TW202400188A - 經冷凍乾燥之rna組成物 - Google Patents

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Abstract

本發明屬於RNA調配之技術領域，尤其係關於RNA之冷凍乾燥。更具體言之，本發明係關於經冷凍乾燥的組成物及用於獲得經冷凍乾燥組成物的方法。此外，本發明提供經復水的根據本發明的組成物在人類及／或獸醫學中的用途。

Description

經冷凍乾燥之RNA組成物
本發明屬於RNA調配物之技術領域，尤其係關於RNA之冷凍乾燥。更具體言之，本發明係關於經冷凍乾燥的組成物及用於獲得經冷凍乾燥組成物的方法。此外，本發明提供經復水的根據本發明的組成物在人類及／或獸醫學中的用途。
基於mRNA的疫苗係可於（相對）短的時間內製備的新穎且有前景的平台。mRNA疫苗具有以下優點：其等不向宿主細胞核遞送病毒核酸（避免與宿主DNA融合）且所注射的mRNA亦具有相對短的活體內半生期。儘管有此等效力及安全性之優點，mRNA疫苗之不穩定性及極低溫儲存需求仍為主要限制。極低溫儲存需求及短保存期限減緩疫苗之分配（大部分是在世界上資源有限的地區）。
於生產、運送期間及在終端使用者所在地的所需儲存條件被認為是mRNA疫苗藥物產品之重要特徵。mRNA調配物之穩定性可（在某種程度上）受多種因子影響，該等因子諸如係賦形劑、pH、溫度、以及mRNA序列之優化；適當的載體挑選；mRNA在脂質奈米粒子（LNP）中的囊封、及冷凍乾燥。冷凍乾燥（Freeze-drying或lyophilization）係用以改善液體疫苗調配物之穩定性的技術，其藉由首先冷凍該調配物然後通過昇華及脫附程序移除水性溶劑（WO2012098358）。
於一系列來自CureVac的專利中，聲稱藉由使用諸如糖的冷凍保護劑於冷凍乾燥及儲存後維持mRNA調配物（有或無魚精蛋白的裸mRNA）之活性（WO2016/165831；WO2011/069528；US9616084）。據稱於實驗期間（至多達36個月）分析的所有品質屬性皆符合穩定且安全的RNA藥品之穩定性規格（即外觀、RNA完整性、RNA含量、pH值、及滲透壓）。於2020，Zhao等人發表了其等之對於相較於新鮮LNP具有不同冷凍保護劑的經冷凍乾燥LNP-mRNA（編碼螢光素酶）之性能的發現。此等作者展示如以活體內生物發光成像研究觀察到的，其經復水物質在小鼠中維持mRNA表現效率（Zhao等人2020）。
於BioNTech／輝瑞之近期研究（Muramatsu等人2022）中，展示了核苷經修飾的mRNA LNP可經冷凍乾燥，且經冷凍乾燥物質之物化特性於室溫下儲存12週後及於4°C下儲存至少24週後未顯著改變。重要地，作者觀察到於4°C下儲存24週後經冷凍乾燥流感mRNA-LNP疫苗之小鼠免疫原性未減低。
儘管敘述了一些mRNA-LNP調配物之冷凍乾燥實驗指引，對於以下者仍有需求：改善可冷凍乾燥組成物以達成具有長保存期限且對mRNA疫苗之生物活性或物化特性（諸如餅外觀、復水後可見粒子之存在、mRNA含量、囊封效率、粒度及多分散性指數（PDI）、pH、及滲透壓）影響小或無影響的穩定產物。
本發明意欲解決以上問題且本發明之目標係獲得一種組成物，其特別適用於冷凍乾燥以提供穩定的產物且（於經冷凍乾燥狀態下）維持其物化特性以及最終維持mRNA-LNP疫苗之物化特性。此目標由申請專利範圍之所請標的解決。尤其，本發明之基礎目標係根據以下者解決：一種組成物，其包含一或多種RNA分子、一或多種脂質奈米粒子、一或多種冷凍保護劑、及參(羥甲基)甲胺（TRIS）；其中該組成物經冷凍乾燥；且其中於冷凍乾燥前該組成物中的TRIS之濃度係3 mM或更少。尤其，該組成物可於人類及／或獸醫學中使用。
本發明進一步提供一種冷凍乾燥之方法，其包含混合RNA分子、一或多種脂質奈米粒子、冷凍保護劑、及TRIS，從而形成根據本發明的組成物；然後通過冷凍步驟、第一乾燥步驟、及第二乾燥步驟冷凍乾燥該組成物；其中該第一乾燥步驟係於低於經最大地冷凍濃縮的溶液之玻璃轉移溫度（Tg’）的溫度下進行。
本發明之發明人已出人意料地發現根據本發明的待冷凍乾燥組成物特別適用於冷凍乾燥之程序。於完成該冷凍乾燥程序後，該經冷凍乾燥組成物之特徵在於(i)高的冷凍乾燥及復水後mRNA回收率、(ii)極佳的RNA完整性、及(iii)最小的LNP粒度之增加。此外，該特別組成物為液體調配物帶來更有利的PDI值且確保足夠的緩衝能力。該調配物之加工完整性及功能性於冷凍乾燥後仍被保留。尤其，增加了儲存穩定性，尤其於長期儲存及／或於非冷卻條件下儲存方面。保存期限達到於冷凍態下於-20°C下至多36個月，於冷態（2-8°C）下於4°C下至多24個月，且於室溫下於25°C下至多24小時。根據本發明的方法可用以以可再現且有成本效益的方式製造具有以上提及的特性的包含RNA的組成物。根據本發明的包含RNA的經冷凍乾燥組成物可有利地於無冷鏈下儲存、運送及（例如）於醫學技術領域中使用（例如作為疫苗），同時該組成物中的RNA之完整性及生物活性仍極高。
於第一方面，本發明係關於一種組成物，其包含：一或多種RNA分子、一或多種脂質奈米粒子、一或多種冷凍保護劑、及參(羥甲基)甲胺（TRIS）；其中所述組成物經冷凍乾燥；且其中於冷凍乾燥前該組成物中的TRIS之濃度係3 mM或更少。
於一本發明之特別實施方式中，所述冷凍保護劑選自包含以下者的列表：海藻糖（trehalose）、麥芽糖、或蔗糖、或其等之組合；尤其蔗糖。
於另一方面，本發明係關於一種組成物，其包含：一或多種RNA分子、一或多種脂質奈米粒子、蔗糖、及參(羥甲基)甲胺（TRIS）；其中所述組成物經冷凍乾燥；且其中於冷凍乾燥前該組成物中的TRIS之濃度係3 mM或更少。
於又一特別實施方式中，於冷凍乾燥前該組成物中的冷凍保護劑之濃度係至少約10%（w/v），尤其至少約15%（w/v），更尤其至少約20%（w/v），較佳至少約15%（w/v）。
於一特別實施方式中，於冷凍乾燥前該組成物中的蔗糖之濃度係至少約5%（w/v），尤其至少約8%（w/v），更尤其至少約10%（w/v）。
於一特別實施方式中，於冷凍乾燥前蔗糖之濃度係約及在5%至約20%（w/v）之間，尤其約及在5%至約15%（w/v）之間，更尤其約及在8%至約15%（w/v）之間，甚至更尤其約及在10%至約15 %（w/v）之間。
於一本發明之進一步實施方式中，於冷凍乾燥前該組成物中的TRIS之濃度係約及在0.01 mM至約3 mM之間，較佳約及在0.1 mM至約2 mM之間，更佳約及在0.5 mM及1.5 mM之間，最佳約1 mM。
