合域進行鑑定。
詳細而言，使用Myc-Ikzf1以及Flag-Foxp3突變體：Flag-Foxp3、Flag-ΔNFoxp3及Flag-ΔCFoxp3之各表現載體，以與上述相同之方式進行解析。
再者，用於製作Flag-Foxp3突變體之叉頭框P3[Mus musculus]之胺基酸序列如下。
MPNPRPAKPMAPSLALGPSPGVLPSWKTAPKGSELLGTRGSGGPFQGRDLRSGAHTSSSLNPLPPSQLQLPTVPLVMVAPSGARLGPSPHLQALLQDRPHFMHQLSTVDAHAQTPVLQVRPLDNPAMISLPPPSAATGVFSLKARPGLPPGINVASLEWVSREPALLCTFPRSGTPRKDSNLLAAPQGSYPLLANGVCKWPGCEKVFEEPEEFLKHCQADHLLDEKGKAQCLLQREVVQSLEQQLELEKEKLGAMQAHLAGKMALAKAPSVASMDKSSCCIVATSTQGSVLPAWSAPREAPDGGLFAVRRHLWGSHGNSSFPEFFHNMDYFKYHNMRPPFTYATLIRWAILEAPERQRTLNEIYHWFTRMFAYFRNHPATWKNAIRHNLSLHKCFVRVESEKGAVWTVDEFEFRKKRSQRPNKCSNPCP(序列編號2)
將所獲得之結果示於圖2中。圖2係確認於藉由抗Flag-M2抗體對各Foxp3突變體進行免疫沈澱時，Ikzf1是否共沈澱之圖，顯示於ΔCFoxp3中Ikzf1不共沈澱(最右側之區帶)。藉此，發現Foxp3之FHD與Ikzf1相互作用。
實施例1-2：使用來自Foxp3
CreIkE5
f/f小鼠之Treg細胞之Ikzf1複合體解析
Foxp3
CreIkE5
f/f小鼠係對於使IkE5
f/f小鼠(Joshi et al Nat Immunol 2014)與Foxp3
Cre基因轉殖小鼠(Rudensky et al Immunity 2008)交配而獲得之小鼠，於Foxp3陽性之Treg細胞中藉由同源重組而去除Ikzf1基因之外顯子5(IkE5)，誘導Ikzf1ΔE5表現。將由Foxp3
CreIkE5
f/f小鼠製備之YFP
+Treg細胞(1×10
5)於TCR刺激及IL-2(1500 U/ml)存在下培養7天後，藉由免疫沈澱細胞溶解緩衝液使其溶解。免疫沈澱係使用抗IgG或抗Foxp3抗體(5 μg/試樣)，於4℃下反應一夜而進行。使蛋白質量一致之細胞溶解液(Input)及免疫沈澱樣品(IP)泳動，藉由用於抗CHD4抗體初級抗體之Simple Western分析進行解析。作為對照，使用以相同方式自Foxp3
Cre基因轉殖小鼠取得之Treg細胞。
將所獲得之結果示於圖3中。對內在性Foxp3進行免疫沈澱(α-Foxp3之區帶)，結果於Ikzf1表現Treg細胞(Foxp3
Cre)中CHD4共沈澱(左)，與此相對，於表現Ikzf1ΔE5之Treg細胞(Foxp3
CreIKE5
f/f)中CHD4不共沈澱(右)。另一方面，對Ikzf1進行免疫沈澱(α-Ikzf1之區帶)，結果於Ikzf1表現Treg細胞及表現Ikzf1ΔE5之Treg細胞中CHD4均共沈澱。由此可知，於Ikzf1複合體中，CHD4與Ikzf1一起行動，而非Foxp3。
實施例1-3：使用來自Foxp3
CreIkE5
f/f小鼠之Treg細胞之Ikzf1複合體解析
將由Foxp3
CreIkE5
f/f小鼠之脾臟及淋巴結純化之CD4+FYP+Treg細胞(1×10
5)於Dynabeads小鼠CD3/CD28 T細胞刺激劑(25 μl/ml)(Thermo Fisher Scientific)及IL-2(1500 U/ml)中培養7天。培養中，於第4天將培養液(亦包含培養細胞)分割為2個部分，以100 μl/孔添加含有IL-2(1500 U/ml)之培養基。培養後，將經活化之Treg細胞於細胞刺激混合液(eBioscience)中於37℃下刺激1小時，藉由免疫沈澱細胞溶解緩衝液(Thermo Fisher Scientific)使其溶解。細胞溶解後，加入DynaBeads IgG磁珠(50 μl/試樣)(Thermo Fisher Scientific)及5 μg抗-IgG(Sigma-Aldrich)或5 μg抗-Foxp3(eBioscience)抗體並於4℃下免疫沈澱一夜。免疫沈澱後，用清洗緩衝液(1 ml/試樣)清洗DynaBeads 5次，清洗後，用試樣緩衝液(25 μl/試樣)進行懸浮，回收蛋白質。藉由Simple Western分析對來自全細胞溶解液(Input)或免疫沈澱液(IP)之等量之蛋白質進行分析。作為對照，使用自Foxp3
