TW202402304A - 使用陽離子膽固醇用於核酸遞送的局部遞送的脂質納米顆粒 - Google Patents

使用陽離子膽固醇用於核酸遞送的局部遞送的脂質納米顆粒 Download PDF

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Abstract

本發明涉及使用陽離子膽固醇用於核酸遞送的局部遞送的脂質納米顆粒，並且當局部給藥時，可以使由全身藥物遞送引起的副作用最小化，並且蛋白質表達可以限制在給藥部位。此外，可以增加給藥部位處的蛋白質表達的持續時間，並且因此脂質納米顆粒可用於與核酸治療相關的技術領域。

Description

使用陽離子膽固醇用於核酸遞送的局部遞送的脂質納米顆粒
本發明涉及用於核酸遞送的脂質納米顆粒，並且更特別地涉及包括陽離子膽固醇的用於局部遞送的脂質納米顆粒，包括所述納米顆粒和核酸的脂質納米顆粒組合物，以及使用其預防或治療疾病的方法。
隨著近來COVID-19疫苗的出現，基於mRNA的疫苗的期望及重要性正在增加。兩種經許可的疫苗(SpikevaxTM、ComirnatyTM)皆使用脂質納米顆粒(LNP)作為遞送載體，並且正在努力透過優化LNP組成和開發額外的可電離脂質來持續提高功效。
然而，一般而言，肌內注射的LNP透過淋巴管和血液擴散到全身以及注射的肌肉部位，這提高了全身反應的風險。特別是，對於COVID-19疫苗，由於一些心臟遞送的疫苗，導致心肌炎的可能性提高，心肌炎是心肌的炎症。因此，對於在大流行結束後的普通健康人群開發預防性疫苗時，需要具有改進的安全性的遞送載體。
目標是解決這些限制，在本發明中，已經嘗試開發遞送載體，其透過僅在注射部位表達mRNA並使全身分佈最小化來減少全身反應。未來，這樣的遞送載體預期適用於局部給藥，除肌內注射外，諸如瘤內注射、皮內注射、腦內注射等。預期透過將mRNA表達限制在給藥部位並減少給藥部位外的損失量，可以充分地利用給藥劑量。
此外，證實了本發明能夠增加肌肉部位處的蛋白質表達的持續時間。通常，肌內注射後肌肉部位處的蛋白質表達的減少示出零級動力學，並且看來本發明能夠顯著增加蛋白質表達的持續時間。因此，預期治療劑量可以減少。
總之，本發明涉及包括陽離子膽固醇的脂質納米顆粒以及包括該脂質納米顆粒的組合物，並且特別地涉及能夠1)透過將蛋白質表達限制在局部部位來增加安全性和2)增加蛋白質表達的持續時間的遞送載體。
背景部分中描述的上述資訊僅用於提高對本發明背景的理解，並且其可不包括形成本發明所屬領域的普通技術人員已知的現有技術的資訊。
本發明的目的是提供脂質納米顆粒以及包括所述脂質納米顆粒和核酸的脂質納米顆粒組合物，所述脂質納米顆粒在局部給藥時將核酸的遞送限制在僅給藥部位，從而減少全身副作用，從而增加安全性，並增加給藥部位處的有效表達的持續時間。
本發明的另一個目的是提供一種包括脂質納米顆粒組合物的疫苗。
本發明的仍另一個目的是提供一種預防或治療疾病的方法，包括向受試者給藥脂質納米顆粒組合物。
本發明的又另一個目的是提供脂質納米顆粒組合物用於預防或治療疾病的用途。
本發明的仍又另一個目的是提供脂質納米顆粒組合物用於製造用於預防或治療疾病的藥物的用途。
為了實現上述目的，本發明提供了一種脂質納米顆粒(LNP)，包括(A)可電離脂質；(B)陽離子膽固醇；(C)膽固醇；(D)輔助脂質；以及(E)PEG脂質(聚乙二醇脂質)，其中(B)陽離子膽固醇與(C)膽固醇的摩爾比為1:0.1至1:10。
此外，本發明提供了包括脂質納米顆粒和核酸的脂質納米顆粒組合物。
此外，本發明提供了一種包括脂質納米顆粒組合物的疫苗。
此外，本發明提供了一種預防或治療疾病的方法，包括向受試者給藥脂質納米顆粒組合物。
此外，本發明提供了脂質納米顆粒組合物用於預防或治療疾病的用途。
此外，本發明提供了脂質納米顆粒組合物用於製造用於預防或治療疾病的藥物的用途。
除非另外定義，否則本文中使用的所有技術術語和科學術語具有與本發明所屬領域的技術人員通常所理解的相同的含義。通常，本文使用的命名法在本領域中是習知的並且是典型的。
在本發明的實施方式中，預期將mRNA表達僅限制在給藥部位，並透過減少給藥部位外的損失量來維持給藥劑量。此外，證實了本發明的脂質納米顆粒組合物的給藥增加了肌內或皮下給藥部位處的蛋白質表達的持續時間。
因此，在一個方面，本發明涉及脂質納米顆粒(LNP)，包括(A)可電離脂質；(B)陽離子膽固醇；(C)膽固醇；(D)輔助脂質；以及(E)PEG脂質(聚乙二醇脂質)，其中(B)陽離子膽固醇與(C)膽固醇的摩爾比為1:0.1至1:10。
在根據本發明的脂質納米顆粒中，(B)陽離子膽固醇與(C)膽固醇的摩爾比可以是1:0.1至1:10，優選1:0.2至1:5，更優選1:0.33至1:3，最優選1:1。在此，證實了當陽離子膽固醇的比例增加時肝組織中的蛋白質表達降低，並且還證實了當陽離子膽固醇的比例超過特定比率時肌肉組織中的蛋白表達降低。
