TW202323270A - 多肽 - Google Patents
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Abstract
本發明係關於包含一或多個突變之經修飾之補體因子I (CFI)多肽，其中該一或多個突變提供較高CFI活性。本發明亦係關於包含CFI核苷酸序列之聚核苷酸，其中該CFI核苷酸序列編碼本發明之該經修飾之CFI多肽。本發明進一步係關於包含重組基因體之病毒粒子，該病毒粒子包含本發明之聚核苷酸；包含本發明之多肽、聚核苷酸或病毒粒子的組合物；及本發明之多肽、聚核苷酸、病毒粒子或組合物的方法及用途。
Description
本發明係關於經修飾之補體因子I (CFI)多肽及包含經修飾之CFI核苷酸序列的聚核苷酸。本發明進一步係關於包含重組基因體之病毒粒子，該病毒粒子包含本發明之聚核苷酸；及包含本發明之經修飾之CFI多肽、聚核苷酸或病毒顆粒的組合物。本發明亦係關於本發明之經修飾之CFI多肽、聚核苷酸、病毒粒子及/或組合物的使用方法及用途。本發明進一步係關於用於治療方法中或用於製造供治療方法使用之藥劑之本發明之經修飾之CFI多肽、聚核苷酸、病毒粒子或組合物。
補體因子I (CFI)為參與補體系統之蛋白質。補體系統為先天性免疫系統之一部分，且藉由觸發發炎反應形成對抗感染之第一線防護。補體系統包含主要藉由肝合成且作為失活前驅體在血液中循環之許多蛋白質。例如藉由外來實體刺激補體系統會觸發系統中之蛋白酶裂解前驅體及釋放諸如細胞介素之分子以起始另一擴增串級。補體系統之活化可刺激吞噬細胞，刺激炎症且活化細胞殺滅攻膜複合物。補體系統可藉由經典途徑、凝集素途徑及替代途徑活化。所有三個途徑在藉由C3-轉化酶裂解及活化C3時會聚。形成C3a及C3b，引起進一步裂解及活化事件之串級。
替代途徑具有較低水準之組成性活性(所謂「活動緩慢(tick-over)」)且亦可在C3b釋放至流體相中時充當擴增環，或更典型地，經調理素化為外來實體。另外，替代途徑可由受損組織觸發或在缺乏基本調節劑之組織上傳播。在正常情形下，替代途徑由兩個競爭循環之間的平衡決定，亦即增強補體擴增之C3b回饋循環及導致下調之C3b分解循環。
替代途徑由於自發性C3水解而以低水準連續活化以形成C3b。C3b可以共價結合至細胞或病原體之表面。表面結合C3b可與因子B組合形成複合物C3bB。C3bB可在因子D存在下裂解以形成可將更多C3轉化為C3b之C3bBb (替代途徑C3-轉化酶)。複合之C3bBb可結合因子P (備解素)以形成穩定化C3-轉化酶C3bBbP，其能夠使更多C3裂解為C3b，由此使反應擴增。當在病原體或細胞表面上形成C3bBbP複合物時，其能夠結合另外的C3b形成由(C3b)
2BbP組成之替代途徑C5-轉化酶。C5-轉化酶將C5裂解為C5a及C5b。攻膜複合物可隨後由C5b依序結合至C6、C7、C8及多個C9分子形成。
存在C3分解循環以防止過量C3b產生。特別地，CFI在C3分解循環中發揮作用。其作用為藉由在兩個步驟裂解C3b及iC3b來調節補體活化。在第一步驟中，在輔因子H存在下，CFI催化C3b裂解為iC3b。iC3b無法形成部分C3或C5轉化酶，但具有促炎性。在第二步驟中，在輔因子CR1 (CD35)存在下，CFI隨後進一步分解iC3b，得到C3片段C3d,g。
補體系統在許多疾病中與免疫組分一起發揮作用。補體系統中途徑之失調使得有害發炎性物質在下游產生，該等有害發炎性物種可導致替代途徑失調疾病(例如C3腎絲球病變、乾性AMD及地圖狀萎縮(GA))或末端途徑失調疾病(例如陣發性夜間血紅素尿症(paroxysmal nocturnal hemoglobinuria；PNH)、非典型溶血性尿毒症候群(atypical haemolytic uremic syndrome；aHUS))，或其中C3下游之補體介導性發炎為疾病發病機制之促成因素的潛在任何疾病(例如狼瘡性腎炎、IgA腎病及C3腎絲球病變)。因此，此等途徑失調有意義。舉例而言，若CFI不起作用或缺乏，或替代途徑被過度刺激或不適當刺激，則補體系統之平衡可能被破壞，從而導致發炎因子在例如腎臟中堆積，其可導致腎臟病變。因此，需要再平衡替代途徑之循環，特別是藉由促進C3b及iC3b分解來進行再平衡，且由此減少發炎。因此，尤其在補體介導之病症中恢復或增加CFI含量將為治療學上有利的。
因此，需要提供用於治療補體介導之病症之經改良且有效的療法，其將允許恢復或增加功能性CFI之表現量及/或活性程度，從而有效再平衡替代途徑之循環。
本發明係關於經修飾之CFI多肽。本發明實例展現在CFI多肽之某些位置處之突變可用於改善/增加CFI多肽之活性。具體而言，實例展現經修飾之CFI多肽包含在對應於SEQ ID NO: 1之位置53、60、383、384、400、401、407、408、409、439、440、441、479及482的位置處呈單獨或組合形式的突變，其展現比在對應於SEQ ID NO: 1之位置53、60、383、384、400、401、407、408、409、439、440、441、479及482的位置處缺乏突變的對應CFI多肽更高的活性。此類經修飾之CFI多肽可用於療法中，以比野生型CFI多肽更有效地再平衡替代途徑之循環。此外，編碼此類經修飾之CFI多肽的核苷酸可用於基因療法中，以有效地再平衡替代途徑之循環。
因此，在第一態樣中，本發明提供包含一或多個突變之經修飾之CFI多肽，其中該一或多個突變提供較高CFI活性。
在第二態樣中，本發明提供包含一或多個突變之經修飾之CFI多肽，其中該一或多個突變包含在對應於選自由SEQ ID NO: 1之53、60、383、384、400、401、407、408、409、439、440、441、479及482組成之群的位置處的突變。
在第三態樣中，本發明提供包含CFI核苷酸序列之聚核苷酸，其中該CFI核苷酸序列編碼本發明之經修飾之CFI多肽。
在第四態樣中，本發明提供一種包含重組基因體之病毒粒子，該病毒粒子包含本發明之聚核苷酸。
在第五態樣中，本發明提供一種組合物，其包含本發明之經修飾之CFI多肽、聚核苷酸或病毒粒子及醫藥學上可接受之賦形劑。
在第六態樣中，本發明提供用於治療方法中之本發明之經修飾之CFI多肽、聚核苷酸、病毒粒子或組合物。
在第七態樣中，本發明提供一種治療方法，其包含投與有效量之本發明之經修飾之CFI多肽、聚核苷酸、病毒粒子或組合物。
在第八態樣中，本發明提供本發明之經修飾之CFI多肽、聚核苷酸、病毒粒子或組合物在製造用於治療方法中之藥劑中的用途。
序列表之描述
一般定義
| 序列編號 | 序列 |
| 1 | 具有信號肽之野生型人類CFI之多肽序列(不成熟) |
| 2 | 不含信號肽之野生型人類CFI之多肽序列(成熟) |
| 3 | 具有信號肽之野生型人類CFI核苷酸序列 |
| 4 | 不含信號肽之野生型人類CFI核苷酸序列 |
| 5 | 對應於信號肽之野生型CFI核苷酸序列 |
| 6 | 信號肽之野生型CFI多肽序列 |
| 7 | 嗜肝性衣殼之多肽序列 |
| 8 | 嗜肝性衣殼之多肽序列 |
| 9 | 嗜肝性衣殼之多肽序列 |
| 10 | 嗜肝性衣殼之多肽序列 |
| 11 | 編碼肝特異性轉錄調節元件之核苷酸序列 |
| 12 | AAV2 5' ITR序列 |
| 13 | AAV2 3' ITR序列 |
| 14 | 牛生長激素poly A序列之核苷酸序列 |
| 15 | SV40內含子之核苷酸序列 |
| 16 | 具有信號肽之密碼子最佳化之CFI核苷酸序列。核苷酸序列包含在編碼信號肽之序列與編碼成熟CFI序列的序列之間的編碼6His-標籤之序列。 |
| 17 | 具有信號肽之密碼子最佳化之CFI核苷酸序列，其含有對應於經編碼之胺基酸序列中之R53L及R383Y之突變。核苷酸序列包含在編碼信號肽之序列與編碼成熟CFI序列的序列之間的編碼6His-標籤之序列。突變之編號對應於SEQ ID NO: 1 (野生型不成熟CFI)之位置。 |
| 18 | 不含信號肽部分之密碼子最佳化之CFI核苷酸序列 |
| 19 | 具有信號肽部分之密碼子最佳化之CFI核苷酸序列 |
| 20 | LSP-S轉錄調節元件 |
| 21 | LSP-L轉錄調節元件 |
| 22 | FRE72 |
| 23 | 土撥鼠肝炎轉錄後調節元件 |
| 24 | 土撥鼠肝炎轉錄後調節元件 |
| 25 | 土撥鼠肝炎轉錄後調節元件 |
| 26 | AAV9衣殼 |
| 27 | AAV2衣殼 |
| 28 | 具有信號肽之密碼子最佳化之CFI核苷酸序列(與SEQ ID NO: 16一致但不含編碼6His-標籤之序列) |
| 29 | 具有信號肽之密碼子最佳化之CFI核苷酸序列，其含有對應於經編碼之胺基酸序列中之R53L及R383Y之突變(與SEQ ID NO: 17一致但不含編碼6His-標籤之序列)。突變之編號對應於SEQ ID NO: 1 (野生型不成熟CFI)之位置。 |
| 30 | 不含信號肽部分之密碼子最佳化之CFI核苷酸序列 |
| 31 | 具有信號肽部分之密碼子最佳化之CFI核苷酸序列 |
| 32 | 不含信號肽部分之密碼子最佳化之CFI核苷酸序列 |
| 33 | 具有信號肽部分之密碼子最佳化之CFI核苷酸序列 |
| 34 | 不含信號肽部分之密碼子最佳化之CFI核苷酸序列 |
| 35 | 具有信號肽部分之密碼子最佳化之CFI核苷酸序列 |
| 36 | 不含信號肽部分之密碼子最佳化之CFI核苷酸序列 |
| 37 | 具有信號肽部分之密碼子最佳化之CFI核苷酸序列 |
| 38 | 不含信號肽部分之密碼子最佳化之CFI核苷酸序列 |
| 39 | 具有信號肽部分之密碼子最佳化之CFI核苷酸序列 |
| 40 | 不含信號肽部分之密碼子最佳化之CFI核苷酸序列 |
| 41 | 具有信號肽部分之密碼子最佳化之CFI核苷酸序列 |
| 42 | 不含信號肽部分之密碼子最佳化之CFI核苷酸序列 |
| 43 | 具有信號肽部分之密碼子最佳化之CFI核苷酸序列 |
| 44 | 具有信號肽部分之密碼子最佳化之CFI核苷酸序列 |
| 45 | 具有信號肽部分之密碼子最佳化之CFI核苷酸序列 |
| 46 | 具有信號肽部分之密碼子最佳化之CFI核苷酸序列 |
| 47 | 具有信號肽部分之密碼子最佳化之CFI核苷酸序列 |
| 48 | 具有信號肽部分之密碼子最佳化之CFI核苷酸序列 |
| 49 | 具有信號肽部分之密碼子最佳化之CFI核苷酸序列 |
| 50 | 具有信號肽部分之密碼子最佳化之CFI核苷酸序列 |
| 51 | 具有信號肽部分之密碼子最佳化之CFI核苷酸序列 |
| 52 | 具有信號肽部分之密碼子最佳化之CFI核苷酸序列 |
| 53 | 啟動子核苷酸序列 |
| 54 | 啟動子核苷酸序列 |
| 55 | 啟動子核苷酸序列 |
| 56 | 啟動子核苷酸序列 |
除非另外定義，否則本文中所用之技術及科學術語具有熟習本發明所屬之技術者通常所理解之含義。
一般而言，術語「
包含(
comprising)」欲意謂包括(但不限於)。舉例而言，片語「
包含兩個突變之經修飾 CFI 多肽」應解釋為意謂經修飾之CFI多肽具有至少兩個突變，但可含有其他突變。類似地，片語「
包含 CFI 核苷酸序列之聚核苷酸」係指具有CFI核苷酸序列之聚核苷酸，但該聚核苷酸可含有其他核苷酸。
在本發明之一些實施例中，字詞「包含」經「基本上由...組成(
consisting essentially of)」之片語替換。術語「基本上由...組成」意謂可存在特定其他組分，亦即，不實質上影響主題之基本特徵之彼等組分。
在本發明之一些實施例中，字詞「包含」經「由...組成(
consisting of)」之片語替換。術語「
由 ... 組成」意欲為限制性的。舉例而言，片語「
由兩個突變組成之經修飾 CFI 多肽」應解釋為意謂經修飾之CFI多肽僅具有兩個突變且無其他突變。類似地，片語「
由 CFI 核苷酸序列組成之聚核苷酸」應理解為意謂該聚核苷酸具有CFI核苷酸序列且無其他核苷酸。
在本發明之一些實施例中，字詞「具有(
have)」可經字詞「
包含 (comprise)」、片語「
基本上由 ... 組 成 (consist essentially of)」或片語「
由 ... 組成 (consist of)」替換。在本發明之一些實施例中，字詞「
具有 (has)」可經字詞「
包含 (comprises)」、片語「基本上由...組成
(consists essentially of)」或片語「
由 ... 組成 (consists of)」替換。
如本文所使用，在指代兩個端點以定義值範圍時的「
在 ... 之間 (between)」應視為意指「
在 ... 之間且包括 (between and including)」。因此，定義為「
在 400 與 583 之間」的範圍包括大於400且小於583之所有值，以及離散值400及583自身。
術語「
蛋白質 (protein)」及「
多肽 (polypeptide)」在本文中可互換使用，且意欲指任何長度之胺基酸之聚合鏈。
術語「
因子 I (Factor I)」、「
CFI」及「
補體因子 I (Complement Factor I)」在本文中可互換地使用。
術語「
因子 H (Factor H)」、「
輔因子 H (cofactor H)」、「
輔因子 H (co-factor H)」、「
CFH」及「
補體因子 H (Complement Factor H)」在本文中可互換地使用。
術語「
突變」、「
取代突變」及「
胺基酸取代」在本文中可互換使用，且欲意謂胺基酸序列中之一個胺基酸經不同胺基酸取代。舉例而言，除CFI多肽之位置53處之胺基酸不同於SEQ ID NO: 1中之位置53處之胺基酸之外，包含在對應於SEQ ID NO: 1之位置53之位置處的突變之經修飾CFI多肽可對應於具有SEQ ID NO: 1之序列的CFI多肽。或者，除了包括位置53處之胺基酸的幾個胺基酸不同於SEQ ID NO: 1中之對應胺基酸(例如，包含位置53之CFI多肽之連續部分可含有不同於SEQ ID NO: 1中之對應胺基酸的胺基酸)之外，包含對應於SEQ ID NO: 1之位置53之位置處之突變的經修飾CFI多肽可對應於具有SEQ ID NO: 1之序列的CFI多肽。在片語「
在對應於 SEQ ID NO: Z 之位置 X 的位置處的突變為經胺基酸 Y 取代」及「
該一或多個突變包含在對應於 SEQ ID NO: Z 之位置 X 的位置處的突變」中，經取代之殘基為在對應於SEQ ID NO: Z之位置X的位置處的胺基酸。胺基酸Y為置換對應於SEQ ID NO: Z之位置X的位置處之胺基酸序列中之原始或天然胺基酸的不同胺基酸。在片語「
胺基酸 X 取代」或「
待取代之胺基酸 X」中，胺基酸X為存在於胺基酸序列內且待置換之原始或天然胺基酸。舉例而言，精胺酸取代意謂原始或天然精胺酸胺基酸經另一胺基酸置換。在片語「
經 胺基酸 Y 取代」或「
突變為 胺基酸 Y」中，胺基酸Y為置換胺基酸序列中之原始或天然胺基酸的不同胺基酸。舉例而言，經白胺酸取代係指原始或天然(非白胺酸)胺基酸經白胺酸置換。用於定義取代突變之標準簡寫命名法列出待取代之胺基酸序列內之位置處之原始或天然胺基酸及置換原始或天然胺基酸之胺基酸。舉例而言，包含取代突變R53L之經修飾CFI多肽係指經修飾之CFI胺基酸序列，其包含在對應於位置53的位置處之精胺酸殘基經白胺酸殘基取代(亦即，其在對應於位置53之位置處包含白胺酸殘基)。
「
對應於」指定SEQ ID NO之指定位置的胺基酸可為在所述特定SEQ ID NO之指定位置處的胺基酸。舉例而言，「
對應於 SEQ ID NO: 1 之位置 53」的胺基酸可為SEQ ID NO: 1之位置53處的胺基酸。或者，「
對應於」指定SEQ ID NO之指定位置之胺基酸可為來自對應於指定SEQ ID NO之指定位置之替代胺基酸序列的胺基酸。舉例而言，「
對應於 SEQ ID NO: 1 之位置 53」的胺基酸可為來自對應於SEQ ID NO: 1之位置53的替代胺基酸序列之胺基酸。確定替代性胺基酸序列中之哪些胺基酸「對應於」指定SEQ ID NO中之指定位置在熟習此項技術者之能力範圍內。舉例而言，熟習此項技術者僅需要使用適合比對演算法(諸如本文所描述之Needleman及Wunsch之比對演算法)進行替代胺基酸序列與指定SEQ ID NO之序列比對，且確定替代胺基酸序列之哪一區與指定SEQ ID NO中之指定位置比對。舉例而言，熟習此項技術者能夠比對替代胺基酸序列與SEQ ID NO: 1且確定哪一胺基酸與例如SEQ ID NO: 1之位置53比對且因此與其相對應。
術語「
野生型」及「
天然」在本文中可互換使用，且意欲描述天然存在的某物。舉例而言，「
野生型 CFI 胺基酸序列」為自然界中存在之CFI胺基酸序列。
術語「
AAV 病毒粒子」及「
AAV 載體」在本文中可互換使用。
在描述核苷酸或胺基酸序列之長度之上下文中所用的術語「
大約 (around)」指示可包含以下或由以下組成之序列：限定數目之核苷酸或胺基酸，加或減10%，更特別地，加或減5%，更特別地，加或減1%，或更特別地，加或減單一整數。舉例而言，提及長度為「大約」1698個核苷酸之核苷酸序列可指長度為1529至1867個核苷酸，更特別地1614至1782個核苷酸，更特別地1682至1714個核苷酸，且更特別地1697至1699個核苷酸的核苷酸序列。
在時間長度(例如，大約16小時)之上下文中使用的術語「
大約」指示時間長度包括指定時間長度加或減10%，更特別地，加或減5%，或更特別地，加或減1%。
出於本發明之目的，為了測定兩個序列(諸如兩個聚核苷酸或兩個多肽序列)之一致性百分比，比對序列以用於最佳比較目的(例如可在第一序列中引入間隙以便與第二序列最佳比對)。接著比較各位置處之核苷酸或胺基酸殘基。當第一序列中之位置由第二序列中對應位置處之相同核苷酸或胺基酸佔據時，則核苷酸或胺基酸在該位置處一致。兩個序列之間的一致性百分比為該等序列共有之一致位置之數目的函數(亦即，一致性% =一致位置數目/參考序列中之位置總數×100)。
通常，序列比較係在參考序列之長度上進行。舉例而言，若使用者希望確定既定(「測試」)序列是否與SEQ ID NO: 1具有至少95%一致性，則SEQ ID NO: 1將為參考序列。為了評定序列是否與SEQ ID NO: 1 (參考序列之實例)具有至少95%一致性，熟習此項技術者將在SEQ ID NO: 1之長度上進行比對，且鑑別測試序列中多少位置與SEQ ID NO: 1之彼等位置一致。若至少95%之位置一致，則測試序列與SEQ ID NO: 1具有至少95%一致性。若測試序列比SEQ ID NO: 1短，則間隙或缺失位置應視為不一致位置。
類似地，為確定「測試」序列是否為或包含與SEQ ID NO: 1之片段具有至少95%一致性的序列，熟習此項技術者將比對測試序列與SEQ ID NO: 1且鑑別與測試序列最佳比對的所需長度之參考序列中的連續部分(「
參考片段」)。與「
參考片段」比對的「
測試」序列之對應部分為「
測試片段」。熟習此項技術者隨後將使用計算一致性% = (「
測試片段」與「
參考片段」之間一致的位置數目/「
參考片段」之長度)×100來計算「測試片段」與「參考片段」之間的一致性百分比。舉例而言，為確定「
測試」序列是否為或包含與SEQ ID NO: 1之至少400個胺基酸之片段具有至少95%一致性的序列，熟習此項技術者將比對測試序列與SEQ ID NO: 1且鑑別與測試序列最佳比對的SEQ ID NO: 1之連續400個胺基酸的部分(在此實例中，其將為「
參考片段」)。與SEQ ID NO: 1之400個胺基酸的部分比對的「
測試」序列之對應部分在此實例中為「
測試片段」。使用者隨後如上文所描述計算「
測試片段」與測試片段比對之SEQ ID NO: 1之400個胺基酸的部分(「
參考片段」)之間的一致性百分比，亦即使用計算一致性% = 「
測試片段」與「
參考片段」之間一致的位置數目/400 (「
參考片段」之長度)×100來計算。
熟習此項技術者瞭解可用於測定兩個序列之間的同源性或一致性的不同電腦程式。舉例而言，可使用數學演算法來實現序列比較及兩個序列之間之一致性百分比測定。在實施例中，可使用已併入Accelrys GCG套裝軟體(可在http://www.accelrys.com/products/gcg/獲得)之GAP程式中的Needleman及Wunsch (1970)演算法，使用Blosum 62矩陣或PAM250矩陣以及間隙權數16、14、12、10、8、6或4及長度權數1、2、3、4、5或6進行比對。
除非內容另外清楚地指示，否則單數形式「一(
a/an)」及「該(
the)」包括複數個指示物。因此，舉例而言，對「
胺基酸」之提及包括此類胺基酸之兩個或更多個個例或型式。
出於本發明之目的，術語「
片段」係指序列之連續部分。舉例而言，具有50個胺基酸之SEQ ID NO: 1之片段係指SEQ ID NO: 1之50個連續胺基酸。
無論見上文或見下文，本文中所引用之所有公開案、專利及專利申請案皆以全文引用之方式併入本文中。
經修飾之 CFI 多肽
本發明提供包含一或多個突變之經修飾之CFI多肽(亦稱為CFI變異體)。術語「經修飾」意謂多肽與野生型CFI多肽有至少一種差異，例如已引入突變。不希望受理論束縛，咸信本發明之胺基酸突變可用以增強CFI與其受質及輔因子之間的結合親和力，由此提供較高CFI活性(例如催化C3b裂解為iC3b及/或降解iC3b)。舉例而言，此可藉由取代CFI中的位於CFI與其受質C3b之間的界面處或位於CFI與其輔因子(因子H)之間的界面處的胺基酸來達成。
視情況地，該一或多個突變包含(或由以下組成)：20個或更少個、10個或更少個、5個或更少個、4個或更少個、3個或更少，或2個或更少突變。視情況地，該一或多個突變包含(或由以下組成)：10個或更少個、5個或更少個、4個或更少個、3個或更少或2個或更少突變。視情況地，該一或多個突變包含(或由以下組成)：5個或更少個、4個或更少個、3個或更少或2個或更少突變。視情況地，該一或多個突變包含(或由以下組成)：5個或更少突變。視情況地，該一或多個突變包含(或由以下組成)：4個或更少突變。視情況地，該一或多個突變包含(或由以下組成)：3個或更少突變。視情況地，該一或多個突變包含(或由以下組成)：2個或更少突變。視情況地，該一或多個突變包含(或由以下組成)：一個突變。
CFI多肽為由重鏈及輕鏈組成的糖蛋白雜二聚體。
重鏈由以下組成：FI攻膜複合物域(FIM域)、CD5域、低密度脂蛋白受體1域、低密度脂蛋白受體2域及D-區(未知同源區)。輕鏈由絲胺酸蛋白酶域(SP域)組成。SP域包含形成催化三聯體之殘基。C3b為CFI之受質且包含α'-鏈及β鏈。α'-鏈包含C端C345c (CTC)域、『補體C1r/C1s、UEGF、BMP1』(CUB)域及含硫酯(TED)域。CUB域包含受質環。CFI藉由介導C3b之α'-鏈中之兩個切口而將C3b裂解為iC3b。釋放小片段(C3f；3kDa)且將α'-鏈分成68kDa片段及43kDa片段。經蛋白水解之C3b稱為iC3b。因子H係涉及催化C3b裂解成iC3b的輔因子。因子H由20個補體控制蛋白(CCP)域組成，包括CCP2及CCP3。熟習此項技術者瞭解基於CFI/C3b/因子H (例如，PDB: 5O32)之已知晶體結構的各種域之位置。
CFI在C3分解循環中發揮作用。CFI可藉由使C3b不活化及降解iC3b調節補體活化。CFI可催化C3b裂解成iC3b (亦稱為「
C3b 不活化」活性或「
iC3b 形成」活性)。CFI可將iC3b分解為C3d,g (亦稱作「
iC3b 降解」活性)。典型野生型CFI多肽由SEQ ID NO: 3或4編碼。視情況，野生型CFI多肽由SEQ ID NO: 28編碼。視情況，野生型CFI多肽由SEQ ID NO: 19編碼。
通常，CFI多肽最初表現為前驅體「
不成熟」形式(例如，由SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 28編碼之SEQ ID NO: 1之CFI)，其包含信號肽(例如，SEQ ID NO: 1之胺基酸殘基1至18及SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 16之密碼子1至18)及成熟CFI多肽區。在處理之後，CFI之「成熟」形式缺乏信號肽。術語「成熟CFI」或「成熟CFI多肽」係指不包含信號肽之CFI多肽，諸如由SEQ ID NO: 4編碼之CFI。SEQ ID NO: 2之CFI多肽序列為成熟CFI。典型野生型CFI信號肽可由SEQ ID NO: 5之核苷酸序列編碼且具有SEQ ID NO: 6之多肽序列。
視情況，本發明之經修飾之CFI多肽包含信號肽。視情況，信號肽之胺基酸序列為野生型(天然) CFI信號肽之胺基酸序列。野生型CFI信號肽之胺基酸序列可為SEQ ID NO: 6之胺基酸序列。視情況，信號肽之胺基酸序列為並非野生型CFI信號肽的信號肽之胺基酸序列。舉例而言，信號肽可不為野生型CFI信號肽。信號肽可為來自另一多肽之信號肽。信號肽可為異源信號肽。異源信號肽可為例如來自另一多肽之信號肽、經修飾之CFI信號肽或合成信號肽。在此類實施例中，「
經修飾之 CFI 信號肽」為已經修飾之野生型CFI信號肽(例如已引入突變)。
視情況，本發明之經修飾之CFI多肽不包含信號肽。
本發明之經修飾之CFI多肽為功能性的。功能性CFI多肽為可如本文所描述藉由使C3b不活化(亦即形成iC3b)及使iC3b降解來調節補體活化之多肽。在熟習此項技術者之能力範圍內的係判定CFI多肽或其片段是否為功能性的。熟習此項技術者僅需要測試多肽是否具有活性。若經修飾之CFI多肽具有至少20% (視情況至少30%、至少40%、至少50%或至少75%)之野生型CFI多肽活性(使用相同方法測定)，則其為功能性的。
較佳地，本發明之經修飾之CFI多肽為經修飾之人類CFI多肽。
在一實施例中，經修飾之CFI多肽的活性與野生型CFI多肽(諸如SEQ ID NO: 1之野生型CFI多肽)相同或比其更高。舉例而言，經修飾之CFI多肽的活性可比SEQ ID NO: 1之野生型CFI多肽高至少1.1倍、至少1.2倍或至少1.5倍。
在一實施例中，經修飾之CFI多肽的活性與SEQ ID NO: 2之野生型CFI多肽相同或比其更高。舉例而言，經修飾之CFI多肽的活性可比SEQ ID NO: 2之野生型CFI多肽高至少1.1倍、至少1.2倍或至少1.5倍。
在一些實施例中，一或多個突變提供較高CFI活性。本文中揭示提供較高CFI活性之例示性突變。藉由指定「
一或多個突變提供較高 CFI 活性」，包含該一或多個突變之經修飾之CFI多肽相對於不包含該一或多個突變但在其他方面與包含該一或多個突變之經修飾之CFI多肽一致的參考CFI多肽具有較高CFI活性。舉例而言，若一或多個突變提供較高CFI活性且包含一或多個突變之經修飾之CFI多肽除了包含一或多個突變(例如，突變R53L及R383Y)之外在其他方面與野生型CFI多肽一致，則包含一或多個突變之經修飾之CFI多肽具有比野生型CFI多肽高的CFI活性。在一些實施例中，若除了一或多個突變之外與SEQ ID NO: 1一致的「
測試」多肽具有比SEQ ID NO: 1之多肽高的CFI活性，則該一或多個突變「
提供較高 CFI 活性」，視情況其中「
測試」多肽及SEQ ID NO: 1係藉由在相同細胞株中表現而產生。包含一或多個突變之經修飾之CFI多肽可不一定具有比野生型CFI多肽更高的CFI活性。舉例而言，包含一或多個突變之經修飾之CFI多肽可包含降低多肽之CFI活性的一或多個其他修飾(諸如缺失部分)。在此類情況下，本文所揭示之一或多個突變可用於為經修飾之CFI多肽提供較高活性，使得經修飾之CFI多肽可不具有與野生型CFI多肽相同的CFI活性，但儘管如此，具有比在其他方面與經修飾之CFI多肽一致但缺乏一或多個突變之參考CFI多肽更高的CFI活性。或者，一或多個突變可提供增加之CFI活性，其將經修飾之CFI多肽之CFI活性恢復至野生型CFI多肽之CFI活性的水準。
在一些實施例中，包含一或多個突變之經修飾之CFI多肽具有較高CFI活性。在一些實施例中，包含一或多個突變之經修飾之CFI多肽相對於如本文所描述之參考CFI多肽具有較高CFI活性。舉例而言，參考CFI多肽可為野生型CFI多肽。參考CFI多肽可為SEQ ID NO: 1之多肽。參考CFI多肽可為SEQ ID NO: 2之多肽。在一些實施例中，將經修飾之CFI之CFI活性與參考CFI多肽之CFI活性進行比較。本文中揭示增加經修飾之CFI多肽之CFI活性的例示性突變。
「
參考 CFI 多肽」為不包含本發明之經修飾之CFI多肽的一或多個突變的CFI多肽。視情況，參考CFI多肽不包含一或多個突變，但在其他方面與本發明之經修飾之CFI多肽一致。參考CFI多肽可為野生型CFI多肽。參考CFI多肽可為SEQ ID NO: 1或2之多肽。視情況，除了包含在對應於SEQ ID NO: 1之位置138的位置處的至纈胺酸(視情況M138V)之突變之外，參考CFI多肽為具有與SEQ ID NO: 1或2相同之序列的CFI多肽。
為了判定經修飾之CFI多肽相對於參考CFI多肽(如本文所描述，諸如野生型CFI多肽)是否具有較高CFI活性，使用相同方法測定經修飾之CFI多肽及參考CFI多肽的CFI活性且比較結果。該方法可為用於測定CFI活性的任一種本文所描述之方法。
視情況，經修飾之CFI多肽的CFI活性比參考CFI多肽(諸如野生型CFI多肽)的CFI活性高至少1.2倍、至少1.5倍、至少2倍、至少2.5倍、至少3倍、至少3.5倍、至少4倍、至少4.5倍、至少5倍、至少5.5倍、至少6倍、至少6.5倍、至少7倍、至少7.5倍、至少8倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、在1.2與3倍之間、在1.2與5倍之間、在2倍與6倍之間、在3倍與8倍之間、在1.5倍與8倍之間、在2倍與8倍之間、在5倍與8倍之間、在6倍與8倍之間、在7倍與8倍之間、在2倍與15倍之間、在3倍與20倍之間、在5倍與10倍之間、在5倍與15倍、或在5倍與20倍之間。當提及活性之倍數變化時，術語「
在 ... 之間 (between)」包括指定值。因此，例如，「
在 1.5 倍與 8 倍之間」包括1.5倍及8倍的值。
視情況，經修飾之CFI多肽的CFI活性比參考CFI多肽(諸如野生型CFI多肽)的CFI活性高至少1.2倍、至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍或至少6倍。視情況，經修飾之CFI多肽的CFI活性比參考CFI多肽(諸如野生型CFI多肽)的CFI活性小20倍或更少、15倍或更少、或10倍或更少。視情況，經修飾之CFI多肽的CFI活性比參考CFI多肽(諸如野生型CFI多肽)的CFI活性高1.2倍與20倍之間、1.2倍與15倍之間、1.5倍與15倍之間、或1.5倍與10倍之間。視情況，經修飾之CFI多肽的CFI活性比參考CFI多肽(諸如野生型CFI多肽)的CFI活性高1.2倍與6倍之間或5倍與10倍之間。
視情況，經修飾之CFI多肽之CFI活性為iC3b形成活性。視情況，使用均相時差式螢光(HTRF)分析測定經修飾之CFI多肽之CFI活性。視情況，在pH 7下與C3b及CFH一起培育1小時，隨後與抗iC3b IgG及抗C3b IgG一起培育1小時之後，量測經修飾之CFI多肽之CFI活性。視情況，在pH 7下與C3b及CFH一起培育30分鐘，隨後與抗iC3b IgG及抗C3b IgG一起培育30分鐘之後量測CFI活性。視情況，抗iC3b IgG為抗iC3b (Tb) IgG，且抗C3b IgG為抗C3b (FITC) IgG。
本文中之CFI多肽之活性(亦稱為「
CFI 活性」)可指用於測定CFI多肽之活性的功能分析中所觀測之活性。活性可為比活性，其係指CFI多肽之每單位的活性，以便考慮到樣本中之CFI多肽的量或濃度來將活性標準化。此可藉由例如使用標準ELISA分析量測樣本中之CFI多肽之濃度及將活性除以CFI濃度來進行。可藉由使用對iC3b新抗原決定基具有特異性之抗體，例如使用均相時差式螢光(HTRF)分析(諸如本文所描述之彼等分析)量測CFI介導之C3b至iC3b之裂解(亦稱為「
CFI iC3b 形成活性」、「
iC3b 形成活性」或「
C3b 降解活性」)來評估CFI多肽之活性。出於本申請案之目的，術語「
iC3b 形成活性」、「
C3b 不活化活性」及「
C3b 降解活性」應視為同義的。舉例而言，在實例1中以標題「
使用 HTRF 分析經由量測 iC3b 形成來測定 CFI 活性」揭示適合的分析。下文論述用於評估CFI多肽之活性的適合方法。
可由熟習此項技術者評定CFI多肽之iC3b形成活性。舉例而言，將包含待測試多肽之樣本與因子H及C3b混合。待與因子H及C3b混合之樣本中之多肽的濃度可為150 pM。樣本可與因子H及C3b混合以使得多肽之濃度為75 pM，C3b之濃度為4.5 nM且因子H之濃度為3 nM。可將混合物培育1小時。培育可在室溫下進行。隨後可使用僅結合人類iC3b新抗原之抗體(亦即僅結合iC3b而非C3b之抗體)及結合至C3b及iC3b兩者之抗體來量測C3b至iC3b之裂解。僅結合人類iC3b新抗原之抗體可為結合於鋱穴狀化合物之單株IgG抗體(例如來自CisBio，諸如實例1中所指定之抗體)。結合至C3b及iC3b兩者之抗體可與螢光素(FITC)結合(例如來自Cedarlane，諸如實例1中指定之抗體)。可將兩種抗體添加至多肽、因子H及C3b之混合物中，使得多肽之濃度為50 pM，C3b之濃度為3 nM且因子H之濃度為2 nM。僅結合人類iC3b新抗原之抗體混合物中之濃度可為0.5 µg/mL，且結合至C3b及iC3b兩者之抗體濃度可為12 nM。可將混合物再培育1小時。接著可如下文所論述以螢光測定方式評定iC3b形成活性。
為了以螢光測定方式評定iC3b形成活性，可將待測試之混合物(例如在與抗體一起培育之後的混合物)暴露於340 nm之激勵波長(例如使用SpectraMax® i3盤式讀取器；Molecular Devices)。接著可獲取螢光讀數。可針對鋱穴狀化合物之發射光譜獲取490 nM下之螢光讀數且針對FITC之發射光譜獲取520 nm下之螢光讀數。接著可針對490 nm及520 nm讀數兩者計算平均螢光強度(MFI)。若已形成iC3b，則兩種抗體將結合iC3b，且鋱穴合物及螢光素將足夠接近在一起以進行FRET。FRET水準(其藉由MFI在490 nm及520 nm下量測)將與所產生之iC3b之量成比例。可隨後藉由將在520 nm (HTRF受體)下量測之MFI除以490 nm (HTRF供體)下量測之MFI且將所得值乘以10,000來計算HTRF比率。
CFI多肽之iC3b形成活性可如何藉由熟習此項技術者評定之另一實例如下。舉例而言，將包含待測試多肽之樣本與因子H及C3b混合。待與因子H及C3b混合之樣本中之多肽的濃度可為75 pM。樣本可與因子H及C3b混合以使得多肽之濃度為37.5 pM，C3b之濃度為4.5 nM且因子H之濃度為3 nM。可將混合物培育30分鐘。培育可在室溫下進行。隨後可使用僅結合人類iC3b新抗原之抗體(亦即僅結合iC3b而非C3b之抗體)及結合至C3b及iC3b兩者之抗體來量測C3b至iC3b之裂解。僅結合人類iC3b新抗原之抗體可為結合於鋱穴狀化合物之單株IgG抗體(例如來自CisBio，諸如實例1中所指定之抗體)。結合至C3b及iC3b兩者之抗體可與螢光素(FITC)結合(例如來自Cedarlane，諸如實例1中指定之抗體)。可將兩種抗體添加至多肽、因子H及C3b之混合物中，使得多肽之濃度為25 pM，C3b之濃度為3 nM且因子H之濃度為2 nM。僅結合人類iC3b新抗原之抗體混合物中之濃度可為0.5 µg/mL，且結合至C3b及iC3b兩者之抗體濃度可為12 nM。可將混合物再培育30分鐘。接著可如上文所論述以螢光測定方式評定iC3b形成活性。
多肽之濃度可使用適合的分析，諸如ELISA測定。本文描述適合的ELISA分析。可使用ELISA，諸如實例1中所描述之ELISA。