Cre小鼠以相同方式取得之Treg細胞，將由Ikzf1ΔE5表現誘導所致之與Foxp3之相互作用之變化進行比較。
Simple Western分析係使用Jess Simple Western System(ProteinSimple)按照製造商之標準方法實施。
將所獲得之結果示於圖4中。對內在性Foxp3進行免疫沈澱(α-Foxp3之區帶)，結果於Ikzf1表現Treg細胞(Foxp3
Cre)中CHD4、HDAC1共沈澱(左)，與此相對，於表現Ikzf1ΔE5之Treg細胞(Foxp3
CreIkE5
f/f)中CHD4不共沈澱且HDAC1減少(右)。由此，提示於Ikzf1複合體中，與CHD4同樣地，HDAC1與Ikzf1一起行動，而非Foxp3。
實施例1-4：於人類Treg細胞中Foxp3與Ikzf1相互作用
測定人類Treg細胞(STEMCELL TECHNOLOGIES)之細胞數後，進行離心(600×g、5分鐘)。去除上清液後用PBS(Phosphate Buffered Saline，磷酸鹽緩衝鹽水)使細胞之顆粒懸浮並進行離心(600×g、5分鐘)。離心後，去除上清液，向人類Treg細胞之顆粒中添加0.6 mL之RIPA(radioimmunoprecipitation assay，放射免疫沈澱分析)緩衝液(nacalai tesque)並靜置(4℃、10分鐘)。其後，對試樣進行離心(15000 rpm、10分鐘)，將上清液每次以300 μL分注於1.5 mL管中，向各者中加入6 μg之抗大鼠IgG2a抗體(eBioscience)或抗Foxp3抗體(eBioscience)及20 μL之ProteinG Dynabeads(Invitrogen)，用旋轉器進行旋轉(4℃、180分鐘)。旋轉後，將試樣設置於磁石，以不吸入被磁石捕獲之Dynabeads之方式去除上清液，加入新RIPA緩衝液，將該作業反覆進行3次。其後，向試樣中添加25 μL之樣品緩衝液(Thermo)，進行加熱(95℃、5分鐘)。試樣係藉由SDS-PAGE(Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳)進行電泳，利用西方墨點法檢測Foxp3及Ikzf1。
將所獲得之結果示於圖5中。圖5顯示若藉由抗Foxp3抗體對Foxp3進行免疫沈澱，則Ikzf1共沈澱。這意指與小鼠Treg同樣地，於人類Treg中Ikzf1與Foxp3亦相互作用。進而，鑒於人類之Ikzf1、Foxp3中亦分別具有外顯子5區域、FHD區域，於人類中該等區域亦有助於Ikzf1與Foxp3之相互作用之可能性極高。
再者，人類之Ikzf1、外顯子5、Foxp3之胺基酸序列如下。
DNA結合蛋白Ikaros轉錄變異體X5[智人]之胺基酸序列：
MDADEGQDMSQVSGKESPPVSDTPDEGDEPMPIPEDLSTTSGGQQSSKSDRVVVTYGADDFRDFHAIIPKSFSPSNVKVETQSDEENGRACEMNGEECAEDLRMLDASGEKMNGSHRDQGSSALSGVGGIRLPNGKLKCDICGIICIGPNVLMVHKRSHTGERPFQCNQCGASFTQKGNLLRHIKLHSGEKPFKCHLCNYACRRRDALTGHLRTHSVGKPHKCGYCGRSYKQRSSLEEHKERCHNYLESMGLPGTLYPVIKEETNHSEMAEDLCKIGSERSLVLDRLASNVAKRKSSMPQKFLGDKGLSDTPYDSSASYEKENEMMKSHVMDQAINNAINYLGAESLRPLVQTPPGGSEVVPVISPMYQLHKPLAEGTPRSNHSAQDSAVENLLLLSKAKLVPSEREASPSNSCQDSTDTESNNEEQRSGLIYLTNHIAPHARNGLSLKEEHRAYDLLRAASENSQDALRVVSTSGEQMKVYKCEHCRVLFLDHVMYTIHMGCHGFRDPFECNMCGYHSQDRYEFSSHITRGEHRFHMS(序列編號3)；