於一本發明之進一步實施方式中，於冷凍乾燥前該組成物中的TRIS之濃度係約及在0.01 mM至約3 mM之間，較佳約及在0.1 mM至約3 mM之間，更佳約及在0.5 mM及3 mM之間，最佳約及在1 mM至約3 mM之間。或者約及在2 mM至約3 mM之間
於一本發明之特別實施方式中，所述脂質奈米粒子包含PEG脂質，尤其PEG2000脂質，更尤其DMG-PEG2000。
於一特別實施方式中，於冷凍乾燥前該組成物中的脂質奈米粒子包含約及在40 mol%及60 mol%之間的可離子化脂質、約及在5 mol%及15 mol%之間的磷脂、約及在20 mol%及40 mol%之間的固醇、及至少0.5 mol%的PEG脂質。
於又一進一步實施方式中，於冷凍乾燥前該組成物進一步包含水或注射用水（WFI）。
於一本發明之以下實施方式中，所述一或多種RNA分子係線性或環狀RNA分子。
於又一進一步實施方式中，所述一或多種RNA分子係mRNA分子。
於一進一步方面，本發明提供一種組成物，其供於人類及／或獸醫學中使用。
於一較佳實施方式中，根據本發明的組成物於向需要其的個體投予前經復水。
於一特別實施方式中，該復水係使用水，尤其注射用水（WFI）或鹽之水溶液，較佳TBS，更佳具有20 mM TRIS的TBS，最佳具有20 mM TRIS及0.9% NaCl的TBS進行。
於又一特別實施方式中，該經復水組成物pH約6至約8。
於又一進一步方面，本發明提供一種冷凍乾燥包含RNA分子及脂質奈米粒子的組成物的方法，所述方法包含在水或注射用水中混合RNA分子、一或多種脂質奈米粒子、冷凍保護劑、及濃度3 mM或更低的TRIS，從而形成根據本發明的組成物；及通過冷凍步驟、第一乾燥步驟、及第二乾燥步驟冷凍乾燥該組成物；其中所述第一乾燥步驟係於低於經最大地冷凍濃縮的溶液之玻璃轉移溫度（Tg’）的溫度下進行。
於一本發明之方法之進一步實施方式中，該第一乾燥步驟係於約及在-30°C至約-50°C之間，較佳約及在-35°C及約-45°C之間，尤其於約-40°C的溫度下進行。
現將進一步敘述本發明。於以下段落，更詳細地定義本發明之不同方面。可組合所定義的各方面與任一或多個其他方面，除非明確指示相反者。尤其，可組合任何指出為較佳或有利的特徵與任一或多個指出為較佳或有利的其他特徵。
用於本說明書及所附申請專利範圍中，單數形式「一（「a」和「an」）」及「該」包括複數所指事物，除非前後文另有明確規定。舉例而言，「一種化合物」意味一種化合物或超過一種化合物。
用於本文中，術語「包含（「comprising」、「comprises」、及「comprised of」）與「包括（「including」及「includes」）」或「含有（「containing」及「contains」）」同義且係包容性的或開放式的且不排除另外的未列舉成員、元件、或方法步驟。此術語亦包括「由...組成」及「基本上由...組成」。
用於本文中，當指可測量的值（諸如參數、量、持續時間、等等）時，術語「約」或「大約」意欲包含所明確指出的值之+/-10%或更小，較佳+/-5%或更小，更佳+/- 1 %或更小，且又更佳+/-0.1 %或更小的變異或距離所明確指出的值+/-10%或更小，較佳+/-5%或更小，更佳+/- 1 %或更小，且又更佳+/-0.1 %或更小的變異，其程度為如此變異於所揭露的發明中適合執行。應了解修飾語「約」或「大約」所指的值本身亦被明確地（且較佳地）揭露。
於第一方面，本發明係關於一種組成物，其包含：一或多種RNA分子、一或多種脂質奈米粒子、一或多種冷凍保護劑、及參(羥甲基)甲胺（TRIS）；且其中於冷凍乾燥前該組成物中的TRIS之濃度係3 mM或更少。
用於本文中，術語「組成物」可指二或多種產物或化合物之任何混合物，其係為了長期穩定化（諸如預防於預期的保存期限之期間內的變性或聚集）之目的。於本發明之前後文中，術語本發明之「經冷凍乾燥組成物」係指冷凍乾燥程序後呈經冷凍乾燥粉末的形式或固體形式的終產物。另一方面，術語「經復水組成物」係用於於在例如水中復水後呈水性形式且準備好向需要其的個體投予的經冷凍乾燥組成物。最後，本發明提及「待冷凍乾燥組成物」，其係一種於冷凍乾燥程序前的組成物，其可呈溶液、懸液劑、液體、或水性調配物的形式。除非另有說明，用於本文中的例如TRIS、冷凍保護劑、RNA分子、LNP之濃度、量、比率、比例、等等係關於冷凍乾燥後的組成物（即經冷凍乾燥組成物）。更具體言之，於該等例子中，本申請案會指冷凍乾燥前的組成物（即待冷凍乾燥組成物）之濃度、量、比率、比例、等等。
於本發明之前後文中，術語「冷凍乾燥（lyophilisation，亦以freeze drying為人所知）」係應用於維持或改善產物之保存期限，使其更便於儲存、分配、及運輸。冷凍乾燥程序通常包含三個連續步驟：i)冷凍步驟，其中溶劑（諸如例如水）結晶成冰、ii)第一乾燥步驟，其中於真空下藉由昇華移除溶劑、iii)第二乾燥步驟，其中藉由擴散及脫附移除大部分的未冷凍溶劑。
於本發明之前後文中，應將術語「TRIS」或參(羥甲基)胺基甲烷（或於醫藥使用期間以胺丁三醇（tromethamine）或THAM為人所知）理解成一種具有式(HOCH 2) 3CNH 2的有機化合物。其被常規地用作為緩衝溶液之組分，諸如在TAE及TBE緩衝劑中，尤其用於核酸之溶液。Tris被頻繁用於增加細胞膜之滲透性或用作為溶液中對金屬離子的化合物。用於本文中，TRIS起於冷凍乾燥前將溶液pH維持於可接受的範圍內的緩衝劑的作用。覆蓋寬廣的pH範圍的許多其他緩衝劑可供於調配中挑選，例如醋酸鹽、檸檬酸鹽、甘胺酸、組胺酸、磷酸鹽（鈉或鉀）、及二乙醇胺，且因此於本發明之前後文中亦可能係適合的。雖然可使用任何pH調整劑，使用參(羥甲基)胺基甲烷鹽酸鹽係較佳的。
於一些實施方式中，於冷凍乾燥前該組成物中的TRIS之所述濃度可係約3 mM或更少，諸如約2.9、2.8、2.7、2.6、2.5、2.4、2.3、2.2、2.1、2.0、1.9、1.8、1.7、1.6、1.5、1.4、1.3、1.2、1.1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0.09、0.08、0.07、0.06、0.05、0.04、0.03、0.02、0.01 mM。
於一特別實施方式中，於冷凍乾燥前該組成物中的TRIS之濃度較佳係約0.5 mM、約1 mM、或約1.5 mM。
於一本發明之進一步實施方式中，於冷凍乾燥前該組成物中的TRIS之濃度係約及在0.01至約3 mM之間，較佳約及在0.1 mM至約2 mM之間，更佳約及在0.5 mM及1.5 mM之間，最佳約1 mM。