在根據本發明的脂質納米顆粒中，(B)陽離子膽固醇與(A)可電離脂質的摩爾比可以是1:0.5至1:20，優選1:1至1:10，更優選1:2至1:5，最優選1:2.59。
在根據本發明的脂質納米顆粒中，(B)陽離子膽固醇與(D)輔助脂質的摩爾比可以是1:0.2至1:10，優選1:0.33至1:5，更優選1:0.5至1:2，最優選1:0.518(1.93:1)。
在根據本發明的脂質納米顆粒中，(B)陽離子膽固醇與(E)PEG脂質的摩爾比可以是1:0.01至1:1，優選1:0.02至1:0.2，更優選1:0.05至1:0.1，最優選1:0.078(12.87:1)。
此外，根據本發明的脂質納米顆粒優選地包括30至80 mol%的可電離脂質；0.01至50 mol%的陽離子膽固醇；以及0.01至50 mol%的膽固醇，更優選40至60 mol%的可電離脂質；5至25 mol%的陽離子膽固醇；以及5至25 mol%的膽固醇，最優選45至55 mol%的可電離脂質；15至25 mol%的陽離子膽固醇；以及15至25 mol%的膽固醇。
此外，脂質納米顆粒優選地進一步包括0.01至20 mol%、更優選5至15 mol%、最優選8至12 mol%的輔助脂質(磷脂)。
此外，脂質納米顆粒優選地進一步包括0.01至10 mol%、更優選0.01至5 mol%、最優選1至2 mol%的PEG脂質。
根據本發明的脂質納米顆粒可以具有5 mV至15 mV的ζ電位和50 nm至250 nm的粒度(Z平均值)。脂質納米顆粒的粒度(Z平均值)和ζ電位使用Zetasizer Pro(Malvern Instruments，英國(United Kingdom))來測量。使用1X DPBS稀釋後測量粒度，並且使用10 mM NaCl來進行ζ電位測量。基於測量結果，粒度相似，但是包括陽離子膽固醇的組合物表現出更高的ζ電位。
在根據本發明的脂質納米顆粒中，陽離子膽固醇可以是但不限於選自由以下組成的組中的至少一種：AC-膽固醇(3β-[N-(氨基乙烷)氨基甲醯基]-膽固醇)、MC-膽固醇(3β-[N-(N′-甲基氨基乙烷)氨基甲醯基]-膽固醇)、DC-膽固醇(3β-[N-(N′,N′-二甲基氨基乙烷)氨基甲醯基]-膽固醇)、DMHAPC-膽固醇(3-[N-[3-[(2-羥乙基)二甲基銨基]丙基]氨基甲酸酯])、DMPAC-膽固醇(3-[[3-(二甲基氨基)丙基]氨基甲酸酯])、MHAPC-膽固醇(3-[N-[3-[(2-羥乙基)甲基氨基]丙基]氨基甲酸酯])、HAPC-膽固醇(3-[N-[3-[(2-羥乙基)氨基]丙基]氨基甲酸酯])、OH-膽固醇(N-[2-[(2-羥乙基)氨基]乙基]-(3β)-膽甾-5-烯-3-甲醯胺)以及OH-C-膽固醇(3-[N-[2-[(2-羥乙基)氨基]乙基]氨基甲酸酯])。
在根據本發明的脂質納米顆粒中，可電離脂質可以是但不限於選自由以下組成的組中的至少一種：DLin-DMA(1,2-二亞油基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷)、DLin-KC2-DMA(2,2-二亞油基-4-(2-二甲基氨基乙基)-[1,3]-二氧戊環)、DLin-MC3-DMA((6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七烷-6,9,28,31-四烯-19-基-4-(二甲基氨基)丁酸酯)、DODAP(1,2-二油醯基-3-二甲基銨丙烷)、DODMA(N,N-二甲基-(2,3-二油烯基氧基)丙胺)、由以下化學式1所示的cKK-E12、由以下化學式2所示的C12-200、由以下化學式3所示的ATX-002以及由以下化學式4所示的SM-102。 [化學式1] [化學式2] [化學式3] [化學式4]
此外，在根據本發明的脂質納米顆粒中，可電離脂質可以是但不限於選自由以下組成的組中的至少一種：1-亞油醯基-2-亞油基氧基-3-二甲基氨基丙烷(DLin-2-DMAP)、1,2-二亞油基氨基甲醯基氧基-3-二甲基氨基丙烷(DLin-C-DAP)、1,2-二亞油醯基-3-二甲基氨基丙烷(DLin-DAP)、2,2-二亞油基-4-二甲基氨基甲基-[1,3]-二氧戊環(DLin-K-DMA)、雙十八烷基醯胺基甘氨醯基羧基精胺(DOGS)、精胺膽固醇基氨基甲酸酯(GL-67)、雙胍鎓-亞精胺-膽固醇(BGTC)、1,1'-(2-(4-(2-((2-(雙(2-羥基癸基)氨基)乙基)(2-羥基癸基)氨基)乙基)哌嗪-1-基)乙基氮烷二基)雙十二烷-2-醇(C12-200)、N-叔丁基-N′-十四烷基-氨基-丙脒(雙C14-脒)、二甲基雙十八烷基溴化銨(DDAB)、N-(1,2-二肉豆蔻基氧基丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羥乙基溴化銨(DMRIE)、N,N-二油烯基-N,N-二甲基氯化銨(DODAC)、二油烯基氧基丙基-3-二甲基羥乙基溴化銨(DORIE)、N-(1-(2,3-二油烯基氧基)丙基)-N-2-(精胺甲醯胺基)乙基)-N,N-二甲基三氟乙酸銨(DOSPA)、1,2-二油醯基三甲基丙烷氯化銨(DOTAP)、N-(1-(2,3-二油烯基氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化銨(DOTMA)以及溴化氨基丙基-二甲基-雙(十二烷基氧基)-丙銨(GAP-DLRIE)。