人類Ikzf1外顯子5胺基酸序列：
GERPFQCNQCGASFTQKGNLLRHIKLHSGEKPFKCHLCNYACRRRDALTGHLRTHS(序列編號10)。
人類Ikzf1 ZF2胺基酸序列：
QCNQCGASFTQKGNLLRHIKLHS(序列編號17)。
人類Ikzf1 ZF3胺基酸序列：
KCHLCNYACRRRDALTGHLRTHS(序列編號18)。
Foxp3[智人]之胺基酸序列：
MPNPRPGKPSAPSLALGPSPGASPSWRAAPKASDLLGARGPGGTFQGRDLRGGAHASSSSLNPMPPSQLQLPTLPLVMVAPSGARLGPLPHLQALLQDRPHFMHQLSTVDAHARTPVLQVHPLESPAMISLTPPTTATGVFSLKARPGLPPGINVASLEWVSREPALLCTFPNPSAPRKDSTLSAVPQSSYPLLANGVCKWPGCEKVFEEPEDFLKHCQADHLLDEKGRAQCLLQREMVQSLEQQLVLEKEKLSAMQAHLAGKMALTKASSVASSDKGSCCIVAAGSQGPVVPAWSGPREAPDSLFAVRRHLWGSHGNSTFPEFLHNMDYFKFHNMRPPFTYATLIRWAILEAPEKQRTLNEIYHWFTRMFAFFRNHPATWKNAIRHNLSLHKCFVRVESEKGAVWTVDELEFRKKRSQRPSRCSNPTPGP(序列編號4)；
實施例2
對小鼠中之Ikzf之作用所致之向IFN-γ陽性Treg細胞之變化
實施例2-1：Ikzf1ΔE5之Treg細胞之解析
由Foxp3
CreIkE5
f/f小鼠之脾臟及淋巴結製備細胞懸浮液。細胞懸浮於含有針對CD4之抗體(BD Pharmingen)之FACS(Fluorescence activated Cell Sorting，螢光活化細胞分選)緩衝液(PBS，2%胎牛血清)中，於冰上染色15分鐘。其後，利用FACSAria II細胞儀(BD)對CD4
+YFP
+Treg細胞進行分選。為了製備細胞內蛋白質之染色用樣品，將Treg細胞於PMA(Phorbol 12-myristate 13-acetate，佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯)/離子黴素(Ionomycin)及布雷非德菌素A(Brefeldin A)之存在下刺激4小時，清洗細胞後，用Foxp3-染色緩衝液(Foxp3-staining buffer：eBioscience)進行固定(45分鐘、冰上)。對於經固定之細胞，用破膜緩衝液(Perm buffer)清洗後，用抗IFN-γ抗體進行染色。其後，用FACSCanto流式細胞儀(BD)取得資料，用FlowJo(TreeStar)解析資料。作為對照，使用自Foxp3
Cre基因轉殖小鼠以相同方式取得之Treg細胞(表現Ikzf1)，將由Ikzf1ΔE5表現誘導所致之向IFN-γ陽性Treg細胞之變化進行比較。
實施例2-2：剔除小鼠Treg細胞中之Ikzf家族所致之向IFN-γ陽性Treg細胞之變化
用於剔除之針對靶基因之引導RNA(gRNA)(下段)係使用IDT引導RNA設計工具進行設計。由Foxp3
Cre小鼠製備YFP
+Treg細胞(1×10
5)，於TCR(Dynabeads)及IL-2(1500 U/ml)之存在下培養7天。使所培養之Treg細胞(2×10
6)懸浮於P4原代細胞溶液(P4 Primary Cell Solution；P4 Primary cell 4D-nucleofector X kit S)中，將Cas9蛋白及gRNA藉由Amaxa 4D進行基因導入(DG137 program)。基因導入後，清洗細胞，於TCR(Dynabeads)及IL-2(1500 U/ml)之存在下培養3天。其後，對細胞表面及細胞內分子進行染色。作為對照，使用對照gRNA(INTEGRATED DNA TECHNOLOGIES)。藉由本方法，將未剔除Ikzf家族之Treg細胞、僅剔除Ikzf1之Treg、剔除Ikzf1及3之Treg細胞向IFN-γ陽性Treg細胞之變化進行比較。
