TW202334216A - 抗cd47抗體及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本文中提供靶向人類CD47之抗體，經遮蔽抗體(例如可活化抗體)及其抗原結合片段、編碼該等抗體之核酸分子、其醫藥組合物及其治療諸如癌症之CD47陽性疾病。本文所用之經遮蔽抗體可包含IgG1 Fc區。
Description
本發明為靶向人類CD47之抗體、經遮蔽抗體(例如可活化抗體)及其抗原結合片段、編碼該等抗體之核酸、其醫藥組合物及其用途。
在多種類型之癌細胞之表面過量表現之CD47與骨髓細胞上之信號調節蛋白α (SIRPα)之結合引發抑制性信號通路引起「別吃我」信號，從而從宿主免疫系統逃脫惡性細胞。靶向CD47/SIRPα信號軸療法已在臨床前模型中成功，目前實體及血液惡性腫瘤之臨床試驗正在進行中。抗CD47療法在早期臨床試驗中顯示出有希望之活性；然而，也存在挑戰。例如，多種不同之人類細胞類型，包括紅血球(RBC)，表現CD47，產生大量之抗CD47抗體抗原沉沒。阻斷紅血球之CD47，諸如Magrolimab (Hu5F9)會導致短暫性貧血，需要在臨床上遞增劑量。值得注意許多抗CD47療法，諸如Hu5F9，TJC4，AK117，CC-90002及IBI188都是IgG4亞型之抗體。IgG1抗體可靶向ADCC及ADCP活性免疫細胞，使其靶向表現IgG1抗體靶向之抗原。由於CD47在正常組織中也廣泛表達，因此通常認為IgG1亞型不應用於治療性抗CD47抗體中，以防止或限制靶向/非腫瘤毒性。
因此，仍然需要可阻斷CD47與SIRPα結合而不表現與紅血球及其他非癌細胞結合之不良影響之新型抗CD47抗體。
為了提供具有強大抗腫瘤活性及減少脫靶效應之抗CD47抗體，發明人開發了一套經遮蔽抗CD47抗體(包括可活化抗CD47抗體)，各抗體包含一個N端遮蔽性肽及IgG1 Fc區。抗體之抗腫瘤活性為雙重：1)阻斷CD47-SIRPα相互作用，允許巨噬細胞識別及吞噬腫瘤細胞，2)藉由IgG1 Fc介導之效應功能(諸如ADCC及ADCP)殺死腫瘤。該遮蔽性肽設計用於與抗CD47抗體部分競爭靶結合，從而抑制健康組織中靶向/非腫瘤活性，並允許腫瘤微環境(TME)中之抗腫瘤活性。
經遮蔽抗體被設計成用遮蔽性肽中之遮蔽性部分遮蔽其抗原結合位點，從而防止抗體與健康組織中之靶結合。經遮蔽抗體可為可活化的，也稱為SAFEBODY
TM，其中遮蔽性部分被設計為在具有特定活化條件之TME中活化抗體，允許抗原結合位點與其靶結合。例如，可活化抗體之遮蔽性肽可包含可裂解部分，該部分在被蛋白酶裂解時，致使抗體中之遮蔽性部分去除並活化抗體以結合CD47。在正常組織及迴圈中，可活化抗CD47抗體中之遮蔽性部分具有阻斷與CD47結合之功能，從而減少與抗CD47抗體相關之脫靶效應，例如貧血。然而，在已經報導蛋白酶活性升高之TME中，遮蔽性部分被裂解，從而使經活化之抗CD47抗體能夠結合腫瘤細胞上之CD47。因此，本文所用之可活化抗CD47抗體藉由阻斷CD47-SIRPα相互作用及ADCC/ADCP效應功能展示增強之抗腫瘤活性，與現有之抗CD47抗體相比，對正常細胞毒性降低。
因此，於一些態樣，本文提供之抗體(例如，經分離之抗體)、抗原結合片段及與CD47結合之經遮蔽抗體(例如，可活化抗體) (例如，人類CD47)。於一些實施例中，抗體(例如，經分離之抗體)、抗原結合片段及經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)具有至少一種(例如，至少一種、至少兩種、至少三種、至少四種、至少五種或全部六種)以下功能特性：(a)以500 nm或更低之K
D與人類CD47結合；(b)與猴、大鼠或狗CD47交叉反應；(c)能夠抑制腫瘤細胞生長；(d)對癌症有治療作用；(e)阻斷CD47及SIRP蛋白之間之結合(例如，SIRPα)；且(f)引起表現CD47之腫瘤細胞之抗體依賴性細胞毒性(ADCC)及/或抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)。
因此，於一些態樣，本文提供之經遮蔽抗體包含：(a)遮蔽性肽，自N端至C端包含遮蔽性部分(MM)及連接部分(LM)，及(b)包含抗體重鏈可變區(VH)及抗體輕鏈可變區(VL)之靶結合部分(TBM)，其中TBM與人類CD47結合；其中遮蔽性肽與VH或VL之N端相連；其中MM與人類CD47競爭結合TBM。於一些實施例中，1)所述VH包含第一互補決定區(CDR-H1)、第二互補決定區(CDR-H2)及第三互補決定區(CDR-H3)，其中CDR-H1包含SEQ ID NO: 182或183之胺基酸序列；其中CDR-H2包含SEQ ID NO: 184或185之胺基酸序列；及其中CDR-H3包含選自由SEQ ID NOs: 186-189組成之群之胺基酸序列；及/或2) VL包含包含第一互補決定區(CDR-L1)，第二互補決定區(CDR-L2)及第三互補決定區(CDR-L3)，其中CDR-L1包含選自由SEQ ID NOs: 190-193組成之群之胺基酸序列；其中CDR-L2包含SEQ ID NO: 194之胺基酸序列；及其中CDR-L3包含SEQ ID NO: 195或196之胺基酸序列。於某些實施例中，VH包含包含SEQ ID NO: 182之胺基酸序列之CDR-H1，包含SEQ ID NO: 185之胺基酸序列之CDR-H2，及包含SEQ ID NO: 188之胺基酸序列之CDR-H3；b) VL包含包含SEQ ID NO: 191之胺基酸序列之CDR-L1，包含SEQ ID NO: 194之胺基酸序列之CDR-L2，及包含SEQ ID NO: 195之胺基酸序列之CDR-L3。於一些實施例中，經遮蔽抗體包含自N端至C端包含遮蔽性肽及VL之第一多肽，及包含VH之第二多肽。於其他實施例中，經遮蔽抗體包含自N端至C端包含遮蔽性肽及VH之第一多肽，及包含VL之第二多肽。於另外之實施例中，經遮蔽抗體包含自N端至C端包含遮蔽性肽，VL及VH之第一多肽。於另外之實施例中，經遮蔽抗體包含自N端至C端包含遮蔽性肽，VH及VL之第一多肽。於一些實施例中，遮蔽性部分(MM)包含選自由SEQ ID NOs: 197-200組成之群之胺基酸序列。於一個實施例中，MM包含SEQ ID NO: 199之胺基酸序列。於某些實施例中，MM包含選自由SEQ ID NOs: 137及167-181組成之群之胺基酸序列。其中，MM包含SEQ ID NO: 137之胺基酸序列。於一些實施例中，藉由Jurkat NFAT報告子分析測定，遮蔽性肽或其部分(例如MM)之遮蔽效率為至少50。於一些實施例中，藉由Jurkat NFAT報告子分析測定，遮蔽性肽或其部分(例如MM)之遮蔽效率為至少100。於一些實施例中，經遮蔽抗體包含自N端至C端包含遮蔽性肽及VL之第一多肽，及包含VH之第二多肽。於某些實施例中，經遮蔽抗體包含人類IgG4可結晶(Fc)區。於某些實施例中，經遮蔽抗體包含人類IgG1 Fc區。於一些實施例中，人類IgG1 Fc區包含兩個Fc結構域，其中兩個Fc結構域中的每一個包含S239D取代及/或I332E取代(例如，S239D取代及I332E取代)。於一些實施例中，經遮蔽抗體與選自由人類CD47之K39、W40、K41、F50、D51、G52、T99、E100、L101及T102組成之群之一個或多個胺基酸殘基結合。於一些實施例中，經遮蔽抗體不與選自由人類CD47之L2、L3、F4、K6、N27、E29、A30、Q31、T34、E35、V36、Y37、D46、T49、A53、E97、R103、E104、G105及E106組成之群之一個或多個胺基酸殘基結合。於某些實施例中，經遮蔽抗體與人類CD47之K39、W40、K41、F50、D51、G52、T99、E100、L101及T102胺基酸殘基結合，及/或不與人類CD47之L2、L3、F4、K6、N27、E29、A30、Q31、T34、E35、V36、Y37、D46、T49、A53、E97、R103、E104、G105及E106胺基酸殘基結合。
於一些實施例中，本文提供之經遮蔽抗體包含：(a)遮蔽性肽，其自N端至C端包含遮蔽性部分(MM)及連接部分(LM)；及(b)靶結合部分(TBM)，其包含抗體重鏈可變區(VH)及抗體輕鏈可變區(VL)，其中TBM與人類CD47結合；及(c) IgG1 Fc區(例如，人類IgG1 Fc區)或具有增強之抗體依賴性細胞毒性(ADCC)活性之IgG Fc區(例如，人類IgG Fc區)，其中遮蔽性肽與VH或VL之N端相連，及其中所述MM與人類CD47競爭結合TBM。於一些實施例中，經遮蔽抗體包含人類IgG1 Fc區。於一些實施例中，經遮蔽抗體包含具有增強ADCC活性之IgG Fc區。於一些實施例中，人類IgG1 Fc區包含兩個Fc結構域，其中兩個Fc結構域中的每一個包含S239D取代及/或I332E取代(例如，S239D取代及I332E取代)。
於一些實施例中，本文提供之經遮蔽抗體包含：(a)遮蔽性肽，其自N端至C端包含遮蔽性部分(MM)及連接部分(LM)；及(b)靶結合部分(TBM)，其包含抗體重鏈可變區(VH)及抗體輕鏈可變區(VL)，其中TBM與人類CD47結合，其中遮蔽性肽與VH或VL之N端相連，及其中所述MM與人類CD47競爭結合TBM；其中(a) VH包含包含選自由SEQ ID NOs: 35-37及39-50組成之群之胺基酸序列之CDR-H1，包含選自由SEQ ID NOs: 52-54及56-67組成之群之胺基酸序列之CDR-H2，以及包含選自由SEQ ID NOs: 69-71及73-84組成之群之胺基酸序列之CDR-H3；及(b) VL包含包含選自由SEQ ID NOs: 86-88及89-101組成之群之胺基酸序列之CDR-L1，包含選自由SEQ ID NOs: 103-105及106-118組成之群之胺基酸序列之CDR-L2，及包含選自由SEQ ID NOs: 120-122及124-135組成之群之胺基酸序列之CDR-L3。
於某些實施例中，本文提供之經遮蔽抗體包含：(a)遮蔽性肽，其自N端至C端包含遮蔽性部分(MM)及連接部分(LM)；及(b)靶結合部分(TBM)，其包含抗體重鏈可變區(VH)及抗體輕鏈可變區(VL)，其中TBM與人類CD47結合；其中遮蔽性肽與VH或VL之N端相連，及其中所述MM與人類CD47競爭結合TBM；其中VH包含選自由SEQ ID NOs: 1、3、5、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29及31組成之群之胺基酸序列；及/或其中VL包含選自由SEQ ID NOs: 2、4、6、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30及32組成之群之胺基酸序列。
於一些實施例中，本文提供之經遮蔽抗體包含：(a)遮蔽性肽，其自N端至C端包含遮蔽性部分(MM)及連接部分(LM)；及(b)靶結合部分(TBM)，其包含抗體重鏈可變區(VH)及抗體輕鏈可變區(VL)，其中TBM與人類CD47結合；其中遮蔽性肽與VH或VL之N端相連，及其中所述MM與人類CD47競爭結合TBM；其中1) VH包含包含SEQ ID NO: 48之胺基酸序列之CDR-H1，包含SEQ ID NO: 65之胺基酸序列之CDR-H2及包含SEQ ID NO: 82之胺基酸序列之CDR-H3；及2) VL包含包含SEQ ID NO: 99之胺基酸序列之CDR-L1，包含SEQ ID NO: 116之胺基酸序列之CDR-L2及包含SEQ ID NO: 133之胺基酸序列之CDR-L3。於某些實施例中，本文提供之經遮蔽抗體包含：(a)遮蔽性肽，其自N端至C端包含遮蔽性部分(MM)及連接部分(LM)；及(b)靶結合部分(TBM)，其包含抗體重鏈可變區(VH)及抗體輕鏈可變區(VL)，及其中TBM與人類CD47結合，其中遮蔽性肽與VH或VL之N端相連，及其中所述MM與人類CD47競爭結合TBM；其中VH包含SEQ ID NO: 27之胺基酸序列，及/或VL包含SEQ ID NO: 28之胺基酸序列。於某些實施例中，MM包含SEQ ID NO: 137之胺基酸序列。
於一些實施例中，本文提供之經遮蔽抗體包含：(a)遮蔽性肽，其自N端至C端包含遮蔽性部分(MM)及連接部分(LM)；及(b)靶結合部分(TBM)，其包含抗體重鏈可變區(VH)及抗體輕鏈可變區(VL)，其中TBM與人類CD47結合，其中遮蔽性肽與VH或VL之N端相連，及其中所述MM與人類CD47競爭結合TBM；其中1) VH包含包含SEQ ID NO: 49之胺基酸序列之CDR-H1，包含SEQ ID NO: 66之胺基酸序列之CDR-H2及包含SEQ ID NO: 83之胺基酸序列之CDR-H3；及2) VL包含包含SEQ ID NO: 100之胺基酸序列之CDR-L1，包含SEQ ID NO: 117之胺基酸序列之CDR-L2及包含SEQ ID NO: 134之胺基酸序列之CDR-L3。於某些實施例中，本文提供之經遮蔽抗體包含：(a)遮蔽性肽，其自N端至C端包含遮蔽性部分(MM)及連接部分(LM)；(b)靶結合部分(TBM)，其包含抗體重鏈可變區(VH)及抗體輕鏈可變區(VL)，其中TBM與人類CD47結合，其中遮蔽性肽與VH或VL之N端相連，及其中所述MM與人類CD47競爭結合TBM；其中VH包含SEQ ID NO: 29之胺基酸序列，及/或VL包含SEQ ID NO: 30之胺基酸序列。於某些實施例中，MM包含SEQ ID NO: 137之胺基酸序列。
於一些實施例中，本文提供之經遮蔽抗體包含：(a)遮蔽性肽，其自N端至C端包含遮蔽性部分(MM)及連接部分(LM)；及(b)靶結合部分(TBM)，其包含抗體重鏈可變區(VH)及抗體輕鏈可變區(VL)，其中TBM與人類CD47結合，其中遮蔽性肽與VH或VL之N端相連，及其中所述MM與人類CD47競爭結合TBM；其中1) VH包含包含SEQ ID NO: 50之胺基酸序列之CDR-H1，包含SEQ ID NO: 67之胺基酸序列之CDR-H2及包含SEQ ID NO: 84之胺基酸序列之CDR-H3；及2) VL包含包含SEQ ID NO: 101之胺基酸序列之CDR-L1，包含SEQ ID NO: 118之胺基酸序列之CDR-L2及包含SEQ ID NO: 135之胺基酸序列之CDR-L3。於某些實施例中，本文提供之經遮蔽抗體包含：(a)遮蔽性肽，其自N端至C端包含遮蔽性部分(MM)及連接部分(LM)；及(b)靶結合部分(TBM)，其包含抗體重鏈可變區(VH)及抗體輕鏈可變區(VL)，其中TBM與人類CD47結合，其中遮蔽性肽與VH或VL之N端相連，及其中所述MM與人類CD47競爭結合TBM；其中VH包含SEQ ID NO: 31之胺基酸序列，及/或VL包含SEQ ID NO: 32之胺基酸序列。於某些實施例中，MM包含SEQ ID NO: 137之胺基酸序列。
於一些實施例中，本文提供之經遮蔽抗體包含：(a)遮蔽性肽，其自N端至C端包含遮蔽性部分(MM)及連接部分(LM)；及(b)靶結合部分(TBM)，其包含抗體重鏈可變區(VH)及抗體輕鏈可變區(VL)，其中TBM與人類CD47結合，其中遮蔽性肽與VH或VL之N端相連，及其中所述MM與人類CD47競爭結合TBM；其中1) VH包含包含SEQ ID NO: 35之胺基酸序列之CDR-H1，包含SEQ ID NO: 52之胺基酸序列之CDR-H2及包含SEQ ID NO: 69之胺基酸序列之CDR-H3；及2) VL包含包含SEQ ID NO: 86之胺基酸序列之CDR-L1，包含SEQ ID NO: 103之胺基酸序列之CDR-L2及包含SEQ ID NO: 120之胺基酸序列之CDR-L3。於某些實施例中，本文提供之經遮蔽抗體包含：(a)遮蔽性肽，其自N端至C端包含遮蔽性部分(MM)及連接部分(LM)；及(b)靶結合部分(TBM)，其包含抗體重鏈可變區(VH)及抗體輕鏈可變區(VL)，其中TBM與人類CD47結合，其中遮蔽性肽與VH或VL之N端相連，及其中所述MM與人類CD47競爭結合TBM；其中VH包含SEQ ID NO: 1之胺基酸序列，及/或VL包含SEQ ID NO: 2之胺基酸序列。於某些實施例中，MM包含SEQ ID NO: 137之胺基酸序列。
於一些實施例中，本文提供之經遮蔽抗體包含：(a)遮蔽性肽，其自N端至C端包含遮蔽性部分(MM)及連接部分(LM)；及(b)靶結合部分(TBM)，其包含抗體重鏈可變區(VH)及抗體輕鏈可變區(VL)，其中TBM與人類CD47結合，其中遮蔽性肽與VH或VL之N端相連，及其中所述MM與人類CD47競爭結合TBM；其中1) VH包含包含SEQ ID NO: 36之胺基酸序列之CDR-H1，包含SEQ ID NO: 53之胺基酸序列之CDR-H2及包含SEQ ID NO: 70之胺基酸序列之CDR-H3；及2) VL包含包含SEQ ID NO: 87之胺基酸序列之CDR-L1，包含SEQ ID NO: 104之胺基酸序列之CDR-L2及包含SEQ ID NO: 121之胺基酸序列之CDR-L3。於某些實施例中，本文提供之經遮蔽抗體包含：(a)遮蔽性肽，其自N端至C端包含遮蔽性部分(MM)及連接部分(LM)；及(b)靶結合部分(TBM)，其包含抗體重鏈可變區(VH)及抗體輕鏈可變區(VL)，其中TBM與人類CD47結合，其中遮蔽性肽與VH或VL之N端相連，及其中所述MM與人類CD47競爭結合TBM；其中VH包含SEQ ID NO: 3之胺基酸序列，及/或VL包含SEQ ID NO: 4之胺基酸序列。於某些實施例中，MM包含SEQ ID NO: 137之胺基酸序列。
於一些實施例中，本文提供之經遮蔽抗體包含：(a)遮蔽性肽，其自N端至C端包含遮蔽性部分(MM)及連接部分(LM)；及(b)靶結合部分(TBM)，其包含抗體重鏈可變區(VH)及抗體輕鏈可變區(VL)，其中TBM與人類CD47結合，其中遮蔽性肽與VH或VL之N端相連，及其中所述MM與人類CD47競爭結合TBM；其中1) VH包含包含SEQ ID NO: 37之胺基酸序列之CDR-H1，包含SEQ ID NO: 54之胺基酸序列之CDR-H2及包含SEQ ID NO: 71之胺基酸序列之CDR-H3；及2) VL包含包含SEQ ID NO: 88之胺基酸序列之CDR-L1，包含SEQ ID NO: 105之胺基酸序列之CDR-L2及包含SEQ ID NO: 122之胺基酸序列之CDR-L3。於某些實施例中，本文提供之經遮蔽抗體包含：(a)遮蔽性肽，其自N端至C端包含遮蔽性部分(MM)及連接部分(LM)；及(b)靶結合部分(TBM)，其包含抗體重鏈可變區(VH)及抗體輕鏈可變區(VL)，其中TBM與人類CD47結合，其中遮蔽性肽與VH或VL之N端相連，及其中所述MM與人類CD47競爭結合TBM；其中VH包含SEQ ID NO: 5之胺基酸序列，及/或VL包含SEQ ID NO: 6之胺基酸序列。於某些實施例中，MM包含SEQ ID NO: 137之胺基酸序列。
於一些實施例中，本文提供之經遮蔽抗體包含：(a)遮蔽性肽，其自N端至C端包含遮蔽性部分(MM)及連接部分(LM)；及(b)靶結合部分(TBM)，其包含抗體重鏈可變區(VH)及抗體輕鏈可變區(VL)，其中TBM與人類CD47結合，其中遮蔽性肽與VH或VL之N端相連，及其中所述MM與人類CD47競爭結合TBM；其中1) VH包含包含SEQ ID NO: 39之胺基酸序列之CDR-H1，包含SEQ ID NO: 56之胺基酸序列之CDR-H2及包含SEQ ID NO: 73之胺基酸序列之CDR-H3；及2) VL包含包含SEQ ID NO: 90之胺基酸序列之CDR-L1，包含SEQ ID NO: 107之胺基酸序列之CDR-L2及包含SEQ ID NO: 124之胺基酸序列之CDR-L3。於某些實施例中，本文提供之經遮蔽抗體包含：(a)遮蔽性肽，其自N端至C端包含遮蔽性部分(MM)及連接部分(LM)；及(b)靶結合部分(TBM)，其包含抗體重鏈可變區(VH)及抗體輕鏈可變區(VL)，其中TBM與人類CD47結合，其中遮蔽性肽與VH或VL之N端相連，及其中所述MM與人類CD47競爭結合TBM；其中VH包含SEQ ID NO: 9之胺基酸序列，及/或VL包含SEQ ID NO: 10之胺基酸序列。於某些實施例中，MM包含SEQ ID NO: 137之胺基酸序列。
於一些實施例中，本文提供之經遮蔽抗體包含：(a)遮蔽性肽，其自N端至C端包含遮蔽性部分(MM)及連接部分(LM)；及(b)靶結合部分(TBM)，其包含抗體重鏈可變區(VH)及抗體輕鏈可變區(VL)，其中TBM與人類CD47結合，其中遮蔽性肽與VH或VL之N端相連，及其中所述MM與人類CD47競爭結合TBM；其中1) VH包含包含SEQ ID NO: 40之胺基酸序列之CDR-H1，包含SEQ ID NO: 57之胺基酸序列之CDR-H2及包含SEQ ID NO: 74之胺基酸序列之CDR-H3；及2) VL包含包含SEQ ID NO: 91之胺基酸序列之CDR-L1，包含SEQ ID NO: 108之胺基酸序列之CDR-L2及包含SEQ ID NO: 125之胺基酸序列之CDR-L3。於某些實施例中，本文提供之經遮蔽抗體包含：(a)遮蔽性肽，其自N端至C端包含遮蔽性部分(MM)及連接部分(LM)；及(b)靶結合部分(TBM)，其包含抗體重鏈可變區(VH)及抗體輕鏈可變區(VL)，其中TBM與人類CD47結合，其中遮蔽性肽與VH或VL之N端相連，及其中所述MM與人類CD47競爭結合TBM；其中VH包含SEQ ID NO: 11之胺基酸序列，及/或VL包含SEQ ID NO: 12之胺基酸序列。於某些實施例中，MM包含SEQ ID NO: 137之胺基酸序列。
於一些實施例中，本文提供之經遮蔽抗體包含：(a)遮蔽性肽，其自N端至C端包含遮蔽性部分(MM)及連接部分(LM)；及(b)靶結合部分(TBM)，其包含抗體重鏈可變區(VH)及抗體輕鏈可變區(VL)，其中TBM與人類CD47結合，其中遮蔽性肽與VH或VL之N端相連，及其中所述MM與人類CD47競爭結合TBM；其中1) VH包含包含SEQ ID NO: 41之胺基酸序列之CDR-H1，包含SEQ ID NO: 58之胺基酸序列之CDR-H2及包含SEQ ID NO: 75之胺基酸序列之CDR-H3；及2) VL包含包含SEQ ID NO: 92之胺基酸序列之CDR-L1，包含SEQ ID NO: 109之胺基酸序列之CDR-L2及包含SEQ ID NO: 126之胺基酸序列之CDR-L3。於某些實施例中，本文提供之經遮蔽抗體包含：(a)遮蔽性肽，其自N端至C端包含遮蔽性部分(MM)及連接部分(LM)；及(b)靶結合部分(TBM)，其包含抗體重鏈可變區(VH)及抗體輕鏈可變區(VL)，其中TBM與人類CD47結合，其中遮蔽性肽與VH或VL之N端相連，及其中所述MM與人類CD47競爭結合TBM；其中VH包含SEQ ID NO: 13之胺基酸序列，及/或VL包含SEQ ID NO: 14之胺基酸序列。於某些實施例中，MM包含SEQ ID NO: 137之胺基酸序列。
於一些實施例中，本文提供之經遮蔽抗體包含：(a)遮蔽性肽，其自N端至C端包含遮蔽性部分(MM)及連接部分(LM)；及(b)靶結合部分(TBM)，其包含抗體重鏈可變區(VH)及抗體輕鏈可變區(VL)，其中TBM與人類CD47結合，其中遮蔽性肽與VH或VL之N端相連，及其中所述MM與人類CD47競爭結合TBM；其中1) VH包含包含SEQ ID NO: 42之胺基酸序列之CDR-H1，包含SEQ ID NO: 59之胺基酸序列之CDR-H2及包含SEQ ID NO: 76之胺基酸序列之CDR-H3；及2) VL包含包含SEQ ID NO: 93之胺基酸序列之CDR-L1，包含SEQ ID NO: 110之胺基酸序列之CDR-L2及包含SEQ ID NO: 127之胺基酸序列之CDR-L3。於某些實施例中，本文提供之經遮蔽抗體包含：(a)遮蔽性肽，其自N端至C端包含遮蔽性部分(MM)及連接部分(LM)；及(b)靶結合部分(TBM)，其包含抗體重鏈可變區(VH)及抗體輕鏈可變區(VL)，其中TBM與人類CD47結合，其中遮蔽性肽與VH或VL之N端相連，及其中所述MM與人類CD47競爭結合TBM；其中VH包含SEQ ID NO: 15之胺基酸序列，及/或VL包含SEQ ID NO: 16之胺基酸序列。於某些實施例中，MM包含SEQ ID NO: 137之胺基酸序列。
於一些實施例中，本文提供之經遮蔽抗體包含：(a)遮蔽性肽，其自N端至C端包含遮蔽性部分(MM)及連接部分(LM)；及(b)靶結合部分(TBM)，其包含抗體重鏈可變區(VH)及抗體輕鏈可變區(VL)，其中TBM與人類CD47結合，其中遮蔽性肽與VH或VL之N端相連，及其中所述MM與人類CD47競爭結合TBM；其中1) VH包含包含SEQ ID NO: 43之胺基酸序列之CDR-H1，包含SEQ ID NO: 60之胺基酸序列之CDR-H2及包含SEQ ID NO: 77之胺基酸序列之CDR-H3；及2) VL包含包含SEQ ID NO: 94之胺基酸序列之CDR-L1，包含SEQ ID NO: 111之胺基酸序列之CDR-L2及包含SEQ ID NO: 128之胺基酸序列之CDR-L3。於某些實施例中，本文提供之經遮蔽抗體包含：(a)遮蔽性肽，其自N端至C端包含遮蔽性部分(MM)及連接部分(LM)；(b)靶結合部分(TBM)，其包含抗體重鏈可變區(VH)及抗體輕鏈可變區(VL)，其中TBM與人類CD47結合，其中遮蔽性肽與VH或VL之N端相連，及其中所述MM與人類CD47競爭結合TBM；其中VH包含SEQ ID NO: 17之胺基酸序列，及/或VL包含SEQ ID NO: 18之胺基酸序列。於某些實施例中，MM包含SEQ ID NO: 137之胺基酸序列。
於一些實施例中，本文提供之經遮蔽抗體包含：(a)遮蔽性肽，其自N端至C端包含遮蔽性部分(MM)及連接部分(LM)；及(b)靶結合部分(TBM)，其包含抗體重鏈可變區(VH)及抗體輕鏈可變區(VL)，其中TBM與人類CD47結合，其中遮蔽性肽與VH或VL之N端相連，及其中所述MM與人類CD47競爭結合TBM；其中1) VH包含包含SEQ ID NO: 44之胺基酸序列之CDR-H1，包含SEQ ID NO: 61之胺基酸序列之CDR-H2及包含SEQ ID NO: 78之胺基酸序列之CDR-H3；及2) VL包含包含SEQ ID NO: 95之胺基酸序列之CDR-L1，包含SEQ ID NO: 112之胺基酸序列之CDR-L2及包含SEQ ID NO: 129之胺基酸序列之CDR-L3。於某些實施例中，本文提供之經遮蔽抗體包含：(a)遮蔽性肽，其自N端至C端包含遮蔽性部分(MM)及連接部分(LM)；(b)靶結合部分(TBM)，其包含抗體重鏈可變區(VH)及抗體輕鏈可變區(VL)，其中TBM與人類CD47結合，其中遮蔽性肽與VH或VL之N端相連，及其中所述MM與人類CD47競爭結合TBM；其中VH包含SEQ ID NO: 19之胺基酸序列，及/或VL包含SEQ ID NO: 20之胺基酸序列。於某些實施例中，MM包含SEQ ID NO: 137之胺基酸序列。
於一些實施例中，本文提供之經遮蔽抗體包含：(a)遮蔽性肽，其自N端至C端包含遮蔽性部分(MM)及連接部分(LM)；及(b)靶結合部分(TBM)，其包含抗體重鏈可變區(VH)及抗體輕鏈可變區(VL)，其中TBM與人類CD47結合，其中遮蔽性肽與VH或VL之N端相連，及其中所述MM與人類CD47競爭結合TBM；其中1) VH包含包含SEQ ID NO: 45之胺基酸序列之CDR-H1，包含SEQ ID NO: 62之胺基酸序列之CDR-H2及包含SEQ ID NO: 79之胺基酸序列之CDR-H3；及2) VL包含包含SEQ ID NO: 96之胺基酸序列之CDR-L1，包含SEQ ID NO: 113之胺基酸序列之CDR-L2及包含SEQ ID NO: 130之胺基酸序列之CDR-L3。於某些實施例中，本文提供之經遮蔽抗體包含：(a)遮蔽性肽，其自N端至C端包含遮蔽性部分(MM)及連接部分(LM)；及(b)靶結合部分(TBM)，其包含抗體重鏈可變區(VH)及抗體輕鏈可變區(VL)，其中TBM與人類CD47結合，其中遮蔽性肽與VH或VL之N端相連，及其中所述MM與人類CD47競爭結合TBM；其中VH包含SEQ ID NO: 21之胺基酸序列，及/或VL包含SEQ ID NO: 22之胺基酸序列。於某些實施例中，MM包含SEQ ID NO: 137之胺基酸序列。
於一些實施例中，本文提供之經遮蔽抗體包含：(a)遮蔽性肽，其自N端至C端包含遮蔽性部分(MM)及連接部分(LM)；及(b)靶結合部分(TBM)，其包含抗體重鏈可變區(VH)及抗體輕鏈可變區(VL)，其中TBM與人類CD47結合，其中遮蔽性肽與VH或VL之N端相連，及其中所述MM與人類CD47競爭結合TBM；其中1) VH包含包含SEQ ID NO: 46之胺基酸序列之CDR-H1，包含SEQ ID NO: 63之胺基酸序列之CDR-H2及包含SEQ ID NO: 80之胺基酸序列之CDR-H3；及2) VL包含包含SEQ ID NO: 97之胺基酸序列之CDR-L1，包含SEQ ID NO: 114之胺基酸序列之CDR-L2及包含SEQ ID NO: 131之胺基酸序列之CDR-L3。於某些實施例中，本文提供之經遮蔽抗體包含：(a)遮蔽性肽，其自N端至C端包含遮蔽性部分(MM)及連接部分(LM)；(b)靶結合部分(TBM)，其包含抗體重鏈可變區(VH)及抗體輕鏈可變區(VL)，其中TBM與人類CD47結合，其中遮蔽性肽與VH或VL之N端相連，及其中所述MM與人類CD47競爭結合TBM；其中VH包含SEQ ID NO: 23之胺基酸序列，及/或VL包含SEQ ID NO: 24之胺基酸序列。於某些實施例中，MM包含SEQ ID NO: 137之胺基酸序列。
於一些實施例中，本文提供之經遮蔽抗體包含：(a)遮蔽性肽，其自N端至C端包含遮蔽性部分(MM)及連接部分(LM)；及(b)靶結合部分(TBM)，其包含抗體重鏈可變區(VH)及抗體輕鏈可變區(VL)，其中TBM與人類CD47結合，其中遮蔽性肽與VH或VL之N端相連，及其中所述MM與人類CD47競爭結合TBM；其中1) VH包含包含SEQ ID NO: 47之胺基酸序列之CDR-H1，包含SEQ ID NO: 64之胺基酸序列之CDR-H2及包含SEQ ID NO: 81之胺基酸序列之CDR-H3；及2) VL包含包含SEQ ID NO: 98之胺基酸序列之CDR-L1，包含SEQ ID NO: 115之胺基酸序列之CDR-L2及包含SEQ ID NO: 132之胺基酸序列之CDR-L3。於某些實施例中，本文提供之經遮蔽抗體包含：(a)遮蔽性肽，其自N端至C端包含遮蔽性部分(MM)及連接部分(LM)；及(b)靶結合部分(TBM)，其包含抗體重鏈可變區(VH)及抗體輕鏈可變區(VL)，其中TBM與人類CD47結合，其中遮蔽性肽與VH或VL之N端相連，及其中所述MM與人類CD47競爭結合TBM；其中VH包含SEQ ID NO: 25之胺基酸序列，及/或VL包含SEQ ID NO: 26之胺基酸序列。於某些實施例中，MM包含SEQ ID NO: 137之胺基酸序列。
於如上述經遮蔽抗體中之任一者之一些實施例中，LM不包含包含至少一個裂解位點之可裂解部分(CM)。
於如上述經遮蔽抗體中之任一者之一些實施例中，經遮蔽抗體為可活化抗體。因此，於某些態樣，本文所用可活化抗體包含：(a)遮蔽性肽，其自N端至C端包含遮蔽性部分(MM)及連接部分(LM)，其中LM包含包含至少一個裂解位點之CM；及(b)靶結合部分(TBM)，其包含抗體重鏈可變區(VH)及抗體輕鏈可變區(VL)，其中TBM與人類CD47結合；及其中遮蔽性肽與VH或VL之N端相連；及其中所述MM與人類CD47競爭結合TBM。於優選之實施例中，可活化抗體在活體外CM裂解時比CM裂解前對人類CD47具有更高之結合親和力。於一些實施例中，1) VH包含第一互補決定區(CDR-H1)、第二互補決定區(CDR-H2)及第三互補決定區(CDR-H3)，其中CDR-H1包含SEQ ID NO: 182或183之胺基酸序列；其中CDR-H2包含SEQ ID NO: 184或185之胺基酸序列；及其中CDR-H3包含選自由SEQ ID NOs: 186-189組成之群之胺基酸序列；及/或2) VL包含第一互補決定區(CDR-L1)，第二互補決定區(CDR-L2)及第三互補決定區(CDR-L3)，其中CDR-L1包含選自由SEQ ID NOs: 190-193組成之群之胺基酸序列；其中CDR-L2包含SEQ ID NO: 194之胺基酸序列；及其中CDR-L3包含SEQ ID NO: 195或196之胺基酸序列。於某些實施例中，VH包含包含SEQ ID NO: 182之胺基酸序列之CDR-H1，包含SEQ ID NO: 185之胺基酸序列之CDR-H2及包含SEQ ID NO: 188之胺基酸序列之CDR-H3；且b) VL包含包含SEQ ID NO: 191之胺基酸序列之CDR-L1，包含SEQ ID NO: 194之胺基酸序列之CDR-L2及包含SEQ ID NO: 195之胺基酸序列之CDR-L3。於一些實施例中，可活化抗體包含自N端至C端包含遮蔽性肽及VL之第一多肽，及包含VH之第二多肽。於其他實施例中，可活化抗體包含自N端至C端包含遮蔽性肽及VH之第一多肽，及包含VL之第二多肽。於另外之實施例中，可活化抗體包含自N端至C端包含遮蔽性肽，VL及VH之第一多肽。於另外之實施例中，可活化抗體包含自N端至C端包含遮蔽性肽，VH及VL之第一多肽。於一些實施例中，可裂解部分(CM)之裂解位點為選自由以下蛋白酶之蛋白酶裂解位點組成之群：尿激酶型纖維蛋白溶酶原活化因數(uPA)、基質金屬蛋白酶-1 (MMP-1)、MMP-2、MMP-3、MMP-8、MMP-9、MMP-14、煙草蝕紋病毒(TEV)蛋白酶、胞漿素、凝血酶、因數X、PSA、PSMA、組織蛋白酶D、組織蛋白酶K、組織蛋白酶S、ADAM10、ADAM12、ADAMTS、卡斯蛋白酶-1、卡斯蛋白酶-2、卡斯蛋白酶-3、卡斯蛋白酶-4、卡斯蛋白酶-5、卡斯蛋白酶-6、卡斯蛋白酶-7、卡斯蛋白酶-8、卡斯蛋白酶-9、卡斯蛋白酶-10、卡斯蛋白酶-11、卡斯蛋白酶-12、卡斯蛋白酶-13、卡斯蛋白酶-14及TACE。於某些實施例中，CM包含由MMP-9裂解之MMP-9之裂解位點。於一些實施例中，CM包含SEQ ID NO: 138之胺基酸序列。於一些實施例中，遮蔽性肽包含選自由SEQ ID NOs: 139及152-166組成之群之胺基酸序列。於某些實施例中，遮蔽性肽包含SEQ ID NO: 139之胺基酸序列。於一些實施例中，藉由Jurkat NFAT報告子分析測定，遮蔽性肽或其部分(例如，MM)之遮蔽效率至少為50。於一些實施例中，藉由Jurkat NFAT報告子分析測定，遮蔽性肽或其部分(例如，MM)之遮蔽效率至少為100。於一些實施例中，可活化抗體包含自N端至C端包含遮蔽性肽及VL之第一多肽，及包含VH之第二多肽。於某些實施例中，可活化抗體包含人類IgG4可結晶(Fc)區。於某些實施例中，可活化抗體包含人類IgG1 Fc區。於一些實施例中，人類IgG1 Fc區包含兩個Fc結構域，其中兩個Fc結構域中的每一個包含S239D取代及/或I332E取代(例如，S239D取代及I332E取代)。
於一些實施例中，本文提供之可活化抗體包含：(a)遮蔽性肽，其自N端至C端包含遮蔽性部分(MM)及連接部分(LM)，其中LM包含包含至少一個裂解位點之可裂解部分(CM)；及(b)靶結合部分(TBM)，其包含抗體重鏈可變區(VH)及抗體輕鏈可變區(VL)，其中TBM與人類CD47結合，其中遮蔽性肽與VH或VL之N端相連，及其中所述MM與人類CD47競爭結合TBM；其中(a) VH包含包含選自由SEQ ID NOs: 35-37及39-50組成之群之胺基酸序列之CDR-H1，包含選自由SEQ ID NOs: 52-54及56-67組成之群之胺基酸序列之CDR-H2，以及包含選自由SEQ ID NOs: 69-71及73-84組成之群之胺基酸序列之CDR-H3；及(b) VL包含包含選自由SEQ ID NOs: 86-88及89-101組成之群之胺基酸序列之CDR-L1，包含選自由SEQ ID NOs: 103-105及106-118組成之群之胺基酸序列之CDR-L2，及包含選自由SEQ ID NO: 120-122及124-135組成之群之胺基酸序列之CDR-L3。
於某些實施例中，本文提供之可活化抗體包含：(a)遮蔽性肽，其自N端至C端包含遮蔽性部分(MM)及連接部分(LM)，其中LM包含包含至少一個裂解位點之可裂解部分(CM)；及(b)靶結合部分(TBM)，其包含抗體重鏈可變區(VH)及抗體輕鏈可變區(VL)，其中TBM與人類CD47結合，其中遮蔽性肽與VH或VL之N端相連，及其中所述MM與人類CD47競爭結合TBM；其中VH包含選自由SEQ ID NOs: 1、3、5、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29及31組成之群之胺基酸序列；及/或其中VL包含選自由SEQ ID NOs: 2、4、6、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30及32組成之群之胺基酸序列。
於一些實施例中，本文提供之可活化抗體包含：(a)遮蔽性肽，其自N端至C端包含遮蔽性部分(MM)及連接部分(LM)，其中LM包含包含至少一個裂解位點之可裂解部分(CM)；及(b)靶結合部分(TBM)，其包含抗體重鏈可變區(VH)及抗體輕鏈可變區(VL)，其中TBM與人類CD47結合，其中遮蔽性肽與VH或VL之N端相連，及其中所述MM與人類CD47競爭結合TBM；其中1) VH包含包含SEQ ID NO: 48之胺基酸序列之CDR-H1，包含SEQ ID NO: 65之胺基酸序列之CDR-H2及包含SEQ ID NO: 82之胺基酸序列之CDR-H3；及2) VL包含包含SEQ ID NO: 99之胺基酸序列之CDR-L1，包含SEQ ID NO: 116之胺基酸序列之CDR-L2及包含SEQ ID NO: 133之胺基酸序列之CDR-L3。於某些實施例中，本文提供之可活化抗體包含：(a)遮蔽性肽，其自N端至C端包含遮蔽性部分(MM)及連接部分(LM)，其中LM包含包含至少一個裂解位點之可裂解部分(CM)；及(b)靶結合部分(TBM)，其包含抗體重鏈可變區(VH)及抗體輕鏈可變區(VL)，其中TBM與人類CD47結合，其中遮蔽性肽與VH或VL之N端相連，及其中所述MM與人類CD47競爭結合TBM；其中VH包含SEQ ID NO: 27之胺基酸序列，及/或VL包含SEQ ID NO: 28之胺基酸序列。於某些實施例中遮蔽性肽包含SEQ ID NO: 139之胺基酸序列，MM包含SEQ ID NO: 137之胺基酸序列；及/或CM包含SEQ ID NO: 138之胺基酸序列。於一些實施例中，可活化抗體包含自N端至C端包含遮蔽性肽及VL之第一多肽，及包含VH之第二多肽。於某些實施例中，可活化抗體包含人類IgG4可結晶(Fc)區。於一些實施例中，第一多肽包含自N端至C端包含遮蔽性肽及VL之輕鏈，其中第一多肽包含SEQ ID NO: 142之胺基酸序列，及其中第二多肽包含自N端至C端包含VH及人類IgG4 Fc結構域之重鏈，其中第二多肽包含SEQ ID NO: 143之胺基酸序列。於某些實施例中，可活化抗體包含人類IgG1 Fc區。於一個實施例中，第一多肽包含自N端至C端包含遮蔽性肽及VL之輕鏈，其中第一多肽包含SEQ ID NO: 148之胺基酸序列，及其中第二多肽包含自N端至C端包含VH及人類IgG1 Fc結構域之重鏈，其中第二多肽包含SEQ ID NO: 149之胺基酸序列。於一些實施例中，人類IgG1 Fc區包含兩個Fc結構域，其中兩個Fc結構域中的每一個包含S239D取代及/或I332E取代(例如，S239D取代及I332E取代)。於一個實施例中，第一多肽包含自N端至C端包含遮蔽性肽及VL之輕鏈，其中第一多肽包含SEQ ID NO: 150之胺基酸序列，及其中第二多肽包含自N端至C端包含VH及人類IgG1 Fc結構域之重鏈，其中第二多肽包含SEQ ID NO: 151之胺基酸序列。
於一些實施例中，本文提供之可活化抗體包含：(a)遮蔽性肽，其自N端至C端包含遮蔽性部分(MM)及連接部分(LM)，其中LM包含包含至少一個裂解位點之可裂解部分(CM)；及(b)靶結合部分(TBM)，其包含抗體重鏈可變區(VH)及抗體輕鏈可變區(VL)，其中TBM與人類CD47結合，其中遮蔽性肽與VH或VL之N端相連，及其中所述MM與人類CD47競爭結合TBM；其中1) VH包含包含SEQ ID NO: 49之胺基酸序列之CDR-H1，包含SEQ ID NO: 66之胺基酸序列之CDR-H2及包含SEQ ID NO: 83之胺基酸序列之CDR-H3；及2) VL包含包含SEQ ID NO: 100之胺基酸序列之CDR-L1，包含SEQ ID NO: 117之胺基酸序列之CDR-L2及包含SEQ ID NO: 134之胺基酸序列之CDR-L3。於某些實施例中，本文提供之可活化抗體包含：(a)遮蔽性肽，其自N端至C端包含遮蔽性部分(MM)及連接部分(LM)，其中LM包含包含至少一個裂解位點之可裂解部分(CM)；及(b)靶結合部分(TBM)，其包含抗體重鏈可變區(VH)及抗體輕鏈可變區(VL)，其中TBM與人類CD47結合，其中遮蔽性肽與VH或VL之N端相連，及其中所述MM與人類CD47競爭結合TBM；其中VH包含SEQ ID NO: 29之胺基酸序列，及/或VL包含SEQ ID NO: 30之胺基酸序列。於某些實施例中遮蔽性肽包含SEQ ID NO: 139之胺基酸序列，MM包含SEQ ID NO: 137之胺基酸序列；及/或CM包含SEQ ID NO: 138之胺基酸序列。
於一些實施例中，本文提供之可活化抗體包含：(a)遮蔽性肽，其自N端至C端包含遮蔽性部分(MM)及連接部分(LM)，其中LM包含包含至少一個裂解位點之可裂解部分(CM)；及(b)靶結合部分(TBM)，其包含抗體重鏈可變區(VH)及抗體輕鏈可變區(VL)，其中TBM與人類CD47結合，其中遮蔽性肽與VH或VL之N端相連，及其中所述MM與人類CD47競爭結合TBM；其中1) VH包含包含SEQ ID NO: 50之胺基酸序列之CDR-H1，包含SEQ ID NO: 67之胺基酸序列之CDR-H2及包含SEQ ID NO: 84之胺基酸序列之CDR-H3；及2) VL包含包含SEQ ID NO: 101之胺基酸序列之CDR-L1，包含SEQ ID NO: 118之胺基酸序列之CDR-L2及包含SEQ ID NO: 135之胺基酸序列之CDR-L3。於某些實施例中，本文提供之可活化抗體包含：(a)遮蔽性肽，其自N端至C端包含遮蔽性部分(MM)及連接部分(LM)，其中LM包含包含至少一個裂解位點之可裂解部分(CM)；及(b)靶結合部分(TBM)，其包含抗體重鏈可變區(VH)及抗體輕鏈可變區(VL)，其中TBM與人類CD47結合，其中遮蔽性肽與VH或VL之N端相連，及其中所述MM與人類CD47競爭結合TBM；其中VH包含SEQ ID NO: 31之胺基酸序列，及/或VL包含SEQ ID NO: 32之胺基酸序列。於某些實施例中遮蔽性肽包含SEQ ID NO: 139之胺基酸序列，MM包含SEQ ID NO: 137之胺基酸序列；及/或CM包含SEQ ID NO: 138之胺基酸序列。
於一些實施例中，本文提供之可活化抗體包含：(a)遮蔽性肽，其自N端至C端包含遮蔽性部分(MM)及連接部分(LM)，其中LM包含包含至少一個裂解位點之可裂解部分(CM)；及(b)靶結合部分(TBM)，其包含抗體重鏈可變區(VH)及抗體輕鏈可變區(VL)，其中TBM與人類CD47結合，其中遮蔽性肽與VH或VL之N端相連，及其中所述MM與人類CD47競爭結合TBM；其中1) VH包含包含SEQ ID NO: 35之胺基酸序列之CDR-H1，包含SEQ ID NO: 52之胺基酸序列之CDR-H2及包含SEQ ID NO: 69之胺基酸序列之CDR-H3；及2) VL包含包含SEQ ID NO: 86之胺基酸序列之CDR-L1，包含SEQ ID NO: 103之胺基酸序列之CDR-L2及包含SEQ ID NO: 120之胺基酸序列之CDR-L3。於某些實施例中，本文提供之可活化抗體包含：(a)遮蔽性肽，其自N端至C端包含遮蔽性部分(MM)及連接部分(LM)，其中LM包含包含至少一個裂解位點之可裂解部分(CM)；及(b)靶結合部分(TBM)，其包含抗體重鏈可變區(VH)及抗體輕鏈可變區(VL)，其中TBM與人類CD47結合，其中遮蔽性肽與VH或VL之N端相連，及其中所述MM與人類CD47競爭結合TBM；其中VH包含SEQ ID NO: 1之胺基酸序列，及/或VL包含SEQ ID NO: 2之胺基酸序列。於某些實施例中遮蔽性肽包含SEQ ID NO: 139之胺基酸序列，MM包含SEQ ID NO: 137之胺基酸序列；及/或CM包含SEQ ID NO: 138之胺基酸序列。
於一些實施例中，本文提供之可活化抗體包含：(a)遮蔽性肽，其自N端至C端包含遮蔽性部分(MM)及連接部分(LM)，其中LM包含包含至少一個裂解位點之可裂解部分(CM)；及(b)靶結合部分(TBM)，其包含抗體重鏈可變區(VH)及抗體輕鏈可變區(VL)，其中TBM與人類CD47結合，其中遮蔽性肽與VH或VL之N端相連，及其中所述MM與人類CD47競爭結合TBM；其中1) VH包含包含SEQ ID NO: 36之胺基酸序列之CDR-H1，包含SEQ ID NO: 53之胺基酸序列之CDR-H2及包含SEQ ID NO: 70之胺基酸序列之CDR-H3；2) VL包含包含SEQ ID NO: 87之胺基酸序列之CDR-L1，包含SEQ ID NO: 104之胺基酸序列之CDR-L2及包含SEQ ID NO: 121之胺基酸序列之CDR-L3。於某些實施例中，本文提供之可活化抗體包含：(a)遮蔽性肽，其自N端至C端包含遮蔽性部分(MM)及連接部分(LM)，其中LM包含包含至少一個裂解位點之可裂解部分(CM)；及(b)靶結合部分(TBM)，其包含抗體重鏈可變區(VH)及抗體輕鏈可變區(VL)，其中TBM與人類CD47結合，其中遮蔽性肽與VH或VL之N端相連，及其中所述MM與人類CD47競爭結合TBM；其中VH包含SEQ ID NO: 3之胺基酸序列，及/或VL包含SEQ ID NO: 4之胺基酸序列。於某些實施例中遮蔽性肽包含SEQ ID NO: 139之胺基酸序列，MM包含SEQ ID NO: 137之胺基酸序列；及/或CM包含SEQ ID NO: 138之胺基酸序列。
於一些實施例中，本文提供之可活化抗體包含：(a)遮蔽性肽，其自N端至C端包含遮蔽性部分(MM)及連接部分(LM)，其中LM包含包含至少一個裂解位點之可裂解部分(CM)；及(b)靶結合部分(TBM)，其包含抗體重鏈可變區(VH)及抗體輕鏈可變區(VL)，其中TBM與人類CD47結合，其中遮蔽性肽與VH或VL之N端相連，及其中所述MM與人類CD47競爭結合TBM；其中1) VH包含包含SEQ ID NO: 37之胺基酸序列之CDR-H1，包含SEQ ID NO: 54之胺基酸序列之CDR-H2及包含SEQ ID NO: 71之胺基酸序列之CDR-H3；及2) VL包含包含SEQ ID NO: 88之胺基酸序列之CDR-L1，包含SEQ ID NO: 105之胺基酸序列之CDR-L2及包含SEQ ID NO: 122之胺基酸序列之CDR-L3。於某些實施例中，本文提供之可活化抗體包含：(a)遮蔽性肽，其自N端至C端包含遮蔽性部分(MM)及連接部分(LM)，其中LM包含包含至少一個裂解位點之可裂解部分(CM)；及(b)靶結合部分(TBM)，其包含抗體重鏈可變區(VH)及抗體輕鏈可變區(VL)，其中TBM與人類CD47結合，其中遮蔽性肽與VH或VL之N端相連，及其中所述MM與人類CD47競爭結合TBM；其中VH包含SEQ ID NO: 5之胺基酸序列，及/或VL包含SEQ ID NO: 6之胺基酸序列。於某些實施例中遮蔽性肽包含SEQ ID NO: 139之胺基酸序列，MM包含SEQ ID NO: 137之胺基酸序列；及/或CM包含SEQ ID NO: 138之胺基酸序列。
於一些實施例中，本文提供之可活化抗體包含：(a)遮蔽性肽，其自N端至C端包含遮蔽性部分(MM)及連接部分(LM)，其中LM包含包含至少一個裂解位點之可裂解部分(CM)；及(b)靶結合部分(TBM)，其包含抗體重鏈可變區(VH)及抗體輕鏈可變區(VL)，其中TBM與人類CD47結合，其中遮蔽性肽與VH或VL之N端相連，及其中所述MM與人類CD47競爭結合TBM；其中1) VH包含包含SEQ ID NO: 39之胺基酸序列之CDR-H1，包含SEQ ID NO: 56之胺基酸序列之CDR-H2及包含SEQ ID NO: 73之胺基酸序列之CDR-H3；及2) VL包含包含SEQ ID NO: 90之胺基酸序列之CDR-L1，包含SEQ ID NO: 107之胺基酸序列之CDR-L2及包含SEQ ID NO: 124之胺基酸序列之CDR-L3。於某些實施例中，本文提供之可活化抗體包含：(a)遮蔽性肽，其自N端至C端包含遮蔽性部分(MM)及連接部分(LM)，其中LM包含包含至少一個裂解位點之可裂解部分(CM)；及(b)靶結合部分(TBM)，其包含抗體重鏈可變區(VH)及抗體輕鏈可變區(VL)，其中TBM與人類CD47結合，其中遮蔽性肽與VH或VL之N端相連，及其中所述MM與人類CD47競爭結合TBM；其中VH包含SEQ ID NO: 9之胺基酸序列，及/或VL包含SEQ ID NO: 10之胺基酸序列。於某些實施例中遮蔽性肽包含SEQ ID NO: 139之胺基酸序列，MM包含SEQ ID NO: 137之胺基酸序列；及/或CM包含SEQ ID NO: 138之胺基酸序列。
於一些實施例中，本文提供之可活化抗體包含：(a)遮蔽性肽，其自N端至C端包含遮蔽性部分(MM)及連接部分(LM)，其中LM包含包含至少一個裂解位點之可裂解部分(CM)；及(b)靶結合部分(TBM)，其包含抗體重鏈可變區(VH)及抗體輕鏈可變區(VL)，其中TBM與人類CD47結合，其中遮蔽性肽與VH或VL之N端相連，及其中所述MM與人類CD47競爭結合TBM；其中1) VH包含包含SEQ ID NO: 40之胺基酸序列之CDR-H1，包含SEQ ID NO: 57之胺基酸序列之CDR-H2及包含SEQ ID NO: 74之胺基酸序列之CDR-H3；及2) VL包含包含SEQ ID NO: 91之胺基酸序列之CDR-L1，包含SEQ ID NO: 108之胺基酸序列之CDR-L2及包含SEQ ID NO: 125之胺基酸序列之CDR-L3。於某些實施例中，本文提供之可活化抗體包含：(a)遮蔽性肽，其自N端至C端包含遮蔽性部分(MM)及連接部分(LM)，其中LM包含包含至少一個裂解位點之可裂解部分(CM)；及(b)靶結合部分(TBM)，其包含抗體重鏈可變區(VH)及抗體輕鏈可變區(VL)，其中TBM與人類CD47結合，其中遮蔽性肽與VH或VL之N端相連，及其中所述MM與人類CD47競爭結合TBM；其中VH包含SEQ ID NO: 11之胺基酸序列，及/或VL包含SEQ ID NO: 12之胺基酸序列。於某些實施例中遮蔽性肽包含SEQ ID NO: 139之胺基酸序列，MM包含SEQ ID NO: 137之胺基酸序列；及/或CM包含SEQ ID NO: 138之胺基酸序列。
於一些實施例中，本文提供之可活化抗體包含：(a)遮蔽性肽，其自N端至C端包含遮蔽性部分(MM)及連接部分(LM)，其中LM包含包含至少一個裂解位點之可裂解部分(CM)；及(b)靶結合部分(TBM)，其包含抗體重鏈可變區(VH)及抗體輕鏈可變區(VL)，其中TBM與人類CD47結合，其中遮蔽性肽與VH或VL之N端相連，及其中所述MM與人類CD47競爭結合TBM；其中1) VH包含包含SEQ ID NO: 41之胺基酸序列之CDR-H1，包含SEQ ID NO: 58之胺基酸序列之CDR-H2及包含SEQ ID NO: 75之胺基酸序列之CDR-H3；及2) VL包含包含SEQ ID NO: 92之胺基酸序列之CDR-L1，包含SEQ ID NO: 109之胺基酸序列之CDR-L2及包含SEQ ID NO: 126之胺基酸序列之CDR-L3。於某些實施例中，本文提供之可活化抗體包含：(a)遮蔽性肽，其自N端至C端包含遮蔽性部分(MM)及連接部分(LM)，其中LM包含包含至少一個裂解位點之可裂解部分(CM)；及(b)靶結合部分(TBM)，其包含抗體重鏈可變區(VH)及抗體輕鏈可變區(VL)，其中TBM與人類CD47結合，其中遮蔽性肽與VH或VL之N端相連，及其中所述MM與人類CD47競爭結合TBM；其中VH包含SEQ ID NO: 13之胺基酸序列，及/或VL包含SEQ ID NO: 14之胺基酸序列。於某些實施例中遮蔽性肽包含SEQ ID NO: 139之胺基酸序列，MM包含SEQ ID NO: 137之胺基酸序列；及/或CM包含SEQ ID NO: 138之胺基酸序列。
於一些實施例中，本文提供之可活化抗體包含：(a)遮蔽性肽，其自N端至C端包含遮蔽性部分(MM)及連接部分(LM)，其中LM包含包含至少一個裂解位點之可裂解部分(CM)；及(b)靶結合部分(TBM)，其包含抗體重鏈可變區(VH)及抗體輕鏈可變區(VL)，其中TBM與人類CD47結合，其中遮蔽性肽與VH或VL之N端相連，及其中所述MM與人類CD47競爭結合TBM；其中1) VH包含包含SEQ ID NO: 42之胺基酸序列之CDR-H1，包含SEQ ID NO: 59之胺基酸序列之CDR-H2及包含SEQ ID NO: 76之胺基酸序列之CDR-H3；及2) VL包含包含SEQ ID NO: 93之胺基酸序列之CDR-L1，包含SEQ ID NO: 110之胺基酸序列之CDR-L2及包含SEQ ID NO: 127之胺基酸序列之CDR-L3。於某些實施例中，本文提供之可活化抗體包含：(a)遮蔽性肽，其自N端至C端包含遮蔽性部分(MM)及連接部分(LM)，其中LM包含包含至少一個裂解位點之可裂解部分(CM)；及(b)靶結合部分(TBM)，其包含抗體重鏈可變區(VH)及抗體輕鏈可變區(VL)，其中TBM與人類CD47結合，其中遮蔽性肽與VH或VL之N端相連，及其中所述MM與人類CD47競爭結合TBM；其中VH包含SEQ ID NO: 15之胺基酸序列，及/或VL包含SEQ ID NO: 16之胺基酸序列。於某些實施例中遮蔽性肽包含SEQ ID NO: 139之胺基酸序列，MM包含SEQ ID NO: 137之胺基酸序列；及/或CM包含SEQ ID NO: 138之胺基酸序列。
於一些實施例中，本文提供之可活化抗體包含：(a)遮蔽性肽，其自N端至C端包含遮蔽性部分(MM)及連接部分(LM)，其中LM包含包含至少一個裂解位點之可裂解部分(CM)；及(b)靶結合部分(TBM)，其包含抗體重鏈可變區(VH)及抗體輕鏈可變區(VL)，其中TBM與人類CD47結合，其中遮蔽性肽與VH或VL之N端相連，及其中所述MM與人類CD47競爭結合TBM；其中1) VH包含包含SEQ ID NO: 43之胺基酸序列之CDR-H1，包含SEQ ID NO: 60之胺基酸序列之CDR-H2及包含SEQ ID NO: 77之胺基酸序列之CDR-H3；及2) VL包含包含SEQ ID NO: 94之胺基酸序列之CDR-L1，包含SEQ ID NO: 111之胺基酸序列之CDR-L2及包含SEQ ID NO: 128之胺基酸序列之CDR-L3。於某些實施例中，本文提供之可活化抗體包含：(a)遮蔽性肽，其自N端至C端包含遮蔽性部分(MM)及連接部分(LM)，其中LM包含包含至少一個裂解位點之可裂解部分(CM)；及(b)靶結合部分(TBM)，其包含抗體重鏈可變區(VH)及抗體輕鏈可變區(VL)，其中TBM與人類CD47結合，其中遮蔽性肽與VH或VL之N端相連，及其中所述MM與人類CD47競爭結合TBM；其中VH包含SEQ ID NO: 17之胺基酸序列，及/或VL包含SEQ ID NO: 18之胺基酸序列。於某些實施例中遮蔽性肽包含SEQ ID NO: 139之胺基酸序列，MM包含SEQ ID NO: 137之胺基酸序列；及/或CM包含SEQ ID NO: 138之胺基酸序列。
於一些實施例中，本文提供之可活化抗體包含：(a)遮蔽性肽，其自N端至C端包含遮蔽性部分(MM)及連接部分(LM)，其中LM包含包含至少一個裂解位點之可裂解部分(CM)；及(b)靶結合部分(TBM)，其包含抗體重鏈可變區(VH)及抗體輕鏈可變區(VL)，其中TBM與人類CD47結合，其中遮蔽性肽與VH或VL之N端相連，及其中所述MM與人類CD47競爭結合TBM；其中1) VH包含包含SEQ ID NO: 44之胺基酸序列之CDR-H1，包含SEQ ID NO: 61之胺基酸序列之CDR-H2及包含SEQ ID NO: 78之胺基酸序列之CDR-H3；及2) VL包含包含SEQ ID NO: 95之胺基酸序列之CDR-L1，包含SEQ ID NO: 112之胺基酸序列之CDR-L2及包含SEQ ID NO: 129之胺基酸序列之CDR-L3。於某些實施例中，本文提供之可活化抗體包含：(a)遮蔽性肽，其自N端至C端包含遮蔽性部分(MM)及連接部分(LM)，其中LM包含包含至少一個裂解位點之可裂解部分(CM)；及(b)靶結合部分(TBM)，其包含抗體重鏈可變區(VH)及抗體輕鏈可變區(VL)，其中TBM與人類CD47結合，其中遮蔽性肽與VH或VL之N端相連，及其中所述MM與人類CD47競爭結合TBM；其中VH包含SEQ ID NO: 19之胺基酸序列，及/或VL包含SEQ ID NO: 20之胺基酸序列。於某些實施例中遮蔽性肽包含SEQ ID NO: 139之胺基酸序列，MM包含SEQ ID NO: 137之胺基酸序列；及/或CM包含SEQ ID NO: 138之胺基酸序列。
於一些實施例中，本文提供之可活化抗體包含：(a)遮蔽性肽，其自N端至C端包含遮蔽性部分(MM)及連接部分(LM)，其中LM包含包含至少一個裂解位點之可裂解部分(CM)；及(b)靶結合部分(TBM)，其包含抗體重鏈可變區(VH)及抗體輕鏈可變區(VL)，其中TBM與人類CD47結合，其中遮蔽性肽與VH或VL之N端相連，及其中所述MM與人類CD47競爭結合TBM；其中1) VH包含包含SEQ ID NO: 45之胺基酸序列之CDR-H1，包含SEQ ID NO: 62之胺基酸序列之CDR-H2及包含SEQ ID NO: 79之胺基酸序列之CDR-H3；及2) VL包含包含SEQ ID NO: 96之胺基酸序列之CDR-L1，包含SEQ ID NO: 113之胺基酸序列之CDR-L2及包含SEQ ID NO: 130之胺基酸序列之CDR-L3。於某些實施例中，本文提供之可活化抗體包含：(a)遮蔽性肽，其自N端至C端包含遮蔽性部分(MM)及連接部分(LM)，其中LM包含包含至少一個裂解位點之可裂解部分(CM)；及(b)靶結合部分(TBM)，其包含抗體重鏈可變區(VH)及抗體輕鏈可變區(VL)，其中TBM與人類CD47結合，其中遮蔽性肽與VH或VL之N端相連，及其中所述MM與人類CD47競爭結合TBM；其中VH包含SEQ ID NO: 21之胺基酸序列，及/或VL包含SEQ ID NO: 22之胺基酸序列。於某些實施例中遮蔽性肽包含SEQ ID NO: 139之胺基酸序列，MM包含SEQ ID NO: 137之胺基酸序列；及/或CM包含SEQ ID NO: 138之胺基酸序列。
於一些實施例中，本文提供之可活化抗體包含：(a)遮蔽性肽，其自N端至C端包含遮蔽性部分(MM)及連接部分(LM)，其中LM包含包含至少一個裂解位點之可裂解部分(CM)；及(b)靶結合部分(TBM)，其包含抗體重鏈可變區(VH)及抗體輕鏈可變區(VL)，其中TBM與人類CD47結合，其中遮蔽性肽與VH或VL之N端相連，及其中所述MM與人類CD47競爭結合TBM；其中1) VH包含包含SEQ ID NO: 46之胺基酸序列之CDR-H1，包含SEQ ID NO: 63之胺基酸序列之CDR-H2及包含SEQ ID NO: 80之胺基酸序列之CDR-H3；2) VL包含包含SEQ ID NO: 97之胺基酸序列之CDR-L1，包含SEQ ID NO: 114之胺基酸序列之CDR-L2及包含SEQ ID NO: 131之胺基酸序列之CDR-L3。於某些實施例中，本文提供之可活化抗體包含：(a)遮蔽性肽，其自N端至C端包含遮蔽性部分(MM)及連接部分(LM)，其中LM包含包含至少一個裂解位點之可裂解部分(CM)；及(b)靶結合部分(TBM)，其包含抗體重鏈可變區(VH)及抗體輕鏈可變區(VL)，其中TBM與人類CD47結合，其中遮蔽性肽與VH或VL之N端相連，及其中所述MM與人類CD47競爭結合TBM；其中VH包含SEQ ID NO: 23之胺基酸序列，及/或VL包含SEQ ID NO: 24之胺基酸序列。於某些實施例中遮蔽性肽包含SEQ ID NO: 139之胺基酸序列，MM包含SEQ ID NO: 137之胺基酸序列；及/或CM包含SEQ ID NO: 138之胺基酸序列。
於一些實施例中，本文提供之可活化抗體包含：(a)遮蔽性肽，其自N端至C端包含遮蔽性部分(MM)及連接部分(LM)，其中LM包含包含至少一個裂解位點之可裂解部分(CM)；及(b)靶結合部分(TBM)，其包含抗體重鏈可變區(VH)及抗體輕鏈可變區(VL)，其中TBM與人類CD47結合，其中遮蔽性肽與VH或VL之N端相連，及其中所述MM與人類CD47競爭結合TBM；其中1) VH包含包含SEQ ID NO: 47之胺基酸序列之CDR-H1，包含SEQ ID NO: 64之胺基酸序列之CDR-H2及包含SEQ ID NO: 81之胺基酸序列之CDR-H3；及2) VL包含包含SEQ ID NO: 98之胺基酸序列之CDR-L1，包含SEQ ID NO: 115之胺基酸序列之CDR-L2及包含SEQ ID NO: 132之胺基酸序列之CDR-L3。於某些實施例中，本文提供之可活化抗體包含：(a)遮蔽性肽，其自N端至C端包含遮蔽性部分(MM)及連接部分(LM)，其中LM包含包含至少一個裂解位點之可裂解部分(CM)；及(b)靶結合部分(TBM)，其包含抗體重鏈可變區(VH)及抗體輕鏈可變區(VL)，其中TBM與人類CD47結合，其中遮蔽性肽與VH或VL之N端相連，及其中所述MM與人類CD47競爭結合TBM；其中VH包含SEQ ID NO: 25之胺基酸序列，及/或VL包含SEQ ID NO: 26之胺基酸序列。於某些實施例中遮蔽性肽包含SEQ ID NO: 139之胺基酸序列，MM包含SEQ ID NO: 137之胺基酸序列；及/或CM包含SEQ ID NO: 138之胺基酸序列。
於其他態樣，本文提供之經分離之抗體或其抗原結合片段與人類CD47結合，其包含VH及VL。於一些實施例中，1)所述VH包含第一互補決定區(CDR-H1)、第二互補決定區(CDR-H2)及第三互補決定區(CDR-H3)，其中CDR-H1包含SEQ ID NO: 182或183之胺基酸序列；其中CDR-H2包含SEQ ID NO: 184或185之胺基酸序列；及/或其中CDR-H3包含選自由SEQ ID NOs: 186-189組成之群之胺基酸序列；及/或2) VL包含第一互補決定區(CDR-L1)，第二互補決定區(CDR-L2)及第三互補決定區(CDR-L3)，其中 CDR-L1包含選自由SEQ ID NOs: 190-193組成之群之胺基酸序列；其中CDR-L2包含SEQ ID NO: 194之胺基酸序列；及/或其中CDR-L3包含SEQ ID NO: 195或196之胺基酸序列。於某些實施例中，VH包含包含SEQ ID NO: 182之胺基酸序列之CDR-H1；包含SEQ ID NO: 185之胺基酸序列之CDR-H2；及包含SEQ ID NO: 188之胺基酸序列之CDR-H3；且b) VL包含包含SEQ ID NO: 191之胺基酸序列之CDR-L1；包含SEQ ID NO: 194之胺基酸序列之CDR-L2；及包含SEQ ID NO: 195之胺基酸序列之CDR-L3。於一些實施例中，經分離之抗體包含人類IgG4 Fc區。於其他實施例中，經分離之抗體包含人類IgG1 Fc區。於一些實施例中，人類IgG1 Fc區包含兩個Fc結構域，其中兩個Fc結構域中的每一個包含S239D取代及/或I332E取代(例如，S239D取代及I332E取代)。於一些實施例中，抗原結合片段選自由Fab、Fv、scFab及scFv組成之群。於一些實施例中，抗體或抗原結合片段與選自由人類CD47之K39、W40、K41、F50、D51、G52、T99、E100、L101及T102組成之群之一個或多個胺基酸殘基結合。於一些實施例中，抗體或抗原結合片段不與選自由人類CD47之L2、L3、F4、K6、N27、E29、A30、Q31、T34、E35、V36、Y37、D46、T49、A53、E97、R103、E104、G105及E106組成之群之一個或多個胺基酸殘基結合。於某些實施例中，抗體或抗原結合片段與人類CD47之K39、W40、K41、F50、D51、G52、T99、E100、L101及T102胺基酸殘基結合，及/或不與人類CD47之L2、L3、F4、K6、N27、E29、A30、Q31、T34、E35、V36、Y37、D46、T49、A53、E97、R103、E104、G105及E106胺基酸殘基結合。
於一些實施例中，本文提供之經分離之抗體或其抗原結合片段與人類CD47結合，其包含VH及VL，其中(a) VH包含包含選自由SEQ ID NOs: 35-37及39-50組成之群之胺基酸序列之CDR-H1，包含選自由SEQ ID NOs: 52-54及56-67組成之群之胺基酸序列之CDR-H2，以及包含選自由SEQ ID NOs: 69-71及73-84組成之群之胺基酸序列之CDR-H3；及(b) VL包含包含選自由SEQ ID NOs: 86-88及89-101組成之群之胺基酸序列之CDR-L1，包含選自由SEQ ID NOs: 103-105及106-118組成之群之胺基酸序列之CDR-L2，及包含選自由SEQ ID NOs: 120-122及124-135組成之群之胺基酸序列之CDR-L3。於某些實施例中，本文提供之經分離之抗體或其抗原結合片段與人類CD47結合，其包含VH及VL，其中VH包含選自由SEQ ID NOs: 1、3、5、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29及31組成之群之胺基酸序列；及/或其中VL包含選自由SEQ ID NOs: 2、4、6、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30及32組成之群之胺基酸序列。
於一些實施例中，本文提供之經分離之抗體或其抗原結合片段與人類CD47結合，其包含VH及VL，其中1) VH包含包含SEQ ID NO: 48之胺基酸序列之CDR-H1，包含SEQ ID NO: 65之胺基酸序列之CDR-H2及包含SEQ ID NO: 82之胺基酸序列之CDR-H3；及2) VL包含包含SEQ ID NO: 99之胺基酸序列之CDR-L1，包含SEQ ID NO: 116之胺基酸序列之CDR-L2及包含SEQ ID NO: 133之胺基酸序列之CDR-L3。於某些實施例中，本文提供之經分離之抗體或其抗原結合片段與人類CD47結合，其包含VH及VL，其中1) VH包含SEQ ID NO: 27之胺基酸序列，及/或VL包含SEQ ID NO: 28之胺基酸序列。於一些實施例中，經分離之抗體包含人類IgG4 Fc區。於一個實施例中，經分離之抗體包含包含VL之輕鏈之第一多肽，其中第一多肽包含SEQ ID NO: 140之胺基酸序列；及自N端至C端包含VH及人類IgG4 Fc區之重鏈之第二多肽，其中第二多肽包含SEQ ID NO: 141之胺基酸序列。於其他實施例中，經分離之抗體包含人類IgG1 Fc區。於一個實施例中，經分離之抗體包含包含VL之輕鏈之第一多肽，其中第一多肽包含SEQ ID NO: 144之胺基酸序列；及自N端至C端包含VH及人類IgG1 Fc區之重鏈之第二多肽，其中第二多肽包含SEQ ID NO: 145之胺基酸序列。於某些實施例中，人類IgG1 Fc區包含兩個Fc結構域，其中兩個Fc結構域中的每一個包含S239D取代及/或I332E取代(例如，S239D取代及I332E取代)。於一個實施例中，其中經分離之抗體包含包含VL之輕鏈之第一多肽，其中第一多肽包含SEQ ID NO: 146之胺基酸序列；及自N端至C端包含VH及人類IgG1 Fc區之重鏈之第二多肽，其中第二多肽包含SEQ ID NO: 147之胺基酸序列。
於一些實施例中，本文提供之經分離之抗體或其抗原結合片段與人類CD47結合，其包含VH及VL，其中1) VH包含包含SEQ ID NO: 49之胺基酸序列之CDR-H1，包含SEQ ID NO: 66之胺基酸序列之CDR-H2及包含SEQ ID NO: 83之胺基酸序列之CDR-H3；及2) VL包含包含SEQ ID NO: 100之胺基酸序列之CDR-L1，包含SEQ ID NO: 117之胺基酸序列之CDR-L2及包含SEQ ID NO: 134之胺基酸序列之CDR-L3。於某些實施例中，本文提供之經分離之抗體或其抗原結合片段與人類CD47結合，其包含VH及VL，其中VH包含SEQ ID NO: 29之胺基酸序列，及/或VL包含SEQ ID NO: 30之胺基酸序列。於一些實施例中，經分離之抗體包含人類IgG1 Fc區。於某些實施例中，人類IgG1 Fc區包含兩個Fc結構域，其中兩個Fc結構域中的每一個包含S239D取代及/或I332E取代(例如，S239D取代及I332E取代)。
於一些實施例中，本文提供之經分離之抗體或其抗原結合片段與人類CD47結合，其包含VH及VL，其中1) VH包含包含SEQ ID NO: 50之胺基酸序列之CDR-H1，包含SEQ ID NO: 67之胺基酸序列之CDR-H2及包含SEQ ID NO: 84之胺基酸序列之CDR-H3；及2) VL包含包含SEQ ID NO: 101之胺基酸序列之CDR-L1，包含SEQ ID NO: 118之胺基酸序列之CDR-L2及包含SEQ ID NO: 135之胺基酸序列之CDR-L3。於某些實施例中，本文提供之經分離之抗體或其抗原結合片段與人類CD47結合，其包含VH及VL，其中VH包含SEQ ID NO: 31之胺基酸序列，及/或VL包含SEQ ID NO: 32之胺基酸序列。於一些實施例中，經分離之抗體包含人類IgG1 Fc區。於某些實施例中，人類IgG1 Fc區包含兩個Fc結構域，其中兩個Fc結構域中的每一個包含S239D取代及/或I332E取代(例如，S239D取代及I332E取代)。
於一些實施例中，本文提供之經分離之抗體或其抗原結合片段與人類CD47結合，其包含VH及VL，其中1) VH包含包含SEQ ID NO: 35之胺基酸序列之CDR-H1，包含SEQ ID NO: 52之胺基酸序列之CDR-H2及包含SEQ ID NO: 69之胺基酸序列之CDR-H3；及2) VL包含包含SEQ ID NO: 86之胺基酸序列之CDR-L1，包含SEQ ID NO: 103之胺基酸序列之CDR-L2及包含SEQ ID NO: 120之胺基酸序列之CDR-L3。於某些實施例中，本文提供之經分離之抗體或其抗原結合片段與人類CD47結合，其包含VH及VL，其中VH包含SEQ ID NO: 1之胺基酸序列，及/或VL包含SEQ ID NO: 2之胺基酸序列。於一些實施例中，經分離之抗體包含人類IgG1 Fc區。於某些實施例中，人類IgG1 Fc區包含兩個Fc結構域，其中兩個Fc結構域中的每一個包含S239D取代及/或I332E取代(例如，S239D取代及I332E取代)。
於一些實施例中，本文提供之經分離之抗體或其抗原結合片段與人類CD47結合，其包含VH及VL，其中1) VH包含包含SEQ ID NO: 36之胺基酸序列之CDR-H1，包含SEQ ID NO: 53之胺基酸序列之CDR-H2及包含SEQ ID NO: 70之胺基酸序列之CDR-H3；及2) VL包含包含SEQ ID NO: 87之胺基酸序列之CDR-L1，包含SEQ ID NO: 104之胺基酸序列之CDR-L2及包含SEQ ID NO: 121之胺基酸序列之CDR-L3。於某些實施例中，本文提供之經分離之抗體或其抗原結合片段與人類CD47結合，其包含VH及VL，其中VH包含SEQ ID NO: 3之胺基酸序列，及/或VL包含SEQ ID NO: 4之胺基酸序列。於一些實施例中，經分離之抗體包含人類IgG1 Fc區。於某些實施例中，人類IgG1 Fc區包含兩個Fc結構域，其中兩個Fc結構域中的每一個包含S239D取代及/或I332E取代(例如，S239D取代及I332E取代)。
於一些實施例中，本文提供之經分離之抗體或其抗原結合片段與人類CD47結合，其包含VH及VL，其中1) VH包含包含SEQ ID NO: 37之胺基酸序列之CDR-H1，包含SEQ ID NO: 54之胺基酸序列之CDR-H2及包含SEQ ID NO: 71之胺基酸序列之CDR-H3；及2) VL包含包含SEQ ID NO: 88之胺基酸序列之CDR-L1，包含SEQ ID NO: 105之胺基酸序列之CDR-L2及包含SEQ ID NO: 122之胺基酸序列之CDR-L3。於某些實施例中，本文提供之經分離之抗體或其抗原結合片段與人類CD47結合，其包含VH及VL，其中VH包含SEQ ID NO: 5之胺基酸序列，及/或VL包含SEQ ID NO: 6之胺基酸序列。於一些實施例中，經分離之抗體包含人類IgG1 Fc區。於某些實施例中，人類IgG1 Fc區包含兩個Fc結構域，其中兩個Fc結構域中的每一個包含S239D取代及/或I332E取代(例如，S239D取代及I332E取代)。
於一些實施例中，本文提供之經分離之抗體或其抗原結合片段與人類CD47結合，其包含VH及VL，其中1) VH包含包含SEQ ID NO: 39之胺基酸序列之CDR-H1，包含SEQ ID NO: 56之胺基酸序列之CDR-H2及包含SEQ ID NO: 73之胺基酸序列之CDR-H3；及2) VL包含包含SEQ ID NO: 90之胺基酸序列之CDR-L1，包含SEQ ID NO: 107之胺基酸序列之CDR-L2及包含SEQ ID NO: 124之胺基酸序列之CDR-L3。於某些實施例中，本文提供之經分離之抗體或其抗原結合片段與人類CD47結合，其包含VH及VL，其中VH包含SEQ ID NO: 9之胺基酸序列，及/或VL包含SEQ ID NO: 10之胺基酸序列。於一些實施例中，經分離之抗體包含人類IgG1 Fc區。於某些實施例中，人類IgG1 Fc區包含兩個Fc結構域，其中兩個Fc結構域中的每一個包含S239D取代及/或I332E取代(例如，S239D取代及I332E取代)。
於一些實施例中，本文提供之經分離之抗體或其抗原結合片段與人類CD47結合，其包含VH及VL，其中1) VH包含包含SEQ ID NO: 40之胺基酸序列之CDR-H1，包含SEQ ID NO: 57之胺基酸序列之CDR-H2及包含SEQ ID NO: 74之胺基酸序列之CDR-H3；及2) VL包含包含SEQ ID NO: 91之胺基酸序列之CDR-L1，包含SEQ ID NO: 108之胺基酸序列之CDR-L2及包含SEQ ID NO: 125之胺基酸序列之CDR-L3。於某些實施例中，本文提供之經分離之抗體或其抗原結合片段與人類CD47結合，其包含VH及VL，其中VH包含SEQ ID NO: 11之胺基酸序列，及/或VL包含SEQ ID NO: 12之胺基酸序列。於一些實施例中，經分離之抗體包含人類IgG1 Fc區。於某些實施例中，人類IgG1 Fc區包含兩個Fc結構域，其中兩個Fc結構域中的每一個包含S239D取代及/或I332E取代(例如，S239D取代及I332E取代)。
於一些實施例中，本文提供之經分離之抗體或其抗原結合片段與人類CD47結合，其包含VH及VL，其中1) VH包含包含SEQ ID NO: 41之胺基酸序列之CDR-H1，包含SEQ ID NO: 58之胺基酸序列之CDR-H2及包含SEQ ID NO: 75之胺基酸序列之CDR-H3；及2) VL包含包含SEQ ID NO: 92之胺基酸序列之CDR-L1，包含SEQ ID NO: 109之胺基酸序列之CDR-L2及包含SEQ ID NO: 126之胺基酸序列之CDR-L3。於某些實施例中，本文提供之經分離之抗體或其抗原結合片段與人類CD47結合，其包含VH及VL，其中VH包含SEQ ID NO: 13之胺基酸序列，及/或VL包含SEQ ID NO: 14之胺基酸序列。於一些實施例中，經分離之抗體包含人類IgG1 Fc區。於某些實施例中，人類IgG1 Fc區包含兩個Fc結構域，其中兩個Fc結構域中的每一個包含S239D取代及/或I332E取代(例如，S239D取代及I332E取代)。
於一些實施例中，本文提供之經分離之抗體或其抗原結合片段與人類CD47結合，其包含VH及VL，其中1) VH包含包含SEQ ID NO: 42之胺基酸序列之CDR-H1，包含SEQ ID NO: 59之胺基酸序列之CDR-H2及包含SEQ ID NO: 76之胺基酸序列之CDR-H3；及2) VL包含包含SEQ ID NO: 93之胺基酸序列之CDR-L1，包含SEQ ID NO: 110之胺基酸序列之CDR-L2及包含SEQ ID NO: 127之胺基酸序列之CDR-L3。於某些實施例中，本文提供之經分離之抗體或其抗原結合片段與人類CD47結合，其包含VH及VL，其中VH包含SEQ ID NO: 15之胺基酸序列，及/或VL包含SEQ ID NO: 16之胺基酸序列。於一些實施例中，經分離之抗體包含人類IgG1 Fc區。於某些實施例中，人類IgG1 Fc區包含兩個Fc結構域，其中兩個Fc結構域中的每一個包含S239D取代及/或I332E取代(例如，S239D取代及I332E取代)。
於一些實施例中，本文提供之經分離之抗體或其抗原結合片段與人類CD47結合，其包含VH及VL，其中1) VH包含包含SEQ ID NO: 43之胺基酸序列之CDR-H1，包含SEQ ID NO: 60之胺基酸序列之CDR-H2及包含SEQ ID NO: 77之胺基酸序列之CDR-H3；及2) VL包含包含SEQ ID NO: 94之胺基酸序列之CDR-L1，包含SEQ ID NO: 111之胺基酸序列之CDR-L2及包含SEQ ID NO: 128之胺基酸序列之CDR-L3。於某些實施例中，本文提供之經分離之抗體或其抗原結合片段與人類CD47結合，其包含VH及VL，其中VH包含SEQ ID NO: 17之胺基酸序列，及/或VL包含SEQ ID NO: 18之胺基酸序列。於一些實施例中，經分離之抗體包含人類IgG1 Fc區。於某些實施例中，人類IgG1 Fc區包含兩個Fc結構域，其中兩個Fc結構域中的每一個包含S239D取代及/或I332E取代(例如，S239D取代及I332E取代)。
於一些實施例中，本文提供之經分離之抗體或其抗原結合片段與人類CD47結合，其包含VH及VL，其中1) VH包含包含SEQ ID NO: 44之胺基酸序列之CDR-H1，包含SEQ ID NO: 61之胺基酸序列之CDR-H2及包含SEQ ID NO: 78之胺基酸序列之CDR-H3；及2) VL包含包含SEQ ID NO: 95之胺基酸序列之CDR-L1，包含SEQ ID NO: 112之胺基酸序列之CDR-L2及包含SEQ ID NO: 129之胺基酸序列之CDR-L3。於某些實施例中，本文提供之經分離之抗體或其抗原結合片段與人類CD47結合，其包含VH及VL，其中VH包含SEQ ID NO: 19之胺基酸序列，及/或VL包含SEQ ID NO: 20之胺基酸序列。於一些實施例中，經分離之抗體包含人類IgG1 Fc區。於某些實施例中，人類IgG1 Fc區包含兩個Fc結構域，其中兩個Fc結構域中的每一個包含S239D取代及/或I332E取代(例如，S239D取代及I332E取代)。
於一些實施例中，本文提供之經分離之抗體或其抗原結合片段與人類CD47結合，其包含VH及VL，其中1) VH包含包含SEQ ID NO: 45之胺基酸序列之CDR-H1，包含SEQ ID NO: 62之胺基酸序列之CDR-H2及包含SEQ ID NO: 79之胺基酸序列之CDR-H3；及2) VL包含包含SEQ ID NO: 96之胺基酸序列之CDR-L1，包含SEQ ID NO: 113之胺基酸序列之CDR-L2及包含SEQ ID NO: 130之胺基酸序列之CDR-L3。於某些實施例中，本文提供之經分離之抗體或其抗原結合片段與人類CD47結合，其包含VH及VL，其中VH包含SEQ ID NO: 21之胺基酸序列，及/或VL包含SEQ ID NO: 22之胺基酸序列。於一些實施例中，經分離之抗體包含人類IgG1 Fc區。於某些實施例中，人類IgG1 Fc區包含兩個Fc結構域，其中兩個Fc結構域中的每一個包含S239D取代及/或I332E取代(例如，S239D取代及I332E取代)。