此外，在根據本發明的脂質納米顆粒中，可電離脂質更優選為包含叔胺的脂質。
在根據本發明的脂質納米顆粒中，輔助脂質(磷脂)可以是但不限於選自由以下組成的組中的至少一種：DMPC(1,2-二肉豆蔻醯基-sn-甘油-3-磷脂醯膽鹼)、DOPC(1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼)、DOPI(1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸-(1'-肌肉肌醇))、DOPE(1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)、DPPC(1,2-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼)、DSPC(1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼)、DSPI(1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸肌醇)以及DLPC(1,2-二亞油醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼)。
此外，在根據本發明的脂質納米顆粒中，輔助脂質(磷脂)可以是但不限於選自由以下組成的組中的至少一種：1,2-二亞油醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DLPC)、1,2-雙十一烷醯基-sn-甘油-磷酸膽鹼(DUPC)、1-棕櫚醯基-2-油醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(POPC)、1,2-二-O-十八碳烯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(18:0 二醚PC)、1-油醯基-2-膽固醇基半琥珀醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(OChemsPC)、1-十六烷基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(C16 Lyso PC)、1,2-二亞麻醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼、1,2-二花生四烯醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼、1,2-雙二十二碳六烯醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼、1,2-二植烷醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(4ME 16:0 PE)、1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亞油醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亞麻醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二花生四烯醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-雙二十二碳六烯醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸-rac-(1-甘油)鈉鹽(DOPG)、二棕櫚醯基磷脂醯甘油(DPPG)、棕櫚醯基油醯基磷脂醯乙醇胺(POPE)、二硬脂醯基-磷脂醯基-乙醇胺(DSPE)、二棕櫚醯基磷脂醯乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻醯基磷酸乙醇胺(DMPE)、1-硬脂醯基-2-油醯基-磷脂醯乙醇胺(SOPE)、1-硬脂醯基-2-油醯基-磷脂醯膽鹼(SOPC)、鞘磷脂、磷脂醯膽鹼、磷脂醯乙醇胺、磷脂醯絲氨酸、磷脂醯肌醇、磷脂酸、棕櫚醯基油醯基磷脂醯膽鹼、溶血磷脂醯膽鹼和溶血磷脂醯乙醇胺(LPE)。
在根據本發明的脂質納米顆粒中，PEG脂質可以是但不限於選自由以下組成的組中的至少一種：PEG修飾的磷脂醯乙醇胺、PEG修飾的磷脂酸、PEG修飾的神經醯胺、PEG修飾的二烷基胺、PEG修飾的二醯甘油和PEG修飾的二烷基甘油。