用於剔除之gRNA之序列
Ikzf1：AGAGCGATGCCACAACTACTTGG(序列編號5)及CAGAACTCCAAGAGTGATCGAGG(序列編號6)
Ikzf3：AGATGAACTGCGACGTGTGCGGG(序列編號7)及ATTATGAAGCCGGAGCCCATGGG(序列編號8)及CGACTATGAAAGCATTAAGCTGG(序列編號9)
Ikzf2：CGAAGGGGAACACGCCAATATGG(序列編號11)及GGGTAAAAGAAGCTCCGCACTGG(序列編號12)及TCAGTTTACCATTCGGAAGCCGG(序列編號13)
Ikzf4：AAGCTCAAGTGCGACGTCTGCGG(序列編號14)及CTTGTAGGGTTTGCCCACGGTGG(序列編號15)及TTATCCAGGAGCCGTTCATCCGG(序列編號16)
將實施例2-1及2-2中所獲得之結果彙總於圖6(1)～(6)中。圖6顯示由對Ikzf之作用所引起之Treg細胞→IFN-γ陽性Treg細胞(IFN-γ產生)之效果為以下順序，IkzfΔE5表現Treg細胞向IFN-γ陽性Treg細胞之變化率顯著較高：
Ikzf1ΔE5表現＞Ikzfs(Ikzf1～4)KO＞Ikzf1,3 KO＞Ikzf1 KO。
因此，於Treg細胞中，相較於剔除Ikzf1，進而相較於剔除Ikzf1及3、Ikzf1～4，於表現Ikzf1ΔE5之情形時向IFN-γ陽性Treg細胞之變化率較大，表示IFN-γ之產生能力提高。
實施例2-3：小鼠Treg細胞中之Ikzf1ΔE5過度表現所致之向IFN-γ陽性Treg細胞之變化
為了製作反轉錄病毒，將HEK293T細胞(2×10
5細胞/孔，2 ml培養基中)培養24小時。將無血清培養基(Opti-MEM：Gibco)以200 μl/孔分注於1.5 ml管中，將引入有Ikzf1ΔE5之反轉錄病毒載體(1 μg)與作為反轉錄病毒包裝載體之pCL-Eco(1 μg)一起添加至其中。其後，添加6 μl/試管量之HD(Promega)，輕輕渦漩後，於室溫下靜置20分鐘。20分鐘後，向所培養之HEK293T細胞中滴加含有載體之無血清培養基，進而培養2天。2天後，回收培養上清液，用0.45 μm之過濾器進行過濾後，獲得含有目標基因之病毒用於以下實驗。
由Foxp3
Cre小鼠製備YFP
+Treg細胞，於塗佈有抗CD3抗體(1 μg/ml)及抗CD28抗體(1 μg/ml)之96孔培養盤中，於IL-2(100 U/ml)之存在下培養24～28小時(1×10
5/孔/100 μl)。培養後，向已製作之反轉錄病毒中加入凝聚胺(1.5 μl/ml)，以200 μl/孔之量將反轉錄病毒緩慢添加至培養中之孔中。添加反轉錄病毒後，於32℃、2500 rpm、加速器最小值、制動閘最小值之條件下離心90分鐘，藉此進行病毒感染。離心後，於37℃之培養箱中靜置30分鐘，其後，緩慢去除上清液(240 μl)，緩慢添加培養基200 μl。添加培養基後，於32℃、500 g之條件下離心5分鐘，緩慢(200 μl)去除上清液，緩慢添加培養基200 μl，於37℃下培養4天。培養中，於第2天去除一半量(120 μl/孔)之培養液(亦包含培養細胞)，添加同量之培養基。
培養後，對細胞表面及細胞內分子進行染色。作為對照，使用未引入任何基因之空(empty)反轉錄病毒載體。藉由本方法，將過度表現Ikzf1ΔE5之Treg細胞向IFN-γ陽性Treg細胞之變化進行比較。
將結果示於圖6(7)、(8)中。根據此處之結果，可知與藉由同源重組之Ikzf1ΔE5表現同樣地，藉由外源Ikzf1ΔE5之過度表現亦促進向IFN-γ陽性Treg細胞之變化；及相較於Ikzf1 KO，變化促進之程度較大。此處之結果與實施例2-1及2-2中之結果同樣地，顯示於Treg細胞中，相較於剔除Ikzf1，於表現Ikzf1ΔE5之情形時向IFN-γ陽性Treg細胞之變化率較大，IFN-γ之產生能力提高。進而提示由於Ikzf1ΔE5係與Foxp3之相互作用區域經缺失之Ikzf1突變體，因此藉由與Ikzf1競爭來抑制Ikzf1與Foxp3之締合，而抑制Ikzf1複合體之形成，誘導向IFN-γ陽性Treg細胞之變化；及其誘導能力大於Ikzf1 KO。