待測試之多肽可包含於上清液中。因此，包含CFI多肽之樣本可為上清液。在用包含編碼多肽之核苷酸序列的聚核苷酸轉染細胞之後，待測試之多肽可能已表現且分泌至上清液中。用於獲得包含待測試之多肽之上清液的適合方法如下。包含編碼多肽之核苷酸序列的聚核苷酸(例如如實例1中所描述之含有轉殖基因之質體)可例如藉由使用轉染試劑轉染至細胞(例如Expi293F細胞)中。視情況，包含編碼弗林蛋白酶(Furin) (例如人類弗林蛋白酶)之核苷酸序列的聚核苷酸亦可轉染至細胞中。接著可培育細胞以允許多肽表現及分泌至上清液中。隨後可收集上清液。可根據實例1中所描述之方案獲得包含多肽之上清液。視情況，當測試多肽時，用His-標籤(例如6His-標籤)標記多肽。舉例而言，當進行測試時，多肽可在成熟CFI多肽之N端處包含His-標籤(例如6His-標籤)。若在用包含編碼多肽之核苷酸序列的聚核苷酸轉染細胞之後待測試之多肽表現且分泌至上清液中，則核苷酸序列可在編碼成熟CFI多肽之序列之N端處編碼His-標籤(例如6His-標籤)。舉例而言，核苷酸序列可編碼在編碼信號肽之序列與編碼成熟CFI多肽之序列之間的His-標籤(例如6His-標籤)。舉例而言，可製備轉殖基因，其包含編碼信號肽之序列、編碼6His-標籤之序列及編碼成熟CFI序列之序列，如實例1中所闡述。舉例而言，若待測試之多肽包含在對應於SEQ ID NO: 1之位置383的位置處經酪胺酸之取代及在對應於SEQ ID NO: 1之位置53的位置處經白胺酸之取代，則轉殖基因可包含SEQ ID NO: 17之序列。
在ELISA分析之實例中，結合於CFI多肽之抗體可結合至培養盤。可使包含未知濃度之CFI多肽的樣本通過培養盤。結合於CFI多肽之第二偵測抗體可塗覆至培養盤，且洗掉任何盈餘物。留下(亦即未洗掉)之偵測抗體將結合於CFI多肽。偵測抗體可連接至酶，諸如辣根過氧化酶，或偵測抗體可經生物素標記。可藉由量測偵測抗體之量來量測結合於培養盤上之CFI多肽的偵測抗體之含量。舉例而言，若偵測抗體連接至辣根過氧化酶，則辣根過氧化酶可催化自諸如TMB（3,3',5,5'-四甲基聯苯胺)之受質產生藍色反應產物，且可藉由450 nm下之吸光度偵測藍色產物之含量。作為另一實例，若偵測抗體經生物素標記，則可以添加鏈黴抗生物素蛋白過氧化酶結合物以便結合經生物素標記之偵測抗體，且過氧化酶可以催化自諸如TMB (3,3',5,5'-四甲基聯苯胺)之受質產生藍色反應產物，且可以藉由450 nm下之吸光度偵測藍色產物之含量。藍色產物之含量與洗滌步驟後剩餘之偵測抗體之量成比例，該量與樣本中之CFI多肽之量成比例。藍色產物之含量愈高，樣本中CFI多肽之濃度愈高。CFI多肽之濃度可使用標準曲線評估。舉例而言，可藉由獲得用於已知濃度之一系列CFI標準(除了樣本之外)的吸光度及相對於對應濃度(對數)標繪每一標準之吸光度(線性)來獲得標準曲線。可隨後根據標準曲線判定樣本中CFI多肽之濃度。或者，例如當使用純化蛋白質時，可以分光光度法測定CFI多肽之量或濃度。
視情況，一或多個突變包含在經修飾之CFI多肽內可與C3b形成界面的一或多個位置處的突變。視情況，一或多個突變包含在經修飾之CFI多肽內可與因子H形成界面的一或多個位置處的突變。視情況，該一或多個突變包含(i)在經修飾之CFI多肽內可與C3b形成界面的一或多個位置處的突變，及/或(ii)在經修飾之CFI多肽內可與因子H形成界面的一或多個位置處的突變。
片語「
一或多個突變包含在經修飾之 CFI 多肽內可與 [ 多肽 X] 形成界面的一或多個位置處的突變」意謂該一或多個突變中之突變在經修飾之CFI多肽內能夠與多肽X (其為C3b或因子H)形成界面的一或多個位置處。一或多個位置處之突變僅需要能夠與多肽X形成界面。其不需要與多肽X形成界面。舉例而言，一或多個位置處之突變可不與多肽X相互作用。視情況，經修飾之CFI多肽可不結合於多肽X。或者，一或多個位置處之突變可與多肽X相互作用。視情況，經修飾之CFI多肽可結合於多肽X。此外，當界面處存在兩個或更多個突變時，該兩個或更多個突變不必在多肽之一級、二級或三級結構中彼此緊鄰。實情為，全部所需的係其均形成介面之部分。
當野生型CFI多肽與多肽X相互作用或結合於多肽X時，「
在經修飾之 CFI 多肽內可與[多肽X]
形成界面的一或多個位置」被視為對應於野生型CFI多肽(諸如SEQ ID NO: 1之多肽)內之胺基酸位置的經修飾CFI多肽內的任一胺基酸位置，該野生型CFI多肽在多肽X中之胺基酸之6埃內。多肽X為C3b或因子H。熟習此項技術者可易於藉由例如分析晶體結構而確定兩個胺基酸是否在彼此6埃內。舉例而言，有可能使用此項技術中已知之任何結構分析軟體來量測距離。熟習此項技術者亦可使用此項技術中已知之任何其他適合之方法來確定CFI多肽中可與諸如C3b或因子H之多肽X形成界面的位置。
視情況，一或多個突變包含在經修飾之CFI多肽內可與C3b形成界面的一或多個位置處的突變。視情況，一或多個突變包含在經修飾之CFI多肽內可與C3b形成界面的兩個或更多個位置處的突變。
視情況，一或多個突變包含在經修飾之CFI多肽內可與因子H形成界面的一或多個位置處的突變。視情況，一或多個突變包含在經修飾之CFI多肽內可與因子H形成界面的兩個或更多個位置處的突變。視情況，一或多個突變包含在經修飾之CFI多肽內可與因子H形成界面的三個或更多個位置處的突變。視情況，一或多個突變包含在經修飾之CFI多肽內可與因子H形成界面的四個或更多個位置處的突變。視情況，一或多個突變包含在經修飾之CFI多肽內可與因子H形成界面的五個或更多個位置處的突變。
視情況，該一或多個突變包含(i)在經修飾之CFI多肽內可與C3b形成界面的一或多個位置處的突變，及(ii)在經修飾之CFI多肽內可與因子H形成界面的一或多個位置處的突變。視情況，該一或多個突變包含(i)在經修飾之CFI多肽內可與C3b形成界面的一或多個位置處的突變，及(ii)在經修飾之CFI多肽內可與因子H形成界面的兩個或更多個位置處的突變。視情況，該一或多個突變包含(i)在經修飾之CFI多肽內可與C3b形成界面的一或多個位置處的突變，及/或(ii)在經修飾之CFI多肽內可與因子H形成界面的三個或更多個位置處的突變。視情況，該一或多個突變包含(i)在經修飾之CFI多肽內可與C3b形成界面的一或多個位置處的突變，及/或(ii)在經修飾之CFI多肽內與因子H形成界面的四個或更多個位置處的突變。視情況，該一或多個突變包含(i)在經修飾之CFI多肽內可與C3b形成界面的兩個或更多個位置處的突變，及(ii)在經修飾之CFI多肽內可與因子H形成界面的一或多個位置處的突變。視情況，該一或多個突變包含(i)在經修飾之CFI多肽內可與C3b形成界面的兩個或更多個位置處的突變，及(ii)在經修飾之CFI多肽內可與因子H形成界面的兩個或更多個位置處的突變。視情況，該一或多個突變包含(i)在經修飾之CFI多肽內可與C3b形成界面的兩個或更多個位置處的突變，及/或(ii)在經修飾之CFI多肽內與因子H形成界面的三個或更多個位置處的突變。
視情況，經修飾CFI多肽內可與C3b形成界面的一或多個位置為經修飾CFI多肽內對應於選自以下之胺基酸位置的任一胺基酸位置：SEQ ID NO: 1之53、54、55、56、58、60、63、64、65、66、69、80、81、82、83、84、87、88、90、91、94、95、360、361、362、363、364、365、379、381、383、384、385、386、389、390、414、416、417、418、419、421、422、423、424、425、426、473、474、477、479、481、499、502、511、519、520、521、522、523、524、526、544、545、546、547、548、549、550、551、552、555、556、557、558、559、567、568、570、571、572、574及575。
視情況，經修飾CFI多肽內可與C3b形成界面的位置不包括經修飾之CFI多肽內對應於選自SEQ ID NO: 1之380、429及525之胺基酸位置的任一胺基酸位置。視情況，經修飾之CFI多肽內可與C3b形成界面的位置不包括經修飾之CFI多肽內對應於形成活性位點之胺基酸位置的任一胺基酸位置。野生型CFI多肽之活性位點包含對應於SEQ ID NO: 1之位置380、429及525處之胺基酸之所謂胺基酸『催化三聯體』。取代此等胺基酸中之一者或此等胺基酸中之一者附近之胺基酸可降低CFI之催化活性。
視情況，經修飾之CFI多肽內可與C3b形成界面的至少一個位置處於SP域中。視情況，SP域中之經修飾CFI多肽內的可與C3b形成界面的位置為經修飾CFI多肽內對應於選自以下之位置的任一位置：SEQ ID NO: 1之360、361、362、363、364、365、379、381、383、384、385、386、389、390、414、416、417、418、419、421、422、423、424、425、426、473、474、477、479、481、499、502、511、519、520、521、522、523、524、526、544、545、546、547、548、549、550、551、552、555、556、557、558、559、567、568、570、571、572、574及575。
視情況，經修飾CFI多肽內可與C3b形成界面的至少一個位置處於SP域中且可與C3bα鏈中之CTC域形成界面。視情況，SP域中之經修飾CFI多肽內的可與C3bα鏈中之CTC域形成界面的至少一個位置為經修飾CFI多肽內對應於選自SEQ ID NO: 1之414、416、417、418、419、567、568、570、571、572、574及575之位置的任一位置。視情況，SP域中之經修飾CFI多肽內的可與C3bα鏈中之CTC域形成界面的至少一個位置為經修飾之CFI多肽內對應於選自SEQ ID NO: 1之419、568、571、572及575之位置的任一位置。
視情況，經修飾CFI多肽內可與C3b形成界面之至少一個位置處於SP域中且可與C3bα鏈中之CUB域形成界面。視情況，SP域中之經修飾CFI多肽內的可與C3bα鏈中之CUB域形成界面的至少一個位置為經修飾CFI多肽內對應於選自以下之位置的任一位置：SEQ ID NO: 1之361、362、363、364、365、379、381、383、384、385、386、390、417、421、422、423、424、425、426、473、474、477、479、481、499、502、511、519、520、521、522、523、524、526、544、545、546、547、548、549、550、551、552、555、556、557、558及559。視情況，SP域中之經修飾CFI多肽內的可與C3bα鏈中之CUB域形成界面的至少一個位置為經修飾CFI多肽內對應於選自以下之位置的任一位置：SEQ ID NO: 1之362、384、385、386、421、423、424、426、474、479、481、502、519、520、522、523、544、545、547、548、549、555及557。
視情況，經修飾CFI多肽內可與C3b形成界面的至少一個位置處於SP域中且可與C3bα鏈中之CUB域內的受質環形成界面。視情況，SP域中之經修飾CFI多肽內的可與C3bα鏈中之CUB域內的受質環形成界面的至少一個位置為經修飾CFI多肽內對應於選自以下之位置的任一位置：SEQ ID NO: 1之361、362、363、364、365、381、423、424、426、473、474、477、479、481、499、502、511、519、520、521、522、523、524、526、544、545、546、547、548、549、550、551、552、555、556、557、558及559。視情況，SP域中之經修飾CFI多肽內的可與C3bα鏈中之CUB域內的受質環形成界面的一或多個位置為經修飾CFI多肽內對應於選自以下之位置的任一位置：SEQ ID NO: 1之362、423、424、426、474、479、481、502、519、520、522、523、544、545、547、548、549、555及557。
視情況，經修飾CFI多肽內可與C3b形成界面的至少一個位置處於SP域中且可與C3b之C3bβ鏈形成界面。視情況，SP域中之經修飾CFI多肽內的可與C3b之C3bβ鏈形成界面的至少一個位置為經修飾CFI多肽內對應於選自以下之位置的任一位置：SEQ ID NO: 1之360、386及389。視情況，SP域中之經修飾CFI多肽內的可與C3b之C3bβ鏈形成界面的一或多個位置為經修飾CFI多肽內對應於SEQ ID NO: 1之位置386的位置。
視情況，經修飾之CFI多肽內可與C3b形成界面的至少一個位置處於FIM域中。視情況，FIM域中之經修飾之CFI多肽內的可與C3b形成界面的位置為經修飾之CFI多肽內對應於選自以下之位置的任一位置：SEQ ID NO: 1之53、54、55、56、58、60、63、64、65、66、69、80、81、82、83、84、87、88、90、91、94及95。
視情況，經修飾CFI多肽內可與C3b形成界面的至少一個位置處於FIM域中且可與C3bα鏈中之CTC域形成界面。視情況，FIM域中之經修飾CFI多肽內的可與C3bα鏈中之CTC域形成界面的至少一個位置為經修飾CFI多肽內對應於選自以下之位置的任一位置：SEQ ID NO: 1之53、54、55、56、58、60、63、64、65、66、69、80、81、82、83、84、87、88、90、91、94及95。
視情況，經修飾CFI多肽內可與因子H形成界面的至少一個位置處於SP域中。視情況，SP域中之經修飾CFI多肽內的可與因子H形成界面的位置為經修飾之CFI多肽內對應於選自以下之位置的任一位置：SEQ ID NO: 1之345、358、360、361、362、363、364、391、393、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、436、437、438、439、440、441、442、474、478、479、480、481、482及483。
視情況，可與因子H形成介面之經修飾CFI多肽內的至少一個位置處於SP域中且可與因子H中之CCP2域形成介面。視情況，SP域中之經修飾CFI多肽內的可與因子H之CCP2域形成界面的至少一個位置為經修飾之CFI多肽內對應於選自以下之位置的任一位置：SEQ ID NO: 1之358、360、391、393、399、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、436、437、438、439、440、441及442。視情況，SP域中之經修飾CFI多肽內的可與因子H之CCP2域形成界面的至少一個位置為經修飾之CFI多肽內對應於選自以下之位置的任一位置：SEQ ID NO: 1之358、391、393、399、402、404、405、406、407、408、409、410、411、437、440及441。
視情況，經修飾CFI多肽內可與因子H形成界面的至少一個位置處於SP域中且可與因子H中之CCP3域形成界面。視情況，SP域中之經修飾CFI多肽內的可與因子H之CCP3域形成界面的一或多個位置為經修飾CFI多肽內對應於選自以下之位置的任一位置：SEQ ID NO: 1之345、358、361、362、363、364、393、399、400、401、402、404、474、478、479、480、481、482及483。視情況，SP域中之經修飾CFI多肽內的可與因子H之CCP3域形成界面的一或多個位置為經修飾CFI多肽內對應於選自以下之位置的任一位置：SEQ ID NO: 1之358、362、393、399、402、404、474、479、481及482。
本發明之經修飾CFI多肽包含一或多個突變(亦即至少一個取代突變)。一或多個突變(諸如在對應於下文列出之位置的位置處之突變)可提供如本文中所論述之特性中之一或多者(例如較高CFI活性)。包含一或多個突變(諸如在對應於下文列出之位置的位置處之突變)之經修飾CFI多肽可具有如本文中所論述之特性中之一或多者(例如較高CFI活性)。
在一些實施例中，一或多個突變包含在對應於選自由以下組成之群的位置處的突變：SEQ ID NO: 1之53、60、383、384、400、401、407、408、409、439、440、441、479及482。視情況，該一或多個突變包含在一或多個、兩個或更多個、三個或更多個、四個或更多個或五個或更多個對應於選自由以下組成之群的位置的位置處之突變：SEQ ID NO: 1之53、60、383、384、400、401、407、408、409、439、440、441、479及482。
視情況，該一或多個突變包含在對應於選自由以下組成之群之位置的位置處之突變：SEQ ID NO: 1之53、60、383、384、401、407、408、409、439、441、479及482。視情況，該一或多個突變包含在一或多個、兩個或更多個、三個或更多個、四個或更多個或五個或更多個對應於選自由以下組成之群的位置的位置處之突變：SEQ ID NO: 1之53、60、383、384、401、407、408、409、439、441、479及482。
視情況，該一或多個突變包含在對應於選自由以下組成之群的位置的位置處之突變：SEQ ID NO: 1之53、383、401、408、409、439、441、479及482。視情況，該一或多個突變包含在一或多個、兩個或更多個、三個或更多個、四個或更多個或五個或更多個對應於選自由以下組成之群的位置的位置處之突變：SEQ ID NO: 1之53、383、401、408、409、439、441、479及482。
視情況，該一或多個突變包含在對應於選自由以下組成之群的位置的位置處之突變：SEQ ID NO: 1之53、383、401、409、439、441及479。視情況，該一或多個突變包含在一或多個、兩個或更多個、三個或更多個、四個或更多個或五個或更多個對應於選自由以下組成之群的位置的位置處之突變：SEQ ID NO: 1之53、383、401、409、439、441及479。視情況，該一或多個突變包含在一或多個或兩個或更多個對應於選自由以下組成之群的位置的位置處之突變：SEQ ID NO: 1之53、383、401、409、439、441及479。
視情況，該一或多個突變包含在對應於選自由以下組成之群的位置的位置處之突變：SEQ ID NO: 1之53、383、401、409、439及479。視情況，該一或多個突變包含在一或多個、兩個或更多個、三個或更多個、四個或更多個或五個或更多個對應於選自由以下組成之群的位置的位置處之突變：SEQ ID NO: 1之53、383、401、409、439及479。視情況，該一或多個突變包含在兩個或更多個對應於選自由以下組成之群的位置的位置處之突變：SEQ ID NO: 1之53、383、401、409、439及479。
視情況，經修飾CFI多肽的一或多個突變包含突變為更具疏水性的胺基酸。已進行生物物理研究以確定二十個天然存在之胺基酸之疏水性，或更特別地，胺基酸之相對疏水性，且疏水性標度列出胺基酸中之每一者之親水性。一個此類實例為Wimley-White全殘基疏水性標度，其計算胺基酸自水相轉移至非水相(辛醇)之自由能。術語「更具疏水性的胺基酸」係指根據Wimley-White疏水性標度具有自水相轉變為辛醇之更有利(更小的負ΔG)自由能值的胺基酸。水相轉變為辛醇之自由能顯示於下表3中，且以圖形方式顯示於圖8中。以更具疏水性的胺基酸為起始物質，Wimley-White疏水性標度按以下次序列出胺基酸之疏水性：色胺酸、苯丙胺酸、白胺酸、異白胺酸、酪胺酸、甲硫胺酸、纈胺酸、半胱胺酸、麩胺酸(不帶電)、組胺酸(不帶電)、脯胺酸、蘇胺酸、天冬胺酸(不帶電)、絲胺酸、丙胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、甘胺酸、精胺酸(帶正電)、組胺酸(帶正電)、離胺酸(帶正電)、麩胺酸(帶負電)、天冬胺酸(帶負電)。
表3-水轉變為辛醇之Wimley-White全殘基疏水性標度。
| 胺基酸 | 辛醇標度 ΔG w-oct (kcal/mol) |
| Trp | -2.09 |
| Phe | -1.71 |
| Leu | -1.25 |
| Ile | -1.12 |
| Tyr | -0.71 |
| Met | -0.67 |
| Val | -0.46 |
| Cys | -0.02 |
| Glu | 0.11 |
| His | 0.11 |
| Pro | 0.14 |
| Thr | 0.25 |
| Asp | 0.43 |
| Ser | 0.46 |
| Ala | 0.5 |
| Gln | 0.77 |
| Asn | 0.85 |
| Gly | 1.15 |
| Arg+ | 1.81 |
| His+ | 2.33 |
| Lys+ | 2.8 |
| Glu- | 3.63 |
| Asp- | 3.64 |
視情況，經修飾CFI多肽之一或多個突變包含對應於SEQ ID NO: 1之位置53的位置處之突變。視情況，在對應於SEQ ID NO: 1之位置53的位置處之突變為經異白胺酸、白胺酸、酪胺酸或麩胺酸取代。視情況，在對應於SEQ ID NO: 1之位置53的位置處之突變為經異白胺酸取代，視情況為R53I。視情況，在對應於SEQ ID NO: 1之位置53的位置處之突變為經白胺酸取代，視情況為R53L。視情況，在對應於SEQ ID NO: 1之位置53的位置處之突變為經酪胺酸取代，視情況為R53Y。視情況，在對應於SEQ ID NO: 1之位置53的位置處之突變為經麩胺酸，視情況R53E取代。
視情況，經修飾CFI多肽之一或多個突變包含對應於SEQ ID NO: 1之位置60的位置處之突變。視情況，在對應於SEQ ID NO: 1之位置60的位置處之突變為經絲胺酸或麩胺酸取代。視情況，在對應於SEQ ID NO: 1之位置60的位置處之突變為經絲胺酸，視情況V60S取代。視情況，在對應於SEQ ID NO: 1之位置60的位置處之突變為經麩胺酸，視情況V60E取代。
視情況，經修飾CFI多肽之一或多個突變包含對應於SEQ ID NO: 1之位置383的位置處之突變。視情況，在對應於SEQ ID NO: 1之位置383的位置處之突變為經異白胺酸、白胺酸、酪胺酸、麩胺酸或苯丙胺酸取代。視情況，在對應於SEQ ID NO: 1之位置383的位置處之突變為經異白胺酸取代，視情況為R383I。視情況，在對應於SEQ ID NO: 1之位置383的位置處之突變為經白胺酸，視情況R383L取代。視情況，在對應於SEQ ID NO: 1之位置383的位置處之突變為經酪胺酸取代，視情況為R383Y。視情況，在對應於SEQ ID NO: 1之位置383的位置處之突變為經麩胺酸取代，視情況為R383E。視情況，在對應於SEQ ID NO: 1之位置383的位置處之突變為經苯丙胺酸取代，視情況為R383F。
視情況，經修飾CFI多肽之一或多個突變包含對應於SEQ ID NO: 1之位置384的位置處之突變。視情況，在對應於SEQ ID NO: 1之位置384的位置處之突變為經異白胺酸、色胺酸、酪胺酸或苯丙胺酸取代。視情況，在對應於SEQ ID NO: 1之位置384的位置處之突變為經異白胺酸，視情況A384I取代。視情況，在對應於SEQ ID NO: 1之位置384的位置處之突變為經色胺酸，視情況A384W取代。視情況，在對應於SEQ ID NO: 1之位置384的位置處之突變為經酪胺酸，視情況A384Y取代。視情況，在對應於SEQ ID NO: 1之位置384的位置處之突變為經苯丙胺酸，視情況A384F取代。
視情況，經修飾CFI多肽之一或多個突變包含對應於SEQ ID NO: 1之位置400的位置處之突變。視情況，在對應於SEQ ID NO: 1之位置400的位置處之突變為經色胺酸、酪胺酸或精胺酸取代。視情況，在對應於SEQ ID NO: 1之位置400的位置處之突變為經色胺酸，視情況I400W取代。視情況，在對應於SEQ ID NO: 1之位置400的位置處之突變為經酪胺酸，視情況I400Y取代。視情況，在對應於SEQ ID NO: 1之位置400的位置處之突變為經精胺酸，視情況I400R取代。
視情況，經修飾CFI多肽之一或多個突變包含對應於SEQ ID NO: 1之位置401的位置處之突變。視情況，在對應於SEQ ID NO: 1之位置401的位置處之突變為經甘胺酸、酪胺酸、苯丙胺酸或色胺酸取代。視情況，在對應於SEQ ID NO: 1之位置401的位置處之突變為經甘胺酸，視情況H401G取代。視情況，在對應於SEQ ID NO: 1之位置401的位置處之突變為經酪胺酸取代，視情況為H401Y。視情況，在對應於SEQ ID NO: 1之位置401的位置處之突變為經苯丙胺酸，視情況H401F取代。視情況，在對應於SEQ ID NO: 1之位置401的位置處之突變為經色胺酸，視情況H401W取代。
視情況，經修飾CFI多肽之一或多個突變包含對應於SEQ ID NO: 1之位置407的位置處之突變。視情況，在對應於SEQ ID NO: 1之位置407的位置處之突變為經苯丙胺酸，視情況I407F取代。
視情況，經修飾CFI多肽之一或多個突變包含對應於SEQ ID NO: 1之位置408的位置處之突變。視情況，在對應於SEQ ID NO: 1之位置408的位置處之突變為經蘇胺酸或酪胺酸取代。視情況，在對應於SEQ ID NO: 1之位置408的位置處之突變為經蘇胺酸，視情況V408T取代。視情況，在對應於SEQ ID NO: 1之位置408的位置處之突變為經酪胺酸，視情況V408Y取代。
視情況，經修飾CFI多肽之一或多個突變包含對應於SEQ ID NO: 1之位置409的位置處之突變。視情況，在對應於SEQ ID NO: 1之位置409的位置處之突變為經苯丙胺酸、色胺酸或麩胺酸取代。視情況，在對應於SEQ ID NO: 1之位置409的位置處之突變為經苯丙胺酸取代，視情況為I409F。視情況，在對應於SEQ ID NO: 1之位置409的位置處之突變為經色胺酸，視情況I409W取代。視情況，在對應於SEQ ID NO: 1之位置409的位置處之突變為經麩胺酸，視情況I409E取代。
視情況，經修飾CFI多肽之一或多個突變包含對應於SEQ ID NO: 1之位置439的位置處之突變。視情況，在對應於SEQ ID NO: 1之位置439的位置處之突變為經白胺酸、麩胺酸或麩醯胺酸取代。視情況，在對應於SEQ ID NO: 1之位置439的位置處之突變為經白胺酸，視情況麩胺酸G439L取代。視情況，在對應於SEQ ID NO: 1之位置439的位置處之突變為經麩胺酸取代，視情況為G439E。視情況，在對應於SEQ ID NO: 1之位置439的位置處之突變為經麩醯胺酸，視情況G439Q取代。
視情況，經修飾CFI多肽之一或多個突變包含對應於SEQ ID NO: 1之位置440的位置處之突變。視情況，在對應於SEQ ID NO: 1之位置440的位置處之突變為經蘇胺酸，視情況N440T取代。
視情況，經修飾CFI多肽之一或多個突變包含對應於SEQ ID NO: 1之位置441的位置處之突變。視情況，在對應於SEQ ID NO: 1之位置441的位置處之突變為經麩胺酸、苯丙胺酸或酪胺酸取代。視情況，在對應於SEQ ID NO: 1之位置441的位置處之突變為經麩胺酸，視情況K441E取代。視情況，在對應於SEQ ID NO: 1之位置441的位置處之突變為經苯丙胺酸取代，視情況為K441F。視情況，在對應於SEQ ID NO: 1之位置441的位置處之突變為經酪胺酸取代，視情況為K441Y。
視情況，經修飾CFI多肽之一或多個突變包含對應於SEQ ID NO: 1之位置479的位置處之突變。視情況，在對應於SEQ ID NO: 1之位置479的位置處之突變為經天冬胺酸取代，視情況為E479D。
視情況，經修飾CFI多肽之一或多個突變包含對應於SEQ ID NO: 1之位置482的位置處之突變。視情況，在對應於SEQ ID NO: 1之位置482的位置處之突變為經色胺酸、白胺酸、組胺酸、異白胺酸、麩醯胺酸、精胺酸或蘇胺酸取代。視情況，在對應於SEQ ID NO: 1之位置482的位置處之突變為經色胺酸，視情況F482W取代。視情況，在對應於SEQ ID NO: 1之位置482的位置處之突變為經白胺酸，視情況F482L取代。視情況，在對應於SEQ ID NO: 1之位置482的位置處之突變為經組胺酸，視情況F482H取代。視情況，在對應於SEQ ID NO: 1之位置482的位置處之突變為經異白胺酸，視情況F482I取代。視情況，在對應於SEQ ID NO: 1之位置482的位置處之突變為經麩醯胺酸，視情況F482Q取代。視情況，在對應於SEQ ID NO: 1之位置482的位置處之突變為經精胺酸，視情況F482R取代。視情況，在對應於SEQ ID NO: 1之位置482的位置處之突變為經蘇胺酸，視情況F482T取代。
視情況，經修飾CFI多肽的一或多個突變包含：
(i) 在對應於SEQ ID NO: 1之位置53的位置處之突變；及
(ii) 在對應於SEQ ID NO: 1之位置383的位置處之突變。
視情況：
(i) 在對應於SEQ ID NO: 1之位置53的位置處之突變為經異白胺酸取代，視情況為R53I；及
(ii) 在對應於SEQ ID NO: 1之位置383的位置處之突變為經麩胺酸取代，視情況為R383E。
視情況：
(i) 在對應於SEQ ID NO: 1之位置53的位置處之突變為經白胺酸取代，視情況為R53L；及
(ii) 在對應於SEQ ID NO: 1之位置383的位置處之突變為經麩胺酸、異白胺酸或酪胺酸取代。
視情況：
(i) 在對應於SEQ ID NO: 1之位置53的位置處之突變為經白胺酸取代，視情況為R53L；及
(ii) 在對應於SEQ ID NO: 1之位置383的位置處之突變為經麩胺酸取代，視情況為R383E。
視情況：
(i) 在對應於SEQ ID NO: 1之位置53的位置處之突變為經白胺酸取代，視情況為R53L；及
(ii) 在對應於SEQ ID NO: 1之位置383的位置處之突變為經異白胺酸取代，視情況為R383I。
視情況：
(i) 在對應於SEQ ID NO: 1之位置53的位置處之突變為經白胺酸取代，視情況為R53L；及
(ii) 在對應於SEQ ID NO: 1之位置383的位置處之突變為經酪胺酸取代，視情況為R383Y。
視情況：
(i) 在對應於SEQ ID NO: 1之位置53的位置處之突變為經酪胺酸取代，視情況為R53Y；及
(ii) 在對應於SEQ ID NO: 1之位置383的位置處之突變為經酪胺酸取代，視情況為R383Y。
視情況，經修飾CFI多肽的一或多個突變包含：
(i) 在對應於SEQ ID NO: 1之位置53的位置處之突變；及
(ii) 在對應於SEQ ID NO: 1之位置401的位置處之突變。
視情況：
(i) 在對應於SEQ ID NO: 1之位置53的位置處之突變為經白胺酸取代，視情況為R53L；及
(ii) 在對應於SEQ ID NO: 1之位置401的位置處之突變為經酪胺酸取代，視情況為H401Y。
視情況：
(i) 在對應於SEQ ID NO: 1之位置53的位置處之突變為經酪胺酸取代，視情況為R53Y；及
(ii) 在對應於SEQ ID NO: 1之位置401的位置處之突變為經酪胺酸取代，視情況為H401Y。
視情況，經修飾CFI多肽的一或多個突變包含：
(i) 在對應於SEQ ID NO: 1之位置53的位置處之突變；及
(ii) 在對應於SEQ ID NO: 1之位置409的位置處之突變。
視情況：
(i) 在對應於SEQ ID NO: 1之位置53的位置處之突變為經白胺酸取代，視情況為R53L；及
(ii) 在對應於SEQ ID NO: 1之位置409的位置處之突變為經苯丙胺酸取代，視情況為I409F。
視情況：
(i) 在對應於SEQ ID NO: 1之位置53的位置處之突變為經酪胺酸取代，視情況為R53Y；及
(ii) 在對應於SEQ ID NO: 1之位置409的位置處之突變為經苯丙胺酸取代，視情況為I409F。
視情況，經修飾CFI多肽的一或多個突變包含：
(i) 在對應於SEQ ID NO: 1之位置53的位置處之突變；及
(ii) 在對應於SEQ ID NO: 1之位置479的位置處之突變。
視情況：
(i) 在對應於SEQ ID NO: 1之位置53的位置處之突變為經白胺酸取代，視情況為R53L；及
(ii) 在對應於SEQ ID NO: 1之位置479的位置處之突變為經天冬胺酸取代，視情況為E479D。
視情況，經修飾CFI多肽的一或多個突變包含：
(i) 在對應於SEQ ID NO: 1之位置383的位置處之突變；及
(ii) 在對應於SEQ ID NO: 1之位置401的位置處之突變。
視情況：
(i) 在對應於SEQ ID NO: 1之位置383的位置處之突變為經苯丙胺酸取代，視情況為R383F；及
(ii) 在對應於SEQ ID NO: 1之位置401的位置處之突變為經酪胺酸取代，視情況為H401Y。
視情況，經修飾CFI多肽的一或多個突變包含：
(i) 在對應於SEQ ID NO: 1之位置383的位置處之突變；及
(ii) 在對應於SEQ ID NO: 1之位置409的位置處之突變。
視情況：
(i) 在對應於SEQ ID NO: 1之位置383的位置處之突變為經苯丙胺酸取代，視情況為R383F；及
(ii) 在對應於SEQ ID NO: 1之位置409的位置處之突變為經苯丙胺酸取代，視情況為I409F。
視情況，經修飾CFI多肽的一或多個突變包含：
(i) 在對應於SEQ ID NO: 1之位置383的位置處之突變；及
(ii) 在對應於SEQ ID NO: 1之位置439的位置處之突變。
視情況：
(i) 在對應於SEQ ID NO: 1之位置383的位置處之突變為經苯丙胺酸取代，視情況為R383F；及
(ii) 在對應於SEQ ID NO: 1之位置439的位置處之突變為經麩胺酸取代，視情況為G439E。
視情況，該一或多個突變不包含選自M138V或S525A之突變，M138V或S525A為分別與SEQ ID NO: 1中之位置138及525對應之位置。視情況，該一或多個突變不包含M138V突變(其為與SEQ ID NO: 1中之位置138對應之位置)。視情況，該一或多個突變不包含S525A突變(其為與SEQ ID NO: 1中之位置525對應之位置)。視情況，該一或多個突變不包含在對應於SEQ ID NO: 1之位置380之位置處，視情況在H380處的突變。視情況，該一或多個突變不包含在對應於SEQ ID NO: 1之位置429之位置處，視情況在D429處的突變。視情況，該一或多個突變不包含在對應於SEQ ID NO: 1之位置525之位置處，視情況在S525處的突變。