此外，PEG脂質優選地包括具有100 Da至20 kDa大小的PEG部分，並且更優選但不限於選自由以下組成的組中的至少一種：DMG-PEG2000(1,2-二肉豆蔻醯基-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000)、DSPE-PEG2000(1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[氨基(聚乙二醇)-2000]，以及神經醯胺-PEG2000(N-棕櫚醯基-鞘氨醇-1-{琥珀醯基[甲氧基(聚乙二醇))2000]})。
另一方面，本發明涉及包括脂質納米顆粒和核酸的脂質納米顆粒組合物。
在根據本發明的脂質納米顆粒組合物中，核酸可以是選自由以下組成的組中的至少一種：mRNA、siRNA、aiRNA、miRNA、dsRNA、shRNA、lncRNA、saRNA、rRNA、RNA、DNA、cDNA、質粒、適配體、tRNA、piRNA、circRNA、反義寡核苷酸、核酶、PNA以及DNAzyme，並且最優選mRNA，但不限於此。
根據本發明的脂質納米顆粒組合物的N/P比優選為2至12，更優選為4至8。N/P比透過將脂質納米顆粒組合物中所包括的可質子化胺基團的摩爾數N除以mRNA中磷酸酯基團的摩爾數P來確定。
仍另一方面，本發明涉及包括脂質納米顆粒組合物的疫苗。
在本發明中，術語“疫苗”理解為提供至少一種抗原、優選免疫原的預防性或治療性物質。抗原或免疫原可以來源於任何適合疫苗接種的物質。例如，抗原或免疫原可以來源於病原體，諸如細菌或病毒顆粒，或者腫瘤或癌組織。抗原或免疫原刺激身體的適應性免疫系統，這提供適應性免疫應答。
又另一方面，本發明涉及一種預防或治療疾病的方法，該方法包括向受試者給藥脂質納米顆粒組合物。
另外方面，本發明涉及脂質納米顆粒組合物用於預防或治療疾病的用途。
仍另外方面，本發明涉及脂質納米顆粒組合物用於製造用於預防或治療疾病的藥物的用途。
如本文所用，術語“預防”是指透過給藥組合物預防疾病發作或延緩疾病進展的任何作用。此外，術語“治療”是指透過給藥組合物改善疾病症狀或者減輕或消除症狀的任何作用。
如本文所用，術語“受試者”是指患有可透過給藥根據本發明的組合物而減輕、抑制或治療的病症或疾病或者處於所述病症或疾病的風險的哺乳動物，優選人類。
如本文所用，術語“給藥”是指透過任何適當的方法將本發明的組合物引入受試者的行為，並且給藥途徑可以包括各種口服或腸胃外途徑，只要藥物能夠到達目標群組織。腸胃外給藥可以是肌內(IM)、靜脈內(IV)、皮下(SC)、腹腔內(IP)、瘤內(IT)、皮內(ID)或腦內注射，並且給藥劑量可根據患者的狀態和體重、疾病的嚴重程度、藥物類型以及給藥途徑和時間而變化，但可由本領域技術人員適當地選擇。
本發明的組合物對人體的給藥劑量可以根據患者的年齡、體重、性別、劑型、健康狀況和疾病的嚴重程度而變化。
在本發明中，當配製組合物時，通常可使用稀釋劑或賦形劑，諸如填料、填充劑、粘結劑、潤濕劑、崩解劑、表面活性劑等。用於腸胃外給藥的製劑可包括滅菌水性溶液、非水性溶劑、助懸劑、乳劑、凍幹製劑、栓劑等。非水性溶劑或助懸劑的實例可包括丙二醇、聚乙二醇、植物油諸如橄欖油、可注射酯諸如油酸乙酯等。栓劑的基礎成分的實例可包括Witepsol、Macrogol、Tween 61、可可脂、月桂酸甘油酯油(laurin butter)、甘油、明膠等。
透過以下實施例可以更好地理解本發明。這些實施例僅陳述用於說明本發明，而不應被解釋為限制本發明的範圍，如對本領域技術人員來說是顯而易見的。
實施例1：包括陽離子膽固醇的脂質納米顆粒的製備及其特性的確認
將可電離脂質、膽固醇、陽離子膽固醇、磷脂和PEG脂質以50:19.25:19.25:10:1.5的摩爾比溶解於乙醇中，以及然後以1:3的體積比與溶解在檸檬酸鹽緩衝液(pH 4.0，50 mM)中的mRNA混合。對於對照，將可電離脂質、膽固醇、磷脂和PEG脂質以50:38.5:10:1.5的摩爾比使用，不包括陽離子膽固醇(圖1)。實施例中使用的陽離子膽固醇為DC-膽固醇(Avanti Polar Lipids)、HAPC-膽固醇(GLPBIO，USA)、DMPAC-膽固醇(GLPBIO，USA)或DMHAPC-膽固醇(GLPBIO，USA)(圖2)，所使用的可電離脂質為D-Lin-MC3-DMA(MedChemExpress，USA)、D-Lin-DMA(MedChemExpress, USA)、D-Lin-KC2-DMA(MedChemExpress USA)、cKK-E12(Organix, USA)、C12-200(Organix, USA)、ATX-002 (Organix, USA)、DODAP (Avanti Polar Lipids, USA)、DOMDA (Avanti Polar Lipids, USA)或SM-102 (Xiamen Sinopeg Biotech, 中國)(圖3)。