於一些實施例中，本文提供之經分離之抗體或其抗原結合片段與人類CD47結合，其包含VH及VL，其中1) VH包含包含SEQ ID NO: 46之胺基酸序列之CDR-H1，包含SEQ ID NO: 63之胺基酸序列之CDR-H2及包含SEQ ID NO: 80之胺基酸序列之CDR-H3；及2) VL包含包含SEQ ID NO: 97之胺基酸序列之CDR-L1，包含SEQ ID NO: 114之胺基酸序列之CDR-L2及包含SEQ ID NO: 131之胺基酸序列之CDR-L3。於某些實施例中，本文提供之經分離之抗體或其抗原結合片段與人類CD47結合，其包含VH及VL，其中VH包含SEQ ID NO: 23之胺基酸序列，及/或VL包含SEQ ID NO: 24之胺基酸序列。於一些實施例中，經分離之抗體包含人類IgG1 Fc區。於某些實施例中，人類IgG1 Fc區包含兩個Fc結構域，其中兩個Fc結構域中的每一個包含S239D取代及/或I332E取代(例如，S239D取代及I332E取代)。
於一些實施例中，本文提供之經分離之抗體或其抗原結合片段與人類CD47結合，其包含VH及VL，其中1) VH包含包含SEQ ID NO: 47之胺基酸序列之CDR-H1，包含SEQ ID NO: 64之胺基酸序列之CDR-H2及包含SEQ ID NO: 81之胺基酸序列之CDR-H3；及2) VL包含包含SEQ ID NO: 98之胺基酸序列之CDR-L1，包含SEQ ID NO: 115之胺基酸序列之CDR-L2及包含SEQ ID NO: 132之胺基酸序列之CDR-L3。於某些實施例中，本文提供之經分離之抗體或其抗原結合片段與人類CD47結合，其包含VH及VL，其中VH包含SEQ ID NO: 25之胺基酸序列，及/或VL包含SEQ ID NO: 26之胺基酸序列。於一些實施例中，經分離之抗體包含人類IgG1 Fc區。於某些實施例中，人類IgG1 Fc區包含兩個Fc結構域，其中兩個Fc結構域中的每一個包含S239D取代及/或I332E取代(例如，S239D取代及I332E取代)。於一些實施例中，經分離之抗體或抗原結合片段以約50 nM或更低之KD結合人類CD47。於某些實施例中，經分離之抗體或抗原結合片段以約10 nM或更低之KD結合人類CD47。於一些實施例中，經分離之抗體或抗原結合片段以約100 nM或更低之半抑制濃度(IC50)在活體外阻斷人類CD47與人類SIRPα之結合。於某些實施例中，經分離之抗體或抗原結合片段以約10 nM或更低之半抑制濃度(IC50)在活體外阻斷人類CD47與人類SIRPα之結合。於一些實施例中，當經分離之抗體或抗原結合片段以1 μM或更高之濃度提供時，經分離之抗體或抗原結合片段在活體外完全阻斷人類CD47與人類SIRPα之結合。於一些實施例中，經分離之抗體或抗原結合片段以約10 nM或更低之半最大效應濃度(EC50)在活體外與腫瘤細胞結合，其中腫瘤細胞包含B細胞淋巴瘤細胞株，T細胞淋巴瘤細胞株或其組合。於一些實施例中，經分離之抗體或抗原結合片段以約10 nM或更低之半最大效應濃度(EC50)在活體外增加腫瘤細胞之巨噬細胞吞噬作用，其中腫瘤細胞包含B細胞淋巴瘤細胞株，T細胞淋巴瘤細胞株或其組合。於某些實施例中，經分離之抗體或抗原結合片段以約1 nM或更低之半最大效應濃度(EC50)在活體外增加腫瘤細胞之巨噬細胞吞噬作用，其中腫瘤細胞包含B細胞淋巴瘤細胞株，T細胞淋巴瘤細胞株或其組合。
在可以與任何前述實施例組合的一些實施例中，經遮蔽抗體、可活化抗體、經分離之抗體或其抗原結合片段與至少一種選自由食蟹猴、大鼠及狗組成之群之非人類物種之CD47多肽交叉反應。在可以與任何前述實施例組合的某些實施例中，經遮蔽抗體、可活化抗體、經分離之抗體或其抗原結合片段與食蟹猴CD47結合。
於某些態樣，本文提供單離編碼本文所用之任何經遮蔽抗體、可活化抗體、經分離之抗體或其抗原結合片段之一個或多個多肽鏈之核酸。
於其他態樣，本文提供包含編碼本文所用之任何經遮蔽抗體、可活化抗體、經分離之抗體或其抗原結合片段之一個或多個多肽鏈之核酸之載體
於其他態樣，本文提供包含包含編碼本文所用之任何經遮蔽抗體、可活化抗體、經分離之抗體或其抗原結合片段之一個或多個多肽鏈之核酸之載體之宿主細胞。
於其他態樣，本文提供一種製備經遮蔽抗體、可活化抗體、經分離之抗體或其抗原結合片段之方法，其包含在適於產生經遮蔽抗體、可活化抗體、經分離之抗體或其抗原結合片段之條件下培養宿主細胞，其中宿主細胞包含編碼本文所用之任何經遮蔽抗體、可活化抗體、經分離之抗體或其抗原結合片段之一個或多個多肽鏈之核酸之載體。
於某些態樣，本文提供之醫藥組合物包含本文所用之任何經遮蔽抗體、可活化抗體、經分離之抗體或其抗原結合片段及醫藥學上可接受之載劑。
於其他態樣，本文提供一種治療有需要受試者之CD47陽性疾病或病症之方法，其包含對受試者投與有效量之醫藥組合物，本文所用之任何經遮蔽抗體、可活化抗體、經分離之抗體或其抗原結合片段及醫藥學上可接受之載劑。於一些實施例中，投與不會引起受試者貧血。於一些實施例中，疾病或病症為癌症。於某些實施例中，癌症包含B細胞淋巴瘤，T細胞淋巴瘤或其組合。於一些實施例中，癌症選自由淋巴瘤、白血病、頭頸癌、胃癌、食道癌、乳癌、宮頸癌、膽管癌、結腸癌、卵巢癌、甲狀腺癌、子宮癌、子宮內膜癌、肺癌、間皮瘤(MESO)或胰腺癌組成之群。於某些實施例中，癌症選自由三陰性乳腺癌(TNBC)、HER2+胃食管結合(GEJ)癌症、小細胞肺癌(SCLC)、彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、急性髓系細胞白血病(AML)、頭頸部鱗狀細胞癌(HNSC)、胃癌(GC)、乳癌(BRCA)、宮頸鱗癌及內宮頸內膜癌(CESC)、膽管癌(CHOL)、結腸腺癌(COAD)、卵巢漿液性囊腺癌(OV)、甲狀腺癌(THCA)、子宮內膜癌(UCEC)、HER2+乳癌、激素受體陽性乳癌、淋巴樣腫瘤彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBC)、肺腺癌(LUAD)、肺鱗癌(LUSC)、間皮瘤(MESO)及胰腺腺癌(PAAD)組成之群。於一些實施例中，經遮蔽抗體或抗體或其抗原結合片段以至少0.6 mg/kg之劑量投與。於一些實施例中，藥物組合物以至少每三週一次或至少每兩週一次之頻次投與。
於如上述治療CD47陽性疾病或病症之任一方法之任一者之一些實施例中，該方法還包含向受試者投與有效量之一或多種另外之治療劑。於一些實施例中，一或多種另外治療劑包含病毒基因療法、免疫檢查點抑制劑、靶療法、放射療法、化療或其任意組合。於某些實施例中，一或多種另外治療劑包含鉑美特(pomalyst)、瑞複美(revlimid)、來那度胺(lenalidomide)、泊馬度胺(pomalidomide)、沙利度胺(thalidomide)、DNA烷基化含鉑衍生物、順鉑(cisplatin)、5-氟尿嘧啶、環磷醯胺(cyclophosphamide)、抗CD47抗體、抗CTLA4抗體、抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體、抗CD20抗體、抗CD40抗體、抗DR5抗體、抗CD1d抗體、抗TIM3抗體、抗SLAMF7抗體、抗KIR受體抗體、抗OX40抗體、抗HER2抗體、抗ErbB-2抗體、抗EGFR抗體、西妥昔單抗(cetuximab)、利妥昔單抗(rituximab)、曲妥珠單抗(trastuzumab)、派姆單抗(pembrolizumab)、放射療法、單劑量輻射、分次輻射、焦點輻射、全器官輻射、IL-12、IFNα、GM-CSF、嵌合抗原受體、授受性轉移之T細胞、抗癌疫苗、及溶瘤病毒或其任意組合。
於其他態樣，本文提供一種治療癌症之方法，其包含投與抗CD47可活化抗體，其中抗CD47可活化抗體包含人類IgG1 Fc或具有增強之抗體依賴性細胞毒性(ADCC)活性之IgG1 Fc，其中抗CD47可活化抗體包含包含至少一個裂解位點之可裂解部分(CM)之遮蔽性肽，其中當CM在癌症部位(例如，在腫瘤微環境(TME)中)裂解時，可活化抗體與人類CD47具有更高之結合親和力。
相關申請案之交叉參考
申請主張2021年10月27日申請之國際申請案第PCT/CN2021/126597號之優先權，其以引用方式整體併入本文。
序列表之參考
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以下描述闡述了例示性方法、參數等。然而，應當認識到這種描述並不旨在限制本公開之範圍，而是作為例示性實施例之描述提供。
A. 定義
除非本文另外定義，否則與本揭示案結合使用之科學及技術術語應具有普通熟習此項技術者通常理解之含義。此外，除非上下文另外要求，否則單數術語應包括複數，且複數術語應包括單數。通常，與本文所用之抗體工程化、免疫療法、細胞及組織培養、分子生物學、免疫學、微生物學、遺傳學以及蛋白質及核酸化學結合使用之命名法及技術為此項技術眾所周知且常用之彼等者。
如本文所用，以下各術語在此部分中均具有與它相關聯的含義。
冠詞「一個/種(「a」及「an」)」系指一個/種或多個/種(即指至少一個/種)的所述冠詞的語法賓語。藉由舉例的方式，「元件」意指一個元件或多於一個元件。
術語「胺基酸」系指天然產生及合成胺基酸，以及胺基酸類似物及功能類似於天然產生胺基酸之胺基酸擬似物。天然產生胺基酸為藉由遺傳密碼編碼之彼等，以及後期經修飾之彼等胺基酸，例如，羥基脯胺酸、γ-羧基麩胺酸及O-磷酸絲胺酸。術語「胺基酸類似物」系指具有與天然產生胺基酸相同之基本化學結構但是C端羧基、N端胺基或側鏈官能基已經化學修飾成另一官能基。術語「胺基酸擬似物」系指具有不同於胺基酸之一般化學結構之結構但是功能類似於天然產生胺基酸之化學化合物。如本文中所用，二十種習知胺基酸及其縮略語遵循習知用法。參見例如，Immunology—A Synthesis (第2版，E. S. Golub及D. R. Gren編輯，Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991))。
術語「胺基酸取代」或「胺基酸殘基取代」系指胺基酸序列之一個胺基酸殘基相對於所述參考序列的變化。胺基酸序列可以在該序列任意殘基處相對於所述參考序列具有任意數量的胺基酸取代(例如，1,2,3,4,5或更多)。術語「變體」系指相對於所述胺基酸序列具有一個或多個胺基酸取代之多肽或胺基酸序列。
術語「抗體」在本文中以最廣義使用，且特別涵蓋單株抗體(包括全長單株抗體)、多株抗體、經遮蔽抗體(例如可活化抗體)、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)及抗體片段(例如單鏈可變片段或scFv)，只要它們表現出所要生物活性即可。
術語「抗體」為此項技術公認之術語，且可系指具有由兩個相同重(H)鏈及兩個相同輕(L)鏈組成之基本四多肽鏈結構之抗原結合蛋白(亦即，免疫球蛋白)。每條L鏈藉由一個共價二硫鍵連接至H鏈，而兩條H鏈則根據H鏈同型藉由一或多個二硫鍵彼此連接。每條重鏈在N端具有可變區(本文縮寫為VH)，接著為恒定區。重鏈恒定區包含三個域CH1、CH2及CH3。每個輕鏈在N端具有可變區(在本文中縮寫為VL)，接著在另一端具有恒定區。輕鏈恒定區包含一個域CL。VL與VH對齊，且CL與重鏈之第一個恒定域(CH1)對齊。VH及VL之配對一起形成單個抗原結合位點。IgM抗體由5個基本異四聚體單元連同稱為J鏈之其他多肽組成，且因此含有10個抗原結合位點，而分泌之IgA抗體可以聚合以形成。
如本文所用之術語「超變區」或「HVR」系指抗體可變結構域中在序列上超變之每一區。HVR可形成在結構上經界定之環(「超變環」)。通常，天然四鏈抗體包含六個HVR；三個在VH中(H1、H2、H3)，且三個在VL中(L1、L2、L3)。HVR散佈有更為保守之區域，其稱為構架區(FW)。每個VH及VL包含三個HVR及四個FW，其自胺基端到羧基端按以下順序排列：FW1、HVR1、FW2、HVR2、FW3、HVR3、FW4。HVR通常包含來自超變環及/或來自「互補決定區」(CDR)之胺基酸殘基，CDR具有最高之序列變異性及/或參與抗原識別。例示性超變環出現在胺基酸殘基26-32 (L1)、50-52 (L2)、91-96 (L3)、26-32 (H1)、53-55 (H2)及96-101 (H3)處。(Chothia及Lesk，J.Mol.Biol.196:901-917(1987)。)。例示性CDRs (CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3)出現在L1之胺基酸殘基24-34、L2之50-56、L3之89-97、H1之31-35B、H2之50-65及H3之95-102處。(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991))。除VH中之CDR1外，CDR通常包含形成超變環之胺基酸殘基。CDR亦包含「特異性決定殘基」或「SDR」，其為接觸抗原之殘基。SDR含於CDR中稱為縮短-CDR (abbreviated-CDR)或a-CDR之區內。例示性a-CDR (a-CDR-L1、a-CDR-L2、a-CDR-L3、a-CDR-H1、a-CDR-H2及a-CDR-H3)出現在L1之胺基酸殘基31-34、L2之50-55、L3之89-96、H1之31-35B、H2之50-58及H3之95-102處。(參見Almagro及Fransson，Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008))。
下表1提供根據此項技術中已知之各種演算法之例示性CDR定義。
表1. CDR定義。
1殘基編號遵循Kabat等人，J. Biol. Chem. 252:6609-6616 (1977)；Kabat等人，U.S. Dept. of Health and Human Services, “Sequences of proteins of immunological interest” (1991)之命名法。
2殘基編號遵循Chothia等人，J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)；Al-Lazikani B.等人，J. Mol. Biol., 273: 927-948 (1997)之命名法。
3殘基編號遵循MacCallum等人，J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996)；Abhinandan及Martin，Mol. Immunol., 45: 3832-3839 (2008)之命名法。
4殘基編號遵循Lefranc M.P.等人，Dev. Comp. Immunol., 27: 55-77 (2003)；及Honegger及Plückthun，J. Mol. Biol., 309:657-670 (2001)之命名法。
5殘基編號遵循Honegger及Plückthun，J. Mol. Biol., 309:657-670 (2001)之命名法。
| Kabat1 | Chothia2 | MacCallum3 | IMGT4 | AHo5 | |
| CDR-H1 | 31-35 | 26-32 | 30-35 | 27-38 | 25-40 |
| CDR-H2 | 50-65 | 53-55 | 47-58 | 56-65 | 58-77 |
| CDR-H3 | 95-102 | 96-101 | 93-101 | 105-117 | 109-137 |
| CDR-L1 | 24-34 | 26-32 | 30-36 | 27-38 | 25-40 |
| CDR-L2 | 50-56 | 50-52 | 46-55 | 56-65 | 58-77 |
| CDR-L3 | 89-97 | 91-96 | 89-96 | 105-117 | 109-137 |
重鏈及輕鏈之可變區含有與抗原相互作用之結合域。抗體之恒定區可以介導免疫球蛋白與宿主組織或因數之結合，該等宿主組織或因數包括免疫系統之各種細胞(例如，效應細胞)及經典補體系統之第一組分(Clq)。在輕鏈及重鏈中，可變區及恒定區藉由具有約12個或更多個胺基酸之「J」區連接，其中重鏈亦包括具有約10個或更多胺基酸之「D」區。通常參見Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W.編, 第2版 Raven Press, N.Y. (1989))。
基於其恒定域之胺基酸序列，可以將來自任何脊椎動物物種之L鏈指定為兩種明顯不同之類型之一，分別稱為κ及λ。根據其重鏈恒定域(CH)之胺基酸序列，可以將抗體指定為不同類別或同型。術語「可結晶(Fc)區」系指重鏈恒定區。抗體分為五類：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，其具有分別命名為α、δ、ε、γ及μ之重鏈。抗體之IgG類別可以分別藉由γ重鏈Y1-Y4進一步分為IgG1、IgG2、IgG3及IgG4四個亞類。
術語抗體之「抗原結合片段」或「抗原結合部分」系指抗體之保留與該抗體所結合之抗原(例如，CD47)結合之能力的一或多個部分。抗體之「抗原結合片段」之實例包括：(i) Fab片段，其為由VL、VH、CL及CH1域組成之單價片段；(ii) F(ab')
2片段，其為包含在鉸鏈區藉由二硫橋連接之兩個Fab片段之二價片段；(iii) Fd片段，其由VH及CH1域組成；(iv) Fv片段，其由抗體單臂之VL及VH域組成；(v) dAb片段(Ward等，Nature 341:544-546 (1989))，該片段由VH域組成；(vi)經分離之互補決定區(CDR)。
術語之「經遮蔽抗體」系指抗體或其抗原結合片段包含幹預、阻止、降低(能力)、防止、抑制靶結合部分結合至其靶，或與抗體之靶結合部分(TBM)，或抗原結合片段競爭結合至其靶。經遮蔽抗體可以藉由將遮蔽性肽連接到抗體的TBM或抗原片段來產生。
術語之「可活化抗體」系指經遮蔽抗體或者抗原結合片段在未活化(例如，抑制、經遮蔽及/或未裂解)狀態下對靶表現出之第一結合親和力，並在活化(例如，未抑制、未遮蔽及/或裂解)狀態下對靶表現出第二結合親和力，其中第二結合親和力大於第一結合親和力。可活化抗體可藉由將包含可活化部分(例如，可裂解部分(CM))之遮蔽性肽連接到抗體之靶結合部分(TBM)或其抗原結合片段來產生。可活化抗體已描述於例如美國專利公開第2019/0241886號及美國專利公開第2021/0207126號中，該專利以引用方式整體併入本文。
術語之「靶結合部分(TBM)」系指抗體之抗原結合部分之結構部分，它與抗體之靶抗原結合。TBM可以包含VH及VL，諸如本文所用之任何VH或VL的任何組合。
術語「遮蔽性肽」系指經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)之結構部分，其抑制TBM與其靶抗原結合，並且通常自N端至C端包含遮蔽性部分(MM)及連接部分(LM)。遮蔽性肽之C端通常與經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)之VH或VL之N端相連。於一些實施例中，遮蔽性肽或其一部分幹擾或抑制TBM與其靶之結合如此有效使得TBM與其靶結合極低及/或在檢測限以下(例如，於ELISA或流動式細胞量測術檢定中不可檢測結合)。本文所用之經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)可以包含一個或多個連接體，例如，在LM內、置於MM及LM之間、LM及VH或VL之間或VH及Fc鉸鏈區之間。
遮蔽性肽之LM可以包含可裂解部分(CM)。該CM一般包含可裂解之胺基酸序列，例如，用作能形成可還原二硫鍵之酵素及/或半胱胺酸-半胱胺酸對之受質。因而，當術語「裂解」、「可裂解」、「經裂解」及類似者結合CM使用時，該等術語涵蓋例如藉由蛋白酶之酶促裂解，以及半胱胺酸-半胱胺酸對之間之二硫鍵經由可由暴露於還原劑產生之二硫鍵之還原之中斷。該CM之胺基酸序列可與該MM重迭或包含於該MM內。可活化抗體可以包含配置為介導抗體活化之CM。例如，當可活化抗體之CM為完整時(例如，未藉由對應酵素裂解，及/或含有未經還原之半胱胺酸-半胱胺酸二硫鍵)，該遮蔽性肽或其一部分可能幹預或抑制TBM結合至其靶。
術語「遮蔽效率」系指遮蔽性肽抑制TBM與靶抗原結合之效率。遮蔽效率可以藉由具有TBM及遮蔽性肽之經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)相對於具有相同TBM但缺乏遮蔽性肽之對應之未經遮蔽抗體(「親本抗體」)之特性(例如，與靶抗原之結合親和力)或活性(例如，阻斷靶抗原與配體之結合)之差異或比率來量測。在可活化抗體中，遮蔽效率可以藉由具有TBM及遮蔽性肽之可活化抗體的未活化狀態(例如，抑制、遮蔽及/或未裂解)相對於其活化狀態(例如，未抑制、未遮蔽及/或裂解)的特性(例如，與靶抗原之結合親和力)或活性(例如，阻斷靶抗原與配體之結合)，或相對於具有相同TBM但缺乏遮蔽性肽之親本抗體之差異或比率來量測。例如，遮蔽效率可以藉由可活化抗體之未活化狀態(例如，抑制、遮蔽及/或未裂解)與靶抗原結合之EC50除以可活化抗體之活化狀態(例如，未抑制、未遮蔽及/或裂解)與靶抗原結合之EC50或K
D，或親本抗體與靶抗原結合之的EC50或K
D來量測。可以藉由ELISA量測EC50值，例如實例5所述，或藉由Jurkat NFAT報告子分析測定，例如美國專利公開第US20210207126 A1號所述。K
D值可以藉由，例如，使用本文所用系統之一的藉由表面電漿子共振量測。
術語「抗體衍生物」或抗體之「衍生物」系指能結合至與抗體結合相同抗原(例如，CD47)且包含連接至另外分子實體之抗體之胺基酸序列的分子。含於抗體衍生物中之抗體之胺基酸序列可為全長重鏈、全長輕鏈、全長重鏈之任何部分、抗體之全長輕鏈之任何部分、抗體之任何其他片段、或完整抗體。另外分子實體可為化學或生物分子。另外分子實體之實例包括化學基團、胺基酸、肽、蛋白質(諸如酵素、抗體)及化學化合物。另外分子實體可具有任何效用，諸如用作檢測劑、標籤、標記、藥劑或治療劑。抗體之胺基酸序列可藉由化學偶合、基因融合、非共價締合或其他方式附接或連接至另外分子實體。術語「抗體衍生物」亦涵蓋嵌合抗體、人源化抗體及衍生自CD47抗體之胺基酸序列之修飾(諸如保守胺基酸取代、新增及插入)之分子。
術語「結合分子」涵蓋(1)抗體、(2)抗體之抗原結合片段、(3)經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)及(4)抗體之衍生物，其各自如本文所定義。
術語「結合CD47 (binding CD47/binds CD47)」或「與CD47結合(binding to CD47/binds to CD47)」系指在活體外檢定(例如實施例2中描述之Octet® RED96檢定)中結合分子(例如，抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如可活化抗體))以100 nM或更低的親和力(K
D)與人類CD47之結合。
術語「CD47」及「CD47受體」在本申請案中可互換使用，且包括人類CD47受體及其變異體、同功型及物種同源物。因此，結合分子(例如，抗體、抗原結合片段及經遮蔽抗體(諸如可活化抗體))亦可以結合除人以外之物種的CD47。於其他情況下，結合分子(例如，抗體、抗原結合片段及經遮蔽抗體(諸如可活化抗體))可能對人類CD47具有完全特異性，且可能不表現出物種或其他類型之交叉反應性。術語「CD47-ECD」系指CD47細胞外域。
術語「CD47」在本申請案中使用且包含人類CD47 (例如UniProt寄存編號Q08722；NCBI寄存編號NP_001768)，以及其變異體、同工異型物及物種同源物(例如，小鼠CD47 (UniProt寄存編號Q61735；NCBI寄存編號NP_034711)、大鼠CD47 (UniProt寄存編號P97829；NCBI寄存編號NP_062068)、狗CD47 (UniProt寄存編號F1P6D7)、食蟹猴CD47 (UniProt寄存編號G7NZR3；NCBI寄存編號XP_005548289)、恒河猴(NCBI寄存編號NP_001253446)等)。因此，結合分子(例如，抗體、抗原結合片段及經遮蔽抗體(諸如可活化抗體))亦可結合來自除了人類外之物種之CD47。於其他情況下，結合分子可對人類CD47完全特異性且可不展示物種或其他類型之交叉反應性。
術語「SIRPα」在本申請案中使用且包含人類SIRPα (例如UniProt寄存編號P78324)，以及其變異體、同工異型物及物種同源物(例如，小鼠SIRPα (UniProt寄存編號P97797)、大鼠SIRPα (UniProt寄存編號P97710)、狗SIRPα (UniProt寄存編號F1PK00)、食蟹猴SIRPα (NCBI寄存編號NP_001271679)等)。因此，結合分子(例如，抗體、抗原結合片段及經遮蔽抗體(諸如可活化抗體))亦可阻斷CD47來自除人類以外的物種與SIRPα來自除人類以外的物種之結合。於其他情況下，結合分子可對人類CD47與人類SIRPα相互作用完全特異性且可不展示物種或其他類型之交叉反應性。
術語「CD47抗體」或「抗CD47抗體」系指如本文所定義之能夠結合人類CD47受體之抗體。
術語「嵌合抗體」系指包含衍生自不同動物物種之胺基酸序列之抗體，諸如具有衍生自人抗體之可變區及鼠類免疫球蛋白恒定區之彼等抗體。
術語「競爭結合」系指兩種抗體在其與結合靶結合時之相互作用。若第一抗體與其同源表位之結合在第二抗體存在下與第一抗體在、第二抗體不存在下之結合相比可偵測地降低，則第一抗體與第二抗體競爭結合。第二抗體與其表位之結合在第一抗體存在下亦可偵測地降低之替代情形可能如此但並非一定如此。亦即，第一抗體可以抑制第二抗體與其表位之結合，而第二抗體不會抑制第一抗體與其相應表位之結合。但是，在各抗體可偵測地抑制另一種抗體與其同源表位之結合時，無論其程度相同或更大或更小均認為該等抗體相互「交叉競爭」結合其相應表位。
術語「表位」系指與抗體(或其抗原結合片段)結合之抗原之一部分。表位可以由藉由蛋白質之三級折迭並列之連續胺基酸或非連續胺基酸形成。由連續胺基酸形成之表位通常在暴露於變性溶劑時保留，而藉由三級折迭形成之表位通常在用變性溶劑處理時喪失。表位可以包括處於獨特空間構型中之不同數目的胺基酸。確定表位之空間構型之方法包括例如X射線晶體學、二維核磁共振、氘及氫交換結合質譜法、或定點誘變、或與抗原及其與其結合抗體及其變異體之複合物結構之計算模型結合使用之所有方法。參見例如Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, 第66卷, G. E. Morris編(1996)。一旦確定抗原之所要表位，即可以例如使用本文所用之技術產生針對該表位之抗體。抗體之產生及表徵亦可以闡明有關所需表位之資訊。由該資訊，然後可以競爭性地篩選結合相同表位之抗體。達成此目的之方法進行交叉競爭研究，以發現彼此競爭結合之抗體，亦即，競爭結合抗原之抗體。在PCT公開案第WO 03/48731號中描述了用於基於抗體之交叉競爭來對抗體「分組」之高通量方法。
術語「糖基化位點」系指藉由真核細胞識別為糖殘基之連接位置之胺基酸殘基。在碳水化合物(諸如寡糖)之情況下連接之胺基酸通常為天冬醯胺(N-鍵聯)、絲胺酸(O-鍵聯)及蘇胺酸(O-鍵聯)殘基。特定連接位點通常藉由胺基酸序列(本文中稱作「糖基化位點序列」)信號傳導。用於N-連接之糖基化之糖基化位點序列為：-Asn-X-Ser-或-Asn-X-Thr-，其中X可為習知胺基酸中之任一者，除了脯胺酸。術語「N-連接」及「O-連接」系指用作糖分子與胺基酸殘基之間之連接位點之化學基團。N-連接之糖藉由胺基連接；O-連接之糖藉由羥基連接。術語「多醣佔用」系指連接至糖基化位點之碳水化合物部分之存在(即，佔用多醣位點)。在多肽上存在至少兩個潛在糖基化位點之情況下，無(0-多醣位點佔用)、一個(1-多醣位點佔用)或兩個(2-多醣位點佔用)位點可由碳水化合物部分佔用。
術語「宿主細胞」系指可工程改造以產生所關注蛋白質、蛋白質片段或肽之細胞系統。宿主細胞包括(不限於)經培養細胞，例如，源自囓齒動物(例如，大鼠、小鼠、豚鼠或倉鼠)之哺乳動物培養細胞，諸如CHO、BHK、NSO、SP2/0、YB2/0；或人類組織或雜交瘤細胞、酵母細胞、昆蟲細胞、及包含於轉殖基因動物或經培養組織內之細胞。術語不僅涵蓋特定受試者細胞，而且涵蓋此細胞之後代。因為某些修飾可發生於後代中，由於突變或環境影響，此後代可不與親本細胞相同，但是仍包含於術語「宿主細胞」之範圍內。
術語「人抗體」系指其中輕鏈及重鏈之全部胺基酸序列均來自人免疫球蛋白基因之抗體。人抗體若在小鼠類、小鼠細胞或衍生自小鼠細胞之融合瘤中產生，則可含有鼠類碳水化合物鏈。人抗體可以此項技術中已知之多種方式製備。
術語「人源化抗體」系指含有衍生自人抗體序列之胺基酸殘基之嵌合抗體。人源化抗體可含有來自非人動物或合成抗體之一些或全部CDR或HVR，而抗體之構架區及恒定區則含有衍生自人抗體序列之胺基酸殘基。
術語「說明性抗體」或「例示性抗體」系指本發明中所述及如表3A-6中所列之彼等所指定之抗體、經遮蔽抗體(例如可活化抗體)及抗原結合片段中之任一者。此等抗體可為任何類別(例如，IgA、IgD、IgE、IgG及IgM)。因此，以上所識別之各抗體涵蓋具有VL及VH區之相同胺基酸序列之所有五類抗體。此外，IgG類別之抗體可為任何子類別(例如，IgG1、IgG2、IgG3及IgG4)。因此，以上於IgG子類別中所識別之各抗體涵蓋具有VL及VH區之相同胺基酸序列之所有四種子類別之抗體。五類以及四種IgG子類別之人類抗體之重鏈恒定區之胺基酸序列系此項技術中已知。本發明中提供了表6所示之每個說明性抗體之IgG4及IgG1亞類的全長重鏈及輕鏈的胺基酸序列。
術語「經分離之抗體」或「經分離之結合分子」系指如本文所定義之抗體或結合分子，其：(1)不與在天然狀態下伴隨之天然締合組分締合；(2)不含來自相同物種之其他蛋白質；(3)由來自不同物種之細胞表現；或(4)不存在於自然界中。經分離之抗體之實例包括已使用CD47親和純化之CD47抗體、已藉由融合瘤或其他細胞系在活體外產生之CD47抗體、及源自轉基因動物之CD47抗體。
術語「經分離之核酸」或「經分離之核酸」系指基因組、cDNA或合成來源、或其組合來源之核酸分子或核酸，與存在於天然核酸來源中之其他核酸分子核酸分離。例如，關於基因組DNA，術語「經分離」包括與及基因組DNA天然締合之染色體分離之核酸分子或核酸。較佳地，「經分離」核酸或核酸不含天然位於核酸或核酸側翼之序列(亦即，位於感興趣核酸之5'及3'末端之序列。
術語「k
a」系指特定結合分子-抗原相互作用之締合速率常數，其中術語「k
d」系指特定結合分子-抗原相互作用之解離速率常數。
術語「K
D」系指特定抗體-抗原相互作用之平衡解離常數。其自k
d與k
a之比率(即，k
d/k
a)獲得且表示為莫耳濃度(M)。K
D系用作抗體結合至其結合搭檔之親和力之量度。K
D越小，抗體結合越緊密，或抗體與抗原之間之親和力越高。例如，具有奈莫耳(nM)解離常數之抗體較具有微莫耳(μM)解離常數之抗體與特定抗原結合更緊密(例如，有更高之結合親和力)。可使用此項技術中良好建立之方法測定抗體之K
D值。一種測定抗體之K
D之方法為藉由使用表面電漿子共振，通常使用生物感測器系統，諸如Biacore®系統或Octet® RED96系統。使用或Octet® RED96系統之檢定程式述於本發明之實例中。
如本文所用，術語「受試者」、「患者」及「個體」可互換使用，且可系指人類或非人類動物。於一些實例中，「受試者」、「患者」或「個體」指因疾病或失調需要治療的受試者、患者或個體。「非人類動物」且可系指任何不屬於人類的動物，如家養動物、農場動物或動物園動物、運動動物、寵物動物(如狗、馬、貓、牛等)，以及用於研究的動物。研究動物且可系指但不限於線蟲、節肢動物、脊椎動物、哺乳動物、青蛙、齧齒動物(例如，小鼠或大鼠)、魚類(例如，斑馬魚或河豚魚)、鳥類(例如，雞)、狗、貓及非人類靈長類動物(例如，恒河猴、食蟹猴、黑猩猩等)。於一些實施例中，受試者、患者或個體系人類。
關於哺乳動物之某種疾病病狀之術語「預防(prevent/preventing)」系指預防或延遲該疾病之發作，或預防其臨床或亞臨床症狀之表現。
如本文所用，兩個多肽序列之間之「序列同一性」表示序列之間相同的胺基酸之百分比。多肽之胺基酸序列同一性可以習知地使用已知電腦程式(例如Bestfit、FASTA或BLAST)來確定(參見例如Pearson, Methods Enzymol. 183:63-98 (1990)；Pearson, Methods Mol. Biol. 132:185-219 (2000)；Altschul等人, J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)；Altschul等人, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997))。當使用Bestfit或任何其他序列比對程式確定特定序列是否與參考胺基酸序列例如具有95%同一性時，應設置參數，以便在參考胺基酸序列之全長範圍內計算同一性百分比，且允許參考序列中胺基酸殘基總數之多至5%同源性之間隙。確定多肽之間同一性百分比之上述方法適用於本文揭示之所有蛋白質、片段或其變異體。
關於哺乳動物中之某種疾病狀況，術語「治療(「treat/treating/treatment」)」系指在患有該疾病狀況之哺乳動物中引起期望或有益之作用。理想或有益之作用可包括降低疾病之一或多種症狀(亦即腫瘤之生長及/或轉移或免疫細胞之數目及/或活性介導之其他作用等)之頻率或嚴重性，或阻止或抑制疾病、病狀或病症之進一步發展。在治療哺乳動物癌症的情況下，期望或有益之作用可包括抑制癌細胞之進一步生長或擴散、癌細胞之死亡、抑制癌症之復發、減輕與癌症相關之疼痛或改善哺乳動物之存活。作用可為主觀或客觀的。例如，若哺乳動物為人，則人可以注意到活力或生命力改善或作為改善或對治療起反應之主觀症狀之疼痛減輕。或者，臨床醫生可基於體格檢查、實驗室參數、腫瘤標誌物或影像學檢查來發現腫瘤大小或腫瘤負荷減少。臨床醫生可觀測到之對治療起反應之一些實驗室體征包括測試正常化，例如白血球計數、紅血球計數、血小板計數、紅血球沉降率及各種酶水準。另外，臨床醫生可觀測到可偵測腫瘤標誌物之減少。或者，可以使用其他測試來評估客觀改善，例如聲波記錄、核磁共振測試及正電子發射測試。
術語「CD47陽性疾病」或「CD47陽性病狀」系指涉及一個或多個細胞CD47表達、數量、活性或功能異常的疾病或病狀，及/或可以藉由調節CD47與其一個或多個結合配偶體之結合來治療。例如，與健康組織相比，CD47陽性疾病包括以腫瘤表達高水準的CD47為特徵的癌症，並且可以藉由抑制CD47與其結合配偶體之一(如SIRPα)之結合來治療。本文提供了示範性CD47-陽性的癌症。CD47-陽性的癌症包括但不限於淋巴瘤(如彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)及淋巴樣腫瘤彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBC))、白血病(如急性髓系白血病(AML))、頭頸部癌(如頭頸部鱗狀細胞癌(HNSC))、胃癌(如胃癌(GC)及HER2+胃食道交界癌(GEJ))、乳癌(如乳腺浸潤性癌(BRCA)、HER2+乳癌、激素受體陽性乳癌及三陰性乳癌(TNBC))、宮頸癌(如宮頸鱗狀細胞癌及宮頸內腺癌(CESC))、膽管癌(CHOL)、結腸癌(如結腸腺癌(COAD))、卵巢癌(如卵巢漿液性囊腺癌(OV))、甲狀腺癌(如甲狀腺癌(THCA))、子宮癌(如子宮肌體子宮內膜癌(UCEC))、子宮內膜癌、肺癌(如肺腺癌(LUAD)、肺鱗狀細胞癌(LUSC)及小細胞肺癌(SCLC))、間皮瘤(MESO)及胰腺癌(如胰腺腺癌(PAAD))。
術語「載體」系指能轉運外來核酸分子之核酸分子。外來核酸分子藉由重組技術(諸如連接或重組)連接至載體核酸分子。此允許外來核酸分子被操作、選擇、於宿主細胞或生物體中進一步操作或表現。載體可為質粒、噬菌體、轉位子、黏粒、染色體、病毒或病毒子。可在引入宿主細胞後將一種載體融合至宿主細胞之基因組，及從而連同宿主基因組(例如，非表小體哺乳動物載體)複製。另一種載體能於引入其之宿主細胞中自發複製(例如，具有複製之細菌來源之細菌載體及表小體哺乳動物載體)。能指導以可操作方式連接其之可表現外來核酸之表現之另一特定類型之載體通常被稱作「表現載體」。表現載體一般具有驅動可表現外來核酸之表現之控制序列。稱作「轉錄載體」之更簡單載體僅能被轉錄但是不能被轉譯：其可於靶細胞中複製但是不可表現。術語「載體」涵蓋所有類型之載體，不管其功能。能指導以可操作方式連接其之可表現核酸之表現之載體通常被稱作「表現載體」。
除非另外指出，否則本揭示案之方法及技術通常根據此項技術眾所周知且如本說明書通篇所引用及討論之各種一般及更具體之參考文獻中所述之方法來進行。此類參考文獻包括例如Sambrook及Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Approach, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001)；Ausubel 等人, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (2002)；及Harlow及Lane Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990)。酶促反應及純化技術根據製造商之說明書來進行，如此項技術通常完成或如本文所用。本文所用之與分析化學、合成有機化學以及藥物及醫藥化學結合使用之術語以及分析化學、合成有機化學以及藥物及醫藥化學之實驗室程式及技術為此項技術中眾所周知且常用的。標準技術用於化學合成、化學分析、醫藥製備、調配、遞送及患者治療。
B. 結合人類CD47抗體、抗原結合片段及經遮蔽抗體
本揭示案提供了與人類CD47結合之經分離之結合分子(例如，抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體))，包括CD47抗體、可活化CD47抗體、CD47抗體之抗原結合片段及CD47抗體之衍生物。於一些實施例中，結合分子為本文所用之任何抗體、經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)及抗原結合片段，包括抗體、經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)及參照表位結合所描述之抗原結合片段以及關於CDRs、可變區(VL、VH)以及IgG (例如，IgG1及IgG4)輕鏈及重鏈的具體胺基酸序列所描述之抗體。於一些實施例中，本發明涉及與人類CD47結合之抗體、抗原結合片段及經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)具有至少一種(例如，至少一種、至少兩種、至少三種、至少四種、至少五種或全部六種)以下功能特性：(a)以500 nm或更低之K
D與人類CD47結合；(b)與猴、大鼠或狗CD47交叉反應；(c)能夠抑制腫瘤細胞生長；(d)對癌症有治療作用；(e)阻斷CD47及SIRP蛋白之間之結合(例如，SIRPα)；且(f)引起表現CD47之腫瘤細胞之抗體依賴性細胞毒性(ADCC)及/或抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)。於一些實施例中，本文公開之抗體、抗原結合片段及經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)還可以阻斷，例如，完全阻斷CD47與其配體SIRPα之間之結合。本文還提供了一種或多種抗CD47抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)與本文所用之一種或多種抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)交叉競爭結合人類CD47。
於一些實施例中，當表現人類CD47之細胞(例如，人類細胞)與抗體或抗原結合片段接觸時，抗體，抗原結合片段或遮蔽抗體(例如，可活化抗體)改變(例如，抑制或增強)一種或多種(例如，一種或多種，兩種或多種，三種或更多種等)人類CD47的活性。此項技術中已知多種CD47活性，可包括但不限於免疫細胞(如巨噬細胞)對抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)之抑制；藉由自然殺手(NK)細胞抑制ADCC；以及細胞-細胞融合、T細胞活化、T細胞增殖、細胞凋亡、細胞增殖、細胞存活及細胞粘附的刺激(Sick等人. “CD47 update: a multifaceted actor in the tumor microenvironment of potential therapeutic interest.” Br J Pharmacol. 2012; 167(7):1415-1430)。於一些實施例中，一種或多種CD47活性並非CD47與其配體(例如SIRPα)結合。測定CD47活性(例如，抑制吞噬作用，抑制ADCC等)之方法系此項技術中已知的，包括例如下文實例9及10中描述之方法。
於一些實施例中，本文所用之抗體，抗原結合片段及遮蔽抗體(例如，可活化抗體)具有增強抗體依賴性細胞毒性(ADCC)及/或抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)之功能。測定抗體及抗原結合片段ADCC之方法在此項技術中系已知的。為評價所關注分子的活體外ADCC活性，非限制性實例在美國專利第5,500,362號(參見例如，Hellstrom, I. 等人. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986))及Hellstrom, I. 等人., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82: 1499-1502 (1985)；第5,821,337號美國專利(參見Bruggemann, M. 等人, J. Exp. Med. 166: 1351-1361 (1987))中描述。或者，也可以採用非放射性測定方法(參見例如，ACTI™ non-radioactive cytotoxicity assay for flow cytometry用於流式細胞計量術的非放射性細胞毒性測定(Cell Technology, Inc. Mountain View, Calif及CytoTox 96™非放射性細胞毒性測定(Promega, Madison, Wis.)。用於此類測定之有用效應細胞包括外周血單個核細胞(PBMC)及自然殺傷細胞(NK)。或者，或另外，可以在活體內評估關注分子之ADCC活性，例如Clynes等人. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998)中公開的動物模型。可以測定ADCC對腫瘤細胞殺傷之貢獻，例如，使用經高親和力FcR轉染之NK-92細胞的特定測試。結果與野生型不表達FcR之NK-92細胞進行比較。或者，或另外，可以在活體內評估關注分子之ADCC活性，例如Clynes等人. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998)中公開的動物模型。測定抗體及抗原結合片段ADCC之方法包括，例如，下文實例10中描述之方法。測定抗體及抗原結合片段ADCP之方法在此項技術中也系已知的。例如，為了評估關注分子之ADCP活性，可以進行活體外ADCP測定(參見例如Bracher等人., 2007, J. Immunol. Methods 323:160-71)。有用之吞噬細胞包括外周血單個核細胞(PBMC)、從PBMC純化的單核細胞或分化為單核型的U937細胞。或者，或另外，也可以在活體內評估關注分子之ADCP活性，例如，在動物模型中(參見例如Wallace 等人., 2001, J. Immunol. Methods 248:167-82)。)。測定抗體及抗原結合片段ADCP的方法包括，例如，下文實例9中描述之方法。
於一些實施例中，抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)在活體外不引起紅血球(RBCs) (例如，人類紅血球)凝集(例如，聚類)。於某些實施例中，當以高達約50 nM、高達約100 nM、高達約500 nM、高達約1000 nM或高達約5000 nM之濃度提供抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)時，在活體外不引起人類紅血球凝集。
於一些實施例中，抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)對癌症具有治療作用。於一些實施例中，抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)減少癌症之一或多種體征或症狀。於一些實施例中，當投與抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)時，患有癌症之受試者進入部分或完全回應。於一些實施例中，癌症包含B細胞淋巴瘤，T細胞淋巴瘤或其任何組合。於某些實施例中，癌症系B細胞淋巴瘤。於其它實施例中，癌症為T細胞淋巴瘤。於一些實施例中，癌症為淋巴瘤(例如，彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)及淋巴樣腫瘤彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBC))、白血病(例如，急性髓系細胞白血病(AML))、頭頸癌(例如，頭頸部鱗狀細胞癌(HNSC))、胃癌(例如，胃癌(GC)及HER2+胃食管結合(GEJ)癌症)、乳癌(例如，乳癌(BRCA)、HER2+乳癌、激素受體陽性乳癌及三陰性乳癌(TNBC))、宮頸癌(例如，宮頸鱗癌及內宮頸內膜癌(CEC))、膽管癌(CHOL)、結腸癌(例如，結腸腺癌(COAD))、卵巢癌(例如，卵巢漿液性囊腺癌(OV))、甲狀腺癌(例如甲狀腺癌(THCA))、子宮癌(例如子宮內膜癌(UCEC))、子宮內膜癌、肺癌(例如肺腺癌(LUAD)、肺鱗癌(LUSC)及小細胞肺癌(SCLC))、間皮瘤(MESO)或胰腺癌(例如胰腺腺癌(PAAD))。
於一些實施例中，抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)與人類CD47之結合表位不同於其它抗體。於一些實施例中，抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)與人類CD47之不同表位之結合導致抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)以順式構型而非反式構型與人類CD47結合。於一些實施例中，抗體，抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化的抗體)與順式構型之人類CD47不同表位之結合導致比反式構型結合人類CD47之抗體表現出更低之紅血球凝集。於某些實施例中，經遮蔽抗體與選自由人類CD47之K39、W40、K41、F50、D51、G52、T99、E100、L101及T102組成之群的1、2、3、4、5、6、7、8、9或全部10個胺基酸殘基結合。於某些實施例中，其可與前述實施例組合，經遮蔽抗體不與選自由人類CD47之L2、L3、F4、K6、N27、E29、A30、Q31、T34、E35、V36、Y37、D46、T49、A53、E97、R103、E104、G105及E106組成之群的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或全部20個胺基酸殘基結合。於某些實施例中，經遮蔽抗體與人類CD47之K39、W40、K41、F50、D51、G52、T99、E100、L101及T102胺基酸殘基結合，並且不與人類CD47之L2、L3、F4、K6、N27、E29、A30、Q31、T34、E35、V36、Y37、D46、T49、A53、E97、R103、E104、G105及E106胺基酸殘基中之任一個結合。
於另一個態樣，本申請案提供了與本申請案之任何說明性抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)競爭或交叉競爭結合人類CD47之經分離之抗體，例如TY25031、TY25034、TY25040、TY21446、TY21447、TY26294 (當CM裂解時)、TY26896、TY26897、TY26898 (當CM裂解時)及TY26899 (當CM裂解時)。於特定實施例中，本申請案提供了經分離之抗體，該經分離之抗體與本申請案之任何說明性抗體競爭或交叉競爭結合人類CD47之相同表位。抗體與另一種抗體競爭或交叉競爭結合之能力可以使用此項技術中已知之標準結合檢定法，例如BIAcore分析、ELISA檢定法或流動式細胞量測術來確定。例如，可以使本揭示案之說明性抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)在飽及條件下結合人類CD47，且然後量測測試抗體結合CD47之能力。若測試抗體能夠與說明性抗體同時結合CD47，則測試抗體與說明性抗體結合不同表位。然而，若測試抗體不能同時結合CD47，則測試抗體結合相同表位、重迭表位或與由說明性抗體結合之表位鄰近之表位。此實驗可以使用多種方法，例如ELISA、RIA、FACS或表面電漿子共振來進行。
於一個態樣，本揭示案提供具有特定互補決定區(CDRs)之經分離之抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)。所述經分離之抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)可以包含本文所用之任何CDRs中之一個或多個(例如，一個，兩個，三個，四個，五個或六個)之任一組合。
於一些實施例中，經分離之抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)包含抗體重鏈可變區(VH)、抗體輕鏈可變區(VL)或兩者。於一些實施例中，VH包含第一互補決定區(CDR-H1)，第二互補決定區(CDR-H2)及第三互補決定區(CDR-H3)。
於一些實施例中，CDR-H1包含根據式(I)：X1YX2IH (SEQ ID NO: 182)之胺基酸序列，其中X1為D、G、N、R或S，且X2為A、G或W。
於一些實施例中，CDR-H1包含根據式(II)：SGX1X2WX3 (SEQ ID NO: 183)之胺基酸序列，其中X1及X2分別為獨立的H或Y，X3為D、G、N、S或T。
於一些實施例中，CDR-H2包含根據式(III)：X1IX2X3X4GX5X6X7YX8PSLKS (SEQ ID NO: 184)之胺基酸序列，其中X1為A、E或R，X2為S或Y，X3為H、W或Y，X4為D或S，X5為D、N或S，X6為K或T，X7為R或Y，且X8為N或S。
於一些實施例中，CDR-H2包含根據式(IV)：X1IX2X3X4X5X6X7X8X9YAX10X11X12X13G (SEQ ID NO: 185)之胺基酸序列，其中X1為A、G、I、R或 W，X2為I、N、S或Y，X3為G或P，X4為A、N、S或V，X5為F、G或S，X6為G或S，X7為G、S或T，X8為A、P或T，X9為K、N或Y，X10為D或Q，X11為K或S，X12為F或V，且X13為K或Q。
於一些實施例中，CDR-H3包含根據式(V)：X1X2X3X4X5X6FX7X8 (SEQ ID NO: 186)之胺基酸序列，其中X1為Q、R、S或Y，X2為G、R、V或Y，X3為G、H、I、P或Y，X4為A、G、L或Y，X5為A、G、P或Y，X6為A、D、G、R、S或V，X7為A或D，且X8為V或Y。
於一些實施例中，CDR-H3包含根據式(VI)：X1X2X3GX4X5X6X7DX8 (SEQ ID NO: 187)之胺基酸序列，其中X1及X4分別為獨立的G或Y，X2為A或G，X3為R或Y，X5及X6分別為獨立的A或Y，X7為F或L，且X8為V或Y。
於一些實施例中，CDR-H3包含根據式(VII)：X1X2X3X4X5X6GX7FDX8 (SEQ ID NO: 188)之胺基酸序列，其中X1為G或R，X2為G或V，X3為R或S，X4為G或Y，X5為G或S，X6為F或Y，X7為A或W，且X8為V或Y。
於一些實施例中，CDR-H3包含根據式(VIII)：X1X2X3X4X5X6SX7X8YDX9FDX10 (SEQ ID NO: 189)之胺基酸序列，其中X1為D或H，X2為R或Y，X3為A或L，X4為F或P，X5及X9分別為獨立的A或G，X6為G或S，X7為G或T，X8為S或Y，且X10為I或Y。
於一些實施例中，CDR-L1包含根據式(IX)：SASSX1VX2YX3Y (SEQ ID NO: 190)之胺基酸序列，其中X1為R或S，X2為G、S或T，且X3為I或V。
於一些實施例中，CDR-L1包含根據式(X)：RASQX1IX2X3X4LX5 (SEQ ID NO: 191)之胺基酸序列，其中X1為G或T、X2為G或S、X3為R或S、X4為V或Y，且X5為A或N。
於一些實施例中，CDR-L1包含根據式(XI)：RASQX1VX2X3RX4LA (SEQ ID NO: 192)之胺基酸序列，其中X1為S或T，X2為I或R，X3為G或S，且X4為L或Y。
於一些實施例中，CDR-L1包含根據式(XII)：RASX1SVDFX2GX3SFLX4 (SEQ ID NO: 193)之胺基酸序列，其中X1為E或Q，X2為H、V或Y，X3為F、I或K，且X4為A、D或H。
於一些實施例中，CDR-L2包含根據式(XIII)：X1ASX2X3X4X5 (SEQ ID NO: 194)之胺基酸序列，其中X1為A或D，X2為N、S或T，X3為L或R，X4為A、E或Q，且X5為S或T。
於一些實施例中，CDR-L3包含根據式(XIV)：X1QX2X3X4X5PX6T (SEQ ID NO: 195)之胺基酸序列，其中X1為A、H、Q或V，X2為A、G、R、S或Y，X3為G、I、L、S、T或Y，X4為A、E、P、Q、R、S、T或Y，X5為A、I、L、S、T或W，且X6為F、H、L、W或Y。
於一些實施例中，CDR-L3包含根據式(XV)：QX1YX2SX3PX4X5X6T (SEQ ID NO: 196)之胺基酸序列，其中X1為H或Q，X2為A、T或V，X3為S或W，X4為P或R，X5為G或V，且X6為F或Y。
於一些實施例中，經分離之抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)包含一個或多個(例如，一個，兩個，三個，四個，五個或六個) CDRs，所述CDRs之胺基酸序列選自由SEQ ID NO: 182-196組成之群。於一些實施例中，經分離之抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)包含兩個或多個(例如，兩個，三個，四個，五個或六個) CDRs，所述CDRs之胺基酸序列選自由SEQ ID NO: 182-196組成之群。
於一些實施例中，經分離之抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)包含VH及VL。於一些實施例中，VH包含CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3。於一些實施例中，CDR-H1包含SEQ ID NO: 182或183之胺基酸序列。於一些實施例中，CDR-H2包含SEQ ID NO: 184或185之胺基酸序列。於一些實施例中，CDR-H3包含選自由SEQ ID NOs: 186-189組成之群中之胺基酸序列。於某些實施例中，所述VL包含CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3。於一些實施例中，CDR-L1包含選自由SEQ ID NOs: 190-193組成之群中之胺基酸序列。於一些實施例中，CDR-L2包含SEQ ID NO: 194之胺基酸序列。於一些實施例中，CDR-L3包含SEQ ID NO: 195或196之胺基酸序列。
於一些實施例中，經分離之抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)可以包含包含胺基酸序列為SEQ ID NO: 182或183之CDR-H1；胺基酸序列為SEQ ID NO: 184或185之CDR-H2；胺基酸序列選自由SEQ ID NOs: 186-189組成之群之CDR-H3；胺基酸序列選自由SEQ ID NOs: 190-193組成之群之CDR-L1；胺基酸序列為SEQ ID NO: 194之CDR-L2；及/或胺基酸序列為SEQ ID NO: 195或196之CDR-L3。
於一些實施例中，經分離之抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)包含VH及VL，其中1)所述VH包含CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，其中CDR-H1包含SEQ ID NO: 182或183之胺基酸序列；CDR-H2包含選自由SEQ ID NO: 184或185組成之群之胺基酸序列；及/或CDR-H3包含選自由SEQ ID NOs: 186-189組成之群之胺基酸序列；及/或2)所述VL包含CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3，CDR-L1包含選自由SEQ ID NOs: 190-193組成之群之胺基酸序列；CDR-L2包含SEQ ID NO: 194之胺基酸序列；及/或CDR-L3包含SEQ ID NO: 195或196之胺基酸序列。
於某些實施例中，經分離之抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)包含VH及VL，其中1)所述VH包含包含SEQ ID NO: 182之胺基酸序列之CDR-H1；包含SEQ ID NO: 185之胺基酸序列之CDR-H2；及/或包含SEQ ID NO: 188之胺基酸序列之CDR-H3；及/或b)所述VL包含包含SEQ ID NO: 191之胺基酸序列之CDR-L1；包含SEQ ID NO: 194之胺基酸序列之CDR-L2；及/或包含SEQ ID NO: 195之胺基酸序列之CDR-L3。於一個實施例中，經分離之抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)包含VH及VL，其中1)所述VH包含包含SEQ ID NO: 182胺基酸序列之CDR-H1、包含SEQ ID NO: 185胺基酸序列之CDR-H2及包含SEQ ID NO: 188胺基酸序列之CDR-H3；以及b)所述VL包含包含SEQ ID NO: 191之胺基酸序列之CDR-L1、包含SEQ ID NO: 194之胺基酸序列之CDR-L2及包含SEQ ID NO: 195之胺基酸序列之CDR-L3。
於一些實施例中，經分離之抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)包含VH及VL，其中VH包含選自由SEQ ID NOs: 182-189組成之群之一個或多個胺基酸序列，及/或VL包含選自由SEQ ID NOs: 190-196組成之群之一個或多個胺基酸序列。於一些實施例中，經分離之抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)包含VH及VL，其中VH包含選自由SEQ ID NOs: 182-189組成之群之一個或多個胺基酸序列，且VL包含選自由SEQ ID NOs: 190-196組成之群之一個或多個胺基酸序列。
於某些實施例中，經分離之抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)包含VH及VL，其中1)所述VH包含選自由SEQ ID NOs: 182-183組成之群之一個或多個胺基酸序列，選自由SEQ ID NOs: 184-185組成之群之一個或多個胺基酸序列，及/或選自由SEQ ID NOs: 186-189組成之群之一個或多個胺基酸序列；及/或2) VL包含選自由SEQ ID NOs: 190-193組成之群之一個或多個胺基酸序列，SEQ ID NO: 194之胺基酸序列，及/或從選自由SEQ ID NOs: 195-196組成之群之一個或多個胺基酸序列。於某些實施例中，經分離之抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)包含VH及VL，其中1) VH包含選自由SEQ ID NOs: 182-183組成之群之一個或多個胺基酸序列，及選自由SEQ ID NOs: 184-185組成之群之一個或多個胺基酸序列，及選自由SEQ ID NOs: 186-189組成之群之一個或多個胺基酸序列，且2) VL包含選自由SEQ ID NOs: 190-193組成之群之一個或多個胺基酸序列，SEQ ID NO: 194之胺基酸序列，及選自由SEQ ID NOs: 195-196組成之群之一個或多個胺基酸序列。
於一些實施例中，1) VH包含SEQ ID NO: 182之胺基酸序列；SEQ ID NO: 185之胺基酸序列；及/或SEQ ID NO: 188之胺基酸序列；及/或2) VL包含SEQ ID NO: 191之胺基酸序列；SEQ ID NO: 194之胺基酸序列；及/或SEQ ID NO: 195之胺基酸序列。於一個實施例中，1) VH包含SEQ ID NO: 182之胺基酸序列，SEQ ID NO: 185之胺基酸序列，及SEQ ID NO: 188之胺基酸序列；及2) VL包含SEQ ID NO: 191之胺基酸序列，SEQ ID NO: 194之胺基酸序列及SEQ ID NO: 195之胺基酸序列。
於一些實施例中，經分離之抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)包含一個或多個(例如，一個、兩個、三個、四個、五個或六個) CDRs，其包含選自由SEQ ID NO: 35-136組成之群之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。經分離之抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)可包含兩個或多個(例如，兩個、三個、四個、五個或六個) CDRs，每個CDR包含選自由SEQ ID NO: 35-136組成之群之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1，2，3，4或5個)胺基酸取代之變體，任意組合。於一些實施例中，經分離之抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)包含一個或多個如表3A-3B中所示之說明性抗體之一個或多個(例如，一個、兩個、三個、四個、五個或六個) CDRs，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。
於一些實施例中，經分離之抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)包含VH及VL。於一些實施例中，VH包含CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3。於一些實施例中，CDR-H1包含選自由SEQ ID NOs: 35-51組成之群之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於一些實施例中，CDR-H2包含選自由SEQ ID NOs: 52-68組成之群之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於一些實施例中，CDR-H3包含選自由SEQ ID NOs: 69-85組成之群之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於某些實施例中，VL包含CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3。於一些實施例中，CDR-L1包含選自由SEQ ID NOs: 86-102組成之群之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於一些實施例中，CDR-L2包含選自由SEQ ID NOs: 103-119組成之群之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於一些實施例中，CDR-L3包含選自由SEQ ID NOs: 120-136組成之群之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。
於一些實施例中，抗體可包含CDR-H1具有選自由SEQ ID NOs: 35-51組成之群之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；CDR-H2具有選自由SEQ ID NOs: 52-68組成之群之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1，2，3，4或5個)胺基酸取代之變體；CDR-H3具有選自SEQ ID NOs: 69-85組成之群之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1，2，3，4或5個)胺基酸取代之變體；CDR-L1具有選自由SEQ ID NOs: 86-102組成之群之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1，2，3，4或5個)胺基酸取代之變體；CDR-L2具有選自由SEQ ID NOs: 103-119組成之群之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或CDR-L3具有選自由SEQ ID NOs: 120-136組成之群之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1，2，3，4或5個)胺基酸取代之變體。
於一些實施例中，經分離之抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)包含VH及VL，其中1)所述VH包含CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3，其中CDR-H1包含選自由SEQ ID NOs: 35-51組成之群之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；CDR-H2包含選自由SEQ ID NOs: 52-68組成之群之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或CDR-H3包含選自由SEQ ID NOs: 69-85組成之群之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或VL包含CDR-L1，CDR-L2及CDR-L3，CDR-L1包含選自由SEQ ID NOs: 86-102組成之群之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；CDR-L2包含選自由SEQ ID NOs: 103-119組成之群之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或CDR-L3包含選自由SEQ ID NOs: 120-136組成之群之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。
於一些實施例中，經分離之抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)包含VH及VL，其中VH包含選自由SEQ ID NOs: 35-85組成之群之一個或多個胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或VL包含選自由SEQ ID NOs: 86-136組成之群之一個或多個胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於某些實施例中，經分離之抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)包含VH及VL，其中1)所述VH包含選自由SEQ ID NOs: 35-51組成之群之一個或多個胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；選自由SEQ ID NOs: 52-68組成之群之一個或多個胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或選自由SEQ ID NOs: 69-85組成之群之一個或多個胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或2) VL包含選自由SEQ ID NOs: 86-102 組成之群之一個或多個胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；選自由SEQ ID NOs: 103-119組成之群一個或多個胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或選自由SEQ ID NOs: 120-136組成之群之一個或多個胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於某些實施例中，經分離之抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)包含VH及VL，其中1) VH包含選自由SEQ ID NOs: 35-51組成之群之一個或多個胺基酸序列，選自由SEQ ID NOs: 52-68組成之群之一個或多個胺基酸序列，及選自由SEQ ID NOs: 69-85組成之群之一個或多個胺基酸序列；及2) VL包含選自由SEQ ID NOs: 86-102組成之群之一個或多個胺基酸序列，選自由SEQ ID NOs: 103-119組成之群之一個或多個胺基酸序列，及選自由SEQ ID NOs: 120-136組成之群之一個或多個胺基酸序列。於一些實施例中，經分離之抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)包含VH及VL，其中1) VH包含如表3A所示之說明性抗體之一個或多個(例如，一個、兩個、三個、四個、五個或六個) CDRs，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或2) VL包含表3B所示之說明性抗體之一個或多個(例如，一個，兩個，三個，四個，五個或六個) CDRs，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。
於一些實施例中，經分離之抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)包含包含選自由SEQ ID NOs: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31及33組成之群之胺基酸序列之VH，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於一些實施例中，經分離之抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)包含包含選自由SEQ ID NOs: 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32及34組成之群之胺基酸序列之VL，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於某些實施例中，包含包含選自由SEQ ID NOs: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31及33組成之群之胺基酸序列之VH，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體，及包含選自由SEQ ID NOs: 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32及34組成之群之胺基酸序列之VL，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於一些實施例中，經分離之抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)包含如表4A所示之說明性抗體之VH及/或VL，或與如表4A所示之說明性抗體之VH或VL具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性之一個或多個胺基酸序列。經分離之抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)可包含本文所用之任意VH及任意VL之任意組合。
於某些實施例中，經分離之抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)包含輕鏈及/或重鏈(例如，IgG例如IgG1或IgG4)。於一些實施例中，重鏈包含選自由SEQ ID NOs: 35-85組成之群之一個或多個胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或輕鏈包含選自由SEQ ID NOs: 86-136的組成之群之一個或多個胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於一些實施例中，經分離之抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)包含重鏈及輕鏈，其中1)重鏈包含選自由SEQ ID NOs: 35-51組成之群之一個或多個胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；選自由SEQ ID NOs: 52-68組成之群之一個或多個胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或選自由SEQ ID NOs: 69-85組成之群之一個或多個胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或2)輕鏈包含選自由SEQ ID NOs: 86-102組成之群之一個或多個胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；選自由SEQ ID NOs: 103-119組成之群之一個或多個胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或選自由SEQ ID NOs: 120-136組成之群之一個或多個胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。
於一些實施例中，經分離之抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)包含VH，其包含序列NYAIH (SEQ ID NO: 48)之CDR-H1，包含序列AISGSGSSTYYADSVKG (SEQ ID NO: 65)之CDR-H2，及包含序列RGSYGFGAFDY (SEQ ID NO: 82)之CDR-H3，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體之CDR-H1序列、CDR-H2序列及/或CDR-H3序列；及/或包含VL，其包含序列RASQTIGRYLN (SEQ ID NO: 99)之CDR-L1、包含序列DASNRAT (SEQ ID NO: 116)之CDR-L2及包含序列QQRYPWPYT (SEQ ID NO: 133)之CDR-L3，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體之CDR-H1序列、CDR-H2序列及/或CDR-H3序列。
於一些實施例中，經分離之抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)包含VH及VL，其中a) VH包含包含SEQ ID NO: 48之胺基酸序列之CDR-H1，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；包含SEQ ID NO: 65之胺基酸序列之CDR-H2，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或包含SEQ ID NO: 82之胺基酸序列之CDR-H3，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或b) VL包含包含SEQ ID NO: 99之胺基酸序列之CDR-L1，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；包含SEQ ID NO: 116之胺基酸序列之CDR-L2，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或包含SEQ ID NO: 133之胺基酸序列之CDR-L3，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於某些實施例中，a) VH包含包含SEQ ID NO: 48之胺基酸序列之CDR-H1，包含SEQ ID NO: 65之胺基酸序列之CDR-H2及包含SEQ ID NO: 82之胺基酸序列之CDR-H3；且b) VL包含包含SEQ ID NO: 99之胺基酸序列之CDR-L1，包含SEQ ID NO: 116之胺基酸序列之CDR-L2及包含SEQ ID NO: 133之胺基酸序列之CDR-L3。於一些實施例中，分經分離之抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)包含VH及VL，其中a) VH包含SEQ ID NO: 48之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；SEQ ID NO: 65之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或SEQ ID NO: 82之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或b) VL包含SEQ ID NO: 99之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；SEQ ID NO: 116之胺基酸序列或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或SEQ ID NO: 133之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於某些實施例中，a) VH包含SEQ ID NO: 48之胺基酸序列、SEQ ID NO: 65之胺基酸序列及SEQ ID NO: 82之胺基酸序列；且b) VL包含SEQ ID NO: 99之胺基酸序列，SEQ ID NO: 116之胺基酸序列及SEQ ID NO: 133之胺基酸序列。於一些實施例中，經分離之抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)包含表如3A-3B所示之說明性抗體TY21446之一個、兩個、三個、四個、五個或六個CDRs，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。