視情況，該一或多個突變不包含對應於SEQ ID NO: 1之位置53的位置處之突變，視情況其中該突變為經A取代。視情況，該一或多個突變不包含在對應於SEQ ID NO: 1之位置383的位置處之突變，視情況其中該突變為經A、V、M、W、G、P、S、T、N、Q、H、K或D取代。視情況，該一或多個突變不包含對應於SEQ ID NO: 1之位置383的位置處之突變，其中該突變為經A、V、I、M、W、G、P、S、T、N、Q、H、K或D取代。視情況，該一或多個突變不包含在對應於SEQ ID NO: 1之位置383的位置處之突變，其中該突變為經A、V、I、M、W、G、P、S、T、N、Q、H、K、D、F、Y、L或E取代。視情況，該一或多個突變不包含對應於SEQ ID NO: 1之位置401的位置處之突變，視情況其中該突變為經G取代。視情況，該一或多個突變不包含在對應於SEQ ID NO: 1之位置409的位置處之突變，視情況其中該突變為經G取代。視情況，該一或多個突變不包含在對應於SEQ ID NO: 1之位置441的位置處之突變，視情況其中該突變為經G、A或D取代。視情況，該一或多個突變不包含對應於SEQ ID NO: 1之位置441的位置處之突變，其中該突變為經G、A、D或E取代。視情況，該一或多個突變不包含對應於SEQ ID NO: 1之位置384的位置處之突變，視情況其中該突變為經G取代。視情況，該一或多個突變不包含對應於SEQ ID NO: 1之位置400的位置處之突變，視情況其中該突變為經G取代。視情況，該一或多個突變不包含對應於SEQ ID NO: 1之位置407的位置處之突變，視情況其中該突變為經G取代。視情況，該一或多個突變不包含對應於SEQ ID NO: 1之位置408的位置處之突變，視情況其中該突變為經G取代。視情況，該一或多個突變不包含在對應於SEQ ID NO: 1之位置409的位置處之突變，視情況其中該突變為經G取代。視情況，該一或多個突變不包含在對應於SEQ ID NO: 1之位置440的位置處之突變，視情況其中該突變為經K取代。視情況，該一或多個突變不包含在對應於SEQ ID NO: 1之位置441的位置處之突變，視情況其中該突變為經G、A、E或D取代。視情況，該一或多個突變不包含在對應於SEQ ID NO: 1之位置441的位置處之突變，其中該突變為經G、A或D取代。視情況，該一或多個突變不包含在對應於SEQ ID NO: 1之位置479的位置處之突變，視情況其中該突變為經Q、K、R、H、G、A、D、F、I、L、M、N、P、S、T、W、Y或V取代。視情況，該一或多個不包含在對應於SEQ ID NO: 1之位置479的位置處之突變，其中該突變為經Q、K、R、H、G、A、F、I、L、M、N、P、S、T、W、Y或V取代。視情況，該一或多個突變不包含在對應於SEQ ID NO: 1之位置482的位置處之突變，視情況其中該突變為經Y取代。視情況，該一或多個突變不包含在對應於SEQ ID NO: 1之位置482的位置處之突變，其中該突變為經Y、L、I、A、P、H或G取代。視情況，該一或多個突變不包含在對應於SEQ ID NO: 1之位置482的位置處之突變，其中該突變為經Y、A、P或G取代。
視情況，該一或多個突變不包含表2至9、表13、表15及WO 2021/257480 (以引用之方式併入本文中)之實例中所呈現之一或多個修飾。視情況，該一或多個突變不包含表2至9、表13、表15及WO 2021/257480之實例中所呈現之修飾中之任一者。視情況，該一或多個突變不包含WO 2021/257480 (以引用之方式併入本文中)中所描述之一或多種修飾。視情況，該一或多個突變不包含WO 2021/257480中所描述之修飾中的任一者。視情況，該一或多個突變不包含表2至9、表13、表15及WO 2021/257480之實例中所呈現之一或多個取代突變。視情況，該一或多個突變不包含表2至9、表13、表15及WO 2021/257480之實例中所呈現之取代突變中之任一者。視情況，該一或多個突變不包含WO 2021/257480中所描述之一或多個取代突變。視情況，該一或多個突變不包含WO 2021/257480中所描述之取代突變中之任一者。視情況，經修飾之CFI多肽不包含表2至9、表13、表15及WO 2021/257480之實例中所呈現之一或多個CFI變異體。視情況，經修飾之CFI多肽不包含表2至9、表13、表15及WO 2021/257480之實例中所呈現之CFI變異體中之任一者。視情況，經修飾之CFI多肽不包含WO 2021/257480中所描述之一或多個CFI變異體。視情況，經修飾之CFI多肽不包含WO 2021/257480中所描述之CFI變異體中之任一者。
視情況，經修飾之CFI多肽不包含由WO 2021/257480中所描述之融合構築體中之一或多者編碼的胺基酸序列。視情況，經修飾之CFI多肽不包含由WO 2021/257480中所描述之融合構築體中之任一者編碼的胺基酸序列。
視情況，經修飾之CFI多肽不為融合蛋白。在此類實施例中，術語「融合蛋白」係指(例如直接或經由連接子)連接至CFI胺基酸序列之多肽組分之組合。「
多肽組分」與並非CFI多肽的多肽之連續片段具有至少80%一致性。在此類實施例中，「
連續片段」為「
並非 CFI 多肽之多肽」的至少25%。舉例而言，「
並非 CFI 多肽之多肽」可為白蛋白(諸如人類血清白蛋白)，且在此類實施例中，「
多肽組分」與至少25%白蛋白(諸如人類血清白蛋白)之連續片段具有至少80%一致性。在另一實例中，「
多肽組分」可為來自「並
非 CFI 多肽之多肽」的域。在另一實例中，「
多肽組分」可為「
並非 CFI 多肽之多肽」。
若經修飾之CFI多肽包含並非野生型(天然) CFI信號肽之信號肽，則此不會使經修飾之CFI多肽成為融合蛋白。特別地，若經修飾之CFI多肽包含來自另一多肽或為合成信號肽之信號肽，則此不會使經修飾之CFI多肽成為融合蛋白。
視情況，經修飾之CFI多肽包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2之至少200個胺基酸、至少250個胺基酸、至少300個胺基酸、至少400個胺基酸、至少500個胺基酸、400與565個之間的胺基酸、500與565個之間的胺基酸、520與565個之間的胺基酸、400與583個之間的胺基酸、500與583個之間的胺基酸或520與583個之間的胺基酸的片段具有至少80%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致性的胺基酸序列。視情況，經修飾之CFI多肽包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2具有至少80%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致性之胺基酸序列。視情況，經修飾之CFI多肽包含與SEQ ID NO: 1之500與583個之間的胺基酸的片段具有至少98%一致性之胺基酸序列。視情況，經修飾之CFI多肽包含與SEQ ID NO: 2之500與565個之間的胺基酸的片段具有至少98%一致性之胺基酸序列。視情況，經修飾之CFI多肽包含與SEQ ID NO: 1具有至少98%一致性之胺基酸序列。視情況，經修飾之CFI多肽包含與SEQ ID NO: 2具有至少98%一致性之胺基酸序列。
視情況，除了經修飾之CFI多肽包含本文中所描述之一或多個突變之外，經修飾之CFI多肽包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2一致之胺基酸序列。視情況，除了經修飾之CFI多肽包含本文所描述的在對應於SEQ ID NO: 1之位置53的位置處之突變之外，經修飾之CFI多肽包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2一致之胺基酸序列。視情況，除了經修飾之CFI多肽包含本文所描述的在對應於SEQ ID NO: 1之位置60的位置處之突變之外，該經修飾之CFI多肽包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2一致之胺基酸序列。視情況，除了經修飾之CFI多肽包含本文所描述的在對應於SEQ ID NO: 1之位置383的位置處之突變之外，該經修飾之CFI多肽包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2一致之胺基酸序列。視情況，除了經修飾之CFI多肽包含本文所描述的在對應於SEQ ID NO: 1之位置384的位置處的突變之外，該經修飾之CFI多肽包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2一致之胺基酸序列。視情況，除經修飾之CFI多肽包含本文所描述的在對應於SEQ ID NO: 1之位置400的位置處之突變之外，該經修飾之CFI多肽包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2一致之胺基酸序列。視情況，除經修飾之CFI多肽包含本文所描述的在對應於SEQ ID NO: 1之位置401的位置處之突變之外，該經修飾之CFI多肽包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2一致之胺基酸序列。視情況，除經修飾之CFI多肽包含本文所描述的在對應於SEQ ID NO: 1之位置407的位置處之突變之外，該經修飾之CFI多肽包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2一致之胺基酸序列。視情況，除經修飾之CFI多肽包含本文所描述的在對應於SEQ ID NO: 1之位置408的位置處之突變之外，該經修飾之CFI多肽包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2一致之胺基酸序列。視情況，除經修飾之CFI多肽包含本文所描述的在對應於SEQ ID NO: 1之位置409的位置處之突變之外，該經修飾之CFI多肽包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2一致之胺基酸序列。視情況，除經修飾之CFI多肽包含本文所描述的在對應於SEQ ID NO: 1之位置439的位置處之突變之外，該經修飾之CFI多肽包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2一致之胺基酸序列。視情況，除經修飾之CFI多肽包含本文所描述的在對應於SEQ ID NO: 1之位置440的位置處之突變之外，該經修飾之CFI多肽包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2一致之胺基酸序列。視情況，除經修飾之CFI多肽包含本文所描述的在對應於SEQ ID NO: 1之位置441的位置處之突變之外，該經修飾之CFI多肽包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2一致之胺基酸序列。視情況，除經修飾之CFI多肽包含本文所描述的在對應於SEQ ID NO: 1之位置479的位置處之突變之外，該經修飾之CFI多肽包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2一致之胺基酸序列。視情況，除經修飾之CFI多肽包含本文所描述的在對應於SEQ ID NO: 1之位置482的位置處之突變之外，該經修飾之CFI多肽包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2一致之胺基酸序列。
視情況，除經修飾之CFI多肽包含本文所描述的對應於SEQ ID NO: 1之位置53的位置處之突變及對應於SEQ ID NO: 1之位置383的位置處之突變之外，經修飾之CFI多肽包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2一致之胺基酸序列。視情況，除經修飾之CFI多肽包含本文所描述的對應於SEQ ID NO: 1之位置53的位置處之突變及對應於SEQ ID NO: 1之位置401的位置處之突變之外，經修飾之CFI多肽包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2一致之胺基酸序列。視情況，除經修飾之CFI多肽包含本文所描述的對應於位置53的位置處之突變及對應於SEQ ID NO: 1之位置408的位置處之突變之外，經修飾之CFI多肽包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2一致之胺基酸序列。視情況，除經修飾之CFI多肽包含本文所描述的對應於SEQ ID NO: 1之位置53的位置處之突變及對應於SEQ ID NO: 1之位置409的位置處之突變之外，經修飾之CFI多肽包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2一致之胺基酸序列。視情況，除經修飾之CFI多肽包含本文所描述的對應於位置53的位置處之突變及對應於SEQ ID NO: 1之位置439的位置處之突變之外，經修飾之CFI多肽包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2一致之胺基酸序列。視情況，除經修飾之CFI多肽包含本文所描述的對應於SEQ ID NO: 1之位置53的位置處之突變及對應於SEQ ID NO: 1之位置479的位置處之突變之外，經修飾之CFI多肽包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2一致之胺基酸序列。視情況，除經修飾之CFI多肽包含本文所描述的對應於位置53的位置處之突變及對應於SEQ ID NO: 1之位置482的位置處之突變之外，經修飾之CFI多肽包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2一致之胺基酸序列。視情況，除經修飾之CFI多肽包含本文所描述的對應於SEQ ID NO: 1之位置383的位置處之突變及對應於SEQ ID NO: 1之位置401的位置處之突變之外，經修飾之CFI多肽包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2一致之胺基酸序列。視情況，除經修飾之CFI多肽包含本文所描述的對應於位置383的位置處之突變及對應於SEQ ID NO: 1之位置408的位置處之突變之外，經修飾之CFI多肽包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2一致之胺基酸序列。視情況，除經修飾之CFI多肽包含本文所描述的對應於SEQ ID NO: 1之位置383的位置處之突變及對應於SEQ ID NO: 1之位置409的位置處之突變之外，經修飾之CFI多肽包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2一致之胺基酸序列。視情況，除經修飾之CFI多肽包含本文所描述的對應於SEQ ID NO: 1之位置383的位置處之突變及對應於SEQ ID NO: 1之位置439的位置處之突變之外，經修飾之CFI多肽包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2一致之胺基酸序列。視情況，除經修飾之CFI多肽包含本文所描述的對應於位置383的位置處之突變及對應於SEQ ID NO: 1之位置479的位置處之突變之外，經修飾之CFI多肽包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2一致之胺基酸序列。視情況，除經修飾之CFI多肽包含本文所描述的對應於位置383的位置處之突變及對應於SEQ ID NO: 1之位置482的位置處之突變之外，經修飾之CFI多肽包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2一致之胺基酸序列。視情況，除經修飾之CFI多肽包含本文所描述的對應於位置408的位置處之突變及對應於SEQ ID NO: 1之位置401的位置處之突變之外，經修飾之CFI多肽包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2一致之胺基酸序列。視情況，除經修飾之CFI多肽包含本文所描述的對應於位置408的位置處之突變及對應於SEQ ID NO: 1之位置479的位置處之突變之外，經修飾之CFI多肽包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2一致之胺基酸序列。視情況，除經修飾之CFI多肽包含本文所描述的對應於位置409的位置處之突變及對應於SEQ ID NO: 1之位置479的位置處之突變之外，經修飾之CFI多肽包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2一致之胺基酸序列。
視情況，除經修飾之CFI多肽包含在對應於SEQ ID NO: 1之位置53的位置處經異白胺酸之取代及在對應於SEQ ID NO: 1之位置383的位置處經麩胺酸之取代之外，經修飾之CFI多肽包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2一致之胺基酸序列。視情況，除經修飾之CFI多肽包含在對應於SEQ ID NO: 1之位置53的位置處經白胺酸之取代及在對應於SEQ ID NO: 1之位置383的位置處經麩胺酸之取代之外，經修飾之CFI多肽包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2一致之胺基酸序列。視情況，除經修飾之CFI多肽包含在對應於SEQ ID NO: 1之位置53的位置處經白胺酸之取代及在對應於SEQ ID NO: 1之位置383的位置處經異白胺酸之取代之外，經修飾之CFI多肽包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2一致之胺基酸序列。視情況，除經修飾之CFI多肽包含在對應於SEQ ID NO: 1之位置53的位置處經白胺酸之取代及在對應於SEQ ID NO: 1之位置383的位置處經酪胺酸之取代之外，經修飾之CFI多肽包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2一致之胺基酸序列。視情況，除經修飾之CFI多肽包含在對應於SEQ ID NO: 1之位置53的位置處經白胺酸之取代及在對應於SEQ ID NO: 1之位置409的位置處經苯丙胺酸之取代之外，該經修飾之CFI多肽包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2一致之胺基酸序列。視情況，除經修飾之CFI多肽包含在對應於SEQ ID NO: 1之位置53的位置處經白胺酸之取代及在對應於SEQ ID NO: 1之位置401的位置處經酪胺酸之取代之外，該經修飾之CFI多肽包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2一致之胺基酸序列。視情況，除經修飾之CFI多肽包含在對應於SEQ ID NO: 1之位置53的位置處經白胺酸之取代及在對應於SEQ ID NO: 1之位置479的位置處經天冬胺酸之取代之外，經修飾之CFI多肽包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2一致之胺基酸序列。視情況，除經修飾之CFI多肽包含在對應於SEQ ID NO: 1之位置53的位置處經酪胺酸之取代及在對應於SEQ ID NO: 1之位置383的位置處經酪胺酸之取代之外，經修飾之CFI多肽包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2一致之胺基酸序列。視情況，除經修飾之CFI多肽包含在對應於SEQ ID NO: 1之位置53的位置處經酪胺酸之取代及在對應於SEQ ID NO: 1之位置401的位置處經酪胺酸之取代之外，經修飾之CFI多肽包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2一致之胺基酸序列。視情況，除經修飾之CFI多肽包含在對應於SEQ ID NO: 1之位置53的位置處經酪胺酸之取代及在對應於SEQ ID NO: 1之位置409的位置處經苯丙胺酸之取代之外，經修飾之CFI多肽包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2一致之胺基酸序列。視情況，除經修飾之CFI多肽包含在對應於SEQ ID NO: 1之位置383的位置處經苯丙胺酸之取代及在對應於SEQ ID NO: 1之位置409的位置處經苯丙胺酸之取代之外，經修飾之CFI多肽包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2一致之胺基酸序列。視情況，除經修飾之CFI多肽包含在對應於SEQ ID NO: 1之位置383的位置處經苯丙胺酸之取代及在對應於SEQ ID NO: 1之位置439的位置處經麩胺酸之取代之外，經修飾之CFI多肽包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2一致之胺基酸序列。視情況，除經修飾之CFI多肽包含在對應於SEQ ID NO: 1之位置383的位置處經苯丙胺酸之取代及在對應於SEQ ID NO: 1之位置401的位置處經酪胺酸之取代之外，經修飾之CFI多肽包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2一致之胺基酸序列。
視情況，經修飾之CFI多肽之一或多個突變包含選自本文所描述之位置之以下突變組合，其中該等位置對應於其在SEQ ID NO: 1中之各別位置：R53I；R53L；R53Y；R53E；V60S；V60E；R383F；R383Y；R383I；R383L；R383E；A384I；A384W；A384Y；A384F；I400W；I400Y；I400R；H401W；H401Y；H401F；H401G；I407F；V408T；V408Y；I409F；I409W；I409E；G439L；G439E；N440T；K441E；K441F；K441Y；E479D；F482W；F482L；F482H；F482I；F482Q；F482R；F482T；R53E及R383E；R53E及R383I；R53E及R383L；R53E及R383Y；R53E及R383F；R53E及V408T；R53E及I409F；R53E及G439Q；R53E及G439E；R53E及H401Y；R53E及E479D；R53I及R383E；R53I及R383I；R53I及R383L；R53I及R383Y；R53I及R383F；R53I及V408T；R53I及I409F；R53I及G439Q；R53I及G439E；R53I及H401Y；R53I及E479D；R53I及F482Q；R53L及R383E；R53L及R383I；R53L及R383L；R53L及R383Y；R53L及R383F；R53L及V408T；R53L及I409F；R53L及G439Q；R53L及G439E；R53L及H401Y；R53L及E479D；R53L及F482Q；R53Y及R383E；R53Y及R383I；R53Y及R383L；R53Y及R383Y；R53Y及R383F；R53Y及V408T；R53Y及I409F；R53Y及G439Q；R53Y及G439E；R53Y及H401Y；R53Y及E479D；R53Y及F482Q；R383E及V408T；R383E及I409F；R383E及G439E；R383E及H401Y；R383E及E479D；R383I及V408T；R383I及I409F；R383I及G439Q；R383I及G439E；R383I及H401Y；R383L及I409F；R383L及G439E；R383L及H401Y；R383L及E479D；R383L及F482Q；R383Y及V408T；R383Y及I409F；R383Y及G439Q；R383Y及G439E；R383Y及H401Y；R383Y及E479D；R383Y及F482Q；R383F及V408T；R383F及I409F；R383F及G439Q；R383F及G439E；R383F及H401Y；R383F及E479D；R383F及F482Q；V408T及H401Y；V408T及E479D；I409F及E479D；G439Q及H401Y；G439Q及E479D；G439Q及F482Q；G439E及H401Y；G439E及E479D；G439E及F482Q；R53E、R383E及I409F；R53E、R383E及G439E；R53E、R383E及H401Y；R53L、R383L及V408T；R53L、R383L及G439E；R53L、R383L及E479D；R383E、G439Q及V408T；R383E、G439Q及I409F；R383E、G439Q及H401Y；R383E、G439Q及F482Q；V408T、I409F及G439Q；V408T、I409F及H401Y；V408T、I409F及E479D；V408T、I409F及F482Q；H401Y、E479D及F482Q；R53E、R383E、I409F及G439E；R53E、R383E、V408T及F482Q；R53E、R383E、I409F及H401Y；R53E、R383E、G439E及H401Y；R53E、R383L、V408T及H401Y；R53E、R383L、V408T及F482Q；R53E、R383L、G439E及F482Q；R53E、R383Y、V408T及H401Y；R53E、R383Y、V408T及F482Q；R53E、R383Y、I409F及H401Y；R53E、R383Y、I409F及F482Q；R53E、R383F、V408T及F482Q；R53E、R383F、I409F及H401Y；R53E、R383F、I409F及F482Q；R53E、R383F、G439E及H401Y；R53E、R383F、G439E及F482Q；R53I、R383E、G439E及H401Y；R53I、R383I、V408T及H401Y；R53I、R383I、V408T及F482Q；R53I、R383I、G439Q及H401Y；R53I、R383I、G439Q及F482Q；R53I、R383L、V408T及H401Y；R53I、R383L、G439Q及H401Y；R53I、R383L、G439Q及F482Q；R53I、R383Y、V408T及H401Y；R53I、R383Y、V408T及F482Q；R53I、R383Y、G439Q及H401Y；R53I、R383Y、G439Q及F482Q；R53I、R383F、V408T及H401Y；R53I、R383F、V408T及F482Q；R53I、R383F、G439Q及H401Y；R53I、R383F、G439Q及F482Q；R53L、R383E、V408T及H401Y；R53L、R383E、I409F及F482Q；R53L、R383E、G439E及H401Y；R53L、R383E、G439E及F482Q；R53L、R383I、V408T及H401Y；R53L、R383I、G439Q及H401Y；R53L、R383L、V408T及H401Y；R53L、R383L、V408T 及F482Q；R53L、R383L、G439Q及H401Y；R53L、R383L、G439E及F482Q；R53L、R383Y、V408T及H401Y；R53L、R383Y、V408T及F482Q；R53L、R383Y、I409F及H401Y；R53L、R383Y、I409F及F482Q；R53L、R383Y、G439Q及H401Y；R53L、R383Y、G439Q及F482Q；R53L、R383Y、G439E及H401Y；R53L、R383F、V408T及H401Y；R53L、R383F、V408T及F482Q；R53L、R383F、I409F及H401Y；R53L、R383F、I409F及F482Q；R53L、R383F、G439Q及H401Y；R53L、R383F、G439Q及F482Q；R53L、R383F、G439E及H401Y；R53L、R383F、G439E及F482Q；R53Y、R383E、I409F及F482Q；R53Y、R383E、G439E及H401Y；R53Y、R383E、G439E及F482Q；R53Y、R383L、V408T及H401Y；R53Y、R383L、V408T及F482Q；R53Y、R383L、I409F及H401Y；R53Y、R383L、G439Q及H401Y；R53Y、R383L、G439E及F482Q；R53Y、R383Y、V408T及H401Y；R53Y、R383Y、V408T及F482Q；R53Y、R383Y、I409F及H401Y；R53Y、R383Y、I409F及F482Q；R53Y、R383Y、G439Q及H401Y；R53Y、R383Y、G439Q及F482Q；R53Y、R383F、V408T及H401Y；R53Y、R383F、V408T及F482Q；R53Y、R383F、I409F及H401Y；R53Y、R383F、I409F及F482Q；R53Y、R383F、G439Q及H401Y；R53Y、R383F、G439Q及F482Q；R53Y、R383F、G439E及H401Y；R53Y、R383F、G439E及F482Q；R53Y、H401Y、I409F、E479D及F482Q；R383E、H401Y、I409F、E479D及F482Q；R383I、H401Y、I409F、E479D及F482Q；R383L、H401Y、I409F、E479D及F482Q；及R383Y、H401Y、I409F、E479D及F482Q。
視情況，經修飾之CFI多肽之一或多個突變包含選自本文所描述之位置之以下突變組合，其中該等位置對應於其在SEQ ID NO: 1中之各別位置：R53Y、R383I、V408T及H401Y；R53Y、R383I、G439Q及H401Y；及R53Y、R383I、G439Q及F482Q。
在一個實施例中，至少一個突變包含：
i) 在對應於SEQ ID NO: 1之位置53的位置處之突變且為經白胺酸取代，視情況為R53L；及
(ii) 在對應於SEQ ID NO: 1之位置383的位置處之突變且為經酪胺酸取代，視情況為R383Y，
且其中當在pH 7下與C3b及CFH一起培育30分鐘，隨後與抗iC3b (Tb) IgG及抗C3b (FITC) IgG一起培育30分鐘之後量測時，該經修飾之CFI多肽的CFI活性比參考CFI多肽高至少5倍，視情況其中該參考CFI多肽為野生型CFI多肽。
包含 CFI 核苷酸序列之聚核苷酸
本發明提供包含CFI核苷酸序列之聚核苷酸，其中該CFI核苷酸序列編碼本發明之經修飾之CFI多肽。核苷酸序列與野生型CFI核苷酸序列有至少一種差異，例如已引入突變。
術語「
核酸分子 (nucleic acid molecule)」、「
聚核苷酸 (polynucleotide)」及「
核苷酸序列 (nucleotide sequence)」意欲指任何長度之核苷酸(包括去氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或其類似物)的聚合鏈。舉例而言，核酸分子、聚核苷酸或核苷酸序列可包含DNA (去氧核糖核苷酸)或RNA (核糖核苷酸)。核酸分子、聚核苷酸或核苷酸序列可由DNA組成。核酸分子、聚核苷酸或核苷酸序列可為mRNA。由於核酸分子、聚核苷酸或核苷酸序列可包含RNA或DNA，所以所有提及的T (胸腺嘧啶)核苷酸可經U (尿嘧啶)置換。
在一些實施例中，術語「
核苷酸序列」可經術語「
核酸分子」置換。
CFI核苷酸序列編碼CFI多肽。本發明之聚核苷酸包含CFI核苷酸序列且CFI核苷酸序列編碼本發明之經修飾之CFI多肽。術語「
編碼 ... 序列 (sequence that encodes)」或「
序列編碼 ...(sequence encodes)」係指包含有包含對經編碼多肽進行編碼之密碼子的開放閱讀框架的核苷酸序列。舉例而言，編碼CFI多肽之核苷酸序列包含編碼CFI多肽之胺基酸序列的密碼子。編碼野生型CFI之CFI核苷酸序列之實例提供於SEQ ID NO: 3、4、28、18或19中。
編碼多肽之密碼子亦稱為「
編碼核苷酸 (coding nucleotides)」。CFI核苷酸序列可間雜有非編碼核苷酸(例如內含子)，但只有編碼多肽之核苷酸(亦即編碼核苷酸)應視為CFI核苷酸序列之一部分。舉例而言，編碼CFI多肽之CFI核苷酸序列將包含編碼形成CFI多肽之一部分之胺基酸的任何密碼子(亦即編碼核苷酸)，無論彼等密碼子在序列中係連續的抑或由一或多個非編碼核苷酸分隔。換言之，含有間雜有非編碼核苷酸延伸段之編碼核苷酸延伸段的CFI聚核苷酸應被視為包含由緊鄰的非連續編碼延伸段組成(亦即減去非編碼核苷酸延伸段)之「
CFI 核苷酸序列」。然而，終止密碼子之核苷酸在本文中將視為編碼核苷酸。
編碼CFI多肽之CFI核苷酸序列亦可包含編碼信號肽之序列。熟知一些蛋白質，尤其是輸出至不同組織之蛋白質，係用信號肽表現。信號肽可位於蛋白質序列之N端(且在此情況下位於編碼序列之5'端)且許多信號肽在細胞處理之後裂解。因此，成熟蛋白質或多肽(諸如成熟CFI蛋白質或多肽)在本文中將被視為在信號肽已經處理及移除/裂解(且因此不再形成多肽序列之一部分)之後的所得蛋白質或多肽。經修飾之CFI多肽可「經弗林蛋白酶裂解」，亦即可在弗林蛋白酶裂解位點處裂解成重鏈及輕鏈。在此類情況下，經修飾之CFI多肽包含CFI重鏈(對應於SEQ ID NO: 1之殘基19至335)及輕鏈(對應於SEQ ID NO: 1之殘基340至583)之二硫鍵連接之二聚體。
下表描述編碼各胺基酸之密碼子：
表A
| 胺基酸 | 密碼子 | 胺基酸 | 密碼子 | 胺基酸 | 密碼子 |
| 苯丙胺酸 | TTC TTT | 脯胺酸 | CCT CCC CCA CCG | 天冬醯胺 | AAT AAC |
| 白胺酸 | TTA TTG CTT CTC CTA CTG | 蘇胺酸 | ACT ACC ACA ACG | 離胺酸 | AAA AAG |
| 異白胺酸 | ATT ATC ATA | 丙胺酸 | GCT GCC GCA GCG | 天冬胺酸 | GAT GAC |
| 甲硫胺酸 | ATG | 酪胺酸 | TAT TAC | 麩胺酸 | GAA GAG |
| 纈胺酸 | GTT GTC GTA GTG | 組胺酸 | CAT CAC | 半胱胺酸 | TGT TGC |
| 絲胺酸 | TCT TCC TCA TCG AGT AGC | 麩醯胺酸 | CAA CAG | 色胺酸 | TGG |
| 精胺酸 | CGT CGC CGA CGG AGA AGG | 甘胺酸 | GGT GGC GGA GGG |
對應RNA密碼子將含有Us代替上表中之Ts。
本發明提供包含經修飾之CFI核苷酸序列的聚核苷酸，其中該CFI核苷酸序列編碼本發明之經修飾之CFI多肽。視情況，CFI核苷酸序列包含與SEQ ID NO: 16、17、18或19中之任一者的至少1200個、至少1400個、至少1500個、1698或更少個、1752或更少個、1200與1698個之間、1200與1752個之間、1500與1698個之間、1500與1752個之間、約1698個或約1752個核苷酸之片段具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.4%、至少99.5%、至少99.6%、至少99.7%、至少99.8%、至少99.9%或100%一致性的序列。視情況，CFI核苷酸序列包含與SEQ ID NO: 16、17、18或19中之任一者的至少1200個、至少1400個、至少1500個、1698或更少個、1752或更少個、1200與1698個之間、1200與1752個之間、1500與1698個之間、1500與1752個之間、約1698個或約1752個核苷酸之片段具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.5%或至少99.8%一致性的序列。視情況，CFI核苷酸序列包含與SEQ ID NO: 16、17、18或19中之任一者的核苷酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.4%、至少99.5%、至少99.6%、至少99.7%、至少99.8%、至少99.9%或100%一致性的序列。視情況，CFI核苷酸序列包含與SEQ ID NO: 16、17、18或19中之任一者的核苷酸序列具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.5%或至少99.8%一致性的序列。視情況，除了所提及之SEQ ID NO: 16或17經所提及之SEQ ID NO: 28或29置換之外，CFI核苷酸序列包含如上文所描述之序列。視情況，CFI核苷酸序列包含與SEQ ID NO: 18或19之至少1200個、至少1400個、至少1500個、1698或更少個、1752或更少個、1200與1698個之間、1200與1752個之間、1500與1698個之間、1500與1752個之間、約1698個或約1752個核苷酸之片段具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.5%或至少99.8%一致性的序列。視情況，CFI核苷酸序列包含與SEQ ID NO: 18或19之至少1500個核苷酸之片段具有至少98%一致性的序列。視情況，CFI核苷酸序列包含與SEQ ID NO: 18或19之核苷酸序列具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.5%或至少99.8%一致性的序列。視情況，CFI核苷酸序列包含與SEQ ID NO: 18或19具有至少98%一致性之序列。