於另一實施方式中，於冷凍乾燥前該組成物中的TRIS之濃度係約及在0.01至約3 mM之間，較佳約及在0.1 mM至約3 mM之間，更佳約及在0.5 mM及2 mM之間，最佳約及在1 mM至約3 mM之間。或者，約及在2 mM至約3 mM之間。
於一特別實施方式中，於冷凍乾燥前該組成物中的TRIS之濃度係約1 mM、約2 mM、或約3mM。
根據本發明，該待冷凍乾燥組成物亦包含至少一種冷凍保護劑。用於本文中且除非另外明確指出，術語「冷凍保護劑」係指一種賦形劑且應將其理解成一種用於保護一組成物及其相關化合物免於導因於例如冰形成的冷凍性損傷的穿透性或非穿透性物質。習用冷凍保護劑一般係二元醇（含有至少二個羥基的醇）及糖，諸如乙二醇、丙二醇、甘油、及海藻糖。一般，於本發明之前後文中為較佳者的糖具有高水置換活性及高玻璃轉移溫度。尤其，蔗糖及海藻糖係於冷凍及解凍期間以非毒性方式保留細胞之結構完整性的非還原性糖。
於一特別實施方式中，該冷凍保護劑可選自包含以下者的列表：檸檬酸鈉、氯化鈉、山梨糖醇、聚山梨糖醇酯、海藻糖、甘露糖、甘露糖醇、麥芽糖、蔗糖、葡萄糖、果糖、乳糖、組胺酸、精胺酸、離胺酸、右旋糖酐（dextran）、麥芽糊精、環糊精、聚乙烯吡咯啶酮（PVP）、甘胺酸、甘油、聚乙二醇（PEG）、丙二醇、及／或其等之混合物。
於一本發明之特別實施方式中，所述冷凍保護劑選自包含以下者的列表：海藻糖、麥芽糖、或蔗糖、或其等之組合；尤其蔗糖。
於一特別實施方式中，該冷凍保護劑係蔗糖。
因此，本發明係關於一種組成物，其包含：一或多種RNA分子、一或多種脂質奈米粒子、蔗糖、及參(羥甲基)甲胺（TRIS）；且其中於冷凍乾燥前該組成物中的TRIS之濃度係3 mM或更少。
於一特別實施方式中，於冷凍乾燥前本發明之組成物包含至少約0.01%（w/v）、至少約0.1%（w/v）、至少約0.5%（w/v）、至少約1%（w/v）、至少約2.5%（w/v）、至少約5%（w/v）、至少約10%（w/v）、至少約15%（w/v）、至少約20%（w/v）、至少約25%（w/v）、至少約30%（w/v），尤其至少約15%（w/v）的冷凍保護劑。
於又一特別實施方式中，於冷凍乾燥前該組成物中的冷凍保護劑之濃度係約及在0.01%至約30%（w/v）之間，較佳約及在10%至約20%（w/v）之間，最佳約15%（w/v）。
於另一實施方式中，於冷凍乾燥前蔗糖之濃度係約及在5%至約20%（w/v）之間的蔗糖，諸如約5%、6%、8%、9%、10%至約15%、16%、17%、18%、19%、20%（w/v）的蔗糖。
於另一實施方式中，於冷凍乾燥前蔗糖之濃度係約及在5%至約20%（w/v）之間，尤其約及在5%至約15%（w/v）之間，更尤其約及在8%至約15%（w/v）之間，甚至更尤其約及在10%至約15 %（w/v）之間。於一個實施方式中，於冷凍乾燥前該組成物中的冷凍保護劑之濃度係約5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%（w/v）。
於一個實施方式中，於冷凍乾燥前該組成物中的冷凍保護劑之濃度係15%（w/v）
於另一實施方式中，於冷凍乾燥前該組成物中的蔗糖之濃度係約5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%（w/v）。
於一特別實施方式中，於冷凍乾燥前該組成物中的蔗糖之濃度係15%（w/v）。
於一進一步實施方式中，於冷凍乾燥前本發明之組成物包含濃度1 mM的TRIS及15%的蔗糖（w/v）。
於又一進一步實施方式中，於冷凍乾燥前本發明之組成物包含濃度3 mM或更少的TRIS及約及在5%至約20%（w/v）之間的蔗糖，諸如約5%、6%、8%、9%、10%至約15%、16%、17%、18%、19%、20%（w/v）。
於另一實施方式中，於冷凍乾燥前本發明之組成物包含濃度3 mM或更少的TRIS及約及在5%至約20%（w/v）之間的蔗糖，諸如約及在8%至約20%（w/v）之間、約及在8%至約15%（w/v）之間、約及在10%至約15%（w/v）之間的蔗糖。
於本發明之前後文中，根據本發明的組成物包含至少一種或多種RNA分子，其在一或多種包含脂質、脂質體、脂質奈米粒子、聚合物、或基於聚合物的奈米粒子的媒介物中遞送。
用於本文中，脂質被稱為任何來自類別脂肪酸、甘油脂、甘油磷脂、神經鞘脂、固醇、3-甲基-2-丁烯-1-醇、醣脂、聚酮（polyketide）的組分。
進一步，於本發明之前後文中，脂質體係球形囊泡結構，其等具有至少一個脂質雙層，該脂質雙層以空心球之形狀形成，該空心球包含水相。如此，任何所關注的貨物（諸如含核酸調配物、醫藥藥物、蛋白質／胜肽）皆可被囊封在脂質體內的水性隔室（若其為水溶性／親水性）中或脂質雙層（若為脂溶性／親脂性）內。
於本發明之前後文中，通過術語「脂質奈米粒子」或LNP提及一種奈米級粒子，其由一或多種特別適用於將種類繁多的核酸（RNA及DNA）囊封在非水性核心中作為藥物或疫苗的脂質（例如不同脂質之組合）構成。更具體言之，該脂質奈米粒子一般形狀係球形且由透過介面活性劑穩定化的固體脂質核心組成。該等核心脂質可係脂肪酸、醯基甘油、蠟、及其等之混合物。可利用生物膜脂質（諸如磷脂、鞘磷脂、膽鹽（牛膽酸鈉）、及固醇（膽固醇））作為穩定劑。在LNP中使用的可能脂質可係例如（但不限於）至少一種磷脂、至少一種經修飾脂質，諸如PEG脂質（例如PEG2000脂質）、至少一種可離子化脂質、及至少一種固醇。本文之揭露內容之脂質奈米粒子及其組成物一般於發明所屬技術領域中係已知的。