於一些實施例中，經分離之抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)包含包含SEQ ID NO: 27之胺基酸序列之CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3之VH，或胺基酸序列與SEQ ID NO: 27具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性；及/或包含SEQ ID NO: 28之胺基酸序列之VL之CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3之VL，或胺基酸序列與SEQ ID NO: 28具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性。於一些實施例中，VH包含SEQ ID NO: 27之胺基酸序列，或胺基酸序列與SEQ ID NO: 27具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性，及/或VL包含SEQ ID NO: 28之胺基酸序列，或胺基酸序列與SEQ ID NO: 28具有至少80% (例如，至少85%，90%，95%，98%或99%；或100%)序列同一性。於一些實施例中，經分離之抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)包含如表4A所示之說明性抗體TY21446之VH及/或VL，或與如表4A所示之說明性抗體TY21446之VH及/或VL具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性之一個或多個胺基酸序列。
於一些實施例中，經分離之抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)包含VH及VL，其中a) VH包含包含SEQ ID NO: 49之胺基酸序列之CDR-H1，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；包含SEQ ID NO: 66胺基酸序列之CDR-H2，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或包含SEQ ID NO: 83胺基酸序列之CDR-H3，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或b) VL包含包含SEQ ID NO: 100胺基酸序列之CDR-L1，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；包含SEQ ID NO: 117之胺基酸序列之CDR-L2，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或包含SEQ ID NO: 134之胺基酸序列之CDR-L3，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於一些實施例中，a) VH包含SEQ ID NO: 49之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；SEQ ID NO: 66之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或SEQ ID NO: 83之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或b) VL包含SEQ ID NO: 100之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；SEQ ID NO: 117之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或SEQ ID NO: 134之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於一些實施例中，經分離之抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)包含如表3A-3B所示之說明性抗體TY21447之一個、兩個、三個、四個、五個或六個CDRs，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。
於一些實施例中，經分離之抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)包含包含SEQ ID NO: 29之胺基酸序列之CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3之VH，或胺基酸序列與SEQ ID NO: 29具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性；及/或包含SEQ ID NO: 30之胺基酸序列之VL之CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3之VL，或胺基酸序列與SEQ ID NO: 30具有至少80% (例如，至少 85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性。於某些實施例中，VH包含SEQ ID NO: 29之胺基酸序列，或胺基酸序列與SEQ ID NO: 29具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性，及/或VL包含SEQ ID NO: 30之胺基酸序列，或胺基酸序列與SEQ ID NO: 30具有至少80% (例如，至少85%，90%，95%，98%或99%；或100%)序列同一性。於一些實施例中，經分離之抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)包含如表4A所示之說明性抗體TY21447之VH及/或VL，或與如表4A所示之說明性抗體TY21447之VH及/或VL具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性之一個或多個胺基酸序列。
於一些實施例中，經分離之抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)包含VH及VL，其中a)所述VH包含包含SEQ ID NO: 50之胺基酸序列之CDR-H1，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；包含 EQ ID NO: 67胺基酸序列之CDR-H2，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或包含SEQ ID NO: 84胺基酸序列之CDR-H3，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或b) VL包含包含SEQ ID NO: 101胺基酸序列之CDR-L1，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；包含SEQ ID NO: 118之胺基酸序列之CDR-L2，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或包含SEQ ID NO: 135之胺基酸序列之CDR-L3，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於一些實施例中，a) VH包含SEQ ID NO: 50之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；SEQ ID NO: 67之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或SEQ ID NO: 84之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或b) VL包含SEQ ID NO: 101之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；SEQ ID NO: 118之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或SEQ ID NO: 135之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於一些實施例中，經分離之抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)包含如表3A-3B所示之說明性抗體TY21449之一個、兩個、三個、四個、五個或六個CDRs，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。
於一些實施例中，經分離之抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)包含包含SEQ ID NO: 31之胺基酸序列CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3之VH，或胺基酸序列與SEQ ID NO: 31具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性；及/或包含SEQ ID NO: 32之胺基酸序列之VL之CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3之VL，或胺基酸序列與SEQ ID NO: 32具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性。於某些實施例中，VH包含SEQ ID NO: 31之胺基酸序列，或胺基酸序列與SEQ ID NO: 31具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性，及/或VL包含SEQ ID NO: 32之胺基酸序列，或胺基酸序列與SEQ ID NO: 32具有至少80% (例如，至少85%，90%，95%，98%或99%；或100%)序列同一性。於一些實施例中，經分離之抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)包含如表4A所示之說明性抗體TY21449之VH及/或VL，或與如表4A所示之說明性抗體TY21449之VH及/或VL具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性之一個或多個胺基酸序列。
於一些實施例中，經分離之抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)包含VH及VL，其中a)所述VH包含包含SEQ ID NO: 35之胺基酸序列之CDR-H1，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；包含SEQ ID NO: 52胺基酸序列之CDR-H2，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或包含SEQ ID NO: 69胺基酸序列之CDR-H3，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或b) VL包含包含SEQ ID NO: 86胺基酸序列之CDR-L1，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；包含SEQ ID NO: 103之胺基酸序列之CDR-L2，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或包含SEQ ID NO: 120之胺基酸序列之CDR-L3，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於一些實施例中，a) VH包含SEQ ID NO: 35之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；SEQ ID NO: 52之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或SEQ ID NO: 69之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或b) VL包含SEQ ID NO: 86之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；SEQ ID NO: 103之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或SEQ ID NO: 120之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於一些實施例中，經分離之抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)包含表3A-3B所示之說明性抗體TY25029之一個、兩個、三個、四個、五個或六個CDR，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。
於一些實施例中，經分離之抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)包含包含SEQ ID NO: 1之胺基酸序列之CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3之VH，或胺基酸序列與SEQ ID NO: 1具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性；及/或包含SEQ ID NO: 2之胺基酸序列之VL之CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3之VL，或胺基酸序列與SEQ ID NO: 2具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性。於某些實施例中，VH包含SEQ ID NO: 1之胺基酸序列，或胺基酸序列與SEQ ID NO: 1具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性，及/或VL包含SEQ ID NO: 2之胺基酸序列，或胺基酸序列與SEQ ID NO: 2具有至少80% (例如，至少85%，90%，95%，98%或99%；或100%)序列同一性。於一些實施例中，經分離之抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)包含如表4A所示之說明性抗體TY25029之VH及/或VL，或與如表4A所示之說明性抗體TY25029之VH及/或VL具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性之一個或多個胺基酸序列。
於一些實施例中，經分離之抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)包含VH及VL，其中a)所述VH包含包含SEQ ID NO: 36之胺基酸序列之CDR-H1，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；包含SEQ ID NO: 53胺基酸序列之CDR-H2，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或包含SEQ ID NO: 70胺基酸序列之CDR-H3，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或b) VL包含包含SEQ ID NO: 87胺基酸序列之CDR-L1，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；包含SEQ ID NO: 104之胺基酸序列之CDR-L2，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或包含SEQ ID NO: 121之胺基酸序列之CDR-L3，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於一些實施例中，a) VH包含SEQ ID NO: 36之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；SEQ ID NO: 53之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或SEQ ID NO: 70之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或b) VL包含SEQ ID NO: 87之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；SEQ ID NO: 104之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或SEQ ID NO: 121之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於一些實施例中，經分離之抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)包含如表3A-3B所示之說明性抗體TY25030之一個、兩個、三個、四個、五個或六個CDRs，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。
於一些實施例中，經分離之抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)包含包含SEQ ID NO: 3之胺基酸序列之CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3之VH，或胺基酸序列與SEQ ID NO: 3具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性；及/或包含SEQ ID NO: 4之胺基酸序列之VL之CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3之VL，或胺基酸序列與SEQ ID NO: 4具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性。於某些實施例中，VH包含SEQ ID NO: 3之胺基酸序列，或胺基酸序列與SEQ ID NO: 3具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性，及/或VL包含SEQ ID NO: 4之胺基酸序列，或胺基酸序列與SEQ ID NO: 4具有至少80% (例如，至少85%，90%，95%，98%或99%；或100%)序列同一性。於一些實施例中，經分離之抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)包含如表4A所示之說明性抗體TY25030之VH及/或VL，或與如表4A所示之說明性抗體TY25030之VH及/或VL具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性之一個或多個胺基酸序列。
於一些實施例中，經分離之抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)包含VH及VL，其中a)所述VH包含包含SEQ ID NO: 37之胺基酸序列之CDR-H1，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；包含SEQ ID NO: 54胺基酸序列之CDR-H2，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或包含SEQ ID NO: 71胺基酸序列之CDR-H3，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或b) VL包含包含SEQ ID NO: 88胺基酸序列之CDR-L1，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；包含SEQ ID NO: 105之胺基酸序列之CDR-L2，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或包含SEQ ID NO: 122之胺基酸序列之CDR-L3，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於一些實施例中，a) VH包含SEQ ID NO: 37之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；SEQ ID NO: 54之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或SEQ ID NO: 71之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或b) VL包含SEQ ID NO: 88之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；SEQ ID NO: 105之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或SEQ ID NO: 122之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於一些實施例中，經分離之抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)包含如表3A-3B所示之說明性抗體TY25031之一個、兩個、三個、四個、五個或六個CDRs，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。
於一些實施例中，經分離之抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)包含包含SEQ ID NO: 5之胺基酸序列之CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3之VH，或胺基酸序列與SEQ ID NO: 5具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性；及/或包含SEQ ID NO: 6之胺基酸序列之VL之CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3之VL，或胺基酸序列與SEQ ID NO: 6具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性。於某些實施例中，VH包含SEQ ID NO: 5之胺基酸序列，或胺基酸序列與SEQ ID NO: 5具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性，及/或VL包含SEQ ID NO: 6之胺基酸序列，或胺基酸序列與SEQ ID NO: 6具有至少80% (例如，至少85%，90%，95%，98%或99%；或100%)序列同一性。於一些實施例中，經分離之抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)包含如表4A所示之說明性抗體TY25031之VH及/或VL，或與如表4A所示之說明性抗體TY25031之VH及/或VL具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性之一個或多個胺基酸序列。
於一些實施例中，經分離之抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)包含VH及VL，其中a)所述VH包含包含SEQ ID NO: 38之胺基酸序列之CDR-H1，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；包含SEQ ID NO: 55胺基酸序列之CDR-H2，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或包含SEQ ID NO: 72胺基酸序列之CDR-H3，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或b) VL包含包含SEQ ID NO: 89胺基酸序列之CDR-L1，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；包含SEQ ID NO: 106之胺基酸序列之CDR-L2，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或包含SEQ ID NO: 123之胺基酸序列之CDR-L3，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於一些實施例中，a) VH包含SEQ ID NO: 38之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；SEQ ID NO: 55之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或SEQ ID NO: 72之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或b) VL包含SEQ ID NO: 89之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；SEQ ID NO: 106之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或SEQ ID NO: 123之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於一些實施例中，經分離之抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)包含如表3A-3B所示之說明性抗體TY25032之一個、兩個、三個、四個、五個或六個CDRs，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。
於一些實施例中，經分離之抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)包含包含SEQ ID NO: 7之胺基酸序列之CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3之VH，或胺基酸序列與SEQ ID NO: 7具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性；及/或包含SEQ ID NO: 8之胺基酸序列之VL之CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3之VL，或胺基酸序列與SEQ ID NO: 8具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性。於某些實施例中，VH包含SEQ ID NO: 7之胺基酸序列，或胺基酸序列與SEQ ID NO: 7具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性，及/或VL包含SEQ ID NO: 8之胺基酸序列，或胺基酸序列與SEQ ID NO: 8具有至少80% (例如，至少85%，90%，95%，98%或99%；或100%)序列同一性。於一些實施例中，經分離之抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)包含如表4A所示之說明性抗體TY25032之VH及/或VL，或與如表4A所示之說明性抗體TY25032之VH及/或VL具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性之一個或多個胺基酸序列。
於一些實施例中，經分離之抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)包含VH及VL，其中a)所述VH包含包含SEQ ID NO: 39之胺基酸序列之CDR-H1，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；包含SEQ ID NO: 56胺基酸序列之CDR-H2，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或包含SEQ ID NO: 73胺基酸序列之CDR-H3，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或b) VL包含包含SEQ ID NO: 90胺基酸序列之CDR-L1，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；包含SEQ ID NO: 107之胺基酸序列之CDR-L2，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或包含SEQ ID NO: 124之胺基酸序列之CDR-L3，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於一些實施例中，a) VH包含SEQ ID NO: 39之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；SEQ ID NO: 56之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或SEQ ID NO: 73之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或b) VL包含SEQ ID NO: 90之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；SEQ ID NO: 107之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或SEQ ID NO: 124之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於一些實施例中，經分離之抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)包含如表3A-3B所示之說明性抗體TY25033之一個、兩個、三個、四個、五個或六個CDRs，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。
於一些實施例中，經分離之抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)包含包含SEQ ID NO: 9之胺基酸序列之CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3之VH，或胺基酸序列與SEQ ID NO: 9具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性；及/或包含SEQ ID NO: 10之胺基酸序列之VL之CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3之VL，或胺基酸序列與SEQ ID NO: 10具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性。於某些實施例中，VH包含SEQ ID NO: 9之胺基酸序列，或胺基酸序列與SEQ ID NO: 9具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性，及/或VL包含SEQ ID NO: 10之胺基酸序列，或胺基酸序列與SEQ ID NO: 10具有至少80% (例如，至少85%，90%，95%，98%或99%；或100%)序列同一性。於一些實施例中，經分離之抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)包含如表4A所示之說明性抗體TY25033之VH及/或VL，或與如表4A所示之說明性抗體TY25033之VH及/或VL具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性之一個或多個胺基酸序列。
於一些實施例中，經分離之抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)包含VH及VL，其中a)所述VH包含包含SEQ ID NO: 40之胺基酸序列之CDR-H1，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；包含SEQ ID NO: 57胺基酸序列之CDR-H2，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或包含SEQ ID NO: 74胺基酸序列之CDR-H3，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或b) VL包含包含SEQ ID NO: 91胺基酸序列之CDR-L1，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；包含SEQ ID NO: 108之胺基酸序列之CDR-L2，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或包含SEQ ID NO: 125之胺基酸序列之CDR-L3，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於一些實施例中，a) VH包含SEQ ID NO: 40之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；SEQ ID NO: 57之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或SEQ ID NO: 74之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或b) VL包含SEQ ID NO: 91之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；SEQ ID NO: 108之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或SEQ ID NO: 125之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於一些實施例中，經分離之抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)包含如表3A-3B所示之說明性抗體TY25034之一個、兩個、三個、四個、五個或六個CDRs，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。
於一些實施例中，經分離之抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)包含包含SEQ ID NO: 11之胺基酸序列之CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3之VH，或胺基酸序列與SEQ ID NO: 11具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性；及/或包含SEQ ID NO: 12之胺基酸序列之VL之CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3之VL，或胺基酸序列與SEQ ID NO: 12具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性。於某些實施例中，VH包含SEQ ID NO: 11之胺基酸序列，或胺基酸序列與SEQ ID NO: 11具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性，及/或VL包含SEQ ID NO: 12之胺基酸序列，或胺基酸序列與SEQ ID NO: 12具有至少80% (例如，至少85%，90%，95%，98%或99%；或100%)序列同一性。於一些實施例中，經分離之抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)包含如表4A所示之說明性抗體TY25034之VH及/或VL，或與如表4A所示之說明性抗體TY25034之VH及/或VL具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性之一個或多個胺基酸序列。
於一些實施例中，經分離之抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)包含VH及VL，其中a)所述VH包含包含SEQ ID NO: 41之胺基酸序列之CDR-H1，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；包含SEQ ID NO: 58胺基酸序列之CDR-H2，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或包含SEQ ID NO: 75胺基酸序列之CDR-H3，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或b) VL包含包含SEQ ID NO: 92胺基酸序列之CDR-L1，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；包含SEQ ID NO: 109之胺基酸序列之CDR-L2，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或包含SEQ ID NO: 126之胺基酸序列之CDR-L3，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於一些實施例中，a) VH包含SEQ ID NO: 41之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；SEQ ID NO: 58之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或SEQ ID NO: 75之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或b) VL包含SEQ ID NO: 92之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；SEQ ID NO: 109之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或SEQ ID NO: 126之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於一些實施例中，經分離之抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)包含如表3A-3B所示之說明性抗體TY25035之一個、兩個、三個、四個、五個或六個CDRs，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。
於一些實施例中，經分離之抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)包含包含SEQ ID NO: 13之胺基酸序列之CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3之VH，或胺基酸序列與SEQ ID NO: 13具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性；及/或包含SEQ ID NO: 14之胺基酸序列之VL之CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3之VL，或胺基酸序列與SEQ ID NO: 14具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性。於某些實施例中，VH包含SEQ ID NO: 13之胺基酸序列，或胺基酸序列與SEQ ID NO: 13具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性，及/或VL包含SEQ ID NO: 14之胺基酸序列，或胺基酸序列與SEQ ID NO: 14具有至少80% (例如，至少85%，90%，95%，98%或99%；或100%)序列同一性。於一些實施例中，經分離之抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)包含如表4A所示之說明性抗體TY25035之VH及/或VL，或與如表4A所示之說明性抗體TY25035之VH及/或VL具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性之一個或多個胺基酸序列。
於一些實施例中，經分離之抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)包含VH及VL，其中a)所述VH包含包含SEQ ID NO: 42之胺基酸序列之CDR-H1，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；包含SEQ ID NO: 59胺基酸序列之CDR-H2，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或包含SEQ ID NO: 76胺基酸序列之CDR-H3，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或b) VL包含包含SEQ ID NO: 93胺基酸序列之CDR-L1，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；包含SEQ ID NO: 110之胺基酸序列之CDR-L2，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或包含SEQ ID NO: 127之胺基酸序列之CDR-L3，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於一些實施例中，a) VH包含SEQ ID NO: 42之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；SEQ ID NO: 59之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或SEQ ID NO: 76之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或b) VL包含SEQ ID NO: 93之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；SEQ ID NO: 110之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或SEQ ID NO: 127之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於一些實施例中，經分離之抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)包含如表3A-3B所示之說明性抗體TY25036之一個、兩個、三個、四個、五個或六個CDRs，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。
於一些實施例中，經分離之抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)包含包含SEQ ID NO: 15之胺基酸序列之CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3之VH，或胺基酸序列與SEQ ID NO: 15具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性；及/或包含SEQ ID NO: 16之胺基酸序列之VL之CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3之VL，或胺基酸序列與SEQ ID NO: 16具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性。於某些實施例中，VH包含SEQ ID NO: 15之胺基酸序列，或胺基酸序列與SEQ ID NO: 15具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性，及/或VL包含SEQ ID NO: 16之胺基酸序列，或胺基酸序列與SEQ ID NO: 16具有至少80% (例如，至少85%，90%，95%，98%或99%；或100%)序列同一性。於一些實施例中，經分離之抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)包含如表4A所示之說明性抗體TY25036之VH及/或VL，或與如表4A所示之說明性抗體TY25036之VH及/或VL具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性之一個或多個胺基酸序列。
於一些實施例中，經分離之抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)包含VH及VL，其中a)所述VH包含包含SEQ ID NO: 43之胺基酸序列之CDR-H1，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；包含SEQ ID NO: 60胺基酸序列之CDR-H2，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或包含SEQ ID NO: 77胺基酸序列之CDR-H3，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或b) VL包含包含SEQ ID NO: 94胺基酸序列之CDR-L1，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；包含SEQ ID NO: 111之胺基酸序列之CDR-L2，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或包含SEQ ID NO: 128之胺基酸序列之CDR-L3，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於一些實施例中，a) VH包含SEQ ID NO: 43之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；SEQ ID NO: 60之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或SEQ ID NO: 77之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或b) VL包含SEQ ID NO: 94之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；SEQ ID NO: 111之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或SEQ ID NO: 128之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於一些實施例中，經分離之抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)包含如表3A-3B所示之說明性抗體TY25037之一個、兩個、三個、四個、五個或六個CDRs，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。
於一些實施例中，經分離之抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)包含包含SEQ ID NO: 17之胺基酸序列之CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3之VH，或胺基酸序列與SEQ ID NO: 17具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性；及/或包含SEQ ID NO: 18之胺基酸序列之VL之CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3之VL，或胺基酸序列與SEQ ID NO: 18具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性。於某些實施例中，VH包含SEQ ID NO: 17之胺基酸序列，或胺基酸序列與SEQ ID NO: 17具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性，及/或VL包含SEQ ID NO: 18之胺基酸序列，或胺基酸序列與SEQ ID NO: 18具有至少80% (例如，至少85%，90%，95%，98%或99%；或100%)序列同一性。於一些實施例中，經分離之抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)包含如表4A所示之說明性抗體TY25037之VH及/或VL，或與如表4A所示之說明性抗體TY25037之VH及/或VL具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性之一個或多個胺基酸序列。
於一些實施例中，經分離之抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)包含VH及VL，其中a)所述VH包含包含SEQ ID NO: 44之胺基酸序列之CDR-H1，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；包含SEQ ID NO: 61胺基酸序列之CDR-H2，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或包含SEQ ID NO: 78胺基酸序列之CDR-H3，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或b) VL包含包含SEQ ID NO: 95胺基酸序列之CDR-L1，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；包含SEQ ID NO: 112之胺基酸序列之CDR-L2，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或包含SEQ ID NO: 129之胺基酸序列之CDR-L3，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於一些實施例中，a) VH包含SEQ ID NO: 44之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；SEQ ID NO: 61之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或SEQ ID NO: 78之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或b) VL包含SEQ ID NO: 95之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；SEQ ID NO: 112之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或SEQ ID NO: 129之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於一些實施例中，經分離之抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)包含如表3A-3B所示之說明性抗體TY25038之一個、兩個、三個、四個、五個或六個CDRs，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。
於一些實施例中，經分離之抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)包含包含SEQ ID NO: 19之胺基酸序列之CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3之VH，或胺基酸序列與SEQ ID NO: 19具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性；及/或包含SEQ ID NO: 20之胺基酸序列之VL之CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3之VL，或胺基酸序列與SEQ ID NO: 20具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性。於某些實施例中，VH包含SEQ ID NO: 19之胺基酸序列，或胺基酸序列與SEQ ID NO: 19具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性，及/或VL包含SEQ ID NO: 20之胺基酸序列，或胺基酸序列與SEQ ID NO: 20具有至少80% (例如，至少85%，90%，95%，98%或99%；或100%)序列同一性。於一些實施例中，經分離之抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)包含如表4A所示之說明性抗體TY25038之VH及/或VL，或與如表4A所示之說明性抗體TY25038之VH及/或VL具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性之一個或多個胺基酸序列。
於一些實施例中，經分離之抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)包含VH及VL，其中a)所述VH包含包含SEQ ID NO: 45之胺基酸序列之CDR-H1，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；包含SEQ ID NO: 62胺基酸序列之CDR-H2，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或包含SEQ ID NO: 79胺基酸序列之CDR-H3，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或b) VL包含包含SEQ ID NO: 96胺基酸序列之CDR-L1，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；包含SEQ ID NO: 113之胺基酸序列之CDR-L2，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或包含SEQ ID NO: 130之胺基酸序列之CDR-L3，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於一些實施例中，a) VH包含SEQ ID NO: 45之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；SEQ ID NO: 62之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或SEQ ID NO: 79之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或b) VL包含SEQ ID NO: 96之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；SEQ ID NO: 113之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或SEQ ID NO: 130之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於一些實施例中，經分離之抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)如包含表3A-3B所示之說明性抗體TY25039之一個、兩個、三個、四個、五個或六個CDRs，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。
於一些實施例中，經分離之抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)包含包含SEQ ID NO: 21之胺基酸序列之CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3之VH，或胺基酸序列與SEQ ID NO: 21具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性；及/或包含SEQ ID NO: 22之胺基酸序列之VL之CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3之VL，或胺基酸序列與SEQ ID NO: 22具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性。於某些實施例中，VH包含SEQ ID NO: 21之胺基酸序列，或胺基酸序列與SEQ ID NO: 21具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性，及/或VL包含SEQ ID NO: 22之胺基酸序列，或胺基酸序列與SEQ ID NO: 22具有至少80% (例如，至少85%，90%，95%，98%或99%；或100%)序列同一性。於一些實施例中，經分離之抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)包含如表4A所示之說明性抗體TY25039之VH及/或VL，或與如表4A所示之說明性抗體TY25039之VH及/或VL具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性之一個或多個胺基酸序列。
於一些實施例中，經分離之抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)包含VH及VL，其中a)所述VH包含包含SEQ ID NO: 46之胺基酸序列之CDR-H1，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；包含SEQ ID NO: 63胺基酸序列之CDR-H2，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或包含SEQ ID NO: 80胺基酸序列之CDR-H3，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或b) VL包含包含SEQ ID NO: 97胺基酸序列之CDR-L1，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；包含SEQ ID NO: 114之胺基酸序列之CDR-L2，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或包含SEQ ID NO: 131之胺基酸序列之CDR-L3，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於一些實施例中，a) VH包含SEQ ID NO: 46之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；SEQ ID NO: 63之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或SEQ ID NO: 80之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或b) VL包含SEQ ID NO: 97之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；SEQ ID NO: 114之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或SEQ ID NO: 131之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於一些實施例中，經分離之抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)包含如表3A-3B所示之說明性抗體TY25040之一個、兩個、三個、四個、五個或六個CDRs，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。
於一些實施例中，經分離之抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)包含包含SEQ ID NO: 23之胺基酸序列之CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3之VH，或胺基酸序列與SEQ ID NO: 23具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性；及/或包含SEQ ID NO: 24之胺基酸序列之VL之CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3之VL，或胺基酸序列與SEQ ID NO: 24具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性。於某些實施例中，VH包含SEQ ID NO: 23之胺基酸序列，或胺基酸序列與SEQ ID NO: 23具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性，及/或VL包含SEQ ID NO: 24之胺基酸序列，或胺基酸序列與SEQ ID NO: 24具有至少80% (例如，至少85%，90%，95%，98%或99%；或100%)序列同一性。於一些實施例中，經分離之抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)包含如表4A所示之說明性抗體TY25040之VH及/或VL，或與如表4A所示之說明性抗體TY25040之VH及/或VL具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性之一個或多個胺基酸序列。
於一些實施例中，經分離之抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)包含VH及VL，其中a)所述VH包含包含SEQ ID NO: 47之胺基酸序列之CDR-H1，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；包含SEQ ID NO: 64胺基酸序列之CDR-H2，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或包含SEQ ID NO: 81胺基酸序列之CDR-H3，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或b) VL包含包含SEQ ID NO: 98胺基酸序列之CDR-L1，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；包含SEQ ID NO: 115之胺基酸序列之CDR-L2，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或包含SEQ ID NO: 132之胺基酸序列之CDR-L3，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於一些實施例中，a) VH包含SEQ ID NO: 47之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；SEQ ID NO: 64之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或SEQ ID NO: 81之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或b) VL包含SEQ ID NO: 98之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；SEQ ID NO: 115之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或SEQ ID NO: 132之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於一些實施例中，經分離之抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)包含如表3A-3B所示之說明性抗體TY25041之一個、兩個、三個、四個、五個或六個CDRs，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。
於一些實施例中，經分離之抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)包含包含SEQ ID NO: 25之胺基酸序列之CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3之VH，或胺基酸序列與SEQ ID NO: 25具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性；及/或包含SEQ ID NO: 26之胺基酸序列之VL之CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3之VL，或胺基酸序列與SEQ ID NO: 26具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性。於某些實施例中，VH包含SEQ ID NO: 25之胺基酸序列，或胺基酸序列與SEQ ID NO: 25具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性，及/或VL包含SEQ ID NO: 26之胺基酸序列，或胺基酸序列與SEQ ID NO: 26具有至少80% (例如，至少85%，90%，95%，98%或99%；或100%)序列同一性。於一些實施例中，經分離之抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)包含如表4A所示之說明性抗體TY25041之VH及/或VL，或與如表4A所示之說明性抗體TY25041之VH及/或VL具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性之一個或多個胺基酸序列。
B-1. 經分離之抗體
於某些態樣中，本發明提供結合至人類CD47之經分離之抗體。於一些實施例中，經分離之抗體抗體以約100 nM或更低之EC50在活體外結合人類CD47。於一些實施例中，經分離之抗體抗體以約100 nM或更低之IC50在活體外阻斷人類CD47與人類SIRPα之結合。於一些實施例中，抗體以50 nM或更低之K
D結合人類CD47，如藉由表面電漿子共振所量測。於一些實施例中，抗體與至少一種選自由食蟹猴、大鼠及狗組成之列表之非人類物種交叉反應。本文所用之經分離之抗體可用於治療CD47陽性疾病或病症(例如癌症)。本揭示案之經分離之抗體可包含本文所用之任何CDR、VH、VL、重鏈及/或輕鏈序列。
本文中所述之CD47抗體可為任何類別，諸如IgG、IgM、IgE、IgA或IgD。於一些實施例中，該等CD47抗體為IgG類別，諸如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4子類別。可使用此項技術中已知之方法將CD47抗體自一種類別或子類別轉變成另一種類別或子類別。用於產生所需類別或子類別之抗體之例示性方法包括以下步驟：單離編碼CD47抗體之重鏈之核酸及編碼CD47抗體之輕鏈之核酸，單離編碼VH區之序列，將該VH序列連接至編碼所需類別或子類別之重鏈恒定區之序列，表現細胞中之輕鏈基因及重鏈構築體，及收集CD47抗體。
本文所用之經分離之抗體可包含人類IgG、IgM、IgE、IgA或IgD之Fc區。於較佳之實施例中，經分離之抗體包括人類IgG之IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亞類之Fc區。相對於人類抗體類或亞類Fc區之已知序列，所述Fc區可包含一個或多個(例如，1、2、3、4、5、10或多個)胺基酸取代。
於一些實施例中，經分離之抗體包含包含VL之輕鏈之第一多肽及自N端至C端包含VH及Fc區之重鏈之第二多肽。於一些實施例中，Fc區為IgG4 Fc區。於一些實施例中，Fc區為IgG1 Fc區。於某些實施例中，Fc區為IgG1 Fc區，所述IgG1 Fc區包含S239D取代及/或I332E取代，其中編號根據Kabat。於某些實施例中，Fc區為IgG1 Fc區，所述IgG1 Fc區包含S239D取代及I332E取代，其中編號根據Kabat。包含S239D取代及I332E取代之IgG1 Fc區在Lazar等人(Engineered antibody Fc variants with enhanced effector function." PNAS 103.11 (2006): 4005-4010)中有詳細描述。第一多肽及第二多肽可包含本文所用之任何CDR、VH、VL、重鏈及/或輕鏈序列。於一些實施例中，a)第一多肽之VL包含選自由SEQ ID NOs: 190-196組成之群之一個或多個胺基酸序列；及/或b)第二多肽之VH包含選自由SEQ ID NOs: 182-189組成之群之一個或多個胺基酸序列。於一些變體中，a)第一多肽之VL包含SEQ ID NOs: 191、194及/或195之胺基酸序列；及/或b)第二多肽之VH包含SEQ ID NOs: 182、185及/或188之胺基酸序列。於某些實施例中，a)第一多肽之VL包含選自由SEQ ID NOs: 31-85組成之群之一個或多個胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或b)第二多肽之VH包含選自由SEQ ID NOs: 86-136組成之群之一個或多個胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於一些變體中，a)第一多肽之VL包含包含選自由SEQ ID NOs: 86-102組成之群之胺基酸序列之CDR-L1，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；包含選自由SEQ ID NOs: 103-119組成之群之胺基酸序列之CDR-L2，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或包含選自由SEQ ID NOs: 120-136組成之群之胺基酸序列之CDR-L3，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或b)第二多肽之VH包含包含選自由SEQ ID NOs: 35-51組成之群之胺基酸序列之CDR-H1，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；包含選自由SEQ ID NOs: 52-68組成之群之胺基酸序列之CDR-H2，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或選自由SEQ ID NOs: 69-85組成之群之胺基酸序列之CDR-H3，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於某些實施例中，a)第一多肽之VL包含SEQ ID NO: 99之胺基酸序列、SEQ ID NO: 116之胺基酸序列及/或SEQ ID NO: 133之胺基酸序列；及/或b)第二多肽之VH包含SEQ ID NO: 48之胺基酸序列，SEQ ID NO: 65之胺基酸序列及/或SEQ ID NO: 82之胺基酸序列。於一些實施例中，第一多肽之VL包含如表3B所示之說明性抗體TY21446之一個、兩個或三個CDRs，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或第二多肽之VH包含表3A所示之說明性抗體TY21446之一個、兩個或三個CDRs，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於一些實施例中，第一多肽之VL包含SEQ ID NO: 28之胺基酸序列，或胺基酸序列與SEQ ID NO: 28具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性；且第二多肽之VH包含SEQ ID NO: 27之胺基酸序列，或胺基酸序列與SEQ ID NO: 27具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性。於某些實施例中，第一多肽包含如表4A所示之說明性抗體TY21446之VL，或胺基酸序列與表4A所示之說明性抗體TY21446之VL序列具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性；第二多肽包含如表4A所示之說明性抗體TY21446之VH，或胺基酸序列與表4A所示之說明性抗體TY21446之VH序列具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性。
於一些實施例中，本文提供之經分離之抗CD47抗體或其抗原結合片段包含IgG1 Fc區，其中抗CD47抗體包含a) VH包含：SEQ ID NO: 48之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；SEQ ID NO: 65之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體，及SEQ ID NO: 82之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；且b) VL包含：SEQ ID NO: 99之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；SEQ ID NO: 116之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及SEQ ID NO: 133之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於某些實施例中，本文提供之經分離之抗CD47抗體或其抗原結合片段包含IgG1 Fc區，其中抗CD47抗體包含a) VH包含：SEQ ID NO: 48之胺基酸序列、SEQ ID NO: 65之胺基酸序列及SEQ ID NO: 82之胺基酸序列，或SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 65及/或SEQ ID NO: 82之變體包含多達5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；且b) VL包含：SEQ ID NO: 99之胺基酸序列，SEQ ID NO: 116之胺基酸序列及SEQ ID NO: 133之胺基酸序列，或SEQ ID NO: 99，SEQ ID NO: 116，及/或SEQ ID NO: 133之變體包含多達5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於一些實施例中，本文提供之經分離之抗CD47抗體或其抗原結合片段包含IgG1 Fc區，其中抗CD47抗體包含如表3A-3B所示之說明性抗體TY21446之一個、兩個、三個、四個、五個或六個CDRs，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於某些實施例中，本文提供之經分離之抗CD47抗體或其抗原結合片段包含IgG1 Fc區，其中抗CD47抗體包含包含SEQ ID NO: 27之胺基酸序列之VH，或胺基酸序列與SEQ ID NO: 27之胺基酸序列具有至少80% (例如，至少85%，90%，95%，98%或99%；或100%)序列同一性；包含SEQ ID NO: 28之胺基酸序列之VL，或胺基酸序列與SEQ ID NO: 28之胺基酸序列具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性。於一些實施例中，本文提供之經分離之抗CD47抗體或其抗原結合片段，包含IgG1 Fc區，其中抗CD47抗體包含如表4A所示之說明性抗體TY21446之VH及/或VL，或與如表4A所示之說明性抗體TY21446之VH及/或VL具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性之一個或多個胺基酸序列。於一些實施例中，抗CD47抗體包含包含SEQ ID NO: 145之胺基酸序列之重鏈，或胺基酸序列與SEQ ID NO: 145之胺基酸序列具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性；且包含SEQ ID NO: 144之胺基酸序列之輕鏈，或胺基酸序列與與SEQ ID NO: 144之胺基酸序列之具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性。於一些實施例中，抗CD47抗體包含如表6所示之說明性抗體TY26896之重鏈及/或輕鏈，或與表6所示之說明性抗體TY26896之重鏈或輕鏈具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性之一個或多個胺基酸序列。於一些實施例中，IgG1 Fc區包含S239D取代及/或I332E取代。於某些實施例中，IgG1 Fc區包含S239D取代及I332E取代。於某些實施例中，人類IgG1 Fc區包含兩個Fc結構域，其中兩個Fc結構域中的每一個包含S239D取代及/或I332E取代(例如，S239D取代及I332E取代)。於一些實施例中，抗CD47抗體包含包含SEQ ID NO: 147之胺基酸序列之重鏈，或胺基酸序列與SEQ ID NO: 147之胺基酸序列具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性；且包含SEQ ID NO: 146之胺基酸序列之輕鏈，或胺基酸序列與SEQ ID NO: 146之胺基酸序列具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性。於一些實施例中，抗CD47抗體包含如表6所示之說明性抗體TY26897之重鏈及/或輕鏈，或與如表6所示之說明性抗體TY26897之重鏈及/或輕鏈具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性之一個或多個胺基酸序列。於一些實施例中，IgG1 Fc區具有增強之抗體依賴性細胞毒性(ADCC)及/或抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)功能。