實施例3
由對人類中之Ikzf之作用所致之向IFN-γ陽性Treg細胞之變化
實施例3-1：藉由剔除人類Treg細胞中之Ikzf家族所致之向IFN-γ陽性Treg細胞之變化
使用EasySep人類CD4
+CD127lowCD25
+調節性T細胞分離套組(STEMCELL)製備人類Treg細胞。將Treg細胞於Dynabeads T-活化劑(2.5 μl/孔，Thermo Fisher Scientific)及IL-2(100 U/ml，Milteny Biotec)之存在下培養9天。回收所培養之Treg細胞，將陰性對照(Negative Control)gRNA或Ikzf1、2、3及4之gRNA與Cas9蛋白(Thermo Fisher Scientific)混合，藉由核轉染(Nucleofection)導入至Treg細胞中。第二天回收Treg細胞，以1×10
4細胞/孔接種於96孔培養盤中，於100 U/ml IL-2且2.5 μl/孔之Dynabeads T-活化劑之共存下進行培養。培養3天後，添加布雷非德菌素A及莫能菌素、細胞活化混合液(Biolegend)。培養5小時後，用抗CD4及抗CD25抗體進行染色。將細胞固定後，對IFNγ及作為核蛋白之Foxp3進行染色，藉由CytoFLEX LX(Beckman Coulter)對表現IFN-γ之Treg細胞之比率進行解析。
將所獲得之結果示於圖7中。根據此處之結果，顯示藉由Ikzf1、2、3及4全部剔除，於人類Treg中亦誘導向IFN-γ陽性Treg細胞之變化。
實施例3-2：藉由人類Treg細胞中之Ikzf家族分解物質處理所致之向IFN-γ陽性Treg細胞之變化
使用EasySep人類CD4+ T細胞分離套組(STEMCELL)製備人類CD4+。其後，用抗CD4抗體、抗CD25抗體、抗CD45RA抗體進行染色，使用MA900(SONY)對Fr I(CD45RA+CD25+)及Fr II(CD45RA-CD25++)進行分選。確認所分選之試樣之純度後，於Dynabeads T-活化劑(2.5 μl/孔，Thermo Fisher Scientific)、IL-2(100 U/ml，Milteny Biotec)及泊馬度胺(Ikzf1,3分解物質(Ikzf1,3 degrader))或REF001329(Ikzf2,4分解物質(Ikzf2,4 degrader))之存在下，以1×10
4細胞/孔接種於96孔培養盤中，培養9天。其後，去除上清液，添加布雷非德菌素A及莫能菌素、細胞活化混合液(Biolegend)。培養5小時後，用針對CD4、CD25之抗體進行染色，固定細胞後，對IFN-γ及作為核蛋白之Foxp3、Ikzf1及Ikzf2進行染色。其後，藉由CytoFLEX LX(Beckman Coulter)對該試樣進行解析。
將所獲得之結果示於圖8中。圖8A顯示Ikzf1,3被泊馬度胺分解，Ikzf2,4被REF001329分解。圖8B係藉由流式細胞分析對IFN-γ陽性Treg細胞進行設門，示出其比率之圖。該等結果顯示藉由減弱Ikzf1,3，誘導自Treg細胞向IFNγ陽性Treg細胞之變化。另一方面，若減弱Ikzf2,4，則不誘導自Treg細胞向IFNγ陽性Treg細胞之變化。
根據實施例3-1及3-2，顯示於人類中Ikzf1亦有助於向IFN-γ陽性Treg細胞之變化之可能性較高，鑒於實施例2-1及2-2，提示與小鼠同樣地，於人類中亦有效的是表現Ikzf1ΔE5。
實施例4
自人類初始T細胞誘導iTreg細胞中之Ikzf家族分解物質處理之影響
使用人類初始CD4+ T細胞分離套組II(Milteny Biotec)自人類PBMC(Peripheral blood mononuclear cell，周邊血液單核細胞)製備初始T細胞，使用含有TGF(transforming growth factor，轉形生長因子)-β(10 ng/ml)及IL-2(200 U/ml)之培養基，接種於塗佈有抗CD3抗體(8 μg/ml)之培養盤中。其後，加入各種濃度之泊馬度胺或REF001329，一面進行培養基更換及繼代作業一面進行10天培養。接種後，於第4天、第6天、第10天回收細胞，使用人類調節性T細胞分選混合液(BD)及抗Foxp3抗體對細胞進行染色，藉由CytoFLEX LX(Beckman Coulter)對分化之iTreg細胞進行解析。又，對於第6天之試樣之一部分，藉由西方墨點法評估Ikzf家族之蛋白質量。