此外，所使用的磷脂是1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DSPC)(Avanti Polar Lipids, USA)，並且所使用的PEG脂質是1,2-二肉豆蔻醯基-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000(DMG-PEG2000)(Avanti Polar Lipids，USA)。作為mRNA，使用CleanCap®螢火蟲螢光素酶mRNA(TriLink，USA)、CleanCap®紅細胞生成素mRNA (TriLink, USA)、HA mRNA(內部生產)或自擴增mRNA(內部生產)。
為了生產脂質納米顆粒，使用NanoAssemblr® IgniteTM(Precision Nanosystems，Inc.加拿大)，並且總流量設置為12 mL/min。使用Amicon®超離心過濾器MWCO 10 kDa(Millipore，USA)對所製備的脂質納米顆粒進行乙醇去除、緩衝液更換和濃縮。使用1X DPBS(Thermo Scientific，USA)進行稀釋和緩衝液更換。
為了分析所形成的脂質納米顆粒的特性，使用Zetasizer Pro(Malvern Instruments，英國)測量粒度(Z平均值)和ζ電位。使用1X DPBS稀釋後測量粒度，並且使用10 mM NaCl來進行ζ電位測量。其測量結果示出於下表1中。使用Ribogreen RNA測定試劑盒(Invitrogen，USA)測量mRNA的量。
[表1]
脂質納米顆粒 Z 平均值 (d, nm) ζ 電位 (mV)
D-Lin-MC3-DMA 97.8 ± 0.7 1.8 ± 0.5
D-Lin-MC3-DMA + DC-膽固醇 (膽固醇:DC-膽固醇=1:1) 96.9 ± 0.5 9.7 ± 0.6
D-Lin-DMA 91.8 ± 1.2 7.6 ± 0.7
D-Lin-DMA + DC-膽固醇 (膽固醇:DC-膽固醇=1:1) 102.2 ± 1.0 9.2 ± 1.0
D-Lin-KC2-DMA 87.2 ± 1.0 6.6 ± 0.3
D-Lin-KC2-DMA + DC-膽固醇 (膽固醇:DC-膽固醇=1:1) 97.0 ± 1.6 8.9 ± 0.4
cKK-E12 133.0 ± 1.4 -12.9 ± 0.4
cKK-E12 + DC-膽固醇 (膽固醇:DC-膽固醇=1:1) 118.8 ± 0.3 9.3 ± 0.5
C12-200 130.7 ± 3.3 2.6 ± 0.1
C12-200 + DC-膽固醇 (膽固醇:DC-膽固醇=1:1) 142.5 ± 2.2 8.4 ± 0.5
ATX-002 124.7 ± 1.8 3.9 ± 0.7
ATX-002 + DC-膽固醇 (膽固醇:DC-膽固醇=1:1) 126.8 ± 0.2 10.7 ± 0.8
DODAP 102.7 ± 1.3 -3.5 ± 0.7
DODAP + DC-膽固醇 (膽固醇:DC-膽固醇=1:1) 226.2 ± 3.1 10.2 ± 1.4
DODMA 120.7 ± 0.4 3.7 ± 0.4
DODMA + DC-膽固醇 (膽固醇:DC-膽固醇=1:1) 149.0 ± 1.0 9.4 ± 0.8
SM-102 88.1 ± 1.9 3.0 ± 0.2
SM-102 + DC-膽固醇 (膽固醇:DC-膽固醇=1:1) 102.6 ± 0.4 13.1 ± 0.6
對於透過添加陽離子膽固醇形成的脂質納米顆粒，粒度相似，並且陽離子ζ電位增加。
實施例2：肌內注射包括陽離子膽固醇的脂質納米顆粒後藥物遞送分佈和持續時間的評估
為了評估局部給藥實施例1中製備的物質後的藥物遞送分佈，將對應於0.25 mg/kg mRNA的脂質納米顆粒肌內注射至Balb/c小鼠(雄性，5周齡)的大腿(注射體積：50μL)。注射後6小時或7天，向其腹腔內給藥150 mg/kg的D-螢光素(Perkin Elmer，USA)，並且在15分鐘後，使用IVIS Lumina XR(Perkin Elmer，USA)測量生物發光。
使用全身圖像測量給藥的肌肉組織和肝組織的發光水準，並且在向小鼠肌內注射不具有/具有陽離子膽固醇的使用9種可電離脂質的脂質納米顆粒後的藥物遞送分佈的結果示出於圖4中。特別地，向小鼠肌內注射具有包封的螢光素酶mRNA的使用9種可電離脂質(D-Lin-MC3-DMA、D-Lin-DMA、D-Lin-KC2-DMA、cKK-E12、C12-200、ATX-002、DODAP、DODMA、SM-102)的脂質納米顆粒，並且在6小時或7天后，測量發光圖像以評估蛋白質表達的分佈和動力學。肌肉和肝組織在6小時和7天的發光信號(圖5)以及脂質納米顆粒的物理特性在圖中呈現(圖6)。如圖5所示，對於不具有陽離子膽固醇的常規脂質納米顆粒，除了給藥部位外，在肝中觀察到了大量的蛋白質表達。然而，當包括陽離子膽固醇時，蛋白質表達限制於肌肉組織。此外，在注射後第7天，由常規脂質納米顆粒的蛋白質表達大大降低，而具有陽離子膽固醇的脂質納米顆粒持續維持顯著水準的蛋白質表達。