於一些實施例中，本文提供之經分離之抗CD47抗體或其抗原結合片段包含IgG1 Fc區，其中抗CD47抗體包含a) VH包含：SEQ ID NO: 49之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；SEQ ID NO: 66之胺基酸序列或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體，及SEQ ID NO: 83之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；且b) VL包含：SEQ ID NO: 100之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；SEQ ID NO: 117之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及SEQ ID NO: 134之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於某些實施例中，本文提供之經分離之抗CD47抗體或其抗原結合片段包含IgG1 Fc區，其中抗CD47抗體包含a) VH包含：SEQ ID NO: 49之胺基酸序列、SEQ ID NO: 66之胺基酸序列及SEQ ID NO: 83之胺基酸序列，或SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 66及/或SEQ ID NO: 83之變體包含多達5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；且b) VL包含：SEQ ID NO: 100之胺基酸序列，SEQ ID NO: 117之胺基酸序列及SEQ ID NO: 134之胺基酸序列，或SEQ ID NO: 100，SEQ ID NO: 117，及/或SEQ ID NO: 134之變體包含多達5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於一些實施例中，本文提供之經分離之抗CD47抗體或其抗原結合片段包含IgG1 Fc區，其中抗CD47抗體包含如表3A-3B所示之說明性抗體TY21447之一個、兩個、三個、四個、五個或六個CDRs，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於某些實施例中，本文提供之經分離之抗CD47抗體或其抗原結合片段包含IgG1 Fc區，其中抗CD47抗體包含包含SEQ ID NO: 29之胺基酸序列之VH，或胺基酸序列與SEQ ID NO: 29之胺基酸序列具有至少80% (例如，至少85%，90%，95%，98%或99%；或100%)序列同一性；且包含SEQ ID NO: 30之胺基酸序列之VL，或胺基酸序列與SEQ ID NO: 30之胺基酸序列具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性。於一些實施例中，本文提供之經分離之抗CD47抗體或其抗原結合片段，包含IgG1 Fc區，其中抗CD47抗體包含如表4A所示之說明性抗體TY21447之VH及/或VL，或與如表4A所示之說明性抗體TY21447之VH及/或VL具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性之一個或多個胺基酸序列。於一些實施例中，IgG1 Fc區包含S239D取代及/或I332E取代。於某些實施例中，IgG1 Fc區包含S239D取代及I332E取代。於某些實施例中，人類IgG1 Fc區包含兩個Fc結構域，其中兩個Fc結構域中的每一個包含S239D取代及/或I332E取代(例如，S239D取代及I332E取代)。於一些實施例中，IgG1 Fc區具有增強之抗體依賴性細胞毒性(ADCC)及/或抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)功能。
於一些實施例中，本文提供之經分離之抗CD47抗體或其抗原結合片段包含IgG1 Fc區，其中抗CD47抗體包含a) VH包含：SEQ ID NO: 50之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；SEQ ID NO: 67之胺基酸序列或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體，及SEQ ID NO: 84之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；且b) VL包含：SEQ ID NO: 101之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；SEQ ID NO: 118之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及SEQ ID NO: 135之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於某些實施例中，本文提供之經分離之抗CD47抗體或其抗原結合片段包含IgG1 Fc區，其中抗CD47抗體包含a) VH包含：SEQ ID NO: 50之胺基酸序列、SEQ ID NO: 67之胺基酸序列及SEQ ID NO: 84之胺基酸序列，或SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 67及/或SEQ ID NO: 84之變體包含多達5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；且b) VL包含：SEQ ID NO: 101之胺基酸序列，SEQ ID NO: 118之胺基酸序列及SEQ ID NO: 135之胺基酸序列，或SEQ ID NO: 101，SEQ ID NO: 118，及/或SEQ ID NO: 135之變體包含多達5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於一些實施例中，本文提供之經分離之抗CD47抗體或其抗原結合片段包含IgG1 Fc區，其中抗CD47抗體包含表3A-3B所示之說明性抗體TY21449之一個、兩個、三個、四個、五個或六個CDRs，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於某些實施例中，本文提供之經分離之抗CD47抗體或其抗原結合片段包含IgG1 Fc區，其中抗CD47抗體包含包含SEQ ID NO: 31之胺基酸序列之VH，或胺基酸序列與SEQ ID NO: 31之胺基酸序列具有至少80% (例如，至少85%，90%，95%，98%或99%；或100%)序列同一性；包含SEQ ID NO: 32之胺基酸序列之VL，或胺基酸序列與SEQ ID NO: 32之胺基酸序列具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性。於一些實施例中，本文提供之經分離之抗CD47抗體或其抗原結合片段，包含IgG1 Fc區，其中抗CD47抗體包含如表4A所示之說明性抗體TY21449之VH及/或VL，或與如表4A所示之說明性抗體TY21449之VH及/或VL具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性之一個或多個胺基酸序列。於一些實施例中，IgG1 Fc區包含S239D取代及/或I332E取代。於某些實施例中，IgG1 Fc區包含S239D取代及I332E取代。於某些實施例中，人類IgG1 Fc區包含兩個Fc結構域，其中兩個Fc結構域中的每一個包含S239D取代及/或I332E取代(例如，S239D取代及I332E取代)。於一些實施例中，IgG1 Fc區具有增強之抗體依賴性細胞毒性(ADCC)及/或抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)功能。
於一些實施例中，經分離之抗體包含人類IgG4 Fc區。本揭示案之經分離之抗體可包含IgG4 Fc區及本文所用之CDR、VH、VL及/或輕鏈序列之任意組合。於一些實施例中，經分離之抗體包含包含VL之輕鏈之第一多肽及自N端至C端包含VH及人類IgG4 Fc區之重鏈之第二多肽。於某些實施例中，a)第一多肽之VL包含SEQ ID NO: 99之胺基酸序列、SEQ ID NO: 116之胺基酸序列及/或SEQ ID NO: 133之胺基酸序列；及/或b)第二多肽之VH包含SEQ ID NO: 48之胺基酸序列，SEQ ID NO: 65之胺基酸序列及/或SEQ ID NO: 82之胺基酸序列。於一些實施例中，第一多肽之VL包含表3B所示之說明性抗體TY21446之一個、兩個或三個CDRs，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或第二多肽之VH包含表3A所示之說明性抗體TY21446之一個、兩個或三個CDRs，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於一些實施例中，第一多肽之VL包含SEQ ID NO: 28之胺基酸序列，及/或第二多肽之VH包含SEQ ID NO: 27之胺基酸序列。於某些實施例中，第一多肽包含如表4A所示之說明性抗體TY21446之VL，或胺基酸序列與表4A所示之說明性抗體TY21446之VL具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性；第二多肽包含如表4A所示之說明性抗體TY21446之VH，或胺基酸序列與表4A所示之說明性抗體TY21446之VH具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性。於某些實施例中，第一多肽包含SEQ ID NO: 140之胺基酸序列，或胺基酸序列與SEQ ID NO: 140之胺基酸序列具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性；及/或第二多肽包含SEQ ID NO: 141之胺基酸序列，或胺基酸序列與SEQ ID NO: 141之胺基酸序列具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性。於一些實施例中，第一多肽包含如表6所示抗體TY21446之輕鏈，或胺基酸序列與表6所示說明性抗體TY21446之輕鏈之胺基酸序列具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性；及/或第二多肽包含如表6所示之TY21446之重鏈，或胺基酸序列與表6所示說明性抗體TY21446之重鏈之胺基酸序列具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性。
於一些實施例中，經分離之抗體包含人類IgG1 Fc區。本揭示案之經分離之抗體可包含IgG1 Fc區及本文所用之CDR、VH、VL及/或輕鏈序列之任意組合。於一些實施例中，經分離之抗體包含包含VL之輕鏈之第一多肽及自N端至C端包含VH及人類IgG1 Fc區之重鏈之第二多肽。於某些實施例中，a)第一多肽之VL包含SEQ ID NO: 99之胺基酸序列、SEQ ID NO: 116之胺基酸序列及/或SEQ ID NO: 133之胺基酸序列；及/或b)第二多肽之VH包含SEQ ID NO: 48之胺基酸序列，SEQ ID NO: 65之胺基酸序列及/或SEQ ID NO: 82之胺基酸序列。於一些實施例中，第一多肽之VL包含SEQ ID NO: 28之胺基酸序列，及/或第二多肽之VH包含SEQ ID NO: 27之胺基酸序列。於某些實施例中，第一多肽包含SEQ ID NO: 144之胺基酸序列，或胺基酸序列與SEQ ID NO: 144之胺基酸序列具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性；及/或第二多肽包含SEQ ID NO: 145之胺基酸序列，或胺基酸序列與SEQ ID NO: 145之胺基酸序列具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性。於一些實施例中，第一多肽包含如表6所示抗體TY26896之輕鏈，或胺基酸序列與表6所示說明性抗體TY26896之輕鏈胺基酸序列具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性；及/或第二多肽包含如表6所示之TY26896之重鏈，或胺基酸序列與表6所示說明性抗體TY26896之重鏈胺基酸序列具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性。
於一些實施例中，經分離之抗體包含具有一個或多個胺基酸取代之人類IgG1 Fc區。所述IgG1 Fc區可包含此項技術中已知之任何胺基酸取代，以賦予具有IgG1 Fc區之抗體所需之性質。於一些實施例中，IgG1 Fc區具有增強之抗體依賴性細胞毒性(ADCC)及/或抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)功能。於某些實施例中，人類IgG1 Fc區包含S239D取代及/或I332E取代。於某些實施例中，人類IgG1 Fc區包含兩個Fc結構域，其中兩個Fc結構域中的每一個包含S239D取代及/或I332E取代(例如，S239D取代及I332E取代)。本揭示案之經分離之抗體可包含IgG1 Fc區，該區域包含S239D取代及/或I332E取代以及本文所用之CDR、VH、VL及/或輕鏈序列之任意組合。於一些實施例中，經分離之抗體包含包含VL之輕鏈之第一多肽及自N端至C端包含VH及包含S239D取代及/或I332E取代之人類IgG1 Fc區之重鏈之第二多肽。於某些實施例中，經分離之抗體具有增強之ADCC活性。於一些實施例中，經分離之抗體包含包含VL之輕鏈之第一多肽及自N端至C端包含VH及人類IgG1 Fc區之重鏈之第二多肽。於某些實施例中，a)第一多肽之VL包含SEQ ID NO: 99之胺基酸序列、SEQ ID NO: 116之胺基酸序列及/或SEQ ID NO: 133之胺基酸序列；及/或b)第二多肽之VH包含SEQ ID NO: 48之胺基酸序列，SEQ ID NO: 65之胺基酸序列及/或SEQ ID NO: 82之胺基酸序列。於一些實施例中，第一多肽之VL包含SEQ ID NO: 28之胺基酸序列，及/或第二多肽之VH包含SEQ ID NO: 27之胺基酸序列。於某些實施例中，第一多肽包含SEQ ID NO: 146之胺基酸序列，或胺基酸序列與SEQ ID NO: 146之胺基酸序列具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性；及/或第二多肽包含SEQ ID NO: 147之胺基酸序列，或胺基酸序列與SEQ ID NO: 147之胺基酸序列具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性。於一些實施例中，第一多肽包含如表6所示抗體TY26897之輕鏈，或胺基酸序列與表6所示抗體TY26897之輕鏈之胺基酸序列具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性；及/或第二多肽包含如表6所示TY26897之重鏈，或胺基酸序列與如表6所示TY26897之重鏈之胺基酸序列具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性。
此外，本揭示案提供之抗體可為單克隆或多克隆的。於較佳之實施例中，經分離之抗體為單克隆。
本揭示案提供之特異性經分離之抗體之實例包含表3A-6中列出之抗體。還提供了這些抗體之重鏈可變區、IgG1及IgG4亞類的全長重鏈、輕鏈可變區及全長輕鏈之胺基酸序列。
還提供了抗CD47抗體，其與本文所用之任何一種抗CD47抗體競爭性結合到相同之表位，包含表3A-6中列出之抗體。
於一些實施例中，經分離之抗體或其抗原結合片段以約500 nM或更低(例如，約500 nM或更低、約400 nM或更低、約300 nM或更低、約200 nM或更低、約150 nM或更低、約100 nM或更低、約90 nM或更低、約80 nM或更低、約75 nM或更低、約70 nM或更低、約60 nM或更低、約50 nM或更低、約40 nM或更低、約30 nM或更低、約25 nM或更低、約20 nM或更低、約10 nM或更低、約1 nM或更低、約0.1 nM或更低等)之K
D特異性結合人類CD47。於一些實施例中，經分離之抗體或其抗原結合片段以約100 nM或更低之K
D特異性結合人類CD47。於一些實施例中，經分離之抗體或其抗原結合片段以約50 nM或更低之K
D特異性結合人類CD47。於一些實施例中，經分離之抗體或其抗原結合片段以約10 nM或更低之K
D特異性結合人類CD47。量測抗體或其抗原結合片段之K
D之方法可以使用此項技術中已知之任何方法來進行，包含例如藉由表面電漿子共振、ELISA、等溫滴定量熱法、篩檢程式結合檢定法、EMSA 等。於一些實施例中，K
D藉由表面電漿子共振來量測(參見例如，下述實例2)。
於一些實施例中，經分離之抗體或其抗原結合片段以約500 nM或更低(例如，約500 nM或更低、約400 nM或更低、約300 nM或更低、約200 nM或更低、約150 nM或更低、約100 nM或更低、約90 nM或更低、約80 nM或更低、約75 nM或更低、約70 nM或更低、約60 nM或更低、約50 nM或更低、約40 nM或更低、約30 nM或更低、約25 nM或更低、約20 nM或更低、約10 nM或更低、約1 nM或更低、約0.1 nM或更低等)之半最大效應濃度(EC50)在活體外結合人類CD47。於一些實施例中，抗體或其抗原結合片段以約100 nM或更低之EC50在活體外結合人類CD47。於一些實施例中，抗體或其抗原結合片段以約10 nM或更低之EC50在活體外結合人類CD47。於一些實施例中，抗體或其抗原結合片段以約1 nM或更低之EC50在活體外結合人類CD47。量測抗體或其抗原結合片段之EC50結合靶(例如CD47)之方法可以使用此項技術中已知之任何方法來進行，包含例如藉由表面電漿子共振、ELISA、篩檢程式結合檢定法、EMSA等。於一些實施例中，EC50藉由ELISA來量測(參見例如，下述實例2)。
於一些實施例中，經分離之抗體或其抗原結合片段以約500 nM或更低(例如，約500 nM或更低、約400 nM或更低、約300 nM或更低、約200 nM或更低、約150 nM或更低、約100 nM或更低、約90 nM或更低、約80 nM或更低、約75 nM或更低、約70 nM或更低、約60 nM或更低、約50 nM或更低、約40 nM或更低、約30 nM或更低、約25 nM或更低、約20 nM或更低、約10 nM或更低、約1 nM或更低、約0.1 nM或更低等)之半抑制濃度(IC50)在活體外阻斷人類CD47與人類SIRPα之結合。於一些實施例中，抗體或其抗原結合片段以約100 nM或更低之IC50在活體外阻斷人類CD47與人類SIRPα之結合。於一些實施例中，抗體或其抗原結合片段以約25 nM或更低之IC50在活體外阻斷人類CD47與人類SIRPα之結合。於一些實施例中，抗體或其抗原結合片段以約10 nM或更低之IC50在活體外阻斷人類CD47與人類SIRPα之結合。於一些實施例中，抗體或其抗原結合片段以約5 nM或更低之IC50在活體外阻斷人類CD47與人類SIRPα之結合。量測抗體或其抗原結合片段之IC50結合靶(例如CD47)之方法可以使用此項技術中已知之任何方法來進行，包括例如藉由表面電漿子共振、ELISA、篩檢程式結合檢定法、EMSA 等。於一些實施例中，IC50藉由ELISA來量測(參見例如，下述實例2)。
於某些實施例中，當抗體或其抗原結合片段以約1 nM或更高之濃度(例如，約1 nM或更高，約5 nM或更高，約10 nM或更高，約20 nM或更高、約40 nM或更高、約60 nM或更高、約80 nM或更高、約100 nM或更高、約200 nM或更高、約400 nM或更高、約600 nM或更高、約800 nM或更高、約1 μM或更高、約2 μM或更高、約4 μM或更高，約6 μM或更高，約8 μM或更高，約10 μM或更高，約20 μM或更高，約40 μM或更高，約60 μM或更高，約80 μM或更高，約100 μM或更高等)提供時，抗體或其抗原結合片段在活體外完全阻斷人類CD47與人類SIRPα之結合。於一些實施例中，當經分離之抗體或其抗原結合片段以約1 μM或更高濃度提供時，抗體或其抗原結合片段在活體外完全阻斷人類CD47與人類SIRPα之結合。於一些實施例中，當抗體或其抗原結合片段以約100 nM或更高濃度提供時，抗體或其抗原結合片段在活體外完全阻斷人類CD47與人類SIRPα之結合。於一些實施例中，當抗體或其抗原結合片段以約100 nM或更高濃度提供時，抗原結合片段在活體外完全阻斷人類CD47與人類SIRPα之結合。於一些實施例中，當抗體或其抗原結合片段以約10 nM或更高濃度提供時，抗體或其抗原結合片段在活體外完全阻斷人類CD47與人類SIRPα之結合。如本文所用，術語「完全阻斷(complete blocking)」或「完全地阻斷(completely blocks)」系指抗體或抗原結合片段將第一蛋白質與第二蛋白質之間之結合減少至少約80% (例如，至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約99%等)之能力。量測抗體或抗原結合片段阻斷第一蛋白質(例如CD47)及第二蛋白質(例如SIRPα)之結合之能力之方法為此項技術中已知的，包括但不限於藉由BIAcore分析、ELISA檢定及流動式細胞量測術(參見例如，下述實例2)。
於一些實施例中，抗體或其抗原結合片段以約500 nM或更低(例如，約500 nM或更低、約400 nM或更低、約300 nM或更低、約200 nM或更低、約150 nM或更低、約100 nM或更低、約90 nM或更低、約80 nM或更低、約75 nM或更低、約70 nM或更低、約60 nM或更低、約50 nM或更低、約40 nM或更低、約30 nM或更低、約25 nM或更低、約20 nM或更低、約10 nM或更低、約1 nM或更低、約0.1 nM或更低等)之半最大效應濃度(EC50)在活體外與腫瘤細胞結合。於一些實施例中，抗體或其抗原結合片段以約50 nM或更低之EC50在活體外結合人類CD47。於一些實施例中，抗體或其抗原結合片段以約10 nM或更低之EC50在活體外與腫瘤細胞結合。於一些實施例中，抗體或其抗原結合片段以約5 nM或更低之EC50在活體外與腫瘤細胞結合。於一些實施例中，抗體或其抗原結合片段以約1 nM或更低之在活體外與腫瘤細胞結合。於某些實施例中，腫瘤細胞包含B細胞淋巴瘤細胞株(例如Raji細胞株)。於進一步之實施例中，所述腫瘤細胞包含T細胞淋巴瘤細胞株(例如CEM細胞株)。量測抗體或抗原結合片段之EC50結合靶腫瘤細胞之方法可以使用此項技術中已知之任何方法來進行，包括例如流動式細胞量測術(參見例如，下述實例6)。
於一些實施例中，抗體或其抗原結合片段以約100 nM或更低(例如，約100 nM或更低、約90 nM或更低、約80 nM或更低、約75 nM或更低、約70 nM或更低、約60 nM或更低、約50 nM或更低、約40 nM或更低、約30 nM或更低、約25 nM或更低、約20 nM或更低、約10 nM或更低、約5 nM或更低、約2 nM或更低、約1 nM或更低、約0.5 nM或更低、約0.4 nM或更低、約0.3 nM或更低、約0.2 nM、約0.1 nM或更低等)之半最大效應濃度(EC50)在活體外增加腫瘤細胞之巨噬細胞吞噬作用。一些實施例中，抗體或其抗原結合片段以約10 nM或更低之EC50在在活體外增加腫瘤細胞之巨噬細胞吞噬作用。於一些實施例中，抗體或其抗原結合片段以約5 nM或更低之EC50在活體外增加腫瘤細胞之巨噬細胞吞噬作用。於一些實施例中，抗體或其抗原結合片段以約1 nM或更低之EC50在活體外增加腫瘤細胞之巨噬細胞吞噬作用。於一些實施例中，當以1 μM或更高濃度提供時，抗體或其抗原結合片段導致活體外腫瘤細胞之最大巨噬細胞吞噬作用約為20%或更高(例如，約20%或更高，約30%或更高，約40%或更高，約50%或更高，約60%或更高，約70%或更高，約80%或更高，約90%或更高，約95%或更高等)。於某些實施例中，當以1 μM或更高濃度提供時，抗體或其抗原結合片段導致體外腫瘤細胞之最大巨噬細胞吞噬作用增加約50%或更高(例如，約50%或更高，約2倍或更高，約3倍或更高，約4倍或更高，約5倍或更高，約10倍或更高等)，與抗體或其抗原結合片段相比，以相同濃度提供時不結合CD47。於某些實施例中，腫瘤細胞包含B細胞淋巴瘤細胞株(例如Raji細胞株)。於進一步之實施例中，所述腫瘤細胞包含T細胞淋巴瘤細胞株(例如CEM細胞株)。量測抗體或其抗原結合片段之EC50在活體外增加腫瘤細胞之巨噬細胞吞噬作用之方法可以使用此項技術中已知之任何方法來進行，包括例如流動式細胞量測術(參見例如，下述實例9)。
於一些實施例中，抗體或其抗原結合片段具有抗體依賴性細胞毒性(ADCC)活性。ADCC由免疫細胞(例如自然殺傷(NK)細胞)介導，在體液免疫應答中起重要作用(例如，對感染，對腫瘤細胞等)。於一些實施例中，當以0.01 nM或更高濃度提供時，抗體或其抗原結合片段之ADCC活性導致腫瘤細胞裂解約5%或更高(例如，約5%或更高，約10%或更高，約15%或更高，約20%或更高，約25%或更高，約30%或更高，約40%或更高，約50%或更高等)。於一些實施例中，當以0.1 nM或更高濃度提供時，抗體或其抗原結合片段之ADCC活性導致腫瘤細胞裂解約10%或更高(例如，約10%或更高、約15%或更高、約20%或更高、約25%或更高、約30%或更高、約40%或更高、約50%或更高等)。於一些實施例中，當以1 nM或更高濃度提供時，抗體或其抗原結合片段之ADCC活性導致腫瘤細胞裂解約20%或更高(例如，約20%或更高、約25%或更高、約30%或更高、約40%或更高、約50%或更高等)。於某些實施例中，腫瘤細胞包含B細胞淋巴瘤細胞株(例如Raji細胞株)的。於進一步之實施例中，腫瘤細胞包含T細胞淋巴瘤細胞株(例如CEM細胞株)。量測ADCC抗體及抗原結合片段之方法系此項技術中已知，並且包括例如下述實例10中描述之方法。
於一些實施例中，抗體、抗原結合片段或可活化抗體(例如食蟹猴)、大鼠及/或狗CD47交叉反應。於一些實施例中，抗體、抗原結合片段或可活化抗體與猴CD47交叉反應。於一些實施例中，抗體、抗原結合片段或可活化抗體與大鼠CD47交叉反應。於一些實施例中，抗體、抗原結合片段或可活化抗體與狗CD47交叉反應。於一些實施例中，抗體、抗原結合片段或可活化抗體與猴及大鼠CD47；猴及狗CD47；大鼠及狗CD47或猴、大鼠及狗CD47交叉反應。於一些實施例中，抗體、抗原結合片段或可活化抗體在約100 nM (例如，在約1 nM、約10 nM、約25 nM、約50 nM、約75 nM、約100 nM)與猴(例如食蟹猴)、大鼠及/或狗CD47交叉反應。量測抗體交叉反應性之方法為此項技術中已知的，包括但不限於表面電漿子共振、ELISA、等溫滴定量熱法、篩檢程式結合檢定法、EMSA等。於一些實施例中，交叉反應藉由ELISA來量測(參見例如，下述實例5)。
於某些實施例中，抗體、抗原結合片段或可活化抗體與食蟹猴CD47交叉反應。於一些實施例中，抗體或其抗原結合片段以約100 nM或更低(例如，約100 nM或更低、約90 nM或更低、約80 nM或更低、約75 nM或更低、約70 nM或更低、約60 nM或更低、約50 nM或更低，約40 nM或更低，約30 nM或更低，約25 nM或更低，約20 nM或更低，約10 nM或更低，約5 nM或更低，約2 nM或更低，約1 nM或更低，約0.5 nM或更低，約0.4 nM或更低，約0.3 nM或更低，約0.2 nM或更低，約0.1 nM以下等)之半最大效應濃度(EC50)在活體外與食蟹猴CD47結合。於一些實施例中，抗體或其抗原結合片段以約10 nM或更低之EC50在活體外與食蟹猴CD47結合。於一些實施例中，抗體或其抗原結合片段以約5 nM或更低之EC50在活體外與食蟹猴CD47結合。於一些實施例中，抗體或其抗原結合片段以約1 nM或更低之EC50在活體外與食蟹猴CD47結合。
本揭示案之抗體可以藉由此項技術中已知之技術產生，包括習知之單株抗體方法，例如標準體細胞雜交技術(參見例如Kohler及Milstein, Nature 256:495 (1975)、B淋巴球之病毒或致癌轉化或如下文詳述之重組抗體技術。
融合瘤之產生為非常完善之程式。用於製備融合瘤之常見動物系統為鼠類系統。用於分離經免疫脾細胞以用於融合之免疫方案及技術為此項技術中已知之。融合配偶體(例如鼠類骨髓瘤細胞)及融合程式亦為已知之。可用於製備本揭示案提供之人類CD47抗體之一種眾所周知的方法涉及使用XENOMOUSE
™動物系統。XENOMOUSE
™小鼠為經工程改造之小鼠品系，其包含人免疫球蛋白重鏈及輕鏈基因座之大片段，且小鼠抗體產生不足。參見例如Green 等人, Nature Genetics 7:13-21 (1994)及WO2003/040170。用CD47抗原免疫動物。分離出CD47抗原且/或純化CD47，較佳CD47。其可以為CD47之片段，例如CD47胞外域片段，特別為包含SEQ ID NO: 1之胺基酸殘基34-108或34-93之CD47胞外域片段。動物之免疫可以藉由在此項技術中已知之任何方法來執行。參見例如Harlow及Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1990。用於免疫非人動物例如小鼠、大鼠、綿羊、山羊、豬、牛及馬之方法為此項技術眾所周知的。參見例如Harlow及Lane, 同上及美國專利第5,994,619號。CD47抗原可以與佐劑一起投與以刺激免疫反應。示範性佐劑包括完全或不完全弗氏佐劑、RIBI (胞壁醯基二肽)或ISCOM (免疫刺激複合物)。用CD47抗原免疫動物後，由分離自免疫動物之細胞中製備產生抗體之永生細胞系。免疫後，處死動物並使淋巴結及/或脾臟B細胞永生。使細胞永生化之方法包括但不限於用癌基因轉移該等細胞、用致癌病毒感染該等細胞、在選擇永生細胞之條件下培養該等細胞、使該等細胞經受致癌或突變化合物、將該等細胞與永生化細胞(例如骨髓瘤細胞)融合及使腫瘤抑制基因失活。參見例如Harlow及Lane, 同上。若使用與骨髓瘤細胞之融合，則骨髓瘤細胞較佳不分泌免疫球蛋白多肽(非分泌細胞系)。使用CD47、其一部分或表現CD47之細胞篩選永生化細胞。選擇、選殖產生CD47抗體之細胞( 例如融合瘤)，且針對所需特徵進行進一步篩選，該等特徵包括穩健生長、高抗體產量及所需抗體特徵，如下文進一步論述。融合瘤可以在活體內在同基因動物中、在缺乏免疫系統之動物(例如裸鼠)中或活體外細胞培養中擴增。選擇、選殖及擴增融合瘤之方法為普通熟習此項技術者眾所周知的。
亦可以使用噬菌體展示或酵母展示方法來製備本揭示案之抗體。此類用於分離人抗體之展示方法為此項技術中既定的，例如Achim Knappik等人, “Fully Synthetic Human Combinatorial Antibody Libraries (HuCAL) Based on Modular Consensus Frameworks and CDRs Randomized with Trinucleotides.” J. Mol. Biol. (2000) 296, 57-86；及Michael J. Feldhaus, 等人, “Flow-cytometric isolation of human antibodies from a non-immune Saccharomyces cerevisiae surface display library” Nat Biotechnol (2003) 21:163-170。
B-2. 經遮蔽抗體
於一些態樣，本文提供與CD47結合之經遮蔽抗體。於一些實施例中，經遮蔽抗體包含：(a)遮蔽性肽，其自N端至C端包含遮蔽性部分(MM)及連接部分(LM)；及(b)靶結合部分(TBM)，其包含抗體重鏈可變區(VH)及抗體輕鏈可變區(VL)，其中TBM與人類CD47結合。於某些實施例中，遮蔽性肽與VH或VL之N端相連。於優選實施例中，MM與人類CD47競爭結合TBM。TBM可以包含本文所用之抗CD47抗體或抗原結合片段之一個或多個序列，包括所述抗體或抗原結合片段參照CDRs之特定胺基酸序列、可變區域(VL、VH)及/或輕鏈及重鏈(例如IgG1、IgG2、IgG4)。於一些實施例中，TBM包含本文所用之一個或多個抗CD47抗體之全長抗體輕鏈及/或全長抗體重鏈。
於一些實施例中，本發明涉及與人類CD47結合之經遮蔽抗體具有至少一種(例如，至少一種、至少兩種、至少三種、至少四種、至少五種、至少六種、至少七種、至少八種、至少九種、至少10種、至少11種、至少12種、或全部13種)以下功能特性；(a)與具有相同TBM但缺少遮蔽性肽之親本抗體相比，與人類CD47結合具有更高之K
D：(b)與具有相同TBM但缺少遮蔽性肽之親本抗體相比，與人類CD47結合具有更高之半最大效應濃度(EC50)；(c)與具有相同TBM但缺少遮蔽性肽之親本抗體相比，具有更高之半抑制濃度(IC50)在活體外阻斷人類CD47與人類SIRPα之結合；(d)當經遮蔽抗體以約1 nM或更高濃度提供時，在活體外完全阻斷人類CD47與人類SIRPα之結合；(e)與具有相同TBM但缺少遮蔽性肽之親本抗體相比，具有更高之EC50在活體外與腫瘤細胞結合；(f)與具有相同TBM但缺少遮蔽性肽之親本抗體相比，在活體外與紅血球(RBC)之結合減少；(g)與具有相同TBM但缺少遮蔽性肽之親本抗體相比，具有更高之EC50增加活體外腫瘤細胞之巨噬細胞吞噬作用；(h)以500 nM或更低之K
D與人類CD47結合；(i)與猴、大鼠或狗CD47交叉反應；(j)能夠抑制腫瘤細胞生長；(k) 對癌症有一項或多項有治療作用；(l)阻斷CD47及SIRP蛋白之間之結合(例如，SIRPα)；且(m)引起表現CD47之腫瘤細胞之抗體依賴性細胞毒性(ADCC)。
於一些實施例中，經遮蔽抗體選擇性地與具有高CD47表現水準之組織及細胞結合。避免受理論約束，因為MM與人類CD47競爭結合TBM，在CD47表現水準足夠高之細胞及組織中，經遮蔽抗體選擇性地結合CD47，因此，細胞表面CD47之局部濃度足夠高。這種在高表現靶點(如CD47)之組織及細胞上選擇性地與靶點(如CD47)結合之現象可稱為選擇性靶作用。於某些實施例中，與具有相同TBM但缺少遮蔽性部分之遮蔽性肽之抗CD47抗體相比，本文所用之抗CD47經遮蔽抗體之選擇性靶作用引起靶向非腫瘤效應(例如，抗原沉沒效應、貧血)之降低。
於一些實施例中，經遮蔽抗體包含靶結合部分(TBM)。於一些實施例中，TBM包含抗體輕鏈可變區及/或抗體重鏈可變區。於一些實施例中，TBM包含抗體輕鏈可變區。於一些實施例中，TBM包含抗體重鏈可變區。於一些實施例中，TBM包含抗體輕鏈可變區及抗體重鏈可變區。於一些實施例中，所述抗體重鏈可變區為抗體輕鏈可變區之C端。於一些實施例中，所述抗體輕鏈可變區為抗體重鏈可變區之C-端。於一些實施例中，本發明之TBM包含針對CD47具有特異性之抗體輕鏈可變區及/或抗體重鏈可變區。於一些實施例中，TBM包含全長抗體輕鏈及/或全長抗體重鏈。抗體輕鏈可以為κ或λ輕鏈。抗體之重鏈可為任何類別，諸如IgG、IgM、IgE、IgA或IgD。於一些實施例中，抗體重鏈為IgG類別，諸如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4子類別。可使用此項技術中已知之方法將抗體重鏈自一種類別或子類別轉變成另一種類別或子類別。本文所用之任何一個或多個TBMs可以包含本文所用之任何抗CD47抗體之任何CDR序列(例如，一個，兩個或三個重鏈可變區之CDR序列，及/或一個，兩個或三個輕鏈可變區之CDR序列)，重鏈可變區序列及/或本文之輕鏈可變區序列。
於一些實施例中，經遮蔽抗體或其抗原結合片段包含自N端至C端包含遮蔽性肽及VL之第一多肽，以及包含VH之第二多肽(例如，Fab片段)。於其他實施例中，經遮蔽抗體或其抗原結合片段包含自N端至C端包含遮蔽性肽及VH之第一多肽，以及包含VL之第二多肽(例如，Fab片段)。於其他實施例中，經遮蔽抗體或其抗原結合片段包含自N端至C端包含遮蔽性肽、VL及VH(例如scFv)之第一多肽。於另外之實施例中，經遮蔽抗體或其抗原結合片段包含自N端至C端包含遮蔽性肽、VH及VL(例如scFv)之第一多肽。
於一些實施例中，經遮蔽抗體或其抗原結合片段包含自N端至C端包含遮蔽性肽及VL之第一多肽，包含VH之第二多肽，包含遮蔽性肽及VL之第三多肽，及包含VH之第四多肽。於某些實施例中，經遮蔽抗體包含自N端至C端包含遮蔽性肽及VL之第一多肽，包含VH及第一Fc區之第二多肽，包含遮蔽性肽及VL之第三多肽，及包含VH及第二Fc區之第四多肽。於某些實施例中，第一及第二Fc區相同。於其他實施例中，第一及第二Fc區不同。於一些實施例中，第一及第二Fc區都為IgG4 Fc區(例如，人類IgG4 Fc區)。第一及第二IgG4 Fc區可以相同或不同。於其他實施例中，第一及第二Fc區都為IgG1 Fc區(例如，人類IgG1 Fc區)。第一及第二IgG1 Fc區可以相同或不同。於一些實施例中，第一及第二IgG1 Fc區分別包含S239D取代及/或I332E取代。於某些實施例中，第一及第二IgG1 Fc區分別包含S239D取代及I332E取代。
於一些實施例中，經遮蔽抗體或其抗原結合片段包含自N端至C端包含MM及LM之遮蔽性肽。於一些實施例中，MM包含根據式(XVI)：X1X2X3X4X5X6CX7DDX8X9X10CX11X12 (SEQ ID NO: 197)之胺基酸序列，其中X1為D，H，N或Y，X2為A，D，F，P，T或Y，X3為A，L，N，P，T或Y，X4為A，D，H或S，X5為A，D，F，H或N，X6為D、S或T，X7為D、S或Y，X8為D、F或Y，X9及X11分別為獨立的A、D或Y，X10為A、D、F或P，X12 為D、F、I、T或Y。於某些實施例中，MM包含根據式(XVII)：X1X2X3X4X5DCPX6X7DX8X9CX10X11 (SEQ ID NO: 198)之胺基酸序列，其中X1為A、N或P，X2為A、N、P或Q，X3為A、D或S，X4為A、D、S或V，X5為D、F或P，X6為A、D或T，X7為A、H或Y，X8為A、D或V，X9為F或Y，X10為D、N、S或Y，X11為D、P或V。於某些實施例中，MM包含根據式(XVIII)：X1X2X3X4X5X6CDX7X8X9X10X11CX12A (SEQ ID NO: 199)之胺基酸序列，其中X1為A或L，X2為A或T，X3為S或V，X4為D或P，X5為A或Y，X6為F或T，X7為D或I，X8為D或T，X9為L或P，X10為F或L，X11為F或Y，X12為N或P。於另外實施例中，MM包含根據式(XIX)：X1X2CX3X4X5X6X7X8X9FCX10X11 (SEQ ID NO: 200)之胺基酸序列，其中X1為D，F或V，X2為A、S或Y，X3為P、R或T，X4為A、G或I，X5為A、E或F，X6為A、D或V，X7為D或V，X8為D或G，X9為I或P，X10為I或S，X11為A、Q或V。於一些實施例中，MM包含選自由SEQ ID NOs: 137及167-181組成之群之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於某些實施例中，MM包含SEQ ID NO: 137之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於一些實施例中，MM包含如表5A所述說明性抗體之MM胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於某些實施例中，所述MM包含如表5A所述說明性抗體TY26294之MM胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。
於一些實施例中，遮蔽性肽還包含一個或多個(例如，一個、兩個、三個或多個)連接體。於某些實施例中，MM還包含一個或多個(例如，一個、兩個、三個或多個)連接體。可以使用此項技術中已知之任何合適的連接體(例如，柔性連接體)，包括例如：甘胺酸聚合物(G)n，其中n是至少1的整數(例如，至少一個，至少2個，至少3個，至少4個，至少5個，至少6個，至少7個，至少8個，至少9個，至少10個等)；甘胺酸-絲胺酸聚合物(GS)n，其中n是至少1的整數(例如，至少1，至少2，至少3，至少4，至少5，至少6，至少7，至少8，至少9，至少10等)；甘胺酸-丙胺酸聚合物；丙胺酸-絲胺酸聚合物；等等。連接體序列可以是任意長度，例如約1個胺基酸(例如甘胺酸或絲胺酸)至約20個胺基酸(例如，20個胺基酸的甘胺酸聚合物或甘胺酸-絲胺酸聚合物)，約1個胺基酸至約15個胺基酸，約3個胺基酸至約12個胺基酸，約4個胺基酸至約10個胺基酸，約5個胺基酸至約9個胺基酸，約6個胺基酸至約8個胺基酸等。於一些實施例中，連接體長度為約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個胺基酸中的任一者。
於一些實施例中，本文中所述之遮蔽性肽中之任一者可另包含一或多個另外胺基酸序列(例如，一或多個多肽標籤)。適宜另外胺基酸序列之實例可包括(不限於)純化標籤(諸如his-標籤、flag-標籤、麥芽糖結合蛋白及谷胱甘肽-S-轉移酶標籤)、檢測標籤(諸如可亮度學檢測之標籤(例如，紅色或綠色螢光蛋白等))、具有可檢測之酵素活性之標籤(例如，鹼性磷酸酶等)、含有分泌序列、前導序列及/或穩定序列之標籤、蛋白酶裂解位點(例如，弗林蛋白酶(furin)裂解位點、TEV裂解位點、凝血酶裂解位點)及類似者。於一些實施例中，一或多個另外胺基酸序列在遮蔽性肽之N端。
於一些實施例中，遮蔽性肽不包含可裂解部分(CM)。於其它實施例中，遮蔽性肽包含可裂解部分(CM)。於某些實施例中，CM包含至少一個裂解位點。所述裂解位點可系此項技術中已知的或本文所用之任一裂解位點。
於一些實施例中，連接部分(LM)不包含可裂解部分(CM)。於其它實施例中，連接部分(LM)包含可裂解部分(CM)。於某些實施例中，CM包含至少一個裂解位點。所述裂解位點可系此項技術中已知之或本文所用之任一裂解位點。
於某些實施例中，經遮蔽抗體包含自N端至C端包含遮蔽性肽及VL之第一多肽，及包含VH之第二多肽。於一些實施例中，第二多肽進一步包含Fc區。於一些實施例中，Fc區為IgG4 Fc區。於一些實施例中，Fc區為IgG1 Fc區。於某些實施例中，Fc區為IgG1 Fc區，所述IgG1 Fc區包含S239D取代及/或I332E取代，其中編號根據Kabat。於某些實施例中，Fc區為IgG1 Fc區，所述IgG1 Fc區包含S239D取代及I332E取代，其中編號根據Kabat。於某些實施例中，包含S239D取代及I332E取代之IgG1 Fc區域在Lazar等人(Engineered antibody Fc variants with enhanced effector function." PNAS 103.11 (2006): 4005-4010)中有詳細描述。於一些實施例中，a)第一多肽之VL包含選自由SEQ ID NOs: 190-196組成之群之一個或多個胺基酸序列；及/或b)第二多肽之VH包含選自由SEQ ID NOs: 182-189組成之群之一個或多個胺基酸序列。於一些變體中，a)第一多肽之VL包含SEQ ID NOs: 191，194及/或195之胺基酸序列；及/或b)第二多肽之VH包含SEQ ID NOs: 182、185及/或188之胺基酸序列。於某些實施例中，a)第一多肽之VL包含選自由SEQ ID NOs: 31-85組成之群之一個或多個胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或b)第二多肽之VH包含選自由SEQ ID NOs: 86-136組成之群之一個或多個胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於一些變體中，a)第一多肽之VL包含包含選自由SEQ ID NOs: 86-102組成之群之胺基酸序列之CDR-L1，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；包含選自由SEQ ID NOs: 103-119組成之群之胺基酸序列之CDR-L2，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或包含選自由SEQ ID NOs: 120-136組成之群之胺基酸序列之CDR-L3，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或b)第二多肽之VH包含包含選自由SEQ ID NOs: 35-51組成之群之胺基酸序列之CDR-H1，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；包含選自由SEQ ID NOs: 52-68組成之群之胺基酸序列之CDR-H2，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或選自由SEQ ID NOs: 69-85組成之群之胺基酸序列之CDR-H3，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於某些實施例中，a)第一多肽之VL包含SEQ ID NO: 99之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；SEQ ID NO: 116之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或SEQ ID NO: 133之胺基酸序列或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或b)第二多肽之VH包含SEQ ID NO: 48之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；SEQ ID NO: 65之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或SEQ ID NO: 82之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於一些實施例中，第一多肽之VL包含如表3B所示之說明性抗體TY21446之一個、兩個或三個CDRs，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或第二多肽之VH包含如表3A所示之說明性抗體TY21446之一個、兩個或三個CDRs，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於一些實施例中，第一多肽之VL包含SEQ ID NO: 28之胺基酸序列，或胺基酸序列與SEQ ID NO: 28具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性；並且第二多肽之VH包含SEQ ID NO: 27之胺基酸序列，或胺基酸序列與SEQ ID NO: 27具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)之序列同一性。於某些實施例中，第一多肽包含如表4A所示之說明性抗體TY21446之VL，或胺基酸序列與表4A所示之說明性抗體TY21446之VL序列具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性；第二多肽包含如表4A所示之說明性抗體TY21446之VH，或胺基酸序列與表4A所示之說明性抗體TY21446之VH序列具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性。
於一些實施例中，本文提供之經遮蔽抗體包含：(a)遮蔽性肽，自N端至C端包含遮蔽性部分(MM)及連接部分(LM)，及(b)包含抗體重鏈可變區(VH)及抗體輕鏈可變區(VL)之靶結合部分(TBM)，其中TBM與人類CD47結合；其中遮蔽性肽與VL之N端相連；其中MM與人類CD47競爭結合TBM；其中：1) VH包含包含SEQ ID NO: 48之胺基酸序列之CDR-H1，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；包含SEQ ID NO: 65之胺基酸序列之CDR-H2，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或包含SEQ ID NO: 82之胺基酸序列之CDR-H3，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；且2) VL包含包含SEQ ID NO: 99之胺基酸序列之CDR-L1，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；包含SEQ ID NO: 116之胺基酸序列之CDR-L2，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或包含SEQ ID NO: 133之胺基酸序列之CDR-L3，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於一些實施例中，經遮蔽抗體包含：(a)遮蔽性肽，自N端至C端包含MM及LM，及(b)包含VH及VL之TBM，其中TBM與人類CD47結合；其中遮蔽性肽與VL之N端相連；其中MM與人類CD47競爭結合TBM；其中1) VH包含包含SEQ ID NO: 48之胺基酸序列之CDR-H1，包含SEQ ID NO: 65之胺基酸序列之CDR-H2及包含SEQ ID NO: 82之胺基酸序列之CDR-H3；且2) VL包含包含SEQ ID NO: 99之胺基酸序列之CDR-L1，包含SEQ ID NO: 116之胺基酸序列之CDR-L2及包含SEQ ID NO: 133之胺基酸序列之CDR-L3。於一些實施例中，經遮蔽抗體包含：(a)遮蔽性肽，自N端至C端包含MM及LM，及(b)包含VH及VL之TBM，其中TBM與人類CD47結合；其中遮蔽性肽與VL之N端相連；其中MM與人類CD47競爭結合TBM；其中1) VH包含SEQ ID NO: 48之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；SEQ ID NO: 65之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或SEQ ID NO: 82之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；且2) VL包含SEQ ID NO: 99之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；SEQ ID NO: 116之胺基酸序列或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或SEQ ID NO: 133之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於一些實施例中，經遮蔽抗體包含如表3A-3B所示之說明性抗體TY21446之一個、兩個、三個、四個、五個或六個CDRs，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於一些實施例中，MM包含SEQ ID NO: 137之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於一些實施例中，MM包含如表5A所述之說明性抗體TY26294之MM之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於一些實施例中，經遮蔽抗體包含：(a)遮蔽性肽，自N端至C端包含MM及LM，及(b)包含VH及VL之TBM，其中TBM與人類CD47結合；其中遮蔽性肽與VL之N端相連；其中MM與人類CD47競爭結合TBM；其中：1) VH包含SEQ ID NO: 27之胺基酸序列，或胺基酸序列與SEQ ID NO: 27具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性，且2) VL包含SEQ ID NO: 28之胺基酸序列，或胺基酸序列與SEQ ID NO: 28具有至少80% (例如，至少85%，90%，95%，98%或99%；或100%)序列同一性。於一些實施例中，經遮蔽抗體包含如表4A所示之說明性抗體TY21446之VH及/或VL，或與如表4A所示之說明性抗體TY21446之VH及/或VL具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性之一個或多個胺基酸序列。於一些實施例中，經遮蔽抗體包含IgG1 Fc區。於某些實施例中，經遮蔽抗體包含人類IgG1 Fc區。於一些實施例中，IgG1 Fc區包含S239D取代及/或I332E取代。於一些實施例中，IgG1 Fc區包含S239D取代及I332E取代。於某些實施例中，人類IgG1 Fc區包含兩個Fc結構域，其中兩個Fc結構域中的每一個包含S239D取代及/或I332E取代(例如，S239D取代及I332E取代)。於一些實施例中，IgG1 Fc區具有增強之抗體依賴性細胞毒性(ADCC)及/或抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)功能。於一些實施例中，經遮蔽抗體包含IgG4 Fc區。於某些實施例中，經遮蔽抗體包含人類IgG4 Fc區。
於一些實施例中，本文提供之經遮蔽抗體包含：(a)遮蔽性肽，自N端至C端包含遮蔽性部分(MM)及連接部分(LM)，及(b)包含抗體重鏈可變區(VH)及抗體輕鏈可變區(VL)之靶結合部分(TBM)，其中TBM與人類CD47結合；其中遮蔽性肽與VL之N端相連；其中MM與人類CD47競爭結合TBM；其中：1) VH包含包含SEQ ID NO: 49之胺基酸序列之CDR-H1，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；包含SEQ ID NO: 66之胺基酸序列之CDR-H2，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或包含SEQ ID NO: 83之胺基酸序列之CDR-H3，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；且2) VL包含包含SEQ ID NO: 100之胺基酸序列之CDR-L1，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；包含SEQ ID NO: 117之胺基酸序列之CDR-L2，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或包含SEQ ID NO: 134之胺基酸序列之CDR-L3，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於一些實施例中，經遮蔽抗體包含：(a)遮蔽性肽，自N端至C端包含MM及LM，及(b)包含VH及VL之TBM，其中TBM與人類CD47結合；其中遮蔽性肽與VL之N端相連；其中MM與人類CD47競爭結合TBM；其中1) VH包含包含SEQ ID NO: 49之胺基酸序列之CDR-H1，包含SEQ ID NO: 66之胺基酸序列之CDR-H2及包含SEQ ID NO: 83之胺基酸序列之CDR-H3；且2) VL包含包含SEQ ID NO: 100之胺基酸序列之CDR-L1，包含SEQ ID NO: 117之胺基酸序列之CDR-L2及包含SEQ ID NO: 134之胺基酸序列之CDR-L3。於一些實施例中，經遮蔽抗體包含：(a)遮蔽性肽，自N端至C端包含MM及LM，及(b)包含VH及VL之TBM，其中TBM與人類CD47結合；其中遮蔽性肽與VL之N端相連；其中MM與人類CD47競爭結合TBM；其中1) VH包含SEQ ID NO: 49之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；SEQ ID NO: 66之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或SEQ ID NO: 83之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；且2) VL包含SEQ ID NO: 100之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；SEQ ID NO: 117之胺基酸序列或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或SEQ ID NO: 134之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於一些實施例中，經遮蔽抗體包含如表3A-3B所示之說明性抗體TY21447之一個、兩個、三個、四個、五個或六個CDRs，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於一些實施例中，MM包含SEQ ID NO: 137之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於一些實施例中，MM包含如表5A所述之說明性抗體TY26294之MM之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於一些實施例中，經遮蔽抗體包含：(a)遮蔽性肽，自N端至C端包含MM及LM，及(b)包含VH及VL之TBM，其中TBM與人類CD47結合；其中遮蔽性肽與VL之N端相連；其中MM與人類CD47競爭結合TBM；其中：1) VH包含SEQ ID NO: 29之胺基酸序列，或胺基酸序列與SEQ ID NO: 29具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性，且2) VL包含SEQ ID NO: 30之胺基酸序列，或胺基酸序列與SEQ ID NO: 30具有至少80% (例如，至少85%，90%，95%，98%或99%；或100%)序列同一性。於一些實施例中，經遮蔽抗體包含如表4A所示之說明性抗體TY21447之VH及/或VL，或與如表4A所示之說明性抗體TY21447之VH及/或VL具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性之一個或多個胺基酸序列。於一些實施例中，經遮蔽抗體包含IgG1 Fc區。於某些實施例中，IgG1 Fc區包含S239D取代及/或I332E取代。於一些實施例中，經遮蔽抗體包含人類IgG1 Fc區。於某些實施例中，人類IgG1 Fc區包含S239D取代及I332E取代。於某些實施例中，人類IgG1 Fc區包含兩個Fc結構域，其中兩個Fc結構域中的每一個包含S239D取代及/或I332E取代(例如，S239D取代及I332E取代)。於一些實施例中，IgG1 Fc區具有增強之抗體依賴性細胞毒性(ADCC)及/或抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)功能。於一些實施例中，經遮蔽抗體包含IgG4 Fc區。於某些實施例中，經遮蔽抗體包含人類IgG4 Fc區。
於一些實施例中，本文提供之經遮蔽抗體包含：(a)遮蔽性肽，自N端至C端包含遮蔽性部分(MM)及連接部分(LM)，及(b)包含抗體重鏈可變區(VH)及抗體輕鏈可變區(VL)之靶結合部分(TBM)，其中TBM與人類CD47結合；其中遮蔽性肽與VL之N端相連；其中MM與人類CD47競爭結合TBM；其中：1) VH包含包含SEQ ID NO: 50之胺基酸序列之CDR-H1，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；包含SEQ ID NO: 67之胺基酸序列之CDR-H2，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或包含SEQ ID NO: 84之胺基酸序列之CDR-H3，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；且2) VL包含包含SEQ ID NO: 101之胺基酸序列之CDR-L1，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；包含SEQ ID NO: 118之胺基酸序列之CDR-L2，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或包含SEQ ID NO: 135之胺基酸序列之CDR-L3，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於一些實施例中，經遮蔽抗體包含：(a)遮蔽性肽，自N端至C端包含MM及LM，及(b)包含VH及VL之TBM，其中TBM與人類CD47結合；其中遮蔽性肽與VL之N端相連；其中MM與人類CD47競爭結合TBM；其中1) VH包含包含SEQ ID NO: 50之胺基酸序列之CDR-H1，包含SEQ ID NO: 67之胺基酸序列之CDR-H2及包含SEQ ID NO: 84之胺基酸序列之CDR-H3；且2) VL包含包含SEQ ID NO: 101之胺基酸序列之CDR-L1，包含SEQ ID NO: 118之胺基酸序列之CDR-L2及包含SEQ ID NO: 135之胺基酸序列之CDR-L3。於一些實施例中，經遮蔽抗體包含：(a)遮蔽性肽，自N端至C端包含MM及LM，及(b)包含VH及VL之TBM，其中TBM與人類CD47結合；其中遮蔽性肽與VL之N端相連；其中MM與人類CD47競爭結合TBM；其中1) VH包含SEQ ID NO: 50之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；SEQ ID NO: 67之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或SEQ ID NO: 84之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；且2) VL包含SEQ ID NO: 101之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；SEQ ID NO: 118之胺基酸序列或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或SEQ ID NO: 135之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於一些實施例中，經遮蔽抗體包含如表3A-3B所示之說明性抗體TY21449之一個、兩個、三個、四個、五個或六個CDR，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於一些實施例中，MM包含SEQ ID NO: 137之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於一些實施例中，MM包含如表5A所述之說明性抗體TY26294之MM之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於一些實施例中，經遮蔽抗體包含：(a)遮蔽性肽，自N端至C端包含MM及LM，及(b)包含VH及VL之TBM，其中TBM與人類CD47結合；其中遮蔽性肽與VL之N端相連；其中MM與人類CD47競爭結合TBM；其中：1) VH包含SEQ ID NO: 31之胺基酸序列，或胺基酸序列與SEQ ID NO: 31具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性，且2) VL包含SEQ ID NO: 32之胺基酸序列，或胺基酸序列與SEQ ID NO: 32具有至少80% (例如，至少85%，90%，95%，98%或99%；或100%)序列同一性。於一些實施例中，經遮蔽抗體包含如表4A所示之說明性抗體TY21449之VH及/或VL，或與如表4A所示之說明性抗體TY21449之VH及/或VL具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性之一個或多個胺基酸序列。於一些實施例中，經遮蔽抗體包含IgG1 Fc區。於某些實施例中，IgG1 Fc區包含S239D取代及/或I332E取代。於一些實施例中，經遮蔽抗體包含人類IgG1 Fc區。於某些實施例中，人類IgG1 Fc區包含S239D取代及I332E取代。於某些實施例中，人類IgG1 Fc區包含兩個Fc結構域，其中兩個Fc結構域中的每一個包含S239D取代及/或I332E取代(例如，S239D取代及I332E取代)。於一些實施例中，IgG1 Fc區具有增強之抗體依賴性細胞毒性(ADCC)及/或抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)功能。於一些實施例中，經遮蔽抗體包含IgG4 Fc區。於某些實施例中，經遮蔽抗體包含人類IgG4 Fc區。
於一些實施例中，經遮蔽抗體包含人類IgG4 Fc區。本揭示案之經遮蔽抗體可包含IgG4 Fc區及本文所用之CDR、VH、VL及/或輕鏈序列之任意組合。於一些實施例中，經遮蔽抗體包含包含VL之輕鏈之第一多肽及自N端至C端包含VH及人類IgG4 Fc區之重鏈之第二多肽。於某些實施例中，a)第一多肽之VL包含SEQ ID NO: 99之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；SEQ ID NO: 116之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或SEQ ID NO: 133之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或b)第二多肽之VH包含SEQ ID NO: 48之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；SEQ ID NO: 65之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或SEQ ID NO: 82之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於一些實施例中，第一多肽之VL包含如表3B所示之說明性抗體TY21446之一個、兩個或三個CDRs，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或第二多肽之VH包含如表3A所示之說明性抗體TY21446之一個、兩個或三個CDRs，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於一些實施例中，第一多肽之VL包含SEQ ID NO: 28之胺基酸序列，或胺基酸序列與SEQ ID NO: 28之胺基酸序列具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性，及/或第二多肽之VH包含SEQ ID NO: 27之胺基酸序列，或胺基酸序列與SEQ ID NO: 27之胺基酸序列具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性。於某些實施例中，第一多肽包含如表4A所示之說明性抗體TY21446之VL，或胺基酸序列與表4A所示之說明性抗體TY21446之VL具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性；第二多肽包含如表4A所示之說明性抗體TY21446之VH，或胺基酸序列與表4A所示之說明性抗體TY21446之VH具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性。於一些實施例中，第一多肽包含自N端至C端包含遮蔽性肽及VL之輕鏈，及/或第二多肽包含自N端至C端包含VH及人類IgG4 Fc結構域之重鏈。
於一些實施例中，經遮蔽抗體包含人類IgG1 Fc區。本揭示案之經遮蔽抗體可包含IgG1 Fc區及本文所用之CDR、VH、VL及/或輕鏈序列之任意組合。於一些實施例中，經遮蔽抗體包含包含VL之輕鏈之第一多肽及自N端至C端包含VH及人類IgG1 Fc區之重鏈之第二多肽。於某些實施例中，a)第一多肽之VL包含SEQ ID NO: 99之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；SEQ ID NO: 116之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或SEQ ID NO: 133之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或b)第二多肽之VH包含SEQ ID NO: 48之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；SEQ ID NO: 65之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或SEQ ID NO: 82之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於一些實施例中，第一多肽之VL包含如表3B所示之說明性抗體TY21446之一個、兩個或三個CDRs，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或第二多肽之VH包含如表3A所示之說明性抗體TY21446之一個、兩個或三個CDRs，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於一些實施例中，第一多肽之VL包含SEQ ID NO: 28之胺基酸序列，或胺基酸序列與SEQ ID NO: 28之胺基酸序列具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性，及/或第二多肽之VH包含SEQ ID NO: 27之胺基酸序列，或胺基酸序列與SEQ ID NO: 27之胺基酸序列具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性。於某些實施例中，第一多肽包含如表4A所示之說明性抗體TY21446之VL，或胺基酸序列與表4A所示之說明性抗體TY21446之VL具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性；第二多肽包含如表4A所示之說明性抗體TY21446之VH，或胺基酸序列與表4A所示之說明性抗體TY21446之VH具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性。於一些實施例中，第一多肽包含自N端至C端包含遮蔽性肽及VL之輕鏈，及/或第二多肽包含自N端至C端包含VH及人類IgG1 Fc結構域之重鏈。
於一些實施例中，經分離之抗體包含具有一個或多個胺基酸取代之人類IgG1 Fc區。所述IgG1 Fc區可包含此項技術中已知之任何胺基酸取代，以賦予具有IgG1 Fc區之抗體所需之性質。於某些實施例中，人類IgG1 Fc區包含S239D取代及/或I332E取代。於某些實施例中，人類IgG1 Fc區包含兩個Fc結構域，其中兩個Fc結構域中的每一個包含S239D取代及/或I332E取代(例如，S239D取代及I332E取代)。本揭示案之經分離之抗體可包含IgG1 Fc區，該區域包含S239D取代及/或I332E取代以及本文所用之CDR、VH、VL及/或輕鏈序列之任意組合。於一些實施例中，經遮蔽抗體包含包含VL之輕鏈之第一多肽及自N端至C端包含VH及包含S239D取代及/或I332E取代之人類IgG1 Fc區之重鏈之第二多肽。於一些實施例中，經遮蔽抗體包含包含VL之輕鏈之第一多肽及自N端至C端包含VH及人類IgG1 Fc區之重鏈之第二多肽。於某些實施例中，a)第一多肽之VL包含SEQ ID NO: 99之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；SEQ ID NO: 116之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或SEQ ID NO: 133之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或b)第二多肽之VH包含SEQ ID NO: 48之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；SEQ ID NO: 65之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或SEQ ID NO: 82之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於一些實施例中，第一多肽之VL包含如表3B所示之說明性抗體TY21446之一個、兩個或三個CDRs，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或第二多肽之VH包含如表3A所示之說明性抗體TY21446之一個、兩個或三個CDRs，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於一些實施例中，第一多肽之VL包含SEQ ID NO: 28之胺基酸序列，或胺基酸序列與SEQ ID NO: 28之胺基酸序列具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性，及/或第二多肽之VH包含SEQ ID NO: 27之胺基酸序列，或胺基酸序列與SEQ ID NO: 27之胺基酸序列具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性。於某些實施例中，第一多肽包含如表4A所示之說明性抗體TY21446之VL，或胺基酸序列與表4A所示之說明性抗體TY21446之VL具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性；第二多肽包含如表4A所示之說明性抗體TY21446之VH，或胺基酸序列與表4A所示之說明性抗體TY21446之VH具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性。於一些實施例中，第一多肽包含自N端至C端包含遮蔽性肽及VL之輕鏈，及/或第二多肽自N端至C端包含VH及包含S239D取代及/或I332E取代之人類IgG1 Fc區之重鏈。
此外，本揭示案提供之經遮蔽抗體可系單克隆或多克隆的。於較佳之實施例中，經遮蔽抗體系單克隆。
於一些實施例中，遮蔽性肽或其部分(例如，遮蔽性部分(MM))幹預、阻止、降低(能力)、防止、抑制靶結合部分結合至其靶(例如CD47))。於一些實施例中，遮蔽性肽或其部分(例如MM)與TBM之結合具有比經遮蔽抗體或其部分(例如，TBM)與其靶(例如，CD47)之解離常數更高(例如，至少高約1.5倍，至少高約2倍，至少高約2.5倍，至少高約3倍，至少高約3.5倍，至少高約4倍，至少高約4.5倍，至少高約5倍，至少高約10倍，至少高約100倍，至少高約500倍等等)。
於一些實施例中，遮蔽性肽或其部分(例如，遮蔽性部分(MM))具有可量測之遮蔽效率。於一些實施例中，遮蔽效率量測為包含遮蔽性肽之經遮蔽抗體與靶結合相對於缺少遮蔽性肽之多肽結合其靶之親和力差異(例如，包含遮蔽性肽之經遮蔽抗體相對於缺少遮蔽性肽之親本抗體對其靶抗原(例如CD47)之親和力差異)。於一些實施例中，遮蔽效率可以藉由包含遮蔽性肽之經遮蔽抗體之EC
50除以缺少遮蔽性肽之親本抗體之EC
50來量測(例如，藉由ELISA量測EC
50；參見例如實例5之方法)。於一些實施例中，遮蔽性肽或其部分(例如，MM)與靶結合部分(TBM)，並阻止經遮蔽抗體與其靶抗原(例如CD47)結合。於一些實施例中，遮蔽性肽或其部分(例如，MM)與靶結合部分(TBM)之解離常數大於TBM與其靶抗原(例如CD47)之解離常數。解離常數可(例如)藉由諸如ELISA、表面電漿子共振或生物層干涉術(BLI)或流式細胞術等技術來量測。
於一些實施例中，遮蔽性肽或其部分(例如，遮蔽性部分(MM))具有至少約2.0之遮蔽效率(例如，至少約2.0，至少約3.0，至少約4.0，至少約5.0，至少約6.0，至少約7.0，至少約8.0，至少約9.0，至少約10，至少約25，至少約50，至少約75，至少約100，至少約150，至少約200，至少約300，至少約400，至少約500等)或藉由例如Jurkat NFAT報告子分析測定，如美國專利第16/966,848號中所述。於一些實施例中，遮蔽性肽或其部分(例如，遮蔽性部分(MM))具有至少50之遮蔽效率，藉由Jurkat NFAT報告子分析測定。於某些實施例中，遮蔽性肽或其部分(例如，遮蔽性部分(MM))具有至少100之遮蔽效率，藉由Jurkat NFAT報告子分析測定。
於一些實施例中，與具有相同TBM但缺少遮蔽性肽之親本抗體相比，包含遮蔽性肽及靶結合部分(TBM)之經遮蔽性抗體在活體外與紅血球(RBC)之結合減少。於一些實施例中，具有遮蔽性肽、VH及VL之經遮蔽抗體以大於100 nM (例如，約110 nM、約120 nM、約130 nM、約140 nM、約150 nM、約200 nM、約300 nM、約400 nM、約500 nM、約1 μM或更高)之EC50在活體外與紅血球結合，且具有相同VH及VL缺少遮蔽性肽之抗體以小於10 nM (例如，約9 nM，約8 nM，約7 nM，約6 nM，約5 nM，約4 nM，約3 nM，約2 nM，約1 nM，約0.5 nM，約0.4 nM，約0.3 nM，約0.2 nM，約0.1 nM或更少)之EC50在相同量測條件下在活體外與紅血球結合。於某些實施例中，具有遮蔽性肽、VH及VL之經遮蔽抗體比具有相同VH及VL缺少遮蔽性肽之抗體以約10倍、約50倍、約100倍、約200倍、約300倍、約400倍、約500倍、約600倍、約700倍、約800倍、約900倍，約1000倍，約1500倍，約2000倍或約2500倍之EC50在活體外與紅血球結合。
於一些實施例中，經遮蔽抗體不是可活化抗體。於其他實施例中，經遮蔽抗體為可活化抗體。於一些實施例中，經遮蔽抗體為可活化抗體，並且連接部分(LM)包含可裂解部分(CM)。於某些實施例中，經遮蔽抗體為可活化抗體，LM包含CM，並且可活化抗體在活體外CM裂解時比CM裂解前對人類CD47具有更高之結合親和力。
B-3. 可活化抗體