於本發明之前後文中，術語「PEG脂質」或「聚乙二醇化脂質」意欲係任何適合的以PEG（聚乙二醇）基團修飾的脂質。於本發明之前後文中，特別適合的PEG脂質之特徵在於係二C14-PEG脂質。於本發明之前後文中，當使用術語C14-PEG脂質時，此意欲係二C14-PEG脂質，即具有2個C14脂質尾的脂質。C14-PEG脂質含有聚乙二醇部分（其界定該等脂質之分子量）以及包含14個C原子的脂肪酸尾。例如，於本發明之前後文中，PEG脂質可係二C14-PEG脂質，諸如例如DMG-PEG，更尤其DMG-PEG2000（1,2-二肉豆蔻醯基-外消旋-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000）或DMPE-PEG，更尤其DMPE-PEG2000（1,2-二肉豆蔻醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000）。或者，亦可適當地使用較長鏈PEG脂質，諸如二C16-脂質或二C18-脂質。於一特別實施方式中，所述二C18-PEG2000脂質選自包含以下者的列表：(基於二硬脂醯基的)-PEG2000脂質，諸如DSG-PEG2000脂質（2-二硬脂醯基-外消旋-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000）或DSPE-PEG2000脂質（1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]）；或(基於二油醯基-的)-PEG2000脂質，諸如DOG-PEG2000脂質（1,2-二油醯基-外消旋-甘油）或DOPE-PEG2000脂質（1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[胺基(聚乙二醇)-2000]）或PEG5000脂質。
於一特別實施方式中，所述PEG2000脂質在所述脂質之脂肪酸尾中包含至少3個氧原子。如此PEG脂質之實例係DMG-PEG2000、DSPE-PEG2000。
於一本發明之特別實施方式中，所述PEG2000脂質係DMG-PEG2000。
於本發明之前後文中，於化合物或脂質之前後文中，術語「可離子化」（或者陽離子性）意味任何所述化合物或脂質中的不帶電基團之存在，該不帶電基團能夠藉由產生一離子（通常係H+離子）而解離並因此本身變得帶正電。或者，任何所述化合物或脂質中的不帶電基團可產生一電子並因此變得帶負電。用於本文中，可適當地使用任何類型的可離子化脂質。例如，適合的可離子化脂質係可離子化胺基脂質，其包含2個通過S-S鍵連接的相同或不同的尾。
於本發明之前後文中，術語「磷脂」意欲係由二個疏水性脂肪酸「尾」及一由磷酸基組成的親水性「頭」組成的脂質分子。該二個組份最常通過甘油分子連接在一起，因此，本發明之磷脂較佳係甘油-磷脂。此外，該磷酸基往往以簡單有機分子修飾，該等簡單有機分子諸如係膽鹼（即成為磷酸膽鹼）或乙醇胺（即成為磷酸乙醇胺）。
於本發明之前後文中，術語「固醇」（亦以類固醇醇為人所知）係一類固醇之亞類，其在植物、動物、及真菌中天然存在，或可藉由一些細菌生產。於本發明之前後文中，可使用任何適合的固醇，諸如選自包含以下者的列表：膽固醇、麥角固醇、菜油固醇、氧化膽固醇、樟芝素（antrosterol）、鏈甾醇（desmosterol）、尼卡固醇（nicasterol）、麥固醇、及豆固醇；較佳膽固醇。
於一特別實施方式中，所述LNP包含約及在10 mol%及60 mol%之間，較佳約及在40 mol%及60 mol%之間的所述可離子化脂質。
於又另一特別實施方式中，所述LNP包含約及在15 mol%及50 mol%之間，較佳約及在20 mol%及40 mol%之間的固醇。
於一進一步實施方式中，所述LNP包含約及在0.5 mol%及10 mol%之間，較佳約及在0.5 mol%及5 mol%之間的所述PEG2000脂質。
於另一實施方式中，所述LNP包含至少0.5 mol%，諸如至少1 mol%，諸如至少1.5 mol%，諸如至少2 mol%，諸如至少2.5 mol%，諸如至少3 mol%的所述PEG2000脂質。
於另一特別實施方式中，所述LNP包含約及在5 mol%及40 mol%之間，較佳約及在5 mol%及15 mol%之間的所述磷脂。
於一特別實施方式中，於冷凍乾燥前該組成物中的脂質奈米粒子包含約及在40 mol%及60 mol%之間的可離子化脂質、約及在5 mol%及15 mol%之間的磷脂、約及在20 mol%及40 mol%之間的固醇、及至少0.5 mol%的所述PEG2000脂質。
於又一進一步實施方式中，於冷凍乾燥前該組成物進一步包含水或注射用水（WFI）。
於本發明之前後文中，應將術語「注射用水」理解成藉由蒸餾或逆滲透純化且pH約5.0至7.0的蒸餾水之無菌、非致熱性、無溶質製劑。其僅用作為用於適用於非經腸投予的藥物或溶液的無菌溶劑或稀釋媒液，且意欲於藥品之製造中使用或用於注射。
於一本發明之以下實施方式中，所述一或多種RNA分子係線性或環狀RNA分子。
於本發明之前後文中，術語「RNA」係關於一種分子，其包含核糖核苷酸殘基且較佳完全或實質上由核糖核苷酸殘基構成。「核糖核苷酸」係關於一種核苷酸，其於β-D-核呋喃糖基之2’-位置具有羥基。尤其，此術語係指單股RNA，但亦可指雙股RNA、經分離RNA，諸如經部分純化RNA、基本上純的RNA、合成RNA、重組生產的RNA、以及與天然存在的RNA差異在於一或多個核苷酸之添加、缺失、取代、及／或改變的經修飾RNA。如此改變可包括將非核苷酸物質添加（諸如）至RNA之末端或內部，例如於該RNA之一或多個核苷酸。RNA分子中的核苷酸亦可包含非標準核苷酸，諸如非天然存在的核苷酸或化學合成的核苷酸或去氧核苷酸。此等經改變RNA可稱為類似物或天然存在的RNA之類似物。
於又一進一步實施方式中，所述一或多種RNA分子係mRNA分子。
根據本發明，術語「RNA」包括且較佳係關於「mRNA」，其意味「傳訊RNA」且係關於「轉錄本」，其可使用DNA作為模板來生產且編碼胜肽或蛋白質。mRNA通常包含5’非轉譯區（5’-UTR）、蛋白質或胜肽編碼區、及3’非轉譯區（3’-UTR）。在細胞中及試管內，mRNA之半生期有限。較佳，mRNA係使用DNA模板藉由試管內轉錄生產。於本發明之一個實施方式中，該RNA係藉由試管內轉錄或化學合成獲得。試管內轉錄方法學對於發明所屬技術領域中具有通常知識者而言係已知的。例如，存在各種各樣可商購的試管內轉錄套組。
為避免任何誤解，根據本發明的組成物包含LNP，該等LNP進一步包含一或多種mRNA分子，或其等可包含許多mRNA分子，諸如一或多種編碼免疫調節蛋白的mRNA分子及／或一或多種編碼抗原專一性蛋白及／或疾病專一性蛋白的mRNA分子之組合。
於一極特別實施方式中，該組成物包含一或多種mRNA分子，該（等）mRNA分子編碼至少一種選自包含CD40L、CD70、及caTLR4的列表的免疫刺激性蛋白。
據此，本發明提供一種經冷凍乾燥組成物，其包含編碼CD40L的mRNA分子、編碼CD70的mRNA分子、編碼caTLR4的mRNA分子，其中所述mRNA分子在脂質奈米粒子中調配，且其中所述組成物進一步包含一或多種冷凍保護劑、及於冷凍乾燥前濃度3mM或更少的TRIS。於一進一步方面，本發明提供一種組成物，其供於人類及／或獸醫學中使用。