無論測試的可電離脂質的類型如何，皆獲得了上述結果，這表明使用可電離脂質可以將組成比率一般地應用於脂質納米顆粒。
實施例3：根據陽離子膽固醇的比例對肌內注射脂質納米顆粒後的藥物遞送分佈的評估
為了確認陽離子膽固醇的最佳組成，用不同比例的陽離子膽固醇評估蛋白質表達譜，如表2所示。所用的可電離脂質是D-Lin-MC3-DMA。
[表2]
脂質納米顆粒組合物 A B C D E F
可電離脂質 50%
陽離子膽固醇 - 3.9% 9.6% 19.3% 28.9% 38.5%
膽固醇 38.5% 34.7% 28.9% 19.3% 9.6% -
磷脂 10%
PEG脂質 1.5%
向Balb/c小鼠(雄性，5周齡)的大腿肌內注射(0.25 mg/kg mRNA)後6小時，使用IVIS Lumina XR測量生物發光，並且其結果示出於圖7。特別地，透過包括不同比例的陽離子膽固醇來包封包含螢光素酶mRNA使用D-Lin-MC3-DMA的脂質納米顆粒，並在向小鼠肌內注射後6小時測量發光圖像。給藥的肌肉組織中的發光的測量結果示出於圖8，肝組織的發光的測量結果示出於圖9，並且肌肉組織與肝組織的發光比示出於圖10。證實了肝組織中的蛋白質表達隨著陽離子膽固醇的比例的增加而降低，並且還證實了當陽離子膽固醇的比例超過特定比率(D)時肌肉組織中的蛋白表達降低。因此，確定了能夠維持肌肉組織中的蛋白質表達水準並使全身遞送最小化的組成比率(D；膽固醇:陽離子膽固醇=1:1)。
實施例4：根據陽離子膽固醇的類型對肌內注射脂質納米顆粒後的藥物遞送分佈的評估
為了根據陽離子膽固醇的類型確認肌內注射後的藥物遞送分佈，使用實施例3中選擇的組成比率(可電離脂質:陽離子膽固醇:膽固醇:磷脂:PEG脂質=50:19.3:19.3:10:1.5摩爾比)製備脂質納米顆粒並進行評估。透過包括不同類型的陽離子膽固醇，製備包含螢光素酶mRNA使用D-Lin-MC3-DMA的脂質納米顆粒。
向Balb/c小鼠(雄性，5周齡)的大腿肌內注射(0.25 mg/kg mRNA)後6小時或7天，使用IVIS Lumina XR測量生物發光，並且其結果示出於圖11。特別地，給藥的肌肉組織中發光的測量結果示出於圖12，肝組織的發光的測量結果示出於圖13、肌肉組織與肝組織的發光比示出於圖14，並且注射後6小時和7天肌肉組織和肝組織中蛋白質表達水準的測量結果示出於圖15。證實了肝組織中的蛋白質表達由於包括陽離子膽固醇而降低，無論所評估的陽離子膽固醇的類型如何(HAPC-膽固醇、DMPAC-膽固醇、DMHAPC-膽固醇)。
實施例5：流感疫苗在肌內注射(IM)途徑中的應用
為了確認包括陽離子膽固醇的脂質納米顆粒對疫苗的適用性，製備了包括流感HA mRNA的脂質納米顆粒和包括陽離子膽固醇的脂質納米顆粒。在此，所用的可電離脂質為MC3。使用胰島素注射器將包括2μg或10μg的HA mRNA的LNP肌內注射到Balb/c小鼠(雌性，6周齡)的右大腿，間隔為2周兩次。在第二次免疫後2、4、6和9周透過眼眶後采血獲得血清，並且透過ELISA測量HA抗原特異性IgG水準以確認抗原特異性免疫原性。結果是，在2μg和10μg兩者下，皆確認了由包括陽離子膽固醇的脂質納米顆粒誘導的應答與由脂質納米顆粒誘導的應答相似(圖16)。
實施例6：確認皮下注射(SC)途徑的適用性
為了評估皮下注射在實施例1中製備的物質中的SM-102 LNP後的藥物遞送分佈，將對應於0.25 mg/kg mRNA的脂質納米顆粒皮下(s.c.)注射到Balb/c小鼠(雄性，6周齡)的頸背(注射體積：50μL)。注射後6小時、5天、10天或21天，向其腹腔內給藥150 mg/kg的D-螢光素(Perkin Elmer，USA)，並且在15分鐘後，使用IVIS Lumina XR(Perkin Elmer，USA)測量生物發光。給藥部位的圖像和發光值的測量結果示出於圖17。已確認，與當使用常規脂質納米顆粒時相比，當使用包括陽離子膽固醇的脂質納米顆粒時，蛋白質表達的持續時間持續維持最高達10天，甚至在皮下注射時，與實施例2中肌內注射後的結果一樣。
實施例7：確認包括陽離子膽固醇的脂質納米顆粒的全身遞送最小化
為了評估肌內注射在實施例1中製備的物質中的SM-102 LNP後的全身暴露蛋白質水準，將對應於2 mg/kg mRNA(紅細胞生成素mRNA)的脂質納米顆粒肌內(i.m.)注射到Balb/c小鼠(雄性，6周齡)(注射體積：50μL)。在注射後3小時、1天、4天、7天和14天採集血液，並測量血清紅細胞生成素的濃度。血液EPO濃度隨時間的測量結果示出於圖18。與當使用常規脂質納米顆粒時相比，當使用包括陽離子膽固醇的脂質納米顆粒時，觀察到血液中的蛋白質量小約10倍，表明當包括陽離子膽固醇時，全身暴露的蛋白質的量可減少。