於一些態樣，本文提供與CD47結合之可活化抗體。於一些實施例中，可活化抗體包含：(a)遮蔽性肽，其自N端至C端包含遮蔽性部分(MM)及可裂解部分(CM)，其中CM包含至少一個裂解位點；及(b)靶結合部分(TBM)，其包含抗體重鏈可變區(VH)及抗體輕鏈可變區(VL)。於一些實施例中，遮蔽性肽與VH或VL之N端相連。於優選之實施例中，可活化抗體在活體外CM裂解時比CM裂解前對人類CD47具有更高之結合親和力。TBM可以包含本文所用之抗CD47抗體或抗原結合片段之一個或多個序列，包含所述抗體或抗原結合片段參照CDRs之特定胺基酸序列、可變區域(VL、VH)及/或輕鏈及重鏈(例如IgG1、IgG2、IgG4)。於一些實施例中，TBM包含本文所用之一個或多個抗CD47抗體之全長抗體輕鏈及/或全長抗體重鏈。
於一些實施例中，本發明涉及與人類CD47結合之可活化抗體具有至少一種(例如，至少一種、至少兩種、至少三種、至少四種、至少五種、至少六種、至少七種、至少八種、至少九種、至少10種、至少11種、至少12種、或全部13種)以下功能特性：(a) CM未裂解時比CM裂解時與人類CD47結合具有更高之K
D；(b) CM未裂解時比CM裂解時與人類CD47結合具有更高之半最大效應濃度(EC50)；(c) CM未裂解時比CM裂解時具有更高之半抑制濃度(IC50)在活體外阻斷人類CD47與人類SIRPα之結合；(d) CM裂解時可活化抗體以約1 nM或更高濃度提供時，在活體外完全阻斷人類CD47與人類SIRPα之結合；(e) CM未裂解時比CM裂解時具有更高之EC50在活體外與腫瘤細胞結合；(f) CM未裂解時比CM裂解時在活體外與紅血球(RBC)之結合減少；(g) CM未裂解時比CM裂解具有更高之EC50增加活體外腫瘤細胞之巨噬細胞吞噬作用；(h) CM裂解時以500 nM或更低之K
D與人類CD47結合；(i) CM裂解時與猴、大鼠或狗CD47交叉反應；(j) CM裂解時能夠抑制腫瘤細胞生長；(k)對癌症有一項或多項有治療作用；(l) CM裂解時阻斷CD47及SIRP蛋白之間之結合(例如，SIRPα)；且(m) CM裂解時引起表現CD47之腫瘤細胞之抗體依賴性細胞毒性(ADCC)。
於一些實施例中，可活化抗體包含靶結合部分(TBM)。於一些實施例中，TBM包含抗體輕鏈可變區及/或抗體重鏈可變區。於一些實施例中，TBM包含抗體輕鏈可變區。於一些實施例中，TBM包含抗體重鏈可變區。於一些實施例中，TBM包含抗體輕鏈可變區及抗體重鏈可變區。於一些實施例中，所述抗體重鏈可變區為抗體輕鏈可變區之C端。於一些實施例中，所述抗體輕鏈可變區為抗體重鏈可變區之C-末端。於一些實施例中，本發明之TBM包含針對CD47具有特異性之抗體輕鏈可變區及/或抗體重鏈可變區。於一些實施例中，TBM包含全長抗體輕鏈及/或全長抗體重鏈。抗體輕鏈可為κ或λ輕鏈。抗體之重鏈可為任何類別，諸如IgG、IgM、IgE、IgA或IgD。於一些實施例中，抗體重鏈為IgG類別，諸如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4子類別。可使用此項技術中已知之方法將抗體重鏈自一種類別或子類別轉變成另一種類別或子類別。本文所用之任何一個或多個TBMs可包含本文所用之任何抗CD47抗體之任何CDR序列(例如，一個，兩個或三個重鏈可變區之CDR序列，及/或一個，兩個或三個輕鏈可變區之CDR序列)，重鏈可變區序列及/或本文之輕鏈可變區序列。
於一些實施例中，可活化抗體或其抗原結合片段包含自N端至C端包含遮蔽性肽及VL之第一多肽，以及包含VH之第二多肽(例如，Fab片段)。於其他實施例中，可活化抗體或其抗原結合片段包含自N端至C端包含遮蔽性肽及VH之第一多肽，以及包含VL之第二多肽(例如，Fab片段)。於其他實施例中，可活化抗體或其抗原結合片段包含自N端至C端包含遮蔽性肽、VL及VH(例如scFv)之第一多肽。於另外之實施例中，可活化抗體或其抗原結合片段包含自N端至C端包含遮蔽性肽、VH及VL(例如scFv)之第一多肽。
於一些實施例中，可活化抗體包含自N端至C端包含MM及CM之遮蔽性肽。於一些實施例中，MM包含根據式(XVI)：X1X2X3X4X5X6CX7DDX8X9X10CX11X12 (SEQ ID NO: 197)之胺基酸序列，其中X1為D，H，N或Y，X2為A，D，F，P，T或Y，X3為A，L，N，P，T或Y，X4為A，D，H或S，X5為A，D，F，H或N，X6為D、S或T，X7為D、S或Y，X8為D、F或Y，X9及X11分別為獨立的A、D或Y，X10為A、D、F或P，X12為D、F、I、T或Y。於某些實施例中，MM包含根據式(XVII)：X1X2X3X4X5DCPX6X7DX8X9CX10X11 (SEQ ID NO: 198)之胺基酸序列，其中X1為A、N或P，X2為A、N、P或Q，X3為A、D或S，X4為A、D、S或V，X5為D、F或P，X6為A、D或T，X7為A、H或Y，X8為A、D或V，X9為F或Y，X10為D、N、S或Y，X11為D、P或V。於某些實施例中，MM包含根據式(XVIII)：X1X2X3X4X5X6CDX7X8X9X10X11CX12A (SEQ ID NO: 199)之胺基酸序列，其中X1為A或L，X2為A或T，X3為S或V，X4為D或P，X5為A或Y，X6為F或T，X7為D或I，X8為D或T，X9為L或P，X10為F或L，X11為F或Y，X12為N或P。於另外實施例中，MM包含根據式(XIX)：X1X2CX3X4X5X6X7X8X9FCX10X11 (SEQ ID NO: 200)之胺基酸序列，其中X1為D，F或V，X2為A、S或Y，X3為P、R或T，X4為A、G或I，X5為A、E或F，X6為A、D或V，X7為D或V，X8為D或G，X9為I或P，X10為I或S，X11為A、Q或V。於一些實施例中，MM包含選自由SEQ ID NOs: 137及167-181組成之群之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於某些實施例中，MM包含SEQ ID NO: 137之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於一些實施例中，MM包含如表5A所述說明性抗體之MM胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於某些實施例中，所述MM包含如表5A所述說明性抗體TY26294之MM胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。
於一些實施例中，可活化抗體包含自N端至C端包含MM及CM之遮蔽性肽，其中CM包含至少一個(例如，一個、兩個、三個或更多)裂解位點。於一些實施例中，裂解位點系蛋白酶裂解位點。可使用藉由此項技術中已知之任何蛋白酶(例如，已知與包含CM之可活化抗體之靶共定位之蛋白酶)識別及/或裂解之任何適宜蛋白酶裂解位點，包含例如，藉由以下識別及/或裂解之蛋白酶裂解位點：尿激酶型纖維蛋白溶酶原活化因數(uPA)、基質金屬蛋白酶(例如，MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-7、MMP-8、MMP-9、MMP-10、MMP-11、MMP-12、MMP-13、MMP-14、MMP-15、MMP-16、MMP-17、MMP-19、MMP-20、MMP-23、MMP-24、MMP-26、及/或MMP-27)、煙草蝕紋病毒(TEV)蛋白酶、胞漿素、凝血酶、PSA、PSMA、ADAMS/ADAMTS (例如，ADAM 8、ADAM 9、ADAM 10、ADAM 12、ADAM 15、ADAM 17/TACE、ADAMDEC1、ADAMTS1、ADAMTS4、及/或ADAMTS5)、卡斯蛋白酶(例如，卡斯蛋白酶-1、卡斯蛋白酶-2、卡斯蛋白酶-3、卡斯蛋白酶-4、卡斯蛋白酶-5、卡斯蛋白酶-6、卡斯蛋白酶-7、卡斯蛋白酶-8、卡斯蛋白酶-9、卡斯蛋白酶-10、卡斯蛋白酶-11、卡斯蛋白酶-12、卡斯蛋白酶-13、及/或卡斯蛋白酶-14)、天冬胺酸蛋白酶(例如，RACE及/或腎素(Renin))；天冬胺酸組織蛋白酶(例如，組織蛋白酶D及/或組織蛋白酶E)、半胱胺酸組織蛋白酶(例如，組織蛋白酶B、組織蛋白酶C、組織蛋白酶K、組織蛋白酶L、組織蛋白酶S、組織蛋白酶V/L2、及/或組織蛋白酶X/Z/P)、半胱胺酸蛋白酶(例如，Cruzipain、Legumain及/或Otubain-2)、KLK (例如，KLK4、KLK5、KLK6、KLK7、KLK8、KLK10、KLK11、KLK13、及/或KLK14)、金屬蛋白酶(例如，Meprin、奈溶酶(Neprilysin)、PSMA、及/或BMP-1)、絲胺酸蛋白酶(例如，經活化之蛋白C、組織蛋白酶A、組織蛋白酶G、胃促胰酶(Chymase)、及/或凝血因數蛋白酶(諸如FVIIa、FIXa、Fxa、FXIa、FXIIa))、彈性蛋白酶、粒酶B、胍基苯甲酸酶(guanidino-benzoatase)、HtrA1、人類嗜中性白血球彈性蛋白酶、乳鐵蛋白(lactoferrin)、marapsin、NS3/4A、PACE4、tPA、類胰蛋白酶(tryptase)、II型跨膜絲胺酸蛋白酶(TTSP) (例如，DESC1、DPP-4、FAP、第二型穿膜絲胺酸蛋白酶(Hepsin)、間質蛋白酶(Matriptase)-2、MT-SP1/間質蛋白酶、TMPRSS2、TMPRSS3及/或TMPRSS4)等。於某些實施例中，一個或多個為選自以下之蛋白酶之裂解位點：尿激酶型纖維蛋白溶酶原活化因數(uPA)、基質金屬蛋白酶-1 (MMP-1)、MMP-2、MMP-3、MMP-8、MMP-9、MMP-14、煙草蝕紋病毒(TEV)蛋白酶、胞漿素、凝血酶、因數X、PSA、PSMA、組織蛋白酶D、組織蛋白酶K、組織蛋白酶S、ADAM 10、ADAM 12、ADAMTS、卡斯蛋白酶-1、卡斯蛋白酶-2、卡斯蛋白酶-3、卡斯蛋白酶-4、卡斯蛋白酶-5、卡斯蛋白酶-6、卡斯蛋白酶-7、卡斯蛋白酶-8、卡斯蛋白酶-9、卡斯蛋白酶-10、卡斯蛋白酶-11、卡斯蛋白酶-12、卡斯蛋白酶-13、卡斯蛋白酶-14及TACE。於一些實施例中，CM包含由MMP-9裂解之MMP-9之裂解位點。於某些實施例中，CM包含SEQ ID NO: 138之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於某實施例中，CM包含如表5A所述說明性抗體TY26294之CM胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。
於一些實施例中，遮蔽性肽還包含一個或多個(例如，一個、兩個、三個或多個)連接體。於某些實施例中，CM還包含一個或多個(例如，一個、兩個、三個或多個)連接體，可為C端至裂解位點或N端至裂解位點。於某些實施例中，MM還包含一個或多個(例如，一個、兩個、三個或多個)連接體。可使用此項技術中已知之任何合適的連接體(例如，柔性連接體)，包括例如：甘氨酸聚合物(G)n，其中n是至少1的整數(例如，至少一個，至少2個，至少3個，至少4個，至少5個，至少6個，至少7個，至少8個，至少9個，至少10個等)；甘氨酸-絲氨酸聚合物(GS)n，其中n是至少1的整數(例如，至少1，至少2，至少3，至少4，至少5，至少6，至少7，至少8，至少9，至少10等)；甘氨酸-丙氨酸聚合物；丙氨酸-絲氨酸聚合物；等等。連接體序列可為任意長度，例如約1個胺基酸(例如甘氨酸或絲氨酸)至約20個胺基酸(例如，20個胺基酸的甘氨酸聚合物或甘氨酸-絲氨酸聚合物)，約1個胺基酸至約15個胺基酸，約3個胺基酸至約12個胺基酸，約4個胺基酸至約10個胺基酸，約5個胺基酸至約9個胺基酸，約6個胺基酸至約8個胺基酸等。於一些實施例中，連接體長度為約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個胺基酸中的任一者。
於一些實施例中，可活化抗體包含包含胺基酸序列選自由SEQ ID NOs: 139及152-166組成之群之遮蔽性肽，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於一些實施例中，可活化抗體包含包含SEQ ID NO: 139之胺基酸序列之遮蔽性肽，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於一些實施例中，遮蔽性肽包含如表5B所述說明性抗體之遮蔽性肽之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於一些實施例中，遮蔽性肽包含如表5B所述說明性抗體TY26294之遮蔽性肽之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。
於一些實施例中，本文中所述之遮蔽性肽中之任一者可另包含一或多個另外胺基酸序列(例如，一或多個多肽標籤)。適宜另外胺基酸序列之實例可包括(不限於)純化標籤(諸如his-標籤、flag-標籤、麥芽糖結合蛋白及谷胱甘肽-S-轉移酶標籤)、檢測標籤(諸如可亮度學檢測之標籤(例如，紅色或綠色螢光蛋白等))、具有可檢測之酵素活性之標籤(例如，鹼性磷酸酶等)、含有分泌序列、前導序列及/或穩定序列之標籤、蛋白酶裂解位點(例如，弗林蛋白酶(furin)裂解位點、TEV裂解位點、凝血酶裂解位點)及類似者。於一些實施例中，一或多個另外胺基酸序列在遮蔽性肽之N端。
於某些實施例中，可活化抗體包含自N端至C端包含遮蔽性肽及VL之第一多肽，及包含VH之第二多肽。於一些實施例中，第二多肽進一步包含Fc區。於一些實施例中，Fc區為IgG4 Fc區。於一些實施例中，Fc區為IgG1 Fc區。於某些實施例中，Fc區為IgG1 Fc區，所述IgG1 Fc區包含S239D取代及/或I332E取代，其中編號根據Kabat。於某些實施例中，Fc區為IgG1 Fc區，所述IgG1 Fc區包含S239D取代及I332E取代，其中編號根據Kabat。於某些實施例中，包含S239D取代及I332E取代之IgG1 Fc區域在Lazar等人(Engineered antibody Fc variants with enhanced effector function." PNAS 103.11 (2006): 4005-4010)中有詳細描述。於一些實施例中，a)第一多肽之VL包含選自由SEQ ID NOs: 190-196組成之群之一個或多個胺基酸序列；及/或b)第二多肽之VH包含選自由SEQ ID NOs: 182-189組成之群之一個或多個胺基酸序列。於一些變體中，a)第一多肽之VL包含SEQ ID NOs: 191，194及/或195之胺基酸序列；及/或b)第二多肽之VH包含SEQ ID NOs: 182、185及/或188之胺基酸序列。於某些實施例中，a)第一多肽之VL包含選自由SEQ ID NOs: 31-85組成之群之一個或多個胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或b)第二多肽之VH包含選自由SEQ ID NOs: 86-136組成之群之一個或多個胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於一些變體中，a)第一多肽之VL包含包含選自由SEQ ID NOs: 86-102組成之群之胺基酸序列之CDR-L1，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；包含選自由SEQ ID NOs: 103-119組成之群之胺基酸序列之CDR-L2，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或包含選自由SEQ ID NOs: 120-136組成之群之胺基酸序列之CDR-L3，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或b)第二多肽之VH包含包含選自由SEQ ID NOs: 35-51組成之群之胺基酸序列之CDR-H1，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；包含選自由SEQ ID NOs: 52-68組成之群之胺基酸序列之CDR-H2，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或選自由SEQ ID NOs: 69-85組成之群之胺基酸序列之CDR-H3，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於某些實施例中，a)第一多肽之VL包含SEQ ID NO: 99之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；SEQ ID NO: 116之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或SEQ ID NO: 133之胺基酸序列或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或b)第二多肽之VH包含SEQ ID NO: 48之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；SEQ ID NO: 65之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或SEQ ID NO: 82之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於一些實施例中，第一多肽之VL包含如表3B所示之說明性抗體TY21446之一個、兩個或三個CDRs，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或第二多肽之VH包含如表3A所示之說明性抗體TY21446之一個、兩個或三個CDRs，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於一些實施例中，第一多肽之VL包含SEQ ID NO: 28之胺基酸序列，或胺基酸序列與SEQ ID NO: 28具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性；且第二多肽之VH包含SEQ ID NO: 27之胺基酸序列，或胺基酸序列與SEQ ID NO: 27具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)之序列同一性。於某些實施例中，第一多肽包含如表4A所示之說明性抗體TY21446之VL，或胺基酸序列與表4A所示之說明性抗體TY21446之VL序列具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性；且第二多肽包含如表4A所示之說明性抗體TY21446之VH，或胺基酸序列與表4A所示之說明性抗體TY21446之VH序列具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性。
於一些實施例中，本文提供之可活化抗體包含：(a)遮蔽性肽，自N端至C端包含遮蔽性部分(MM)及可裂解部分(CM)，其中CM包含至少一個裂解位點，及(b)包含抗體重鏈可變區(VH)及抗體輕鏈可變區(VL)之靶結合部分(TBM)；其中遮蔽性肽與VL之N端相連；其中可活化抗體在活體外CM裂解時比CM裂解前對人類CD47具有更高之結合親和力；其中：1) VH包含包含SEQ ID NO: 48之胺基酸序列之CDR-H1，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；包含SEQ ID NO: 65之胺基酸序列之CDR-H2，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或包含SEQ ID NO: 82之胺基酸序列之CDR-H3，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；且2) VL包含包含SEQ ID NO: 99之胺基酸序列之CDR-L1，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；包含SEQ ID NO: 116之胺基酸序列之CDR-L2，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或包含SEQ ID NO: 133之胺基酸序列之CDR-L3，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於一些實施例中，可活化抗體包含：(a)遮蔽性肽，自N端至C端包含MM及CM，其種CM包含至少一個裂解位點，及(b)包含VH及VL之TBM；其中遮蔽性肽與VL之N端相連，其中可活化抗體在活體外CM裂解時比CM裂解前對人類CD47具有更高之結合親和力；其中1) VH包含包含SEQ ID NO: 48之胺基酸序列之CDR-H1，包含SEQ ID NO: 65之胺基酸序列之CDR-H2及包含SEQ ID NO: 82之胺基酸序列之CDR-H3；且2) VL包含包含SEQ ID NO: 99之胺基酸序列之CDR-L1，包含SEQ ID NO: 116之胺基酸序列之CDR-L2及包含SEQ ID NO: 133之胺基酸序列之CDR-L3。於一些實施例中，可活化抗體包含：(a)遮蔽性肽，自N端至C端包含MM及CM，其種CM包含至少一個裂解位點，及(b)包含VH及VL之TBM；其中遮蔽性肽與VL之N端相連；其中可活化抗體在活體外CM裂解時比CM裂解前對人類CD47具有更高之結合親和力；其中1) VH包含SEQ ID NO: 48之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；SEQ ID NO: 65之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或SEQ ID NO: 82之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；且2) VL包含SEQ ID NO: 99之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；SEQ ID NO: 116之胺基酸序列或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或SEQ ID NO: 133之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於一些實施例中，可活化抗體包含如表3A-3B所示之說明性抗體TY21446之一個、兩個、三個、四個、五個或六個CDR，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於一些實施例中，MM包含SEQ ID NO: 137之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於一些實施例中，MM包含如表5A所述之說明性抗體TY26294之MM之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於一些實施例中，CM包含SEQ ID NO: 138之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於一些實施例中，CM包含如表5A所述之說明性抗體TY26294之CM之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於一些實施例中，遮蔽性肽包含SEQ ID NO: 139之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於一些實施例中，遮蔽性肽包含如表5B所述之說明性抗體TY26294之遮蔽性肽之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於一些實施例中，可活化抗體包含：(a)遮蔽性肽，自N端至C端包含MM及CM，其中CM包含至少一個裂解位點，及(b)包含VH及VL之TBM；其中遮蔽性肽與VL之N端相連；其中可活化抗體在活體外CM裂解時比CM裂解前對人類CD47具有更高之結合親和力；其中：1) VH包含SEQ ID NO: 27之胺基酸序列，或胺基酸序列與SEQ ID NO: 27具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性，且2) VL包含SEQ ID NO: 28之胺基酸序列，或胺基酸序列與SEQ ID NO: 28具有至少80% (例如，至少85%，90%，95%，98%或99%；或100%)序列同一性。於一些實施例中，可活化抗體包含如表4A所示之說明性抗體TY21446之VH及/或VL，或與如表4A所示之說明性抗體TY21446之VH及/或VL具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性之一個或多個胺基酸序列。於一些實施例中，可活化抗體包含IgG1 Fc區。於一些實施例中，可活化抗體包含人類IgG1 Fc區。於某些實施例中，可活化抗體包含第一多肽及第二多肽，其中第一多肽包含自N端至C端包含遮蔽性肽及VL之輕鏈，其中第一多肽包含SEQ ID NO: 148之胺基酸序列，或胺基酸序列與SEQ ID NO: 148之胺基酸序列具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性；其中第二多肽包含自N端至C端包含VH及人類IgG1 Fc區之重鏈，其中第二多肽含SEQ ID NO: 149之胺基酸序列，或胺基酸序列與SEQ ID NO: 149之胺基酸序列具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性。於一些實施例中，可活化抗體包含如表6所示之說明性抗體TY2689之重鏈及/或輕鏈，或與如表6所示之說明性抗體TY2689之重鏈及/或輕鏈具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性之一個或多個胺基酸序列。於一些實施例中，IgG1 Fc區包含S239D取代及/或I332E取代。於某些實施例中，IgG1 Fc區包含S239D取代及I332E取代。於某些實施例中，人類IgG1 Fc區包含S239D取代及I332E取代。於某些實施例中，人類IgG1 Fc區包含兩個Fc結構域，其中兩個Fc結構域中的每一個包含S239D取代及/或I332E取代(例如，S239D取代及I332E取代)。於一些實施例中，可活化抗體包含第一多肽及第二多肽，其中第一多肽包含自N端至C端包含遮蔽性肽及VL之輕鏈，其中第一多肽包含SEQ ID NO: 150之胺基酸序列，或胺基酸序列與SEQ ID NO: 150之胺基酸序列具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性；其中第二多肽包含自N端至C端包含VH及人類IgG1 Fc區之重鏈，其中第二多肽含SEQ ID NO: 151之胺基酸序列，或胺基酸序列與SEQ ID NO: 151之胺基酸序列具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性。於一些實施例中，可活化抗體包含如表6所示之說明性抗體TY26294之重鏈及/或輕鏈，或與如表6所示之說明性抗體TY26294之重鏈及/或輕鏈具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性之一個或多個胺基酸序列。於一些實施例中，IgG1 Fc區具有增強之抗體依賴性細胞毒性(ADCC)及/或抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)功能。於一些實施例中，可活化抗體包含IgG4 Fc區。於某些實施例中，可活化抗體包含人類IgG4 Fc區。於一些實施例中，可活化抗體包含第一多肽及第二多肽，其中第一多肽包含自N端至C端包含遮蔽性肽及VL之輕鏈，其中第一多肽包含SEQ ID NO: 142之胺基酸序列，或胺基酸序列與SEQ ID NO: 142之胺基酸序列具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性；其中第二多肽包含自N端至C端包含VH及人類IgG4 Fc區之重鏈，其中第二多肽含SEQ ID NO: 143之胺基酸序列，或胺基酸序列與SEQ ID NO: 143之胺基酸序列具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性。於一些實施例中，可活化抗體包含如表6所示之說明性抗體TY26294之重鏈及/或輕鏈，或與如表6所示之說明性抗體TY26294之重鏈及/或輕鏈具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性之一個或多個胺基酸序列。
於一些實施例中，本文提供之可活化抗體包含：(a)遮蔽性肽，自N端至C端包含遮蔽性部分(MM)及可裂解部分(CM)，其中CM包含至少一個裂解位點，及(b)包含抗體重鏈可變區(VH)及抗體輕鏈可變區(VL)之靶結合部分(TBM)；其中遮蔽性肽與VL之N端相連；其中可活化抗體在活體外CM裂解時比CM裂解前對人類CD47具有更高之結合親和力；其中：1) VH包含包含SEQ ID NO: 49之胺基酸序列之CDR-H1，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；包含SEQ ID NO: 66之胺基酸序列之CDR-H2，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或包含SEQ ID NO: 83之胺基酸序列之CDR-H3，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；且2) VL包含包含SEQ ID NO: 100之胺基酸序列之CDR-L1，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；包含SEQ ID NO: 117之胺基酸序列之CDR-L2，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或包含SEQ ID NO: 134之胺基酸序列之CDR-L3，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於一些實施例中，可活化抗體包含：(a)遮蔽性肽，自N端至C端包含MM及CM，其中CM包含至少一個裂解位點，及(b)包含VH及VL之TBM，其中遮蔽性肽與VL之N端相連；其中可活化抗體在活體外CM裂解時比CM裂解前對人類CD47具有更高之結合親和力；其中1) VH包含包含SEQ ID NO: 49之胺基酸序列之CDR-H1，包含SEQ ID NO: 66之胺基酸序列之CDR-H2及包含SEQ ID NO: 83之胺基酸序列之CDR-H3；且2) VL包含包含SEQ ID NO: 100之胺基酸序列之CDR-L1，包含SEQ ID NO: 117之胺基酸序列之CDR-L2及包含SEQ ID NO: 134之胺基酸序列之CDR-L3。於一些實施例中，可活化抗體包含：(a)遮蔽性肽，自N端至C端包含MM及CM，其中CM包含至少一個裂解位點，及(b)包含VH及VL之TBM，其中遮蔽性肽與VL之N端相連；其中可活化抗體在活體外CM裂解時比CM裂解前對人類CD47具有更高之結合親和力；其中1) VH包含SEQ ID NO: 49之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；SEQ ID NO: 66之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或SEQ ID NO: 83之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；且2) VL包含SEQ ID NO: 100之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；SEQ ID NO: 117之胺基酸序列或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或SEQ ID NO: 134之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於一些實施例中，可活化抗體包含如表3A-3B所示之說明性抗體TY21447之一個、兩個、三個、四個、五個或六個CDR，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於一些實施例中，MM包含SEQ ID NO: 137之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於一些實施例中，MM包含如表5A所述之說明性抗體TY26294之MM之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於一些實施例中，CM包含SEQ ID NO: 138之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於一些實施例中，CM包含如表5A所述之說明性抗體TY26294之CM之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於一些實施例中，遮蔽性肽包含SEQ ID NO: 139之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於一些實施例中，遮蔽性肽包含如表5B所述之說明性抗體TY26294之遮蔽性肽之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於一些實施例中，可活化抗體包含：可活化抗體包含：(a)遮蔽性肽，自N端至C端包含MM及CM，其中CM包含至少一個裂解位點，及(b)包含VH及VL之TBM,其中遮蔽性肽與VL之N端相連；其中可活化抗體在活體外CM裂解時比CM裂解前對人類CD47具有更高之結合親和力；其中：1) VH包含SEQ ID NO: 29之胺基酸序列，或胺基酸序列與SEQ ID NO: 29具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性，且2) VL包含SEQ ID NO: 30之胺基酸序列，或胺基酸序列與SEQ ID NO: 30具有至少80% (例如，至少85%，90%，95%，98%或99%；或100%)序列同一性。於一些實施例中，可活化抗體包含如表4A所示之說明性抗體TY21447之VH及/或VL，或與如表4A所示之說明性抗體TY21447之VH及/或VL具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性之一個或多個胺基酸序列。於一些實施例中，可活化抗體包含IgG1 Fc區。於某些實施例中，IgG1 Fc區包含S239D取代及/或I332E取代。於一些實施例中，可活化抗體包含人類IgG1 Fc區。於某些實施例中，IgG1 Fc區包含S239D取代及/或I332E取代。於某些實施例中，人類IgG1 Fc區包含兩個Fc結構域，其中兩個Fc結構域中的每一個包含S239D取代及/或I332E取代(例如，S239D取代及I332E取代)。於一些實施例中，IgG1 Fc區具有增強之抗體依賴性細胞毒性(ADCC)及/或抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)功能。於一些實施例中，可活化抗體包含IgG4 Fc區。於某些實施例中，可活化抗體包含人類IgG4 Fc區。
於一些實施例中，本文提供之可活化抗體包含：(a)遮蔽性肽，自N端至C端包含遮蔽性部分(MM)及可裂解部分(CM)，其中CM包含至少一個裂解位點，及(b)包含抗體重鏈可變區(VH)及抗體輕鏈可變區(VL)之靶結合部分(TBM；其中遮蔽性肽與VL之N端相連；其中可活化抗體在活體外CM裂解時比CM裂解前對人類CD47具有更高之結合親和力；其中：1) VH包含包含SEQ ID NO: 50之胺基酸序列之CDR-H1，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；包含SEQ ID NO: 67之胺基酸序列之CDR-H2，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或包含SEQ ID NO: 84之胺基酸序列之CDR-H3，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；且2) VL包含包含SEQ ID NO: 101之胺基酸序列之CDR-L1，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；包含SEQ ID NO: 118之胺基酸序列之CDR-L2，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或包含SEQ ID NO: 135之胺基酸序列之CDR-L3，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於一些實施例中，可活化抗體包含：(a)遮蔽性肽，自N端至C端包含MM及CM，其中CM包含至少一個裂解位點，及(b)包含VH及VL之TBM，其中遮蔽性肽與VL之N端相連；其中可活化抗體在活體外CM裂解時比CM裂解前對人類CD47具有更高之結合親和力；其中1) VH包含包含SEQ ID NO: 50之胺基酸序列之CDR-H1，包含SEQ ID NO: 67之胺基酸序列之CDR-H2及包含SEQ ID NO: 84之胺基酸序列之CDR-H3；且2) VL包含包含SEQ ID NO: 101之胺基酸序列之CDR-L1，包含SEQ ID NO: 118之胺基酸序列之CDR-L2及包含SEQ ID NO: 135之胺基酸序列之CDR-L3。於一些實施例中，可活化抗體包含：(a)遮蔽性肽，自N端至C端包含MM及CM，其中CM包含至少一個裂解位點，及(b)包含VH及VL之TBM，其中遮蔽性肽與VL之N端相連；其中可活化抗體在活體外CM裂解時比CM裂解前對人類CD47具有更高之結合親和力；其中1) VH包含SEQ ID NO: 50之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；SEQ ID NO: 67之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或SEQ ID NO: 84之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或2) VL包含SEQ ID NO: 101之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；SEQ ID NO: 118之胺基酸序列或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或SEQ ID NO: 135之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於一些實施例中，可活化抗體包含如表3A-3B所示之說明性抗體TY21449之一個、兩個、三個、四個、五個或六個CDR，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於一些實施例中，MM包含SEQ ID NO: 137之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於一些實施例中，MM包含如表5A所述之說明性抗體TY26294之MM之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於一些實施例中，CM包含SEQ ID NO: 138之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於一些實施例中，CM包含如表5A所述之說明性抗體TY26294之CM之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於一些實施例中，遮蔽性肽包含SEQ ID NO: 139之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於一些實施例中，遮蔽性肽包含如表5B所述之說明性抗體TY26294之遮蔽性肽之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於一些實施例中，可活化抗體包含：可活化抗體包含：(a)遮蔽性肽，自N端至C端包含MM及CM，其中CM包含至少一個裂解位點，及(b)包含VH及VL之TBM,其中遮蔽性肽與VL之N端相連；其中可活化抗體在活體外CM裂解時比CM裂解前對人類CD47具有更高之結合親和力；其中：1) VH包含SEQ ID NO: 31之胺基酸序列，或胺基酸序列與SEQ ID NO: 31具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性，且2) VL包含SEQ ID NO: 32之胺基酸序列，或胺基酸序列與SEQ ID NO: 32具有至少80% (例如，至少85%，90%，95%，98%或99%；或100%)序列同一性。於一些實施例中，可活化抗體包含如表4A所示之說明性抗體TY21449之VH及/或VL，或與如表4A所示之說明性抗體TY21449之VH及/或VL具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性之一個或多個胺基酸序列。於一些實施例中，可活化抗體包含IgG1 Fc區。於某些實施例中，IgG1 Fc區包含S239D取代及/或I332E取代。於一些實施例中，可活化抗體包含人類IgG1 Fc區。於某些實施例中，IgG1 Fc區包含S239D取代及/或I332E取代。於某些實施例中，人類IgG1 Fc區包含兩個Fc結構域，其中兩個Fc結構域中的每一個包含S239D取代及/或I332E取代(例如，S239D取代及I332E取代)。於一些實施例中，IgG1 Fc區具有增強之抗體依賴性細胞毒性(ADCC)及/或抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)功能。於一些實施例中，可活化抗體包含IgG4 Fc區。於某些實施例中，可活化抗體包含人類IgG4 Fc區。
於一些實施例中，可活化抗體包含人類IgG4 Fc區。本揭示案之可活化抗體可包含IgG4 Fc區及本文所用之CDR、VH、VL及/或輕鏈序列之任意組合。於一些實施例中，可活化抗體包含包含VL之輕鏈之第一多肽及自N端至C端包含VH及人類IgG4 Fc區之重鏈之第二多肽。於某些實施例中，a)第一多肽之VL包含SEQ ID NO: 99之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；SEQ ID NO: 116之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或SEQ ID NO: 133之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或b)第二多肽之VH包含SEQ ID NO: 48之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；SEQ ID NO: 65之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或SEQ ID NO: 82之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於一些實施例中，第一多肽之VL包含如表3B所示之說明性抗體TY21446之一個、兩個或三個CDRs，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或第二多肽之VH包含如表3A所示之說明性抗體TY21446之一個、兩個或三個CDRs，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於一些實施例中，第一多肽之VL包含SEQ ID NO: 28之胺基酸序列，或胺基酸序列與SEQ ID NO: 28之胺基酸序列具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性，及/或第二多肽之VH包含SEQ ID NO: 27之胺基酸序列，或胺基酸序列與SEQ ID NO: 27之胺基酸序列具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性。於某些實施例中，第一多肽包含如表4A所示之說明性抗體TY21446之VL，或胺基酸序列與表4A所示之說明性抗體TY21446之VL具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性；第二多肽包含如表4A所示之說明性抗體TY21446之VH，或胺基酸序列與表4A所示之說明性抗體TY21446之VH具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性。於一些實施例中，第一多肽包含自N端至C端包含遮蔽性肽及VL之輕鏈，及/或第二多肽包含自N端至C端包含VH及人類IgG4 Fc結構域之重鏈。於某些實施例中，第一多肽包含SEQ ID NO: 142之胺基酸序列，或胺基酸序列與SEQ ID NO: 142之胺基酸序列具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性；及/或第二多肽含SEQ ID NO: 143之胺基酸序列，或胺基酸序列與SEQ ID NO: 143之胺基酸序列具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性。於一些實施例中，可活化抗體包含如表6所示之說明性抗體TY26294之重鏈及/或輕鏈，或與如表6所示之說明性抗體TY26294之重鏈及/或輕鏈具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性之一個或多個胺基酸序列。
於一些實施例中，可活化抗體包含人類IgG1 Fc區。本揭示案之可活化抗體可包含IgG1 Fc區及本文所用之CDR、VH、VL及/或輕鏈序列之任意組合。於一些實施例中，可活化抗體包含包含VL之輕鏈之第一多肽及自N端至C端包含VH及人類IgG1 Fc區之重鏈之第二多肽。於某些實施例中，a)第一多肽之VL包含SEQ ID NO: 99之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；SEQ ID NO: 116之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或SEQ ID NO: 133之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或b)第二多肽之VH包含SEQ ID NO: 48之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；SEQ ID NO: 65之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或SEQ ID NO: 82之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於一些實施例中，第一多肽之VL包含如表3B所示之說明性抗體TY21446之一個、兩個或三個CDRs，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或第二多肽之VH包含如表3A所示之說明性抗體TY21446之一個、兩個或三個CDRs，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於一些實施例中，第一多肽之VL包含SEQ ID NO: 28之胺基酸序列，或胺基酸序列與SEQ ID NO: 28之胺基酸序列具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性，及/或第二多肽之VH包含SEQ ID NO: 27之胺基酸序列，或胺基酸序列與SEQ ID NO: 27之胺基酸序列具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性。於某些實施例中，第一多肽包含如表4A所示之說明性抗體TY21446之VL，或胺基酸序列與表4A所示之說明性抗體TY21446之VL具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性；第二多肽包含如表4A所示之說明性抗體TY21446之VH，或胺基酸序列與表4A所示之說明性抗體TY21446之VH具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性。於一些實施例中，第一多肽包含自N端至C端包含遮蔽性肽及VL之輕鏈，及/或第二多肽包含自N端至C端包含VH及人類IgG1 Fc結構域之重鏈。於某些實施例中，第一多肽包含SEQ ID NO: 148之胺基酸序列，或胺基酸序列與SEQ ID NO: 148之胺基酸序列具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性；及/或第二多肽含SEQ ID NO: 149之胺基酸序列，或胺基酸序列與SEQ ID NO: 149之胺基酸序列具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性。於一些實施例中，可活化抗體包含如表6所示之說明性抗體TY26898之重鏈及/或輕鏈，或與如表6所示之說明性抗體TY26898之重鏈及/或輕鏈具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性之一個或多個胺基酸序列。
於一些實施例中，可活化抗體包含具有一個或多個胺基酸取代之人類IgG1 Fc區。所述IgG1 Fc區可包含此項技術中已知之任何胺基酸取代，以賦予具有IgG1 Fc區之抗體所需之性質。於某些實施例中，人類IgG1 Fc區包含S239D取代及/或I332E取代。於某些實施例中，人類IgG1 Fc區包含兩個Fc結構域，其中兩個Fc結構域中的每一個包含S239D取代及/或I332E取代(例如，S239D取代及I332E取代)。本揭示案之可活化抗體可包含IgG1 Fc區，該區域包含S239D取代及/或I332E取代以及本文所用之CDR、VH、VL及/或輕鏈序列之任意組合。於一些實施例中，可活化抗體包含包含VL之輕鏈之第一多肽及自N端至C端包含VH及包含S239D取代及/或I332E取代之人類IgG1 Fc區之重鏈之第二多肽。於一些實施例中，可活化抗體包含包含VL之輕鏈之第一多肽及自N端至C端包含VH及人類IgG1 Fc區之重鏈之第二多肽。於某些實施例中，a)第一多肽之VL包含SEQ ID NO: 99之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；SEQ ID NO: 116之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或SEQ ID NO: 133之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或b)第二多肽之VH包含SEQ ID NO: 48之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；SEQ ID NO: 65之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或SEQ ID NO: 82之胺基酸序列，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於一些實施例中，第一多肽之VL包含如表3B所示之說明性抗體TY21446之一個、兩個或三個CDRs，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及/或第二多肽之VH包含如表3A所示之說明性抗體TY21446之一個、兩個或三個CDRs，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於一些實施例中，第一多肽之VL包含SEQ ID NO: 28之胺基酸序列，或胺基酸序列與SEQ ID NO: 28之胺基酸序列具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性，及/或第二多肽之VH包含SEQ ID NO: 27之胺基酸序列，或胺基酸序列與SEQ ID NO: 27之胺基酸序列具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性。於某些實施例中，第一多肽包含如表4A所示之說明性抗體TY21446之VL，或胺基酸序列與表4A所示之說明性抗體TY21446之VL具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性；第二多肽包含如表4A所示之說明性抗體TY21446之VH，或胺基酸序列與表4A所示之說明性抗體TY21446之VH具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性。於一些實施例中，第一多肽包含自N端至C端包含遮蔽性肽及VL之輕鏈，及/或第二多肽自N端至C端包含VH及包含S239D取代及/或I332E取代之人類IgG1 Fc區之重鏈。於某些實施例中，第一多肽包含SEQ ID NO: 150之胺基酸序列，或胺基酸序列與SEQ ID NO: 150之胺基酸序列具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性；及/或第二多肽含SEQ ID NO: 151之胺基酸序列，或胺基酸序列與SEQ ID NO: 151之胺基酸序列具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性。於一些實施例中，可活化抗體包含如表6所示之說明性抗體TY26899之重鏈及/或輕鏈，或與如表6所示之說明性抗體TY26899之重鏈及/或輕鏈具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性之一個或多個胺基酸序列。
此外，本揭示案提供之可活化抗體可系單克隆或多克隆的。於較佳之實施例中，可活化抗體系單克隆。
於一些實施例中，遮蔽性肽或其部分(例如，遮蔽性部分(MM))幹預、阻止、降低能力、防止、抑制或與靶結合部分(TBM)競爭結合至其靶(例如CD47))。於一些實施例中，僅當多肽尚未被活化(例如，藉由pH變化(增加或減少)活化，藉由溫度變化(增加或減少)活化，與第二分子(諸如小分子或蛋白質配位體)接觸後活化等)時，該遮蔽性部分幹預、阻止、降低、防止、抑制或與TBM競爭結合至其靶。於一些實施例中，僅當多肽活化後(例如，藉由投與一種或多種蛋白酶，其可由可裂解部分(CM)裂解活化，藉由pH變化(增加或減少)活化，藉由溫度變化(增加或減少)活化，與第二分子(諸如酶)接觸後活化等)時，該遮蔽性部分不幹預、不降低靶結合部分之能力、不阻止、不防止、不抑制或不與靶結合部分(TBM)競爭結合至其靶(例如CD47)。於一些實施例中，在CM被一個或多個在CM內裂解之蛋白酶裂解後，該遮蔽性部分不幹預、不降低靶結合部分之能力、不阻止、不防止、不抑制或不與TBM競爭結合至其靶。於一些實施例中，遮蔽性肽或其一部分(例如MM)在活化前(例如，投與一種或多種蛋白酶，其由可裂解部分(CM)裂解前，發生pH(局部)變化(增加或減少)前，溫度變化(增加或減少)前，與第二分子(諸如小分子或配體蛋白)接觸前等)結合TBM且抑制TBM與其靶(例如，CD47)結合，但在活化後(例如，投與一種或多種蛋白酶，其由可裂解部分(CM)裂解後，發生pH(局部)變化(增加或減少)活化，溫度變化(增加或減少)後，與第二分子(諸如小分子或配體蛋白)接觸後等)不結合TBM及/或抑制多肽與其靶(例如，CD47)結合。於一些實施例中，活化誘導CM內多肽之裂解。於一些實施例中，活化誘導多肽之構象變化(例如，MM或遮蔽性肽之取代)，導致遮蔽性肽不阻止可活化抗體與其靶(例如CD47)結合。於一些實施例中，僅當CM未被一個或多個在CM內裂解之蛋白酶裂解時，遮蔽性肽或其一部分(例如MM)幹預、阻止、降低能力、防止、抑制或與TBM競爭結合至其靶(例如CD47))。於一些實施例中，當CM未裂解時，遮蔽性肽或其一部分(例如，MM)抑制可活化抗體與其靶(例如CD47)結合，但是當CM裂解時，不抑制可活化抗體與其靶(例如CD47)結合。
於一些實施例中，遮蔽性肽或其部分(例如，MM)與靶結合部分(TBM)之解離常數大於((例如，至少大約1.5倍，至少約2倍，至少約2.5倍，至少約3倍，至少約3.5倍，至少約4倍，至少約4.5倍，至少約5倍，至少約10倍，至少約100倍，至少大約500倍以上，等等)可活化抗體或其一部分(例如，TBM)對於其目標(例如，CD47)之解離常數。
於一些實施例中，遮蔽性肽或其部分(例如，遮蔽性部分(MM))具有可量測之遮蔽效率。於一些實施例中，遮蔽效率量測為包含遮蔽性肽之可活化抗體與靶結合(活化前)相對於缺少遮蔽性肽之多肽結合其靶之親和力差異(例如，包含遮蔽性肽之可活化抗體相對於缺少遮蔽性肽之親本抗體對其靶抗原(例如CD47)之親和力差異或包含遮蔽性肽之可活化抗體(活化前)相對於活化後之可活化抗體對其靶抗原之親和力差異)。於一些實施例中，遮蔽效率可藉由包含遮蔽性肽(活化前)之可活化抗體之EC
50除以缺少遮蔽性肽之親本抗體之EC
50來量測(例如，藉由ELISA量測EC
50；參見例如實例5之方法)。於一些實施例中，遮蔽效率可藉由包含遮蔽性肽之可活化抗體在活化前與其靶結合合之親和力相對於包含遮蔽性肽之可活化抗體或其一部分(例如，MM)在活化後與其靶結合之親和力之差異(例如，活化前之可活化抗體相對於活化後之可活化抗體對靶抗原(如CD47)之親和力差異)。於一些實施例中，遮蔽性肽或其部分(例如，MM)與靶結合部分(TBM)，並阻止可活化抗體與其靶抗原(例如CD47)結合。於一些實施例中，遮蔽性肽或其部分(例如，MM)與靶結合部分(TBM)之解離常數大於TBM與其靶抗原(例如CD47)之解離常數。解離常數可(例如)藉由諸如ELISA、表面電漿子共振或生物層干涉術(BLI)或流式細胞術等技術來量測。
於一些實施例中，遮蔽性肽或其部分(例如，遮蔽性部分(MM))具有至少約2.0之遮蔽效率(例如，至少約2.0，至少約3.0，至少約4.0，至少約5.0，至少約6.0，至少約7.0，至少約8.0，至少約9.0，至少約10，至少約25，至少約50，至少約75，至少約100，至少約150，至少約200，至少約300，至少約400，至少約500等)或藉由例如Jurkat NFAT報告子分析測定，如美國專利第16/966,848號中所述。於一些實施例中，遮蔽性肽或其部分(例如，遮蔽性部分(MM))具有至少50之遮蔽效率，藉由Jurkat NFAT報告子分析測定。於某些實施例中，遮蔽性肽或其部分(例如，遮蔽性部分(MM))具有至少100之遮蔽效率，藉由Jurkat NFAT報告子分析測定。於一些實施例中，遮蔽性肽或其部分(例如，遮蔽性部分(MM))在活化前具有至少約2.0之遮蔽效率(例如，至少約2.0，至少約3.0，至少約4.0，至少約5.0，至少約6.0，至少約7.0，至少約8.0，至少約9.0，至少約10，至少約25，至少約50，至少約75，至少約100，至少約150，至少約200，至少約300，至少約400，至少約500等)。於一些實施例中，遮蔽性肽或其部分(例如，遮蔽性部分(MM))在活化後(活化後可活化抗體之相對親和力相對於親本抗體之親和力)具有至多約1.75之遮蔽效率(例如，至多約1.75、至多約1.5、至多約1.4、至多約1.3、至多約1.2、至多約1.1、至多約1.0、至多約0.9、至多約0.8、至多約0.7，至多約0.6，至多約0.5等)。
於一些實施例中，與CM裂解時相比，CM未裂解時可活化抗體與CD47 (例如，人類CD47)結合具有更高之K
D。於一些實施例中，當CM未裂解時，可活化抗體以大於50 nM (例如，約60 nM、約70 nM、約80 nM、約90 nM、約100 nM、約150 nM、約200 nM、約300 nM、約400 nM、約500 nM、約1 μM或更高)之K
D與人類CD47結合，及/或當CM裂解時，以小於50 nM (例如，約40 nM，約30 nM，約20 nM，約10 nM，約5 nM，約4 nM，約3 nM，約2 nM，約1 nM，約0.5 nM，約0.4 nM，約0.3 nM，約0.2 nM，約0.1 nM，或更低)之K
D與人類CD47結合。於一些實施例中，當CM未裂解時，可活化抗體以大於50 nM (例如，約60 nM、約70 nM、約80 nM、約90 nM、約100 nM、約150 nM、約200 nM、約300 nM、約400 nM、約500 nM、約1 μM或更高)之K
D與人類CD47結合，及/或當CM裂解時，以小於10 nM (例如，約9 nM，約8 nM，約7 nM，約6 nM，約5 nM，約4 nM，約3 nM，約2 nM，約1 nM，約0.5 nM，約0.4 nM，約0.3 nM，約0.2 nM，約0.1 nM，或更低)之K
D與人類CD47結合。於一些實施例中，當CM未裂解時，可活化抗體以大於100 nM (例如，約110 nM、約120 nM、約130 nM、約140 nM、約150 nM、約200 nM、約300 nM、約400 nM、約500 nM、約1 μM或更高)之K
D與人類CD47結合，及/或當CM裂解時，以小於10 nM (例如，約9 nM，約8 nM，約7 nM，約6 nM，約5 nM，約4 nM，約3 nM，約2 nM，約1 nM，約0.5 nM，約0.4 nM，約0.3 nM，約0.2 nM，約0.1 nM或更低)之K
D與人類CD47結合。
於一些實施例中，與CM裂解時相比，CM未裂解時可活化抗體具有與CD47 (例如，人類CD47)之結合具有更高之半最大效應濃度(EC50)。於一些實施例中，當CM未裂解時，可活化抗體以大於50 nM (例如，約60 nM、約70 nM、約80 nM、約90 nM、約100 nM、約150 nM、約200 nM、約300 nM、約400 nM、約500 nM、約1 μM或更高)之EC50在活體外結合人類CD47，及/或當CM裂解時，以小於50 nM (例如，約40 nM，約30 nM，約20 nM，約10 nM，約5 nM，約4 nM，約3 nM，約2 nM，約1 nM，約0.5 nM，約0.4 nM，約0.3 nM，約0.2 nM，約0.1 nM或更低)之EC50在活體外結合人類CD47。於一些實施例中，當CM未裂解時，可活化抗體以大於50 nM (例如，約60 nM、約70 nM、約80 nM、約90 nM、約100 nM、約150 nM、約200 nM、約300 nM、約400 nM、約500 nM、約1 μM或更高)之EC50在活體外結合人類CD47，及/或當CM裂解時，以小於10 nM之EC50(例如，約9 nM，約8 nM，約7 nM，約6 nM，約5 nM，約4 nM，約3 nM，約2 nM，約1 nM，約0.5 nM，約0.4 nM，約0.3 nM，約0.2 nM，約0.1 nM或更低)之EC50在活體外結合人類CD47。於一些實施例中，當CM未裂解時，可活化抗體以大於100 nM (例如，約110 nM、約120 nM、約130 nM、約140 nM、約150 nM、約200 nM、約300 nM、約400 nM、約500 nM、約1 μM或更高)之EC50在活體外結合人類CD47，及/或當CM裂解時，以小於10 nM (例如，約9 nM，約8 nM，約7 nM，約6 nM，約5 nM，約4 nM，約3 nM，約2 nM，約1 nM，約0.5 nM，約0.4 nM，約0.3 nM，約0.2 nM，約0.1 nM或更低)之EC50在活體外結合人類CD47。
於一些實施例中，與CM裂解時相比，CM未裂解時可活化抗體與CD47 (例如，人類類CD47)具有更高之半倍最大抑制濃度(IC50)，之半抑制濃度(IC50)在活體外阻斷人類CD47與人類SIRPα之結合。於一些實施例中，當CM未裂解時，可活化抗體以大於50 nM (例如，約60 nM、約70 nM、約80 nM、約90 nM、約100 nM、約150 nM、約200 nM、約300 nM、約400 nM、約500 nM、約1 μM或更高)之IC50在活體外阻斷人類CD47與人類SIRPα之結合，及/或當裂解時以小於50 nM (例如，約40 nM，約30 nM，約20 nM，約10 nM，約5 nM，約4 nM，約3 nM，約2 nM，約1 nM，約0.5 nM，約0.4 nM，約0.3 nM，約0.2 nM，約0.1 nM或更低)之IC50在活體外阻斷人類CD47與人類SIRPα之結合。於一些實施例中，當CM未裂解時，可活化抗體以大於50 nM (例如，當CM未裂解時，約60 nM、約70 nM、約80 nM、約90 nM、約100 nM、約150 nM、約200 nM、約300 nM、約400 nM、約500 nM、約1 μM或更高)之IC50在活體外阻斷人類CD47與人類SIRPα之結合，及/或當裂解時以小於10 nM (例如，約9 nM，約8 nM，約7 nM，約6 nM，約5 nM，約4 nM，約3 nM，約2 nM，約1 nM，約0.5 nM，約0.4 nM，約0.3 nM，約0.2 nM，約0.1 nM或更低)之IC50在活體外阻斷人類CD47與人類SIRPα之結合。於一些實施例中，當CM未裂解時，可活化抗體具有大於100 nM (例如，約110 nM、約120 nM、約130 nM、約140 nM、約150 nM、約200 nM、約300 nM、約400 nM、約500 nM、約1 μM或更高)之IC50在活體外阻斷人類CD47與人類SIRPα之結合，及/或當裂解時以小於10 nM (例如，約9 nM，約8 nM，約7 nM，約6 nM，約5 nM，約4 nM，約3 nM，約2 nM，約1 nM，約0.5 nM，約0.4 nM，約0.3 nM，約0.2 nM，約0.1 nM或更低)之IC50在活體外阻斷人類CD47與人類SIRPα之結合。
於某些實施例中，當可活化抗體以約1 nM或更高之濃度(例如，約1 nM或更高，約5 nM或更高，約10 nM或更高，約20 nM或更高，約40 nM或更高，約60 nM或更高，約80 nM或更高，約100 nM或更高，約200 nM或更高，約400 nM或更高，約600 nM或更高，約800 nM或更高，約1 μM或更高，約2 μM或更高，約4 μM或更高，約6 μM或更高，約8 μM或更高，約10 μM或更高，約20 μM或更高，約40 μM或更高，約60 μM或更高，約80 μM或更高，約100 μM或更高等)提供，且CM裂解時，可活化抗體在活體外完全阻斷人類CD47與人類SIRPα之結合。於一些實施例中，當可活化抗體以約1 μM或更高濃度提供，且CM裂解時，可活化抗體在活體外完全阻斷人類CD47與人類SIRPα之結合。
於一些實施例中，與CM裂解時相比，CM未裂解時可活化抗體具有更高之半最大效應濃度(EC50)在活體外與腫瘤細胞結合。於一些實施例中，當CM未裂解時，可活化抗體以大於10 nM (例如，約15 nM、約20 nM、約30 nM、約40 nM、約50 nM、約100 nM、約200 nM、約300 nM、約400 nM、約500 nM、約1 μM或更高)之EC50在活體外結合人類CD47，及/或當CM裂解時以小於10 nM之EC50(例如，約9 nM，約8 nM，約7 nM，約6 nM，約5 nM，約4 nM，約3 nM，約2 nM，約1 nM，約0.5 nM，約0.4 nM，約0.3 nM，約0.2 nM，約0.1 nM或更低)之EC50在活體外結合人類CD47。於一些實施例中，當CM未裂解時，可活化抗體以大於10 nM (例如，約15 nM、約20 nM、約30 nM、約40 nM、約50 nM、約100 nM、約200 nM、約300 nM、約400 nM、約500 nM、約1 μM或更高)之EC50在活體外結合人類CD47，及/或當CM裂解時以小於1 nM (例如，約0.9 nM、約0.8 nM、約0.7 nM、約0.6 nM、約0.5 nM、約0.4 nM、約0.3 nM、約0.2 nM、約0.1 nM或更低)之EC50在活體外結合人類CD47。於一些實施例中，當CM未裂解時，可活化抗體以大於50 nM (例如，約60 nM、約70 nM、約80 nM、約90 nM、約100 nM、約150 nM、約200 nM、約300 nM、約400 nM、約500 nM、約1 μM或更高)之EC50在活體外結合人類CD47，及/或當CM裂解時以小於 1 nM之EC50(例如，約0.9 nM、約0.8 nM、約0.7 nM、約0.6 nM、約0.5 nM、約0.4 nM、約0.3 nM、約0.2 nM、約0.1 nM或更低)之EC50在活體外結合人類CD47。於某些實施例中，腫瘤細胞包含B細胞淋巴瘤細胞株(例如Raji細胞株)。於進一步之實施例中，所述腫瘤細胞包含T細胞淋巴瘤細胞株(例如CEM細胞株)。於一些實施例中，當CM未裂解時，可活化抗體以大於10 nM之EC50在活體外結合包含B細胞淋巴瘤細胞株(例如Raji細胞株)之腫瘤細胞，及/或當裂解時以小於1 nM之EC50在活體外結合包含B細胞淋巴瘤細胞株之腫瘤細胞(例如，Raji細胞株)。於一些實施例中，當CM未裂解時，可活化抗體以大於50 nM之EC50在活體外結合包含T細胞淋巴瘤細胞株(例如CEM細胞株)之腫瘤細胞結合，當CM未裂解時，及/或當裂解時以小於1 nM之EC50在活體外結合包含T細胞淋巴瘤細胞株之腫瘤細胞結合(例如，CEM細胞株)。
於一些實施例中，與具有相同TBM但缺少遮蔽性肽之親本抗體相比，包含遮蔽性肽及靶結合部分(TBM)之可活化抗體在活體外與紅血球(RBC)之結合減少。於一些實施例中，當CM未裂解時，與具有相同TBM (例如，相同VH及VL)但缺少遮蔽性肽之抗體相比，可活化抗體具有更高之半最大效應濃度(EC50)在活體外與紅血球結合。於一些實施例中，當CM未裂解時，具有遮蔽性肽、VH及VL之可活化抗體以大於100 nM (例如，約110 nM、約120 nM、約130 nM、約140 nM、約150 nM、約200 nM、約300 nM、約400 nM、約500 nM、約1 μM或更高)之EC50在活體外與紅血球結合，且具有相同VH及VL缺少遮蔽性肽之抗體以小於10 nM (例如，約9 nM，約8 nM，約7 nM，約6 nM，約5 nM，約4 nM，約3 nM，約2 nM，約1 nM，約0.5 nM，約0.4 nM，約0.3 nM，約0.2 nM，約0.1 nM或更低)之EC50在相同量測條件下在活體外與紅血球結合。於某些實施例中，當CM未裂解時，具有遮蔽性肽、VH及VL之可活化抗體比具有相同VH及VL缺少遮蔽性肽之抗體以約10倍、約50倍、約100倍、約200倍、約300倍、約400倍、約500倍、約600倍、約700倍、約800倍、約900倍，約1000倍，約1500倍，約2000倍或約2500倍之EC50在活體外與紅血球結合。
於某些實施例中，與CM裂解時相比，可裂解部分(CM)未裂解時相同之可活化抗體在活體外與紅細胞結合減少。於一些實施例中，當CM未裂解時，可活化抗體在活體外與紅細胞結合之半最大效應濃度(EC50)大於CM裂解時之一半。於一些實施例中，當CM未裂解時，可活化抗體以大於100 nM (例如，約110 nM、約120 nM、約130 nM、約140 nM、約150 nM、約200 nM、約300 nM、約400 nM、約500 nM、約1 μM或更高)之EC50在活體外與紅血球結合，及/或當CM裂解時，以小於50 nM (例如，約40 nM，約30 nM，約20 nM，約10 nM，約5 nM，約4 nM，約3 nM，約2 nM，約1 nM，約0.5 nM，約0.4 nM，約0.3 nM，約0.2 nM，約0.1 nM或更低)之EC50在活體外與紅血球結合。於一些實施例中，當以約1 mM或更低(例如，約1 mM或更低，約0.5 mM或更低，約0.1 mM或更低，約50 μM或更低，約10 μM或更低，約5 μM或更低，約4 μM或更低，約3 μM或更低，約2 μM或更低，約1 μM或更低，約500 μM或更低，約100 μM或更低，或約50 μM或更低)之濃度提供時，可活化抗體不會在活體外誘導RBCs凝集。
於一些實施例中，與CM裂解時相比，當CM未裂解時，可活化抗體具有更高之半最大效應濃度(EC50)在活體外增加腫瘤細胞之巨噬細胞吞噬作用。於某些實施例中，可活化抗體以大於20 nM (例如，約20 nM、約30 nM、約40 nM、約50 nM、約60 nM、約70 nM、約80 nM、約90 nM、約100 nM、約150 nM、約200 nM、約300 nM、約400 nM、約500 nM、約1 μM或更高)之EC50在活體外增加腫瘤細胞之巨噬細胞吞噬作用，及/或當CM裂解時以小於20 nM (例如，約15 nM，約10 nM，約5 nM，約4 nM，約3 nM，約2 nM，約1 nM，約0.5 nM，約0.4 nM，約0.3 nM、約0.2 nM、約0.1 nM或更低)之半最大效應濃度(EC50)在活體外增加腫瘤細胞之巨噬細胞吞噬作用。於某些實施例中，可活化抗體以大於20 nM (例如，約20 nM、約30 nM、約40 nM、約50 nM、約60 nM、約70 nM、約80 nM、約90 nM、約100 nM、約150 nM、約200 nM、約300 nM、約400 nM、約500 nM、約1 μM或更高)之EC50在活體外增加腫瘤細胞之巨噬細胞吞噬作用，及/或當裂解時以小於10 nM (例如，約9 nM，約8 nM，約7 nM，約6 nM，約5 nM，約4 nM，約3 nM，約2 nM，約1 nM，約0.5 nM、約0.4 nM、約0.3 nM、約0.2 nM、約0.1 nM或更低)之EC50在活體外增加腫瘤細胞之巨噬細胞吞噬作用。於某些實施例中，當CM未裂解時，可活化抗體以約20 nM或更高之EC50在活體外增加腫瘤細胞之巨噬細胞吞噬作用；及/或當CM裂解時以約1 nM或更低之EC50在活體外增加腫瘤細胞之巨噬細胞吞噬作用。於一些實施例中，當CM未裂解時，以約1 μM或更高之濃度提供可活化抗體以致之活體外腫瘤細胞最大之巨噬細胞吞噬作用約為20%或更低(例如，約20%、約19%、約18%、約17%、約16%、約15%、約10%、約5%或更低)，及/或當CM裂解時，活體外腫瘤細胞最大之巨噬細胞吞噬作用約為50%或更高(例如，約50%，約60%，約70%，約80%，約90%，約95%或更高)。
B-4. 抗原結合片段
於一些其他態樣中，本發明提供本文中所述之CD47抗體或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)中之任一者之抗原結合片段。
抗原結合片段可包含本文中所述抗體或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)中之任一者之任何序列。於一些實施例中，該抗原結合片段包含以下之胺基酸序列：(1) CD47抗體或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)之輕鏈；(2) CD47抗體或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)之重鏈；(3)來自CD47抗體或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)之輕鏈可變區；(4)來自CD47抗體或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)之重鏈可變區；(5) CD47抗體或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)之一或多個CDRs (例如，1、2、3、4、5或6個CDRs)；或(6)來自CD47抗體或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)之輕鏈之三個CDRs及來自CD47抗體或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)之重鏈之三個CDRs；或(7)來自CD47抗體或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)之靶結合部分(TBM)。
於一些特定實施例中，本發明提供選自表3A-6中所列之彼等之抗體或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)之抗原結合片段。
於一些實施例中，CD47抗體或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)之抗原結合片段包括：(i) Fab片段，其為由VL、VH、CL及CH1域組成之單價片段；(ii) F(ab′)2片段，其為包含由鉸鏈區處之二硫橋連接之兩個Fab片段之二價片段；(iii)由VH及CH1域組成之Fd片段；(iv)由抗體或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)之單臂之VL及VH域組成之Fv片段；(v) dAb片段(Ward等人，(1989) Nature 341:544-546)，其由VH域組成；(vi)經單離CDR，及(vii)單鏈抗體(scFv)，其為包含連接至CD47抗體或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)之VH區之CD47抗體或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)之VL區之多肽(參見例如，Bird等人(1988) Science 242:423-426；Huston等人(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883)。
B-5. 說明性抗CD47抗體、經遮蔽抗體及抗原結合片段
本文提供之表3A-6所述之說明性抗體、經遮蔽抗體(包括，例如，可活化抗體)及其抗原結合片段，其靶向CD47 (例如，人類CD47)。
表3A. 例示性抗CD47抗體、經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)及抗原結合片段之重鏈可變區互補決定區(VH-CDRs)序列。
表3B. 例示性抗CD47抗體、經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)及抗原結合片段之輕鏈可變區互補決定區(VL-CDRs)序列。
表4A. 例示性抗CD47抗體、經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)及抗原結合片段之重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)序列。
表4B. 基準抗CD47抗體重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)序列。
表5A. 例示性抗CD47可活化抗體及抗原結合片段之遮蔽性部分(MM)及可裂解部分(CM)序列。
表5B. 例示性抗CD47可活化抗體及抗原結合片段之遮蔽性肽序列。
表6A. 例示性抗CD47抗體、經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)及抗原結合片段之輕鏈(LC)及重鏈(HC)序列。
表6B. 例示性抗CD47抗體及可活化抗體序列。
*NA=不適用
| 例示性抗體 | VH-CDR1 | VH-CDR2 | VH-CDR3 |
| TY25029 | NYWIH (SEQ ID NO: 35) | IIYPSSGSTKYAQKFQG (SEQ ID NO: 52) | DRAPGSSGYYDGFDY (SEQ ID NO: 69) |