視情況，除了對一或多個提供較高CFI活性之突變或包含對應於選自由本文所描述之SEQ ID NO: 1之53、60、383、384、400、401、407、408、409、439、440、441、479及482組成之群的位置的位置處之突變的一或多個突變進行編碼的密碼子之外，CFI核苷酸序列包含與SEQ ID NO: 18或19具有100%一致性之序列。舉例而言，密碼子可編碼對應於SEQ ID NO: 1之位置53的位置處之突變且該突變為經白胺酸取代，視情況為R53L。舉例而言，密碼子可編碼對應於SEQ ID NO: 1之位置53的位置處之突變且該突變為經酪胺酸取代，視情況為R53Y。舉例而言，密碼子可編碼對應於SEQ ID NO: 1之位置383的位置處之突變且該突變經苯丙胺酸取代，視情況為R383F。舉例而言，密碼子可編碼對應於SEQ ID NO: 1之位置383的位置處之突變且該突變為經酪胺酸取代，視情況為R383Y。舉例而言，密碼子可編碼對應於SEQ ID NO: 1之位置383的位置處之突變且該突變為經白胺酸，視情況R383L取代。舉例而言，密碼子可編碼對應於SEQ ID NO: 1之位置383的位置處之突變且該突變為經麩胺酸取代，視情況為R383E。舉例而言，密碼子可編碼對應於SEQ ID NO: 1之位置401的位置處之突變且該突變為經酪胺酸取代，視情況為H401Y。舉例而言，密碼子可編碼對應於SEQ ID NO: 1之位置401的位置處之突變且該突變為經苯丙胺酸，視情況H401F取代。舉例而言，密碼子可編碼對應於SEQ ID NO: 1之位置401的位置處之突變且該突變為經甘胺酸，視情況H401G取代。舉例而言，密碼子可編碼對應於SEQ ID NO: 1之位置409的位置處之突變且該突變為經色胺酸，視情況I409W取代。舉例而言，密碼子可編碼對應於SEQ ID NO: 1之位置409的位置處之突變且該突變為經麩胺酸，視情況I409E取代。舉例而言，密碼子可編碼對應於SEQ ID NO: 1之位置439的位置處之突變且該突變為經麩胺酸取代，視情況為G439E。舉例而言，密碼子可編碼對應於SEQ ID NO: 1之位置441的位置處之突變且該突變為經麩胺酸，視情況K441E取代。舉例而言，密碼子可編碼對應於SEQ ID NO: 1之位置53之位置處且為經異白胺酸取代，視情況為R53I的突變；及對應於SEQ ID NO: 1之位置383之位置處且為經麩胺酸取代，視情況為R383E的突變。舉例而言，密碼子可編碼對應於SEQ ID NO: 1之位置53之位置處且為經白胺酸取代，視情況為R53L的突變；及對應於SEQ ID NO: 1之位置383之位置處且為經異白胺酸取代，視情況為R383I的突變。舉例而言，密碼子可編碼對應於SEQ ID NO: 1之位置53之位置處且為經白胺酸取代，視情況為R53L的突變；及對應於SEQ ID NO: 1之位置383之位置處且為經酪胺酸取代，視情況為R383Y的突變。舉例而言，密碼子可編碼對應於SEQ ID NO: 1之位置53之位置處且為經白胺酸取代，視情況為R53L的突變；及對應於SEQ ID NO: 1之位置401之位置處且為經酪胺酸取代，視情況為H401Y的突變。舉例而言，密碼子可編碼對應於SEQ ID NO: 1之位置53之位置處且為經酪胺酸取代，視情況為R53Y的突變；及對應於SEQ ID NO: 1之位置409之位置處且為經苯丙胺酸取代，視情況為I409F的突變。舉例而言，密碼子可編碼對應於SEQ ID NO: 1之位置53之位置處、且為經酪胺酸取代，視情況為R53Y的突變；及對應於SEQ ID NO: 1之位置401之位置處且為經酪胺酸取代，視情況為H401Y的突變。
視情況，除了所提及之SEQ ID NO: 18或19經所提及之SEQ ID NO: 30或31置換之外，CFI核苷酸序列包含如上文所描述之序列。視情況，除了所提及之SEQ ID NO: 18或19經所提及之SEQ ID NO: 32或33置換之外，CFI核苷酸序列包含如上文所描述之序列。視情況，除了所提及之SEQ ID NO: 18或19經所提及之SEQ ID NO: 34或35置換之外，CFI核苷酸序列包含如上文所描述之序列。視情況，除了所提及之SEQ ID NO: 18或19經所提及之SEQ ID NO: 36或37置換之外，CFI核苷酸序列包含如上文所描述之序列。視情況，除了所提及之SEQ ID NO: 18或19經所提及之SEQ ID NO: 38或39置換之外，CFI核苷酸序列包含如上文所描述之序列。視情況，除了所提及之SEQ ID NO: 18或19經所提及之SEQ ID NO: 40或41置換之外，CFI核苷酸序列包含如上文所描述之序列。視情況，除了所提及之SEQ ID NO: 18或19經所提及之SEQ ID NO: 42或43置換之外，CFI核苷酸序列包含如上文所描述之序列。
視情況，除了所提及之SEQ ID NO: 18或19經所提及之SEQ ID NO: 44、45、46、47、48、49、50、51或52置換之外，CFI核苷酸序列包含如上文所描述之序列。
視情況，除了所提及之SEQ ID NO: 18或19經所提及之SEQ ID NO: 4或3置換之外，CFI核苷酸序列包含如上文所描述之序列。
視情況，CFI核苷酸序列為來自WO2020/086735之SEQ ID NO: 1、2、3或5中之任一者或來自WO2017/072515之SEQ ID NO: 8的核苷酸序列，不同之處在於其包含核苷酸取代以使得經編碼之CFI多肽包含一或多個本文所描述之突變。視情況，CFI核苷酸序列為來自WO2020/086735之SEQ ID NO: 1、2、3或5中之任一者或來自WO2017/072515之SEQ ID NO: 8的核苷酸序列之變異體，其編碼包含分別由來自WO2020/086735之SEQ ID NO: 1、2、3或5或來自WO2017/07251之SEQ ID NO: 8編碼之多肽具有至少95%一致性之序列的CFI多肽。視情況，CFI核苷酸序列為來自WO2020/086735之SEQ ID NO: 1、2、3或5中之任一者或來自WO2017/072515之SEQ ID NO: 8的核苷酸序列，不同之處在於其包含核苷酸取代以使得經編碼之CFI多肽包含一或多個提供較高CFI活性之突變或包含對應於選自由SEQ ID NO: 1之53、60、383、384、400、401、407、408、409、439、440、441、479及482組成之群的位置的位置處之突變的一或多個突變。除非序列識別符另外經指定為來自特定來源，例如來自WO2020/086735之SEQ ID NO: 1，否則本文中所提及的特定序列標識符應理解為表示如本文中所描述及「
序列表描述」及圖6中所列出之序列。對於SEQ ID NO: 28至56，本文中所提及的特定序列識別符應理解為表示如本文中所描述及「
序列表描述」中所列出之序列。視情況，CFI核苷酸序列為來自WO2020/086735之SEQ ID NO: 1、2、3或5中之任一者或來自WO2017/072515之SEQ ID NO: 8的核苷酸序列，不同之處在於其包含核苷酸取代以使得經編碼之CFI多肽在對應於選自由SEQ ID NO: 1之53、60、383、384、400、401、407、408、409、439、440、441、479及482組成之群的位置之位置處具有一或多個、兩個或更多個、三個或更多個、四個或更多個或五個或更多個胺基酸取代。舉例而言，經編碼之CFI多肽具有(i)在對應於SEQ ID NO: 1之位置53的位置處經異白胺酸取代，視情況為R53I；及(ii)在對應於SEQ ID NO: 1之位置383的位置處經麩胺酸取代，視情況為R383E。舉例而言，經編碼之CFI多肽具有(i)在對應於SEQ ID NO: 1之位置53的位置處經白胺酸取代，視情況為R53L；及(ii)在對應於SEQ ID NO: 1之位置383的位置處經異白胺酸取代，視情況為R383I。舉例而言，經編碼之CFI多肽具有(i)在對應於SEQ ID NO: 1之位置53之位置處經白胺酸取代，視情況為R53L；及(ii)在對應於SEQ ID NO: 1之位置383之位置處經酪胺酸取代，視情況為R383Y。舉例而言，經編碼之CFI多肽具有(i)在對應於SEQ ID NO: 1之位置53之位置處經白胺酸取代，視情況為R53L；及(ii)在對應於SEQ ID NO: 1之位置401之位置處經酪胺酸取代，視情況為H401Y。舉例而言，經編碼之CFI多肽具有(i)在對應於SEQ ID NO: 1之位置53之位置處經酪胺酸取代，視情況為R53Y；及(ii)在對應於SEQ ID NO: 1之位置409之位置處經苯丙胺酸取代，視情況為I409F。舉例而言，經編碼之CFI多肽具有(i)在對應於SEQ ID NO: 1之位置53的位置處經酪胺酸取代，視情況為R53Y；及(ii)在對應於SEQ ID NO: 1之位置401的位置處經酪胺酸取代，視情況為H401Y。
視情況，CFI核苷酸序列為來自WO2020/128516之SEQ ID NO: 18至26 (分別併入本文中作為SEQ ID NO 44至52)中之任一者的核苷酸序列，不同之處在於其包含核苷酸取代以使得經編碼之CFI多肽包含一或多個本文所描述之突變。視情況，CFI核苷酸序列為來自WO2020/128516之SEQ ID NO: 18至26中之任一者之核苷酸序列的變異體，其編碼包含與分別由來自WO2020/128516之SEQ ID NO: 18、19、20、21、22、23、24、25或26編碼之多肽具有至少95%一致性之序列的CFI多肽。視情況，CFI核苷酸序列為來自WO2020/128516之SEQ ID NO: 18至26中之任一者的核苷酸序列，不同之處在於其包含核苷酸取代以使得經編碼之CFI多肽包含一或多個提供較高CFI活性之突變或包含對應於選自由SEQ ID NO: 1之53、60、383、384、400、401、407、408、409、439、440、441、479及482組成之群的位置的位置處之突變的一或多個突變。視情況，CFI核苷酸序列為來自WO2020/128516之SEQ ID NO: 18至26中之任一者的核苷酸序列，不同之處在於其包含核苷酸取代以使得經編碼之CFI多肽在對應於選自由SEQ ID NO: 1之53、60、383、384、400、401、407、408、409、439、440、441、479及482組成之群的位置之位置處具有一或多個、兩個或更多個、三個或更多個、四個或更多個或五個或更多個胺基酸取代。舉例而言，經編碼之CFI多肽具有(i)在對應於SEQ ID NO: 1之位置53的位置處經異白胺酸取代，視情況為R53I；及(ii)在對應於SEQ ID NO: 1之位置383的位置處經麩胺酸取代，視情況為R383E。舉例而言，經編碼之CFI多肽具有(i)在對應於SEQ ID NO: 1之位置53的位置處經白胺酸取代，視情況為R53L；及(ii)在對應於SEQ ID NO: 1之位置383的位置處經異白胺酸取代，視情況為R383I。舉例而言，經編碼之CFI多肽具有(i)在對應於SEQ ID NO: 1之位置53之位置處經白胺酸取代，視情況為R53L；及(ii)在對應於SEQ ID NO: 1之位置383之位置處經酪胺酸取代，視情況為R383Y。舉例而言，經編碼之CFI多肽具有(i)在對應於SEQ ID NO: 1之位置53之位置處經白胺酸取代，視情況為R53L；及(ii)在對應於SEQ ID NO: 1之位置401之位置處經酪胺酸取代，視情況為H401Y。舉例而言，經編碼之CFI多肽具有(i)在對應於SEQ ID NO: 1之位置53之位置處經酪胺酸取代，視情況為R53Y；及(ii)在對應於SEQ ID NO: 1之位置409之位置處經苯丙胺酸取代，視情況為I409F。舉例而言，經編碼之CFI多肽具有(i)在對應於SEQ ID NO: 1之位置53的位置處經酪胺酸取代，視情況為R53Y；及(ii)在對應於SEQ ID NO: 1之位置401的位置處經酪胺酸取代，視情況為H401Y。
在一實施例中，CFI核苷酸序列之至少一部分經密碼子最佳化。視情況，CFI核苷酸序列之全部或一部分經密碼子最佳化。密碼子最佳化可改良核苷酸序列(例如CFI核苷酸序列)在特定組織中及/或在特定有機體中之表現。舉例而言，若核苷酸序列經密碼子最佳化以表現於人類肝臟中，則核苷酸序列可經修飾以增加人類肝臟中可受到偏愛的密碼子之數目(就某種意義而言，此類密碼子對應於比對相同胺基酸具有特異性之其他tRNA物質更豐富的tRNA物質)。作為另一實例，若核苷酸序列經密碼子最佳化以表現於人類肝細胞中，則核苷酸序列可經修飾以增加人類肝細胞中可受到偏愛的密碼子之數目(就某種意義而言，此類密碼子對應於比對相同胺基酸具有特異性之其他tRNA物質更豐富的tRNA物質)。密碼子最佳化可改良核苷酸序列(例如CFI核苷酸序列)在特定細胞株中之表現。舉例而言，若核苷酸序列經密碼子最佳化以表現於中國倉鼠卵巢(CHO) (或衍生物)細胞中，則核苷酸序列可經修飾以增加此類CHO細胞中可受到偏愛的密碼子之數目(就某種意義而言，此類密碼子對應於比對相同胺基酸具有特異性之其他tRNA物質更豐富的tRNA物質)。熟習此項技術者應瞭解，對序列進行密碼子最佳化可能不需要改變每一密碼子，尤其是因為「
受偏愛密碼子」可能已存在於一些位置。
此類密碼子最佳化可受其他因素影響。舉例而言，可能不會在如此引入CpG至序列中之位置引入受偏愛密碼子；此將仍被視為密碼子最佳化。在一實施例中，以C核苷酸結尾之受偏愛密碼子將不包括於經密碼子最佳化之編碼序列之一部分中，其中序列中之下一密碼子係以G開始。舉例而言，密碼子GCC編碼丙胺酸。視情況，當GCC為受偏愛密碼子時，其不應該用於編碼丙胺酸，其中序列中之下一密碼子係以G開始，諸如密碼子GAC (或替代地，若可能，則可選擇下一密碼子以在第一位置處避開G）。
很容易確定各密碼子用於核苷酸序列之一部分中之頻率。熟習此項技術者僅需要將該部分之序列鍵入至著眼於密碼子使用且檢查結果之容易獲得之演算法中之一者中。替代地，使用者可僅對其進行計數。
視情況，經密碼子最佳化之CFI核苷酸序列的部分經密碼子最佳化以表現於人類肝細胞中。視情況，經密碼子最佳化之CFI核苷酸序列的部分為連續部分。視情況，CFI核苷酸序列經密碼子最佳化以表現於人類肝細胞中。視情況，若CFI核苷酸序列相比於由參考CFI核苷酸序列編碼之CFI多肽的表現以在人類肝細胞中以更高量表現CFI多肽或其片段，則CFI核苷酸序列或其部分經密碼子最佳化以表現於人類肝細胞中。視情況，若CFI核苷酸序列相比於在經包含參考CFI核苷酸序列之等效聚核苷酸轉染時由參考CFI核苷酸序列編碼之CFI多肽的表現在轉染包含CFI核苷酸序列之聚核苷酸時在人類肝細胞中以較高量表現CFI多肽或其片段，則CFI核苷酸序列或其部分經密碼子最佳化以表現於人類肝細胞中。在此類實施例中，參考CFI核苷酸序列可為野生型CFI核苷酸序列。野生型CFI核苷酸可為SEQ ID NO: 3或4之序列。包含參考CFI核苷酸之「
等效」聚核苷酸為與本發明之聚核苷酸一致(亦即包含相同轉錄調節元件等)但CFI核苷酸序列不同的聚核苷酸。舉例而言，被比較之不同CFI核苷酸序列可操作地連接至相同啟動子序列。視情況，人類肝細胞為Huh-7細胞。
視情況，經密碼子最佳化之CFI核苷酸序列的部分經密碼子最佳化以表現於人類視網膜細胞或人類腎細胞中。因此，視情況，上文所提及之人類肝細胞可經所提及之人類視網膜細胞或人類腎細胞置換。舉例而言，視情況，CFI核苷酸序列經密碼子最佳化以表現於人類視網膜細胞或人類腎細胞中。
在基因療法載體中存在CpG (亦即CG二核苷酸)可對治療性轉殖基因之表現(例如該表現之持久性)具有不良影響。此係因為CpG可經甲基化，且其甲基化可引起基因沈默，從而降低表現。此外，有可能的係，高CpG含量可觸發TLR反應，從而增加抗AAV免疫反應之風險。CFI核苷酸序列或該CFI核苷酸序列中經密碼子最佳化之部分可相比於參考CFI核苷酸序列之對應部分包含數目減少的CpG。參考CFI核苷酸序列可為野生型CFI核苷酸序列。野生型CFI核苷酸可為SEQ ID NO: 3或4之序列。參考CFI核苷酸序列可為SEQ ID NO: 3之核苷酸序列。片語「
參考 CFI 核苷酸序列之對應部分」欲指「
對應於」CFI核苷酸序列或該CFI核苷酸序列中經密碼子最佳化之部分的參考CFI核苷酸序列之部分。在熟習此項技術者之能力範圍內的係確定「
對應於」CFI核苷酸序列或該CFI核苷酸序列中經密碼子最佳化之部分的參考CFI核苷酸序列的部分。舉例而言，熟習此項技術者僅需要使用適合的比對演算法(諸如上文所描述之Needleman及Wunsch之比對演算法)執行參考CFI核苷酸序列與本發明之CFI核苷酸序列的序列比對，且判定參考CFI核苷酸序列之哪個區域與CFI核苷酸序列或該CFI核苷酸序列中經密碼子最佳化之部分進行比對。
在一實施例中，CFI核苷酸序列或該CFI核苷酸序列中經密碼子最佳化之部分(其可為全部CFI核苷酸序列)包含40個或更少個、20個或更少個、15個或更少個、10個或更少個、或5個或更少CpG。在一實施例中，CFI核苷酸序列或該CFI核苷酸序列中經密碼子最佳化之部分(其可為全部CFI核苷酸序列)包含5個或更少CpG。在一實施例中，CFI核苷酸序列或該CFI核苷酸序列中經密碼子最佳化之部分(其可為全部CFI核苷酸序列)包含每100個核苷酸5個或更少個、4個或更少個、3個或更少個、或2個或更少CpG。在一些實施例中，CFI核苷酸序列或該CFI核苷酸序列中經密碼子最佳化之部分(其可全部為CFI核苷酸序列)為無CpG的，亦即不含(0個) CG二核苷酸。
CFI核苷酸序列可編碼信號肽。視情況，信號肽之胺基酸序列為野生型CFI信號肽之胺基酸序列。野生型CFI信號肽之胺基酸序列可為SEQ ID NO: 6之胺基酸序列。信號肽可由SEQ ID NO: 5之核苷酸序列編碼。信號肽可不由編碼野生型CFI信號肽之核苷酸序列編碼。信號肽可由SEQ ID NO: 3、16、17及19中之任一者之核苷酸1至54編碼。視情況，信號肽之胺基酸序列為並非野生型CFI信號肽的信號肽之胺基酸序列。舉例而言，信號肽可不為野生型CFI信號肽。信號肽可為來自另一多肽之信號肽。信號肽可為異源信號肽。異源信號肽可為例如來自另一多肽之信號肽、經修飾之CFI信號肽或合成信號肽。「經修飾之CFI信號肽」為已經修飾之野生型CFI信號肽(例如已引入突變)。視情況，CFI核苷酸序列編碼信號肽。視情況，CFI核苷酸序列不編碼信號肽。視情況，CFI多肽或其片段包含信號肽。視情況，CFI多肽或其片段不包含信號肽。
本發明之聚核苷酸可包含轉錄調節元件。
可使用任何適當轉錄調節元件，諸如HLP2、HLP1、LP1、HCR-hAAT、ApoE-hAAT或LSP，其全部係肝特異性轉錄調節元件。此等轉錄調節元件更詳細地描述於以下參考文獻中：HLP1: McIntosh J.等人，Blood，2013年4月25日，121(17):3335-44；LP1: Nathwani等人，Blood. 2006年4月1日，107(7): 2653-2661；HCR-hAAT: Miao等人，Mol Ther. 2000;1: 522-532；ApoE-hAAT: Okuyama等人，Human Gene Therapy, 7, 637-645 (1996)；及LSP: Wang等人，Proc Natl Acad Sci U S A. 1999年3月30日，96(7): 3906-3910。轉錄調節元件可包含異肝特異性啟動子。
轉錄調節元件可以包含啟動子及/或強化子，諸如來自HLP2、HLP1、LP1、HCR-hAAT、ApoE-hAAT或LSP的啟動子元件及/或強化子元件。此等轉錄調節元件中之每一者包含啟動子、強化子及視情況選用之其他核苷酸。轉錄調節元件可與本發明之CFI核苷酸序列可操作地連接。啟動子及/或強化子可與本發明之CFI核苷酸序列可操作地連接。
視情況，轉錄調節元件與SEQ ID NO: 11之至少500 bp、至少1000 bp、至少1400 bp或至少1450 bp之片段具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%、至少99.5%、至少99.8%或100%一致性。視情況，轉錄調節元件與SEQ ID NO: 11之至少1400 bp或至少1450 bp之片段具有至少98%、至少99%或100%一致性。視情況，轉錄調節元件與SEQ ID NO: 11具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%、至少99.5%、至少99.8%或100%一致性。視情況，轉錄調節元件與SEQ ID NO: 11具有至少98%、至少99%或100%一致性。視情況，聚核苷酸包含與SEQ ID NO: 11具有至少98%、至少99%、至少99.5%、至少99.8%或100%一致性之轉錄調節元件。視情況，聚核苷酸包含與SEQ ID NO: 11具有至少98%性一致之轉錄調節元件。視情況，聚核苷酸包含具有SEQ ID NO: 11之序列的轉錄調節元件。視情況，聚核苷酸包含SEQ ID NO: 11之轉錄調節元件。視情況，聚核苷酸包含由SEQ ID NO: 11組成之轉錄調節元件。
視情況，轉錄調節元件與SEQ ID NO: 20之至少100 bp、至少150 bp、至少200 bp、至少300 bp、至少320 bp或至少330 bp之片段具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%、至少99.5%、至少99.8%或100%一致性。視情況，轉錄調節元件與SEQ ID NO: 20之至少300 bp或至少320 bp的片段具有至少98%、至少99%或至少100%一致性。視情況，轉錄調節元件與SEQ ID NO: 20具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%、至少99.5%、至少99.8%或100%一致性。視情況，轉錄調節元件與SEQ ID NO: 20具有至少98%、至少99%或100%一致性。視情況，聚核苷酸包含與SEQ ID NO: 20具有至少98%、至少99%、至少99.5%、至少99.8%或100%一致性之轉錄調節元件。視情況，聚核苷酸包含與SEQ ID NO: 20具有至少98%性一致之轉錄調節元件。視情況，聚核苷酸包含具有SEQ ID NO: 20之序列的轉錄調節元件。視情況，聚核苷酸包含SEQ ID NO: 20之轉錄調節元件。視情況，聚核苷酸包含由SEQ ID NO: 20組成之轉錄調節元件。
視情況，轉錄調節元件與SEQ ID NO: 21之至少300 bp、至少400 bp、至少500 bp、至少600 bp、至少700 bp、至少720 bp或至少730 bp之片段具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%、至少99.5%、至少99.8%或100%一致性。視情況，轉錄調節元件與SEQ ID NO: 21之至少700 bp或至少720 bp的片段具有至少98%、至少99%或至少100%一致性。視情況，轉錄調節元件與SEQ ID NO: 21具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%、至少99.5%、至少99.8%或100%一致性。視情況，轉錄調節元件與SEQ ID NO: 21具有至少98%、至少99%或100%一致性。視情況，聚核苷酸包含與SEQ ID NO: 21具有至少98%、至少99%、至少99.5%、至少99.8%或100%一致性之轉錄調節元件。視情況，聚核苷酸包含與SEQ ID NO: 21具有至少98%性一致之轉錄調節元件。視情況，聚核苷酸包含具有SEQ ID NO: 21之序列的轉錄調節元件。視情況，聚核苷酸包含SEQ ID NO: 21之轉錄調節元件。視情況，聚核苷酸包含由SEQ ID NO: 21組成之轉錄調節元件。
視情況，轉錄調節元件與SEQ ID NO: 22之至少40 bp、至少50 bp、至少60 bp、至少70 bp、至少80 bp、至少90 bp或至少100 bp之片段具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%、至少99.5%、至少99.8%或100%一致性。視情況，轉錄調節元件與SEQ ID NO: 22之至少90 bp或至少100 bp之片段具有至少98%、至少99%或至少100%一致性。視情況，轉錄調節元件與SEQ ID NO: 22具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%、至少99.5%、至少99.8%或100%一致性。視情況，轉錄調節元件與SEQ ID NO: 22具有至少98%、至少99%或100%一致性。視情況，聚核苷酸包含與SEQ ID NO: 22具有至少98%、至少99%、至少99.5%、至少99.8%或100%一致性之轉錄調節元件。視情況，聚核苷酸包含與SEQ ID NO: 22具有至少98%性一致之轉錄調節元件。視情況，聚核苷酸包含具有SEQ ID NO: 22之序列的轉錄調節元件。視情況，聚核苷酸包含SEQ ID NO: 22之轉錄調節元件。視情況，聚核苷酸包含由SEQ ID NO: 22組成之轉錄調節元件。
轉錄調節元件可包含眼部特異性啟動子及/或強化子。視情況，轉錄調節元件為眼部特異性轉錄調節元件。視情況，轉錄調節元件包含視網膜細胞特異性啟動子及/或強化子。視情況，轉錄調節元件為視網膜細胞特異性轉錄調節元件。視情況，轉錄調節元件包含或為視紫質啟動子、視紫質激酶啟動子(Allocca等人(2007) J. Virol. 81: 1 1372-80)、pR2.1 (Mancuso等人(2009) Nature 461: 784-7)、RPE65啟動子(Bainbridge等人(2008) N. Engl. J. Med. 358: 2231 -9)或VMD2啟動子(Esumi等人(2004) J. Biol. Chem. 279: 19064-73)。
轉錄調節元件可包含腎特異性啟動子及/或強化子。視情況，轉錄調節元件為腎特異性轉錄調節元件。視情況，轉錄調節元件包含足細胞特異性啟動子及/或強化子。視情況，轉錄調節元件為足細胞特異性轉錄調節元件。視情況，轉錄調節元件包含或為足細胞特異性啟動子，諸如揭示於WO 2022/003357中之足細胞特異性啟動子。舉例而言，轉錄調節元件包含或為最小NPHS1啟動子、最小NPHS2啟動子或替代最小NPHS1啟動子。視情況，轉錄調節元件與來自WO 2022/003357之SEQ ID NO: 4、5或27 (分別併入本文中作為SEQ ID NO: 54、55或56)具有至少80%、至少90%、至少95%、至少99.5%、至少99.8%或100%一致性。
轉錄調節元件可為非組織特異性轉錄調節元件。換言之，轉錄調節元件可為遍存轉錄調節元件。視情況，轉錄調節元件包含巨細胞病毒(CMV)啟動子。視情況，轉錄調節元件包含雞β-肌動蛋白(CBA)啟動子。視情況，轉錄調節元件包含來自CAG轉錄調節元件之啟動子元件及/或強化子元件(雞β-肌動蛋白(CBA)啟動子與巨細胞病毒(CMV)強化子元件的組合)。視情況，轉錄調節元件為CAG轉錄調節元件。視情況，轉錄調節元件與SEQ ID NO: 53具有至少80%、至少90%、至少95%、至少99.5%、至少99.8%或100%一致性。
在一實施例中，本發明之聚核苷酸包含土撥鼠肝炎轉錄後調節元件(WPRE)或其變異體。舉例而言，本發明之聚核苷酸包含Zanta-Boussif等人(2009), Gene Therapy, 16:605-619中所描述之突變WPRE序列。視情況，土撥鼠肝炎轉錄後調節元件與SEQ ID NO: 23至25中之任一者具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.5%、至少99.8%或100%一致性。視情況，聚核苷酸包含與SEQ ID NO: 23至25中之任一者具有至少98%、至少99%、至少99.5%、至少99.8%或100%一致性之土撥鼠肝炎轉錄後調節元件。視情況，聚核苷酸包含與SEQ ID NO: 23至25中之任一者具有至少98%一致性之土撥鼠肝炎轉錄後調節元件。視情況，聚核苷酸包含具有SEQ ID NO: 23至25中之任一者之序列的土撥鼠肝炎轉錄後調節元件。視情況，聚核苷酸包含SEQ ID NO: 23至25中之任一者之土撥鼠肝炎轉錄後調節元件。視情況，聚核苷酸包含由SEQ ID NO: 23至25中之任一者組成之土撥鼠肝炎轉錄後調節元件。在另一實施例中，本發明之聚核苷酸不包含土撥鼠肝炎轉錄後調節元件(WPRE)。
在一些實施例中，本發明之聚核苷酸包含轉錄後調節元件(PRE)，其中PRE不為WPRE。
本發明之聚核苷酸可進一步包含一個或兩個ITR。在一個實施例中，該或各ITR之核苷酸序列的長度少於157個、少於154個或約145個核苷酸。視情況，該或各ITR為野生型ITR。視情況，該或各ITR為AAV2 ITR。在一些實施例中，該或各ITR之核苷酸序列包含SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 13之核苷酸序列。
本發明之聚核苷酸可進一步包含polyA核苷酸序列。poly A序列可為牛生長激素poly A序列(bGHpA - SEQ ID NO: 14)。在一些實施例中，polyA核苷酸序列包含SEQ ID NO: 14之核苷酸序列。poly A序列的長度可在200至220個之間、205至215個之間或約208個核苷酸。poly A序列可定位於本發明之CFI核苷酸序列的下游。
本發明之聚核苷酸可進一步包含內含子序列，諸如病毒內含子序列，視情況SV40內含子序列(SEQ ID NO: 15)。
包含聚核苷酸之病毒粒子
本發明進一步提供一種包含重組基因體之病毒粒子，其包含本發明之聚核苷酸。出於本發明之目的，術語「
病毒粒子」係指全部或部分病毒體。舉例而言，病毒粒子包含重組基因體且可進一步包含衣殼。病毒粒子可為基因療法載體。在本文中，術語「
病毒粒子」與「
載體」可互換地使用。出於本申請案之目的，「
基因療法」載體為可用於基因療法中之病毒粒子，亦即包含所有所需功能元件以在投與之後在宿主細胞中表現轉殖基因(諸如，CFI核苷酸序列)的病毒粒子。
適合病毒粒子包括小病毒、反轉錄病毒、慢病毒或單純疱疹病毒。小病毒可為腺相關病毒(AAV)。視情況，病毒粒子為AAV、腺病毒或慢病毒病毒粒子。病毒粒子較佳為重組AAV載體或慢病毒載體。更佳地，病毒粒子為AAV病毒粒子。除非上下文另有說明，否則術語AAV及rAAV在本文中可互換使用。
所有已知AAV血清型之基因體組織非常相似。AAV之基因體係長度小於約5,000個核苷酸之線性單股DNA分子。反向末端重複序列(ITR)側接用於非結構複製（Rep)蛋白及結構(VP)蛋白之獨特編碼核苷酸序列。VP蛋白(VP1、VP-2及VP-3)形成衣殼。末端約145 nt (ITR)為自身互補的且被組織成使得可以形成能量穩定的分子內雙螺旋體，從而形成T形髮夾。此等髮夾結構充當病毒DNA複製之起點，充當細胞DNA聚合酶複合物之引子。在哺乳動物細胞中之野生型(wt) AAV感染之後，Rep基因(亦即編碼Rep78及Rep52蛋白質)分別由P5啟動子及P19啟動子表現，且兩種Rep蛋白質均具有複製病毒基因體之功能。Rep ORF中之剪接事件引起四種Rep蛋白質(亦即Rep78、Rep68、Rep52及Rep40)之表現。然而，已證實哺乳動物細胞中之未經剪接之mRNA (編碼Rep78及Rep52蛋白質)足以用於產生AAV載體。同樣在昆蟲細胞中，Rep78及Rep52蛋白質足以用於產生AAV載體。
如上文所描述，本發明之聚核苷酸可包含一或兩個ITR。因此，重組病毒基因體可包含一或兩個如上文所描述之ITR。本發明之AAV載體有可能與僅一個ITR一起起作用。因此，病毒基因體典型地包含至少一個ITR，但更典型地包含兩個ITR (通常位於病毒基因體之任一端，亦即一個在5'端且一個在3'端)。本發明之CFI核苷酸序列與一個或兩個ITR之間可存在插入序列。CFI核苷酸序列可併入至位於兩個常規ITR之間或位於經兩個D區域工程化之ITR之任一側上的病毒粒子中。
本發明中可用於生產AAV載體的AAV序列可源於自任何AAV血清型的基因體。通常，AAV血清型的基因組序列在胺基酸及核酸層面上具有顯著同源性，提供一組相同遺傳功能，產生在物理上及功能上基本上等效的病毒粒子，並藉由幾乎相同的機制複製及組裝。關於各種AAV血清型之基因體序列及基因體相似性之概述參見例如GenBank寄存號U89790；GenBank寄存號J01901；GenBank寄存號AF043303；GenBank寄存號AF085716；Chiorini等人，1997；Srivastava等人，1983；Chiorini等人，1999；Rutledge等人，1998；及Wu等人，2000。本發明中可使用AAV血清型1、2、3、3B、4、5、6、7、8、9、10、11或12。來自AAV血清型之序列可在用於產生基因療法載體時突變或經工程改造。
視情況，AAV載體包含源自AAV1、AAV2、AAV4及/或AAV6之ITR序列。較佳地，ITR序列為AAV2 ITR序列。本文中，術語AAVx/y係指包含基因體組分(諸如至少來自AAVx之ITR，其中x為AAV血清型編號))且具有來自AAVy之衣殼(其中y為相同或不同血清型之數目)的病毒粒子。舉例而言，AAV2/8載體可包含來自AAV2病毒株之一部分病毒基因體，包括ITR；及來自AAV8病毒株之衣殼。
在一實施例中，病毒粒子包含衣殼。在一實施例中，病毒粒子為包含衣殼之AAV病毒粒子。AAV衣殼通常由三種蛋白質VP1、VP2及VP3形成。VP1之胺基酸序列包含VP2之序列。VP1的不形成一部分VP2的部分被稱作VP1unique或VP1U。VP2之胺基酸序列包含VP3之序列。VP2的不形成一部分VP3的部分被稱作VP2unique或VP2U。視情況，病毒粒子包含嗜肝性衣殼。可例如藉由在多個時間點投與表現標記基因(諸如螢光素酶)之此類粒子及活體內成像來評估病毒粒子(衣殼)是否具有對特定組織之向性(例如，如Zincarelli等人(2008), Molecular Therapy, 16:1073-1080中所描述)。驅使肝臟組織中之標記物表現較強(尤其在與其他組織中之較弱表現形成對比時)之粒子將視為嗜肝性的。視情況，病毒粒子包含嗜腎性衣殼。
在一些實施例中，嗜肝性衣殼可為AAV3、AAV3、AAV5或AAV8衍生之衣殼。視情況，嗜肝性衣殼可為AAV3、AAV3B或AAV8衍生之衣殼。視情況，嗜肝性衣殼包含與SEQ ID NO:7至10中任一者之至少600個、至少650個、至少700個、在600與734個之間、在600與736個之間、在650與734個之間、在650與736個之間、在700與734個之間、在700與736個之間、約734個或約736個胺基酸的片段具有至少98%、至少99%、至少99.5%或100%一致性的序列。視情況，嗜肝性衣殼包含與SEQ ID NO: 7至10中之任一者具有至少99%一致性之序列。視情況，嗜肝性衣殼包含與SEQ ID NO: 7具有至少99%一致性之序列。視情況，嗜肝性衣殼包含與SEQ ID NO: 8具有至少99%一致性之序列。視情況，嗜肝性衣殼包含與SEQ ID NO: 9具有至少99%一致性之序列。視情況，嗜肝性衣殼包含與SEQ ID NO: 10具有至少99%一致性之序列。視情況，嗜肝性衣殼包含與SEQ ID NO: 7具有100%一致性之序列。視情況，嗜肝性衣殼包含與SEQ ID NO: 8具有100%一致性之序列。視情況，嗜肝性衣殼包含與SEQ ID NO: 9具有100%一致性之序列。視情況，嗜肝性衣殼包含與SEQ ID NO: 10具有100%一致性之序列。