實施例8：應用除膽固醇以外的陽離子物質時的效果比較
為了比較使用除陽離子膽固醇以外的陽離子脂質的效果，使用實施例3中選擇的組成比率(可電離脂質:陽離子膽固醇:膽固醇:磷脂:PEG脂質=50:19.3:19.3:10:1.5摩爾比)製備脂質納米顆粒並進行評價。在此，所使用的陽離子脂質是DOTAP。為了評估肌內注射後藥物遞送的分佈，將對應於0.25 mg/kg mRNA的脂質納米顆粒肌內注射(0.25 mg/kg mRNA)到Balb/c小鼠(雄性，6周齡)的大腿，並在6小時、7天和14天后，使用IVIS Lumina XR測量生物發光，並且其結果示出於圖19。即使當使用DOTAP代替陽離子膽固醇時，蛋白質表達的分佈類似地限制在給藥部位，但在給藥部位蛋白質表達的持續時間相對減少(例如，對於DOTAP約7天對比對於陽離子膽固醇約14天)。因此，基於膽固醇的陽離子物質被證明是對於根據本發明的脂質納米顆粒是所必需的。
實施例9：對自擴增RNA適用性的確認
為了評估實施例1中製備的物質中的SM-102 LNP對自擴增RNA(saRNA)的適用性，將對應於0.1 mg/kg mRNA的脂質納米顆粒肌內(i.m.)注射至Balb/c小鼠(雄性，6周齡)(注射體積：50μL)。注射後6小時、7天、14天和21天，使用IVIS Lumina XR(Perkin Elmer，USA)測量生物發光。給藥部位的圖像和發光值的測量結果示出於圖20。已確認，與當使用常規脂質納米顆粒時相比，當使用包括陽離子膽固醇的脂質納米顆粒時，蛋白質表達的持續時間增加，甚至在應用於saRNA時，與應用於常規mRNA(實施例1)的結果一樣。
工業實用性
根據本發明，用於核酸遞送的脂質納米顆粒在局部給藥時有效地最小化藥物的全身遞送並且僅將藥物遞送至給藥部位。這減少了在給藥部位外損失的藥物量，維持了目標部位的給藥劑量。此外，局部給藥根據本發明的脂質納米顆粒後，可以增加肌肉部位處的蛋白質表達的持續時間，這潛在地降低治療劑量。
儘管上文中已經詳細公開了本發明的特定實施方式，但是對於本領域技術人員而言將顯而易見的是，本說明書僅僅是優選的示例性實施方式，而不應被解釋為限制本發明的範圍。因此，本發明的實質範圍將由所附請求項及其等同物來限定。
無。
圖1示出在小鼠中肌內注射根據本發明的實施方式的包括陽離子膽固醇的脂質納米顆粒組合物後的蛋白質表達分佈，連同示出肝組織和肌肉組織中的發光的測量結果的圖。
圖2示出本發明的陽離子膽固醇的示例性結構。
圖3示出在本發明中評估的可電離脂質的示例性結構。
圖4示出用不具有/具有陽離子膽固醇的使用9種不同的可電離脂質的脂質納米顆粒肌內注射至小鼠後的蛋白質表達分佈。
圖5示出對小鼠進行肌內給藥後注射後6小時和7天的肝和肌肉組織中的蛋白質表達水準。
圖6示出測量在本發明的實施方式中使用的脂質納米顆粒的粒度和ζ電位的結果。
圖7示出肌內注射後小鼠中蛋白質表達的分佈，其取決於脂質納米顆粒中陽離子膽固醇的比例的變化。
圖8是示出來自圖7的肌肉組織的發光測量的結果的圖。
圖9是示出來自圖7的肝組織的發光測量的結果的圖。
圖10是示出來自圖7的肌肉組織與肝組織的發光比的圖。
圖11示出肌內注射後小鼠中蛋白質表達的分佈，其取決於脂質納米顆粒中使用的陽離子膽固醇的類型。
圖12是示出來自圖11的肌肉組織的發光測量的結果的圖。
圖13是示出來自圖11的肝組織的發光測量的結果的圖。
圖14是示出來自圖11的肌肉組織與肝組織的發光比的圖。
圖15示出對小鼠進行肌內給藥後注射後6小時和7天的肝和肌肉組織中的蛋白質表達水準，其取決於陽離子膽固醇的類型。
圖16示出在第一次免疫後4、6、8和11周測量的在向小鼠進行兩次肌內注射不具有/具有陽離子膽固醇的脂質納米顆粒後誘導的抗原特異性抗體效價。
圖17示出向小鼠進行皮下注射不具有/具有陽離子膽固醇的脂質納米顆粒後的蛋白質表達動力學。
圖18示出向小鼠進行肌內注射不具有/具有陽離子膽固醇的脂質納米顆粒後，血液中紅細胞生成素的血漿濃度動力學。
圖19示出向小鼠進行肌內注射具有陽離子膽固醇或陽離子脂質DOTAP的脂質納米顆粒後的蛋白質表達動力學。
圖20示出肌內注射具有陽離子膽固醇的脂質納米顆粒和自擴增mRNA後小鼠中的蛋白質表達動力學。
無。

Claims (18)

  1. 一種脂質納米顆粒(LNP)，包括：可電離脂質；陽離子膽固醇；膽固醇；輔助脂質；以及PEG脂質(聚乙二醇脂質)，其中，該陽離子膽固醇與該膽固醇的摩爾比為1:0.1至1:10。
  2. 如請求項1所述的脂質納米顆粒，其中，該陽離子膽固醇與該可電離脂質的摩爾比為1:0.5至1:20。
  3. 如請求項1所述的脂質納米顆粒，其中，該陽離子膽固醇與該輔助脂質的摩爾比為1:0.2至1:10。
  4. 如請求項1所述的脂質納米顆粒，其中，該陽離子膽固醇與該PEG脂質的摩爾比為1:0.01至1:1。
  5. 如請求項1所述的脂質納米顆粒，其中，該脂質納米顆粒包括30至80 mol%的該可電離脂質；0.01至50 mol%的該陽離子膽固醇；以及0.01至50 mol%的該膽固醇。