| TY25030 | SGYYWS (SEQ ID NO: 36) | EIYHSGNTYYNPSLKS (SEQ ID NO: 53) | RVPLGAFDY (SEQ ID NO: 70) |
| TY25031 | SGYHWG (SEQ ID NO: 37) | RIYPSSGSTKYAQKFQG (SEQ ID NO: 54) | GVRGSYGWFDV (SEQ ID NO: 71) |
| TY25032 | SYGIH (SEQ ID NO: 38) | AISGSGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO: 55) | SGHAYDFDY (SEQ ID NO: 72) |
| TY25033 | SYAIH (SEQ ID NO: 39) | IINPNFGSTNYAQKFQG (SEQ ID NO: 56) | YYYGASFDV (SEQ ID NO: 73) |
| TY25034 | SGHYWN (SEQ ID NO: 40) | IISPSGGGTKYAQKFQG (SEQ ID NO: 57) | GARGYYALDY (SEQ ID NO: 74) |
| TY25035 | SGYHWD (SEQ ID NO: 41) | RIYWDGDKRYSPSLKS (SEQ ID NO: 58) | FSDGFDP (SEQ ID NO: 75) |
| TY25036 | GYAIH (SEQ ID NO: 42) | WISPSSGSTKYAQKFQG (SEQ ID NO: 59) | YGYGPVFDY (SEQ ID NO: 76) |
| TY25037 | SGHYWT (SEQ ID NO: 43) | GIIPVFGTPNYAQKFQG (SEQ ID NO: 60) | YGYGGAYFDV (SEQ ID NO: 77) |
| TY25038 | RYAIH (SEQ ID NO: 44) | GIIPVFGTANYAQKFQG (SEQ ID NO: 61) | QGILGGFAY (SEQ ID NO: 78) |
| TY25039 | SGYYWG (SEQ ID NO: 45) | AISYSGSTYYSPSLKS (SEQ ID NO: 62) | HYLFAGSTSYDAFDI (SEQ ID NO: 79) |
| TY25040 | DYGIH (SEQ ID NO: 46) | RIYPSGGSTNYAQKFQG (SEQ ID NO: 63) | QRGYGRFAY (SEQ ID NO: 80) |
| TY25041 | SGHHWN (SEQ ID NO: 47) | AISYSGSTYYSPSLKS (SEQ ID NO: 64) | QGYYGGEGYAVDY (SEQ ID NO: 81) |
| TY21446 | NYAIH (SEQ ID NO: 48) | AISGSGSSTYYADSVKG (SEQ ID NO: 65) | RGSYGFGAFDY (SEQ ID NO: 82) |
| TY21447 | NYAIH (SEQ ID NO: 49) | AISGSGSSTYYADSVKG (SEQ ID NO: 66) | RGSYGFGAFDY (SEQ ID NO: 83) |
| TY21449 | GYAIH (SEQ ID NO: 50) | AISGSGSSTYYADSVKG (SEQ ID NO: 67) | RGSYGFGAFDY (SEQ ID NO: 84) |
| TY21451 | DYWIH (SEQ ID NO: 51) | GISGAGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO: 68) | LGDY (SEQ ID NO: 85) |
| 例示性抗體 | VL-CDR1 | VL-CDR2 | VL-CDR3 |
| TY25029 | RASQSVDFHGISFLH (SEQ ID NO: 86) | DASSLES (SEQ ID NO: 103) | HQRSTTPLT (SEQ ID NO: 120) |
| TY25030 | RASQTVISRYLA (SEQ ID NO: 87) | DASNLET (SEQ ID NO: 104) | QQYYAWPLT (SEQ ID NO: 121) |
| TY25031 | SASSRVSYVY (SEQ ID NO: 88) | AASTLQS (SEQ ID NO: 105) | QHYVSSPRVYT (SEQ ID NO: 122) |
| TY25032 | RASQSVDFYGISFLD (SEQ ID NO: 89) | AASTLQS (SEQ ID NO: 106) | QQGGTSPWT (SEQ ID NO: 123) |
| TY25033 | KSGQSLLHGDVKTYLY (SEQ ID NO: 90) | DASNRAT (SEQ ID NO: 107) | QQYASWPPGFT (SEQ ID NO: 124) |
| TY25034 | RASQSVRGRLLA (SEQ ID NO: 91) | AASSLQS (SEQ ID NO: 108) | AQYLELPYT (SEQ ID NO: 125) |
| TY25035 | RASQSVDFVGISFLH (SEQ ID NO: 92) | DASNRAT (SEQ ID NO: 109) | VQGLQWPHT (SEQ ID NO: 126) |
| TY25036 | SASSSVTYIY (SEQ ID NO: 93) | DASNRAT (SEQ ID NO: 110) | QQYTSSPRGFT (SEQ ID NO: 127) |
| TY25037 | RASQSVDFHGISFLH (SEQ ID NO: 94) | DASNRAT (SEQ ID NO: 111) | VQGIQWPWT (SEQ ID NO: 128) |
| TY25038 | RASESVDFHGKSFLA (SEQ ID NO: 95) | AASSLQS (SEQ ID NO: 112) | QQYLELPFT (SEQ ID NO: 129) |
| TY25039 | RASQSVDFYGFSFLA (SEQ ID NO: 96) | DASNRAT (SEQ ID NO: 113) | QQSYRTPLT (SEQ ID NO: 130) |
| TY25040 | SASSSVGYVY (SEQ ID NO: 97) | DASSLES (SEQ ID NO: 114) | QQYTYAPFT (SEQ ID NO: 131) |
| TY25041 | RASQSVDFYGISFLH (SEQ ID NO: 98) | DASNRAT (SEQ ID NO: 115) | VQATQTPFT (SEQ ID NO: 132) |
| TY21446 | RASQTIGRYLN (SEQ ID NO: 99) | DASNRAT (SEQ ID NO: 116) | QQRYPWPYT (SEQ ID NO: 133) |
| TY21447 | RASQTIGRYLN (SEQ ID NO: 100) | DASNRAT (SEQ ID NO: 117) | QQRYPWPYT (SEQ ID NO: 134) |
| TY21449 | RASQTIGRYLN (SEQ ID NO: 101) | DASNRAT (SEQ ID NO: 118) | QQRYPWPYT (SEQ ID NO: 135) |
| TY21451 | RASQGISSVLA (SEQ ID NO: 102) | AASTLQS (SEQ ID NO: 119) | QQYYSIPFT (SEQ ID NO: 136) |
| SEQ ID NO | 例示性抗體及區域 | 胺基酸序列 |
| SEQ ID NO: 1 | TY25029-VH | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFSNYWIHWVRQAPGKGLEWIGIIYPSSGSTKYAQKFQGRVTISRDNSKNTLYLQLNSLRAEDTAVYYCARDRAPGSSGYYDGFDYWGQGTLVTVSS |
| SEQ ID NO: 2 | TY25029-VL | DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVDFHGISFLHWYQQKPGKAPKLLIYDASSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCHQRSTTPLTFGQGTKVEIKR |
| SEQ ID NO: 3 | TY25030-VH | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSITSGYYWSWIRQAPGKGLEWIGEIYHSGNTYYNPSLKSRVTISRDNSKNTLYLQLNSLRAEDTAVYYCARRVPLGAFDYWGQGTLVTVSS |
| SEQ ID NO: 4 | TY25030-VL | DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQTVISRYLAWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYAWPLTFGQGTKVEIKR |
| SEQ ID NO: 5 | TY25031-VH | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSITSGYHWGWIRQAPGKGLEWIGRIYPSSGSTKYAQKFQGRVTISRDNSKNTLYLQLNSLRAEDTAVYYCARGVRGSYGWFDVWGQGTLVTVSS |
| SEQ ID NO: 6 | TY25031-VL | DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSRVSYVYWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHYVSSPRVYTFGQGTKVEIKR |
| SEQ ID NO: 7 | TY25032-VH | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTSYGIHWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQLNSLRAEDTAVYYCARSGHAYDFDYWGQGTLVTVSS |
| SEQ ID NO: 8 | TY25032-VL | DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVDFYGISFLDWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGGTSPWTFAQGTKVEIKR |
| SEQ ID NO: 9 | TY25033-VH | QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFTFTSYAIHWVRQAPGQGLEWIGIINPNFGSTNYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARYYYGASFDVWGQGTLVTVSS |
| SEQ ID NO: 10 | TY25033-VL | DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCKSGQSLLHGDVKTYLYWYQQKPGKAPKLLIYDASNRATGIPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYASWPPGFTFGQGTKVEIKR |
| SEQ ID NO: 11 | TY25034-VH | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSITSGHYWNWIRQAPGKGLEWIGIISPSGGGTKYAQKFQGRVTISRDNSKNTLYLQLNSLRAEDTAVYYCARGARGYYALDYWGQGTLVTVSS |
| SEQ ID NO: 12 | TY25034-VL | EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVRGRLLAWYQQKPGQAPRLLIYAASSLQSGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCAQYLELPYTFGQGTKVEIKR |
| SEQ ID NO: 13 | TY25035-VH | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSISSGYHWDWIRQAPGKGLEWLARIYWDGDKRYSPSLKSRLTISRDNSKNTLYLQLNSLRAEDTAVYYCARFSDGFDPWGQGTLVTVSS |
| SEQ ID NO: 14 | TY25035-VL | EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVDFVGISFLHWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCVQGLQWPHTFGQGTKVEIKR |
| SEQ ID NO: 15 | TY25036-VH | QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTGYAIHWVRQAPGQGLEWIGWISPSSGSTKYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARYGYGPVFDYWGQGTLVTVSS |
| SEQ ID NO: 16 | TY25036-VL | DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVTYIYWYQQKPGKAPKLLIYDASNRATGIPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYTSSPRGFTFGQGTKVEIKR |
| SEQ ID NO: 17 | TY25037-VH | QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYSITSGHYWTWIRQAPGQGLEWIGGIIPVFGTPNYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCASYGYGGAYFDVWGQGTLVTVSS |
| SEQ ID NO: 18 | TY25037-VL | DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVDFHGISFLHWYQQKPGKAPKLLIYDASNRATGIPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCVQGIQWPWTFGQGTKVEIKR |
| SEQ ID NO: 19 | TY25038-VH | QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFTFSRYAIHWVRQAPGQGLEWLGGIIPVFGTANYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARQGILGGFAYWGQGTLVTVSS |
| SEQ ID NO: 20 | TY25038-VL | DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDFHGKSFLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLELPFTFGQGTKVEIKR |
| SEQ ID NO: 21 | TY25039-VH | QVQPAQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYSISSGYYWGWIRQAPGQGLEWIGAISYSGSTYYSPSLKSRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARHYLFAGSTSYDAFDIWGQGTLVTVSS |
| SEQ ID NO:: 22 | TY25039-VL | DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVDFYGFSFLAWYQQKPGKAPKLLIYDASNRATGIPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYRTPLTFGQGTKVEIKR |
| SEQ ID NO: 23 | TY25040-VH | QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFTFSDYGIHWVRQAPGQGLEWIGRIYPSGGSTNYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARQRGYGRFAYWGQGTLVTVSS |
| SEQ ID NO: 24 | TY25040-VL | DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVGYVYWYQQKPGKAPKLLIYDASSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQYTYAPFTFGQGTKVEIKR |
| SEQ ID NO: 25 | TY25041-VH | QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYSISSGHHWNWIRQAPGQGLEWIGAISYSGSTYYSPSLKSRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARQGYYGGEGYAVDYWGQGTLVTVSS |
| SEQ ID NO: 26 | TY25041-VL | DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVDFYGISFLHWYQQKPGKAPKLLIYDASNRATGIPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCVQATQTPFTFGQGTKVEIKR |
| SEQ ID NO: 27 | TY21446-VH | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTNYAIHWVRQAPGKGLEWVSAISGSGSSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQLNSLRAEDTAVYYCARRGSYGFGAFDYWGQGTLVTVSS |
| SEQ ID NO: 28 | TY21446-VL | DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQTIGRYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNRATGIPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQRYPWPYTFGQGTKVEIKR |
| SEQ ID NO: 29 | TY21447-VH | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAIHWVRQAPGKGLEWVSAISGSGSSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQLNSLRAEDTAVYYCARRGSYGFGAFDYWGQGTLVTVSS |
| SEQ ID NO: 30 | TY21447-VL | DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQTIGRYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNRATGIPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQRYPWPYTFGQGTKVEIKR |
| SEQ ID NO: 31 | TY21449-VH | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSGYAIHWVRQAPGKGLEWVSAISGSGSSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQLNSLRAEDTAVYYCARRGSYGFGAFDYWGQGTLVTVSS |
| SEQ ID NO: 32 | TY21449-VL | DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQTIGRYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNRATGIPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQRYPWPYTFGQGTKVEIKR |
| SEQ ID NO: 33 | TY21451-VH | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYWIHWVRQAPGKGLEWVSGISGAGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQLNSLRAEDTAVYYCARLGDYWGQGTLVTVSS |
| SEQ ID NO: 34 | TY21451-VL | DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSVLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYSIPFTFGQGTKVEIKR |
| SEQ ID NO | 基準抗體及區域 | 胺基酸序列 |
| SEQ ID NO: 201 | TAC2407_VH | EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGLTFERAWMNWVRQAPGKGLEWVGRIKRKTDGETTDYAAPVKGRFSISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCAGSNRAFDIWGQGTMVTVSS |
| SEQ ID NO: 202 | TAC2407_VL | DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYAGNNRNYLAWYQQKPGQPPKLLINQASTRASGVPDRFSGSGSGTEFTLIISSLQAEDVAIYYCQQYYTPPLAFGGGTKLEIK |
| SEQ ID NO: 203 | TAC2204_VH | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYNMHWVRQAPGQRLEWMGTIYPGNDDTSYNQKFKDRVTITADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYRAMDYWGQGTLVTVSS |
| SEQ ID NO: 204 | TAC2204_VL | DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSIVYSNGNTYLGWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPYTFGQGTKLEIK |
| SEQ ID NO | 例示性抗體及區域 | 胺基酸序列 |
| SEQ ID NO: 137 | TY26294_MM | LTVDYFCDIDPLYCNA |
| SEQ ID NO: 138 | TY26294_CM | GGGPLGLAGSGGS |
| SEQ ID NO: 167 | TY26137_MM | NNAAPDCPAADVYCNV |
| SEQ ID NO: 168 | TY26138_MM | DDTAFDCDDDFDDCAT |
| SEQ ID NO: 169 | TY26139_MM | HAYHNDCSDDDDFCAY |
| SEQ ID NO: 170 | TY26292_MM | PADDFDCPAADVFCSP |
| SEQ ID NO: 171 | TY26293_MM | APSVDDCPTYDDFCYD |
| SEQ ID NO: 172 | TY26294_MM | LTVDYFCDIDPLYCNA |
| SEQ ID NO: 173 | TY26295_MM | NYNDDDCYDDDYACDY |
| SEQ ID NO: 174 | TY26296_MM | DTADHDCYDDDDFCYD |
| SEQ ID NO: 175 | TY26297_MM | DFLSASCDDDYAPCAF |
| SEQ ID NO: 176 | TY26298_MM | YPPDDTCDDDYDPCAI |
| SEQ ID NO: 177 | TY26299_MM | AQSSFDCPDHDAFCDP |
| SEQ ID NO: 178 | TY26300_MM | AASPATCDDTLFFCPA |
| SEQ ID NO: 179 | TY26140_MM | DSCPAEVVGIFCIQ |
| SEQ ID NO: 180 | TY26141_MM | FYCTGAAVGIFCSA |
| SEQ ID NO: 181 | TY26301_MM | VACRIFDDDPFCIV |
| SEQ ID NO | 例示性抗體 | 胺基酸序列 |
| SEQ ID NO: 139 | TY26294 | EVGSYLTVDYFCDIDPLYCNAGGGPLGLAGSGGS |
| SEQ ID NO: 152 | TY26137 | EVGSYNNAAPDCPAADVYCNVGGGPLGLAGSGGS |
| SEQ ID NO: 153 | TY26138 | EVGSYDDTAFDCDDDFDDCATGGGPLGLAGSGGS |
| SEQ ID NO: 154 | TY26139 | EVGSYHAYHNDCSDDDDFCAYGGGPLGLAGSGGS |
| SEQ ID NO: 155 | TY26292 | EVGSYPADDFDCPAADVFCSPGGGPLGLAGSGGS |
| SEQ ID NO: 156 | TY26293 | EVGSYAPSVDDCPTYDDFCYDGGGPLGLAGSGGS |
| SEQ ID NO: 157 | TY26294 | EVGSYLTVDYFCDIDPLYCNAGGGPLGLAGSGGS |
| SEQ ID NO: 158 | TY26295 | EVGSYNYNDDDCYDDDYACDYGGGPLGLAGSGGS |
| SEQ ID NO: 159 | TY26296 | EVGSYDTADHDCYDDDDFCYDGGGPLGLAGSGGS |
| SEQ ID NO: 160 | TY26297 | EVGSYDFLSASCDDDYAPCAFGGGPLGLAGSGGS |
| SEQ_ID_NO:161 | TY26298 | EVGSYYPPDDTCDDDYDPCAIGGGPLGLAGSGGS |
| SEQ ID NO: 162 | TY26299 | EVGSYAQSSFDCPDHDAFCDPGGGPLGLAGSGGS |
| SEQ ID NO: 163 | TY26300 | EVGSYAASPATCDDTLFFCPAGGGPLGLAGSGGS |
| SEQ ID NO: 164 | TY26140 | EVGSYDSCPAEVVGIFCIQGGGPLGLAGSGGS |
| SEQ ID NO: 165 | TY26141 | EVGSYFYCTGAAVGIFCSAGGGPLGLAGSGGS |
| SEQ ID NO: 166 | TY26301 | EVGSYVACRIFDDDPFCIVGGGPLGLAGSGGS |
| SEQ ID NO | 例示性抗體及鏈 | 抗體類型 | 胺基酸序列 |
| SEQ ID NO: 140 | TY21446_LC | 不可活化 | DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQTIGRYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNRATGIPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQRYPWPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC |
| SEQ ID NO: 141 | TY21446_HC | 不可活化 | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTNYAIHWVRQAPGKGLEWVSAISGSGSSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQLNSLRAEDTAVYYCARRGSYGFGAFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK |
| SEQ ID NO: 142 | TY26294_LC | 可活化 | EVGSYLTVDYFCDIDPLYCNAGGGPLGLAGSGGSDIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQTIGRYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNRATGIPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQRYPWPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC |
| SEQ ID NO: 143 | TY26294_HC | 可活化 | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTNYAIHWVRQAPGKGLEWVSAISGSGSSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQLNSLRAEDTAVYYCARRGSYGFGAFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK |
| SEQ ID NO: 144 | TY26896_LC | 不可活化 | DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQTIGRYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNRATGIPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQRYPWPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC |
| SEQ ID NO: 145 | TY26896_HC | 不可活化 | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTNYAIHWVRQAPGKGLEWVSAISGSGSSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQLNSLRAEDTAVYYCARRGSYGFGAFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK |
| SEQ ID NO: 146 | TY26897_LC | 不可活化 | DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQTIGRYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNRATGIPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQRYPWPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC |
| SEQ ID NO: 147 | TY26897_HC | 不可活化 | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTNYAIHWVRQAPGKGLEWVSAISGSGSSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQLNSLRAEDTAVYYCARRGSYGFGAFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPEEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK |
| SEQ ID NO: 148 | TY26898_LC | 可活化 | EVGSYLTVDYFCDIDPLYCNAGGGPLGLAGSGGSDIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQTIGRYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNRATGIPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQRYPWPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC |
| SEQ ID NO: 149 | TY26898_HC | 可活化 | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTNYAIHWVRQAPGKGLEWVSAISGSGSSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQLNSLRAEDTAVYYCARRGSYGFGAFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK |
| SEQ ID NO: 150 | TY26899_LC | 可活化 | EVGSYLTVDYFCDIDPLYCNAGGGPLGLAGSGGSDIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQTIGRYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNRATGIPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQRYPWPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC |
| SEQ ID NO: 151 | TY26899_HC | 可活化 | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTNYAIHWVRQAPGKGLEWVSAISGSGSSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQLNSLRAEDTAVYYCARRGSYGFGAFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPEEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK |
| Ab | 經遮蔽？ | 未遮蔽親本 | Fc | SEQ ID NOs | ||||||||||||
| CDRs | VH | VL | 重鏈 | 輕鏈 | MM | CM | 遮蔽性肽 | |||||||||
| H1 | H2 | H3 | L1 | L2 | L3 | |||||||||||
| TY21446 | 否 | NA* | hIgG4 | 48 | 65 | 82 | 99 | 116 | 133 | 27 | 28 | 141 | 140 | NA | NA | NA |
| TY26294 | 是 | TY21446 | hIgG4 | 48 | 65 | 82 | 99 | 116 | 133 | 27 | 28 | 143 | 142 | 137 | 138 | 139 |
| TY26896 | 否 | NA | hIgG1 | 48 | 65 | 82 | 99 | 116 | 133 | 27 | 28 | 145 | 144 | NA | NA | NA |
| TY26898 | 是 | TY26896 | hIgG1 | 48 | 65 | 82 | 99 | 116 | 133 | 27 | 28 | 149 | 148 | 137 | 138 | 139 |
| TY26897 | 否 | NA | hIgG1 S239D 及I332E | 48 | 65 | 82 | 99 | 116 | 133 | 27 | 28 | 147 | 146 | NA | NA | NA |
| TY26899 | 是 | TY26897 | hIgG1 S239D 及I332E | 48 | 65 | 82 | 99 | 116 | 133 | 27 | 28 | 151 | 150 | 137 | 138 | 139 |
於一些實施例中，本文提供之經分離之抗CD47抗體或其抗原結合片段，其中抗CD47抗體包含如表6B所示之說明性抗體TY21446、TY26294、TY26896、TY26897、TY26898或TY26899之一個、兩個、三個、四個、五個或六個CDR，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於某些實施例中，本文提供之經分離之抗CD47抗體或抗原結合片段，其中抗CD47抗體包含如表6B所示之說明性抗體TY21446、TY26294、TY26896、TY26897、TY26898或TY26899之VH，或胺基酸序列具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性；且如表6B所示之說明性抗體TY21446、TY26294、TY26896、TY26897、TY26898或TY26899之VL，或胺基酸序列具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性。於某些實施例中，之經分離之抗CD47抗體或抗原結合片段，其中抗CD47抗體包含如表6B所示之說明性抗體TY21446、TY26896或TY26897之重鏈，或胺基酸序列具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性；且如表6B所示之說明性抗體TY21446、TY26896或TY26897之輕鏈，或胺基酸序列具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性。
於一些實施例中，本文提供之多特異性抗體包含如表6B所示之說明性抗體TY21446、TY26294、TY26896、TY26897、TY26898或TY26899之一個、兩個、三個、四個、五個或六個CDR，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於某些實施例中，本文提供之多特異性抗體包含如表6B所示之說明性抗體TY21446、TY26294、TY26896、TY26897、TY26898或TY26899之VH，或胺基酸序列具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性；且如表6B所示之說明性抗體TY21446、TY26294、TY26896、TY26897、TY26898或TY26899之VL，或胺基酸序列具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性。於一些實施例中，本文提供之雙特異性抗體包含如表6B所示之說明性抗體TY21446、TY26294、TY26896、TY26897、TY26898或TY26899之一個、兩個、三個、四個、五個或六個CDR，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於某些實施例中，本文提供之雙特異性抗體包含如表6B所示之說明性抗體TY21446、TY26294、TY26896、TY26897、TY26898或TY26899之VH，或胺基酸序列具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性；且如表6B所示之說明性抗體TY21446、TY26294、TY26896、TY26897、TY26898或TY26899之VL，或胺基酸序列具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性。
於一些實施例中，本文提供之經分離之抗CD47抗體或其抗原結合片段包含IgG4 Fc區，其中抗CD47抗體包含如表6B所示之說明性抗體TY21446之一個、兩個、三個、四個、五個或六個CDR，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於一些實施例中，本文提供之經分離之抗CD47抗體或其抗原結合片段包含IgG4 Fc區，其中抗CD47抗體包含如表6B所示之說明性抗體TY214469之重鏈可變區(VH)，或胺基酸序列具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性；且如表6B所示之說明性抗體TY21446之輕鏈可變區(VL)，或胺基酸序列具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性。於某些實施例中，本文提供之經分離之抗CD47抗體或其抗原結合片段包含IgG4 Fc區，其中抗CD47抗體包含如表6B所示之說明性抗體TY21446之重鏈，或胺基酸序列具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性；且如表6B所示之說明性抗體TY21446之輕鏈，或胺基酸序列具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性。於某些實施例中，經分離之抗CD47抗體系多特異(例如雙特異)抗體。
於一些實施例中，本文提供之經分離之抗CD47抗體或其抗原結合片段包含IgG4 Fc區，其中抗CD47抗體包含如表6B所示之說明性抗體TY26896之一個、兩個、三個、四個、五個或六個CDR，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於一些實施例中，本文提供之經分離之抗CD47抗體或其抗原結合片段包含IgG4 Fc區，其中抗CD47抗體包含如表6B所示之說明性抗體TY268969之重鏈可變區(VH)，或胺基酸序列具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性；且如表6B所示之說明性抗體TY26896之輕鏈可變區(VL)，或胺基酸序列具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性。於某些實施例中，本文提供之經分離之抗CD47抗體或其抗原結合片段包含IgG1 Fc區，其中抗CD47抗體包含如表6B所示之說明性抗體TY26896之重鏈，或胺基酸序列具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性；且如表6B所示之說明性抗體TY26896之輕鏈，或胺基酸序列具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性。於某些實施例中，經分離之抗CD47抗體系多特異(例如雙特異)抗體。
於一些實施例中，本文提供之經分離之抗CD47抗體或其抗原結合片段包含IgG4 Fc區，其中抗CD47抗體包含如表6B所示之說明性抗體TY26897之一個、兩個、三個、四個、五個或六個CDR，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於一些實施例中，本文提供之經分離之抗CD47抗體或其抗原結合片段包含IgG4 Fc區，其中抗CD47抗體包含如表6B所示之說明性抗體TY268979之重鏈可變區(VH)，或胺基酸序列具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性；且如表6B所示之說明性抗體TY26897之輕鏈可變區(VL)，或胺基酸序列具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性。於某些實施例中，本文提供之經分離之抗CD47抗體或其抗原結合片段包含包含S239D及I332E取代之IgG1 Fc區，其中抗CD47抗體包含如表6B所示之說明性抗體TY26897之重鏈，或胺基酸序列具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性；且如表6B所示之說明性抗體TY26897之輕鏈，或胺基酸序列具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性。於某些實施例中，經分離之抗CD47抗體系多特異(例如雙特異)抗體。於某些實施例中，人類IgG1 Fc區包含兩個Fc結構域，其中兩個Fc結構域中的每一個包含S239D取代及/或I332E取代。於一些實施例中，IgG1 Fc區具有增強之抗體依賴性細胞毒性(ADCC)及/或抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)功能。
於一些實施例中，本文提供之可活化抗體包含：(a)遮蔽性肽，其自N端至C端包含遮蔽性部分(MM)及可裂解部分(CM)，其中CM包含至少一個裂解位點；及(b)靶結合部分(TBM)，其包含抗體重鏈可變區(VH)及抗體輕鏈可變區(VL)，其中遮蔽性肽與VL之N端相連，其中可活化抗體在活體外CM裂解時比CM裂解前對人類CD47具有更高之結合親和力，其中可活化抗體包含如表6B所示之說明性抗體TY21446、TY26294、TY26896、TY26897、TY26898或TY26899之一個、兩個、三個、四個、五個或六個CDR，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於一些實施例中，可活化抗體包含：(a)遮蔽性肽，其自N端至C端包含遮蔽性部分(MM)及可裂解部分(CM)，其中CM包含至少一個裂解位點；及(b)靶結合部分(TBM)，其包含如表6B所示之說明性抗體TY21446、TY26294、TY26896、TY26897、TY26898或TY26899之抗體重鏈可變區(VH)，或胺基酸序列具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性，且如表6B所示之說明性抗體TY21446、TY26294、TY26896、TY26897、TY26898或TY26899之抗體輕鏈可變區(VL)，或胺基酸序列具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性；其中遮蔽性肽與VL之N端相連，其中可活化抗體在活體外CM裂解時比CM裂解前對人類CD47具有更高之結合親和力。
於一些實施例中，本文提供之可活化抗體包含：(a)遮蔽性肽，其自N端至C端包含如表6B所示之說明性抗體TY26294、TY26898或TY26899之遮蔽性部分(MM)及如表6B所示之說明性抗體TY26294、TY26898或TY26899之可裂解部分(CM)；及(b)靶結合部分(TBM)，其包含抗體重鏈可變區(VH)及抗體輕鏈可變區(VL)，其中遮蔽性肽與VL之N端相連，其中可活化抗體在活體外CM裂解時比CM裂解前對人類CD47具有更高之結合親和力，其中可活化抗體包含如表6B所示之說明性抗體TY21446、TY26898或TY26899之一個、兩個、三個、四個、五個或六個CDR，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於一些實施例中，可活化抗體包含：(a)遮蔽性肽，其自N端至C端包含如表6B所示之說明性抗體TY26294、TY26898或TY26899之遮蔽性部分(MM)及如表6B所示之說明性抗體TY26294、TY26898或TY26899之可裂解部分(CM)；及(b)靶結合部分(TBM)，其包含如表6B所示之說明性抗體TY21446、TY26294、TY26896、TY26897、TY26898或TY26899之抗體重鏈可變區(VH)，或胺基酸序列具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性，及如表6B所示之說明性抗體TY21446、TY26898或TY26899之抗體輕鏈可變區(VL)，或胺基酸序列具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性；其中遮蔽性肽與VL之N端相連，其中可活化抗體在活體外CM裂解時比CM裂解前對人類CD47具有更高之結合親和力。
於一些實施例中，本文提供之可活化抗體包含：(a)如表6B所示之說明性抗體TY26294、TY26898或TY26899之遮蔽性肽；及(b)靶結合部分(TBM)，其包含抗體重鏈可變區(VH)及抗體輕鏈可變區(VL)，其中遮蔽性肽與VL之N端相連，其中可活化抗體在活體外CM裂解時比CM裂解前對人類CD47具有更高之結合親和力，其中可活化抗體包含如表6B所示之說明性抗體TY21446、TY26898或TY26899之一個、兩個、三個、四個、五個或六個CDR，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於一些實施例中，可活化抗體包含：(a)如表6B所示之說明性抗體TY26294、TY26898或TY26899之遮蔽性肽；及(b)靶結合部分(TBM)，其包含如表6B所示之說明性抗體TY21446、TY26294、TY26896、TY26897、TY26898或TY26899之抗體重鏈可變區(VH)，或胺基酸序列具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性，及如表6B所示之說明性抗體TY21446、TY26898或TY26899之抗體輕鏈可變區(VL)，或胺基酸序列具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性。
於一些實施例中，本文提供之可活化抗體包含：(a)遮蔽性肽，其自N端至C端包含如表6B所示之說明性抗體TY26294之遮蔽性部分(MM)，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體及如表6B所示之說明性抗體TY26294之可裂解部分(CM)，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及(b)靶結合部分(TBM)，其包含抗體重鏈可變區(VH)及抗體輕鏈可變區(VL)，其中遮蔽性肽與VL之N端相連，其中可活化抗體在活體外CM裂解時比CM裂解前對人類CD47具有更高之結合親和力，其中可活化抗體包含如表6B所示之說明性抗體TY26294之一個、兩個、三個、四個、五個或六個CDR，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於一些實施例中，可活化抗體包含：(a)遮蔽性肽，其自N端至C端包含如表6B所示之說明性抗體TY26294之遮蔽性部分(MM)，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體及如表6B所示之說明性抗體TY26294之可裂解部分(CM)，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及(b)靶結合部分(TBM)，其包含如表6B所示之說明性抗體TY26294之抗體重鏈可變區(VH)及抗體輕鏈可變區(VL)，或其胺基酸序列具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性，其中遮蔽性肽與VL之N端相連，其中可活化抗體在活體外CM裂解時比CM裂解前對人類CD47具有更高之結合親和力。於一些實施例中，本文提供之可活化抗體包含：(a)如表6B所示之說明性抗體TY26294之遮蔽性肽，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及(b)靶結合部分(TBM)，其包含抗體重鏈可變區(VH)及抗體輕鏈可變區(VL)，其中遮蔽性肽與VL之N端相連，其中可活化抗體包含如表6B所示之說明性抗體TY26294之一個、兩個、三個、四個、五個或六個CDR，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於一些實施例中，本文提供之可活化抗體包含：(a)如表6B所示之說明性抗體TY26294之遮蔽性肽，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及(b)靶結合部分(TBM)，其包含如表6B所示之說明性抗體TY26294之抗體重鏈可變區(VH)及抗體輕鏈可變區(VL)，或其胺基酸序列具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性，其中遮蔽性肽與VL之N端相連。於一些實施例中，本文提供之可活化抗體包含如表6B所示之說明性抗體TY26294之重鏈，或其胺基酸序列具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性，及如表6B所示之說明性抗體TY26294之輕鏈，或其胺基酸序列具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性。於某些實施例中，經分離之抗體系多特異(例如雙特異)抗體。
於一些實施例中，本文提供之可活化抗體包含：(a)遮蔽性肽，其自N端至C端包含如表6B所示之說明性抗體TY26898之遮蔽性部分(MM)，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體及如表6B所示之說明性抗體TY26898之可裂解部分(CM)，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及(b)靶結合部分(TBM)，其包含抗體重鏈可變區(VH)及抗體輕鏈可變區(VL)，其中遮蔽性肽與VL之N端相連，其中可活化抗體在活體外CM裂解時比CM裂解前對人類CD47具有更高之結合親和力，其中可活化抗體包含如表6B所示之說明性抗體TY26898之一個、兩個、三個、四個、五個或六個CDR，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於一些實施例中，可活化抗體包含：(a)遮蔽性肽，其自N端至C端包含如表6B所示之說明性抗體TY26898之遮蔽性部分(MM)，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體及如表6B所示之說明性抗體TY26898之可裂解部分(CM)，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及(b)靶結合部分(TBM)，其包含如表6B所示之說明性抗體TY26898之抗體重鏈可變區(VH)及抗體輕鏈可變區(VL)，或其胺基酸序列具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性，其中遮蔽性肽與VL之N端相連，其中可活化抗體在活體外CM裂解時比CM裂解前對人類CD47具有更高之結合親和力。於一些實施例中，本文提供之可活化抗體包含：(a)如表6B所示之說明性抗體TY26898之遮蔽性肽，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及(b)靶結合部分(TBM)，其包含抗體重鏈可變區(VH)及抗體輕鏈可變區(VL)，其中遮蔽性肽與VL之N端相連，其中可活化抗體包含如表6B所示之說明性抗體TY26898之一個、兩個、三個、四個、五個或六個CDR，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於一些實施例中，本文提供之可活化抗體包含：(a)如表6B所示之說明性抗體TY26898之遮蔽性肽，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及(b)靶結合部分(TBM)，其包含如表6B所示之說明性抗體TY26898之抗體重鏈可變區(VH)及抗體輕鏈可變區(VL)，或其胺基酸序列具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性，其中遮蔽性肽與VL之N端相連。於一些實施例中，本文提供之可活化抗體包含如表6B所示之說明性抗體TY26898之重鏈，或其胺基酸序列具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性，及如表6B所示之說明性抗體TY26898之輕鏈，或其胺基酸序列具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性。於某些實施例中，經分離之抗體系多特異(例如雙特異)抗體。
於一些實施例中，本文提供之可活化抗體包含：(a)遮蔽性肽，其自N端至C端包含如表6B所示之說明性抗體TY26899之遮蔽性部分(MM)，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體及如表6B所示之說明性抗體TY26899之可裂解部分(CM)，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及(b)靶結合部分(TBM)，其包含抗體重鏈可變區(VH)及抗體輕鏈可變區(VL)，其中遮蔽性肽與VL之N端相連，其中可活化抗體在活體外CM裂解時比CM裂解前對人類CD47具有更高之結合親和力，其中可活化抗體包含如表6B所示之說明性抗體TY26899之一個、兩個、三個、四個、五個或六個CDR，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於一些實施例中，可活化抗體包含：(a)遮蔽性肽，其自N端至C端包含如表6B所示之說明性抗體TY26899之遮蔽性部分(MM)，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體及如表6B所示之說明性抗體TY26899之可裂解部分(CM)，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及(b)靶結合部分(TBM)，其包含如表6B所示之說明性抗體TY26899之抗體重鏈可變區(VH)及抗體輕鏈可變區(VL)，或其胺基酸序列具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性，其中遮蔽性肽與VL之N端相連，其中可活化抗體在活體外CM裂解時比CM裂解前對人類CD47具有更高之結合親和力。於一些實施例中，本文提供之可活化抗體包含：(a)如表6B所示之說明性抗體TY26899之遮蔽性肽，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及(b)靶結合部分(TBM)，其包含抗體重鏈可變區(VH)及抗體輕鏈可變區(VL)，其中遮蔽性肽與VL之N端相連，其中可活化抗體包含如表6B所示之說明性抗體TY26899之一個、兩個、三個、四個、五個或六個CDR，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體。於一些實施例中，本文提供之可活化抗體包含：(a)如表6B所示之說明性抗體TY26899之遮蔽性肽，或其包含最多5個(例如，1、2、3、4或5個)胺基酸取代之變體；及(b)靶結合部分(TBM)，其包含如表6B所示之說明性抗體TY26899之抗體重鏈可變區(VH)及抗體輕鏈可變區(VL)，或其胺基酸序列具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性，其中遮蔽性肽與VL之N端相連。於一些實施例中，本文提供之可活化抗體包含如表6B所示之說明性抗體TY26899之重鏈，或其胺基酸序列具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性，及如表6B所示之說明性抗體TY26899之輕鏈，或其胺基酸序列具有至少80% (例如，至少85%、90%、95%、98%或99%；或100%)序列同一性。於某些實施例中，經分離之抗體系多特異(例如雙特異)抗體。
B-6. 變體
於一些實施例中，設想了本發明提供之抗CD47結合分子(例如，抗體、抗原結合片段及經遮蔽抗體(例如，可活化抗體))之胺基酸序列變體。例如，可能期望改進抗體、抗原結合片段及經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)之結合親和力及/或其它生物學特性。於一些特定實施例中，揭示案提供了選自表3A-6中列出的那些抗體或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)之變體。
抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體))之胺基酸序列變體之製備可以藉由在編碼抗體、抗原結合片段及經遮蔽抗體(例如，可活化抗體))的核苷酸序列中引入適當的修飾或藉由肽合成。此類修飾包括，例如，在抗體或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)之胺基酸序列中刪除及/或插入及/或取代殘基。刪除、插入及取代之任意組合都可得到最終構建體，前提是最終構建體具有期望的特徵，例如抗原結合。
於一些實施例中，提供了本文所用之具有一種或多種胺基酸取代之抗體、抗原結合片段及經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)之變體。取代誘變之關注位點包括但不限於高變區(HVR)、互補決定區(CDR)、重鏈可變區(VH)、輕鏈可變區(VL)、重鏈恒定區(CH)、輕鏈恒定區(CL)及可結晶片段(Fc區)。可將胺基酸取代引入至所關注抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如可活化抗體)及經篩選具有期望活性之產物中，該期望活性為例如保留/改良之抗原結合、降低之免疫原性、改良或降低之ADCC或CDC或者降低之交聯效應。
保守胺基酸取代如下面的表2所示。
表2. 保守胺基酸取代。
| 原始殘基 | 例示性取代 | 優選取代 |
| Ala (A) | Val; Leu; Ile | Val |
| Arg (R) | Lys; Gln; Asn | Lys |
| Asn (N) | Gln; His; Asp, Lys; Arg | Gln |
| Asp (D) | Glu; Asn | Glu |
| Cys (C) | Ser; Ala | Ser |
| Gln (Q) | Asn; Glu | Asn |
| Glu (E) | Asp; Gln | Asp |
| Gly (G) | Ala | Ala |
| His (H) | Asn; Gln; Lys; Arg | Arg |
| Ile (I) | Leu; Val; Met; Ala; Phe; 正白胺酸 | Leu |
| Leu (L) | 正白胺酸; Ile; Val; Met; Ala; Phe | Ile |
| Lys (K) | Arg; Gln; Asn | Arg |
| Met (M) | Leu; Phe; Ile | Leu |
| Phe (F) | Trp; Leu; Val; Ile; Ala; Tyr | Tyr |
| Pro (P) | Ala | Ala |
| Ser (S) | Thr | Thr |
| Thr (T) | Val; Ser | Ser |
| Trp (W) | Tyr; Phe | Tyr |
| Tyr (Y) | Trp; Phe; Thr; Ser | Phe |
| Val (V) | Ile; Leu; Met; Phe; Ala; 正白胺酸 | Leu |
可根據常見側鏈性質將胺基酸分組：
a. 疏水性：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
b. 中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
c. 酸性：Asp、Glu；
d. 鹼性：His、Lys、Arg；
e. 影響鏈定向之殘基：Gly、Pro；
f. 芳香族：Trp、Tyr、Phe。
非保守性取代將導致該等類別中之一者之成員交換為另一類別。
例示性之取代變體為親和成熟抗體部分，其可方便地生成，例如使用基於噬菌體展示的親和力成熟技術。簡言之，一個或多個CDR殘基發生突變，且將抗體變體部分展示在噬菌體上並篩選特定的生物活性(例如，結合親和力)。改變(例如，取代)可在HVR中進行(例如，在CDR中)，例如，提高抗體部分親和力。這種改變可在HVR「熱點」中進行，即由密碼子編碼之殘基在體細胞成熟過程中發生高頻突變(參見例如，Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207: 179-196 (2008))，及/或特異性決定殘基(SDR)，用產生之變體VH或VL進行結合親和力測試。藉由從二級庫構建及重新選擇親和力成熟已有描述，例如，在Hoogenboom等人in Methods in Molecular Biology 178: 1-37(O'Brien等人，Human Press, Totowa, NJ, (2001)中。在親和力成熟的一些實例中，藉由多種方法(例如，易錯PCR、鏈取代法或寡聚核苷酸定點誘變)中的任一種將多樣性引入選擇用於成熟的可變基因。然後創建二級庫。然後篩選庫以鑒定具有期望親和力的任何抗體部分變體。
另一種引入多樣性之方法涉及HVR定向或CDR定向之方法，其中幾個HVR殘基(例如，一次4-6個殘基)為隨機的(例如，在CDR內)。參與抗原結合之HVR及/或CDR殘基可被特異性識別，例如，使用丙氨酸掃描誘變或建模。特別為CDR-H3及CDR-L3經常成為目標。
於一些實施例中，取代、插入或刪除可能發生在一個或多個HVR內(例如，在CDR內)，只要這種改變不會顯著降低抗體結合抗原之能力。例如，可在HVR中進行不會顯著降低結合親和力之保守改變(例如，本文提供之保守取代)。這些更改可能在 HVR「熱點」或SDR之外。在上述提供之VH及VL序列變體的一些實施例中，每個HVR或CDR要麼沒有改變，要麼含有不超過一個、兩個或三個胺基酸取代。
一種有用的識別可能誘變目標之抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)之殘基或區域之方法稱為「丙胺酸掃描誘變」，如 Cunningham及Wells (1989) Science, 244: 1081-1085中所述。在該方法中，殘基或目標殘基(例如，帶電殘基，例如arg，asp，his，lys及glu)被識別並被為中性或帶負電荷之胺基酸(例如，丙胺酸或聚丙胺酸)替換，以確定抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)與抗原之相互作用是否受到影響。進一步的取代可在對初始取代具有功能敏感性之胺基酸位置引入。
或者，或另外，抗原-抗體複合物之晶體結構可確定識別抗體或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)與抗原之間之接觸位點。這些接觸殘基及鄰近殘基可作為靶向或排除候選取代。變體可篩選以確定它們是否包含期望的性質。
胺基酸序列插入包括胺基及/或羧基末端融合，長度從一個殘基到含有一百個或更多殘基之多肽，以及單個或多個胺基酸殘基之序列內插入。末端插入的例子包括具有N-末端甲硫醯基殘基之抗體。抗體分子或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)分子的其它插入變體包括將抗體或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)之N端或C端融合到酶(例如，用於ADEPT)或增加抗體或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)的血清半衰期之多肽。
Fc區變體
於一些實施例中，可在本發明提供之抗CD47抗體或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)蛋白之Fc區引入將一種或多種胺基酸修飾，從而產生Fc區變體。於一些實施例中，Fc區變體具有增強之ADCC效應功能，通常與Fc受體(FcRs)之結合有關。於一些實施例中，Fc區變體具有降低之ADCC效應功能。有許多Fc序列變化或突變之例子可改變效應功能。例如，WO 00/42072及Shields等人J Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)所描述之提高或降低FcR結合之抗體變體。該等出版物之揭示內容以引用方式併入本文。
抗體依賴性細胞毒性(ADCC)為治療性抗體對腫瘤細胞之一種作用機制。ADCC為一種細胞介導的免疫防禦，免疫系統之效應細胞主動裂解靶細胞(例如癌細胞)，其膜表面抗原已被特異性抗體(例如抗CD47抗體)結合。典型之ADCC涉及抗體啟動NK細胞。NK細胞表現CD16，CD16為一種Fc受體。該受體識別並結合到靶細胞表面結合之抗體之Fc部分。NK細胞表面最常見之Fc受體稱為CD16或FcγRIII。Fc受體與抗體之Fc區結合引起NK細胞活化，釋放細胞溶解顆粒及隨後靶細胞凋亡。ADCC對腫瘤細胞殺傷之貢獻可量測，例如藉由高親和力FcR轉染之NK-92細胞經行特定測試測定。結果與不表達FcR之野生型NK-92細胞進行比較。
於一些實施例中，本發明考慮了抗CD47抗體或經遮蔽(例如，可活化的)抗體變體(例如，經分離之抗CD47抗體變體或經遮蔽(例如，可活化的)抗CD47抗體變體)變體包含Fc區，其具有部分但不是全部效應功能，這使其成為某些應用之合適候選者，例如，其中抗CD47抗體或經遮蔽活體內之半衰期(例如，可活化抗體)很重要，但某些效應功能(諸如CDC及ADCC)為不必要或有害。可進行活體外及/或活體內細胞毒性測定，以確認CDC及/或ADCC活性之減少/消耗。例如，可進行Fc受體(FcR)結合測定以確保抗體或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)缺少FcγR結合(因此可能缺乏ADCC活性)，但保留FcRn結合能力。介導ADCC之原代細胞，NK細胞僅表現FcγRIII，而單核細胞表現FcγRI，FcγRI I及FcγRIII。Ravetch及Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991)之第464頁的表3中總結在造血細胞上之FcR表現。評估目標分子ADCC活性活體外測定之非限制性實例在美國專利第5,500,362號中描述(參見例如，Hellstrom, I.等人. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986))及Hellstrom, I.等人., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82: 1499-1502 (1985)；美國專利第5,821,337號(見Bruggemann, M.等人, J. Exp. Med. 166: 1351-1361 (1987))。可替代地，可採用非放射性測定方法(參見例如，流式細胞術之ACTI
TM放射性細胞毒性測定(CellTechnology, Inc. Mountain View, Calif及CytoTox 96
TM非放射性細胞毒性測定(Promega，Madison, Wis.)。用於此類測定之有用之效應細胞包括周圍血單核細胞(PBMC)及自然殺傷(NK)細胞。可替代地，或另外，可在活體內評估目標分子之ADCC活性，例如，在諸如Clynes等人.Proc. Nat'l Acad. Sci.USA 95:652-656 (1998)揭示之動物模型。還可進行C1q結合測定以確認抗體或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)無法結合C1q，因此缺乏 CDC活性。參見例如，WO 2006/029879及WO 2005/100402中之C1q及C3c ELISA結合。為了評估補體活化，可進行CDC測定(參見例如，Gazzano- Santoro等人, J. Immunol. Methods 202: 163 (1996)；Cragg, M. S.等人, Blood 101: 1045-1052 (2003)及Cragg, M. S.及 M. J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004))。FcRn結合及活體內清除/半衰期測定也可使用此項技術中已知之方法進行(參見例如，Petkova, S. B. 等人, Int'l. Immunol. 18(12): 1759- 1769 (2006))。
效應功能降低之抗體(例如經分離之抗體及可活化抗體)包括這些Fc區238、265、269、270、297、327及329殘基之一個或多個取代之抗體(美國專利第6,737,056號)。這類Fc突變體包括在位於265、269、270、297及327胺基酸上兩個或多個取代之Fc突變體，包括「DANA」Fc突變體，其265及297殘基被丙胺酸取代(美國專利第7,332,581號)。
某些與FcRs結合提高或減弱之抗體變體被描述。(參見例如，美國專利第6,737,056號；WO 2004/056312，及 Shields 等, J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001).)。
於一些實施例中，本文提供之抗CD47抗體或經遮蔽(例如，可活化的)抗體變體(例如，經分離之抗CD47抗體變體或經遮蔽(例如，可活化的)抗CD47抗體變體)包含一個或多個胺基酸取代之Fc區變體，其可提高ADCC。於一些實施例中，Fc區變體包含一個或多個胺基酸取代，其可提高ADCC，其中取代位於Fc區變體之298、333及/或334殘基(EU殘基編號)。於一些實施例中，抗CD47抗體或經遮蔽(例如，可活化的)抗體變體在其Fc區變體中包含以下胺基酸取代：S298A、E333A及/或K334A。
於一些實施例中，在Fc區進行改變，其引起C1q結合及/或補體依賴性細胞毒性(CDC)改變(例如，提高或減弱)，例如，如美國專利第6,194,551號，WO 99/51642及Idusogie等人,J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)中描述。
於一些實施例中，本文提供之抗CD47抗體或經遮蔽(例如，可活化的)抗體變體(例如，經分離之抗CD47抗體變體或經遮蔽(例如，可活化的)抗CD47抗體變體)包含包含一個或多個胺基酸取代之Fc區變體，其增加半衰期及/或提高與新生兒Fc受體(FcRn)之結合。半衰期增加及與FcRn結合之抗體在美國專利第2005/0014934A1號(Hinton等人)中描述。這些抗體包含Fc區，其中Fc區有一個或多個取代，其可提高Fc區與FcRn之結合。這些Fc變體包括這些在一個或多個Fc區殘基上取代：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434，例如，Fc區434殘基取代(美國專利第7,371,826號)。
參見Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988)；美國專利第5,648,260號；美國專利第5,624,821號；及WO 94/29351關於Fc區變體的其他例子。
抗CD47抗體或經遮蔽(例如，可活化的)抗體變體(例如，經分離之抗CD47抗體變體或經遮蔽(例如，可活化的)抗CD47抗體變體)包含本文所用之任一者Fc變體或其組合。
糖基化變體
於一些實施例中，本文提供之抗CD47抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)被改變以增加或減少抗CD47抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)糖基化之程度。藉由改變抗CD47抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)或其多肽部分之胺基酸序列，可方便地實現對抗CD47抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)之糖基化位點添加或刪除，從而建立或去除一個或多個糖基化位點。
其中抗CD47抗體或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)包含Fc區，附著在其上的糖類可能被改變。哺乳動物細胞產生之天然抗體通常包含支鏈之分枝寡糖，其通常藉由N連接到Fc區之CH2結構域之Asn297。參見例如，Wright等人, TIBTECH 15:26-32 (1997)。寡糖可包括各種糖類，例如甘露糖、N-乙醯葡萄糖胺(GlcNAc)、半乳糖及唾液酸，以及附著在雙觸角寡糖之「莖」中的GlcNAc上之岩藻糖。於一些實施例中，對本發明之抗CD47抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)中之寡糖進行修飾，以建立具有某些改進性質之抗CD47抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)變體。
連接到Fc之CH2結構域之N-聚糖系異質的。CHO細胞中產生之抗體或Fc融合蛋白藉由岩藻糖基轉移酶活性進行岩藻糖基化。參見Shoji-Hosaka等人, J. Biochem. 2006, 140:777- 83。通常，可在人血清中檢測到小部分天然存在之去岩藻糖基化IgG。Fc之N-糖基化對於與FcγR結合很重；N-聚糖之去岩藻糖基化修飾增加了Fc與FcγRIIIa之結合能力。增加FcγRIIIa結合可增強ADCC，這於某些需要細胞毒性之抗體治療應用中為有利的。
於一些實施例中，當Fc-介導之細胞毒性為不期望時，增強之效應功能可能為有害的。於一些實施例中，Fc片段或CH2結構域未被糖基化。於一些實施例中，CH2結構域中的N-糖基化位點發生突變以防止糖基化。