於一較佳實施方式中，根據本發明的經冷凍乾燥組成物於向需要其的個體投予前經復水。該組成物之此經復水形式進一步被稱為「經復水組成物」。於一特別實施方式中，根據本發明的經復水組成物係一醫藥組成物，其包含該經冷凍乾燥組成物及至少一種或多種醫藥上可接受的劑，諸如賦形劑、載劑、稀釋劑。
於本發明之前後文中，通過術語「醫藥組成物」提及一種具有醫藥特性的組成物，諸如疫苗（或疫苗組成物）。換言之，提及一種組成物，其提供藥理及／或生理功效。於一些實施方式中，該醫藥上可接受的劑包括（但不限於）生物相容性媒介物、佐劑、添加劑、及稀釋劑以達成可呈劑量形式使用的組成物。另外的適合的醫藥載劑及稀釋劑以及對於使用其等而言的醫藥必需品係於Remington氏醫藥科學（Remington’s Pharmaceutical Sciences）中敘述。於冷凍乾燥後，所得的經乾燥組成物可使用任何適合的基質／緩衝劑復水，該基質／緩衝劑係諸如但不限於水、注射用水、Tris緩衝食鹽水（TBS）、及／或磷酸鹽緩衝食鹽水（PBS）。
於一特別實施方式中，該復水係使用水或鹽之水溶液，較佳TBS，更佳具有20 mM TRIS的TBS，最佳具有20 mM TRIS及0.9% NaCl的TBS進行。
於一特別實施方式中，該復水係使用注射用水（WFI）進行。於又一特別實施方式中，該經復水組成物pH約6至約8。
於一特別實施方式中，該經復水組成物pH約6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1 ,7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0，較佳pH約7.0，較佳約7.4。
本發明提供一種用於預防及治療人類及獸醫病症的方法，其係藉由向需要其的個體投予組成物或醫藥組成物。
於本申請案之前後文中，術語「治療（「treatment」、「treating」、「treat」、及類似者）係指獲得所欲的藥理及／或生理功效。該功效可於完全或部份預防一疾病或其症狀方面係預防性的及／或可於部分或完全穩定或治癒一疾病及／或導因於該疾病的有害效應方面係治療性的。「治療」涵蓋任何哺乳動物，尤其人類中的疾病之治療，且包括：(a)預防該疾病或症狀在可能易患有該等疾病或症狀但尚未被診斷為患有其的個體中發生；(b)抑制該等疾病症狀，即阻止其發展；或(c)緩解該疾病症狀，即造成該疾病或症狀之消退。
於一特別實施方式中，本發明提供一種如本文中界定的醫藥組成物，其於復水後適合供於非經腸投予中使用；更尤其供於靜脈內、腫瘤內、皮內、腹膜內、肌內、或結內投予，較佳肌內投予中使用。
於一特別實施方式中，本發明提供一種經復水組成物或一種醫藥組成物，其供於治療或預防一個體中的病原體，尤其病毒病原體，更尤其SARS-CoV-2病毒中使用。
於另一實施方式中，提供一種如本文中界定的經復水組成物或醫藥組成物，其供於預防及／或治療細胞增生性病症中使用。
於又一進一步方面，本發明提供一種冷凍乾燥方法，其包含：a)混合RNA分子、一或多種脂質奈米粒子、冷凍保護劑、及TRIS，從而形成根據本發明的冷凍乾燥前組成物；及b)通過冷凍步驟、第一乾燥步驟、及第二乾燥步驟冷凍乾燥所述組成物；其中所述第一乾燥步驟係於低於經最大地冷凍濃縮的溶液之玻璃轉移溫度（Tg’）的溫度下進行。
用於本文中，應將術語「玻璃轉移溫度」（Tg）理解成於其冷凍物質自玻璃（脆的）態變成橡膠（可彎曲的或軟的）態的溫度。通常地，於非晶形物質之噴霧冷凍乾燥方法中，已考慮兩個不同類型的玻璃轉移溫度：(i)經最大地冷凍濃縮的溶液之玻璃轉移溫度（Tg’），其與冷凍溶液態有關；(ii)於第一乾燥開始後保持良好的待乾燥固體相之玻璃轉移溫度（Tg）。尤其，為了決定於第一乾燥期間的儲存溫度以避免崩塌，考慮Tg’比考慮Tg更重要。經冷凍乾燥蛋白質之保存期限可受於第一乾燥步驟期間的產物溫度影響。於低於Tg’下進行第一乾燥會使維持經冷凍乾燥產物之物理穩定性（即餅之形狀）變得可能。
於一特別實施方式中，所述第一乾燥亦可於低於崩塌溫度（Tc）的溫度下進行。
用於本文中，應將術語「崩塌溫度」（Tc）理解成於該溫度一物質會軟化至無法支撐其結構的溫度。崩塌現象對最終經冷凍乾燥產物之特性有損害性影響，導致於儲存期間的揮發物損失、差的復水行為、不均勻水分分佈、及廣泛結塊。通常地，一物質之Tc傾向與於乾燥期間所施用的溫度不同。於一些實施方式中，於第一乾燥期間的產物溫度被維持在比其Tc低2-5°C以避免崩塌及維持良好的餅結構。例如，其中產物溫度係-25°C且Tc係-20°C的冷凍乾燥程序產生良好的外觀。通常，崩塌溫度之值比Tg’值高1-3°C。一般而言，一經優化冷凍乾燥程序之第一乾燥期期間的目標產物溫度比對應於經冷凍濃縮相之玻璃轉移溫度（Tg’）的臨界閾值低數度。本文中關於根據本發明的方法界定的溫度通常指冷凍乾燥室中的個別溫度。取決於儀器之類型，冷凍乾燥室中的溫度可藉由不同方式測定。
於一特別實施方式中，所述第一乾燥係於比崩塌溫度（Tc）低約0.5°C、約1°C、約2°C、約3°C、約4°C、約5°C、約6°C、約7°C、約8°C、約9°C、約10°C的溫度下進行。作為一實例，對於於本申請案中敘述的產物，該組成物之崩塌溫度係-33°C，其Tg’係大約-35°C，且其第一乾燥溫度係於-40°C下進行。
於一本發明之方法之特別實施方式中，該第一乾燥步驟係於約及在-30°C至約-50°C之間，較佳約及在-35°C及約-45°C之間，尤其於約-40°C下進行。
於本發明之較佳實施方式中，該第一乾燥溫度等於給定組成物之Tg’或比給定組成物之Tg’低至少0.5°C、1°C、2°C、3°C、4°C、5°C、6°C、7°C、8°C、9°C、10°C、11°C、12°C、13°C、14°C、或15°C。
較佳，根據本發明的方法之步驟b)中的第一乾燥溫度低於-25°C，更佳低於-30°C，且最佳低於-35°C。進一步較佳，根據本發明的方法之步驟b)中的第一乾燥溫度係在-55°C至-25°C，較佳-50°C至-30°C的範圍內，更佳在-45°C至-35°C的範圍內，且最佳在-43°C至-37°C的範圍內。於一特佳實施方式中，該第一乾燥溫度係約-40°C。
於一特別實施方式中，該第一乾燥步驟溫度上升至該第二乾燥溫度。於一些實施方式中，該第一乾燥溫度以約及在-30°C至約-50°C之間，較佳約及在-35°C及約-45°C之間，尤其於約-40°C下開始且上升至約10°C，其中然後該第二乾燥步驟開始。
該Tg通常係依經驗確定。用於確定一物質或組成物之玻璃轉移溫度的方法於發明所屬技術領域中係已知的且包含（例如）藉由使用冷凍乾燥顯微鏡、示差熱分析儀（例如示差掃描量熱法）、或電阻抗分析儀（介電電阻分析）。該冷凍溫度較佳藉由選擇等於或低於給定組成物之Tg的溫度預確定。