在一些實施例中，衣殼可為AAV3、AAV3、AAV5或AAV8衍生之衣殼。視情況，衣殼可為AAV3、AAV3或AAV8衍生之衣殼。視情況，衣殼包含與SEQ ID NO:7至10中任一者之至少600個、至少650個、至少700個、在600與734個之間、在600與736個之間、在650與734個之間、在650與736個之間、在700與734個之間、在700與736個之間、約734個或約736個胺基酸的片段具有至少98%、至少99%、至少99.5%或100%一致性的序列。視情況，衣殼包含與SEQ ID NO: 7至10中之任一者具有至少99%一致性之序列。視情況，衣殼包含與SEQ ID NO: 7具有至少99%一致性之序列。視情況，衣殼包含與SEQ ID NO: 8具有至少99%一致性之序列。視情況，衣殼包含與SEQ ID NO: 9具有至少99%一致性之序列。視情況，衣殼包含與SEQ ID NO: 10具有至少99%一致性之序列。視情況，衣殼包含與SEQ ID NO: 7具有100%一致性之序列。視情況，衣殼包含與SEQ ID NO: 8具有100%一致性之序列。視情況，衣殼包含與SEQ ID NO: 9具有100%一致性之序列。視情況，衣殼包含與SEQ ID NO: 10具有100%一致性之序列。
在一些實施例中，衣殼可為AAV9衍生之衣殼。視情況，衣殼包含與SEQ ID NO: 26之至少600個、至少650個、至少700個、在600與734個之間、在600與736個之間、在650與734個之間、在650與736個之間、在700與734個之間、在700與736個之間、約734個或約736個胺基酸的片段具有至少98%、至少99%、至少99.5%或100%一致性的序列。視情況，衣殼包含與SEQ ID NO: 26具有至少99%一致性之序列。視情況，嗜肝性衣殼包含與SEQ ID NO: 26具有100%一致性之序列。視情況，衣殼包含與SEQ ID NO: 26具有100%一致性之序列。
在一些實施例中，衣殼可為AAV2衍生之衣殼。視情況，衣殼包含與SEQ ID NO: 27之至少600個、至少650個、至少700個、在600與734個之間、在600與735個之間、在650與734個之間、在650與735個之間、在700與734個之間、在700與735個之間、約734個或約735個胺基酸的片段具有至少98%、至少99%、至少99.5%或100%一致性的序列。視情況，衣殼包含與SEQ ID NO: 27具有至少99%一致性之序列。視情況，嗜肝性衣殼包含與SEQ ID NO: 27具有100%一致性之序列。視情況，衣殼包含與SEQ ID NO: 27具有100%一致性之序列。
在一些實施例中，衣殼不為AAV2衍生之衣殼。在一些實施例中，衣殼不為AAV8衍生之衣殼。
本發明之病毒粒子可為「雜交」粒子，其中病毒ITR及病毒衣殼來自不同小病毒，諸如不同AAV血清型。較佳地，病毒ITR及衣殼來自不同AAV血清型，在此情況下，此類病毒粒子被稱為轉衣殼或假型病毒粒子。同樣地，小病毒可具有「
嵌合」衣殼(例如，含有來自不同小病毒，較佳來自不同AAV血清型之序列)或「
靶向」衣殼(例如，定向向性)。
在一些實施例中，重組AAV基因體包含完整ITR，包含功能性末端解析位點(TRS)。此類AAV基因體可含有一個或兩個可解析的ITR，亦即含有可進行位點特異性切口以產生游離3'羥基之功能性TRS的ITR，該游離3'羥基可充當DNA聚合酶之受質以展開及拷貝ITR。
較佳地，重組基因體為單股的(亦即，其以單股形式封裝至病毒粒子中)。視情況，重組基因體不以自身互補組態封裝，亦即基因體不包含單一共價連接之聚核苷酸股，其具有在病毒粒子中黏接之實質性自身互補部分。或者，重組基因體可以「
單體雙螺旋」形式封裝。「
單體雙螺旋」描述於WO 2011/122950中。基因體可以兩種實質上互補但非共價連接之聚核苷酸形式封裝，該等聚核苷酸黏接於病毒粒子中。
如上文所描述，本發明之聚核苷酸可包含polyA核苷酸序列。因此，病毒粒子可包含如上文所描述之poly A序列。
如上文所描述，本發明之聚核苷酸可包含內含子序列。因此，本發明之病毒粒子可包含如上文所描述之內含子序列。
如上文所描述，本發明之聚核苷酸可包含一個或兩個ITR。因此，本發明之病毒粒子可包含如上文所描述之一個或兩個ITR。
如上文所描述，本發明之聚核苷酸可包含轉錄調節元件。因此，本發明之病毒粒子可包含如上文所描述之轉錄調節元件。
在一實施例中，病毒粒子包含聚核苷酸序列，該聚核苷酸序列包含轉錄調節元件(包含例如啟動子及/或強化子)；經修飾之CFI核苷酸序列；及poly A序列，諸如bGHpA序列。在此等實施例中，poly A序列(諸如bGHpA序列)可位於經修飾之CFI核苷酸序列下游。內含子序列，諸如SV40內含子序列，可位於轉錄調節元件與CFI核苷酸序列之間。
組合物、方法及用途
在本發明之另一態樣中，提供一種組合物，其包含本發明之經修飾之CFI多肽、聚核苷酸或載體/病毒粒子及醫藥學上可接受之賦形劑。
醫藥學上可接受之賦形劑可包含載劑、稀釋劑及/或其他藥用製劑、醫藥製劑或佐劑等。視情況，醫藥學上可接受之賦形劑包含生理鹽水溶液。視情況，醫藥學上可接受之賦形劑包含人類血清白蛋白。
本發明進一步提供用於治療方法中之本發明之經修飾之CFI多肽、聚核苷酸、載體/病毒粒子或組合物。視情況，該治療方法包含向患者投與有效量之本發明之經修飾之CFI多肽、聚核苷酸、載體/病毒粒子或組合物。
本發明進一步提供一種治療方法，其包含向患者投與有效量之本發明之經修飾之CFI多肽、聚核苷酸、載體/病毒粒子或組合物。
本發明進一步提供本發明之經修飾之CFI多肽、聚核苷酸、載體/病毒粒子或組合物在製造用於治療方法中之藥劑中的用途。視情況，該治療方法包含向患者投與有效量之本發明之經修飾之CFI多肽、聚核苷酸、載體/病毒粒子或組合物。
視情況，該治療方法為基因療法。「
基因療法」涉及投與本發明之載體/病毒粒子，其能夠在其所投與之宿主(例如，患者)中表現轉殖基因(諸如，CFI核苷酸序列)。
視情況，該治療方法為藉由增加CFI多肽之表現進行之治療方法。視情況，該治療方法為藉由增加CFI多肽之活性進行之治療方法。
視情況，患者具有低於正常含量之CFI蛋白(在投與經修飾之CFI多肽、聚核苷酸、載體/病毒粒子或組合物之前)。視情況，患者具有低於正常量的CFI表現及/或低於正常水準的CFI活性(例如C3b不活化及/或iC3b降解活性) (在投與經修飾之CFI多肽、聚核苷酸、載體/病毒粒子或組合物之前)。視情況，患者具有在
CFI基因中或在用於
CFI基因之轉錄調節元件中之一或多者中的突變。視情況，患者缺乏CFI(在投與經修飾之CFI多肽、聚核苷酸、載體/病毒粒子或組合物之前)。視情況，患者具有正常含量之CFI蛋白(在投與經修飾之CFI多肽、聚核苷酸、載體/病毒粒子或組合物之前)。視情況，患者具有正常量的CFI表現及/或正常水準的CFI活性(例如C3b不活化及/或iC3b降解活性) (在投與經修飾之CFI多肽、聚核苷酸、載體/病毒粒子或組合物之前)。視情況，患者具有野生型
CFI基因。視情況，患者不具有
CFI基因之對偶基因中的突變或缺陷。視情況，患者不具有在用於
CFI基因之轉錄調節元件中之一或多者中的突變或缺陷。視情況，CFI多肽、聚核苷酸、載體/病毒顆粒或組合物之投與增加CFI蛋白之含量。視情況，CFI多肽、聚核苷酸、病毒顆粒或組合物之投與使CFI蛋白之含量增加至高於正常含量。視情況，正常含量之CFI蛋白等效於由血清中之30至40 µg/ml之CFI多肽提供的CFI蛋白。
視情況，CFI蛋白之含量增加(例如，增加至高於正常含量)為向其投與CFI多肽、聚核苷酸、載體/病毒粒子或組合物之組織或器官(諸如眼睛)中的CFI蛋白之含量增加。
視情況，多肽為如本文所描述之本發明之多肽。視情況，聚核苷酸為如本文所描述之本發明之聚核苷酸。視情況，病毒粒子為如本文所描述之本發明之病毒粒子。視情況，組合物為如本文所描述之本發明組合物。
視情況，治療方法為治療補體介導之病症的方法。視情況，補體介導之病症為C3介導之病症。視情況，補體介導之病症為腎臟病症。視情況，補體介導之病症為眼部病症。視情況，補體介導之病症與補體C3b回饋環之過度活性相關。視情況，補體介導之病症係選自C3腎絲球病變、IgA腎病、狼瘡性腎炎、全身性紅斑性狼瘡症、膜性腎病、膜增生性絲球體腎炎、陣發性夜間血紅素尿症、非典型性溶血性尿毒性症候群、自體免疫溶血性貧血、ANCA相關血管炎、高歇氏病、腹膜炎、年齡相關之黃斑部變性、糖尿病性視網膜病變、密度沈積病、年齡相關之發炎性或自體發炎性疾病、自體免疫關節炎(諸如類風濕性關節炎)、動脈粥樣硬化、慢性心血管疾病、阿茲海默症、全身性血管炎、格-巴二氏症候群及亨偌-絲奇恩賴紫癜。
視情況，補體介導之病症為年齡相關之發炎性或自體發炎性疾病。視情況，補體介導之病症為慢性發炎性疾病。
視情況，補體介導之病症係選自C3腎絲球病變、C3絲球體腎炎及密度沈積病。
視情況，補體介導之病症為非典型性溶血性尿毒性症候群。視情況，病症為具有單一複對偶基因CFH突變之非典型性溶血性尿毒性症候群。換言之，補體介導之病症可為非典型性溶血性尿毒性症候群，且待治療之患者群組為具有單一複對偶基因CFH突變之非典型性溶血性尿毒性症候群患者子集。
視情況，補體介導之病症為腎絲球或腎小管病症。視情況，互補介導之病症係選自C3腎絲球病變、IgA腎病、狼瘡性腎炎及膜性腎病。視情況，該病症為狼瘡性腎炎。視情況，該病症為全身性紅斑性狼瘡症。視情況，補體介導之病症為非典型性溶血性尿毒性症候群(aHUS)、stx相關之HUS、冷凝球蛋白血症(cryoglobulinemia)、抗腎絲球基底膜(GBM)疾病、ANCA相關血管炎、細菌性心內膜炎、感染後絲球體腎炎、抗體介導之腎移植排斥反應、膜增生性絲球體腎炎I或膜增生性絲球體腎炎III。
其並不意謂疾病或病症之症狀得到完全治療以使得其不再存在於患者中，但在一些方法中，可能出現此情況。因此，在所有情況下，術語「治療(
treatment)」或「治療(
treating)」可分別用術語「改善(
amelioration)」或「改善(
ameliorating)」替換。本發明之方法或用途(諸如治療方法或治療)可使得疾病或病症之一或多種症狀的嚴重程度比治療之前輕。
另外，本發明之方法或用途可「預防」病症。在一些實施例中，術語「治療（
treatment）」或「治療（
treating）」可分別用術語「預防（
prevention）」或「預防（
preventing）」替換。
「有效量」係指在必需劑量下及在必需時間內有效達成所需治療結果的量。所需治療結果之實例為升高個體中之功能性CFI之含量(例如，以便在足以改善疾病或病症之症狀的含量下產生功能性CFI)。
視情況，CFI多肽、聚核苷酸、載體/病毒粒子及/或組合物係如下投與：經靜脈內投與；全身性地投與：經由周邊靜脈輸注投與至肝臟；經由肝血管(諸如肝靜脈輸注或肝動脈輸注)投與至肝臟；或經由直接腦實質內投與而投與至肝臟。視情況，CFI多肽、聚核苷酸、載體/病毒粒子及/或組合物係經靜脈內投與。視情況，CFI多肽、聚核苷酸、載體/病毒粒子及/或組合物係經全身性投與。視情況，CFI多肽、聚核苷酸、載體/病毒粒子及/或組合物係經由周邊靜脈輸注投與至肝臟。視情況，CFI多肽、聚核苷酸、載體/病毒粒子及/或組合物係經由肝血管(諸如肝靜脈輸注或肝動脈輸注)投與至肝臟。視情況，CFI多肽、聚核苷酸、載體/病毒粒子及/或組合物係經由直接腦實質內投與而投與至肝臟。視情況，CFI多肽、聚核苷酸、載體/病毒粒子及/或組合物係藉由注射至腎動脈中來進行投與。視情況，CFI多肽、聚核苷酸、載體/病毒粒子及/或組合物係藉由逆行投與來投與，例如經由輸尿管，使用泌尿導管進行投與。視情況，CFI多肽、聚核苷酸、載體/病毒粒子及/或組合物係經由直接腎實質注射來投與。視情況，CFI多肽、聚核苷酸、載體/病毒粒子及/或組合物係經由被膜下注射來投與。
視情況，該治療方法為治療眼部病症之方法。視情況，治療方法為治療補體介導之病症的方法。視情況，補體介導之病症為眼部病症。視情況，眼部病症為補體介導之眼睛慢性發炎性病狀。視情況，眼部病症為年齡相關之黃斑部變性(AMD)或糖尿病性視網膜病變。視情況，眼部病症為青光眼、斯特格氏病(Stargardt's disease)、中心性漿液性脈絡膜視網膜病變或色素性視網膜炎。視情況，眼部病症為糖尿病性黃斑水腫(DME)、角膜結膜炎、視神經脊髓炎譜系疾病(neuromyelitis optica spectrum disorder；NMOSD)、開角型青光眼、息肉樣脈絡膜血管病變、葡萄膜炎或玻璃體視網膜病變。視情況，眼部病症為非致癌性的。視情況，眼部病症為AMD。視情況，AMD為乾性AMD。視情況，AMD為地圖狀萎縮(GA)。
視情況，治療方法為治療AMD之方法。視情況，治療方法為治療乾性AMD之方法。視情況，治療方法為治療GA之方法。
視情況，治療方法降低退化型病症(諸如AMD)之進展速率或預防該病症進展。AMD之臨床進展之特徵在於根據黃斑變化的階段。早期AMD之標誌為玻璃膜疣，其為視網膜下方之細胞外碎片之積聚且在臨床檢查及眼底照片上呈現為視網膜中之黃色斑點。玻璃膜疣係根據尺寸分類為小型(＜63µm)、中等(63至124 µm)及大型(＞124µm)。視其邊緣在眼科檢查上之外觀而定，其亦被視為硬或軟的。硬玻璃膜疣有明確限定之邊緣。軟玻璃膜疣具有限定不明確及流動的邊緣。年齡相關之眼病研究(AREDS)眼底照片嚴重程度標度為用於此病況之主要分類系統中之一者。乾性AMD之特徵通常在於視網膜色素上皮(RPE)層中細胞之進行性細胞凋亡、上覆感光細胞且其特徵亦常在於絡膜毛細管層中之底層細胞。伴隨著上覆感光體萎縮之RPE細胞死亡之匯合區域稱為地圖狀萎縮(GA)。患有此形式之AMD之患者經歷中心視覺之緩慢及進行性惡化。
視情況，治療方法預防出現如上文所描述之一或多種AMD特徵或降低其出現率。視情況，該治療方法維持或改善患有AMD之患者之視覺功能。
視情況，治療方法係治療GA。視情況，治療方法預防GA或使GA減少。視情況，治療方法預防GA之面積增加。視情況，治療方法使得GA之量降低。視情況，治療方法使得GA之面積減少。視情況，治療方法使自向眼睛投與CFI多肽、聚核苷酸、載體/病毒粒子及/或組合物(在多次投與的情況下，其為第一次投與)起至少12個月(例如12個月時) GA之量(例如GA之面積)減少至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%。視情況，治療方法預防GA形成或使GA形成減少。視情況，治療方法預防GA進展或使GA進展速率降低。視情況，治療方法使自向眼睛投與CFI多肽、聚核苷酸、載體/病毒粒子及/或組合物(在多次投與的情況下，其為第一次投與)起至少12個月(例如12個月時) GA面積之增加速率相對於未經治療之眼睛在同一時段降低至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%。
視情況，治療方法預防玻璃膜疣形成或使玻璃膜疣形成速率降低。視情況，治療方法使現有玻璃膜疣減少，例如使現有玻璃膜疣之尺寸及/或數目減小。視情況，治療方法預防補體沈積或使補體沈積速率降低。視情況，治療方法使現有補體沈積減少。
視情況，治療方法使視覺或視敏度(vision visual acuity)改善或恢復。視情況，治療方法緩解視覺或視敏度喪失。視情況，治療方法使患者之閱讀速度改善或恢復。視情況，治療方法緩解患者閱讀速度之降低。視情況，治療方法會減少或預防感光體及/或視網膜色素上皮(RPE)之損失。
視情況，眼部病症為AMD。視情況，治療方法為治療AMD之方法。視情況，AMD為乾性AMD。視情況，治療方法為治療乾性AMD之方法。視情況，AMD為GA。視情況，治療方法為治療GA之方法。
視情況，CFI多肽、聚核苷酸、載體/病毒粒子及/或組合物係藉由視網膜下注射、直接視網膜注射、脈絡膜上腔注射及/或玻璃體內注射投與。視情況，CFI多肽、聚核苷酸、載體/病毒粒子及/或組合物係藉由視網膜下注射投與。視情況，CFI多肽、聚核苷酸、載體/病毒粒子及/或組合物係藉由直接視網膜注射投與。視情況，CFI多肽、聚核苷酸、載體/病毒粒子及/或組合物係藉由脈絡膜上腔注射投與。視情況，CFI多肽、聚核苷酸、載體/病毒粒子及/或組合物係藉由玻璃體內注射投與。視情況，CFI多肽、聚核苷酸、載體/病毒粒子及/或組合物係經眼內投與。
視情況，治療方法為治療非眼部病症之方法。視情況，治療方法為治療補體介導之病症的方法。視情況，補體介導之病症為非眼部病症。視情況，非眼部病症為全身性急性病症。視情況，非眼部病狀為選自由以下組成之群之全身性急性病症：急性絲球體腎炎、急性腎損傷、急性呼吸窘迫症候群、細菌腦膜炎、腦出血、燒傷、冠狀病毒感染、埃-巴二氏病毒(Epstein-Barr virus)感染、造血幹細胞移植、局部缺血再灌注損傷、萊姆病(Lyme disease)、心肌梗塞、器官移植、齒根骨膜炎、肺炎、子癇前症、血吸蟲病、敗血症、中風、血栓栓塞、局部缺血-再灌注損傷及創傷性腦損傷。視情況，非眼病症為全身性慢性病症。視情況，非眼部病症為選自由以下組成之群的全身性慢性病症：阿茲海默症(Alzheimer's disease)、抗嗜中性白血球細胞質抗體(ANCA)相關血管炎、抗磷脂症候群、哮喘、動脈粥樣硬化、非典型性溶血性尿毒性症候群(atypical hemolytic uremic syndrome；aHUS)、自體免疫溶血性貧血(autoimmune hemolytic anemia)、大皰性類天疱瘡(bullous pemphigoid；BP)、C3腎絲球病變、慢性腎衰竭、慢性阻塞性肺病、克羅恩氏病(Crohn's disease)、糖尿病神經病變、全身性重症肌無力(generalized myasthenia gravis；gMG)、肉芽腫伴多血管炎(Granulomatosis with Polyangiitis；GPA)、格-巴二氏症候群(Guillain-Barre Syndrome；GBS)、遺傳性血管水腫(hereditary angioedema；HAE)、化膿性汗腺炎(hidradenitis suppurativa；HS)、IgA腎病、狼瘡性腎炎(lupus nephritis；LN)、膜性絲球體腎炎(membranous glomerulonephritis；MN)、顯微多血管炎(microscopic polyangiitis；MPA)、運動神經元病、多灶性運動神經病(multifocal motor neuropathy；MMN)、多發性硬化症(multiple sclerosis；MS)、非胰島素依賴性糖尿病、骨關節炎、胰臟炎、帕金森氏症(Parkinson's disease)、陣發性夜間血紅素尿症(paroxysmal nocturnal hemoglobinuria；PNH)、移植後淋巴細胞增生症、蛋白丟失腸病、牛皮癬、壞疽性膿皮病、類風濕性關節炎、精神分裂症(SZ)、全身性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus；SLE)、免疫性血小板減少症(immune thrombocytopenia；ITP)、潰瘍性結腸炎、肌萎縮性側索硬化(Amyotrophic lateral sclerosis；ALS)、溫自體免疫溶血性貧血(warm autoimmune hemolytic anemia；wAIHA)、冷凝集素病(cold agglutinin disease；CAD)、免疫複合物膜增生性絲球體腎炎(Immune-Complex Membranoproliferative Glomerulonephritis；IC-MPGN)、蘭伯特-伊頓重肌無力症候群(Lampert-Eaton myasthenic syndrome；LEMS)、CHAPLE症候群(CD55不足)、血栓性微血管病(thrombotic microangiography；TMA)、亨廷頓氏病(Huntington's disease)及慢性發炎性脫髓鞘多發性神經病(chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy；CIDP)。
視情況，病症不為眼部病症。視情況，CFI多肽、聚核苷酸、載體/病毒粒子或組合物不經眼內投與。
視情況，CFI多肽、聚核苷酸、載體/病毒粒子或組合物不藉由視網膜下注射、直接視網膜注射、脈絡膜上腔注射及/或玻璃體內注射投與。視情況，CFI多肽、聚核苷酸、載體/病毒粒子或組合物不藉由視網膜下注射投與。視情況，CFI多肽、聚核苷酸、載體/病毒粒子或組合物不藉由直接視網膜注射投與。視情況，CFI多肽、聚核苷酸、載體/病毒粒子或組合物不藉由脈絡膜上腔注射投與。視情況，CFI多肽、聚核苷酸、載體/病毒粒子或組合物不藉由玻璃體內注射投與。視情況，CFI多肽、聚核苷酸、載體/病毒粒子及/或組合物不經眼內投與。
視情況，投與CFI多肽、聚核苷酸、載體/病毒粒子或組合物會增加患者中C3b不活化及/或iC3b降解活性之水準。視情況，投與CFI多肽、聚核苷酸、載體/病毒粒子或組合物會使C3b不活化及/或iC3b降解活性之水準增加至正常水準。視情況，投與CFI多肽、聚核苷酸、載體/病毒粒子或組合物會使C3b不活化及/或iC3b降解活性之水準增加至高於正常水準。視情況，投與CFI多肽、聚核苷酸、載體/病毒粒子或組合物會使C3b不活化及/或iC3b降解活性之水準增加至高於正常水準1.2倍、1.5倍、1.8倍或2倍的水準。視情況，正常水準等於由血清中之30至40 µg/ml之CFI多肽提供的水準。視情況，C3b不活化及/或iC3b降解活性之水準增加係在向其投與CFI多肽、聚核苷酸、載體/病毒粒子或組合物之組織或器官(諸如眼睛)中的C3b不活化及/或iC3b降解活性之水準增加(例如增加至高於正常水準)。舉例而言，藉由視網膜下注射、直接視網膜注射、脈絡膜上腔注射及/或玻璃體內注射投與CFI多肽、聚核苷酸、載體/病毒粒子或組合物可增加眼睛中C3b不活化及/或iC3b降解活性水準(例如增加至高於正常水準)。
視情況，治療方法為增加患者中C3b不活化及/或iC3b降解水準之方法。視情況，治療方法為增加患者中C3b不活化及/或iC3b降解水準從而治療補體介導之病症的方法。視情況，治療方法為藉由增加患者中C3b不活化及/或iC3b降解水準來治療疾病之方法。視情況，增加患者中C3b不活化及/或iC3b降解水準係使C3b不活化及/或iC3b降解活性之水準增加至正常水準。視情況，增加患者中C3b不活化及/或iC3b降解水準係使C3b不活化及/或iC3b降解活性之水準增加至高於正常水準。視情況，增加患者中C3b不活化及/或iC3b降解水準係使C3b不活化及/或iC3b降解活性之水準增加至比正常水準高1.2倍、1.5倍、1.8倍或2倍的水準。視情況，正常水準等於由血清中之30至40 µg/ml之CFI多肽提供的水準。視情況，C3b不活化及/或iC3b降解活性之水準增加係在向其投與CFI多肽、聚核苷酸、載體/病毒粒子或組合物之組織或器官(諸如眼睛)中的C3b不活化及/或iC3b降解活性之水準增加(例如增加至高於正常水準)。舉例而言，藉由視網膜下注射、直接視網膜注射、脈絡膜上腔注射及/或玻璃體內注射投與CFI多肽、聚核苷酸、載體/病毒粒子或組合物可增加眼睛中C3b不活化及/或iC3b降解活性水準(例如增加至高於正常水準)。
本發明現將參見以下實例進行描述，其僅具例示性且無論如何不應視為限制本發明之範疇。
實例 實例 1 - 通用方法
除非另外規定，否則在下文所描述之實例中遵循以下通用方法。
產生 CFI 蛋白質
使用Expi293F細胞(Thermo Fisher，目錄號A14527)表現N端6His-標記之CFI變異體或野生型CFI。除了含有某些胺基酸取代之外，此等CFI變異體對應於野生型CFI。
製備 Expi293F 細胞以供轉染
在具有通氣帽之125 mL塑膠燒瓶(Thermo Scientific，目錄號4115-0125)中，使Expi293F細胞在37℃、125 rpm、80%濕度之8% CO
2氛圍下在30 mL Expi293培養基(Thermo Fisher，目錄號A1435101)中之懸浮液中擴增。在維持及擴增階段期間，當細胞達到3-5×10
6個細胞/毫升之密度時，細胞經繼代為每毫升0.3×10
6個活細胞。使用自動細胞計數器(Thermo Fisher，目錄號AMQAX2000)及台盼藍排除法(Thermo Fisher，目錄號T10282)測定細胞活力。
在每次繼代期間，將細胞在室溫下在50 mL離心管(Corning，目錄號430829)中以400×g短暫離心10分鐘，且藉由抽吸移走培養基，隨後將細胞再懸浮於預溫熱之新鮮Expi293培養基中。
製備轉殖基因表現質體
藉由GenScript™製造表現蛋白質(例如CFI變異體或野生型CFI)之質體。各質體含有編碼CFI變異體及天然信號肽(例如下表2中之PL135之SEQ ID NO: 17)或野生型CFI及天然信號肽(SEQ ID NO: 16)之經密碼子最佳化之轉殖基因。各轉殖基因包含在編碼信號肽之序列與編碼成熟CFI序列的序列之間的編碼6His-標籤之序列。將質體凍乾以用於儲存。
製備轉染複合物
將總共40 μL無核酸酶水(Invitrogen，目錄號AM9937)添加至4 μg含有CFI變異體或野生型CFI轉殖基因之凍乾質體DNA中(根據以上標題為「
製備轉殖基因表現質體」之部分製備)。將總共7 μL之各復原質體DNA轉移至96孔培養盤(V形底；Corning，REF 3894)。將總共3.5 mL OptiMEM (Gibco)與70 μL含有編碼人類弗林蛋白酶(Origene Technologies Biotechnology，目錄號RG204279-FURIN)之轉殖基因的pCMV6-AC-GFP載體的1μg/μl溶液混合，以形成OptiMEM-弗林蛋白酶混合物。隨後將70 μL OptiMEM-弗林蛋白酶混合物添加至含有復原質體DNA之V形底96孔盤之各孔中且培育5分鐘。藉由向15 mL離心管(Corning，目錄號430766)中之7.3 mL OptiMEM中添加400 uL ExpiFectamine (Thermo Fisher，目錄號A14524)來製造ExpiFectamine-OptiMEM之工作溶液。將74 μL ExpiFectamine-OptiMEM之工作溶液添加至V形底96孔盤(已經含有復原質體DNA及OptiMEM-弗林蛋白酶混合物)之各孔中且在室溫下培育。在20至30分鐘培育之後，準備好所得混合物(含有DNA脂質複合物)用於轉染。
轉染 Expi293F 細胞
在轉染當天，使用預溫熱Expi293培養基將Expi293F細胞(根據以上標題為「
製備 Expi293F 細胞以供轉染」之部分製備)調整至2.8×10
6個細胞/毫升之密度，且在96深孔培養盤(Fisher Scientific，目錄號10447181)中每孔添加培養基中之0.7 mL細胞。將各盤用多孔膠帶(Invitrogen，目錄號10544453)密封且置放於400 rpm之震盪培育箱中之微量培養盤托架中，直至準備好DNA脂質複合物(根據以上標題為「
製備轉染複合物」之部分製備)。
向含有Expi293F細胞之各孔中添加70 μL含有DNA脂質複合物之混合物(根據以上標題為「
製備轉染複合物」之部分製備)。再密封培養盤，且在37℃在8% CO
2潮濕氛圍中在震盪(400 rpm)下培養細胞18至24小時。
在初始培育18至24小時之後，添加來自ExpiFectamine 293轉染套組(Thermo Fisher，目錄號A14524)的強化子1與強化子2之混合液(27.5 μL/孔)。隨後將盤再密封且返回至在37℃以400 rpm震盪的潮濕8% CO
2培育箱中再持續四天。
藉由以400×g離心培養盤10分鐘來收集上清液。將上清液轉移至新的96深孔盤中且以2000×g離心10分鐘。用3.0 μm/0.2 μm真空過濾器(PALL目錄號5053)過濾上清液且將其在4℃儲存於新的96深孔盤中直至分析為止。舉例而言，在如下文所闡述之「
使用 ELISA 量化人類 CFI 蛋白」或「
使用 HTRF 分析經由量測 iC3b 形成來測定 CFI 活性」中使用一些上清液。
使用 ELISA 量化人類 CFI 蛋白
使用補體因子I人類ELISA套組(Hycult，目錄號HK355-01)量化自Expi293F細胞表現及分泌之CFI蛋白的濃度。根據分析說明書進行ELISA。簡言之，在塗佈有抗人類CFI抗體之微量滴定孔中培育來自套組之上清液樣本(視需要用來自套組之樣本稀釋劑稀釋)及人類CFI標準物(以捕捉人類CFI)。添加經生物素標記之示蹤物抗體(以結合於所捕捉之人類CFI)，接著添加鏈黴抗生物素蛋白過氧化酶結合物(以結合於經生物素標記之示蹤物抗體)。隨後添加鏈黴抗生物素蛋白過氧化酶結合物與之反應的受質四甲基聯苯胺(TMB)。藉由添加草酸來中止酶反應。對於樣本及標準物中之每一者，用分光光度計量測450 nm下之吸光度。藉由相對於人類CFI標準物之對應濃度(對數)標繪吸光度(線性)而獲得標準曲線。隨後根據標準曲線判定樣本中人類CFI之濃度。
使用 HTRF 分析經由量測 iC3b 形成來測定 CFI 活性
藉由使用均相時差式螢光(HTRF)分析量測CFI使C3b裂解為iC3b的過程來評估CFI變異體及野生型CFI之活性。使用對與鋱穴狀化合物結合之人類iC3b新抗原具有特異性之單株IgG抗體(CisBio，訂單號64CUSTAYE，「
抗 iC3b (Tb) IgG」)及與螢光素(FITC)結合之抗C3b/iC3b抗體(CEDARLANE目錄號CL7632F，「
抗 C3b (FITC) IgG」)來量測C3b之裂解。
將含有CFI蛋白(例如CFI變異體或野生型CFI)之上清液(自如上文所描述之Expi293F細胞轉染獲得)稀釋於50 mM HEPES (Merck，目錄號H3375)、0.1% BSA (Merck，目錄號A4503)、0.1% Tween-20 (Acros Organics，目錄號233362500) ( pH 7.0)中，因此CFI蛋白濃度為例如150 pM (對於包含單一胺基酸突變之CFI變異體而言)或75 pM (對於包含雙重、三重、四重或五重胺基酸突變之CFI變異體而言)。以最低1:100來稀釋上清液。將含有CFI蛋白之經稀釋上清液以每孔5 µL之體積添加至白色的小體積384孔盤(Sigma，目錄號784904)中。使用自動式分配器(MANTIS，FORMULATRIX®)向各孔中添加5 µL含有9 nM C3b (Complement Technology，目錄號A114)及6 nM輔因子H (CFH) (Complement Technology，目錄號A137)的主混合物。在室溫下培育反應物例如1小時(對於包含單一胺基酸突變之CFI變異體而言)或30分鐘(對於包含雙重、三重、四重或五重胺基酸突變之CFI變異體而言)。對於時間反應曲線實驗(圖2)，將反應物培育1小時、2小時、3小時或5小時。隨後向各孔中添加5 µL含有1.5 µg/mL之抗iC3b (Tb) IgG及36 nM之抗C3b (FITC) IgG的抗體主混合物。在室溫下再培育反應物例如1小時(用於包含單一胺基酸突變之CFI變異體而言)或30分鐘(對於包含雙重、三重、四重或五重胺基酸突變之CFI變異體而言)。對於時間反應曲線實驗(圖2)，再培育反應物1小時。添加抗體主混合物後之反應體積為15 µL且CFI蛋白之濃度為例如50 pM (對於包含單一胺基酸突變之CFI變異體而言)或25 pM (對於包含雙重胺基酸突變之CFI變異體而言)。各反應重複進行三次。
計算 HTRF 比率
使用螢光共振能量轉移(FRET)技術以螢光測定方式評定CFI活性。使用SpectraMax® i3盤式讀取器(Molecular Devices)使反應混合物(來自上述方法，在與抗體主混合物一起培育之後)曝露於340 nm之激發波長(λex=340 nm)。可針對鋱穴狀化合物之發射光譜獲取490 nM下之螢光讀數(使用SpectraMax®i3盤式讀取器(Molecular Devices))且針對FITC之發射光譜獲取520 nm下之螢光讀數(λem= 490及520 nm)。自盤上方3 mm之高度且在0.5 ms之積分時間下獲取讀數。計算用於各反應之490 nm及520 nm通道之平均螢光強度(MFI)。可隨後藉由將在520 nm (HTRF FRET受體)下量測之MFI除以在490 nm (HTRF FRET供體)下量測之MFI且將所得值乘以10,000來計算HTRF比率(如下文所示)。
HTRF比率 =
*10,000
計算相對於野生型 CFI 之 CFI 活性
使用野生型CFI以在一些實驗中規範化且比較突變之活性。對於一些實驗，將CFI變異體之HTRF比率除以野生型CFI之HTRF比率，以便獲得CFI活性相對於野生型CFI之倍數變化。
計算 C3b 轉化為 iC3b 之百分比 (iC3b 形成 %)
對於時間-反應曲線實驗(圖2)，使用iC3b標準曲線計算C3b轉化至iC3b之百分比(亦即iC3b形成%)。為產生標準曲線，在不存在任何CFI之情況下在分析緩衝液(50 mM HEPES，pH 7.0，補充有0.1% BSA及0.1% Tween-20)中製備含有不同的C3b與iC3b之比率但具有相等總蛋白濃度的反應混合物。
將反應混合物培育1、2、3或5小時(亦即，C3b及CFH與對應CFI變異體或野生型CFI一起培育之相同時間長度)。將抗體主混合物添加至反應混合物中且再培育反應物1小時。添加抗體主混合物之後，iC3b加C3b之總濃度為3 nM。表1顯示在添加抗體主混合物之後，反應混合物中iC3b及C3b之濃度。
表1：在添加抗體主混合物後，反應混合物中之HTRF分析C3b及iC3b濃度。C3b與iC3b之各比率表示針對iC3b由C3b形成的特定百分比存在的比率。使用反應混合物產生iC3b標準曲線。
| iC3b | C3b | iC3b形成% |
| 3 nM | 0 nM | 100 |
| 1.5 nM | 1.5 nM | 50 |
| 0 nM | 3 nM | 0 |
隨後使用上文所描述之方法計算各反應混合物之HTRF比率。隨後繪製HTRF比率相對於iC3b形成百分比之標準曲線。隨後藉由相對於標準曲線內插來擬合CFI變異體及野生型CFI中之每一者的HTRF比率，以計算C3b相對於iC3b之轉化率百分比。
統計分析
使用GraphPad Prism 7.0.3或8.0.2 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA)分析並圖示資料。資料係以平均值±SD呈現。藉由非線性回歸(四個可變斜率)計算圖2中之CFI時間反應曲線。
實例 2 - CFI 變異體 表 2 ： CFI 變異體之清單
| 變異體名稱(或野生型「wt」) | CFI中之突變(對應於SEQ ID NO: 1中之胺基酸位置的編號) | 編碼變異體或wt之序列 | ||||
| wt (PL01) | 無 | SEQ ID NO: 16 | ||||
| PL09 (陽性對照) | M138V | |||||
| PL10 (陰性對照) | S525A | |||||
| PL11 | R53I | |||||
| PL12 | R53L | |||||
| PL13 | R53Y | |||||
| PL14 | R53E | |||||
| PL17 | V60S | |||||
| PL21 | V60E | |||||
| PL22 | R383F | |||||
| PL23 | R383Y | |||||
| PL24 | R383I | |||||
| PL25 | R383L | |||||
| PL26 | R383E | |||||
| PL27 | A384I | |||||
| PL28 | A384W | |||||
| PL29 | A384Y | |||||