於一些實施例中，提供了抗CD47抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)變體包含Fc區，其中連接Fc區之糖類結構的岩藻糖還原或缺乏可提高ADCC功能。具體地，相對於在野生型中CHO細胞中產生之相同抗CD47抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)之岩藻糖量，本文預期之抗CD47抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)上具有減少之岩藻糖。即它們的特徵在於其岩藻糖量其比天然CHO細胞((例如，產生天然糖基化模式之CHO細胞，例如，含有天然FUT8基因之CHO細胞) 產生之岩藻糖含量更低。於一些實施例中，抗CD47抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)為一種其中少於約50%、40%、30%、20%、10%或5%包含岩藻糖之N-連接聚糖。例如，這種抗CD47抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)中之岩藻糖量可為1%至80%、1%至65%、5%至65%或20%至40%。於一些實施例中，抗CD47抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)為一種其中均不包含岩藻糖之N-連接聚糖，即，其中抗CD47抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)完全不含岩藻糖，或沒有岩藻糖或去岩藻糖基化。岩藻糖量系藉由計算Asn297之糖鏈內岩藻糖之平均量來確定的，相對於藉由MALDI-TOF質譜法量測之連接在Asn 297之所有糖結構(例如，複合物，雜化及高甘露糖結構)之總及，例如WO 2008/077546中所述。例如，Asn297系指位於Fc區297位置之天冬醯胺酸殘基(EU編號之Fc殘基)；然而，由於抗體序列之微小變化，也可能位於位置297上或下約±3個胺基酸，即位置294及300之間。此類岩藻糖基化變體可能具有提高ADCC之功能。參見例如，美國專利公開第US 2003/0157108號(Presta, L.)；美國專利公開第US 2004/0093621號(Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd)。與「去糖基化」或「岩藻糖缺陷」抗體變體異相關出版物之實例包括：美國專利公開第US 2003/0157108號；WO 2000/61739；WO 2001/29246；美國專利公開第US 2003/0115614號；美國專利公開第US 2002/0164328號；美國專利公開第US 2004/0093621號；美國專利公開第US 2004/0132140號；美國專利公開第US 2004/0110704號；美國專利公開第US 2004/0110282號；美國專利公開第US 2004/0109865號；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki等人. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004)；Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004).。能夠產生去糖基化抗體之細胞株實例包括缺乏蛋白質岩藻糖基化之Lec13 CHO細胞(Ripka等人. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986) ；美國專利申請第2003/0157108 A1號, Presta, L及WO 2004/056312 A1, Adams等人，特別系實例11)及敲除細胞株，例如α-1，6-岩藻糖基轉移酶基因，FUT8，敲除CHO細胞(參見例如，Yamane-Ohnuki等人. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y.等人, Biotechnol. Bioeng. 94(4):680-688 (2006)；及WO2003/085107)。
抗CD47抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)變體進一步提供二分寡糖，例如，其中連接到抗GPC3構建體Fc區之分支寡糖被GlcNAc一分為二。此類抗CD47抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)變體可能具有減少岩藻糖基化及/或提高ADCC 功能。此類抗體變體之實例在WO 2003/011878 (Jean-Mairet等人)；美國專利第6,602,684號(Umana等人)；美國專利第2005/0123546號(Umana et al.)，及Ferrara等人, Biotechnology and Bioengineering, 93(5): 851-861 (2006)中描述。還提供了連接到Fc區之寡糖有至少一個半乳糖殘基之抗CD47抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)變體。此類抗CD47抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)變體可能提高 CDC 功能。此類抗體在例如WO 1997/30087 (Patel等人)、WO 1998/58964 (Raju, S.)及WO 1999/22764 (Raju, S.)中描述。
於一些實施例中，抗CD47抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)變體包含Fc區，其能夠與FcγRIII結合。於一些實施例中，與其相同包含人類野生型IgG1 Fc區之抗CD47抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)相比，抗CD47抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)變體包含Fc區在人效應細胞(例如T細胞)存在下具有ADCC活性，或者在人效應細胞存在下具有增加之ADCC活性。
半胱胺酸工程化變體
於一些實施例中，可能期望創建半胱胺酸工程化之抗CD47抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)變體，其中一個或多個胺基酸殘基被半胱胺酸殘基取代。於一些實施例中，取代殘基發生在抗CD47抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)之可及位點。藉由用半胱胺酸取代這些殘基，反應性硫醇基團被定位在抗CD47抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)之可及位點，且可用於將抗CD47抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)偶聯到其他部分，例如藥物部分或連接-藥物部分，以產生抗CD47免疫偶聯物，如本文進一步所述。半胱胺酸工程化之抗CD47抗體、抗原結合片段或遮蔽抗體(例如，可啟動抗體)變體可如描述於美國專利第7,521,541號中產生。
衍生物
於一些實施例中，本文提供之抗CD47抗體、抗原結合片段或遮蔽抗體(例如，可活化抗體)可進一步修飾以包含此項技術中已知且易於獲得之另外非蛋白質部分。適於衍生抗CD47抗體、抗原結合片段或遮蔽抗體(例如，可活化抗體)之部分包括但不限於水溶性聚合物。水溶性聚合物之非限制性實例包括但不限於聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇之共聚物、羧甲基纖維素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1，3-二氧戊烷、聚-1，3，6-三氧六環、乙烯/馬來酸酐共聚物、聚胺基酸(均聚物或無規共聚物)、及葡聚糖或聚(N-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙丙二醇均聚物、環氧丙烯/環氧丙烷共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛由於其在水中之穩定性而在製造中可能具有優勢。聚合物可為任何分子量的，且可為支化或非支化的。附著在抗CD47抗體、抗原結合片段或遮蔽抗體(例如，可活化抗體)上的聚合物數量可能不同，且如果連接了多於一個聚合物，它們可為相同或不同之分子。通常，用於衍生化之聚合物之數量及/或類型可根據考慮因素確定，包括但不限於提高抗CD47抗體、抗原結合片段或遮蔽抗體(例如，可活化抗體)之特定性質或功能，抗CD47抗體、抗原結合片段或遮蔽抗體(例如，可活化抗體)衍生物是否將在規定之條件下用於治療等。
於一些實施例中，提供了抗CD47抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)及非蛋白質部分之偶聯物，其可藉由暴露於輻射而選擇性地加熱。於一些實施例中，非蛋白質部分系碳納米管(Kam等人，美國科學院院刊102：11600-11605(2005))。輻射可系任何波長，包括但不限於，不傷害普通細胞之波長，但將非蛋白質部分加熱到殺死抗CD47抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)非蛋白質部分偶聯物近端細胞之溫度。
D．產生CD47抗體及經遮蔽抗體之核酸、載體、宿主細胞及重組方法
本發明之另一態樣提供經單離核酸，其包含編碼本揭示案所提供之結合分子(例如，抗體、經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)或抗原結合片段)之胺基酸序列之核苷酸序列。藉由核苷酸序列編碼之胺基酸序列可為抗體、經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)或抗原結合片段之任何部分(諸如CDR、包含1、2或3個CDR之序列、重鏈可變區、輕鏈可變區、遮蔽性肽、遮蔽性部分(MM)、連接部分(LM)、可裂解部分(CM)或靶結合部分(TBM))，或可為全長重鏈或全長輕鏈。本發明之核酸可為例如DNA或RNA，且可含或可不含內含子序列。通常，核酸為cDNA分子
於一些實施例中，揭示案提供了一種分離核酸，其包含或由選自由編碼胺基酸序列之核苷酸序列組成之群組成：(1)說明性抗體、抗原結合片段或遮蔽抗體(例如，可活化抗體)之CDR之胺基酸序列；(2)說明性抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如可活化抗體)之重鏈可變區(VH)或輕鏈可變區(VL)；或(3)說明性抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如可活化抗體)之全長重鏈或全長輕鏈。
可使用任何合適之分子生物學技術來獲得本揭示案之核酸。對於由融合瘤表現之抗體或經遮蔽抗體(例如可活化抗體)，可藉由PCR擴增或cDNA選殖技術獲得編碼由融合瘤製備之抗體或經遮蔽抗體(例如可活化抗體)之輕鏈及重鏈之cDNA。對於自免疫球蛋白基因文庫(例如，使用噬菌體展示技術)獲得之抗體或經遮蔽抗體(例如可活化抗體)，可自該文庫中回收編碼抗體或經遮蔽抗體(例如可活化抗體)之核酸。
可藉由將編碼VH之DNA可操作地連接至編碼重鏈恒定區(CH1、CH2及CH3)之另一個DNA分子來將編碼VH區之經分離DNA轉化為全長重鏈基因。人重鏈恒定區基因之序列為此項技術中已知之(參見例如Kabat等人(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第五版, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242)且包含此等區域之DNA片段可藉由標準PCR擴增獲得。Ec區可為IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定區，但最佳為IgG4或IgG1恒定區。IgG4或IgG1恒定區序列可為已知在不同個體之間發生之各種等位基因或同種異型中之任一種。此等同種異型代表IgG4或IgG1恒定區中天然存在之胺基酸取代。對於Fab片段重鏈基因，可將編碼VH之DNA可操作地連接至僅編碼重鏈CH1恒定區之另一個DNA分子。
可藉由將編碼VL之DNA可操作地連接至編碼輕鏈恒定區CL之另一DNA分子來將編碼V
L區域之經分離DNA轉化為全長輕鏈基因(以及Fab輕鏈基因)。人輕鏈恒定區基因之序列為此項技術中已知之(參見例如Kabat等人(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第五版, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242)且包含此等區域之DNA片段可藉由標準PCR擴增獲得。輕鏈恒定區可為κ或λ恒定區。
為創建scFv基因，將編碼VH-及VL-之DNA片段以可操作方式連接至編碼可撓性連接子(例如，編碼胺基酸序列(Gly4-Ser)3)之另一片段，使得該等VH及VL序列可表現為鄰接單鏈蛋白，其中該等VL及VH區藉由可撓性連接子接合(參見例如，Bird等人，Science242:423-426 (1988)；Huston等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA85:5879-5883 (1988)；及McCafferty等人，Nature348:552-554 (1990))。
本發明另提供包含本文中所述之核酸分子之載體。核酸分子可編碼輕鏈或重鏈之部分(諸如CDR或HVR；輕鏈或重鏈可變區)、全長輕鏈或重鏈、包含重鏈或輕鏈之部分或全長之多肽、或抗體、經遮蔽抗體(例如可活化抗體)衍生物或抗原結合片段之胺基酸序列。於一些實施例中，該載體為可用於表現結合分子(諸如抗體、經遮蔽抗體(例如可活化抗體)或抗原結合片段)之表現載體。於一些實施例中，本文中提供載體，其中第一載體包含編碼如本文中所述之重鏈可變區之核酸序列，及第二載體包含編碼如本文中所述之輕鏈可變區之核酸序列。於一些實施例中，單個載體包含編碼如本文中所述之重鏈可變區及如本文中所述之輕鏈可變區之核酸。
為表現本發明之(例如，抗體、經遮蔽抗體(例如可活化抗體)或抗原結合片段)，將編碼部分或全長輕鏈及重鏈之DNA插入表現載體中使得DNA分子以可操作方式連接至轉錄及轉譯控制序列。於此上下文中，術語「以可操作方式連接」意指將抗體、經遮蔽抗體(例如可活化抗體)或抗原結合片段基因連接至載體使得該載體內之轉錄及轉譯控制序列提供其調節DNA分子之轉錄及轉譯所需功能。選擇與使用之表現宿主細胞相容之表現載體及表現控制序列。可將抗體、經遮蔽抗體(例如可活化抗體)或抗原結合片段輕鏈基因及抗體、經遮蔽抗體(例如可活化抗體)或抗原結合片段重鏈基因插入分開載體中，或可將兩種基因插入相同表現載體中。藉由任何適宜方法(例如，連接抗體、經遮蔽抗體(例如可活化抗體)或抗原結合片段基因片段及載體上之互補限制位點，或基於同源重組之DNA連接)將抗體、經遮蔽抗體(例如可活化抗體)或抗原結合片段基因插入表現載體中。可使用本文中所述之抗體、經遮蔽抗體(例如可活化抗體)或抗原結合片段之輕鏈及重鏈可變區以藉由將其插入已編碼所需同型及子類別之重鏈恒定區及輕鏈恒定區之表現載體中使得VH片段以可操作方式連接至該載體內之CH片段及VL片段以可操作方式連接至該載體內之CL片段來創造任何抗體、經遮蔽抗體(例如可活化抗體)或抗原結合片段同型及子類別之全長抗體、經遮蔽抗體(例如可活化抗體)或抗原結合片段基因。此外或者，重組表現載體可編碼促進來自宿主細胞之抗體、經遮蔽抗體(例如可活化抗體)或抗原結合片段鏈之分泌之信號肽。可將抗體、經遮蔽抗體(例如可活化抗體)或抗原結合片段鏈基因選殖至載體使得信號肽於框架內連接至抗體、經遮蔽抗體(例如可活化抗體)或抗原結合片段鏈基因之胺基端。該信號肽可為免疫球蛋白信號肽或異源信號肽(即，來自非免疫球蛋白之信號肽)。
除了抗體或經遮蔽抗體(例如可活化抗體)鏈基因外，本發明之表現載體通常攜帶控制宿主細胞中之抗體或經遮蔽抗體(例如可活化抗體)鏈基因之表現之調節序列。術語「調節序列」意欲包括控制抗體或經遮蔽抗體(例如可活化抗體)鏈基因之轉錄或轉譯之啟動子、增強子及其他表現控制元件(例如，多腺苷酸化信號)。此等調節序列述於例如Goeddel (Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990))中。熟習此項技術者應瞭解，表現載體之設計(包括調節序列之選擇)可取決於如待轉形之宿主細胞之選擇、所需蛋白質之表現水準等之此等因素。用於哺乳動物宿主細胞表現之調節序列之實例包括指導哺乳動物細胞中高水準蛋白質表現之病毒元件，諸如源自巨細胞病毒(CMV)、猿腎病毒(Simian Virus) 40 (SV40)、腺病毒(例如腺病毒主要後期啟動子(AdMLP))及多瘤病毒(polyoma)之啟動子及/或增強子。或者，可使用非病毒調節序列，諸如泛素(ubiquitin)啟動子或β-球蛋白啟動子。更進一步，調節元件由來自不同來源(諸如SR啟動子系統)之序列組成，該啟動子系統含有來自SV40早期啟動子之序列及人類T細胞白血病病毒1型之長末端重複(Takebe, Y.等人(1988)Mol. Cell. Biol.8:466-472)。
除了抗體或經遮蔽抗體(例如可活化抗體)鏈基因及調節序列外，表現載體可攜帶另外序列，諸如調節載體於宿主細胞中之複製(例如，複製起源)之序列及可選擇標記基因。可選擇標記基因促進已引入載體之宿主細胞之選擇(參見例如，美國專利案第4,399,216號、第4,634,665號及第5,179,017號，所有由Axel等人)。例如，已引入載體之宿主細胞上之可選擇標記基因通常賦予對藥物(諸如G418、潮黴素(hygromycin)或胺甲喋呤)之耐性。可選擇標記基因包括二氫葉酸還原酶(DHFR)基因(用於含有胺甲喋呤之dhfr-宿主細胞選擇/擴增)及neo基因(用於G418選擇)。
用於表現輕鏈及重鏈，藉由任何適宜技術將編碼重鏈及輕鏈之表現載體轉染至宿主細胞中。術語「轉染」之各種形式意欲涵蓋用於將外源DNA引入原核或真核宿主細胞中通常所用之廣泛各種技術，例如，電穿孔、磷酸鈣沉澱、DEAE-葡聚糖轉染及類似者。雖然可於原核或真核宿主細胞中表現本發明之抗體或經遮蔽抗體(例如可活化抗體)，真核細胞及通常哺乳動物宿主細胞中之抗體或經遮蔽抗體(例如可活化抗體)之表現為最典型。
本發明進一步提供含有本發明提供之核酸之宿主細胞。宿主細胞實質上可為任何細胞，針對該細胞表現載體為可得。其可為例如高等真核宿主細胞(諸如哺乳動物細胞)、低等真核宿主細胞(諸如酵母細胞)，且可為原核細胞(諸如細菌細胞)。將重組核酸引入宿主細胞中之方法系此項技術中已知，包括例如，藉由磷酸鈣轉染、DEAE、葡聚糖介導之轉染、電穿孔或噬菌體感染。
用於轉化之合適原核宿主包括大腸桿菌、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)及假單胞菌屬(Pseudomonas)、鏈黴菌屬(Streptomyces)及葡萄球菌屬(Staphylococcus)內之各種物種。
用於表現本揭示案之結合分子(例如，抗體、經遮蔽抗體(例如可活化抗體)或抗原結合片段)之哺乳動物宿主細胞包括例如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞(包括dhfr-CHO細胞，其描述於Urlaub及Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220 (1980)中，與DHFR選擇標記一起使用，該選擇標記例如如Kaufman及Sharp，J. Mol. Biol. 159:601-621 (1982)中所述)、NS0骨髓瘤細胞、COS細胞及Sp2細胞。具體而言，為了與NS0骨髓瘤或CHO細胞一起使用，另一種表現系統為WO 87/04462、WO 89/01036及EP 338,841中揭示之GS(麩胺醯胺合成酶)基因表現系統。當將編碼抗體基因之表現載體引入到哺乳動物宿主細胞中時，藉由將宿主細胞培養足以允許抗體或經遮蔽抗體(例如可活化抗體在宿主細胞中表現或抗體或經遮蔽抗體(例如可活化抗體)分泌到宿主細胞所生長之培養基中之時間段來生產抗體或經遮蔽抗體(例如可活化抗體)。可使用任何合適之蛋白質純化方法自培養基中回收抗體及經遮蔽抗體(例如可活化抗體)。
本揭示案還提供了一種製備抗體、經遮蔽抗體(例如可活化抗體)或抗原結合片段之方法，其包括在適於產生抗體、經遮蔽抗體(例如可活化抗體)或抗原結合片段之條件下培養包含編碼抗體、經遮蔽抗體(例如可活化抗體)或抗原結合片段之核酸之載體之宿主細胞。於一些實施例中，該方法進一步包括回收由該細胞產生之體、經遮蔽抗體(例如可活化抗體)或抗原結合片段。
E．包含抗CD47抗體及經遮蔽抗體之組合物
於其他態樣，本申請案提供包含本文所用之結合分子(例如，抗體、經遮蔽抗體(例如可活化抗體)或抗原結合片段)之組合物。於一些態樣中，該組合物為包含抗體、經遮蔽抗體(例如可活化抗體)或抗原結合片段及醫藥學上可接受之載劑之醫藥組合物。該等組合物可藉由此項技術中已知之習知方法製備。
術語「藥學上可接受之載劑」系指適用於在用於遞送活性劑(例如抗體、經遮蔽抗體(例如可活化抗體)或抗原結合片段)之調配物中使用之任何非活性物質。載劑可為抗黏劑、黏合劑、包衣劑、崩解劑、填充劑或稀釋劑、防腐劑(例如抗氧化劑、抗細菌劑或抗真菌劑)、甜味劑、吸收延遲劑、潤濕劑、乳化劑、緩衝劑等。合適醫藥學上可接受之載劑之實例包括水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)、葡萄糖、植物油(例如橄欖油)、鹽水、緩衝液、緩衝鹽水及等滲劑，例如糖、多元醇、山梨糖醇及氯化鈉。
該組合物可為任何合適形式，例如液體、半固體及固體劑型。液體劑型之實例包括溶液(例如，可注射及可輸注之溶液)、微乳液、脂質體、分散液或混懸液。固體劑型之實例包括錠劑、丸劑、膠囊、微膠囊及散劑。適用於遞送結合分子(例如抗體、經遮蔽抗體(例如可活化抗體)或抗原結合片段)之組合物之特定形式為用於注射或輸注之無菌液體，例如溶液、懸浮液或分散液。可藉由將所需量之抗體、經遮蔽抗體(例如可活化抗體)或抗原結合片段摻入到適當載劑中，然後進行滅菌微過濾來製備無菌溶液。通常，藉由將抗體、經遮蔽抗體(例如可活化抗體)或抗原結合片段摻入到含有基本分散介質及其他載劑之無菌媒劑中來製備分散體。在用於製備無菌液體之無菌粉末的情況下，製備方法包括真空乾燥及冷凍乾燥(凍幹)以產生活性成分加上來自其先前經無菌過濾之溶液中之任何其他所要成分的粉末。組合物之各種劑型可藉由此項技術中已知之習知技術來製備。
組合物中所包括之結合分子(例如抗體、經遮蔽抗體(例如可活化抗體)或抗原結合片段)之相對量將根據許多因素而變化，例如特定結合分子及所用載劑、劑型及所要釋放及藥效動力學特性。單一劑型中抗體、經遮蔽抗體(例如可活化抗體)或抗原結合片段之量通常為產生治療作用之量，但是亦可為較小量。通常，該量之範圍為相對於劑型之總重量約0.01%至約99%、約0.1%至約70%或約1%至約30%。
除抗體、經遮蔽抗體(例如可活化抗體)或抗原結合片段外，組合物中亦可包括一或多種另外之治療劑。另外之治療劑之實例描述於本文之中。熟習此項技術者可容易地選擇組合物中包括之另外之治療劑之合適量，且其將根據許多因素而變化，例如所用具體劑及載劑、劑型及所要釋放及藥效動力學特徵。單一劑型中包括之另外之治療劑之量通常將為該劑產生治療作用之量，但是亦可為較少量。
F．抗CD47抗體及經遮蔽抗體之使用方法
本揭示案提供之結合分子(例如，抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體))及藥物組合物可用於治療、診斷或其它目的，例如調節免疫反應、治療癌症及增強其他癌症的治療療效。因此，於其他態樣，本揭示案提供了使用抗體、經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)、抗原結合片段或其藥物組合物之方法。於一個態樣，本揭示案提供了一種治療受試者病症之方法，其包含向需要治療之受試者投與本揭示案提供之治療有效量之抗體、經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)或抗原結合片段。於一些實施例中，受試者系人。於一些實施例中，投與有效量之抗體、經遮蔽之抗體(例如，可活的抗體)或抗原結合片段不會引起受試者紅血球(RBCs) (例如，人紅血球)的凝集(例如，聚集)。於某些實施例中，投與有效量的抗體、經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)或抗原結合片段不會引起受試者貧血。
於一些實施例中，提供了一種治療受試者中的癌症(例如，CD47-陽性癌症)的方法，包含向受試者投與治療有效量的本揭示案提供之抗體、經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)或抗原結合片段。於一些實施例中，提供一種治療受試者癌症(例如CD47-陽性癌症)的方法，包含向受試者投與治療有效量的經遮蔽抗體，包含：(a)遮蔽性肽，其自N端至C端包含遮蔽(MM)部分及連接部分(LM)；(b)靶結合部分(TBM)，其包含抗體重鏈可變區(VH)及抗體輕鏈可變區(VL)，其中TBM與人類CD47結合；(c) IgG1 Fc區或具有增強之抗體依賴性細胞毒性(ADCC)活性之IgG Fc區，其中遮蔽性肽與VH或VL之N端相連，及其中所述MM與人類CD47競爭結合TBM。於一些實施例中，TBM競爭性地與本文所用之任一種抗CD47抗體的表位結合。於一些實施例中，抗體、經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)或抗原結合片段為CD47抗體、經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)或其抗原結合片段及受試者系人。各種CD47陽性癌症(即與CD47有關的癌症)，無論是惡性的還是良性的，無論是原發性的還是繼發性的，都可用本揭示案提供之方法治療或預防。此等癌症之實例包括但不限於淋巴瘤(例如彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、淋巴樣腫瘤彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBC)、套細胞淋巴瘤、邊緣區細胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、多發性B細胞非霍奇金淋巴瘤亞型(NHL) (例如彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、B細胞慢性淋巴細胞白血病(B-CLL)、套細胞淋巴瘤(MCL)、濾泡性淋巴瘤 (FL)、邊緣區淋巴瘤(MZL)及前體B急性淋巴細胞白血病(Pre-B ALL))、白血病(例如急性髓系白血病(AML)、急性淋巴細胞白血病、急性淋巴細胞白血病、慢性淋巴細胞白血病及慢性髓系白血病(CML))、頭頸部癌(例如頭頸部鱗狀細胞癌 (HNSC))、胃癌(例如胃癌、EB病毒相關性胃癌(EBVaGC)，及Her2+胃食管交界處(GEJ)癌症)、乳癌(例如乳腺浸潤癌(BRCA)、HER2+乳癌、激素受體陽性乳癌、三陰性乳癌(TNBC))、宮頸癌(例如宮頸鱗狀細胞癌及宮頸管腺癌(CESC))、膽管癌(CHOL)、結腸癌(例如結腸腺癌(COAD))、卵巢癌(例如卵巢漿液性囊腺癌(OV)、卵巢透明細胞癌、上皮性卵巢癌)、甲狀腺癌(例如甲狀腺癌(THCA))、子宮癌(例如子宮體子宮內膜癌(UCEC))、子宮內膜癌、肺癌(例如肺腺癌(LUAD)、肺鱗狀細胞癌 (LUSC)、小細胞肺癌(SCLC)及非小細胞肺癌(NSCLC))、間皮瘤、胰腺癌(例如胰腺腺癌(PAAD)及胰腺導管腺癌(PDAC))、膀胱癌(例如，肌浸潤性膀胱癌(MIBC)、非肌層浸潤性膀胱癌(NMIBC))、腦癌(例如膠質瘤)、食管癌、腎癌、肝癌(例如肝細胞癌(HCC))、黑色素瘤、前列腺癌、骨髓瘤(例如多發性骨髓瘤)、骨癌(例如骨肉瘤)、肌肉癌(例如平滑肌肉瘤)及骨髓增生異常綜合征(MDS)。
於另一態樣中，本發明提供一種增強受試者之免疫反應之方法，其包含對該受試者投與有效量之本發明所提供之抗體、經遮蔽抗體(例如可活化抗體)或抗原結合片段。於一些實施例中，該抗體、經遮蔽抗體(例如可活化抗體)或抗原結合片段為CD47抗體、經遮蔽抗體(例如可活化抗體)或抗原結合片段且該受試者為人類。術語「增強免疫反應」或其文法變型意指刺激、引起、增加、提高或增強受試者之免疫系統之任何反應。該免疫反應可為細胞反應(即細胞介導，諸如細胞毒性T淋巴細胞介導)或體液反應(即抗體介導)，且可為一級或二級免疫反應。增強免疫反應之實例包括CD4+輔助性T細胞活性增加及溶細胞性T細胞的產生。免疫反應之增強可使用熟習此項技術者已知之許多活體外或活體內量測評估，該等量測包括(但不限於)細胞毒性T淋巴細胞檢定、細胞激素釋放(例如IL-2產生)、腫瘤消退、具有腫瘤動物之存活、抗體產生、免疫細胞增殖、細胞表面標記物之表現，及細胞毒性(例如，抗體依賴性細胞毒性 (ADCC)。通常，當相較於未經處理之受試者或未使用所述方法處理之受試者之免疫反應時，本發明之方法增強受試者之免疫反應。於一個實施例中，抗體、經遮蔽抗體(例如可活化抗體)或抗原結合片段用於增強人類對微生物病原體(例如病毒)的免疫反應。在另一個實施例中，抗體、經遮蔽抗體(例如可活化抗體)或抗原結合片段用於增強人類對疫苗的免疫反應。抗體、經遮蔽抗體(例如可活化抗體)或抗原結合片段可用於增強人類對微生物病原體(如病毒)或疫苗的免疫反應。
於實踐治療方法中，抗體、經遮蔽抗體(例如可活化抗體)或抗原結合片段可單獨投與作為單藥療法或與一或多種另外治療劑或療法組合投與。因此，於另一態樣中，本發明提供一種組合療法，其包含抗體、經遮蔽抗體(例如可活化抗體)或抗原結合片段與一或多種另外療法或治療劑組合用於分開、依序或同時投與。術語「另外治療劑」可系指除了本發明提供之抗體、經遮蔽抗體(例如可活化抗體)或抗原結合片段外之任何治療劑。於一特定態樣中，本發明提供一種用於治療受試者之癌症之組合療法，其包含對該受試者投與有效量之本文中所提供之抗體、經遮蔽抗體(例如可活化抗體)或抗原結合片段與一或多種另外治療劑組合。於另一實施例中，該受試者為人類。
本揭示案提供之抗體、經遮蔽抗體(例如可活化抗體)或抗原結合片段可與多種癌症治療劑組合使用。普通熟習此項技術者將認識到癌症之各種療法的存在及開發，可與本揭示案提供之抗體、經遮蔽抗體(例如可活化抗體)或抗原結合片段組合使用，其不限於本文闡述之彼等形式之療法。用於治療癌症之先前療法(包括標準療法)之類別之實例包括(1)化學治療劑、(2)免疫治療劑及(3)激素治療劑。
術語「化學治療劑」系指可導致癌細胞死亡或幹擾癌細胞之生長、分裂、修復及/或功能的化學或生物物質。化學治療劑之實例包括WO 2006/129163及US 20060153808中所揭示之彼等化學治療劑，該等專利之揭示內容以引用方式併入本文。特定化學治療劑之實例包括：(1)烷基化劑，諸如苯丁酸氮芥(LEUKERAN)、環磷醯胺(CYTOXAN)、異環磷醯胺(IFEX)、鹽酸氮芥(MUSTARGEN)、塞替派(THIOPLEX)、鏈佐黴素(ZANOSAR)、雙氯乙基亞硝脲(BICNU、GLIADEL WAFER)、洛莫司汀(CEENU)及達卡巴嗪(DTIC-DOME)；(2)生物鹼或植物長春花生物鹼，包括細胞毒性抗生素，例如多柔比星(ADRIAMYCIN)、表柔比星(ELLENCE、PHARMORUBICIN)、道諾黴素(CERUBIDINE、DAUNOXOME)、奈莫柔比星、伊達比星(IDAMYCIN PFS、ZAVEDOS)、米托蒽醌(DHAD、NOVANTRONE)、放線菌素(放線菌素D、COSMEGEN)、普卡黴素(MITHRACIN)、絲裂黴素(MUTAMYCIN)及博來黴素(BLENOXANE)、酒石酸長春瑞濱(NAVELBINE)、長春堿(VELBAN)、長春新堿(ONCOVIN)及長春地辛(ELDISINE)；(3)抗代謝物，例如卡培他濱(XELODA)、阿糖胞苷(CYTOSAR-U)、氟達拉濱(FLUDARA)、吉西他濱(GEMZAR)、羥基脲(HYDRA)、甲胺蝶呤(FOLEX、MEXATE、TREXALL)、奈拉濱(ARRANON)、三甲曲沙(NEUTREXIN)及培美曲塞(ALIMTA)；(4)嘧啶拮抗劑，例如5-氟尿嘧啶(5-FU)；卡培他濱(XELODA)、雷替曲塞(TOMUDEX)、替加氟-尿嘧啶(UFTORAL)及吉西他濱(GEMZAR)；(5)紫杉烷類，諸如多西他賽(TAXOTERE)、紫杉醇(TAXOL)；(6)鉑類藥物，例如順鉑(PLATINOL)及卡鉑(PARAPLATIN)及奧沙利鉑(ELOXATIN)；(7)拓撲異構酶抑制劑，諸如伊立替康(CAMPTOSAR)、托泊替康(HYCAMTIN)、依託泊苷(ETOPOPHOS、VEPESSID、TOPOSAR)及替尼泊苷(VUMON)；(8)表鬼臼毒素(鬼臼毒素衍生物)，例如依託泊苷(ETOPOPHOS、VEPESSID、TOPOSAR)；(9)葉酸衍生物，諸如亞葉酸(WELLCOVORIN)；(10)亞硝基脲，例如雙氯乙基亞硝脲(BiCNU)、洛莫司汀(CeeNU)；(11)受體酪胺酸激酶之抑制劑，包括表皮生長因數受體(EGFR)、血管內皮生長因數(VEGF)、胰島素受體、胰島素樣生長因數受體(IGFR)、肝細胞生長因數受體(HGFR)及血小板衍生生長因數受體(PDGFR)，例如吉非替尼(IRESSA)、厄洛替尼(TARCEVA)、硼替佐米(VELCADE)、甲磺酸伊馬替尼(GLEEVEC)、吉非替尼、拉帕替尼、索拉非尼、沙利度胺、舒尼替尼(SUTENT)、阿西替尼、利妥昔單抗(RITUXAN、MABTHERA)、曲妥珠單抗(HERCEPTIN)、西妥昔單抗(ERBITUX)、貝伐單抗(AVASTIN)及雷珠單抗(LUCENTIS)、LYM-1(ONCOLYM)、WO2002/053596揭示之胰島素樣生長因數-1受體(IGF-1R)抗體)；(12)血管生成抑制劑，諸如貝伐單抗(AVASTIN)、蘇拉明(GERMANIN)、血管抑素、SU5416、沙利度胺、及基質金屬蛋白酶抑制劑(例如巴馬司他及馬立馬司他)、及在WO2002055106中揭示之彼等者；及(13)蛋白酶體抑制劑，例如硼替佐米(VELCADE)。
術語「免疫治療劑」系指可增強哺乳動物之免疫反應的化學或生物物質。免疫治療劑之實例包括：卡介苗(BCG)；細胞介素，例如幹擾素；疫苗，諸如MyVax個性化免疫治療、Onyvax-P、Oncophage、GRNVAC1、Favld、Provenge、GVAX、LovaxinC、BiovaxID、GMXX、及NeuVax；及抗體，諸如阿侖珠單抗(alemtuzumab) (CAMPATH)、貝伐單抗(AVASTIN)、西妥昔單抗(ERBITUX)、奧佐米星(gemtuzunab ozogamicin) (MYLOTARG)、替伊莫單抗(ibritumomab tiuxetan) (ZEVALIN)、帕尼單抗(VECTIBIX)、利妥昔單抗(RITUXAN、MABTHERA)、曲妥珠單抗(HERCEPTIN)、托西莫單抗(tositumomab) (BEXXAR)、依匹單抗(ipilimumab；YERVOY)、曲瑞木單抗(tremelimumab)、CAT-3888、OX40受體促效劑抗體(例如在WO2009/079335中揭示之彼等者)、CD40受體促效劑抗體(例如WO2003/040170揭示之彼等者、及TLR-9促效劑(例如WO2003/015711、WO2004/016805、及WO2009/022215揭示之彼等者)。
術語「激素治療劑」系指抑制或消除激素產生或抑制或抵消激素對癌細胞之生長及/或存活之影響的化學或生物物質。適用於本文方法之此類試劑之實例包括US20070117809中揭示之彼等者。特定激素治療劑之實例包括他莫昔芬(tamoxifen) (NOLVADEX)、托瑞米芬(toremifene) (FARESTON)、氟維司群(fulvestrant) (FASLODEX)、阿那曲唑(anastrozole) (ARIMIDEX)、伊析美斯坦(exemestane) (AROMASIN)、利妥唑(letrozole) (FEMARA)、醋酸甲地孕酮(MEGACE)、戈舍瑞林(goserelin) (ZOLADEX)及亮丙瑞林(leuprolide) (LUPRON)。本揭示案之抗體、經遮蔽抗體(例如可活化抗體)或抗原結合片段亦可與非藥物激素療法組合使用，該等非藥物激素療法諸如(1)手術方法，其除去參與激素產生之所有或部分器官或腺體，例如卵巢、睾丸、腎上腺及垂體；及(2)放射治療，其中以足以抑制或消除靶向激素產生之量對患者之器官或腺進行放射。
用於治療癌症之組合療法亦包括抗體、經遮蔽抗體(例如可活化抗體)或抗原結合片段與移除腫瘤之手術之組合。可在手術之前、期間或之後對哺乳動物投與抗體、經遮蔽抗體(例如可活化抗體)或抗原結合片段。
用於治療癌症之組合療法亦包括抗體、經遮蔽抗體(例如可活化抗體)或抗原結合片段與輻射療法(諸如電離(電磁)放射療法(例如，X-射線或γ射線)及粒子束輻射療法(例如，高線性能量輻射))之組合。輻射源可為受試者之外部或內部。可在輻射療法之前、期間或之後對受試者投與抗體、經遮蔽抗體(例如可活化抗體)或抗原結合片段。
本發明提供之抗體、經遮蔽抗體(例如可活化抗體)或抗原結合片段及組合物可經由任何適宜投與之經腸途徑或非經腸途徑投與。術語投與之「經腸途徑」系指經由胃腸道之任何部分投與。經腸途徑之實例包括經口、經黏膜、經頰、及經直腸途徑、或經胃內途徑。投與之「非經腸途徑」系指除了經腸途徑外之投與途徑。投與之非經腸途徑之實例包括靜脈內、肌肉內、皮內、腹膜內、腫瘤內、膀胱內、動脈內、鞘內、囊內、眶內、心內、經氣管、關節內、囊下、蛛網膜下、脊椎內、硬膜外及胸骨內、皮下或局部投與。本發明之抗體、抗原結合片段、經遮蔽抗體(例如可活化抗體)及組合物可使用任何適宜方法投與，諸如藉由口服、鼻飼管、胃造口管、注射、輸注、可移植輸注泵及滲透泵。投與之適宜途徑及方法可取決於諸如以下之許多因素變化：正在使用之特異性抗體、抗原結合片段、經遮蔽抗體(例如可活化抗體)所需吸收速率、使用之特定調配物或劑型、正在治療之病症之類型或嚴重度、特異性作用位點及患者病狀，且可藉由熟習此項技術者容易選擇。
術語抗體、經遮蔽抗體(例如可活化抗體)或抗原結合片段之「治療有效量」可系指有效用於預期治療目的之量。例如，於增強免疫反應之背景下，「治療有效量」可為有效刺激、引起、增加、提高或增強受試者之免疫系統之任何反應的任何量。於治療疾病之背景下，「治療有效量」可為足以造成正在治療之受試者中之任何所需或有益效果的任何量。具體而言，於治療癌症中，所需或有益效果之實例包括抑制癌細胞之進一步生長或擴散、癌細胞之死亡、抑制癌症再發生、減少與癌症相關之疼痛、或提高受試者之存活。CD47抗體、經遮蔽抗體(例如可活化抗體)或抗原結合片段之治療上治療有效量範圍通常為約0.001至約500 mg/kg，及更通常約0.01至約100 mg/kg受試者(例如食蟹猴)之體重。例如，該量可為約0.3 mg/kg、1 mg/kg、3 mg/kg、5 mg/kg、10 mg/kg、50 mg/kg、或100 mg/kg受試者之體重。於一些實施例中，抗體、經遮蔽抗體(例如可活化抗體)或抗原結合片段之治療上治療有效量系於約0.01至60 mg/kg受試者(例如食蟹猴)之體重之範圍內，例如約0.01-1 mg/kg、1-10 mg/kg或10-60 mg/kg的受試者(例如食蟹猴)中的任意一種。例如，CD47抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)以至少約0.01 mg/kg、0.1 mg/kg、0.6 mg/kg、1 mg/kg、5 mg/kg、10 mg/kg、15 mg/kg、20 mg/kg、25 mg/kg或30 mg/kg受試者(例如，食蟹猴)體重之任意一種劑量投與。於一些實施例中，CD47抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)以不超過0.6 mg/kg、1 mg/kg、5 mg/kg、10 mg/kg、15 mg/kg、20 mg/kg、25 mg/kg、30 mg/kg、40 mg/kg、50 mg/kg或60 mg/kg受試者(例如食蟹猴)體重之任意一種劑量投與。於一些實施例中，CD47抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)以至少0.6 mg/kg之劑量投與。待投與之精確劑量水準可由熟習此項技術者容易確定且將取決於許多因素，諸如待治療之病症之類型及嚴重度、採用之特定抗體、經遮蔽抗體(例如可活化抗體)或抗原結合片段、投與途徑、投與時間、治療持續時間、採用之特定另外療法、正在治療之患者之年齡、性別、體重、病狀、一般健康及先前醫療史、及醫療技術中熟知之類似因素。
通常在多種場合投與抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)或組合物。單一劑量之間之間隔可為例如每週、每月、每三個月或每年。例示性治療方案需要以下投與：每週一次、每兩週一次、每三週一次、每四周一次、每月一次、每三個月一次或每三至六個月一次。CD47抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)之典型劑量方案包括1 mg/kg體重或3 mg/kg體重，經由靜脈內投與，使用下列給藥時程表中之一者：(i)每四週六個劑量，然後每三個月；(ii)每三周；(iii) 3 mg/kg體重一次，接著每三周1 mg/kg體重。於一些實施例中，抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)至少每三周投與一次。於某些實施例中，抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)至少每兩周投與一次。於一些實施例中，包含抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)的藥物組合物至少每三周投與一次。於某些實施例中，包含抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)的藥物組合物至少每兩周投與一次。
G.套組及試劑盒
在本揭示案之一些實施例中，提供含有用於治療CD47-陽性疾病(例如癌症)的材料製品，所述材料用於將抗CD47抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)遞送到表面上表現CD47的細胞。製品可包含容器及在容器上或與容器相關聯之標籤或包裝插頁。合適容器包括例如瓶、小瓶、注射器等。容器可由多種材料形成，例如玻璃或塑膠。通常，容器容納本文所用之可有效治療癌症之組合物，且可具有無菌進入口(例如，容器可為靜脈內溶液袋或具有可藉由皮下注射針頭刺穿之塞子的小瓶)。組合物中的至少一種活性劑系本發明的抗CD47抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)構建體。所述標籤或包裝插頁指示所述組合物用於處理所述特定病症。標籤或包裝插頁還將包括用於向患者投與抗CD47抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)組合物之說明書。還考慮了包括本文所用之組合療法的製品及試劑盒。
包裝插頁系指治療產品之商業包裝中慣常包括的說明書，其含有關於適應症、用法、劑量、投與、禁忌症及/或有關此類治療產品之用途之警告的資訊。於一些實施例中，包裝插頁指示該組合物用於治療癌症。
另外，該製品可進一步包含第二容器，該第二容器包含醫藥學上可接受之緩衝液，例如抑菌注射用水(BWFI)、磷酸鹽緩衝鹽水、林格氏溶液及右旋糖溶液。其可進一步包括自商業及用戶觀點看期望的其他材料，包括其他緩衝液、稀釋劑、篩檢程式、針及注射器。
亦提供套組，其可用於多種目的，例如用於治療本文所用之CD47-陽性疾病或失調的治療，用於遞送抗CD47抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)到表面表現CD47的細胞，視情況地與製品組合使用。本申請案之套組包括一或多個容器，該容器包含本文所用之抗CD47抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)組合物(或單位劑型及/或製品)，且於一些實施例中，套組進一步包含根據本文所用之任何方法供使用之其他劑(例如，一或多種另外的治療劑)及/或說明書。套組可進一步包含選擇適用於治療之個體之描述。本申請案之套組中提供之說明書通常為在標籤或包裝插頁(例如，套組中包含之紙張)上之書面說明書，但機器可讀之說明書(例如，磁片儲存器或光碟儲存器上之說明書)亦可接受。
例如，於一些實施例中，套組包括包含抗CD47抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)的組合物。於一些實施例中，所述套組包含a)包含抗CD47抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)的組合物，及b)有效量的至少一種其它試劑，其中其他試劑增強抗CD47抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)的效果(例如，治療效果)。於一些實施例中，所述套組包含a)包含抗CD47抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)的組合物，及b)用於向個體投與抗CD47抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)組合物治療CD47-陽性疾病(例如癌症)的說明書。於一些實施例中，所述套組包含a)包含抗CD47抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)的組合物，b)有效量的至少一種其它試劑，其中其他試劑增強抗CD47抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)的效果(例如，治療效果)，及c)用於向個體投與抗CD47抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)組合物及其它試劑用於治療CD47-陽性疾病(例如癌症)的說明書。抗CD47抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)及其它試劑可存在於單獨的容器中或單個容器中。例如，該套組可包括一種不同組合物或兩種或多種組合物，其中一種組合物包括抗CD47抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)，且另一種組合物包括另一種試劑。
於一些實施例中，套組包含編碼抗CD47抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)的核酸(或一組核酸)或一個或多個多肽部分(例如，CDR、VH、VR、重鏈、輕鏈、遮蔽性肽、Fc區域等)。於一些實施例中，套組包含a)編碼抗CD47抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)或一個或多個多肽部分的核酸(或一組核酸)，以及b)用於表現核酸(或一組核酸)的宿主細胞。於一些實施例中，套組包含a)編碼抗CD47抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)或其多個多肽部分的核酸(或一組核酸)，以及b)用於i)在宿主細胞中表現抗CD47抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)的說明書，ii)製備包含抗CD47抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)的組合物，或表現抗CD47抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)的宿主細胞，以及iii)投與包含抗CD47抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)的組合物，或表現該抗CD47抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)的宿主細胞，用於治療CD47-陽性疾病，如癌症。於一些實施例中，所述宿主細胞來源於個體。於一些實施例中，套組包含a)編碼抗CD47抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)的核酸(或一組核酸)或一個或多個多肽部分，b)用於表現核酸(或一組核酸)的宿主細胞，以及c)用於i)在宿主細胞中表現抗CD47抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)的說明書，ii)製備包含抗CD47抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)的組合物，或表現該抗CD47抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)的宿主細胞，以及iii)投與包含該抗CD47抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)的組合物，或表現該抗CD47抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)的宿主細胞，用於治療CD47-陽性疾病，如癌症。於一些實施例中，抗CD47抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)或一個或多個多肽部分的表現系可誘導的。於一些實施例中，編碼抗CD47抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)的核酸(或一組核酸)，或一個或多個多肽部分在誘導啟動子的控制下。
本申請案之套組系在合適包裝中。合適包裝包括但不限於小瓶、瓶、廣口瓶、軟性包裝(例如，經密封聚酯薄膜或塑膠袋)等。套組可視情況地提供其他組分(例如緩衝液)及解釋性資訊。因此，本申請案亦提供製品，其包括小瓶(例如經密封小瓶)、瓶、廣口瓶、柔性包裝等。
涉及抗CD47抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)組合物的使用說明書通常包含有關預期治療的給藥劑量，給藥方案及給藥途徑的資訊。容器可為單位劑量、散裝包裝(例如，多劑量包裝)或亞單位劑量。例如，可提供包含本揭示案之足夠劑量的抗CD47抗體、抗原結合片段或經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)的試劑盒，以在延長的時間段內為個體提供有效治療，諸如一周、8天、9天、10天、11天、12天、13天、2周、3周、4周、6周、8周、3個月、4個月、5個月、7個月、8個月、9個月或更長時間中的任一者。套組亦可包括多個單位劑量之抗CD47抗體、抗原結合片段或經經遮蔽抗體(例如，可活化抗體)及醫藥組合物及使用說明書，且以足以在藥房例如醫院藥房及配料藥房中儲存及使用之量包裝。
藉由參考以下實例可更全面地理解本揭示案。然而，實例不應被解釋為限制本揭示案之範圍。應瞭解，本文所用之實例及實施例僅用於說明性目的，根據其進行的各種修改或更改將向此項技術中的技術人員提出建議，並且將包括在本申請之本質及範圍以及所附權利要求的範圍內。本揭示案引用之所有附圖及所有參考文獻、專利及公開的專利申請的內容其全文以引用的方式併入本文。
實例
實例1. 特異性結合人類CD47之抗體的產生
採用多個專有之噬菌體文庫對人類CD47-Fc抗原(Sinobiological)進行淘選。抗原可以直接固定在Maxisorp微板上(Thermo Scientific 446469)，也可以生物素化並由Dynabeads (M280，Streptavidin，Invitrogen #60210)捕獲，根據製造商之說明使用KingFisher (Thermo Scientific)進行篩選。該過程採用標準噬菌體篩選規程。對每個抗原總共進行三輪篩選，並加入10-100倍之純化人類Fc以減少背景結合。在最後一輪淘選之後，進行單菌落上清液ELISA以鑒定特異性識別人類CD47之初級命中物。初級命中物定義為ELISA信號至少是背景信號之兩倍的那些命中物。如表7展示，共確定了17個獨特之命中物，將Fab之重鏈及輕鏈克隆至具有IgG4同型的哺乳動物表達載體pcDNA3.3 (Thermo Fisher Scientific)中。按照製造商之說明將成對的質粒暫態轉染到HEK293F細胞中。七天后，將上清液收集，藉由離心及過濾澄清，並且用標準蛋白A親和層析(MabSelect SuRe，GEHealthcare)純化IgG。將蛋白質洗脫並中和，並將緩衝液交換到PB緩衝液(20 mM 磷酸鈉，150 mM 氯化鈉，pH 7.0)中。藉由紫外分光光度法確定蛋白質濃度，並且在變性、還原及非還原條件下分析IgG純度。
表7. 藉由噬菌體展示篩選之抗CD47抗體胺基酸序列。
實例2. 抗CD47親本抗體之體外篩選 使用ELISA技術量測人類CD47 (hCD47)結合親和力
| 抗體識別號 | 重鏈可變區胺基酸序列 SEQ ID Nos | 輕鏈可變區胺基酸序列 SEQ ID Nos | ||||||
| HCVR | HCDR1 | HCDR2 | HCDR3 | LCVR | LCDR1 | LCDR2 | LCDR3 | |
| TY25029 | 1 | 35 | 52 | 69 | 2 | 86 | 103 | 120 |
| TY25030 | 3 | 36 | 53 | 70 | 4 | 87 | 104 | 121 |
| TY25031 | 5 | 37 | 54 | 71 | 6 | 88 | 105 | 122 |
| TY25032 | 7 | 38 | 55 | 72 | 8 | 89 | 106 | 123 |
| TY25033 | 9 | 39 | 56 | 73 | 10 | 90 | 107 | 124 |
| TY25034 | 11 | 40 | 57 | 74 | 12 | 91 | 108 | 125 |
| TY25035 | 13 | 41 | 58 | 75 | 14 | 92 | 109 | 126 |
| TY25036 | 15 | 42 | 59 | 76 | 16 | 93 | 110 | 127 |
| TY25037 | 17 | 43 | 60 | 77 | 18 | 94 | 111 | 128 |
| TY25038 | 19 | 44 | 61 | 78 | 20 | 95 | 112 | 129 |
| TY25039 | 21 | 45 | 62 | 79 | 22 | 96 | 113 | 130 |
| TY25040 | 23 | 46 | 63 | 80 | 24 | 97 | 114 | 131 |
| TY25041 | 25 | 47 | 64 | 81 | 26 | 98 | 115 | 132 |
| TY21446 | 27 | 48 | 65 | 82 | 28 | 99 | 116 | 133 |
| TY21447 | 29 | 49 | 66 | 83 | 30 | 100 | 117 | 134 |
| TY21449 | 31 | 50 | 67 | 84 | 32 | 101 | 118 | 135 |
| TY21451 | 33 | 51 | 68 | 85 | 34 | 102 | 119 | 136 |
將96孔板用2 μg/mL之hCD47-ECD/Fc蛋白(Sinobiological)包被並在4℃下過夜。人源化抗CD47抗體TAC2204 (也稱為5F9，如表4B及美國專利號9,017,675所述)被用作基準對照。在封閉之後，將板洗滌三次，並且在37℃下與測試抗體之連續稀釋液孵育1小時。然後將板洗滌三次，並且在37℃下與經HRP標記之抗人類Fab二抗(Sigma)孵育1小時。洗滌三次後，將板在室溫下與TMB受質一起孵育15分鐘。藉由添加H
2SO
4停止液停止反應。用酶標儀測定450 nm處之吸光度。資料藉由GraphPad Prism 7.0軟體分析。
如表8展示，除TY25032及TY21451外，所有測試抗體以高親和力與人類CD47胞外區域結合。
表8. hCD47之ELISA結合EC50值匯總。相同抗體之重複值表示該抗體的兩個獨立量測值。
配體阻斷
| 抗體識別號 | EC50 (nM) |
| TY25029 | 0.58 |
| TY25030 | 2.42 |
| TY25031 | 0.59 |
| TY25032 | ND |
| TY25033 | 6.11 |
| TY25034 | 0.47 |
| TY25035 | 2.55 |
| TY25036 | 1.71 |
| TY25037 | 0.95 |
| TY25038 | 0.78 |
| TY25039 | 3.66 |
| TY25040 | 0.46 |
| TY25041 | 1.17 |
| TY21446 | 0.41 |
| TY21447 | 0.33 |
| TY21451 | ND |
| TY25031 | 0.60 |
| TY25034 | 0.41 |
| TY25040 | 0.39 |
| TAC2204 | 0.34 |
| TAC2204 | 0.34 |
將96孔板(100 ng/孔)用重組hCD47-ECD/Fc (Sinobiological)包被並在4℃下過夜。在封閉之後，將板洗滌三次，並在37℃下與0.5 μg/mL生物素化之hSIRPα-ECD/His (Sinobiological)及測試抗體混合物連續稀釋液孵育1小時。然後再將板洗滌三次，並且在37℃下與經HRP標記之鏈黴親和素孵育1小時。洗滌後，將板在室溫下與TMB受質一起孵育15分鐘。藉由添加H
2SO
4停止液停止反應。用酶標儀測定450 nm處之吸光度。資料藉由GraphPad Prism 7.0軟體分析。
如表9A-9B所示，TAC2204、TY25031、TY25034、TY25040、TY21446、TY21447及TY21449展示出作用相當之hSIRPα/hCD47阻斷能力。
表9A. 配體阻斷IC50值匯總；第一次獨立實驗。
表9B. 配體阻斷IC50值匯總-第二次實驗。
親和力排序研究
| 抗體識別號 | IC50 (nM) |
| TY25029 | ＞100 |
| TY25030 | 21.68 |
| TY25031 | 4.55 |
| TY25033 | ＞100 |
| TY25034 | 3.53 |
| TY25035 | 60.56 |
| TY25036 | ＞100 |
| TY25037 | ＞100 |
| TY25038 | ＞100 |
| TY25039 | ＞100 |
| TY25040 | 3.30 |
| TY25041 | ＞100 |
| TAC2204 | 2.95 |
| 抗體識別號 | IC50 (nM) |
| TY21446 | 2.86 |
| TY21447 | 3.12 |
| TY21449 | 3.18 |
| TY21451 | ＞100 |
| TAC2204 | 3.12 |
藉由Octet
®RED96系統(ForteBio)量測抗體與人類CD47之間的親和力。TAC2204及抗CD47抗體TAC2407 (也稱為13H3及TJC4 (來佐利單抗)；如表4B及美國專利號US20210095019所述)被用作基準對照。SA感測器(ForteBio)載入生物素化之hCD47-ECD/Fc (Sinobiological)。洗滌後，將感測器浸入包含測試抗體之溶液中300秒以監測締合階段，然後浸入運行緩衝液300秒以監測解離階段。藉由資料獲取軟體7.1 (Data Acquisition software 7.1)處理獲取之ForteBio資料，並且將動力學資料擬合到1:1朗繆爾結合模型。
如表10所示，TY21446及TAC2204展示了相似之平衡解離常數。
表10. 藉由ForteBio量測抗體與hCD47結合親和力之排序研究。TY25034之重複值表示兩個獨立量測值。
實例3. 抗CD47可活化抗體的產生
| 樣品識別號 | KD | Kon | Koff |
| (nM) | (1/Ms) | (1/s) | |
| TAC2204 | 0.3475 | 6.76E+05 | 2.35E-04 |
| TAC2407 | 1.404 | 5.20E+05 | 7.29E-04 |
| TY25029 | 1.515 | 4.17E+05 | 6.31E-04 |
| TY25030 | 4.616 | 3.61E+05 | 1.66E-03 |
| TY25031 | 0.4834 | 1.68E+05 | 8.10E-05 |
| TY25032 | 2.729 | 2.95E+05 | 8.06E-04 |
| TY25033 | ＜ 0.001 | 5.89E+04 | ＜1.0E-07 |
| TY25034 | 0.8256 | 8.13E+05 | 6.71E-04 |
| TY25035 | ＜ 0.001 | 1.71E+05 | ＜1.0E-07 |
| TY25036 | ＜ 0.001 | 9.37E+04 | ＜1.0E-07 |
| TY25037 | 0.6109 | 5.60E+04 | 3.42E-05 |
| TY25038 | 4.467 | 2.49E+05 | 1.11E-03 |
| TY25039 | 0.1407 | 9.73E+04 | 1.37E-05 |
| TY25040 | 0.4739 | 4.22E+05 | 2.00E-04 |
| TY21446 | 0.1937 | 6.42E+05 | 1.24E-04 |
| TY25034 | 0.8697 | 8.09E+05 | 7.04E-04 |
TY21446的IgG同型進一步從人類IgG4轉換為人類IgG1及具有S239D和I332E取代的IgG1，分別生成TY26896及TY26897，以誘導針對腫瘤細胞之ADCC及/或CDC效應。為了藉由抗CD47抗體實現對免疫細胞之腫瘤特異性啟動，進一步開發了可活化抗體TY21446、TY26896及TY26897。使用重組DNA技術，將遮蔽性部分(MM)及包含酶特異性裂解位點之可裂解部分(CM)連接子連接到親本抗體TY21446、TY26896及TY26897輕鏈的N端來分別產生可活化抗體TY26294、TY26898及TY26899。表11展示了可活化及親本(非活化抗體)抗體之識別號(IDs)及IgG亞型。
表11. 抗CD47抗體及活化抗體。
| 活化抗體識別號 | 親本抗體識別號 | IgG |
| TY26294 | TY21446 | hIgG4 |
| TY26898 | TY26896 | hIgG1 |
| TY26899 | TY26897 | hIgG1 S239D及I332E |
有些蛋白酶在人類腫瘤中特異性高度表達。在腫瘤微環境中抗CD47可活化抗體上之掩藏肽可以藉由MMP蛋白酶裂解去除，從而恢復抗體與CD47之結合親和力，並藉由阻斷hSIRPα/hCD47通路來啟動腫瘤特異性巨噬細胞。針對TY26898及TY26899，NK細胞也以腫瘤特異性之方式殺死腫瘤細胞。所有抗CD47可活化抗體限制性的啟動可以減少癌症患者的靶向非腫瘤毒性，特別是RBC減少，並且由於降低抗原沉沒效應增加半衰期。
實例4. 抗CD47可活化抗體穩定性研究
在不同應力條件下檢驗抗體之穩定性。
如表12A-12C所示，藉由SEC-HPLC分析，濃度為1 mg/mL之TY26294、TY26898及TY26899在經受6次冷凍(-80℃)解凍(室溫)後保持穩定。在4或40℃下28天后或者25℃下7天后，TY26294、TY26898及TY26899之高分子量(HMW)聚集物或低分子量(LMW)片段幾乎沒有變化。在室溫pH 3.6下2小時，及在含有300 mM NaCl之高鹽緩衝液環境下24小時，TY26294、TY26898及TY26899仍然穩定。使用中穩定性顯示，1 mg/kg之TY26294、TY26898及TY26899在室溫下30小時仍然穩定。總之，這些結果表明即使沒有進行配製優化，TY26294、TY26898及TY26899也具有卓越之可開發性。
表12A. TY26294在不同應力條件下在SEC-HPLC分析中之HMW%變化。
表12B. TY26898在不同應力條件下在SEC-HPLC分析中之HMW%變化。
表12C. TY26898在不同應力條件下在SEC-HPLC分析中之HMW%變化。
實例5. 抗CD47抗體與人類、食蟹猴及小鼠CD47之結合親和力
| 條件 | 緩衝液 | 未處理 | 處理後 | ||||
| HMW% | 主峰% | LMW % | HMW% | 主峰 % | LMW % | ||
| 冷凍-解凍6個迴圈 | 20 mM 組氨酸，pH 5.5 | 3.2% | 94.4% | 2.4% | 3.6% | 94.6% | 1.8% |
| 在4℃下28天之儲存穩定性 | 20 mM 組氨酸，pH 5.5 | 2.9% | 96.9% | 0.3% | 2.9% | 96.9% | 0.3% |
| 在25℃下7天之儲存穩定性 | 20 mM 組氨酸，pH 5.5 | 3.2% | 94.4% | 2.4% | 3.9% | 93.4% | 2.7% |
| 在40℃下28天之儲存穩定性 | 20 mM 組氨酸，pH 5.5 | 3.5% | 96.5% | 0.1% | 3.3% | 96.6% | 0.1% |
| pH3.6下2小時之pH穩定性，室溫 | 50 mM NaAc/Hac，pH 3.6 | 1.4% | 97.5% | 1.1% | 1.2% | 96.9% | 1.9% |
| 24小時之高鹽穩定性，室溫 | 50 mM 組氨酸，300 mM NaCl，pH 7.0 | 2.7% | 97.3% | 0.0% | 1.6% | 98.4% | 0.0% |
| 30小時1 mg/mL使用中穩定性 | 0.9% NaCl | 2.8% | 97.2% | 0.0% | 2.8% | 97.0% | 0.2% |
| 條件 | 緩衝液 | 未處理 | 已處理 | ||||
| HMW% | 主峰% | LMW % | HMW% | 主峰% | LMW% | ||
| 冷凍-解凍6個迴圈 | 20 mM 組氨酸，pH 5.5 | 3.0% | 95.9% | 1.1% | 3.3% | 96.1% | 0.7% |
| 在4℃下28天之儲存穩定性 | 20 mM 組氨酸，pH 5.5 | 3.2% | 96.0% | 0.7% | 1.7% | 97.6% | 0.8% |
| 在25℃下7天之儲存穩定性 | 20 mM 組氨酸，pH 5.5 | 3.2% | 96.0% | 0.7% | 1.8% | 97.2% | 0.9% |
| 在40℃下28天之儲存穩定性 | 20 mM 組氨酸，pH 5.5 | 3.2% | 96.0% | 0.7% | 1.3% | 96.9% | 1.7% |
| pH3.6下2小時之pH穩定性，室溫 | 50 mM NaAc/Hac，pH 3.6 | 1.1% | 98.0% | 0.8% | 1.1% | 97.9% | 1.0% |
| 24小時之高鹽穩定性，室溫 | 50 mM 組氨酸，300 mM NaCl，pH 7.0 | 2.0% | 97.4% | 0.6% | 2.5% | 96.9% | 0.6% |
| 30小時1 mg/mL使用中穩定性 | 0.9% NaCl | 1.9% | 97.4% | 0.7% | 2.3% | 97.0% | 0.7% |
| 條件 | 緩衝液 | 未處理 | 已處理 | ||||
| HMW% | 主峰% | LMW % | HMW% | 主峰% | LMW % | ||
| 冷凍-解凍6個迴圈 | 20 mM 組氨酸，pH 5.5 | 2.2% | 96.8% | 1.0% | 3.4% | 95.6% | 1.0% |
| 在4℃下28天之儲存穩定性 | 20 mM 組氨酸，pH 5.5 | 2.3% | 96.9% | 0.8% | 1.2% | 98.0% | 0.9% |
| 在25℃下7天之儲存穩定性 | 20 mM 組氨酸，pH 5.5 | 2.3% | 96.9% | 0.8% | 1.3% | 97.6% | 1.1% |
| 在40℃下28天之儲存穩定性 | 20 mM 組氨酸，pH 5.5 | 2.3% | 96.9% | 0.8% | 1.3% | 96.6% | 2.1% |
| pH3.6下2小時之pH穩定性，室溫 | 50 mM NaAc/Hac，pH 3.6 | 1.4% | 97.6% | 1.0% | 1.3% | 97.8% | 1.0% |
| 24小時之高鹽穩定性，室溫 | 50 mM 組氨酸，300 mM NaCl，pH 7.0 | 1.6% | 97.7% | 0.7% | 1.8% | 97.5% | 0.7% |
| 30小時1 mg/mL使用中穩定性 | 0.9% NaCl | 1.7% | 97.4% | 0.9% | 2.0% | 97.2% | 0.8% |
藉由ELISA檢測與人類、食蟹猴(cyno)及小鼠(m) CD47之結合親和力。將96孔板用100 ng/孔之hCD47-ECD/Fc或cynoCD47-ECD/His或mCD47-ECD/His蛋白(Sinobiological)包被並在4℃下過夜。在封閉之後，將板洗滌三次，並在37℃下將測試抗體之連續稀釋液孵育1小時。然後將板洗滌三次，並且在37℃下與經HRP標記之抗人類Fab二抗(Sigma)孵育1小時。洗滌三次後，將板在室溫下與TMB受質一起孵育15分鐘。藉由添加H
2SO
4停止液停止反應。用酶標儀測定450 nm處之吸光度。資料藉由GraphPad Prism 7.0軟體分析。與人類CD47之結合親和力是在三個單獨的批次中測量的。
如表13所示，親本抗體TY21446、TY26896及TY26897與人類及食蟹猴CD47之結合親和力相似，但在高達8 μM時，它們與小鼠CD47不結合。可活化抗體之掩蔽效率可藉由可活化抗體的EC
50值除以親本抗體的EC
50值計算。TY26294、TY26898及TY26899掩蔽抗體與親本抗體與人類CD47之計算掩蔽效率在190至696倍範圍內，未裂解與裂解之掩蔽抗體與人類CD47的計算掩蔽效率在266至572倍之間。然而，可活化抗體與人類CD47體外之結合親和力可以在被MMP9酶裂解後恢復。
表13. 與人類、食蟹猴及小鼠CD47蛋白ELISA結合之EC50值匯總。
ND：未檢測到 *：不確定 NT：未測試
實例6. 抗CD47抗體與腫瘤細胞表面CD47之結合
| 抗體識別號 | 人類CD47 EC50 (nM) | 猴CD47 EC50 (nM) | 小鼠CD47 EC50 (nM) | ||
| 批次1 | 批次2 | 批次3 | |||
| TAC2204 | 0.35 | NT | 0.54 | NT | NT |
| TY21446 | 0.23 | 0.35 | 0.62 | 0.46 | ND |
| TY26896 | 0.19 | 0.33 | 0.5315 | 0.43 | ND |
| TY26897 | 0.34 | 0.34 | NT | 0.58 | ND |
| TY26294 | 160.1 | 185.6 | 146.3 | * | ND |
| TY26898 | 42.8 | 158.1 | 202 | * | ND |
| TY26899 | 64.6 | 160.3 | NT | * | ND |
| TY26294裂解後 | NT | 0.34 | 0.55 | NT | NT |
| TY26898裂解後 | NT | 0.32 | 0.55 | NT | NT |
| TY26899裂解後 | NT | 0.28 | NT | NT | NT |
藉由流式細胞偵測可活化抗體及親本抗體結合CD47+腫瘤細胞系之能力。Raji及CEM分別為具有多種細胞表面CD47表達水準之B淋巴瘤細胞系及T細胞淋巴細胞系。簡單地說，測試抗體被連續稀釋，並與腫瘤細胞一起在冰上孵育。洗滌後，這些細胞隨後與經APC標記之抗人類Fc二抗在冰上一起孵育。細胞在CytoFLEX流式細胞儀(Beckman Coulter)分析前使用PBS洗滌。資料藉由FlowJo軟體10分析。CEM細胞之結合力藉由兩個批次測量(表14A)，Raji細胞之結合親和力藉由3個批次測量(表14B)。第2個批次之CEM細胞結合及第3個批次之Raji細胞結合使用的二抗是山羊抗人類IgG (H+L) APC (Jackson Immunoresearch)，而第1個批次之CEM細胞結合及第1個和第2個批次之Raji細胞結合使用的二抗是APC抗人類IgG Fc (BioLegend)。
如表14A及表14B所示，親本抗體TY21446、TY26896及TY26897，以及基準TAC2204及TAC2407表現出與Raji及CEM細胞高度結合。與親本抗體相比，可活化抗體TY26294、TY26898及TY26899結合較低。然而，可活化抗體TY26294、TY26898及TY26899之結合幾乎可以在MMP9體外裂解移除掩蔽肽後完全恢復。可活化抗體結合CEM細胞之計算掩蔽效率在掩蔽抗體與親本抗體之間為139至1507倍，在未裂解與裂解之掩蔽抗體之間為174至341倍。類似地，可活化抗體結合Raji細胞之計算掩蔽效率在掩蔽抗體與親本抗體之間為35至774倍，在未裂解與裂解之掩蔽抗體之間為64至891倍。
表14A. 抗體與CEM腫瘤細胞CD47結合之EC50值匯總。
MFI=平均螢光程度 ND：未檢測到 NT：未測試
表14B. 抗體與Raji腫瘤細胞CD47結合之EC50值匯總。
MFI=平均螢光程度 ND：未檢測到 NT：未測試
實例7. 抗CD47抗體與RBC CD47之結合
| 抗體識別號 | 批次1 | 批次2 | |
| EC50 (nM) | EC50 (nM) | 最大MFI | |
| TY21446 | 0.41 | 0.51 | 301403 |
| TY26896 | 0.27 | 0.52 | 333719 |
| TY26897 | 0.64 | 0.44 | 324966 |
| TY26294 | 520 | 71.2 | 303589 |
| TY26898 | 407 | 153.6 | 324074 |
| TY26899 | 446 | 106.1 | 387032 |
| TY26294裂解後 | NT | 0.41 | 287019 |
| TY26898裂解後 | NT | 0.45 | 305769 |
| TY26899裂解後 | NT | 0.43 | 323020 |
| TAC2204 | 0.44 | 0.36 | 262989 |
| TAC2407 | NT | 1.18 | 224357 |
| hIgG1同型對照 | ND | ND | 2895 |
| 抗體識別號 | 批次1 | 批次2 | 批次3 | |
| EC50 (nM) | EC50 (nM) | EC50 (nM) | 最大MFI | |
| TY21446 | 0.48 | 0.48 | 0.24 | 144862 |
| TY26896 | 0.49 | 0.46 | 0.26 | 173834 |
| TY26897 | 0.39 | 0.33 | 0.42 | 212761 |
| TY26294 | 272 | 334.8 | 27.6 | 150303 |
| TY26898 | 274 | 356.2 | 31.1 | 118330 |
| TY26899 | 156 | 165.8 | 14.8 | 118354 |
| TY26294裂解後 | NT | 0.48 | 0.26 | 156700 |
| TY26898裂解後 | NT | 0.40 | 0.19 | 164413 |
| TY26899裂解後 | NT | 0.34 | 0.23 | 190675 |
| TAC2204 | 0.29 | 0.33 | 0.14 | 116619 |
| TAC2407 | NT | NT | 1.97 | 65859 |
| hIgG1同型對照 | ND | ND | ND | 6411 |
藉由流式細胞檢測抗體與細胞表面表達CD47之人類紅血球(RBCs)的結合能力。人類RBCs藉由離心從人周圍血中收集，並用DPBS/EDTA緩衝液洗滌兩次，然後用DPBS/EDTA緩衝液重新懸浮培養。最後在37℃下將RBCs與測試抗體之連續稀釋液孵育1小時。將RBCs洗滌兩次並且在37℃下與經APC標記之抗人類IgG Fc二抗(BioLegend)孵育30分鐘。洗滌兩次後，RBCs藉由CytoFLEX流式細胞儀(Beckman Coulter)分析，且資料藉由FlowJo軟體10分析。與人類RBCs結合之兩種不同RBCs供體藉由兩個不同批次測量。
表15展示了抗體與人類RBCs上CD47結合之EC50值匯總。可活化抗體與RBCs之結合大幅減少。可活化抗體結合RBCs之計算掩蔽效率在掩蔽抗體與親本抗體之間為344至2007倍。
表15. 抗體與CD47-陽性人類RBCs結合之EC50值匯總。
MFI=平均螢光程度 ND：未檢測到 NT：未測試
實例8. 抗CD47抗體對紅血球凝集之研究
| 抗體識別號 | 批次1 | 批次2 | |
| EC50 (nM) | EC50 (nM) | 最大MFI | |
| TY21446 | 0.37 | 0.55 | 18016 |
| TY26896 | 0.20 | 0.44 | 14043 |
| TY26897 | 0.36 | 0.43 | 13110 |
| TY26294 | 482.4 | 1104 | 8257 |
| TY26898 | 185.1 | 653 | 2805 |
| TY26899 | 123.7 | 329 | 4862 |
| TAC2204 | 0.76 | 0.33 | 14564 |
| TAC2407 | NT | ND | 2219 |
| 同型對照 | ND | ND | 105 |
對候選抗CD47抗體誘導人類紅血球凝集之能力進行測試，並與基準抗體進行了比較。自兩個不同供體之外周血樣品中純化人類RBCs，並在U型底之96孔板37℃下與測試抗體連續稀釋液孵育1小時。孵育後，與未凝集之RBCs的點狀紅色顆粒相反，團狀渾濁的出現證明瞭RBCs之凝集。
如圖1所示，TAC2204及TAC2407會引起人類RBC凝集，而TY21446、TY26896及TY26897不會(抗體濃度從0.003至66.7 nM)。可活化抗體TY26294、TY26898及TY26899即使在高達8000 nM也不會引起人類RBC凝集。圖1描述了來自兩個供體中其中一個供體的紅血球凝集；在另一名供體中也觀察到類似的紅血球凝集。
實例9. 抗CD47抗體誘導人類巨噬細胞吞噬CEM細胞
CD47被認為是「別吃我」之信號，藉由與具有吞噬能力之細胞例如巨噬細胞上的SIRPα相互作用來防止CD47表達細胞的吞噬。評估了測試抗體增加巨噬細胞吞噬腫瘤細胞的能力。簡要來說，從CSF-1 (Sinobiological)存在8天之人類PBMCs中純化周圍單核球，並由其衍生得到人類巨噬細胞。巨噬細胞以1x10
5細胞/孔之濃度重置在24孔板上，並在37℃下附著24小時。將經5(6)-羧基螢光素二乙酸N-琥珀醯亞酯(CFSE，Sigma)標記之CEM細胞以3.2x10
5細胞/孔的濃度加入至巨噬細胞培養。在靶細胞及效應細胞混合後立即加入連續稀釋之試驗抗體，在37℃孵育2小時。孵育後，用PBS洗滌兩次去除未被吞噬之CEM細胞。將剩餘細胞胰蛋白酶化，並用APC偶聯抗人類CD206抗體(BioLegend)標記，這是一種人類巨噬細胞之標記物。藉由CytoFLEX流式細胞儀(Beckman Coulter)分析細胞，且資料藉由FlowJo軟體及GraphPad Prism 7.0軟體分析。
如表16所示，TY21446與TAC2204之吞噬活性相當。然而，與TY21446、TAC2204及TAC2407相比，TY26896及TY26897顯現出顯著之吞噬作用效力。可活化抗體TY26294、TY26898及TY26899之吞噬活性在20 nM基線處。然而，可活化抗體在體外經MMP9裂解預處理後，吞噬活性完全恢復。