於本發明之較佳實施方式中，該冷凍溫度等於給定組成物之Tg或比給定組成物之Tg低至少0.5°C、1°C、2°C、3°C、4°C、5°C、6°C、7°C、8°C、9°C、10°C、11°C、12°C、13°C、14°C、或15°C。例如，若該第一乾燥步驟係於-40°C（其低於給定組成物之Tg）下進行，該冷凍乾燥步驟可於例如-50°C下進行。
較佳，根據本發明的方法之步驟b)的冷凍溫度低於-30°C，更佳低於-35°C，且最佳低於-40°C。進一步較佳，根據本發明的方法之步驟b)的冷凍溫度係在-65°C至-35°C，較佳-60°C至-40°C的範圍內，更佳在-55°C至-45°C的範圍內，且最佳在-53°C至-47°C的範圍內。於一特佳實施方式中，該冷凍溫度係約-50°C。 實施例
本發明現將通過以下實施例闡明。發明所屬技術領域中具有通常知識者會了解可輕易作種種改變及修飾而不偏離本發明之技術精神或基本特徵。因此，應了解以下敘述的實施例於所有方面皆係闡明性的且不以任何方式限制本發明之範圍。 材料及方法： 原料：
DSPC、膽固醇、及DMG-PEG2000係購自Avanti Polar Lipids Inc.（Birmingham，阿拉巴馬州，USA）。專利可離子化係於eTheRNA Immunotherapies合成或由外部方合成。eGFP mRNA係於eTheRNA Immunotherapies，Niel，比利時製造。 待冷凍乾燥組成物之製備
囊封EGFP mRNA的脂質奈米粒子（LNP）係使用混合裝置製造，在該混合裝置中含有在醋酸鈉緩衝劑（100mM，pH4）中的EGFP mRNA的溶液係以預界定的流率比例與含有可離子化脂質（50% mol%）、輔助脂質（10% mol%）、膽固醇（38.5% mol%）、及DMG-PEG2000的脂質溶液混合。混合後的整體係在注射用水（WFI）中稀釋並透過切向流過濾（TFF）以三個次步驟加工：濃縮、滲濾、及最終濃縮。自TFF程序獲得的整體係以冷凍保護劑稀釋以獲得在15%蔗糖中1 mM的最終Tris緩衝劑濃度。溶液接著係使用0.22 µm聚醚碸（PES）過濾器無菌過濾。T。 冷凍乾燥程序
使含有800 µL的囊封在1 mM Tris及15%蔗糖中的eGFP mRNA的以上提及的脂質組成物的小瓶經歷使用如下所述的冷凍乾燥循環： 1.     於20°C下的溫度校正 2.     以（0.7°C/min）之速率冷凍至-50°C達100分鐘，以達成低於Tg’的溫度 3.     維持-50°C的溫度達60分鐘 4.     第一乾燥次步驟1：將溫度維持於-50°C達15分鐘並開啟真空，壓力設定值：0.0720毫巴 5.     第一乾燥次步驟2：將溫度維持於-50°C達3小時。真空設定值：0.0720毫巴 6.     第一乾燥次步驟3：以0.08°C/min的速率於2小時內使溫度提高至-40°，同時維持真空設定值恆定：0.0720毫巴 7.     第一乾燥次步驟4：將溫度維持於-40°C達70小時，並維持相同的真空設定值-0.0720毫巴 8.     第一乾燥次步驟5：以0.08°C/min的速率於10小時內使溫度提高至10°C。將真空設定值維持於0.0720毫巴 9.     第二乾燥次步驟1：將溫度維持於10°C達15分鐘，同時將真空設定值 降低至0.0100毫巴 10.   第二乾燥次步驟2：使用0.0100毫巴的真空設定值將溫度維持於10°C達5小時50分鐘。 結果 實施例 1- 待冷凍乾燥組成物挑選 - 第 1 期
實施待冷凍乾燥組成物篩選以挑選於復水後產生最佳餅外觀及品質屬性的最優冷凍保護劑調配物。TBS及WFI係組合海藻糖及／或蔗糖測試。值得注意的是，在WFI中冷凍乾燥的樣本係以TBS復水，而在TBS中冷凍乾燥的樣本係在WFI中復水。 表 1中的數據表明作為冷凍保護劑，蔗糖表現比海藻糖佳，而使用20%或25%的冷凍保護劑未觀察到餅外觀及粒子品質屬性之改善。因此，如於實施例2展示地，使用15%蔗糖進行進一步調配物優化。 表 1. 用於待冷凍乾燥組成物挑選的挑選標準之概要表。
待冷凍乾燥組成物 餅外觀 復水後 目視外觀 粒度 （ Z- 平均直徑， nm ） PDI 回收率 mRNA （ % ） mRNA 囊封效率（ % ）
15%蔗糖TBS，pH 7.4 A X 165.6 0.159 87% 94%
20%蔗糖TBS，pH 7.4 A X 137.0 0.146 68% 90%
15%海藻糖TBS，pH 7.4 A Y 355.5 0.503 60% 64%
20%海藻糖TBS，pH 7.4    Y 371.3 0.434 65% 66%
                    
15%蔗糖WFI A Z 97.98 0.242 48% 83%
20%蔗糖WFI B Z 114.1 0.230 72% 83%
25%蔗糖WFI B Z 107.6 0.201 68% 85%
15%海藻糖WFI A Z 135.4 0.236 75% 83%
20%海藻糖WFI B Z 146.9 0.241 69% 83%
A：均質凝聚餅，無崩塌或熔化。 B：差的餅，存在熔化。 X：半透明均質溶液，無可視粒子。 Y：半透明多泡沫溶液，無可視粒子。 Z：半透明多泡沫溶液，存在可視粒子。 實施例 2- 待冷凍乾燥組成物挑選 - 第 2 期
進一步優化包含15%蔗糖的待冷凍乾燥組成物以改善mRNA囊封效率及回收率、減小PDI值、及於復水後獲得較佳的粒度控制。
數種含有或不含增加的TRIS濃度的調配物係於15%蔗糖之存在下測試且如以上於冷凍乾燥程序下詳述地經歷冷凍乾燥，並以TBS復水。於四種所測試的條件中，1 mM Tris加上15%蔗糖產生最佳的粒子品質屬性：粒度被維持且mRNA囊封效率維持高。 表 2. 用於調配物挑選的挑選標準之概要表。
待冷凍乾燥組成物 餅外觀 復水後目視外觀 粒度（ Z- 平均直徑， nm ） PDI 回收率 mRNA （ % ） 囊封效率（ % ）
15%蔗糖WFI A X 85.87 0.102 93% 90%
15%蔗糖1 mM TRIS A X 90.28 0.119 86% 91%
15%蔗糖5 mM TRIS A X 111.0 0.123 80% 86%
15%蔗糖20 mM TRIS A X 111.2 0.162 86% 84%
A：均質凝聚餅，無崩塌或熔化。 X：半透明均質溶液，無可視粒子。 實施例 3- 待冷凍乾燥組成物挑選 - 第 3 期