將所獲得之結果示於圖9中。圖9顯示於Ikzf家族之減弱中使用泊馬度胺減弱Ikzf1,3之情形時向iTreg細胞之分化受到抑制。根據此處之結果，鑒於實施例2，提示Ikzf1ΔE5表現亦作用於初始T細胞，可對向iTreg細胞之分化產生影響。
實施例5
Ikzf1ΔE5 Treg細胞於荷癌小鼠模型中之抗腫瘤效果之研究
對Foxp3eGFP-Cre-ERT2及Foxp3eGFP-Cre-ERT2IkE5
f/f小鼠皮下移植黑色素瘤細胞株B16F0或大腸癌細胞株MC38，於移植後第0、1、3天腹腔內投予他莫昔芬。每2天對腫瘤直徑進行測量。於第18天對腫瘤及引流淋巴結(draining lymph nodes(dLNs))、非引流淋巴結(non-draining lymph nodes(ndLNs))進行採樣。按照程序手冊，使用腫瘤解離套組及gentleMACS OCTO解離器製備腫瘤浸潤淋巴細胞(Tumor-infiltrating lenkocytes(TILs))。
將所獲得之結果示於圖10中。圖10A係示出本實施例之程序之圖。圖10B顯示於表現Ikzf1ΔE5之Foxp3eGFP-Cre-ERT2IkE5
f/f小鼠中，與Foxp3eGFP-Cre-ERT2相比，B16FO細胞之植入及增殖受到抑制。圖10C顯示於表現Ikzf1ΔE5之Foxp3eGFP-Cre-ERT2IkE5
f/f小鼠中，與Foxp3eGFP-Cre-ERT2相比，MC38細胞之植入受到抑制。根據此處之結果，顯示Ikzf1ΔE5可強烈地抑制腫瘤之植入及增殖，即可用於治療及/或預防腫瘤。
實施例6
為了於體內評估Ikzf1之Exon5缺失對Treg細胞之穩定性所產生之影響，藉由使Foxp3
CreIkE5
f/f小鼠與Rosa26
RFP報導小鼠交配，而製作Foxp3表現細胞之命運圖譜小鼠(Foxp3
Cre/+IkE5f/fR26
RFP/+)。Rosa26
RFP報導小鼠係於編碼紅色螢光蛋白(RFP)之DNA序列之前將被loxP部位夾住之STOP盒插入至ROSA26基因座而成之基因修飾小鼠，隨著Cre之表現，STOP盒脫落，從而表現RFP。即，於Foxp3
Cre/+IkE5
f/fR26
RFP/++小鼠中，藉由FACS解析能夠檢測為如下細胞集群：表現Foxp3之Treg細胞中RFP及YFP為兩陽性，一旦以Treg形式表現Foxp3後Foxp3之表現消失之T細胞(以下，有時稱為「exTreg」)中RFP為陽性且YFP為陰性。因此，使用該系統，自Foxp3
Cre/+R26
RFP/+及Foxp3
Cre/+IkE5
f/fR26
RFP/+小鼠(3～4週齡)採取脾臟及淋巴結，藉由FACS解析來測定exTreg之比率，結果可知於Foxp3
Cre/+IkE5
f/fR26
RFP/+小鼠中exTreg之比率顯著增加(圖11)。由此，提示因Ikzf1之Exon5缺失導致Treg之穩定性受損，誘導自Treg向exTreg之變化。
實施例7
表現Ikzf1ΔE5之Treg細胞中之p300、NFAT1之靶基因表現之解析
將由Foxp3
CreIkE5
f/f小鼠之脾臟及淋巴結純化之CD4+FYP+ Treg細胞於細胞刺激混合液(eBioscience)中於37℃下刺激1小時。其後，將經刺激之Treg細胞用1%甲醛於室溫下處理30分鐘。核提取後，藉由使用數位破碎儀(Branson)之超音波處理將DNA片段化，與預先與100 μl DynaBeads IgG磁珠(Thermo Fisher Scientific)反應之5 μg之抗Foxp3(Abcam)抗體、抗p300(Abcam)抗體或抗NFAT1(Abcam)抗體一起於4℃下培養一夜。培養後，用RIPA緩衝液(1 ml/試樣)清洗DynaBeads 4次，用TE-NaCl緩衝液(1 ml/試樣)清洗1次，用溶出緩衝液100 μl/試樣提取DNA。提取後，於65℃、1100 rpm下進行24小時反向交聯，使用ChIP DNA Clean & Concentrator(Zymo Research)純化DNA(40 μl/試樣)。使用Covaris Focused-ultrasonicator S220(Covaris)將經純化之ChIP DNA片段化後製備基因庫。使用Ion Xpress Plus片段基因庫套組(Thermo Fisher Scientific)，按照製造商之指示製備基因庫，用IonS5測序系統(Thermo Fisher Scientific)進行序列測定。作為對照，使用自Foxp3