表16. 抗CD47抗體巨噬細胞吞噬作用研究匯總。
實例10. 抗體ADCC活性
| 抗體識別號 | 供體A | 供體B | ||
| EC50 (nM) | 最大吞噬作用 (%) | EC50 (nM) | 最大吞噬作用(%) | |
| TY21446 | 0.90 | 48.0% | 0.54 | 56.1% |
| TY26896 | 0.22 | 78.8% | 0.16 | 92.2% |
| TY26897 | 0.20 | 75.9% | 0.13 | 85.9% |
| TY26294 | NA | 15.2% | NA | 5.2% |
| TY26898 | NA | 21.2% | NA | 17.8% |
| TY26899 | NA | 18.6% | NA | 14.4% |
| TY26294裂解後 | 1.04 | 55.6% | 0.79 | 57.0% |
| TY26898裂解後 | 0.28 | 88.3% | 0.18 | 87.9% |
| TY26899裂解後 | 0.17 | 87.3% | 0.16 | 85.3% |
| TAC2204 | 1.07 | 58.3% | 1.17 | 76.1% |
| TAC2407 | 4.40 | 29.7% | 0.83 | 29.0% |
| IgG1同型對照 | NA | 14.3% | NA | 2.8% |
以NK細胞為效應細胞及以CD47
+CEM細胞為靶細胞，評價測試抗體之ADCC活性。藉由人類NK單離套組(StemCell)將人類NK細胞自PBMCs中純化。將1x10
4細胞/孔之經鈣黃綠素-AM標記的CEM細胞與不同濃度之測試抗體在37℃孵育30分鐘。添加5x10
4細胞/孔(E/T比率5:1)之人類NK細胞，並將混合物進一步在37℃孵育2小時。孵育後，使用SpectraMax i3x (Molecular Devices)測量上清液中之鈣黃綠素。使用以下公式計算溶胞百分比：溶胞％＝[(實驗釋放)-平均(靶+NK)]/[平均(靶標最大釋放值)-平均(僅靶)]×100％。
如圖2所示，TY21446及TAC2204未顯示出ADCC活性，而TY26896及TY26897展現ADCC活性。TY26897之ADCC活性強於TY26896。
實例11. 抗CD47抗體在小鼠異種移植模型之活體內抗腫瘤功效 B-NDG/Raji-Luc小鼠系統模型
藉由在B-NDG小鼠(Biocytogen)中接種表達螢光素酶(Raji-Luc)之Raji細胞測試抗體的活體內抗腫瘤功效。B-NDG小鼠是藉由將嚴重免疫缺陷表型之NOD-scid小鼠中IL2rg基因刪除產生的。這些小鼠缺乏成熟之T細胞、B細胞及功能性NK細胞，且巨噬細胞有缺陷。將PBS中1x10
5個Raji-Luc細胞靜脈注射到B-NDG小鼠體內。當螢光信號達到~1x10
6p/sec，小鼠開始腹腔注射試驗抗體或對照IgG (每組N=6)，每週2次共4個劑量。每週測量兩次螢光信號及體重，直至研究結束。如果觀察到運動障礙(如後肢癱瘓)或體重減輕超過20%，則對小鼠實施安樂死。腫瘤生長抑制使用公式計算：TGI%=(1-TRTV/CRTV)x100%。TRTV及CRTV分別代表治療組及對照組在特定時間點之相對腫瘤體積。
如圖3A及表17A所示，在B-NDG/Raji-Luc小鼠系統模型中，TAC2204顯示在0.1 mg/kg劑量下腫瘤生長抑制99.6%。TY21446顯示在0.1 mg/kg劑量下腫瘤生長抑制81.8%。可活化抗體TY26294顯示在0.1 mg/kg及0.3 mg/kg劑量腫瘤生長抑制分別為87.4%及97.5%。因此，TAC2204、TY21446及TY26294在B-NDG/Raji-Luc小鼠系統模型中顯示出相當之抗腫瘤功效。在獨立研究中(圖3B及表17B)，TAC2204及親本抗體TY21446在0.3 mg/kg，以及可活化抗體TY26294在1 mg/kg表現出完全之腫瘤抑制。
表17A. 第14天抗體在B-NDG/Raji-Luc小鼠系統模型中的腫瘤生長抑制；第一項獨立研究。
表17B. 第14天抗體在B-NDG/Raji-Luc小鼠系統模型中的腫瘤生長抑制；第二項獨立研究。
B-NDG/Raji小鼠實體瘤模型
| 抗體識別號 | 劑量 (mg/kg) | TGI (%) | P值 | ||
| vs 同型對照 | vs TAC2204 (0.1 mg/kg) | vs TAC2407 (0.1 mg/kg) | |||
| TY21446 | 0.03 | 12.5% | p＜0.01 | ||
| 0.1 | 81.8% | p＜0.0001 | ns | ns | |
| TY26294 | 0.03 | 9.6% | ns | ||
| 0.1 | 87.4% | p＜0.0001 | ns | ns | |
| 0.3 | 97.5% | p＜0.0001 | |||
| TAC2204 | 0.03 | 54.6% | p＜0.01 | ||
| 0.1 | 99.6% | p＜0.0001 | ns | ||
| TAC2407 | 0.1 | 70.1% | p＜0.001 | ns | |
| 同型對照 | 0.3 | 0.0% |
| 抗體識別號 | 劑量(mg/kg) | TGI (%) | P值 |
| vs 同型對照 | |||
| TY21446 | 0.3 | 100.0% | p＜0.0001 |
| 1 | 100.0% | p＜0.0001 | |
| TY26294 | 1 | 100.0% | p＜0.0001 |
| 10 | 100.0% | p＜0.0001 | |
| TAC2204 | 0.3 | 100.0% | p＜0.0001 |
| 1 | 100.0% | p＜0.0001 | |
| 同型對照 | 1 | 0.0% |
藉由在B-NDG小鼠(Biocytogen)中皮下接種Raji細胞測試抗體活體內抗腫瘤功效。將PBS中5x10
5個Raji-Luc細胞皮下注射到B-NDG小鼠活體內。當腫瘤體積達到~100 mm
3，小鼠開始腹腔注射試驗抗體或對照IgG (每組N=5)，每週2次共6個劑量。每週測量兩次腫瘤體積及體重，直至研究結束。如果觀察到腫瘤體積大於3000 mm
3、運動障礙(如後肢癱瘓)或體重減輕超過20%，則對小鼠實施安樂死。腫瘤生長抑制使用公式計算：TGI%=(1-TRTV/CRTV)x100%。TRTV及CRTV分別代表治療組及對照組在特定時間點之相對腫瘤體積。
如圖4A及表18A所示，在小鼠實體瘤模型中，親本抗體TY21446與TAC2204顯示出相當之抗腫瘤功效。所有抗體在3 mg/kg下部分抑制腫瘤生長，且在10 mg/kg下幾乎完全抑制腫瘤生長。在獨立研究中(圖4B)也觀察到TY21446與TAC2204具有相似之抗腫瘤功效。如表18B所示，可活化抗體TY26294在10 mg/kg及30 mg/kg下與TAC2204及親本抗體TY21446在10 mg/kg下之腫瘤生長抑制相當。
表18A. 第17天抗體在B-NDG/Raji-Luc皮下模型中的腫瘤生長抑制；第一項獨立研究。
表18B. 第17天抗體在B-NDG/Raji-Luc皮下模型中的腫瘤生長抑制；第二項獨立研究。
SCID/Raji-Luc小鼠系統模型
| 抗體識別號 | 劑量 (mg/kg) | TGI (%) | P值 | ||
| vs PBS | vs TAC2204 (3 mg/kg) | vs TAC2204 (10 mg/kg) | |||
| TAC2204 | 3 | 44.2% | p＜0.01 | ||
| 10 | 101.6% | p＜0.0001 | |||
| TY21446 | 3 | 25.0% | p＜0.05 | ns | |
| 10 | 97.5% | p＜0.0001 | ns | ||
| PBS | - | 0.0% |
| 抗體識別號 | 劑量 (mg/kg) | TGI (%) | P值 | |||
| vs 同型對照 | vs TAC2204 (3 mg/kg) | vs TAC2204 (10 mg/kg) | Vs TAC2407 (10 mg/kg) | |||
| TAC2204 | 3 | 33.0% | p＜0.05 | |||
| 10 | 56.0% | p＜0.001 | ns | |||
| TY21446 | 3 | 24.0% | ns | p＜0.01 | ||
| 10 | 45.0% | p＜0.001 | ns | ns | ||
| TY26294 | 10 | 45.0% | p＜0.001 | p＜0.05 | ns | |
| 30 | 42% | p＜0.01 | ||||
| TAC2407 | 10 | 48% | p＜0.001 | ns | ||
| 同型對照 | 10 | 0% |
藉由在CB17 SCID小鼠(Biocytogen)中接種表達螢光素酶(Raji-Luc)之Raji細胞測試抗體活體內抗腫瘤功效。CB17 SCID小鼠缺少功能性T細胞、B細胞，但具有正常之NK細胞、巨噬細胞及粒細胞。將PBS中5x10
5個Raji-Luc細胞靜脈注射到CB17 SCID小鼠活體內。當螢光信號達到~1x10
6p/sec，小鼠開始腹腔注射試驗抗體或對照IgG (每組N=8)，每週2次共4個劑量。每週測量兩次螢光信號及體重，直至研究結束。如果觀察到運動障礙(如後肢癱瘓)或體重減輕超過20%，則對小鼠實施安樂死。腫瘤生長抑制使用公式計算：TGI%=(1-TRTV/CRTV)x100%。TRTV及CRTV分別代表治療組及對照組在特定時間點的相對腫瘤體積。
如圖5及表19所示，在SCID/Raji-Luc小鼠系統模型中，在0.03 mg/kg劑量下TAC2204及親本抗體TY21446、TY26896及TY26897顯示出相當之抗腫瘤功效。可活化抗體TY26294在0.03~0.1 mg/kg劑量範圍內未顯示有效性。可活化抗體TY26898及TY26899在0.1 mg/kg劑量下分別顯示81.2%及91.8%之腫瘤生長抑制。
表19. 第13天抗體在SCID/Raji-Luc小鼠系統模型中的腫瘤生長抑制。
實例12. 抗CD47抗體對小鼠毒性研究
| P值 | ||||||
| 抗體識別號 | 劑量 (mg/kg) | TGI (%) | vs 同型對照 | vs TAC2204 (0.03 mg/kg) | vs TY26294 (0.03 mg/kg) | vs TY26294 (0.1 mg/kg) |
| TY21446 | 0.03 | 89.7% | p＜0.0001 | ns | ||
| TY26294 | 0.03 | -20.7% | ns | p＜0.0001 | ||
| 0.1 | -26.7% | ns | p＜0.0001 | |||
| TY26896 | 0.03 | 95.6% | p＜0.0001 | ns | ||
| TY26898 | 0.01 | 7.6% | ns | |||
| 0.03 | 8% | ns | p＜0.0001 | ns | p＜0.0001 | |
| 0.1 | 81% | p＜0.0001 | ns | |||
| TY26897 | 0.03 | 87% | p＜0.0001 | ns | ||
| TY26899 | 0.01 | 48.60% | ns | |||
| 0.03 | 39.70% | ns | p＜0.0001 | p＜0.0001 | p＜0.0001 | |
| 0.1 | 91.80% | p＜0.0001 | ns | |||
| TAC2204 | 0.03 | 99.30% | p＜0.0001 | |||
| TAC2407 | 0.03 | 66.30% | p＜0.01 | ns | ||
| 同型對照 | 0.3 | 0% |
藉由B-hSIRPα/hCD47人源化小鼠(Biocytogen)測試TY21446之毒性。對5~8周齡雌性小鼠腹腔注射TAC2204、TY21446或PBS (每組N=5)。在給藥前、第1天、第3天、第5天、第7天、第9天及第11天監測周圍血中RBC及血紅蛋白水準。如果觀察到運動障礙(如後肢癱瘓)或體重減輕超過20%，則對小鼠實施安樂死。
如圖6A-6B所示，在相同劑量水準下基準對照TAC2204及TY21446表現出相似之周圍血RBC數量(圖6A)及血紅蛋白濃度(圖6B)降低。
實例13. 抗CD47抗體毒性及藥物動力學研究 食蟹猴中之毒性及藥物動力學
在食蟹猴中進行單次劑量研究。將12只雄性食蟹猴分成12組(每組1只動物)。動物靜脈投與TAC2204 (10 mg/kg)、TY21446 (10 mg/kg)、TY26294 (10、30及60 mg/kg)、TY26896 (10 mg/kg)、TY26898 (10、30及60 mg/kg)、TY26897 (10 mg/kg)或TY26899 (10及30 mg/kg) (表20A)。定期在籠旁觀察總體健康狀況及外觀。收集總藥物在給藥前(第-7天、第-3天及第0天)、第2天、第4天、第7天、第10天、第14天及第21天之血液學及血液化學血液樣本。收集給藥前(0h)、0.5h、3h、8h、24h、第2天、第3天、第4天、第7天、第14天及第21天之藥物動力學血漿樣本。藉由山羊抗人類IgG抗體(SouthernBiotech)捕獲抗體，並藉由經HRP標記之山羊抗人類IgG (Fab特異性)抗體(Sigma)檢測抗體。研究結果如圖7A-7E所示。
表20A. 食蟹猴中單次劑量毒性研究分組及劑量。
| 抗體標識號 | 動物數量 | 劑量水準 | 劑量策略 |
| TAC2204 | 1 雄性 | 10 mg/kg | 單次IV |
| TY21446 | 1 雄性 | 10 mg/kg | 單次IV |
| TY26294 | 1 雄性 | 10 mg/kg | 單次IV |
| TY26294 | 1 雄性 | 30 mg/kg | 單次IV |
| TY26294 | 1 雄性 | 60 mg/kg | 單次IV |
| TY26896 | 1 雄性 | 10 mg/kg | 單次IV |
| TY26898 | 1 雄性 | 10 mg/kg | 單次IV |
| TY26898 | 1 雄性 | 30 mg/kg | 單次IV |
| TY26898 | 1 雄性 | 60 mg/kg | 單次IV |
| TY26897 | 1 雄性 | 10 mg/kg | 單次IV |
| TY26899 | 1 雄性 | 10 mg/kg | 單次IV |
| TY26899 | 1 雄性 | 30 mg/kg | 單次IV |
在早期注射抗體後，除一隻注射10 mg/kg劑量之TY26897動物外，所有動物總體健康及外觀正常。一隻注射10 mg/kg劑量之TY26897動物在給藥後5天死亡，如圖7A-7B所示，這可能是由於迴圈RBCs及HGB之嚴重損失造成。
如圖7A-7B所示，在食蟹猴中單次投與10 mg/kg之TAC2204、TY21446及TY26896導致的RBC及HGB減少類似。單次投與TY26897會導致嚴重之RBC及HGB減少，且動物在第5天時死亡。與基準TAC2204及親本抗體TY21446相比，在10、30及60 mg/kg下，TY26294表現出較少之RBC及HGB減少。在10 mg/kg下TAC2204引起~49%之RBCs最大下降，在60 mg/kg下TY26294顯示~23%之RBCs最大下降(圖7A)。單次投與TY26898顯示劑量依賴性血液毒性。在10及30 mg/kg下，TY26898與相同劑量下之TAC2204、TY21446及TY26896相比，引起較小之RBC及HGB減少，然而60 mg/kg下之TY26898與10 mg/kg下之TAC2204、TY21446及TY26896相比會引起更強的RBC及HGB減少。單藥投與10及30 mg/kg之TY26899與10 mg/kg之TAC2204、TY21446及TY26896的RBC及HGB減少類似。總之，可活化抗體TY26294、TY26898及TY26899與基準TAC2204及親本抗體相比顯示出更好的血液安全特性。
抗CD47抗體在食蟹猴活體內之藥物動力學特性如圖7F所示。藉由非隔室分析(NCA)評估測試分子在食蟹猴中之血漿PK特性。在單次靜脈注射後，所有三種可活化抗CD47抗體之計算半衰期(例如，在≥10 mg/kg劑量≥5天)通常比其親本抗體(例如，＜1天)增加10倍以上。當劑量為10 mg/kg時，TY26898之曲線下面積(AUC)比TY26896增加了20倍，而當劑量為10 mg/kg時，TY26294之曲線下面積(AUC)比TY21446增加了約3倍。可活化抗CD47抗體之AUC
最後比較表明，與TY26898相比，TY26294在10及30 mg/kg時具有略微之AUC優勢(例如，70-80%之較高AUC)，但在60 mg/kg時沒有。此外，TAC2204在10 mg/kg劑量下具有約為1天之半衰期。與TAC2204相比，TY26898在10及30 mg/kg時AUC分別增加了~5-6倍及~2.5倍，而TY26294在10及30 mg/kg時AUC分別增加了~9-10倍及~4.4倍。
表20B. 投與不同劑量抗CD47抗體之半衰期及AUC值。
小鼠中藥物動力學
| 抗體 | 劑量(mg/kg) | 半衰期(天) | AUC 最後(時*μg/mL) |
| TAC2204 | 10 | 0.6 | 4395.0 |
| TY21446 | 10 | 0.8 | 12067.0 |
| TY26294 | 10 | 4.7 | 38026.5 |
| 30 | 6.4 | 131897.2 | |
| 60 | 8.2 | 120453.2 |
在CB17 SCID小鼠中進行單劑量藥物動力學(PK)研究(CB17 SCID，每個分子N=3)，血漿PK特性(總藥物濃度)如圖8所示。藉由ELISA法測定總藥物抗體濃度。用山羊抗人類IgG抗體(SouthernBiotech)捕獲抗體，用經HRP標記之山羊抗人類IgG (Fab特異性)抗體(Sigma)檢測抗體。藉由非隔室分析(NCA)評估測試分子在小鼠中之PK特性。
根據AUC
最後平均值，TY26898占TY26294的~70%，而與TY26294相比，TY26899的比例下降到~33%。這也反映在C
最後(336小時資料)中。根據平均AUC
inf，TY26898占TY26294的~81%，而與TY26294相比TY26899的百分比下降到17%。對於測量的C
最大值 ,3 小時，TY26898及TY26294之間沒有差異，而TY26899的平均值略低於TY26294 (例如~89%)。TY26898 (~18±2天)及TY26294 (~15±4天)之平均(SD)終端半衰期相似(P值=0.3)，在數值上略有差異。然而，TY26899之終端半衰期明顯縮短(~3.4±0.5天)。
實例14. 抗CD47抗體之順式/反式結合研究
對候選抗體在細胞表面之順式或反式結合CD47的偏好進行了測試。
在第一個研究中，經2,3,6,7-四氫-9-溴甲基-1氫，5氫-喹啉酮並(9,1-gh)香豆素(BMQC)標記之Jurkat細胞及經CFSE標記之Raji細胞與TAC2204、TY21446、陰性對照或陽性對照(CD3xCD20雙特異抗體)在37℃下孵育1小時。藉由流式細胞法檢測經螢光染料標記之Jurkat及Raji細胞的抗體介導交聯。研究結果如圖9A-9D所示。
在第二個研究中，用BMQC或CFSE標記人類RBCs。經BMQC標記之RBCs及經CFSE標記之RBCs混合後與TAC2204及TY21446在37℃下孵育4小時，然後藉由流式細胞法分析。研究結果如圖10A-10C所示。
在第三個研究中，人類RBCs與TAC2204、TAC2407、TY21446及TY26294在37℃下孵育4小時，然後藉由流式細胞法分析。藉由FSC-A/FSC-H門控策略測量RBCs之抗體介導交聯。研究結果如圖11A-11C所示。
如圖9A-11C所示，與CD47-陽性腫瘤細胞(圖9D)及人類紅血球陰性對照相比，TAC2204增加了細胞聚類，表明細胞表面有反式結合。親本抗體TY21446 (hIgG4 Fc格式)在腫瘤細胞(圖9C)及人類RBCs (圖10B-10C及圖11B-11C)未表現出細胞聚類增加，表明細胞表面有順式結合。可活化抗體TY26294 (hIgG1 Fc格式)在人類RBCs (圖10B-10C及圖11B-11C)未表現出細胞聚類增加，可能是由於掩蔽部分及順式結合聯用導致。
實例.15 抗CD47抗體與RBCs及CD47-陽性Raji腫瘤細胞之活體內結合
hSIRPα/hCD47基因敲入小鼠，藉由尾部靜脈及皮下注射Raji腫瘤細胞評估親本抗體TY21446、可活化抗體TY26294及基準分子TAC2204與小鼠血液細胞及Raji腫瘤細胞之活體內結合。在這些基因敲入小鼠中，小鼠CD47之胞外區域(ECD)用人類CD47替代；因此，人類CD47之ECD會在小鼠CD47表達的所有組織中表達，包括小鼠RBCs。腹腔注射TAC2204 (0.5、2.5或7.5 mg/kg)、TY21446 (0.5、2.5或7.5 mg/kg)或TY26294 (0.5、2.5或15 mg/kg)後，藉由受體佔有率(RO)評估抗體與RBCs、RBCs以外之血液細胞(「WBC」)、小鼠骨髓中之Raji腫瘤細胞，及皮下腫瘤中之Raji腫瘤細胞的體內結合。簡要來說，在給藥後4、24或72小時，收集小鼠全血樣本，在給藥後72小時，收集小鼠骨髓樣本及皮下腫瘤。小鼠全血稀釋、洗淨並分成3等份。或者，將小鼠全血進行RBC裂解(製備「WBC」)，剩餘細胞清洗並分成3等份。小鼠骨髓細胞洗淨並分成3等份。從皮下腫瘤中製備單細胞懸浮液並分成3等份。針對每種組織類型，第一份未用測試抗體染色，第二份與10 nM之人類IgG4同型對照在37℃下孵育30分鐘，第三份與10 nM之TY21446或TAC2204在37℃下孵育30分鐘。第二及第三等份隨後用小鼠抗hCD20抗體及經APC標記之抗人類IgG二抗孵育。藉由CytoFLEX流式細胞儀(Beckman Coulter)分析樣品，且資料藉由FlowJo軟體分析。每種組織細胞之RO比率計算方法為：目標群體中第二種類型之平均螢光強度(MFI)減去第一種類型之MFI，再除以第三種類型之MFI減去第一種類型之MFI。
TAC2204及親本抗體TY21446與hCD47基因敲入小鼠RBCs之結合以時間及劑量依賴方式觀察到，RO在測試之最高劑量時接近100% (圖12A)。另一方面，可活化抗體TY26294在體內未與RBCs結合，並且所有劑量及時間點之RO均低於5% (圖12A)。相似地，圖12B顯示TAC2204及親本抗體TY21446與小鼠WBC之結合以時間及劑量依賴方式增加，而可活化抗體TY26294與這些小鼠細胞極少結合。經TAC2204-治療及經TY21446親本-治療之小鼠RBC及血液細胞活力數與TY26294可活化抗體-治療之動物相比顯著降低(圖12E，表21)，這與未掩蔽之抗CD47抗體與RBCs結合導致RBC計數下降的觀點一致。引起關注的是，在骨髓及皮下腫瘤腫瘤細胞上，可活化抗體TY26294之RO高於TAC2204及親本抗體TY21446。圖12C及12D顯示，與TAC2204及親本抗體TY21446相比，TY26294與小鼠骨髓中Raji細胞及皮下腫瘤的Raji細胞表現出更高之結合。
表21. 注射抗CD47抗體在小鼠樣本中血液細胞活性及全血細胞計數。
實例16. 抗CD47抗體之初步人體藥物動力學及劑量預測
| 組別 | 血液細胞活性(%) | 全血細胞計數(x10 12/L) | ||||
| 7.5 mg/kg TY21446 | 81.5 | 85.4 | 86.0 | 2.70 | 5.18 | 3.85 |
| 15 mg/kg TY26294 | 93.3 | 94.7 | 94.2 | 11.05 | 10.48 | 11.80 |
| 7.5 mg/kg TAC2204 | 84.7 | 85.6 | 88.3 | 8.10 | 5.55 | 4.85 |
人體藥物動力學(PK)參數(例如清除率、分佈體積及半衰期)藉由基於體重之異常標度法從食蟹猴的PK (僅為總PK)中預測。(Mahmood, 2021. "A Single Animal Species-Based Prediction of Human Clearance and First-in-Human Dose of Monoclonal Antibodies: Beyond Monkey." Antibodies 10.3: 35.)。考慮到TY26898或TY26294在食蟹猴單次靜脈給藥10至60 mg/kg後之終末半衰期≥5天，預計患者之最小給藥頻率為Q2W (每兩週一次)，而Q3W (每三週一次)給藥可能是可以實現的。重複劑量PK將在食蟹猴中完成，這可以進一步說明任何潛在之以PK為基礎的TY26898或TY26294與其他抗CD47分子的給藥優勢。基於機制之建模與模擬(M&S)使用了各種當前可獲得的體外(例如ADCC，ADCP)及體內(例如小鼠功效)資料，利用方法(如基於受體佔有率之方法；體外實驗中基於PK之靶向特定濃度的方法)用於其他抗CD47藥物。將行業標準軟體，例如Phoenix
®WinNonlin
®、NONMEM
®7.5及GraphPad Prism用於M&S。TY26898之預測潛在有效劑量≤10 mg/kg (Q2W或Q3W劑量取決於人體PK預測)，安全性由起始單劑量食蟹猴毒理學資料支援。根據目前之毒理學資料，首次人體起始劑量可能低至~0.6 mg/kg，並可能在未來食蟹猴重複劑量毒理學研究確定未觀察到不良反應水準(NOAEL)後增加。這將允許快速劑量遞增(例如，2-3個群組)以達到起始劑量在潛在有效劑量範圍內。
實例17. 表位作圖
為了確定TY21446在胺基酸殘基水準上之結合區域，製備了一系列之人類CD47突變體(表22)。藉由流式細胞分析TY21446與人類CD47突變體之結合。結果匯總在表22。資料顯示TY21446直接與人類CD47之C至C’區域(39K、40W、41K、50F、51D及52G)的39-41及50-52胺基酸殘基結合，並且與FG區(99T、100E、101L及102T)之99-102胺基酸殘基結合(表22)。如圖13A-13B所示，TY21446與人類CD47之結合區域定位至人類CD47晶體結構上，根據莫洛利單抗及SIRPα與人類CD47之複合物晶體結構將它們的接觸區域也定位至人類CD47。與莫洛利單抗相比，TY21446結合至獨特之表位。TY21446之表位與SIRPα部分重疊，而莫洛利單抗與SIRPα之表位大面積重疊。
表21. TY21446與人類CD47突變體之結合；「+」代表結合，「-」代表未結合。
| 突變 | TY21446 | 突變 | TY21446 |
| LL2AA | - | IY47AA | - |
| NK5AA | - | FD50AA | + |
| EF11AA | - | DG51AA | + |
| VT25AA | - | NK55AA | - |
| TN26AA | - | ST57AA | - |
| NME27AAA | - | TD61AA | - |
| ME28AA | - | FS63AA | - |
| QN31AA | - | LK74AA | - |
| TE34AA | - | TE99AA | + |
| KW39AA | + | EL100AA | + |
| WK40AA | + | LT101AA | + |
| FK42AA | - | RE103AA | - |
| RD45AA | - | ET106AA | - |
由於莫洛利單抗之結合表位與SIRPα及CD47的結合表位相似，這表明莫洛利單抗可能以將兩個錨定蛋白在兩個不同之細胞上結合在一起的反式方式結合，類似於SIRPα與CD47之反式結合，而TY21446則不同，可能是順式形式(參見實施例14，反式及順式結合模式及圖之定義)。
實例18. 在B-NDG hCD47/hSIRPα轉基因小鼠MDA-MB-231 TNBC異種移植模型中正常組織及腫瘤的CD47受體佔有率(RO)
B-NDG hCD47/hSIRPα轉基因小鼠來自Biocytogen。將MDA-MB-231三陰性乳癌(TNBC)細胞皮下接種於小鼠右上腹。當腫瘤體積平均達到約200 mm
3時，將小鼠分組，然後給予三個劑量之PBS、TY26898或TAC2204。在第一次及第二次給藥後24小時，采血進行血細胞計數、活力及CD47 RO分析。在第三次給藥後24小時及72小時，採集RBC、骨髓、脾臟、腎臟、肝臟及腫瘤並且處死小鼠。將這些組織分離成單細胞進行CD47 RO分析。如圖14A-14B所示，與TAC2204相比，掩蔽抗體TY26898在靶標腫瘤組織中RO增加，在脫靶組織中RO減少。此外，與TAC2204相比，TY26898治療降低了脫靶結合引起之毒性，這可以藉由與TAC2204相比之總血細胞計數及血細胞活力增加來證明(圖14C-14D)。
實例19. TY26898在轉基因實體瘤模型中的活體內功效及受體佔有率(RO)
藉由CB17 SCID小鼠OE19 HER2+胃食管交界部(GEJ)癌、MDA-MB-231 TNBC、SHP-77小細胞肺癌(SCLC)及OV90卵巢癌異種移植模型及OE19 HER2+ GEJ癌異種移植模型評估TY26898之活體內抗腫瘤功效(圖15A-15E)。還藉由SHP-77 SCLC模型評估了TY26896之活體內抗腫瘤功效(圖15C)。當腫瘤體積平均達到70-80 mm
3時，每週兩次(BIW)給予小鼠腹腔注射。每週測量兩次腫瘤體積及體重，直到研究結束。當腫瘤體積超過2000 mm
3或體重減輕超過20%時，則對小鼠實施安樂死。在所有評估之癌症模型中，TY26898治療可抑制腫瘤生長(圖15A-15E)。此外，在MDA-MB-231 TNBC及SHP-77 SCLC模型中，與TAC2204相比，TY26898表現出更強之腫瘤生長抑制作用(圖15B及15C)。在SCLC模型中，與TAC2204相比，TY26896也顯示出明顯之腫瘤生長抑制(圖15C)。
在實體瘤模型功效研究之最後一次給藥72小時後，收集腫瘤並分離成腫瘤單細胞。將腫瘤單細胞分成兩部分，分別用TY26898、TAC2204或同型抗體染色，然後用APC-抗人類IgG二抗染色。藉由流式細胞儀分析染色樣品，然後計算CD47 RO值(圖16A-16B)。如圖16A所示，在OE19模型、MDA-MB-231及OV90模型中，TY26898與TAC2204之RO相當。
實例20. TY26898在不同實體瘤轉基因模型之裂解
在上述圖15A及15D之功效研究中最後一個劑量後72小時，收集腫瘤並冷凍保存。隨後，將腫瘤在RIPA緩衝液中均質並提取蛋白。取總蛋白2 mg並用蛋白A富集人類IgG。所有富集蛋白樣品在還原性SDS-PAGE凝膠中運行。用相應的一抗及二抗檢測人類IgG的重鏈及輕鏈。將200 ng完整或裂解之TY26898加入空白腫瘤樣品中，處理方法與腫瘤樣品相同，並且與測試腫瘤樣品作為對照一起運行。如圖17A-17B所示，在OE19型模型中有約15%-25%之TY26898裂解，OV90模型中有約20%-25% TY26898裂解。
無
本申請可藉由參考下列描述並結合附圖來理解。
圖1描述所示抗體誘導人類RBC凝集能力。
圖2描述與所示抗體共同孵育之不同供體的經鈣黃綠素標記的CEM細胞上的人類NK細胞的ADCC活性。細胞裂解百分數以細胞毒性百分數展示。
圖3A及圖3B描述在兩個獨立實驗中抗體或同型對照在B-NDG/Raji-Luc小鼠系統模型中之活體內抗腫瘤功效。資料點代表組均值；誤差條表示標準差。圖3A描述第一個獨立實驗。圖3B描述第二個獨立實驗。
圖4A及圖4B描述抗體或同型對照在B-NDG/Raji小鼠皮下腫瘤模型中之活體內抗腫瘤功效。資料點代表組均值；誤差條表示標準差。圖4A描述第一個獨立實驗。圖4B描述第二個獨立實驗。
圖5描述抗體或同型對照在SCID/Raji-Luc小鼠系統模型中之活體內抗腫瘤功效。資料點代表組均值；誤差條表示標準差。
圖6A-6B顯示所示抗體對B-hSIRPα/hCD47人源化小鼠之血液系統毒性。圖6A為單次腹腔注射抗體前後周圍血RBC數量之變化情況。圖6B為單次腹腔注射抗體前後周圍血血紅蛋白水準之變化情況。
圖7A-7F描述食蟹猴單次靜脈注射所示抗體後食蟹猴血液系統毒性及藥物動力學。圖7A展示給藥後RBC百分比之變化。圖7B展示給藥後血紅蛋白百分比之變化。圖7C展示給藥後網狀紅血球百分比之變化。圖7D展示給藥後血容比之變化。圖7E展示給藥後血小板百分比之變化。圖7F展示食蟹猴以指定劑量靜脈注射食蟹猴所示抗體之血濃度。
圖8描述CB17-SCID小鼠以指定劑量靜脈注射所示抗體之血漿濃度。
圖9A-D描述藉由流式細胞儀檢測經CFSE標記之Raji細胞及經BMQC標記之Jurkat細胞聚類。圖9A描述給予陰性同型對照及陰性緩衝對照之CFSE-Raji細胞及BMQC-Jurkat細胞的聚類，並說明瞭抗體與細胞之反式結合及順式結合的概念。圖9B描述給予已知反式結合CFSE-Raji細胞及BMQC-Jurkat細胞之陽性對照時CFSE-Raji細胞及BMQC-Jurkat細胞的聚類。圖9C描述給予抗CD47抗體TY21446時CFSE-Raji細胞及BMQC-Jurkat細胞之聚類。圖9D描述給予抗CD47基準對照抗體TAC2204時CFSE-Raji細胞及BMQC-Jurkat細胞之聚類。
圖10A-C描述藉由流式細胞儀檢測經螢光染料標記之人類RBCs的聚類。圖10A描述藉由流式細胞方法門控策略確定CFSE-RBCs及BMQC-RBCs之聚類。圖10B及圖10C描述使用來自兩種不同供體RBCs展示試驗抗體對人類RBC聚類之影響。
圖11A-C描述流式細胞儀檢測人類RBCs之聚類。圖11A描述藉由流式細胞方法FSC-H/FSC-A門控策略確定聚集紅血球之情況。圖11B及圖11C描述使用來自兩種不同供體RBCs展示試驗抗體對RBC聚類之影響。
圖12A-E描述抗CD47抗體在與表達人類CD47細胞外結構域(ECD)之hSIRPα/hCD47基因敲入小鼠活體內結合的受體佔有率(RO)，hSIRPα/hCD47基因敲入小鼠注射了Raji腫瘤細胞。圖12A及圖12B分別為不同劑量及時間下注射所示抗體後，所示抗體與紅血球(RBCs)及RBCs以外之血細胞(WBC)結合的RO比率。圖12C顯示注射所示抗體72小時後採集之皮下腫瘤樣本中所示抗體與Raji細胞結合的RO比率。圖12D顯示注射所示抗體72小時後獲得之小鼠骨髓中所示抗體與Raji細胞結合的RO比率。圖12E顯示注射所示抗體72小時後小鼠每升血細胞之總數。括弧中帶雙星號(**)表示兩個樣本在p＜0.01時差異顯著，括弧中帶「ns」表示兩個樣本差異不顯著。
圖13A-13B描述SIRPα、莫洛利單抗及TY21446與人類CD47結合表位殘基之定位。圖13A描述人類CD47之晶體結構及SIRPα、莫洛利單抗及TY21446與人類CD47結合的表位殘基，灰色陰影區。圖13B描述SIRPα、莫洛利單抗及TY21446與人類CD47結合之特定殘基，灰色陰影區。
圖14A-14D描述TAC2204及TY26898之CD47受體佔有率(RO)及其對血細胞計數及活力之影響。圖14A描述在經每種抗體給藥之小鼠組織中TAC2204及TY26898的CD47受體佔有率。圖14B描述在經每種抗體給藥之小鼠組織中TAC2204對比TY26898的相對CD47受體佔有率。圖14C描述取自經TAC2204及TY26898給藥之小鼠血液中的總血細胞計數。圖14D描述取自經TAC2204及TY26898給藥之小鼠血液中血細胞活力。
圖15A-15D描述TY26898、TY26896、TAC2204或同型對照在不同癌症模型中之活體內抗腫瘤功效。資料點代表組均值；誤差條表示平均值之標準誤差。圖15A描述TY26898及TAC2204在CB17 SCID小鼠OE19 HER2+ GEJ癌症異種移植模型中之活體內腫瘤抑制作用，赫賽汀為陽性對照，媒劑為陰性對照。圖15B描述TY26898及TAC2204在CB17 SCID小鼠MDA-MB-231三陰性乳癌(TNBC)異種移植瘤模型中之活體內腫瘤抑制作用，PBS為陰性對照。圖15C描述TY26898、TY26896及TAC2204在CB17 SCID小鼠SHP-77小細胞肺癌(SCLC)異種移植模型中之活體內腫瘤抑制作用，PBS為陰性對照。圖15D描述TY26898及TAC2204在CB17 SCID小鼠OV90卵巢癌異種移植瘤模型中之活體內腫瘤抑制作用，PBS為陰性對照。圖15E描述TY26898在OE19 HER2+ GEJ腫瘤模型中之活體內腫瘤抑制作用，PBS為陰性對照。
圖16A-16B描述TY26898在不同腫瘤模型中之CD47受體佔有率(RO)。圖16A描述在OE19 HER2+ GEJ腫瘤、MDA-MB-231 TNBC腫瘤及OV90卵巢腫瘤中TY26898及TAC2204之CD47受體佔有率。圖16B描述TY26898給藥劑量為3 mg/kg或10 mg/kg之小鼠OE19 HER2+ GEJ腫瘤中的CD47受體佔有率。
圖17A-17B描述從先前使用TY26898治療之小鼠中提取的腫瘤中裂解及完整TY26898的蛋白免疫印記及比例。圖17A描述先前使用TY26898治療之小鼠OE19 HER2+ GEJ腫瘤中裂解及完整的TY26898。圖17B描述先前使用TY26898治療之小鼠OV90卵巢腫瘤中裂解及完整的TY26898。
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Claims (144)
- 一種經遮蔽抗體，其包含： (a) 遮蔽性肽，其自N端至C端包含遮蔽性部分(MM)及連接部分(LM)； (b) 靶結合部分(TBM)，其包含抗體重鏈可變區(VH)及抗體輕鏈可變區(VL)，其中TBM與人類CD47結合；且 (c) 人類IgG1 Fc區，或具有增強之抗體依賴性細胞毒性(ADCC)活性之IgG Fc區， 其中遮蔽性肽與VH或VL之N端相連，且 其中MM與人類CD47競爭結合TBM。
- 如請求項1之經遮蔽抗體，其中經遮蔽抗體包含第一多肽，第二多肽，第三多肽及第四多肽，其中： a) 第一多肽包含自N端至C端包含遮蔽性肽及VL之輕鏈； b) 第二多肽包含自N端至C端包含VH及第一人類IgG1 Fc結構域之重鏈； c) 第三多肽包含自N端至C端包含遮蔽性肽及VL之輕鏈；且 d) 第四多肽包含自N端至C端包含VH及第二人類IgG1 Fc結構域之重鏈。
- 一種經遮蔽抗體，其包含： (a) 遮蔽性肽，其自N端至C端包含遮蔽性部分(MM)及連接部分(LM)，且 (b) 靶結合部分(TBM)，其包含抗體重鏈可變區(VH)及抗體輕鏈可變區(VL)，其中TBM與人類CD47結合； 其中遮蔽性肽與VH或VL之N端相連；且 其中MM與人類CD47競爭結合TBM； 其中： 1) VH包含第一互補決定區(CDR-H1)，第二互補決定區(CDR-H2)及第三互補決定區(CDR-H3)， 其中CDR-H1包含SEQ ID NO: 182或183之胺基酸序列； 其中CDR-H2包含SEQ ID NO: 184或185之胺基酸序列； 且其中CDR-H3包含選自由SEQ ID NOs: 186-189組成之群之胺基酸序列；及/或2) VL包含第一互補決定區(CDR-L1)，第二互補決定區(CDR-L2)及第三互補決定區(CDR-L3)， 其中CDR-L1包含選自由SEQ ID NOs: 190-193組成之群之胺基酸序列； 其中CDR-L2包含SEQ ID NO: 194之胺基酸序列；且 其中CDR-L3包含SEQ ID NO: 195或196之胺基酸序列。
- 如請求項1或3之經遮蔽抗體，其中： a) 經遮蔽抗體包含自N端至C端包含遮蔽性肽及VL之第一多肽，且包含VH之第二多肽；或 b) 經遮蔽抗體包含自N端至C端包含遮蔽性肽及VH之第一多肽，及包含VL之第二多肽；或 c) 經遮蔽抗體包含自N端至C端包含遮蔽性肽，VL及VH之第一多肽；或 d) 經遮蔽抗體包含自N端至C端包含遮蔽性肽，VH及VL之第一多肽。
- 如請求項3或4之經遮蔽抗體，其中： a) VH包含 包含SEQ ID NO: 182之胺基酸序列之CDR-H1， 包含SEQ ID NO: 185之胺基酸序列之CDR-H2，及 包含SEQ ID NO: 188之胺基酸序列之CDR-H3，且 b) VL包含 包含SEQ ID NO: 191之胺基酸序列之CDR-L1， 包含SEQ ID NO: 194之胺基酸序列之CDR-L2，及 包含SEQ ID NO: 195之胺基酸序列之CDR-L3。
- 如請求項3或4之經遮蔽抗體，其中： a) VH包含包含選自由SEQ ID NOs: 35-37及39-50組成之群之胺基酸序列之CDR-H1，包含選自由SEQ ID NOs: 52-54及56-67組成之群之胺基酸序列之CDR-H2，以及包含選自由SEQ ID NOs: 69-71及73-84組成之群之胺基酸序列之CDR-H3；且 b) VL包含包含選自由SEQ ID NOs: 86-88及89-101組成之群之胺基酸序列之CDR-L1，包含選自由SEQ ID NOs: 103-105及106-118組成之群之胺基酸序列之CDR-L2，及包含選自由SEQ ID NOs: 120-122及124-135組成之群之胺基酸序列之CDR-L3。
- 如請求項3或4之經遮蔽抗體，其中VH包含選自由SEQ ID NOs: 1、3、5、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29及31組成之群之胺基酸序列；及/或其中VL包含選自由SEQ ID NOs: 2、4、6、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30及32組成之群之胺基酸序列。
- 如請求項3或4之經遮蔽抗體，其中： a) VH包含 包含SEQ ID NO: 48之胺基酸序列之CDR-H1， 包含SEQ ID NO: 65之胺基酸序列之CDR-H2，及 包含SEQ ID NO: 82之胺基酸序列之CDR-H3；且 b) VL包含 包含SEQ ID NO: 99之胺基酸序列之CDR-L1， 包含SEQ ID NO: 116之胺基酸序列之CDR-L2，及 包含SEQ ID NO: 133之胺基酸序列之CDR-L3。
- 如請求項8之經遮蔽抗體，其中VH包含SEQ ID NO: 27之胺基酸序列，及/或VL包含SEQ ID NO: 28之胺基酸序列。
- 如請求項3或4之經遮蔽抗體，其中： a) VH包含 包含SEQ ID NO: 49之胺基酸序列之CDR-H1， 包含SEQ ID NO: 66之胺基酸序列之CDR-H2，及 包含SEQ ID NO: 83之胺基酸序列之CDR-H3；且 b) VL包含 包含SEQ ID NO: 100之胺基酸序列之CDR-L1， 包含SEQ ID NO: 117之胺基酸序列之CDR-L2，及 包含SEQ ID NO: 134之胺基酸序列之CDR-L3。
- 如請求項10之經遮蔽抗體，其中VH包含SEQ ID NO: 29之胺基酸序列，及/或VL包含SEQ ID NO: 30之胺基酸序列。
- 如請求項3或4之經遮蔽抗體，其中： a) VH包含 包含SEQ ID NO: 50之胺基酸序列之CDR-H1， 包含SEQ ID NO: 67之胺基酸序列之CDR-H2，及 包含SEQ ID NO: 84之胺基酸序列之CDR-H3；且 b) VL包含 包含SEQ ID NO: 101之胺基酸序列之CDR-L1， 包含SEQ ID NO: 118之胺基酸序列之CDR-L2，及 包含SEQ ID NO: 135之胺基酸序列之CDR-L3。
- 如請求項12之經遮蔽抗體，其中VH包含SEQ ID NO: 31之胺基酸序列，及/或VL包含SEQ ID NO: 32之胺基酸序列。
- 如請求項3或4之經遮蔽抗體，其中： a) VH包含 包含SEQ ID NO: 35之胺基酸序列之CDR-H1， 包含SEQ ID NO: 52之胺基酸序列之CDR-H2，及 包含SEQ ID NO: 69之胺基酸序列之CDR-H3；且 b) VL包含 包含SEQ ID NO: 86之胺基酸序列之CDR-L1， 包含SEQ ID NO: 103之胺基酸序列之CDR-L2，及 包含SEQ ID NO: 120之胺基酸序列之CDR-L3。
- 如請求項14之經遮蔽抗體，其中VH包含SEQ ID NO: 1之胺基酸序列，及/或VL包含SEQ ID NO: 2之胺基酸序列。
- 如請求項3或4之經遮蔽抗體，其中： a) VH包含 包含SEQ ID NO: 36之胺基酸序列之CDR-H1， 包含SEQ ID NO: 53之胺基酸序列之CDR-H2，及 包含SEQ ID NO: 70之胺基酸序列之CDR-H3；且 b) VL包含 包含SEQ ID NO: 87之胺基酸序列之CDR-L1， 包含SEQ ID NO: 104之胺基酸序列之CDR-L2，及 包含SEQ ID NO: 121之胺基酸序列之CDR-L3。
- 如請求項16之經遮蔽抗體，其中VH包含SEQ ID NO: 3之胺基酸序列，及/或VL包含SEQ ID NO: 4之胺基酸序列。
- 如請求項3或4之經遮蔽抗體，其中： a) VH包含 包含SEQ ID NO: 37之胺基酸序列之CDR-H1， 包含SEQ ID NO: 54之胺基酸序列之CDR-H2，及 包含SEQ ID NO: 71之胺基酸序列之CDR-H3；且 b) VL包含 包含SEQ ID NO: 88之胺基酸序列之CDR-L1， 包含SEQ ID NO: 105之胺基酸序列之CDR-L2，及 包含SEQ ID NO: 122之胺基酸序列之CDR-L3。
- 如請求項18之經遮蔽抗體，其中VH包含SEQ ID NO: 5之胺基酸序列，及/或VL包含SEQ ID NO: 6之胺基酸序列。
- 如請求項3或4之經遮蔽抗體，其中： a) VH包含 包含SEQ ID NO: 39之胺基酸序列之CDR-H1， 包含SEQ ID NO: 56之胺基酸序列之CDR-H2，及 包含SEQ ID NO: 73之胺基酸序列之CDR-H3；且 b) VL包含 包含SEQ ID NO: 90之胺基酸序列之CDR-L1， 包含SEQ ID NO: 107之胺基酸序列之CDR-L2，及 包含SEQ ID NO: 124之胺基酸序列之CDR-L3。
- 如請求項20之經遮蔽抗體，其中VH包含SEQ ID NO: 9之胺基酸序列，及/或VL包含SEQ ID NO: 10之胺基酸序列。
- 如請求項3或4之經遮蔽抗體，其中： a) VH包含 包含SEQ ID NO: 40之胺基酸序列之CDR-H1， 包含SEQ ID NO: 57之胺基酸序列之CDR-H2，及 包含SEQ ID NO: 74之胺基酸序列之CDR-H3；且 b) VL包含 包含SEQ ID NO: 91之胺基酸序列之CDR-L1， 包含SEQ ID NO: 108之胺基酸序列之CDR-L2，及 包含SEQ ID NO: 125之胺基酸序列之CDR-L3。
- 如請求項22之經遮蔽抗體，其中VH包含SEQ ID NO: 11之胺基酸序列，及/或VL包含SEQ ID NO: 12之胺基酸序列。
- 如請求項3或4之經遮蔽抗體，其中： a) VH包含 包含SEQ ID NO: 41之胺基酸序列之CDR-H1， 包含SEQ ID NO: 58之胺基酸序列之CDR-H2，及 包含SEQ ID NO: 75之胺基酸序列之CDR-H3；且 b) VL包含 包含SEQ ID NO: 92之胺基酸序列之CDR-L1， 包含SEQ ID NO: 109之胺基酸序列之CDR-L2，及 包含SEQ ID NO: 126之胺基酸序列之CDR-L3。
- 如請求項24之經遮蔽抗體，其中VH包含SEQ ID NO: 13之胺基酸序列，及/或VL包含SEQ ID NO: 14之胺基酸序列。
- 如請求項3或4之經遮蔽抗體，其中： a) VH包含 包含SEQ ID NO: 42之胺基酸序列之CDR-H1， 包含SEQ ID NO: 59之胺基酸序列之CDR-H2，及 包含SEQ ID NO: 76之胺基酸序列之CDR-H3；且 b) VL包含 包含SEQ ID NO: 93之胺基酸序列之CDR-L1， 包含SEQ ID NO: 110之胺基酸序列之CDR-L2，及 包含SEQ ID NO: 127之胺基酸序列之CDR-L3。
- 如請求項26之經遮蔽抗體，其中VH包含SEQ ID NO: 15之胺基酸序列，及/或VL包含SEQ ID NO: 16之胺基酸序列。
- 如請求項3或4之經遮蔽抗體，其中： a) VH包含 包含SEQ ID NO: 43之胺基酸序列之CDR-H1， 包含SEQ ID NO: 60之胺基酸序列之CDR-H2，及 包含SEQ ID NO: 77之胺基酸序列之CDR-H3；且 b) VL包含 包含SEQ ID NO: 94之胺基酸序列之CDR-L1， 包含SEQ ID NO: 111之胺基酸序列之CDR-L2，及 包含SEQ ID NO: 128之胺基酸序列之CDR-L3。
- 如請求項28之經遮蔽抗體，其中VH包含SEQ ID NO: 17之胺基酸序列，及/或VL包含SEQ ID NO: 18之胺基酸序列。
- 如請求項3或4之經遮蔽抗體，其中： a) VH包含 包含SEQ ID NO: 44之胺基酸序列之CDR-H1， 包含SEQ ID NO: 61之胺基酸序列之CDR-H2，及 包含SEQ ID NO: 78之胺基酸序列之CDR-H3；且 b) VL包含 包含SEQ ID NO: 95之胺基酸序列之CDR-L1， 包含SEQ ID NO: 112之胺基酸序列之CDR-L2，及 包含SEQ ID NO: 129之胺基酸序列之CDR-L3。
- 如請求項30之經遮蔽抗體，其中VH包含SEQ ID NO: 19之胺基酸序列，及/或VL包含SEQ ID NO: 20之胺基酸序列。
- 如請求項3或4之經遮蔽抗體，其中： a) VH包含 包含SEQ ID NO: 45之胺基酸序列之CDR-H1， 包含SEQ ID NO: 62之胺基酸序列之CDR-H2，及 包含SEQ ID NO: 79之胺基酸序列之CDR-H3；且 b) VL包含 包含SEQ ID NO: 96之胺基酸序列之CDR-L1， 包含SEQ ID NO: 113之胺基酸序列之CDR-L2，及 包含SEQ ID NO: 130之胺基酸序列之CDR-L3。
- 如請求項32之經遮蔽抗體，其中VH包含SEQ ID NO: 21之胺基酸序列，及/或VL包含SEQ ID NO: 22之胺基酸序列。
- 如請求項3或4之經遮蔽抗體，其中： a) VH包含 包含SEQ ID NO: 46之胺基酸序列之CDR-H1， 包含SEQ ID NO: 63之胺基酸序列之CDR-H2，及 包含SEQ ID NO: 80之胺基酸序列之CDR-H3；且 b) VL包含 包含SEQ ID NO: 97之胺基酸序列之CDR-L1， 包含SEQ ID NO: 114之胺基酸序列之CDR-L2，及 包含SEQ ID NO: 131之胺基酸序列之CDR-L3。
- 如請求項34之經遮蔽抗體，其中VH包含SEQ ID NO: 23之胺基酸序列，及/或VL包含SEQ ID NO: 24之胺基酸序列。
- 如請求項3或4之經遮蔽抗體，其中： a) VH包含 包含SEQ ID NO: 47之胺基酸序列之CDR-H1， 包含SEQ ID NO: 64之胺基酸序列之CDR-H2，及 包含SEQ ID NO: 81之胺基酸序列之CDR-H3；且 b) VL包含 包含SEQ ID NO: 98之胺基酸序列之CDR-L1， 包含SEQ ID NO: 115之胺基酸序列之CDR-L2，及 包含SEQ ID NO: 132之胺基酸序列之CDR-L3。
- 如請求項36之經遮蔽抗體，其中VH包含SEQ ID NO: 25之胺基酸序列，及/或VL包含SEQ ID NO: 26之胺基酸序列。
- 如請求項1至37中任一項之經遮蔽抗體，其中MM包含選自由SEQ ID NOs: 197-200組成之群之胺基酸序列。
- 如請求項38之經遮蔽抗體，其中MM包含選自由SEQ ID NOs: 137及167-181組成之群之胺基酸序列。
- 如請求項39之經遮蔽抗體，其中MM包含SEQ ID NO: 199之胺基酸序列。
- 如請求項40之經遮蔽抗體，其中MM包含SEQ ID NO: 137之胺基酸序列。
- 如請求項1至41中任一項之經遮蔽抗體，其中LM不包含包含至少一個裂解位點之可裂解部分(CM)。
- 如請求項1至42中任一項之經遮蔽抗體，其中經遮蔽抗體是可活化抗體。
- 如請求項43之經遮蔽抗體，其中LM包含包含至少一個裂解位點之可裂解部分(CM)，且其中可活化抗體在活體外CM裂解時比CM裂解前對人類CD47具有更高之結合親和力。
- 如請求項43或44之經遮蔽抗體，其中裂解位點為選自由以下蛋白酶之蛋白酶裂解位點組成之群：尿激酶型纖維蛋白溶酶原活化因數(uPA)、基質金屬蛋白酶-1 (MMP-1)、MMP-2、MMP-3、MMP-8、MMP-9、MMP-14、煙草蝕紋病毒(TEV)蛋白酶、胞漿素、凝血酶、因數X、PSA、PSMA、組織蛋白酶D、組織蛋白酶K、組織蛋白酶S、ADAM10、ADAM12、ADAMTS、卡斯蛋白酶-1、卡斯蛋白酶-2、卡斯蛋白酶-3、卡斯蛋白酶-4、卡斯蛋白酶-5、卡斯蛋白酶-6、卡斯蛋白酶-7、卡斯蛋白酶-8、卡斯蛋白酶-9、卡斯蛋白酶-10、卡斯蛋白酶-11、卡斯蛋白酶-12、卡斯蛋白酶-13、卡斯蛋白酶-14及TACE。
- 如請求項45之經遮蔽抗體，其中遮蔽性肽包含選自由SEQ ID NOs: 139及152-166組成之群之胺基酸序列。
- 如請求項45之經遮蔽抗體，其中CM包含由MMP-9裂解之MMP-9之裂解位點。
- 如請求項47之經遮蔽抗體，其中CM包含SEQ ID NO: 138之胺基酸序列。
- 如請求項48之經遮蔽抗體，其中遮蔽性肽包含SEQ ID NO: 139之胺基酸序列。
- 如請求項1至49中任一項之經遮蔽抗體，其中經遮蔽抗體包含自N端至C端包含遮蔽性肽及VL之第一多肽，及包含VH之第二多肽。
- 如請求項50之經遮蔽抗體，其中經遮蔽抗體包含人類IgG4可結晶(Fc)區。
- 如請求項51之經遮蔽抗體，其中經遮蔽抗體進一步包含第三多肽及第四多肽，且其中： a) 第一多肽包含自N端至C端包含遮蔽性肽及VL之輕鏈； b) 第二多肽包含自N端至C端包含VH及人類IgG4 Fc結構域之重鏈； c) 第三多肽包含自N端至C端包含遮蔽性肽及VL之輕鏈；且 d) 第四多肽包含自N端至C端包含VH及人類IgG4 Fc結構域之重鏈。
- 如請求項51或52之經遮蔽抗體，其中第一多肽包含自N端至C端包含遮蔽性肽及VL之輕鏈，其中第一多肽包含SEQ ID NO: 142之胺基酸序列；及其中第二多肽包含自N端至C端包含VH及人類IgG4 Fc結構域之重鏈，其中第二多肽包含SEQ ID NO: 143之胺基酸序列。
- 如請求項50之經遮蔽抗體，其中經遮蔽抗體包含人類IgG1 Fc區。
- 如請求項54之經遮蔽抗體，其中經遮蔽抗體進一步包含第三多肽及第四多肽，且其中： a) 第一多肽包含自N端至C端包含遮蔽性肽及VL之輕鏈； b) 第二多肽包含自N端至C端包含VH及人類IgG1 Fc結構域之重鏈； c) 第三多肽包含自N端至C端包含遮蔽性肽及VL之輕鏈；且 d) 第四多肽包含自N端至C端包含VH及人類IgG1 Fc結構域之重鏈；
- 如請求項54或55之經遮蔽抗體，其中第一多肽包含自N端至C端包含遮蔽性肽及VL之輕鏈，其中第一多肽包含SEQ ID NO: 148之胺基酸序列，及其中第二多肽包含自N端至C端包含VH及人類IgG1 Fc結構域之重鏈，其中第二多肽包含SEQ ID NO: 149之胺基酸序列。
- 如請求項54之經遮蔽抗體，其中人類IgG1 Fc區包含兩個Fc結構域，其中兩個Fc結構域中的每一個包含S239D取代及/或I332E取代。
- 如請求項57之經遮蔽抗體，其中經遮蔽抗體進一步包含第三多肽及第四多肽，且其中： a) 第一多肽包含自N端至C端包含遮蔽性肽及VL之輕鏈； b) 第二多肽包含自N端至C端包含VH及包含S239D取代及/或I332E取代之人類IgG1 Fc結構域之重鏈； c) 第三多肽包含自N端至C端包含遮蔽性肽及VL之輕鏈；且 d) 第四多肽包含自N端至C端包含VH及包含S239D取代及/或I332E取代之人類IgG1 Fc結構域之重鏈；
- 如請求項57或58之經遮蔽抗體，其中第一多肽包含自N端至C端包含遮蔽性肽及VL之輕鏈，其中第一多肽包含SEQ ID NO: 150之胺基酸序列，及其中第二多肽包含自N端至C端包含VH及人類IgG1 Fc結構域之重鏈，其中第二多肽包含SEQ ID NO: 151之胺基酸序列。
- 如請求項1至59中任一項之經遮蔽抗體，其中藉由Jurkat NFAT報告子分析測定，遮蔽性肽之遮蔽效率至少為50。
- 如請求項60之經遮蔽抗體，其中藉由Jurkat NFAT報告子分析測定，遮蔽性肽之遮蔽效率至少為100。
- 如請求項1至61中任一項之經遮蔽抗體，其中經遮蔽抗體與至少一種選自由食蟹猴、大鼠及狗組成之群之非人類物種之CD47多肽交叉反應。
- 如請求項62之經遮蔽抗體，其中經遮蔽抗體與食蟹猴CD47結合。
- 如請求項1至63中任一項之經遮蔽抗體，其中經遮蔽抗體與選自由人類CD47之K39、W40、K41、F50、D51、G52、T99、E100、L101及T102組成之群之一個或多個胺基酸殘基結合。
- 如請求項1至64中任一項之經遮蔽抗體，其中經遮蔽抗體不與選自由人類CD47之L2、L3、F4、K6、N27、E29、A30、Q31、T34、E35、V36、Y37、D46、T49、A53、E97、R103、E104、G105及E106組成之群之一個或多個胺基酸殘基結合。
- 如請求項1至65中任一項之經遮蔽抗體，其中經遮蔽抗體與人類CD47之K39、W40、K41、F50、D51、G52、T99、E100、L101及T102之胺基酸殘基結合。
- 如請求項1至66中任一項之經遮蔽抗體，其中經遮蔽抗體不與人類CD47之L2、L3、F4、K6、N27、E29、A30、Q31、T34、E35、V36、Y37、D46、T49、A53、E97、R103、E104、G105及E106之胺基酸殘基結合。
- 一種經分離之抗體或其抗原結合片段與人類CD47結合，其包含VH及VL，其中： 1) VH包含CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3， 其中CDR-H1包含SEQ ID NO: 182或183之胺基酸序列； 其中CDR-H2包含SEQ ID NO: 184或185之胺基酸序列；且 其中CDR-H3包含選自由SEQ ID NOs: 186-189組成之群之胺基酸序列；及/或 2) VL包含CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3， 其中CDR-L1包含選自由SEQ ID NOs: 190-193組成之群之胺基酸序列； 其中CDR-L2包含SEQ ID NO: 194之胺基酸序列；且 其中CDR-L3包含SEQ ID NO: 195或196之胺基酸序列。
- 如請求項68之經分離之抗體或其抗原結合片段，其中： a) VH包含 包含SEQ ID NO: 182之胺基酸序列之CDR-H1， 包含SEQ ID NO: 185之胺基酸序列之CDR-H2，及 包含SEQ ID NO: 188之胺基酸序列之CDR-H3；且 b) VL包含 包含SEQ ID NO: 191之胺基酸序列之CDR-L1， 包含SEQ ID NO: 194之胺基酸序列之CDR-L2，及 包含SEQ ID NO: 195之胺基酸序列之CDR-L3。
- 如請求項68之經分離之抗體或其抗原結合片段，其中： a) VH包含包含選自由SEQ ID NOs: 35-37及39-50組成之群之胺基酸序列之CDR-H1，包含選自由SEQ ID NOs: 52-54及56-67組成之群之胺基酸序列之CDR-H2，及包含選自由SEQ ID NOs: 69-71及73-84組成之群之胺基酸序列之CDR-H3；且 b) VL包含包含選自由SEQ ID NOs: 86-88及89-101組成之群之胺基酸序列之CDR-L1，包含選自由SEQ ID NOs: 103-105及106-118組成之群之胺基酸序列之CDR-L2，及包含選自由SEQ ID NOs: 120-122及124-135組成之群之胺基酸序列之CDR-L3。
- 如請求項68之經分離之抗體或其抗原結合片段，其中VH包含選自由SEQ ID NOs: 1、3、5、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29及31組成之群之胺基酸序列；及/或其中VL包含選自由SEQ ID NOs: 2、4、6、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30及32組成之群之胺基酸序列。
- 如請求項68之經分離之抗體或其抗原結合片段，其中： a) VH包含 包含SEQ ID NO: 48之胺基酸序列之CDR-H1， 包含SEQ ID NO: 65之胺基酸序列之CDR-H2，及 包含SEQ ID NO: 82之胺基酸序列之CDR-H3；且 b) VL包含 包含SEQ ID NO: 99之胺基酸序列之CDR-L1， 包含SEQ ID NO: 116之胺基酸序列之CDR-L2，及 包含SEQ ID NO: 133之胺基酸序列之CDR-L3。
- 如請求項72之經分離之抗體或其抗原結合片段，其中VH包含SEQ ID NO: 27之胺基酸序列，及/或VL包含SEQ ID NO: 28之胺基酸序列。
- 如請求項68之經分離之抗體或其抗原結合片段，其中： a) VH包含 包含SEQ ID NO: 49之胺基酸序列之CDR-H1， 包含SEQ ID NO: 66之胺基酸序列之CDR-H2，及 包含SEQ ID NO: 83之胺基酸序列之CDR-H3；且 b) VL包含 包含SEQ ID NO: 100之胺基酸序列之CDR-L1， 包含SEQ ID NO: 117之胺基酸序列之CDR-L2，及 包含SEQ ID NO: 134之胺基酸序列之CDR-L3。
- 如請求項74之經分離之抗體或其抗原結合片段，其中VH包含SEQ ID NO: 29之胺基酸序列，及/或VL包含SEQ ID NO: 30之胺基酸序列。
- 如請求項68之經分離之抗體或其抗原結合片段，其中： a) VH包含 包含SEQ ID NO: 50之胺基酸序列之CDR-H1， 包含SEQ ID NO: 67之胺基酸序列之CDR-H2，及 包含SEQ ID NO: 84之胺基酸序列之CDR-H3；且 b) VL包含 包含SEQ ID NO: 101之胺基酸序列之CDR-L1， 包含SEQ ID NO: 118之胺基酸序列之CDR-L2，及 包含SEQ ID NO: 135之胺基酸序列之CDR-L3。
- 如請求項76之經分離之抗體或其抗原結合片段，其中VH包含SEQ ID NO: 31之胺基酸序列，及/或VL包含SEQ ID NO: 32之胺基酸序列。
- 如請求項68之經分離之抗體或其抗原結合片段，其中： a) VH包含 包含SEQ ID NO: 35之胺基酸序列之CDR-H1， 包含SEQ ID NO: 52之胺基酸序列之CDR-H2，及 包含SEQ ID NO: 69之胺基酸序列之CDR-H3；且 b) VL包含 包含SEQ ID NO: 86之胺基酸序列之CDR-L1， 包含SEQ ID NO: 103之胺基酸序列之CDR-L2，及 包含SEQ ID NO: 120之胺基酸序列之CDR-L3。
- 如請求項78之經分離之抗體或其抗原結合片段，其中VH包含SEQ ID NO: 1之胺基酸序列，及/或VL包含SEQ ID NO: 2之胺基酸序列。
- 如請求項68之經分離之抗體或其抗原結合片段，其中： a) VH包含 包含SEQ ID NO: 36之胺基酸序列之CDR-H1， 包含SEQ ID NO: 53之胺基酸序列之CDR-H2，及 包含SEQ ID NO: 70之胺基酸序列之CDR-H3；且 b) VL包含 包含SEQ ID NO: 87之胺基酸序列之CDR-L1， 包含SEQ ID NO: 104之胺基酸序列之CDR-L2，及 包含SEQ ID NO: 121之胺基酸序列之CDR-L3。
- 如請求項80之經分離之抗體或其抗原結合片段，其中VH包含SEQ ID NO: 3之胺基酸序列，及/或VL包含SEQ ID NO: 4之胺基酸序列。
- 如請求項68之經分離之抗體或其抗原結合片段，其中： a) VH包含 包含SEQ ID NO: 37之胺基酸序列之CDR-H1， 包含SEQ ID NO: 54之胺基酸序列之CDR-H2，及 包含SEQ ID NO: 71之胺基酸序列之CDR-H3；且 b) VL包含 包含SEQ ID NO: 88之胺基酸序列之CDR-L1， 包含SEQ ID NO: 105之胺基酸序列之CDR-L2，及 包含SEQ ID NO: 122之胺基酸序列之CDR-L3。
- 如請求項82之經分離之抗體或其抗原結合片段，其中VH包含SEQ ID NO: 5之胺基酸序列，及/或VL包含SEQ ID NO: 6之胺基酸序列。
- 如請求項68之經分離之抗體或其抗原結合片段，其中： a) VH包含 包含SEQ ID NO: 39之胺基酸序列之CDR-H1， 包含SEQ ID NO: 56之胺基酸序列之CDR-H2，及 包含SEQ ID NO: 73之胺基酸序列之CDR-H3；且 b) VL包含 包含SEQ ID NO: 90之胺基酸序列之CDR-L1， 包含SEQ ID NO: 107之胺基酸序列之CDR-L2，及 包含SEQ ID NO: 124之胺基酸序列之CDR-L3。
- 如請求項84之經分離之抗體或其抗原結合片段，其中VH包含SEQ ID NO: 9之胺基酸序列，及/或VL包含SEQ ID NO: 10之胺基酸序列。
- 如請求項68之經分離之抗體或其抗原結合片段，其中： a) VH包含 包含SEQ ID NO: 40之胺基酸序列之CDR-H1， 包含SEQ ID NO: 57之胺基酸序列之CDR-H2，及 包含SEQ ID NO: 74之胺基酸序列之CDR-H3；且 b) VL包含 包含SEQ ID NO: 91之胺基酸序列之CDR-L1， 包含SEQ ID NO: 108之胺基酸序列之CDR-L2，及 包含SEQ ID NO: 125之胺基酸序列之CDR-L3。
- 如請求項86之經分離之抗體或其抗原結合片段，其中VH包含SEQ ID NO: 11之胺基酸序列，及/或VL包含SEQ ID NO: 12之胺基酸序列。
- 如請求項68之經分離之抗體或其抗原結合片段，其中： a) VH包含 包含SEQ ID NO: 41之胺基酸序列之CDR-H1， 包含SEQ ID NO: 58之胺基酸序列之CDR-H2，及 包含SEQ ID NO: 75之胺基酸序列之CDR-H3；且 b) VL包含 包含SEQ ID NO: 92之胺基酸序列之CDR-L1， 包含SEQ ID NO: 109之胺基酸序列之CDR-L2，及 包含SEQ ID NO: 126之胺基酸序列之CDR-L3。
- 如請求項88之經分離之抗體或其抗原結合片段，其中VH包含SEQ ID NO: 13之胺基酸序列，及/或VL包含SEQ ID NO: 14之胺基酸序列。
- 如請求項68之經分離之抗體或其抗原結合片段，其中： a) VH包含 包含SEQ ID NO: 42之胺基酸序列之CDR-H1， 包含SEQ ID NO: 59之胺基酸序列之CDR-H2，及 包含SEQ ID NO: 76之胺基酸序列之CDR-H3；且 b) VL包含 包含SEQ ID NO: 93之胺基酸序列之CDR-L1， 包含SEQ ID NO: 110之胺基酸序列之CDR-L2，及 包含SEQ ID NO: 127之胺基酸序列之CDR-L3。
- 如請求項90之經分離之抗體或其抗原結合片段，其中VH包含SEQ ID NO: 15之胺基酸序列，及/或VL包含SEQ ID NO: 16之胺基酸序列。
- 如請求項68之經分離之抗體或其抗原結合片段，其中： a) VH包含 包含SEQ ID NO: 43之胺基酸序列之CDR-H1， 包含SEQ ID NO: 60之胺基酸序列之CDR-H2，及 包含SEQ ID NO: 77之胺基酸序列之CDR-H3；且 b) VL包含 包含SEQ ID NO: 94之胺基酸序列之CDR-L1， 包含SEQ ID NO: 111之胺基酸序列之CDR-L2，及 包含SEQ ID NO: 128之胺基酸序列之CDR-L3。
- 如請求項92之經分離之抗體或其抗原結合片段，其中VH包含SEQ ID NO: 17之胺基酸序列，及/或VL包含SEQ ID NO: 18之胺基酸序列。
- 如請求項68之經分離之抗體或其抗原結合片段，其中： a) VH包含 包含SEQ ID NO: 44之胺基酸序列之CDR-H1， 包含SEQ ID NO: 61之胺基酸序列之CDR-H2，及 包含SEQ ID NO: 78之胺基酸序列之CDR-H3；且 b) VL包含 包含SEQ ID NO: 95之胺基酸序列之CDR-L1， 包含SEQ ID NO: 112之胺基酸序列之CDR-L2，及 包含SEQ ID NO: 129之胺基酸序列之CDR-L3。
- 如請求項94之經分離之抗體或其抗原結合片段，其中VH包含SEQ ID NO: 19之胺基酸序列，及/或VL包含SEQ ID NO: 20之胺基酸序列。
- 如請求項68之經分離之抗體或其抗原結合片段，其中： a) VH包含 包含SEQ ID NO: 45之胺基酸序列之CDR-H1， 包含SEQ ID NO: 62之胺基酸序列之CDR-H2，及 包含SEQ ID NO: 79之胺基酸序列之CDR-H3；且 b) VL包含 包含SEQ ID NO: 96之胺基酸序列之CDR-L1， 包含SEQ ID NO: 113之胺基酸序列之CDR-L2，及 包含SEQ ID NO: 130之胺基酸序列之CDR-L3。
- 如請求項96之經分離之抗體或其抗原結合片段，其中VH包含SEQ ID NO: 21之胺基酸序列，及/或VL包含SEQ ID NO: 22之胺基酸序列。
- 如請求項68之經分離之抗體或其抗原結合片段，其中： a) VH包含 包含SEQ ID NO: 46之胺基酸序列之CDR-H1， 包含SEQ ID NO: 63之胺基酸序列之CDR-H2，及 包含SEQ ID NO: 80之胺基酸序列之CDR-H3；且 b) VL包含 包含SEQ ID NO: 97之胺基酸序列之CDR-L1， 包含SEQ ID NO: 114之胺基酸序列之CDR-L2，及 包含SEQ ID NO: 131之胺基酸序列之CDR-L3。
- 如請求項98之經分離之抗體或其抗原結合片段，其中VH包含SEQ ID NO: 23之胺基酸序列，及/或VL包含SEQ ID NO: 24之胺基酸序列。
- 如請求項68之經分離之抗體或其抗原結合片段，其中： a) VH包含 包含SEQ ID NO: 47之胺基酸序列之CDR-H1， 包含SEQ ID NO: 64之胺基酸序列之CDR-H2，及 包含SEQ ID NO: 81之胺基酸序列之CDR-H3；且 b) VL包含 包含SEQ ID NO: 98之胺基酸序列之CDR-L1， 包含SEQ ID NO: 115之胺基酸序列之CDR-L2，及 包含SEQ ID NO: 132之胺基酸序列之CDR-L3。
- 如請求項100之經分離之抗體或其抗原結合片段，其中VH包含SEQ ID NO: 25之胺基酸序列，及/或VL包含SEQ ID NO: 26之胺基酸序列。
- 如請求項68至101中任一項之經分離之抗體或其抗原結合片段，其中經分離之抗體包含人類IgG4 Fc區。
- 如請求項102之經分離之抗體或其抗原結合片段，其中經分離之抗體包含包含VL之輕鏈之第一多肽，其中第一多肽包含SEQ ID NO: 140之胺基酸序列；且自N端至C端包含VH及人類IgG4 Fc結構域之重鏈之第二多肽，其中第二多肽包含SEQ ID NO: 141之胺基酸序列。
- 如請求項68至101中任一項之經分離之抗體或其抗原結合片段，其中經分離之抗體包含人類IgG1 Fc區。
- 如請求項104之經分離之抗體或其抗原結合片段，其中經分離之抗體包含包含VL之輕鏈之第一多肽，其中第一多肽包含SEQ ID NO: 144之胺基酸序列；且自N端至C端包含VH及人類IgG1 Fc結構域之重鏈之第二多肽，其中第二多肽包含SEQ ID NO: 145之胺基酸序列。
- 如請求項104之經分離之抗體或其抗原結合片段，其中人類IgG1 Fc區包含兩個Fc結構域，其中兩個Fc結構域中的每一個包含S239D取代及/或I332E取代。
- 如請求項106之經分離之抗體或其抗原結合片段，其中經分離之抗體包含包含VL之輕鏈之第一多肽，其中第一多肽包含SEQ ID NO: 146之胺基酸序列；及自N端至C端包含VH及人類IgG1 Fc結構域之重鏈之第二多肽，其中第二多肽包含SEQ ID NO: 147之胺基酸序列。
- 如請求項68至101中任一項之經分離之抗體或其抗原結合片段，其中抗原結合片段選自由Fab、Fv、scFab及scFv組成之群。
- 如請求項68至108中任一項之經分離之抗體或其抗原結合片段，其中經分離之抗體或抗原結合片段以約50 nM或更低之K D結合人類CD47。
- 如請求項109之經分離之抗體或其抗原結合片段，其中經分離之抗體或抗原結合片段以約10 nM或更低之K D結合人類CD47。
- 如請求項68至110中任一項之經分離之抗體或其抗原結合片段，其中經分離之抗體或抗原結合片段以約100 nM或更低之半抑制濃度(IC 50)在活體外阻斷人類CD47與人類SIRPα之結合。
- 如請求項111之經分離之抗體或其抗原結合片段，其中經分離之抗體或抗原結合片段以約10 nM或更低之半抑制濃度(IC 50)在活體外阻斷人類CD47與人類SIRPα之結合。
- 如請求項68至112中任一項之經分離之抗體或其抗原結合片段，其中當經分離之抗體或抗原結合片段以1 μM或更高之濃度提供時，經分離之抗體或抗原結合片段在活體外完全阻斷人類CD47與人類SIRPα之結合。
- 如請求項68至113中任一項之經分離之抗體或其抗原結合片段，其中經分離之抗體或抗原結合片段以約10 nM或更低之半最大效應濃度(EC 50)在活體外與腫瘤細胞結合，其中腫瘤細胞包含B細胞淋巴瘤細胞株，T細胞淋巴瘤細胞株或其組合。
- 如請求項68至114中任一項之經分離之抗體或其抗原結合片段，其中經分離之抗體或抗原結合片段以約10 nM或更低之半最大效應濃度(EC 50)在活體外增加腫瘤細胞之巨噬細胞吞噬作用，其中腫瘤細胞包含B細胞淋巴瘤細胞株，T細胞淋巴瘤細胞株或其組合。
- 如請求項115之經分離之抗體或其抗原結合片段，其中經分離之抗體或抗原結合片段以約1 nM或更低之半最大效應濃度(EC 50)在活體外增加腫瘤細胞之巨噬細胞吞噬作用，其中腫瘤細胞包含B細胞淋巴瘤細胞株，T細胞淋巴瘤細胞株或其組合。
- 如請求項68至116中任一項之經分離之抗體或其抗原結合片段，其中經分離之抗體或其抗原結合片段與至少一種選自由食蟹猴、大鼠及狗組成之群之非人類物種之CD47多肽交叉反應。
- 如請求項117之經分離之抗體或其抗原結合片段，其中經分離之抗體或其抗原結合片段與食蟹猴CD47結合。
- 一種經分離之抗體或其抗原結合片段與選自由人類CD47之K39、W40、K41、F50、D51、G52、T99、E100、L101及T102組成之群之一個或多個胺基酸殘基結合。
- 如請求項119中任一項之經分離之抗體或其抗原結合片段，其中經分離之抗體或其抗原結合片段不與選自由人類CD47之L2、L3、F4、K6、N27、E29、A30、Q31、T34、E35、V36、Y37、D46、T49、A53、E97、R103、E104、G105及E106之一個或多個胺基酸殘基結合。
- 如請求項119至120中任一項之經分離之抗體或其抗原結合片段，其中經分離之抗體或其抗原結合片段與人類CD47之K39、W40、K41、F50、D51、G52、T99、E100、L101及T102胺基酸殘基結合。
- 如請求項119至121中任一項之經分離之抗體或其抗原結合片段，其中經分離之抗體或其抗原結合片段不與人類CD47之L2、L3、F4、K6、N27、E29、A30、Q31、T34、E35、V36、Y37、D46、T49、A53、E97、R103、E104、G105及E106胺基酸殘基結合。
- 一種單離編碼如請求項1至67中任一項之經遮蔽抗體或如請求項68至122中任一項之經分離之抗體或其抗原結合片段之一個或多個多肽鏈之核酸。
- 一種載體包含如請求項123之核酸。
- 如請求項124之載體，其中載體為表現載體。
- 一種宿主細胞包含如請求項124或125之載體。
- 一種製備經遮蔽抗體或抗體或其抗原結合片段之方法，其包括如請求項126之宿主細胞在適用於產生該經遮蔽抗體或抗體或其抗原結合片段之條件下培養。
- 如請求項127之方法，其進一步包括回收由該細胞產生之經遮蔽抗體或抗體或其抗原結合片段。
- 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至67中任一項之經遮蔽抗體或如請求項68至112中任一項之抗體或其抗原結合片段及醫藥上可接受之載劑。
- 一種治療有需要之受試者之CD47陽性疾病或病症之方法，其包含對該受試者投與有效量如請求項129之醫藥組合物。
- 如請求項130之方法，其中投與不會引起受試者貧血。
- 如請求項130或131之方法，其中疾病或病症為癌症。
- 如請求項132之方法，其中癌症包含B細胞淋巴瘤，T細胞淋巴瘤或其組合。
- 如請求項132之方法，其中癌症選自由淋巴瘤、白血病、頭頸癌、胃癌、食道癌、乳癌、宮頸癌、膽管癌、結腸癌、卵巢癌、甲狀腺癌、子宮癌、子宮內膜癌、肺癌、間皮瘤及胰腺癌組成之群。
- 如請求項132之方法，其中癌症選自由三陰性乳腺癌(TNBC)、HER2+胃食管結合(GEJ)癌症、小細胞肺癌(SCLC)、彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、急性髓系細胞白血病(AML)、頭頸部鱗狀細胞癌(HNSC)、胃癌(GC)、乳癌(BRCA)、宮頸鱗癌及內宮頸內膜癌(CESC)、膽管癌(CHOL)、結腸腺癌(COAD)、卵巢漿液性囊腺癌(OV)、甲狀腺癌(THCA)、子宮內膜癌(UCEC)、HER2+乳癌、激素受體陽性乳癌、淋巴樣腫瘤彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBC)、肺腺癌(LUAD)、肺鱗癌(LUSC)、間皮瘤(MESO)及胰腺腺癌(PAAD)組成之群。
- 如請求項130至135中任一項之方法，其中經遮蔽抗體或抗體或其抗原結合片段以至少約0.6 mg/kg之劑量投與。
- 如請求項130至134中任一項之方法，其中藥物組合物以至少每兩週一次之頻次投與。
- 如請求項130至134中任一項之方法，其中藥物組合物以至少每三週一次之頻次投與。
- 如請求項130至138中任一項之方法，還包含向受試者投與有效量之一或多種另外之治療劑。
- 如請求項139之方法，其中一或多種另外治療劑包含病毒基因療法、免疫檢查點抑制劑、靶療法、放射療法、化療或其任意組合。
- 如請求項139或140之方法，其中一或多種另外治療劑包含鉑美特(pomalyst)、瑞複美(revlimid)、來那度胺(lenalidomide)、泊馬度胺(pomalidomide)、沙利度胺(thalidomide)、DNA烷基化含鉑衍生物、順鉑(cisplatin)、5-氟尿嘧啶、環磷醯胺(cyclophosphamide)、抗CD47抗體、抗CTLA4抗體、抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體、抗CD20抗體、抗CD40抗體、抗DR5抗體、抗CD1d抗體、抗TIM3抗體、抗SLAMF7抗體、抗KIR受體抗體、抗OX40抗體、抗HER2抗體、抗ErbB-2抗體、抗EGFR抗體、西妥昔單抗(cetuximab)、利妥昔單抗(rituximab)、曲妥珠單抗(trastuzumab)、派姆單抗(pembrolizumab)、放射療法、單劑量輻射、分次輻射、焦點輻射、全器官輻射、IL-12、IFNα、GM-CSF、嵌合抗原受體、授受性轉移之T細胞、抗癌疫苗、及溶瘤病毒或其任意組合。
- 一種治療癌症之方法，其包含投與抗CD47經遮蔽抗體，其中抗CD47經遮蔽抗體包含： (a) 遮蔽性肽，自N端至C端包含遮蔽性部分(MM)及連接部分(LM)； (b) 靶結合部分(TBM)，包含抗體重鏈可變區(VH)及抗體輕鏈可變區(VL)，其中TBM與人類CD47結合；且 (c) 人類IgG1 Fc或具有增強之抗體依賴性細胞毒性(ADCC)活性之IgG Fc， 其中經遮蔽抗體在癌症部位與人類CD47結合。
- 如請求項142之方法，其中遮蔽性肽不包含可裂解部分。
- 如請求項142之方法，其中經遮蔽抗體為可活化抗體，其LM包含包含至少一個裂解位點之可裂解部分(CM)，且與CM未裂解時相比，當CM在癌症部位裂解時，可活化抗體與人類CD47具有更高之結合親和力。
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