| PL30 | A384F | |||||
| PL34 | A384I | |||||
| PL35 | I400W | |||||
| PL36 | I400Y | |||||
| PL37 | I400R | |||||
| PL40 | H401W | |||||
| PL41 | H401Y | |||||
| PL42 | H401F | |||||
| PL43 | H401G | |||||
| PL47 | I407F | |||||
| PL49 | V408T | |||||
| PL50 | V408Y | |||||
| PL53 | I409F | |||||
| PL54 | I409W | |||||
| PL55 | I409E | |||||
| PL65 | G439L | |||||
| PL69 | G439E | |||||
| PL70 | G439L | |||||
| PL73 | N440T | |||||
| PL76 | K441E | |||||
| PL77 | K441F | |||||
| PL78 | K441Y | |||||
| PL87 | E479D | |||||
| PL89 | F482W | |||||
| PL91 | F482L | |||||
| PL92 | F482H | |||||
| PL93 | F482I | |||||
| PL94 | F482Q | |||||
| PL95 | F482R | |||||
| PL96 | F482T | |||||
| PL108 | R53E | R383E | ||||
| PL109 | R53E | R383I | ||||
| PL110 | R53E | R383L | ||||
| PL111 | R53E | R383Y | ||||
| PL112 | R53E | R383F | ||||
| PL113 | R53E | V408T | ||||
| PL114 | R53E | I409F | ||||
| PL115 | R53E | G439Q | ||||
| PL116 | R53E | G439E | ||||
| PL117 | R53E | H401Y | ||||
| PL118 | R53E | E479D | ||||
| PL120 | R53I | R383E | ||||
| PL121 | R53I | R383I | ||||
| PL122 | R53I | R383L | ||||
| PL123 | R53I | R383Y | ||||
| PL124 | R53I | R383F | ||||
| PL125 | R53I | V408T | ||||
| PL126 | R53I | I409F | ||||
| PL127 | R53I | G439Q | ||||
| PL128 | R53I | G439E | ||||
| PL129 | R53I | H401Y | ||||
| PL130 | R53I | E479D | ||||
| PL131 | R53I | F482Q | ||||
| PL132 | R53L | R383E | ||||
| PL133 | R53L | R383I | ||||
| PL134 | R53L | R383L | ||||
| PL135 | R53L | R383Y | SEQ ID NO: 17 | |||
| PL136 | R53L | R383F | ||||
| PL137 | R53L | V408T | ||||
| PL138 | R53L | I409F | ||||
| PL139 | R53L | G439Q | ||||
| PL140 | R53L | G439E | ||||
| PL141 | R53L | H401Y | ||||
| PL142 | R53L | E479D | ||||
| PL143 | R53L | F482Q | ||||
| PL144 | R53Y | R383E | ||||
| PL145 | R53Y | R383I | ||||
| PL146 | R53Y | R383L | ||||
| PL147 | R53Y | R383Y | ||||
| PL148 | R53Y | R383F | ||||
| PL149 | R53Y | V408T | ||||
| PL150 | R53Y | I409F | ||||
| PL151 | R53Y | G439Q | ||||
| PL152 | R53Y | G439E | ||||
| PL153 | R53Y | H401Y | ||||
| PL154 | R53Y | E479D | ||||
| PL155 | R53Y | F482Q | ||||
| PL156 | R383E | V408T | ||||
| PL157 | R383E | I409F | ||||
| PL159 | R383E | G439E | ||||
| PL160 | R383E | H401Y | ||||
| PL161 | R383E | E479D | ||||
| PL163 | R383I | V408T | ||||
| PL164 | R383I | I409F | ||||
| PL165 | R383I | G439Q | ||||
| PL166 | R383I | G439E | ||||
| PL167 | R383I | H401Y | ||||
| PL171 | R383L | I409F | ||||
| PL173 | R383L | G439E | ||||
| PL174 | R383L | H401Y | ||||
| PL175 | R383L | E479D | ||||
| PL176 | R383L | F482Q | ||||
| PL177 | R383Y | V408T | ||||
| PL178 | R383Y | I409F | ||||
| PL179 | R383Y | G439Q | ||||
| PL180 | R383Y | G439E | ||||
| PL181 | R383Y | H401Y | ||||
| PL182 | R383Y | E479D | ||||
| PL183 | R383Y | F482Q | ||||
| PL184 | R383F | V408T | ||||
| PL185 | R383F | I409F | ||||
| PL186 | R383F | G439Q | ||||
| PL187 | R383F | G439E | ||||
| PL188 | R383F | H401Y | ||||
| PL189 | R383F | E479D | ||||
| PL190 | R383F | F482Q | ||||
| PL191 | V408T | H401Y | ||||
| PL192 | V408T | E479D | ||||
| PL195 | I409F | E479D | ||||
| PL197 | G439Q | H401Y | ||||
| PL198 | G439Q | E479D | ||||
| PL199 | G439Q | F482Q | ||||
| PL200 | G439E | H401Y | ||||
| PL201 | G439E | E479D | ||||
| PL202 | G439E | F482Q | ||||
| PL203 | R53E | R383E | I409F | |||
| PL204 | R53E | R383E | G439E | |||
| PL205 | R53E | R383E | H401Y | |||
| PL206 | R53L | R383L | V408T | |||
| PL207 | R53L | R383L | G439E | |||
| PL208 | R53L | R383L | E479D | |||
| PL210 | R383E | G439Q | V408T | |||
| PL211 | R383E | G439Q | I409F | |||
| PL212 | R383E | G439Q | H401Y | |||
| PL213 | R383E | G439Q | F482Q | |||
| PL214 | V408T | I409F | G439Q | |||
| PL215 | V408T | I409F | H401Y | |||
| PL216 | V408T | I409F | E479D | |||
| PL217 | V408T | I409F | F482Q | |||
| PL218 | H401Y | E479D | F482Q | |||
| PL219 | R53E | R383E | I409F | G439E | ||
| PL223 | R53E | R383E | V408T | F482Q | ||
| PL224 | R53E | R383E | I409F | H401Y | ||
| PL228 | R53E | R383E | G439E | H401Y | ||
| PL238 | R53E | R383L | V408T | H401Y | ||
| PL239 | R53E | R383L | V408T | F482Q | ||
| PL245 | R53E | R383L | G439E | F482Q | ||
| PL246 | R53E | R383Y | V408T | H401Y | ||
| PL247 | R53E | R383Y | V408T | F482Q | ||
| PL248 | R53E | R383Y | I409F | H401Y | ||
| PL249 | R53E | R383Y | I409F | F482Q | ||
| PL255 | R53E | R383F | V408T | F482Q | ||
| PL256 | R53E | R383F | I409F | H401Y | ||
| PL257 | R53E | R383F | I409F | F482Q | ||
| PL260 | R53E | R383F | G439E | H401Y | ||
| PL261 | R53E | R383F | G439E | F482Q | ||
| PL268 | R53I | R383E | G439E | H401Y | ||
| PL270 | R53I | R383I | V408T | H401Y | ||
| PL271 | R53I | R383I | V408T | F482Q | ||
| PL274 | R53I | R383I | G439Q | H401Y | ||
| PL275 | R53I | R383I | G439Q | F482Q | ||
| PL278 | R53I | R383L | V408T | H401Y | ||
| PL282 | R53I | R383L | G439Q | H401Y | ||
| PL283 | R53I | R383L | G439Q | F482Q | ||
| PL286 | R53I | R383Y | V408T | H401Y | ||
| PL287 | R53I | R383Y | V408T | F482Q | ||
| PL290 | R53I | R383Y | G439Q | H401Y | ||
| PL291 | R53I | R383Y | G439Q | F482Q | ||
| PL294 | R53I | R383F | V408T | H401Y | ||
| PL295 | R53I | R383F | V408T | F482Q | ||
| PL298 | R53I | R383F | G439Q | H401Y | ||
| PL299 | R53I | R383F | G439Q | F482Q | ||
| PL302 | R53L | R383E | V408T | H401Y | ||
| PL305 | R53L | R383E | I409F | F482Q | ||
| PL308 | R53L | R383E | G439E | H401Y | ||
| PL309 | R53L | R383E | G439E | F482Q | ||
| PL310 | R53L | R383I | V408T | H401Y | ||
| PL314 | R53L | R383I | G439Q | H401Y | ||
| PL318 | R53L | R383L | V408T | H401Y | ||
| PL319 | R53L | R383L | V408T | F482Q | ||
| PL322 | R53L | R383L | G439Q | H401Y | ||
| PL325 | R53L | R383L | G439E | F482Q | ||
| PL326 | R53L | R383Y | V408T | H401Y | ||
| PL327 | R53L | R383Y | V408T | F482Q | ||
| PL328 | R53L | R383Y | I409F | H401Y | ||
| PL329 | R53L | R383Y | I409F | F482Q | ||
| PL330 | R53L | R383Y | G439Q | H401Y | ||
| PL331 | R53L | R383Y | G439Q | F482Q | ||
| PL332 | R53L | R383Y | G439E | H401Y | ||
| PL334 | R53L | R383F | V408T | H401Y | ||
| PL335 | R53L | R383F | V408T | F482Q | ||
| PL336 | R53L | R383F | I409F | H401Y | ||
| PL337 | R53L | R383F | I409F | F482Q | ||
| PL338 | R53L | R383F | G439Q | H401Y | ||
| PL339 | R53L | R383F | G439Q | F482Q | ||
| PL340 | R53L | R383F | G439E | H401Y | ||
| PL341 | R53L | R383F | G439E | F482Q | ||
| PL345 | R53Y | R383E | I409F | F482Q | ||
| PL348 | R53Y | R383E | G439E | H401Y | ||
| PL349 | R53Y | R383E | G439E | F482Q | ||
| PL350 | R53Y | R383I | V408T | H401Y | ||
| PL354 | R53Y | R383I | G439Q | H401Y | ||
| PL355 | R53Y | R383I | G439Q | F482Q | ||
| PL358 | R53Y | R383L | V408T | H401Y | ||
| PL359 | R53Y | R383L | V408T | F482Q | ||
| PL360 | R53Y | R383L | I409F | H401Y | ||
| PL362 | R53Y | R383L | G439Q | H401Y | ||
| PL365 | R53Y | R383L | G439E | F482Q | ||
| PL366 | R53Y | R383Y | V408T | H401Y | ||
| PL367 | R53Y | R383Y | V408T | F482Q | ||
| PL368 | R53Y | R383Y | I409F | H401Y | ||
| PL369 | R53Y | R383Y | I409F | F482Q | ||
| PL370 | R53Y | R383Y | G439Q | H401Y | ||
| PL371 | R53Y | R383Y | G439Q | F482Q | ||
| PL374 | R53Y | R383F | V408T | H401Y | ||
| PL375 | R53Y | R383F | V408T | F482Q | ||
| PL376 | R53Y | R383F | I409F | H401Y | ||
| PL377 | R53Y | R383F | I409F | F482Q | ||
| PL378 | R53Y | R383F | G439Q | H401Y | ||
| PL379 | R53Y | R383F | G439Q | F482Q | ||
| PL380 | R53Y | R383F | G439E | H401Y | ||
| PL381 | R53Y | R383F | G439E | F482Q | ||
| PL100 | R53Y | H401Y | I409F | E479D | F482Q | |
| PL101 | R383E | H401Y | I409F | E479D | F482Q | |
| PL102 | R383I | H401Y | I409F | E479D | F482Q | |
| PL103 | R383L | H401Y | I409F | E479D | F482Q | |
| PL104 | R383Y | H401Y | I409F | E479D | F482Q |
除了各別列出之突變之外(除PL01外)，表2中之變異體均具有SEQ ID NO: 16之序列。表2中所指示之突變之位置為不成熟CFI多肽序列中之對應位置(亦即，SEQ ID NO: 1之多肽序列中之對應位置)。SEQ ID NO: 16之核苷酸序列包含在編碼信號肽之序列與編碼成熟CFI序列之序列之間的編碼6His-標籤之序列。因此，SEQ ID NO: 1之序列中成熟CFI多肽之胺基酸的位置及編碼SEQ ID NO: 16中成熟CFI多肽之該等胺基酸的密碼子之對應位置移動了6個位置。舉例而言，SEQ ID NO: 1中之位置53對應於由SEQ ID NO: 16編碼之序列中之位置59 (亦即53加6)。換言之，SEQ ID NO: 1中之位置53對應於編碼位置59 (亦即53加6)之SEQ ID NO: 16中之密碼子。因此，除了(不同於PL01) SEQ ID NO: 16中對應於表2中之各別指定位置(亦即SEQ ID NO: 1中之對應位置)的密碼子編碼各別經取代胺基酸之外，表2中之變異體均具有SEQ ID NO: 16之序列。
舉例而言，除對應於SEQ ID NO: 1中之位置409的密碼子編碼苯丙胺酸之外，PL53 (I409F)具有SEQ ID NO: 16之序列。因此，除編碼由SEQ ID NO: 16編碼之序列中之位置415 (亦即409加6)之密碼子編碼苯丙胺酸之外，PL53 (I409F)具有SEQ ID NO: 16之序列。在另一實例中，除對應於SEQ ID NO: 1中之位置53之密碼子編碼白胺酸且對應於SEQ ID NO: 1中之位置383之密碼子編碼異白胺酸之外，PL133 (R53L/R383I)具有SEQ ID NO: 16之序列。因此，除編碼由SEQ ID NO: 16編碼之序列中之位置59 (亦即53加6)的密碼子編碼白胺酸及編碼由SEQ ID NO: 16編碼之序列中之位置389 (亦即383加6)的密碼子編碼異白胺酸之外，PL133 (R53L/R383I)具有SEQ ID NO: 16之序列。在另一實例中，除對應於SEQ ID NO: 1中之位置383之密碼子編碼麩胺酸、對應於SEQ ID NO: 1中之位置439之密碼子編碼麩醯胺酸且對應於SEQ ID NO: 1中之位置409之密碼子編碼苯丙胺酸之外，PL211 (R383E/G439Q/I409F)具有SEQ ID NO: 16之序列。因此，除編碼由SEQ ID NO: 16編碼之序列中之位置389 (亦即383加6)的密碼子編碼麩胺酸、編碼由SEQ ID NO: 16編碼之序列中之位置445 (亦即439加6)的密碼子編碼麩醯胺酸及編碼由SEQ ID NO: 16編碼之序列中之位置415 (亦即409加6)的密碼子編碼苯丙胺酸之外，PL211 (R383E/G439Q/I409F)具有SEQ ID NO: 16之序列。在另一實例中，除對應於位置53之密碼子編碼酪胺酸、對應於位置383之密碼子編碼酪胺酸、對應於位置408之密碼子編碼蘇胺酸及對應於位置401之密碼子編碼酪胺酸之外，PL366 (R53Y/R383Y/V408T/H401Y)具有SEQ ID NO: 16之序列。因此，除編碼由SEQ ID NO: 16編碼之序列中之位置59 (亦即53加6)的密碼子編碼酪胺酸、編碼由SEQ ID NO: 16編碼之序列中之位置389 (亦即383加6)的密碼子編碼酪胺酸、編碼由SEQ ID NO: 16編碼之序列中之位置414 (亦即408加6)的密碼子編碼蘇胺酸以及編碼由SEQ ID NO: 16編碼之序列中之位置407 (亦即401加6)的密碼子編碼酪胺酸之外，PL366 (R53Y/R383Y/V408T/H401Y)具有SEQ ID NO: 16之序列。在另一實例中，除對應於位置383之密碼子編碼異白胺酸、對應於位置401之密碼子編碼酪胺酸、對應於位置409之密碼子編碼苯丙胺酸、對應於位置479之密碼子編碼天冬胺酸及對應於位置482之密碼子編碼麩醯胺酸之外，PL102 (R383I/H401Y/I409F/E479D/F482Q)具有SEQ ID NO: 16之序列。因此，除編碼由SEQ ID NO: 16編碼之序列中之位置389 (亦即383加6)的密碼子編碼異白胺酸、編碼由SEQ ID NO: 16編碼之序列中之位置407 (亦即401加6)的密碼子編碼酪胺酸、編碼由SEQ ID NO: 16編碼之序列中之位置415 (亦即409加6)的密碼子編碼苯丙胺酸、編碼由SEQ ID NO: 16編碼之序列中之位置485 (亦即479加6)的密碼子編碼天冬胺酸及編碼由SEQ ID NO: 16編碼之序列中之位置488 (亦即482加6)的密碼子編碼麩醯胺酸之外，PL102 (R383I/H401Y/I409F/E479D/F482Q)具有SEQ ID NO: 16之序列。除了對應於SEQ ID NO: 1中之位置53之密碼子編碼白胺酸及對應於SEQ ID NO: 1中之位置383之密碼子編碼酪胺酸之外，PL135 (R53L/R383Y)可具有如表中所指示之SEQ ID NO: 17之序列，或其可具有SEQ ID NO: 16之序列。因此，除編碼由SEQ ID NO: 16編碼之序列中之位置59 (亦即53加6)的密碼子編碼白胺酸及編碼由SEQ ID NO: 16編碼之序列中之位置389 (亦即383加6)的密碼子編碼酪胺酸之外，PL135 (R53L/R383Y)具有SEQ ID NO: 16之序列。
產生大量CFI變異體。除了含有特定胺基酸取代，諸如表2中所示之胺基酸取代(以及信號肽與成熟CFI多肽之間的6His-標籤)之外，此等CFI變異體對應於野生型CFI。標準程序可用於產生CFI變異體，諸如定點突變誘發。根據實例1中標題為「
製備轉殖基因表現質體」之部分產生用於表現蛋白質之質體。
測試CFI變異體之iC3b形成活性。簡言之，根據實例1中之標題為「
產生 CFI 蛋白」、「
製備 Expi293F 細胞以供轉染」、「
製備轉殖基因表現質體」、「
製備轉染複合物」及「
轉染 Expi293F 細胞」之部分中所描述之方法來表現且分泌CFI變異體。根據標題為「
使用 ELISA 量化人類 CFI 蛋白」之部分量化自Expi293F細胞表現及分泌之CFI蛋白的濃度。根據標題為「
使用 HTRF 分析經由量測 iC3b 形成來測定 CFI 活性」之部分中所描述之方法來量測自Expi293F細胞表現及分泌之CFI蛋白之CFI iC3b形成活性。
大量CFI變異體具有比野生型CFI更高的CFI iC3b形成活性。結果進一步論述於以下實例中。
實例 3- 藉由包含單一胺基酸突變之 CFI 變異體達成之增加的 CFI iC3b 形成活性
產生包含單一胺基酸突變之大量CFI變異體以及野生型(WT) CFI (PL01)。為了測定CFI iC3b形成活性，稀釋含有CFI變異體之上清液，使得CFI變異蛋白濃度為150 pM (在添加抗體主混合物之後為50 pM)。在與C3b/CFH主混合物一起培育1小時且與抗體主混合物一起培育1小時之後，計算各CFI變異體及野生型CFI之HTRF比率。將各CFI變異體之HTRF比率除以野生型CFI之HTRF比率，以便獲得各CFI變異體之活性相對於野生型CFI的倍數變化。大量變異體具有與野生型CFI一樣良好或比其更高的活性(參見圖1，其顯示此等變異體之子集)。亦包括陰性對照(PL10)且未顯示iC3b形成活性(資料未示出)。圖1中之「100% iC3b」為顯示在不存在任何CFI之情況下對於3 nM iC3b所達成之HTRF比率(繪製為相對於野生型CFI之HTRF比率的倍數變化)的對照。因此，除了不存在任何CFI及C3b之外，iC3b係以與CFI變異體及野生型CFI相同之方式培育，添加抗體主混合物之後的iC3b之濃度為3 nM。
在與C3b及CFH以及抗體一起培育多次(2、3、4及6小時)之後使用CFI HTRF活性分析量測包含單一胺基酸突變之一些最高CFI變異體之iC3b形成活性。根據標題為「
使用 HTRF 分析經由量測 iC3b 形成來測定 CFI 活性」之部分來計算所形成iC3b之百分比(iC3b形成%)且結果顯示於圖2中。
實例 4- 藉由包含雙重胺基酸突變之 CFI 變異體達成之 CFI iC3b 形成活性
各種單一CFI變異體係基於其活性增益、其在不同界面處之相對位置以及其胺基酸取代之性質而選擇，以用於設計雙重CFI變異體。
分析包含雙重胺基酸突變之大量CFI變異體且與野生型CFI進行比較。為了避免CFI iC3b形成活性分析達到飽和(亦即，為了避免所有C3b在分析期間轉化為iC3b)，且因此為了能夠更好地比較CFI變異體與野生型CFI，將包含雙重胺基酸突變之CFI變異體稀釋至75 pM (在添加抗體主混合物之後的反應中稀釋至25 pM)。在與C3b/CFH主混合物一起培育30分鐘且與抗體主混合物一起培育30分鐘之後，計算各CFI變異體及野生型CFI之HTRF比率。將各CFI變異體之HTRF比率除以野生型CFI之HTRF比率，以便獲得各CFI變異體之活性相對於野生型CFI的倍數變化。大量CFI變異體顯示與野生型CFI相比類似或增加之iC3b形成(參見圖3，其顯示此等變異體之子集)。圖3中之「100% iC3b」為顯示在不存在任何CFI之情況下對於3 nM iC3b所達成之HTRF比率(繪製為相對於野生型CFI之HTRF比率的倍數變化)的對照。因此，除了不存在任何CFI及C3b之外，iC3b係以與CFI變異體及野生型CFI相同之方式培育，添加抗體主混合物之後的iC3b之濃度為3 nM。
實例 5- 藉由包含三重、四重或五重胺基酸突變之 CFI 變異體達成之 CFI iC3b 形成活性
分析包含三重、四重或五重突變之大量CFI變異體且與野生型CFI進行比較。為了避免CFI iC3b形成活性分析達到飽和(亦即，為了避免所有C3b在分析期間轉化為iC3b)，且因此為了能夠更好地比較CFI變異體與野生型CFI，將包含三重、四重或五重胺基酸突變之CFI變異體稀釋至75 pM (在添加抗體主混合物之後的反應中稀釋至25 pM)。在與C3b/CFH主混合物一起培育30分鐘且與抗體主混合物一起培育30分鐘之後，計算各CFI變異體及野生型CFI之HTRF比率。將各CFI變異體之HTRF比率除以野生型CFI之HTRF比率，以便獲得各CFI變異體之活性相對於野生型CFI的倍數變化。
大量CFI變異體顯示與野生型CFI相比類似或增加之iC3b形成(參見圖7A及圖7B，其顯示此等變異體之子集)。圖7A及圖7B中之「100% iC3b」為顯示在不存在任何CFI之情況下對於3 nM iC3b所達成之HTRF比率(繪製為相對於野生型CFI之HTRF比率的倍數變化)的對照。因此，除了不存在任何CFI及C3b之外，iC3b係以與CFI變異體及野生型CFI相同之方式培育，添加抗體主混合物之後的iC3b之濃度為3 nM。
本發明之態樣
1. 一種包含一或多個突變的經修飾之補體因子I (CFI)多肽，其中該一或多個突變提供較高CFI活性。
2. 一種包含一或多個突變的經修飾之CFI多肽，其中該一或多個突變包含在對應於選自由以下組成之群的位置的位置處之突變：SEQ ID NO: 1之53、60、383、384、400、401、407、408、409、439、440、441、479及482。
3. 如態樣1或2之經修飾之CFI多肽，其中該一或多個突變包含：
(i) 該經修飾之CFI多肽內可與C3b形成界面之一或多個位置處的突變；及/或
(ii) 該經修飾之CFI多肽內可與因子H形成界面之一或多個位置處的突變。
4. 如前述態樣中任一者之經修飾之CFI多肽，其中該一或多個突變包含在該經修飾之CFI多肽內可與C3b形成界面之一或多個或兩個或更多個位置處的突變。
5. 如前述態樣中任一者之經修飾之CFI多肽，其中該一或多個突變包含在該經修飾之CFI多肽內可與因子H形成界面的一或多個、兩個或更多個、三個或更多個、四個或更多個或五個或更多個位置處的突變。
6. 如前述態樣中任一者之經修飾之CFI多肽，其中該一或多個突變包含：
(i) 該經修飾之CFI多肽內可與C3b形成界面之一或多個位置處的突變；及
(ii) 該經修飾之CFI多肽內可與因子H形成界面之一或多個位置處的突變。
7. 如態樣4或6之經修飾之CFI多肽，其中該經修飾之CFI多肽內可與C3b形成界面之位置中之至少一者處於SP域中。
8. 如態樣4及6至7中之任一者之經修飾之CFI多肽，其中該經修飾之CFI多肽內可與C3b形成界面之位置中之至少一者處於FIM域中。
9. 如態樣4及6至8中之任一者之經修飾之CFI多肽，其中與C3b之界面係與C3bα鏈之界面。
10. 如態樣4及6至9中之任一者之經修飾之CFI多肽，其中與C3b之界面係與C3bα鏈中之CUB域之界面。
11. 如態樣4及6至10中任一者之經修飾之CFI多肽，其中與C3b之界面係與C3bα鏈中之CUB域內之受質環之界面。
12. 如態樣4及6至9中之任一者之經修飾之CFI多肽，其中與C3b之界面係與C3bα鏈中之CTC域之界面。
13. 如態樣4及6至8中之任一者之經修飾之CFI多肽，其中與C3b之界面係與C3bβ鏈之界面。
14. 如態樣5或6之經修飾之CFI多肽，其中該經修飾之CFI多肽內可與因子H形成界面的位置中之至少一者處於SP域中。
15. 如態樣5、6或14之經修飾之CFI多肽，其中與因子H之界面係與因子H中之CCP2域之界面。
16. 如態樣5及14至15中之任一者之經修飾之CFI多肽，其中與因子H之界面係與因子H中之CCP3域之界面。
17. 如前述態樣中任一者之經修飾之CFI多肽，其中該一或多個突變包含在對應於選自由以下組成之群的位置的一或多個、兩個或更多個、三個或更多個、四個或更多個或五個或更多個位置處之突變：SEQ ID NO: 1之53、60、383、384、400、401、407、408、409、439、440、441、479及482。
18. 如前述態樣中任一者之經修飾之CFI多肽，其中該一或多個突變包含在對應於選自由以下組成之群的位置的一或多個、兩個或更多個、三個或更多個、四個或更多個或五個或更多個位置處之突變：SEQ ID NO: 1之53、60、383、384、401、407、408、409、439、441、479及482。
19. 如前述態樣中任一者之經修飾之CFI多肽，其中該一或多個突變包含在對應於選自由以下組成之群的位置的一或多個、兩個或更多個、三個或更多個、四個或更多個或五個或更多個位置處之突變：SEQ ID NO: 1之53、383、401、408、409、439、441、479及482。
20. 如前述態樣中任一者之經修飾之CFI多肽，其中該一或多個突變包含在對應於選自由以下組成之群的位置的一或多個或兩個或更多個位置處之突變：SEQ ID NO: 1之53、383、401、409、439、441及479。
21. 如前述態樣中任一者之經修飾之CFI多肽，其中該一或多個突變包含在對應於選自由以下組成之群的位置的兩個或更多個位置處之突變：SEQ ID NO: 1之53、383、401、409、439及479。
22. 如前述態樣中任一者之經修飾之CFI多肽，其中該一或多個突變包含突變為更具疏水性的胺基酸。
23. 如前述態樣中之任一者之經修飾之CFI多肽，其中該一或多個突變包含對應於SEQ ID NO: 1之位置53的位置處之突變。
24. 如態樣23之經修飾之CFI多肽，其中在對應於SEQ ID NO: 1之位置53的位置處之突變為經異白胺酸、白胺酸、酪胺酸或麩胺酸取代。
25. 如態樣23之經修飾之CFI多肽，其中在對應於SEQ ID NO: 1之位置53的位置處之突變為經異白胺酸取代，視情況為R53I。
26. 如態樣23之經修飾之CFI多肽，其中在對應於SEQ ID NO: 1之位置53的位置處之突變為經白胺酸取代，視情況為R53L。
27. 如態樣23之經修飾之CFI多肽，其中在對應於SEQ ID NO: 1之位置53的位置處之突變為經酪胺酸，視情況R53Y之取代。
28. 如前述態樣中之任一者之經修飾之CFI多肽，其中該一或多個突變包含對應於SEQ ID NO: 1之位置60的位置處之突變。
29. 如態樣28之經修飾之CFI多肽，其中對應於SEQ ID NO: 1之位置60的位置處之突變為經絲胺酸或麩胺酸取代。
30. 如前述態樣中之任一者之經修飾之CFI多肽，其中該一或多個突變包含對應於SEQ ID NO: 1之位置383的位置處之突變。
31. 如態樣30之經修飾之CFI多肽，其中對應於SEQ ID NO: 1之位置383的位置處之突變為經異白胺酸、白胺酸、酪胺酸、麩胺酸或苯丙胺酸取代。
32. 如態樣30之經修飾之CFI多肽，其中對應於SEQ ID NO: 1之位置383的位置處之突變為經異白胺酸取代，視情況為R383I。
33. 如態樣30之經修飾之CFI多肽，其中對應於SEQ ID NO: 1之位置383的位置處之突變為經白胺酸，視情況R383L取代。
34. 如態樣30之經修飾之CFI多肽，其中對應於SEQ ID NO: 1之位置383的位置處之突變為經酪胺酸取代，視情況為R383Y。
35. 如態樣30之經修飾之CFI多肽，其中對應於SEQ ID NO: 1之位置383的位置處之突變為經麩胺酸取代，視情況為R383E。
36. 如態樣30之經修飾之CFI多肽，其中對應於SEQ ID NO: 1之位置383的位置處之突變為經苯丙胺酸取代，視情況為R383F。
37. 如前述態樣中之任一者之經修飾之CFI多肽，其中該一或多個突變包含對應於SEQ ID NO: 1之位置384的位置處之突變。
38. 如態樣37之經修飾之CFI多肽，其中對應於SEQ ID NO: 1之位置384的位置處之突變為經異白胺酸、色胺酸、酪胺酸或苯丙胺酸取代。
39. 如前述態樣中之任一者之經修飾之CFI多肽，其中該一或多個突變包含對應於SEQ ID NO: 1之位置400的位置處之突變。
40. 如態樣39之經修飾之CFI多肽，其中對應於SEQ ID NO: 1之位置400的位置處之突變為經色胺酸、酪胺酸或精胺酸取代。
41. 如前述態樣中之任一者之經修飾之CFI多肽，其中該一或多個突變包含對應於SEQ ID NO: 1之位置401的位置處之突變。
42. 如態樣41之經修飾之CFI多肽，其中對應於SEQ ID NO: 1之位置401的位置處之突變為經甘胺酸、酪胺酸、苯丙胺酸或色胺酸取代。
43. 如態樣41之經修飾之CFI多肽，其中對應於SEQ ID NO: 1之位置401的位置處之突變為經甘胺酸，視情況H401G取代。