Cre小鼠以相同方式取得之Treg細胞，對藉由Ikzf1ΔE5表現誘導而Foxp3之結合增加之基因組域周邊之p300及NFAT1之基因組結合之變化進行定量，將兩者進行比較。
資料解析係首先使用fastQC確認測序讀數之質量，確認到Phred得分之平均值為20以上。其後，藉由Fastx_tool kit之fastx_trimmer對測序讀數進行修剪，使用Bowtie2，將測序讀數以默認設定映射至小鼠基因組mm10。使用MACS2實施峰值識別(Peak Calling)。ChIP-seq波峰係由FindPeaks定義，尺寸為500個鹼基對，波峰間之最小距離為500個鹼基對，FDR為預設值，區域過濾器設定為OFF。Foxp3之結合於野生型Treg細胞及表現Ikzf1ΔE5之Treg細胞間共通之區域或各細胞獨自之區域係使用HOMER(getDifferentialPeaks)，藉由預設之參數進行鑑定。Foxp3結合部位周邊之p300及NFAT1之結合峰之標準化密度圖係使用Homer Package之annotatePeaks進行計算。
將所獲得之Foxp3結合增加區域周邊之p300及NFAT1結合峰之標準化密度圖示於圖12中。若亦結合圖4，則可知於表現Ikzf1ΔE5之Treg細胞中，作為組織蛋白乙醯轉移酶(HAT)之p300與Foxp3相互作用，增強與Foxp3結合增加區域之結合。該等結果顯示Foxp3與Ikzf1形成抑制性複合體，於基因轉錄之控制中可能與活性Foxp3-p300複合體競爭。圖12顯示於Ikzf1ΔE5Treg細胞中與Foxp3結合增加區域之NFAT1結合確實地增加，該情況提示於Foxp3-Ikzf1複合體中與Foxp3結合增加區域之NFAT1結合受到抑制。由此可知，Foxp3-Ikzf1複合體藉由Ikzf1依賴性地經由核小體重組去乙醯酶(NuRD)複合體誘導為封閉之染色質結構，從而與p300或NFAT1等共活化因子競爭，結果抑制其靶基因之表現。
[產業上之可利用性]
根據本發明，可提供一種與腫瘤等之新治療、預防法相關之技術，產業上可利用性極高。
圖1(上)示出各Flag-Ikzf1突變體之結構。圖1(下)係示出於HEK293T細胞中表現各Ikzf1突變體及Myc-Foxp3，藉由抗Flag-M2抗體進行免疫沈澱之西方墨點法之結果的照片。圖中，α-Flag意指抗Flag-M2抗體，α-Myc意指抗c-Myc抗體。
圖2(左)示出各Foxp3突變體之結構。圖2(右)係示出於HEK293T細胞中表現各Foxp3突變體及Myc-Ikzf1，藉由抗Flag-M2抗體進行免疫沈澱之西方墨點法之結果的照片。
圖3係示出於Ikzf1表現Treg細胞(Foxp3
Cre)及表現Ikzf1ΔE5之Treg細胞(Foxp3
CreIKE5
f/f)中，於各種條件下，對內在性Foxp3或Ikzf1進行免疫沈澱之西方墨點法之結果的照片。
圖4係示出於Ikzf1表現Treg細胞(Foxp3
Cre)及表現Ikzf1ΔE5之Treg細胞(Foxp3
CreIkE5
f/f)中，HDAC1與內在性Foxp3進行免疫沈澱之西方墨點法之結果的照片。
圖5係示出於人類Treg細胞中，藉由抗Foxp3抗體進行免疫沈澱之西方墨點法之結果的照片。
圖6係對藉由各種Ikzf之剔除及Ikzf1ΔE5之表現而成為IFN-γ陽性之Treg細胞之比率進行比較的圖。值係於通常之單向方差分析後，藉由Tukey之多重比較而算出。* P＜0.05，** P＜0.01，***; P＜0.001。
圖7係示出人類Treg細胞中之Ikzf家族剔除給IFN-γ之表現帶來之效果的圖。
圖8A係示出確認到人類Treg細胞中泊馬度胺(Pomalidomide)及REF001329為Ikzf家族蛋白分解物質之西方墨點法結果的照片。圖8B係藉由流式細胞分析對IFN-γ陽性Treg細胞進行設門，示出其比率之圖。