為評估低於5 mM（諸如3 mM）的Tris之濃度是否亦適合作為待冷凍乾燥組成物，進行進一步優化實驗。在於冷凍乾燥前包含3 mM Tris的組成物中測試不同量的蔗糖（5%、8%、10%、15%、及20% w/v）（ 表 3）。結果係相對於-80°C液體對照組針對在WFI中復水的經冷凍乾燥餅（FD餅）呈現 表 3. 用於待冷凍乾燥組成物挑選的挑選標準之概要表。
待冷凍乾燥組成物 餅外觀 粒度 （ Z- 平均直徑， nm ） PDI mRNA 囊封效率（ % ）  
3 mM Tris、5%蔗糖， AB 123.2 0.198 88.4%  
3 mM Tris、8%蔗糖 AB 111.5 0.18 90.5%  
3 mM Tris、10%蔗糖 A 110.3 0.173 90.4%  
3 mM Tris、15%蔗糖 A 107 0.157 91.1%  
3 mM Tris、20%蔗糖 C 113.9 0.157 88.4%
A：均質凝聚餅，無崩塌或熔化。 B：在底部有一些收縮。 C：差的餅，存在熔化。
種種LNP之大小維持於在107-123 nm之間的範圍內。PDI維持極低，意味低於0.2的值。隨著蔗糖之量增加同時將pH維持一致於7.4，mRNA含量減少（圖1A）且滲透壓提高（圖1B））（數據未顯示）。
相較於-80°C液體對照組，在具有8-15% w/v蔗糖的調配物之間囊封效率較低但顯示一致性（圖1C）。此外，此等調配物顯示與具有1 mM Tris、15%蔗糖的調配物類似的囊封效率（ 表 2）。如可自 表 2及 3清楚得到的，包含1 mM Tris或3 mM Tris以及種種量的蔗糖的調配物表現一樣好且亦比包含20 mM Tris或5 mM Tris及15%蔗糖的調配物優秀。 實施例 4 - 1 mM Tris 組成物之穩定性研究
為研究經冷凍乾燥組成物之穩定性，製備所選待冷凍乾燥組成物（1 mM Tris、15%蔗糖）、冷凍乾燥、並置於兩種不同的儲存條件下：(1) 2-8°C及(2) 25°C達3個月。於此研究中使用含有藥品的對照組液體樣本（非經冷凍乾燥）物質。於各時間點，於以TBS（20 mM Tris、0.9% NaCl）復水後測試粒子之不同品質屬性。如於 表 4及 表 5中強調的，對於在2-8°C下儲存的餅而言，所有所測試的品質屬性皆隨時間過去維持穩定。於此等中者係粒度、囊封效率、及mRNA含量的關鍵品質屬性。對於在25°C下儲存（加速儲存條件）的餅，品質屬性隨時間過去維持穩定，除了mRNA含量稍微降低。亦值得提及者係，相較於T0，經復水餅遺留物之mRNA完整性及試管內功能性隨時間過去被保持。此表明mRNA維持完整且未於冷凍乾燥程序期間以及於呈經冷凍乾燥形式後於2-8°C下儲存後去穩定化。此外，可推斷脂質奈米粒子未去穩定化。
結論如下：由1 mM Tris、15%蔗糖，pH 7.4構成的待冷凍乾燥組成物在於2-8°C下儲存後產生穩定餅。 表 4 ：於 2-8°C 及 25°C 下作為儲存條件的三個月穩定性數據之概要 A：均質凝聚餅，無崩塌或熔化。 表 5 ：於 2-8°C 及 25°C 下作為儲存條件的三個月穩定性數據之概要
含水量（ % ） 轉染 HEK 細胞 完整性測試
eGFP+ 細胞0.5µg（%） eGFP+ 細胞2µg（%） MFI 0.5µg MFI 2µg 降解
於-80°C下的液體對照組(n=1) T0 NA 59.65 52.92 1187040 2380400 無
T1m NA NA NA NA NA NA
T2m NA NA NA NA NA NA
T3m NA 40.28 52.96 292708 532226 無
於2-8°C下的FD餅(n=2) T0 2.26 64.68 63.48 1444848 2773940 無
T1m NA NA NA NA NA NA
T2m 1.86 NA NA NA NA NA
T3m 1.47 44.11 64.40 366864 824039 無
於25°C下的FD餅(n=2) T0 2.26 64.68 63.48 1444848 2773940 無
T1m NA NA NA NA NA NA
實施例 5- 活體內穩定性測試
為研究於2-8°C、25 °C、或30 °C下儲存達0個月（T0m）、3個月（T3m）、或5個月（T5m）的冷凍乾燥後3 mM Tris、15% w/v蔗糖組成物之儲存條件是否影響mRNA之活性，進行致免疫研究，其中BALB/C小鼠係以含有Sars-Cov2 Omicron棘mRNA或Fluc mRN的LNP注射。小鼠於實驗第1日及第21日在後肢之二頭肌接受總共2次使用50 µL的囊封在TBS或緩衝劑（陰性對照組）中的Sars-Cov2 Omicron棘mRNA（5 µg）的LNP的肌內注射。為監視在此等小鼠中免疫反應之發展，於D20及D35進行頜下血液收集。藉由ELISA測定血清中的抗Omicron IgG之濃度。
整體言之，經冷凍乾燥樣本與於-80°C下的液體對照組或經冷凍乾燥物質之液體形式展示類似的IgG效價（ 圖 2）。於D20，偵測到一些變異，其中於T0的經冷凍乾燥樣本2-8°C之表現較低且於T3m的經冷凍乾燥30°C樣本之抗體效價較低。隨時間過去，觀察到抗體效價稍微減低，其中於T0的總IgG為10 6-10 7，於T3m的總IgG為10 5-6-10 7，且於T5m總的IgG為10 5-10 6。
接著，透過生物發光（BLI）偵測表現水平。小鼠在後肢之二頭肌接受一次使用Fluc mRNA LNP或TBS緩衝劑（陰性對照組）的肌內注射（50 µl；2 µg）。於注射後不同時間點（4h、24h、48h），於以螢光素腹膜內注射後將小鼠放置在生物發光掃描機中並測量螢光素酶表現。對於肌肉，於24h後見到最高表現，尤其對於在T0（ 圖 3A）及T5m（ 圖 3B）兩者的液體-80°C樣本以及對於在溫度2-8°C下儲存的經冷凍乾燥樣本。結論為：經冷凍乾燥樣本，尤其2-8°C者及液體-80°C對照組樣本顯示類似的表現，即使於儲存5個月後亦如此。 參考文獻
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Zhao P., Hou X., Yan J. 用於mRNA遞送的類脂質奈米粒子之長期儲存(Long-term storage of lipid-like nanoparticles for mRNA delivery). Bioact Mater. 2020;5(2):358–363.