44. 如態樣41之經修飾之CFI多肽，其中對應於SEQ ID NO: 1之位置401的位置處之突變為經酪胺酸取代，視情況為H401Y。
45. 如態樣41之經修飾之CFI多肽，其中對應於SEQ ID NO: 1之位置401的位置處之突變為經苯丙胺酸，視情況H401F取代。
46. 如態樣41之經修飾之CFI多肽，其中對應於SEQ ID NO: 1之位置401的位置處之突變為經色胺酸，視情況H401W取代。
47. 如前述態樣中之任一者之經修飾之CFI多肽，其中該一或多個突變包含對應於SEQ ID NO: 1之位置407的位置處之突變。
48. 如態樣47之經修飾之CFI多肽，其中對應於SEQ ID NO: 1之位置407的位置處之突變為經苯丙胺酸，視情況I407F之取代。
49. 如前述態樣中之任一者之經修飾之CFI多肽，其中該一或多個突變包含對應於SEQ ID NO: 1之位置408的位置處之突變。
50. 如態樣49之經修飾之CFI多肽，其中對應於SEQ ID NO: 1之位置408的位置處之突變為經蘇胺酸或酪胺酸取代。
51. 如前述態樣中之任一者之經修飾之CFI多肽，其中該一或多個突變包含對應於SEQ ID NO: 1之位置409的位置處之突變。
52. 如態樣51之經修飾之CFI多肽，其中對應於SEQ ID NO: 1之位置409的位置處之突變為經苯丙胺酸、色胺酸或麩胺酸取代。
53. 如態樣51之經修飾之CFI多肽，其中對應於SEQ ID NO: 1之位置409的位置處之突變為經苯丙胺酸取代，視情況為I409F。
54. 如態樣51之經修飾之CFI多肽，其中對應於SEQ ID NO: 1之位置409的位置處之突變為經色胺酸，視情況I409W取代。
55. 如態樣51之經修飾之CFI多肽，其中對應於SEQ ID NO: 1之位置409的位置處之突變為經麩胺酸，視情況I409E取代。
56. 如前述態樣中之任一者之經修飾之CFI多肽，其中該一或多個突變包含對應於SEQ ID NO: 1之位置439的位置處之突變。
57. 如態樣56之經修飾之CFI多肽，其中對應於SEQ ID NO: 1之位置439的位置處之突變為經白胺酸、麩胺酸或麩醯胺酸取代。
58. 如態樣56之經修飾之CFI多肽，其中對應於SEQ ID NO: 1之位置439的位置處之突變為經麩胺酸取代，視情況為G439E。
59. 如前述態樣中之任一者之經修飾之CFI多肽，其中該一或多個突變包含對應於SEQ ID NO: 1之位置440的位置處之突變。
60. 如態樣59之經修飾之CFI多肽，其中對應於SEQ ID NO: 1之位置440的位置處之突變為經蘇胺酸，視情況N440T取代。
61. 如前述態樣中之任一者之經修飾之CFI多肽，其中該一或多個突變包含對應於SEQ ID NO: 1之位置441的位置處之突變。
62. 如態樣61之經修飾之CFI多肽，其中對應於SEQ ID NO: 1之位置441的位置處之突變為經麩胺酸、苯丙胺酸或酪胺酸取代。
63. 如態樣61之經修飾之CFI多肽，其中對應於SEQ ID NO: 1之位置441的位置處之突變為經麩胺酸，視情況K441E取代。
64. 如態樣61之經修飾之CFI多肽，其中對應於SEQ ID NO: 1之位置441的位置處之突變為經苯丙胺酸取代，視情況為K441F。
65. 如態樣61之經修飾之CFI多肽，其中對應於SEQ ID NO: 1之位置441的位置處之突變為經酪胺酸取代，視情況為K441Y。
66. 如前述態樣中之任一者之經修飾之CFI多肽，其中該一或多個突變包含對應於SEQ ID NO: 1之位置479的位置處之突變。
67. 如態樣66之經修飾之CFI多肽，其中對應於SEQ ID NO: 1之位置479的位置處之突變為經天冬胺酸取代，視情況為E479D。
68. 如前述態樣中之任一者之經修飾之CFI多肽，其中該一或多個突變包含對應於SEQ ID NO: 1之位置482的位置處之突變。
69. 如態樣68之經修飾之CFI多肽，其中在對應於SEQ ID NO: 1之位置482的位置處之突變為經色胺酸、白胺酸、組胺酸、異白胺酸、麩醯胺酸、精胺酸或蘇胺酸取代。
70. 如態樣68之經修飾之CFI多肽，其中對應於SEQ ID NO: 1之位置482的位置處之突變為經色胺酸取代。
71. 如態樣68之經修飾之CFI多肽，其中對應於SEQ ID NO: 1之位置482的位置處之突變為經麩醯胺酸取代。
72. 如態樣68之經修飾之CFI多肽，其中在對應於SEQ ID NO: 1之位置482的位置處之突變為經精胺酸取代。
73. 如態樣68之經修飾之CFI多肽，其中在對應於SEQ ID NO: 1之位置482的位置處之突變為經蘇胺酸之取代。
74. 如前述態樣中任一者之經修飾之CFI多肽，其中該一或多個突變包含：
(i) 在對應於SEQ ID NO: 1之位置53的位置處之突變；及
(ii) 在對應於SEQ ID NO: 1之位置383的位置處之突變。
75. 如態樣74之經修飾之CFI多肽，其中：
(i) 在對應於SEQ ID NO: 1之位置53的位置處之突變為經異白胺酸取代，視情況為R53I；及
(ii) 在對應於SEQ ID NO: 1之位置383的位置處之突變為經麩胺酸取代，視情況為R383E。
76. 如態樣74之經修飾之CFI多肽，其中：
(i) 在對應於SEQ ID NO: 1之位置53的位置處之突變為經白胺酸取代，視情況為R53L；及
(ii) 在對應於SEQ ID NO: 1之位置383的位置處之突變為經麩胺酸、異白胺酸或酪胺酸取代。
77. 如態樣76之經修飾之CFI多肽，其中：
(i) 在對應於SEQ ID NO: 1之位置53的位置處之突變為經白胺酸取代，視情況為R53L；及
(ii) 在對應於SEQ ID NO: 1之位置383的位置處之突變為經麩胺酸取代，視情況為R383E。
78. 如態樣76之經修飾之CFI多肽，其中：
(i) 在對應於SEQ ID NO: 1之位置53的位置處之突變為經白胺酸取代，視情況為R53L；及
(ii) 在對應於SEQ ID NO: 1之位置383的位置處之突變為經異白胺酸取代，視情況為R383I。
79. 如態樣76之經修飾之CFI多肽，其中：
(i) 在對應於SEQ ID NO: 1之位置53的位置處之突變為經白胺酸取代，視情況為R53L；及
(ii) 在對應於SEQ ID NO: 1之位置383的位置處之突變為經酪胺酸取代，視情況為R383Y。
80. 如前述態樣中任一者之經修飾之CFI多肽，其中該一或多個突變包含：
(i) 在對應於SEQ ID NO: 1之位置53的位置處之突變；及
(ii) 在對應於SEQ ID NO: 1之位置401的位置處之突變。
81. 如態樣80之經修飾之CFI多肽，其中：
(i) 在對應於SEQ ID NO: 1之位置53的位置處之突變為經白胺酸取代，視情況為R53L；及
(ii) 在對應於SEQ ID NO: 1之位置401的位置處之突變為經酪胺酸取代，視情況為H401Y。
82. 如前述態樣中任一者之經修飾之CFI多肽，其中該一或多個突變包含：
(i) 在對應於SEQ ID NO: 1之位置53的位置處之突變；及
(ii) 在對應於SEQ ID NO: 1之位置409的位置處之突變。
83. 如態樣82之經修飾之CFI多肽，其中：
(i) 在對應於SEQ ID NO: 1之位置53的位置處之突變為經白胺酸取代，視情況為R53L；及
(ii) 在對應於SEQ ID NO: 1之位置409的位置處之突變為經苯丙胺酸取代，視情況為I409F。
84. 如前述態樣中任一者之經修飾之CFI多肽，其中該一或多個突變包含：
(i) 在對應於SEQ ID NO: 1之位置53的位置處之突變；及
(ii) 在對應於SEQ ID NO: 1之位置479的位置處之突變。
85. 如態樣84之經修飾之CFI多肽，其中：
(i) 在對應於SEQ ID NO: 1之位置53的位置處之突變為經白胺酸取代，視情況為R53L；及
(ii) 在對應於SEQ ID NO: 1之位置479的位置處之突變為經天冬胺酸取代，視情況為E479D。
86. 如態樣74之經修飾之CFI多肽，其中：
(i) 在對應於SEQ ID NO: 1之位置53的位置處之突變為經酪胺酸取代，視情況為R53Y；及
(ii) 在對應於SEQ ID NO: 1之位置383的位置處之突變為經酪胺酸取代，視情況為R383Y。
87. 如態樣80之經修飾之CFI多肽，其中：
(i) 在對應於SEQ ID NO: 1之位置53的位置處之突變為經酪胺酸取代，視情況為R53Y；及
(ii) 在對應於SEQ ID NO: 1之位置401的位置處之突變為經酪胺酸取代，視情況為H401Y。
88. 如態樣82之經修飾之CFI多肽，其中：
(i) 在對應於SEQ ID NO: 1之位置53的位置處之突變為經酪胺酸取代，視情況為R53Y；及
(ii) 在對應於SEQ ID NO: 1之位置409的位置處之突變為經苯丙胺酸取代，視情況為I409F。
89. 如前述態樣中任一者之經修飾之CFI多肽，其中該一或多個突變包含：
(i) 在對應於SEQ ID NO: 1之位置383的位置處之突變；及
(ii) 在對應於SEQ ID NO: 1之位置401的位置處之突變。
90. 如態樣89之經修飾之CFI多肽，其中：
(i) 在對應於SEQ ID NO: 1之位置383的位置處之突變為經苯丙胺酸取代，視情況為R383F；及
(ii) 在對應於SEQ ID NO: 1之位置401的位置處之突變為經酪胺酸取代，視情況為H401Y。
91. 如前述態樣中任一者之經修飾之CFI多肽，其中該一或多個突變包含：
(i) 在對應於SEQ ID NO: 1之位置383的位置處之突變；及
(ii) 在對應於SEQ ID NO: 1之位置409的位置處之突變。
92. 如態樣91之經修飾之CFI多肽，其中：
(i) 在對應於SEQ ID NO: 1之位置383的位置處之突變為經苯丙胺酸取代，視情況為R383F；及
(ii) 在對應於SEQ ID NO: 1之位置409的位置處之突變為經苯丙胺酸取代，視情況為I409F。
93. 如前述態樣中任一者之經修飾之CFI多肽，其中該一或多個突變包含：
(i) 在對應於SEQ ID NO: 1之位置383的位置處之突變；及
(ii) 在對應於SEQ ID NO: 1之位置439的位置處之突變。
94. 如態樣93之經修飾之CFI多肽，其中：
(i) 在對應於SEQ ID NO: 1之位置383的位置處之突變為經苯丙胺酸取代，視情況為R383F；及
(ii) 在對應於SEQ ID NO: 1之位置439的位置處之突變為經麩胺酸取代，視情況為G439E。
95. 如前述態樣中任一者之經修飾之CFI多肽，其中該一或多個突變不包含在對應於SEQ ID NO: 1之位置138的位置處之甲硫胺酸至纈胺酸突變。
96. 如前述態樣中之任一者之經修飾之CFI多肽，其中該一或多個突變不包含對應於SEQ ID NO: 1之位置380的位置處之突變。
97. 如前述態樣中之任一者之經修飾之CFI多肽，其中該一或多個突變不包含在對應於SEQ ID NO: 1之位置429的位置處之突變。
98. 如前述態樣中之任一者之經修飾之CFI多肽，其中該一或多個突變不包含對應於SEQ ID NO: 1之位置525的位置處之突變，視情況其中該一或多個突變不包含對應於SEQ ID NO: 1之位置525的位置處之絲胺酸至丙胺酸突變。
99. 如前述態樣中之任一者之經修飾之CFI多肽，其中該經修飾之CFI多肽相對於參考CFI多肽具有較高CFI活性。
100. 如態樣99之經修飾之CFI多肽，其中該參考CFI多肽為野生型CFI多肽，視情況其中該參考CFI多肽為SEQ ID NO: 1之多肽。
101. 如態樣99之經修飾之CFI多肽，其中該參考CFI多肽為野生型CFI多肽，視情況其中該參考CFI多肽為SEQ ID NO: 2之多肽。
102. 如態樣99至101中任一者之經修飾之CFI多肽，其中該CFI活性比該參考CFI多肽之CFI活性高至少1.2倍、至少1.5倍、至少2倍、至少2.5倍、至少3倍、至少3.5倍、至少4倍、至少4.5倍、至少5倍、至少5.5倍、至少6倍、至少6.5倍、至少7倍、至少7.5倍、至少8倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、在1.2倍與3倍之間、在1.2倍與5倍之間、在2倍與6倍之間、在3倍與8倍之間、在1.5倍與8倍之間、在2倍與8倍之間、在5倍與8倍之間、在6倍與8倍之間、在7倍與8倍之間、在2倍與15倍之間、在3倍與20倍之間、在5倍與10倍之間、在5倍與15倍、在5倍與20倍之間。
103. 如態樣1或3至102中任一者之經修飾之CFI多肽，其中該CFI活性為iC3b形成活性。
104. 如態樣1或3至103中任一者之經修飾之CFI多肽，其中使用均相時差式螢光(HTRF)分析測定該CFI活性。
105. 如態樣1或3至104中任一者之經修飾之CFI多肽，其在pH 7下與C3b及CFH一起培育1小時，隨後與抗iC3b IgG及抗C3b IgG一起培育1小時之後，量測該CFI活性。
106. 如態樣1或3至105中任一者之經修飾之CFI多肽，其中在pH 7下與C3b及CFH一起培育30分鐘，隨後與抗iC3b IgG及抗C3b IgG一起培育30分鐘之後，量測該CFI活性。
107. 如態樣105或106之經修飾之CFI多肽，其中該抗iC3b IgG為抗iC3b (Tb) IgG且該抗C3b IgG為抗C3b (FITC) IgG。
108. 如態樣1、3至104、106或107中任一者之經修飾之CFI多肽，其中該至少一個突變包含：
(i) 在對應於SEQ ID NO: 1之位置53的位置處之突變且為經白胺酸取代，視情況為R53L；及
(ii) 在對應於SEQ ID NO: 1之位置383的位置處之突變且為經酪胺酸取代，視情況為R383Y，
且其中當在pH 7下與C3b及CFH一起培育30分鐘，隨後與抗iC3b (Tb) IgG及抗C3b (FITC) IgG一起培育30分鐘之後量測時，該經修飾之CFI多肽的CFI活性比參考CFI多肽高至少5倍，視情況其中該參考CFI多肽為野生型CFI多肽。
109. 如前述態樣中任一者之經修飾之CFI多肽，其中：
(i) 該經修飾之CFI多肽包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2之至少200個、至少250個、至少300個、至少400個、至少500個、在400與565個之間、在500與565個之間、在520與565個之間的胺基酸、在400與583個之間的胺基酸、在500與583個之間的胺基酸或在520與583個之間的胺基酸之片段具有至少80%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致性的胺基酸序列；或
(ii) 該經修飾之CFI多肽包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2具有至少80%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致性之胺基酸序列；或
(iii) 該經修飾之CFI多肽包含與SEQ ID NO: 1之500與583個之間的胺基酸的片段具有至少98%一致性的胺基酸序列；或
(iv) 該經修飾之CFI多肽包含與SEQ ID NO: 2之500與565個之間的胺基酸的片段具有至少98%一致性的胺基酸序列；或
(v) 該經修飾之CFI多肽包含與SEQ ID NO: 1具有至少98%一致性之胺基酸序列；或
(vi) 該經修飾之CFI多肽包含與SEQ ID NO: 2具有至少98%一致性之胺基酸序列；或
(vii) 除了該經修飾之CFI多肽包含在前述態樣中任一者中所定義的一或多個突變之外，該經修飾之CFI多肽包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2一致之胺基酸序列；或
(viii) 除了該經修飾之CFI多肽包含在對應於SEQ ID NO: 1之位置53的位置處之突變之外，該經修飾之CFI多肽包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2一致之胺基酸序列；或
(ix) 除了該經修飾之CFI多肽包含在對應於SEQ ID NO: 1之位置383的位置處之突變之外，該經修飾之CFI多肽包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2一致之胺基酸序列；或
(x) 除了該經修飾之CFI多肽包含在對應於SEQ ID NO: 1之位置401的位置處之突變之外，該經修飾之CFI多肽包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2一致之胺基酸序列；或
(xi) 除了該經修飾之CFI多肽包含在對應於SEQ ID NO: 1之位置409的位置處之突變之外，該經修飾之CFI多肽包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2一致之胺基酸序列；或
(xii) 除了該經修飾之CFI多肽包含在對應於SEQ ID NO: 1之位置439的位置處之突變之外，該經修飾之CFI多肽包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2一致之胺基酸序列；或
(xiii) 除了該經修飾之CFI多肽包含在對應於SEQ ID NO: 1之位置441的位置處之突變之外，該經修飾之CFI多肽包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2一致之胺基酸序列；或
(xiv) 除了該經修飾之CFI多肽包含在對應於SEQ ID NO: 1之位置479的位置處之突變之外，該經修飾之CFI多肽包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2一致之胺基酸序列；或
(xv) 除了該經修飾之CFI多肽包含在對應於SEQ ID NO: 1之位置53的位置處之突變及在對應於SEQ ID NO: 1之位置383的位置處之突變之外，該經修飾之CFI多肽包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2一致之胺基酸序列；或
(xvi) 除了該經修飾之CFI多肽包含在對應於SEQ ID NO: 1之位置53的位置處之突變及在對應於SEQ ID NO: 1之位置401的位置處之突變之外，該經修飾之CFI多肽包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2一致之胺基酸序列；或
(xvii) 除了該經修飾之CFI多肽包含在對應於SEQ ID NO: 1之位置53的位置處之突變及在對應於SEQ ID NO: 1之位置409的位置處之突變之外，該經修飾之CFI多肽包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2一致之胺基酸序列；或
(xviii) 除了該經修飾之CFI多肽包含在對應於SEQ ID NO: 1之位置53的位置處之突變及在對應於SEQ ID NO: 1之位置479的位置處之突變之外，該經修飾之CFI多肽包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2一致之胺基酸序列；或
(xix) 除了該經修飾之CFI多肽包含在對應於SEQ ID NO: 1之位置383的位置處之突變及在對應於SEQ ID NO: 1之位置401的位置處之突變之外，該經修飾之CFI多肽包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2一致之胺基酸序列；或
(xx) 除了該經修飾之CFI多肽包含在對應於SEQ ID NO: 1之位置383的位置處之突變及在對應於SEQ ID NO: 1之位置409的位置處之突變之外，該經修飾之CFI多肽包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2一致之胺基酸序列；或
(xxi) 除了該經修飾之CFI多肽包含在對應於SEQ ID NO: 1之位置383的位置處之突變及在對應於SEQ ID NO: 1之位置439的位置處之突變之外，該經修飾之CFI多肽包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2一致之胺基酸序列；或
(xxii) 除了該經修飾之CFI多肽包含在對應於SEQ ID NO: 1之位置53的位置處經異白胺酸之取代及在對應於SEQ ID NO: 1之位置383的位置處經麩胺酸之取代之外，該經修飾之CFI多肽包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2一致之胺基酸序列；或
(xxiii) 除了該經修飾之CFI多肽包含在對應於SEQ ID NO: 1之位置53的位置處經白胺酸之取代及在對應於SEQ ID NO: 1之位置383的位置處經麩胺酸之取代之外，該經修飾之CFI多肽包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2一致之胺基酸序列；或
(xxiv) 除了該經修飾之CFI多肽包含在對應於SEQ ID NO: 1之位置53的位置處經白胺酸之取代及在對應於SEQ ID NO: 1之位置383的位置處經異白胺酸之取代之外，該經修飾之CFI多肽包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2一致之胺基酸序列；或
(xxv) 除了該經修飾之CFI多肽包含在對應於SEQ ID NO: 1之位置53的位置處經白胺酸之取代及在對應於SEQ ID NO: 1之位置383的位置處經酪胺酸之取代之外，該經修飾之CFI多肽包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2一致之胺基酸序列；或
(xxvi) 除了該經修飾之CFI多肽包含在對應於SEQ ID NO: 1之位置53的位置處經白胺酸之取代及在對應於SEQ ID NO: 1之位置409的位置處經苯丙胺酸之取代之外，該經修飾之CFI多肽包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2一致之胺基酸序列；或
(xxvii) 除了該經修飾之CFI多肽包含在對應於SEQ ID NO: 1之位置53的位置處經白胺酸之取代及在對應於SEQ ID NO: 1之位置401的位置處經酪胺酸之取代之外，該經修飾之CFI多肽包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2一致之胺基酸序列；或
(xxviii) 除了該經修飾之CFI多肽包含在對應於SEQ ID NO: 1之位置53的位置處經白胺酸之取代及在對應於SEQ ID NO: 1之位置479的位置處經天冬胺酸之取代之外，該經修飾之CFI多肽包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2一致之胺基酸序列；或
(xxix) 除了該經修飾之CFI多肽包含在對應於SEQ ID NO: 1之位置53的位置處經酪胺酸之取代及在對應於SEQ ID NO: 1之位置383的位置處經酪胺酸之取代之外，該經修飾之CFI多肽包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2一致之胺基酸序列；或
(xxx) 除了該經修飾之CFI多肽包含在對應於SEQ ID NO: 1之位置53的位置處經酪胺酸之取代及在對應於SEQ ID NO: 1之位置401的位置處經酪胺酸之取代之外，該經修飾之CFI多肽包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2一致之胺基酸序列；或
(xxxi) 除了該經修飾之CFI多肽包含在對應於SEQ ID NO: 1之位置53的位置處經酪胺酸之取代及在對應於SEQ ID NO: 1之位置409的位置處經苯丙胺酸之取代之外，該經修飾之CFI多肽包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2一致之胺基酸序列；或
(xxxii) 除了該經修飾之CFI多肽包含在對應於SEQ ID NO: 1之位置383的位置處經苯丙胺酸之取代及在對應於SEQ ID NO: 1之位置409的位置處經苯丙胺酸之取代之外，該經修飾之CFI多肽包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2一致之胺基酸序列；或
(xxxiii) 除了該經修飾之CFI多肽包含在對應於SEQ ID NO: 1之位置383的位置處經苯丙胺酸之取代及在對應於SEQ ID NO: 1之位置439的位置處經麩胺酸之取代之外，該經修飾之CFI多肽包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2一致之胺基酸序列；或
(xxxiv) 除了該經修飾之CFI多肽包含在對應於SEQ ID NO: 1之位置383的位置處經苯丙胺酸之取代及在對應於SEQ ID NO: 1之位置401的位置處經酪胺酸之取代之外，該經修飾之CFI多肽包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2一致之胺基酸序列。
110. 如前述態樣中任一者之經修飾之CFI多肽，其中該經修飾之CFI多肽包含信號肽。
111. 如態樣110之經修飾之CFI多肽，其中該信號肽之胺基酸序列為野生型CFI信號肽之胺基酸序列。
112. 如態樣110之經修飾之CFI多肽，其中該信號肽之胺基酸序列為並非野生型CFI信號肽之信號肽的胺基酸序列。
113. 如態樣110或112之經修飾之CFI多肽，其中該信號肽為異源信號肽。
114. 如態樣110、112或113中任一者之經修飾之CFI多肽，其中該信號肽來自另一多肽。
115. 如態樣110、112或113中任一者之經修飾之CFI多肽，其中該信號肽為經修飾之CFI信號肽。
116. 如態樣110、112或113中任一者之經修飾之CFI多肽，其中該信號肽為合成信號肽。
117. 一種包含CFI核苷酸序列之聚核苷酸，其中該CFI核苷酸序列編碼前述態樣中任一者之經修飾之CFI多肽。
118. 如態樣117之聚核苷酸，其中CFI核苷酸序列包含與SEQ ID NO: 16、17、18或19中任一者之至少1200個、至少1400個、至少1500個、1698個或更少個、1752個或更少個、在1200與1698個之間、在1200與1752個之間、在1500與1698個之間、在1500與1752個之間、約1698個或約1752個核苷酸之片段具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.5%或至少99.8%一致性的序列。
119. 如態樣118之聚核苷酸，其中該CFI核苷酸序列包含與SEQ ID NO: 16、17、18或19中任一者之核苷酸序列具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.5%或至少99.8%一致性的序列。
120. 如態樣117至119中任一者之聚核苷酸，其中除了編碼提供較高CFI活性之一或多個突變或包含對應於選自由SEQ ID NO: 1之53、60、383、384、400、401、407、408、409、439、440、441、479及482組成之群的位置的位置處之突變的一或多個突變的密碼子之外，該CFI核苷酸序列包含與SEQ ID NO: 18或19具有100%一致性之序列。
121. 如態樣117至120中任一者之聚核苷酸，其中該CFI核苷酸序列包含與SEQ ID NO: 18或19之至少1500個核苷酸之片段具有至少98%一致性的序列。
122. 如態樣117至121中任一者之聚核苷酸，其中該CFI核苷酸序列包含與SEQ ID NO: 18或19具有至少98%一致性之序列。
123. 如態樣之117聚核苷酸，其中該CFI核苷酸序列包含與SEQ ID NO: 28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51或52中任一者的至少1200個、至少1400個、至少1500個、1698個或更少個、1752個或更少個、在1200與1698個之間、在1200與1752個之間、在1500與1698個之間、在1500與1752個之間、約1698個或約1752個核苷酸之片段具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.5%或至少99.8%一致性的序列；
124. 如態樣123之聚核苷酸，其中該CFI核苷酸序列包含與SEQ ID NO 28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51或52中任一者之核苷酸序列具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.5%或至少99.8%一致性的序列。
125. 如態樣117、123或124中任一者之聚核苷酸，其中除了編碼提供較高CFI活性之一或多個突變或包含對應於選自由SEQ ID NO: 1之53、60、383、384、400、401、407、408、409、439、440、441、479及482組成之群的位置的位置處之突變的一或多個突變的密碼子之外，該CFI核苷酸序列包含與SEQ ID NO: 28、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51或52具有100%一致性之序列；
126. 如態樣117及123至125中任一者之聚核苷酸，其中該CFI核苷酸序列包含與SEQ ID NO: 28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42或43之至少1500個核苷酸之片段具有至少98%一致性的序列。
127. 如態樣117及123至126中任一者之聚核苷酸，其中該CFI核苷酸序列包含與SEQ ID NO: 28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42或43具有至少98%一致性的序列。
128. 如態樣117及123至125中任一者之聚核苷酸，其中該CFI核苷酸序列包含與SEQ ID NO: 44、45、46、47、48、49、50、51或52之至少1500個核苷酸之片段具有至少98%一致性的序列。
129. 如態樣117、123至125及128中任一者之聚核苷酸，其中該CFI核苷酸序列包含與SEQ ID NO: 44、45、46、47、48、49、50、51或52具有至少98%一致性之序列。
130. 如態樣117之聚核苷酸，其中CFI核苷酸序列包含與SEQ ID NO: 4或3中任一者之至少1200個、至少1400個、至少1500個、1698個或更少個、1752個或更少個、在1200與1698個之間、在1200與1752個之間、在1500與1698個之間、在1500與1752個之間、約1698個或約1752個核苷酸之片段具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.5%或至少99.8%一致性的序列。
131. 如態樣130之聚核苷酸，其中該CFI核苷酸序列包含與SEQ ID NO: 4或3中之任一者之核苷酸序列具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.5%或至少99.8%一致性的序列。
132. 如態樣117、130及131中任一者之聚核苷酸，其中除編碼提供較高CFI活性之一或多個突變或包含與選自由SEQ ID NO: 1之53、60、383、384、400、401、407、408、409、439、440、441、479及482組成之群的位置的位置處之突變的一或多個突變的密碼子之外，該CFI核苷酸序列包含與SEQ ID NO: 4或3 100%一致之序列。
133. 如態樣117及130至132中任一者之聚核苷酸，其中該CFI核苷酸序列包含與SEQ ID NO: 4或3之至少1500個核苷酸之片段具有至少98%一致性的序列。
134. 如態樣117及130至133中任一者之聚核苷酸，其中該CFI核苷酸序列包含與SEQ ID NO: 4或3至少98%一致之序列。
135. 如態樣117至129中任一者之聚核苷酸，其中該CFI核苷酸序列之至少一部分經密碼子最佳化。
136. 如態樣117至129及135中任一者之聚核苷酸，其中該CFI核苷酸序列經密碼子最佳化。
137. 如態樣135或136之聚核苷酸，其中該CFI核苷酸序列或該CFI核苷酸序列中經密碼子最佳化之部分經密碼子最佳化以表現於人類肝細胞中。
138. 如態樣135或136之聚核苷酸，其中該CFI核苷酸序列或該CFI核苷酸序列中經密碼子最佳化之部分經密碼子最佳化以表現於人類視網膜細胞或人類腎細胞中。
139. 如態樣135至138中任一者之聚核苷酸，其中該CFI核苷酸序列或該CFI核苷酸序列中經密碼子最佳化之該部分相比於參考CFI核苷酸序列之對應部分包含數目減少的CpG。
140. 如態樣139之聚核苷酸，其中該CFI核苷酸序列或該CFI核苷酸序列中經密碼子最佳化之部分包含40個或更少個、20個或更少個、15個或更少個、10個或更少個、或5個或更少個CpG。
141. 如態樣139或140之聚核苷酸，其中該CFI核苷酸序列包含5個或更少CpG。
142. 如態樣139至141中任一者之聚核苷酸，其中該CFI核苷酸序列或該CFI核苷酸序列中經密碼子最佳化之部分為CpG的。
143. 如態樣139至142中任一者之聚核苷酸，其中該CFI核苷酸序列為無CpG的。
144. 如態樣139至143中任一者之聚核苷酸，其中該參考CFI核苷酸序列為野生型CFI核苷酸序列。
145. 如態樣144之聚核苷酸，其中該野生型CFI核苷酸序列為SEQ ID NO: 3或4之核苷酸序列。
146. 如態樣117至145中任一者之聚核苷酸，其中該CFI核苷酸序列編碼信號肽。
147. 如態樣146之聚核苷酸，其中該信號肽之胺基酸序列為野生型CFI信號肽之胺基酸序列。
148 如態樣146之聚核苷酸，其中該信號肽之胺基酸序列為並非野生型CFI信號肽之信號肽的胺基酸序列。
149. 如態樣146或148之聚核苷酸，其中該信號肽為異源信號肽。
150. 如態樣146、148或149中任一者之聚核苷酸，其中該信號肽來自另一多肽。
151. 如態樣146、148或149中任一者之聚核苷酸，其中該信號肽為經修飾之CFI信號肽。
152. 如態樣146、148或149中任一者之聚核苷酸，其中該信號肽為合成信號肽。
153. 如態樣117至152中任一者之聚核苷酸，其中該聚核苷酸進一步包含轉錄調節元件。
154. 如態樣153之聚核苷酸，其中該轉錄調節元件包含肝特異性啟動子。
155. 如態樣153或154之聚核苷酸，其中該轉錄調節元件與SEQ ID NO: 11、20、21或22至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%、至少99.5%、至少99.8%或100%一致。
156. 如態樣153至155中任一者之聚核苷酸，其中該轉錄調節元件具有SEQ ID NO: 11之序列。
157. 如態樣153至155中任一者之聚核苷酸，其中該轉錄調節元件具有SEQ ID NO: 20之序列。
158. 如態樣153至155中任一者之聚核苷酸，其中該轉錄調節元件具有SEQ ID NO: 21之序列。
159. 如態樣153至155中任一者之聚核苷酸，其中該轉錄調節元件具有SEQ ID NO: 22之序列。
160. 如態樣153之聚核苷酸，其中該轉錄調節元件包含眼部特異性啟動子及/或強化子。