圖9係示出於人類初始T細胞中使用泊馬度胺對Ikzf1,3進行蛋白減弱之情形時分化為Treg細胞之效果的流式細胞分析之結果。
圖10示出Ikzf1ΔE5 Treg細胞之抗腫瘤效果。圖10A示出實驗程序。圖10B係示出於Foxp3細胞特異性地表現Ikzf1ΔE5之Foxp3eGFP-Cre-ERT2IkE5
f/f小鼠中，與Foxp3eGFP-Cre-ERT2相比，B16FO細胞之植入受到抑制的曲線圖。圖10C係示出於表現Ikzf1ΔE5之Foxp3eGFP-Cre-ERT2IkE5
f/f小鼠中，與Foxp3eGFP-Cre-ERT2相比，MC38細胞之植入受到抑制的曲線圖。
圖11係示出自Foxp3
Cre/+R26
RFP/+及Foxp3
Cre/+IkE5
f/fR26
RFP/+小鼠(3～4週齡)採取脾臟及淋巴結，藉由FACS解析測定exTreg之比率所得之結果的圖。檢測為於表現Foxp3之Treg細胞中RFP及YFP為兩陽性，於Foxp3之表現消失之exTreg中RFP為陽性且YFP為陰性的細胞集群。
圖12係Foxp3
Cre小鼠(直線)與Foxp3
CreIkE5
f/f小鼠(波形線)之CD4+YFP+Treg細胞中之Foxp3結合增加區域周邊之p300及NFAT1結合波峰之標準化密度曲線圖。經標準化之訊號密度係於以Foxp3結合部位為中心之窗口±1 kb內進行繪圖。
TW202408550A_112126174_SEQL.xml
Claims (12)
- 一種腫瘤之預防及/或治療劑，其含有Ikzf1ΔE5蛋白、或Ikzf1ΔE5基因相關物質。
- 如請求項1之腫瘤之預防及/或治療劑，其以T細胞為靶。
- 如請求項2之腫瘤之預防及/或治療劑，其中T細胞係CD4陽性T細胞。
- 如請求項2之腫瘤之預防及/或治療劑，其中T細胞係調節性T細胞及/或初始T細胞。
- 如請求項1至4中任一項之腫瘤之預防及/或治療劑，其中Ikzf1ΔE5基因相關物質係編碼Ikzf1ΔE5蛋白之核酸分子。
- 如請求項1至4中任一項之腫瘤之預防及/或治療劑，其中Ikzf1ΔE5基因相關物質係Ikzf1基因之外顯子5部分之一部分或全部缺失之物質。
- 如請求項6之腫瘤之預防及/或治療劑，其中Ikzf1基因之外顯子5部分之一部分或全部缺失之物質選自由針對Ikzf1基因之外顯子5之外顯子跳躍劑及CRISPR/Cas等基因治療載體所組成之群。
- 如請求項7之腫瘤之預防及/或治療劑，其中外顯子跳躍劑係核酸。
- 如請求項1之腫瘤之預防及/或治療劑，其含有表現Ikzf1ΔE5之T細胞。
- 一種對Ikzf1複合體之形成調節物質進行篩選之方法，該Ikzf1複合體含有Ikzf1蛋白及Foxp3蛋白以及CHD4蛋白及/或HDAC1蛋白，該方法包括以下步驟： (a)使含有Ikzf1蛋白或其片段、以及Foxp3蛋白或其片段、CHD4蛋白或其片段及/或HDAC1蛋白或其片段之系統與Ikzf1複合體之形成調節物質之候選化合物接觸； (b)調查上述候選化合物是否抑制或促進Ikzf1蛋白或其片段與Foxp3蛋白或其片段之締合、是否抑制或促進Ikzf1蛋白或其片段與CHD4蛋白或其片段之締合、是否抑制或促進Ikzf1蛋白或其片段與HDAC1蛋白或其片段之締合、是否抑制或促進Foxp3蛋白或其片段與CHD4蛋白或其片段之締合、以及/或者是否抑制或促進Foxp3蛋白或其片段與HDAC1蛋白或其片段之締合； (c)若上述候選化合物抑制或促進任一締合，則鑑定為Ikzf1複合體之形成調節物質。
- 如請求項10之方法，其中Ikzf1複合體之形成調節物質係抑制或促進Ikzf1蛋白或其片段與Foxp3蛋白或其片段之締合之物質。
- 如請求項10或11之方法，其中Ikzf1複合體之形成調節物質係腫瘤之預防及/或治療劑、干擾素γ產生調整劑、或者T細胞調整劑。
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2022-112660 | 2022-07-13 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| TW202408550A true TW202408550A (zh) | 2024-03-01 |
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