  6. 如請求項5所述的脂質納米顆粒，其中，該脂質納米顆粒進一步包括0.01至20 mol%的該輔助脂質。
  7. 如請求項5所述的脂質納米顆粒，其中，該脂質納米顆粒進一步包括0.01至10 mol%的該PEG脂質。
  8. 如請求項1所述的脂質納米顆粒，其中，該脂質納米顆粒具有5 mV至15 mV的ζ電位。
  9. 如請求項1所述的脂質納米顆粒，其中，該脂質納米顆粒具有50 nm至250 nm的粒度(Z平均值)。
  10. 如請求項1所述的脂質納米顆粒，其中，該陽離子膽固醇是選自由以下組成的組中的至少一種：AC-膽固醇(3β-[N-(氨基乙烷)氨基甲醯基]-膽固醇)、MC-膽固醇(3β-[N-(N′-甲基氨基乙烷)氨基甲醯基]-膽固醇)、DC-膽固醇(3β-[N-(N′,N′-二甲基氨基乙烷)氨基甲醯基]-膽固醇)、DMHAPC-膽固醇(3-[N-[3-[(2-羥乙基)二甲基銨基]丙基]氨基甲酸酯])、DMPAC-膽固醇(3-[[3-(二甲基氨基)丙基]氨基甲酸酯])、MHAPC-膽固醇(3-[N-[3-[(2-羥乙基)甲基氨基]丙基]氨基甲酸酯])、HAPC-膽固醇(3-[N-[3-[(2-羥乙基)氨基]丙基]氨基甲酸酯])、OH-膽固醇(N-[2-[(2-羥乙基)氨基]乙基]-(3β)-膽甾-5-烯-3-甲醯胺)以及OH-C-膽固醇(3-[N-[2-[(2-羥乙基)氨基]乙基]氨基甲酸酯])。
  11. 如請求項1所述的脂質納米顆粒，其中，該可電離脂質是選自由以下組成的組中的至少一種：DLin-DMA(1,2-二亞油基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷)、DLin-KC2-DMA(2,2-二亞油基-4-(2-二甲基氨基乙基)-[1,3]-二氧戊環)、DLin-MC3-DMA((6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七烷-6,9,28,31-四烯-19-基-4-(二甲基氨基)丁酸酯)、DODAP(1,2-二油醯基-3-二甲基銨丙烷)、DODMA(N,N-二甲基-(2,3-二油烯基氧基)丙胺)、由以下化學式1所示的cKK-E12、由以下化學式2所示的C12-200、由以下化學式3所示的ATX-002以及由以下化學式4所示的SM-102： [化學式1] [化學式2] [化學式3] [化學式4]
  12. 如請求項1所述的脂質納米顆粒，其中，該輔助脂質是選自由以下組成的組中的至少一種：DMPC(1,2-二肉豆蔻醯基-sn-甘油-3-磷脂醯膽鹼)、DOPC(1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼)、DOPI(1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸-(1'-肌肉肌醇))、DOPE(1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)、DPPC(1,2-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼)、DSPC(1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼)、DSPI(1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸肌醇)以及DLPC(1,2-二亞油醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼)。
  13. 如請求項1所述的脂質納米顆粒，其中，該PEG脂質是選自由以下組成的組中的至少一種：PEG修飾的磷脂醯乙醇胺、PEG修飾的磷脂酸、PEG修飾的神經醯胺、PEG修飾的二烷基胺、PEG修飾的二醯甘油和PEG修飾的二烷基甘油。
  14. 一種脂質納米顆粒組合物，包括如請求項1至13中任一項所述的脂質納米顆粒，以及核酸。
  15. 如請求項14所述的脂質納米顆粒組合物，其中，該核酸是選自由以下組成的組中的至少一種：mRNA、siRNA、aiRNA、miRNA、dsRNA、shRNA、lncRNA、saRNA、rRNA、RNA、DNA、cDNA、質粒、適配體、tRNA、piRNA、circRNA、反義寡核苷酸、核酶、PNA以及DNAzyme。
  16. 如請求項14所述的脂質納米顆粒組合物，其中，該組合物具有2至12的N/P比。
  17. 一種疫苗，包括如請求項14所述的脂質納米顆粒組合物。
  18. 一種預防或治療疾病的方法，包括向受試者給藥如請求項14所述的脂質納米顆粒組合物。
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