無
現具體參照圖式，欲強調者係所顯示的具體態樣僅係舉例及為了說明性討論本發明之不同實施方式的目的。其等係為了提供被認為最有用且最容易敘述本發明之原理及概念方面者而呈現。於此方面，未嘗試以超過基本了解本發明所需者的細節來顯示本發明之結構細節。以下敘述加上圖式使得對於發明所屬技術領域中具有通常知識者而言本發明之數種形式可如何實際實施變得很明顯。
[ 圖 1] ：於冷凍乾燥前包含 3 mM Tris 及種種量的蔗糖的經冷凍乾燥組成物之物化特性。結果係相較於-80°C液體對照組針對在WFI中復水的經冷凍乾燥餅（FD餅）呈現。(A) RNA含量（µg/ml）。(B)滲透壓（mOsm/kg）。(C)囊封效率（%）。
[ 圖 2] ：於 Sars-Cov2 Omicron 棘後的抗體反應。於復水前將經冷凍乾燥組成物於不同溫度（即2-8°C、25°C、或30°C）下儲存達0個月（T0）、3個月（T3）、或5個月（T5）。將液體對照組儲存於-80°C下或於2-8°C下。為監視在此等小鼠中的免疫反應之發展，於D20及D35時進行頜下血液收集。血清中抗Omicron IgG之濃度係藉由ELISA測定。
[ 圖 3] ：於 LNP 注射後 4h 、 24h 、及 48h 時的螢光素酶表現。注射係以TBS或液體-80°C樣本（對照組）或於復水前於不同溫度（即2-8°C、25°C、或30°C）下儲存達0個月（T0）（A組）或5個月（T5）（B組）的經冷凍乾燥組成物進行。
無

Claims (15)

  1. 一種組成物，其包含：一或多種RNA分子、一或多種脂質奈米粒子、蔗糖、及參(羥甲基)甲胺（TRIS）； 其中所述組成物經冷凍乾燥；且其中於冷凍乾燥前該組成物中的TRIS之濃度係3 mM或更少及蔗糖之濃度係少於20%（w/v）。
  2. 如請求項1之組成物，其中於冷凍乾燥前該組成物中的蔗糖之濃度係至少約5%（w/v），尤其至少約8%（w/v），更尤其至少約10%（w/v）。
  3. 如請求項1之組成物，其中於冷凍乾燥前蔗糖之濃度係約及在5%至約20%（w/v）之間，尤其約及在5%至約15%（w/v）之間，更尤其約及在8%至約15%（w/v）之間，甚至更尤其約及在10%至約15 %（w/v）之間。
  4. 如請求項1或3中任一項之組成物，其中於冷凍乾燥前該組成物中的TRIS之濃度係約及在0.01 mM至約3 mM之間，較佳約及在0.1 mM至約3 mM之間，更佳約及在0.5 mM及3 mM之間，最佳約及在1 mM至約3 mM之間。
  5. 如請求項1或4中任一項之組成物，其中所述脂質奈米粒子包含PEG脂質，尤其PEG2000脂質，更尤其DMG-PEG2000。
  6. 如請求項1至5中任一項之組成物，其中所述脂質奈米粒子包含約及在40 mol%及60 mol%之間的可離子化脂質、約及在5 mol%及15 mol%之間的磷脂、約及在20 mol%及40 mol%之間的固醇、及至少0.5 mol%的PEG脂質。
  7. 如請求項1至6中任一項之組成物，其中於冷凍乾燥前該組成物進一步包含水，尤其注射用水（WFI）。
  8. 如請求項1至7中任一項之組成物，其中所述一或多種RNA分子係線性或環狀RNA分子。
  9. 如請求項1至8中任一項之組成物，其中所述一或多種RNA分子係mRNA分子。
  10. 如請求項1至9中任一項之組成物，其供於人類及／或獸醫學中使用。
  11. 如請求項1至10中任一項之組成物，其於向需要其的個體投予前經復水。
  12. 如請求項11之組成物，其中所述復水係使用水或鹽之水溶液，較佳TBS，更佳具有20 mM TRIS的TBS，最佳具有20 mM TRIS及0.9% NaCl的TBS進行。
  13. 如請求項11或12之組成物，其pH約6至約8。
  14. 一種冷凍乾燥包含RNA分子及脂質奈米粒子的組成物之方法，所述方法包含： a.     在水，尤其注射用水中混合RNA分子、一或多種脂質奈米粒子、冷凍保護劑、及濃度3 mM或更低的TRIS， b.     冷凍乾燥所述組成物，其包含冷凍步驟、第一乾燥步驟、及第二乾燥步驟； 其中所述第一乾燥步驟係於低於經最大地冷凍濃縮的溶液之玻璃轉移溫度（Tg’）的溫度下進行。
  15. 如請求項14之方法，其中所述第一乾燥步驟係於約及在-30°C至約-50°C之間，較佳約及在-35°C及約-45°C之間，尤其於約-40°C下的溫度下進行。
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