161. 如態樣153之聚核苷酸，其中該轉錄調節元件包含視網膜細胞特異性啟動子及/或強化子。
162. 如態樣153之聚核苷酸，其中該轉錄調節元件包含腎特異性啟動子及/或強化子。
163. 如態樣153之聚核苷酸，其中該轉錄調節元件包含足細胞細胞特異性啟動子及/或強化子。
164. 如態樣153之聚核苷酸，其中該轉錄調節元件為非組織特異性轉錄調節元件。
165. 如態樣117至164中任一者之聚核苷酸，其中該聚核苷酸包含土撥鼠肝炎轉錄後調節元件(WPRE)。
166. 如態樣117至165中任一者之聚核苷酸，其中該聚核苷酸包含與SEQ ID NO: 23至25中之任一者至少98%、至少99%、至少99.5%、至少99.8%或100%一致之土撥鼠肝炎轉錄後調節元件(WPRE)。
167. 如態樣117至166中任一者之聚核苷酸，其中該聚核苷酸包含與SEQ ID NO: 23至25中之任一者至少98%一致之土撥鼠肝炎轉錄後調節元件(WPRE)。
168. 如態樣117至167中任一者之聚核苷酸，其中該聚核苷酸包含SEQ ID NO: 23至25中之任一者之土撥鼠肝炎轉錄後調節元件(WPRE)。
169. 如態樣117至168中任一者之聚核苷酸，其中該聚核苷酸進一步包含一或兩個ITR。
170. 如態樣169之聚核苷酸，其中該或各ITR為野生型ITR。
171. 如態樣169或170之聚核苷酸，其中該或各ITR為AAV2 ITR。
172. 如態樣169至171中任一者之聚核苷酸，其中該或各ITR之核苷酸序列包含SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 13之核苷酸序列。
173. 如態樣117至172中任一者之聚核苷酸，其中該聚核苷酸進一步包含polyA核苷酸序列。
174. 如態樣173之聚核苷酸，其中該polyA核苷酸序列包含SEQ ID NO: 14之核苷酸序列。
175. 如態樣117至174中任一者之聚核苷酸，其中該聚核苷酸進一步包含內含子。
176. 如態樣117之聚核苷酸，其中該CFI核苷酸序列為來自WO2020/086735之SEQ ID NO: 1、2、3或5中之任一者或來自WO2017/072515之SEQ ID NO: 8的核苷酸序列，不同之處在於其包含核苷酸取代使得該經編碼之CFI多肽包含提供較高CFI活性的一或多個突變或包含在對應於選自由SEQ ID NO: 1之53、60、383、384、400、401、407、408、409、439、440、441、479及482組成之群的位置的位置處之突變的一或多個突變。
177. 如態樣117或176之聚核苷酸，其中該CFI核苷酸序列為來自WO2020/086735之SEQ ID NO: 1、2、3或5中之任一者或來自WO2017/072515之SEQ ID NO: 8的核苷酸序列，不同之處在於其包含核苷酸取代以使得該經編碼之CFI多肽在對應於選自由SEQ ID NO: 1之53、60、383、384、400、401、407、408、409、439、440、441、479及482組成之群的位置之位置處具有一或多個、兩個或更多個、三個或更多個、四個或更多個或五個或更多個胺基酸取代。
178. 如態樣117之聚核苷酸，其中該CFI核苷酸序列為來自WO2020/128516之SEQ ID NO: 18至26中之任一者的核苷酸序列，不同之處在於其包含核苷酸取代使得該經編碼之CFI多肽包含提供較高CFI活性的一或多個突變或包含在對應於選自由SEQ ID NO: 1之53、60、383、384、400、401、407、408、409、439、440、441、479及482組成之群的位置的位置處之突變的一或多個突變。
179. 如態樣117或178之聚核苷酸，其中該CFI核苷酸序列為來自WO2020/128516之SEQ ID NO: 18至26中之任一者的核苷酸序列，不同之處在於其包含核苷酸取代以使得該經編碼之CFI多肽在對應於選自由SEQ ID NO: 1之53、60、383、384、400、401、407、408、409、439、440、441、479及482組成之群的位置之位置處具有一或多個、兩個或更多個、三個或更多個、四個或更多個或五個或更多個胺基酸取代。
180. 如態樣176至179中任一者之聚核苷酸，其中該經編碼之CFI多肽具有(i)在對應於SEQ ID NO: 1之位置53的位置處經白胺酸取代，視情況為R53L；及(ii)在對應於SEQ ID NO: 1之位置383的位置處經酪胺酸取代，視情況為R383Y。
181. 一種包含重組基因體之病毒粒子，其包含如態樣117至180中任一者之聚核苷酸。
182. 如態樣181之病毒粒子，其為AAV、腺病毒或慢病毒病毒粒子。
183. 如態樣182之病毒粒子，其為AAV病毒粒子。
184. 如態樣181至183中任一者之病毒粒子，其中該病毒粒子包含衣殼。
185. 如態樣184之病毒粒子，其中該病毒粒子包含嗜肝性衣殼。
186. 如態樣185之病毒粒子，其中該嗜肝性衣殼包含與SEQ ID NO: 7至10中任一者的至少600個、至少650個、至少700個、在600與734個之間、在600與736個之間、在650與734個之間、在650與736個之間、在700與734個之間、在700與736個之間、約734個或約736個胺基酸之片段具有至少98%、至少99%、至少99.5%或100%一致性的序列。
187. 如態樣185或186之病毒粒子，其中該嗜肝性衣殼包含與SEQ ID NO: 7至10中之任一者至少99%或100%一致之序列。
188. 如態樣184之病毒粒子，其中該衣殼包含與SEQ ID NO: 26或27至少99%或100%一致之序列。
189. 如態樣184之病毒粒子，其中該衣殼包含與SEQ ID NO: 7至10中任一者之至少600個、至少650個、至少700個、在600與734個之間、在600與736個之間、在650與734個之間、在650與736個之間、在700與734個之間、在700與736個之間、約734個或約736個胺基酸的片段具有至少98%、至少99%、至少99.5%或100%一致性的序列。
190. 如態樣184或189之病毒粒子，其中該衣殼包含與SEQ ID NO: 7至10中任一者具有至少99%或100%一致性之序列。
191. 如態樣184之病毒粒子，其中該病毒粒子包含嗜腎性衣殼。
192. 如態樣181至191中任一者之病毒粒子，其中該重組基因體為單股的。
193. 如態樣181至192中任一者之病毒粒子，其中該病毒粒子進一步包含：
a) AAV2 ITR；
b) polyA序列；及/或
c)內含子。
194. 一種組合物，其包含如前述態樣中任一者之經修飾之CFI多肽、聚核苷酸或病毒粒子及醫藥學上可接受之賦形劑。
195. 如態樣1至116中任一者之經修飾之CFI多肽、如態樣117至180中任一者之聚核苷酸、如態樣181至193中任一者之病毒粒子或如態樣194之組合物，其用於治療方法中。
196. 一種治療方法，其包含投與有效量之如態樣1至116中任一者之經修飾之CFI多肽、如態樣117至180中任一者之聚核苷酸、如態樣181至193中任一者之病毒粒子或如態樣194之組合物。
197. 一種如態樣1至116中任一者之經修飾之CFI多肽、如態樣117至180中任一者之聚核苷酸、如態樣181至193中任一者之病毒粒子或如態樣194之組合物在製造用於治療方法中之藥劑中的用途。
198. 如態樣195至197中任一者所使用之經修飾之CFI多肽、聚核苷酸、病毒粒子或組合物、方法或用途，其中該治療方法包含向患者投與有效量之多肽、聚核苷酸、病毒粒子或組合物。
199. 如態樣195至198中任一者所使用之經修飾之CFI多肽、聚核苷酸、病毒粒子或組合物、方法或用途，其中該治療方法為基因治療方法。
200. 如態樣195至199中任一者所使用之經修飾之CFI多肽、聚核苷酸、病毒粒子或組合物、方法或用途，其中該治療方法為藉由增加CFI多肽之表現的治療方法。
201. 如態樣195至200中任一者所使用之經修飾之CFI多肽、聚核苷酸、病毒粒子或組合物或用途，其中該治療方法為治療補體介導之病症的方法。
202. 如態樣201所使用之經修飾之CFI多肽、聚核苷酸、病毒粒子或組合物、用途或方法，其中該病症為C3介導之病症。
203. 如態樣201或202所使用之經修飾之CFI多肽、聚核苷酸、病毒粒子或組合物、用途或方法，其中該病症為腎臟病症。
204. 如態樣201至203中任一者所使用之經修飾之CFI多肽、聚核苷酸、病毒粒子或組合物、用途或方法，其中該病症與補體C3b回饋環之過度活性相關。
205. 如態樣201至204中任一者所使用之經修飾之CFI多肽、聚核苷酸、病毒粒子或組合物、用途或方法，其中該病症係選自C3腎絲球病變、IgA腎病、狼瘡性腎炎、全身性紅斑性狼瘡症、膜性腎病、膜增生性絲球體腎炎、陣發性夜間血紅素尿症、非典型性溶血性尿毒性症候群、自體免疫溶血性貧血、ANCA相關血管炎、高歇氏病、腹膜炎、年齡相關之黃斑部變性、糖尿病性視網膜病變、密度沈積病、年齡相關之發炎性或自體發炎性疾病、自體免疫關節炎(諸如類風濕性關節炎)、動脈粥樣硬化、慢性心血管疾病、阿茲海默症、全身性血管炎、格-巴二氏症候群及亨偌-絲奇恩賴紫癜。
206. 如態樣201至205中任一者所使用之經修飾之CFI多肽、聚核苷酸、病毒粒子或組合物、用途或方法，其中該病症係選自C3腎絲球病變、C3絲球體腎炎及密度沈積病。
207. 如態樣201至205中任一者所使用之經修飾之CFI多肽、聚核苷酸、病毒粒子或組合物、用途或方法，其中該病症為非典型性溶血性尿毒性症候群，視情況為具有單一複對偶基因CFH突變之非典型性溶血性尿毒性症候群。
208. 如態樣201至205中任一者所使用之經修飾之CFI多肽、聚核苷酸、病毒粒子或組合物、用途或方法，其中該病症為腎絲球或腎小管病症。
209. 如態樣201至205或208中任一者所使用之經修飾之CFI多肽、聚核苷酸、病毒粒子或組合物、用途或方法，其中該病症係選自C3腎絲球病變、IgA腎病、狼瘡性腎炎及膜性腎病。
210. 如態樣201至205、208或209中任一者所使用之經修飾之CFI多肽、聚核苷酸、病毒粒子或組合物、用途或方法，其中該病症為狼瘡性腎炎。
211. 如態樣201至205中任一者所使用之經修飾之CFI多肽、聚核苷酸、病毒粒子或組合物、用途或方法，其中該病症為全身性紅斑性狼瘡症。
212. 如態樣195至211中任一者所使用之經修飾之CFI多肽、聚核苷酸、病毒粒子或組合物、用途或方法，其中該多肽、聚核苷酸、病毒粒子或組合物係根據態樣1至194中之任一者。
213. 如態樣195至202中任一者所使用之經修飾之CFI多肽、聚核苷酸、病毒粒子或組合物或用途，其中該治療方法為治療眼部病症之方法。
214. 如態樣201或202中任一者所使用之經修飾之CFI多肽、聚核苷酸、病毒粒子或組合物、用途或方法，其中該病症為眼部病症。
215. 如態樣195至214中任一者所使用之經修飾之CFI多肽、聚核苷酸、病毒粒子或組合物、用途或方法，其中該治療方法降低退化型病症之進展速率或預防退化型病症進展。
216. 如態樣213至215中任一者所使用之經修飾之CFI多肽、聚核苷酸、病毒粒子或組合物、用途或方法，其中該眼部病症為AMD、糖尿病性視網膜病變、青光眼、斯特格氏病、中心性漿液性脈絡膜視網膜病變、色素性視網膜炎、糖尿病性黃斑水腫(DME)、角膜結膜炎、視神經脊髓炎譜系疾病(NMOSD)、開角型青光眼、息肉樣脈絡膜血管病變、葡萄膜炎、玻璃體視網膜病變，或為非致癌性的。
217. 如態樣213、214及216中任一者所使用之經修飾之CFI多肽、聚核苷酸、病毒粒子或組合物、用途或方法，其中該眼部病症為AMD。
218. 如態樣217所使用之經修飾之CFI多肽、聚核苷酸、病毒粒子或組合物、用途或方法，其中該AMD為乾性AMD或地圖狀萎縮(GA)。
219. 如態樣195至202及213至218中任一者所使用之經修飾之CFI多肽、聚核苷酸、病毒粒子或組合物、用途或方法，其中該治療方法為治療AMD、乾性AMD或GA之方法。
220. 如態樣195至202及213至219中任一者所使用之經修飾之CFI多肽、聚核苷酸、病毒粒子或組合物、用途或方法，其中該治療方法治療GA。
221. 如態樣217至220中任一者所使用之經修飾之CFI多肽、聚核苷酸、病毒粒子或組合物、用途或方法，其中該治療方法(i)預防GA之面積增加或(ii)減少GA之面積。
222. 如態樣217至221中任一者所使用之經修飾之CFI多肽、聚核苷酸、病毒粒子或組合物、用途或方法，其中該治療方法使自向眼睛投與CFI多肽、聚核苷酸、載體/病毒粒子及/或組合物起至少12個月的GA之量減少至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%，視情況其中GA之量為GA之面積。
223. 如態樣217至222中任一者所使用之經修飾之CFI多肽、聚核苷酸、病毒粒子或組合物、用途或方法，其中該治療方法預防GA進展或降低GA進展速率。
224. 如態樣217至223中任一者所使用之經修飾之CFI多肽、聚核苷酸、病毒粒子或組合物、用途或方法，其中該治療方法使自向眼睛投與CFI多肽、聚核苷酸、載體/病毒粒子及/或組合物起至少12個月的GA面積之增加速率相對於未經治療之眼睛在同一時段降低至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%。
225. 如態樣217至224中任一者所使用之經修飾之CFI多肽、聚核苷酸、病毒粒子或組合物、用途或方法，其中該治療方法預防玻璃膜疣形成或使玻璃膜疣形成速率降低。
226. 如態樣217至225中任一者所使用之經修飾之CFI多肽、聚核苷酸、病毒粒子或組合物、用途或方法，其中該治療方法使現有玻璃膜疣減少，例如使現有玻璃膜疣之尺寸及/或數目減小。
227. 如態樣217至226中任一者所使用之經修飾之CFI多肽、聚核苷酸、病毒粒子或組合物、用途或方法，其中該治療方法預防補體沈積或降低補體沈積速率。
228. 如態樣217至227中任一者所使用之經修飾之CFI多肽、聚核苷酸、病毒粒子或組合物、用途或方法，其中該治療方法使現有補體沈積減少。
229. 如態樣213至228中任一者所使用之經修飾之CFI多肽、聚核苷酸、病毒粒子或組合物、用途或方法，其中該多肽、聚核苷酸、病毒粒子或組合物係藉由視網膜下注射、直接視網膜注射、脈絡膜上腔注射及/或玻璃體內注射投與。
230. 如態樣213至229中任一者所使用之經修飾之CFI多肽、聚核苷酸、病毒粒子或組合物、用途或方法，其中該多肽、聚核苷酸、病毒粒子或組合物係經眼內投與。
231. 如態樣201至212中任一者所使用之經修飾之CFI多肽、聚核苷酸、病毒粒子或組合物、用途或方法，其中該病症不為眼部病症。
232. 如態樣231所使用之經修飾之CFI多肽、聚核苷酸、病毒粒子或組合物、用途或方法，其中該病症為全身性急性病症。
233. 如態樣231所使用之經修飾之CFI多肽、聚核苷酸、病毒粒子或組合物、用途或方法，其中該病症為全身性慢性病症。
234. 如態樣201至212、或231至233中任一者所使用之經修飾之CFI多肽、聚核苷酸、病毒粒子或組合物、用途或方法，其中該多肽、聚核苷酸、病毒粒子或組合物不藉由視網膜下注射、直接視網膜注射、脈絡膜上腔注射及/或玻璃體內注射投與。
235. 如態樣201至212、或231至234中任一者所使用之經修飾之CFI多肽、聚核苷酸、病毒粒子或組合物、用途或方法，其中該多肽、聚核苷酸、病毒粒子或組合物不經眼內投與。
236. 如態樣195至228、或231至235中任一者所使用之經修飾之CFI多肽、聚核苷酸、病毒粒子或組合物、用途或方法，其中該聚核苷酸、病毒粒子或組合物係如下投與：經靜脈內投與；全身性地投與：經由周邊靜脈輸注投與至肝臟；經由肝血管(諸如肝靜脈輸注或肝動脈輸注)投與至肝臟；或經由直接腦實質內投與而投與至肝臟。
237. 如態樣195至228、或231至235中任一者所使用之經修飾之CFI多肽、聚核苷酸、病毒粒子或組合物、用途或方法，其中該多肽、聚核苷酸、病毒粒子或組合物係藉由注射至腎動脈中來投與。
238. 如態樣195至228、或231至235中任一者所使用之經修飾之CFI多肽、聚核苷酸、病毒粒子或組合物、用途或方法，其中該多肽、聚核苷酸、病毒粒子或組合物係藉由逆行投與來投與，視情況其中該投與係經由輸尿管，使用泌尿導管進行。
239. 如態樣195至228、或231至235中任一者所使用之經修飾之CFI多肽、聚核苷酸、病毒粒子或組合物、用途或方法，其中該聚核苷酸、病毒粒子或組合物係經由直接腎臟實質注射或被膜下注射投與。
240. 如態樣195至239中任一者所使用之經修飾之CFI多肽、聚核苷酸、病毒粒子或組合物、用途或方法，其中投與該多肽、聚核苷酸、病毒粒子或組合物增加患者中C3b不活化及/或iC3b降解活性之水準。
241. 如態樣240所使用之經修飾之CFI多肽、聚核苷酸、病毒粒子或組合物、用途或方法，其中投與該多肽、聚核苷酸、病毒粒子或組合物使C3b不活化及/或iC3b降解活性之水準增加至高於正常水準。
242. 如態樣240或241所使用之經修飾之CFI多肽、聚核苷酸、病毒粒子或組合物、用途或方法，其中投與該多肽、聚核苷酸、病毒粒子或組合物使C3b不活化及/或iC3b降解活性之水準增加至比正常水準高1.2倍、1.5倍、1.8倍或2倍的水準。
243. 如態樣241或242所使用之經修飾之CFI多肽、聚核苷酸、病毒粒子或組合物、用途或方法，其中正常含量等於由血清中之30至40µg/ml之CFI多肽提供的含量。
244. 如態樣195至243中任一者所使用之經修飾之CFI多肽、聚核苷酸、病毒粒子或組合物、用途或方法，其中該治療方法為增加患者中C3b不活化及/或iC3b降解活性之水準的方法。
245. 如態樣195至244中任一者所使用之經修飾之CFI多肽、聚核苷酸、病毒粒子或組合物、用途或方法，其中該治療方法為增加患者中C3b不活化及/或C3b降解水準從而治療補體介導之病症的方法。
246. 如態樣195至245中任一者所使用之經修飾之CFI多肽、聚核苷酸、病毒粒子或組合物、用途或方法，其中該治療方法為藉由增加患者中C3b不活化及/或iC3b降解水準來治療疾病之方法。
247. 如態樣244至246中任一者所使用之經修飾之CFI多肽、聚核苷酸、病毒粒子或組合物、用途或方法，其中增加患者中C3b不活化及/或iC3b降解水準係使C3b不活化及/或iC3b降解活性之水準增加至高於正常水準。
248. 如態樣244至247中任一者所使用之經修飾之CFI多肽、聚核苷酸、病毒粒子或組合物、用途或方法，其中增加患者中C3b不活化及/或iC3b降解水準係使C3b不活化及/或iC3b降解活性之水準增加至比正常水準高1.2倍、1.5倍、1.8倍或2倍的水準。
249. 如態樣240至248中任一者所使用之經修飾之CFI多肽、聚核苷酸、病毒粒子或組合物、用途或方法，其中C3b不活化及/或iC3b降解活性之水準增加係在向其投與該CFI多肽、聚核苷酸、載體/病毒粒子或組合物之組織或器官中的C3b不活化及/或iC3b降解活性之水準增加。
250. 如態樣198至249中任一者所使用之經修飾之CFI多肽、聚核苷酸、病毒粒子或組合物、用途或方法，其中該患者具有低於正常含量之CFI蛋白。
251. 如態樣198至250中任一者所使用之經修飾之CFI多肽、聚核苷酸、病毒粒子或組合物、用途或方法，其中該患者具有低於正常量的CFI表現及/或低於正常水準的CFI活性。
252. 如態樣198至249中任一者所使用之經修飾之CFI多肽、聚核苷酸、病毒粒子或組合物、用途或方法，其中該患者具有正常含量之CFI蛋白。
253. 如態樣198至249中任一者所使用之經修飾之CFI多肽、聚核苷酸、病毒粒子或組合物、用途或方法，其中該患者具有正常量之CFI表現及/或正常水準之CFI活性。
254. 如態樣247至253中任一者所使用之經修飾之CFI多肽、聚核苷酸、病毒粒子或組合物、用途或方法，其中正常含量等於由血清中之30至40µg/ml之CFI多肽提供的含量。
255. 如態樣195至254中任一者所使用之經修飾之CFI多肽、聚核苷酸、病毒粒子或組合物、用途或方法，其中該多肽、聚核苷酸、病毒粒子或組合物係根據態樣1至194中之任一者。
圖1提供包含單一胺基酸突變(列於表2中)之各種CFI變異體及野生型CFI (PL01)之iC3b形成活性水準的比較。活性水準被繪製為關於野生型CFI之活性水準的倍數變化。(特別地，已將各CFI變異體之HTRF比率除以野生型CFI之HTRF比率)。誤差條=平均值±SD。「100% iC3b」為顯示在不存在任何CFI之情況下對於3 nM iC3b所達成之HTRF比率(繪製為關於野生型CFI之HTRF比率的倍數變化)的對照。包括PL09作為陽性對照。
圖2提供包含單一胺基酸突變之一些最高CFI變異體之時間反應曲線。將此等單一突變體之iC3b形成速率與野生型CFI (WT)進行比較。「iC3b形成速率」 (3nM iC3b之%)針對特定反應時間顯示已形成之iC3b之百分比，其中100%表示3nM iC3b之形成。「反應時間」對應於CFI變異體或野生型CFI已與C3b及CFH及抗體一起培育的總時間長度。誤差條=平均值±SD。
圖3提供包含雙重胺基酸突變(列於表2中)之各種CFI變異體及野生型CFI (PL01)之iC3b形成水準的比較。活性水準被繪製為關於野生型CFI之活性水準的倍數變化。(特別地，已將各CFI變異體之HTRF比率除以野生型CFI之HTRF比率)。誤差條=平均值±SD。「100% iC3b」為顯示在不存在任何CFI之情況下對於3 nM iC3b所達成之HTRF比率(繪製為關於野生型CFI之HTRF比率的倍數變化)的對照。
圖4顯示補體活化步驟之梗概。FD、FB、FH及FI分別代表D、B、H及I。
圖5顯示脊椎動物補體之替代途徑的回饋環。短劃線指示酶促反應。實線指示蛋白質轉化。D、B、H及I分別代表因子D、B、H及I。
圖6-序列表
圖7A及圖7B顯示包含三重、四重或五重胺基酸突變(列於表2中)之各種CFI變異體、野生型CFI (PL01)及包含雙重胺基酸突變之CFI變異體PL120、PL133、PL135及PL141之iC3b形成水準的比較。活性水準被繪製為關於野生型CFI之活性水準的倍數變化。(特別地，已將各CFI變異體之HTRF比率除以野生型CFI之HTRF比率)。誤差條=平均值±SD。「100% iC3b」為顯示在不存在任何CFI之情況下對於3 nM iC3b所達成之HTRF比率(繪製為關於野生型CFI之HTRF比率的倍數變化)的對照。
圖8顯示胺基酸自水相至非水相之自由能(ΔG)轉變之Wimley-White疏水性標度。更小的負ΔG值與自水相至非水相中之更有利轉變相關，且表示更具疏水性的胺基酸。
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Claims (26)
- 一種包含一或多個突變的經修飾之補體因子I (CFI)多肽，其中該一或多個突變提供較高CFI活性。
- 一種包含一或多個突變的經修飾之CFI多肽，其中該一或多個突變包含在對應於選自由以下組成之群的位置的位置處之突變：SEQ ID NO: 1之53、60、383、384、400、401、407、408、409、439、440、441、479及482。
- 如請求項1或2之經修飾之CFI多肽，其中該一或多個突變包含： (i) 該經修飾之CFI多肽內可與C3b形成界面之一或多個位置處的突變；及/或 (ii) 該經修飾之CFI多肽內可與因子H形成界面之一或多個位置處的突變。
- 如請求項3之經修飾之CFI多肽，其中該經修飾之CFI多肽內的該等位置中之至少一者： (i) 可與C3b形成界面之位置處於SP域中； (ii) 可與C3b形成界面之位置處於FIM域中；及/或 (iii) 可與因子H形成界面之位置處於SP域中。
- 如請求項3或4之經修飾之CFI多肽，其中： (i) 與C3b之界面係與C3bα鏈之界面； (ii) 與C3b之界面係與C3bα鏈中之CUB域之界面； (iii) 與C3b之界面係與C3bα鏈中之CUB域內之受質環的界面； (iv) 與C3b之界面係與C3bα鏈中之CTC域之界面； (v) 與因子H之界面係與因子H中之CCP2域之界面；及/或 (vi) 與因子H之界面係與因子H中之CCP3域之界面。
- 如前述請求項中任一項之經修飾之CFI多肽，其中該一或多個突變包含在對應於選自由以下組成之群的位置的一或多個、兩個或更多個、三個或更多個、四個或更多個、或五個或更多個位置處之突變：SEQ ID NO: 1之53、60、383、384、400、401、407、408、409、439、440、441、479及482。
- 如前述請求項中任一項之經修飾之CFI多肽，其中該一或多個突變包含： (i) 在對應於SEQ ID NO: 1之位置53的位置處之突變，視情況其中在對應於SEQ ID NO: 1之位置53的位置之該突變為經異白胺酸、白胺酸、酪胺酸或麩胺酸取代； (ii) 在對應於SEQ ID NO: 1之位置383的位置處之突變，視情況其中在對應於SEQ ID NO: 1之位置383的位置處之該突變為經異白胺酸、白胺酸、酪胺酸、麩胺酸或苯丙胺酸取代； (iii) 在對應於SEQ ID NO: 1之位置401的位置處之突變，視情況其中在對應於SEQ ID NO: 1之位置401的位置處之突變為經甘胺酸、酪胺酸、苯丙胺酸或色胺酸取代，進一步視情況經酪胺酸、苯丙胺酸或色胺酸取代； (iv) 在對應於SEQ ID NO: 1之位置409的位置處之突變，視情況其中在對應於SEQ ID NO: 1之位置409的位置處之該突變為經苯丙胺酸、色胺酸或麩胺酸取代； (v) 在對應於SEQ ID NO: 1之位置439的位置處之突變，視情況其中在對應於SEQ ID NO: 1之位置439的位置處之該突變為白胺酸、麩胺酸或麩醯胺酸取代；及/或 (vi) 在對應於SEQ ID NO: 1之位置479的位置處之突變，視情況其中在對應於SEQ ID NO: 1之位置479的位置處之該突變為經天冬胺酸取代，視情況為E479D。
- 如前述請求項中任一項之經修飾之CFI多肽，其中該一或多個突變包含： (i) 在對應於SEQ ID NO: 1之位置53的位置處之突變；及 (ii) 在對應於SEQ ID NO: 1之位置383、401或409的位置處之突變，視情況其中： (a) 在對應於SEQ ID NO: 1之位置53的位置處之該突變為經白胺酸取代，視情況為R53L，且在對應於SEQ ID NO: 1之位置383的位置處之該突變為經酪胺酸取代，視情況為R383Y； (b) 在對應於SEQ ID NO: 1之位置53的位置處之該突變為經異白胺酸取代，視情況為R53I，且在對應於SEQ ID NO: 1之位置383的位置處之該突變為經麩胺酸取代，視情況為R383E； (c) 在對應於SEQ ID NO: 1之位置53的位置處之該突變為經白胺酸取代，視情況為R53L，且在對應於SEQ ID NO: 1之位置383的位置處之該突變為經異白胺酸取代，視情況為R383I； (d) 在對應於SEQ ID NO: 1之位置53的位置處之該突變為經白胺酸取代，視情況為R53L，且在對應於SEQ ID NO: 1之位置401的位置處之該突變為經酪胺酸取代，視情況為R401Y； (e) 在對應於SEQ ID NO: 1之位置53的位置處之該突變為經酪胺酸取代，視情況為R53Y，且在對應於SEQ ID NO: 1之位置401的位置處之該突變為經酪胺酸取代，視情況為H401Y；或 (f) 在對應於SEQ ID NO: 1之位置53的位置處之該突變為經酪胺酸取代，視情況為R53Y，且在對應於SEQ ID NO: 1之位置409的位置處之該突變為經苯丙胺酸取代，視情況為I409F。
- 如前述請求項中任一項之經修飾之CFI多肽，其中該經修飾之CFI多肽相對於參考CFI多肽具有較高CFI活性。
- 如請求項9之經修飾之CFI多肽，其中該參考CFI多肽為野生型CFI多肽，進一步視情況其中該參考CFI多肽為SEQ ID NO: 1或2之多肽。
- 如請求項9或10之經修飾之CFI多肽，其中該CFI活性比該參考CFI多肽之CFI活性高至少1.2倍、至少1.5倍、至少2倍、至少2.5倍、至少3倍、至少3.5倍、至少4倍、至少4.5倍、至少5倍、至少5.5倍、至少6倍、至少6.5倍、至少7倍、至少7.5倍、至少8倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、在1.2倍與3倍之間、在1.2倍與5倍之間、在2倍與6倍之間、在3倍與8倍之間、在1.5倍與8倍之間、在2倍與8倍之間、在5倍與8倍之間、在6倍與8倍之間、在7倍與8倍之間、在2倍與15倍之間、在3倍與20倍之間、在5倍與10倍之間、在5倍與15倍、在5倍與20倍之間。
- 如請求項1或3至11中任一項之經修飾之CFI多肽，其中該CFI活性為iC3b形成活性。
- 如請求項1或3至12中任一項之經修飾之CFI多肽，其中使用均相時差式螢光(HTRF)分析測定該CFI活性。
- 如請求項1或3至13中任一項之經修飾之CFI多肽，其在pH 7下與C3b及CFH一起培育1小時，隨後與抗iC3b IgG及抗C3b IgG一起培育1小時之後，量測該CFI活性。
- 如請求項1或3至13中任一項之經修飾之CFI多肽，其中在pH 7下與C3b及CFH一起培育30分鐘，隨後與抗iC3b IgG及抗C3b IgG一起培育30分鐘之後，量測該CFI活性。
- 如請求項14或15之經修飾之CFI多肽，其中該抗iC3b IgG為抗iC3b (Tb) IgG且該抗C3b IgG為抗C3b (FITC) IgG。
- 如前述請求項中任一項之經修飾之CFI多肽，其中： (i) 該經修飾之CFI多肽包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2之至少200個、至少250個、至少300個、至少400個、至少500個、在400與565個之間、在500與565個之間、在520與565個之間的胺基酸、在400與583個之間的胺基酸、在500與583個之間的胺基酸或在520與583個之間的胺基酸之片段具有至少80%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致性的胺基酸序列；或 (ii) 該經修飾之CFI多肽包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2具有至少80%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致性之胺基酸序列；或 (iii) 該經修飾之CFI多肽包含與SEQ ID NO: 1之500與583個之間的胺基酸的片段具有至少98%一致性的胺基酸序列；或 (iv) 該經修飾之CFI多肽包含與SEQ ID NO: 2之500與565個之間的胺基酸的片段具有至少98%一致性的胺基酸序列；或 (v) 該經修飾之CFI多肽包含與SEQ ID NO: 1具有至少98%一致性之胺基酸序列；或 (vi) 該經修飾之CFI多肽包含與SEQ ID NO: 2具有至少98%一致性之胺基酸序列；或 (vii) 除了該經修飾之CFI多肽包含在前述請求項中任一項中所定義之該一或多個突變之外，該經修飾之CFI多肽包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2一致之胺基酸序列；或 (viii) 除了該經修飾之CFI多肽包含在對應於SEQ ID NO: 1之位置53的位置處之突變之外，該經修飾之CFI多肽包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2一致之胺基酸序列；或 (ix) 除了該經修飾之CFI多肽包含在對應於SEQ ID NO: 1之位置383的位置處之突變之外，該經修飾之CFI多肽包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2一致之胺基酸序列；或 (x) 除了該經修飾之CFI多肽包含在對應於SEQ ID NO: 1之位置401的位置處之突變之外，該經修飾之CFI多肽包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2一致之胺基酸序列；或 (xi) 除了該經修飾之CFI多肽包含在對應於SEQ ID NO: 1之位置409的位置處之突變之外，該經修飾之CFI多肽包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2一致之胺基酸序列；或 (xii) 除了該經修飾之CFI多肽包含在對應於SEQ ID NO: 1之位置439的位置處之突變之外，該經修飾之CFI多肽包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2一致之胺基酸序列；或 (xiii) 除了該經修飾之CFI多肽包含在對應於SEQ ID NO: 1之位置441的位置處之突變之外，該經修飾之CFI多肽包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2一致之胺基酸序列；或 (xiv) 除了該經修飾之CFI多肽包含在對應於SEQ ID NO: 1之位置479的位置處之突變之外，該經修飾之CFI多肽包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2一致之胺基酸序列；或 (xv) 除了該經修飾之CFI多肽包含在對應於SEQ ID NO: 1之位置53的位置處之突變及在對應於SEQ ID NO: 1之位置383的位置處之突變之外，該經修飾之CFI多肽包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2一致之胺基酸序列；或 (xvi) 除了該經修飾之CFI多肽包含在對應於SEQ ID NO: 1之位置53的位置處之突變及在對應於SEQ ID NO: 1之位置401的位置處之突變之外，該經修飾之CFI多肽包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2一致之胺基酸序列；或 (xvii) 除了該經修飾之CFI多肽包含在對應於SEQ ID NO: 1之位置53的位置處之突變及在對應於SEQ ID NO: 1之位置409的位置處之突變之外，該經修飾之CFI多肽包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2一致之胺基酸序列；或 (xviii) 除了該經修飾之CFI多肽包含在對應於SEQ ID NO: 1之位置53的位置處之突變及在對應於SEQ ID NO: 1之位置479的位置處之突變之外，該經修飾之CFI多肽包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2一致之胺基酸序列；或 (xix) 除了該經修飾之CFI多肽包含在對應於SEQ ID NO: 1之位置383的位置處之突變及在對應於SEQ ID NO: 1之位置401的位置處之突變之外，該經修飾之CFI多肽包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2一致之胺基酸序列；或 (xx) 除了該經修飾之CFI多肽包含在對應於SEQ ID NO: 1之位置383的位置處之突變及在對應於SEQ ID NO: 1之位置409的位置處之突變之外，該經修飾之CFI多肽包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2一致之胺基酸序列；或 (xxi) 除了該經修飾之CFI多肽包含在對應於SEQ ID NO: 1之位置383的位置處之突變及在對應於SEQ ID NO: 1之位置439的位置處之突變之外，該經修飾之CFI多肽包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2一致之胺基酸序列；或 (xxii) 除了該經修飾之CFI多肽包含在對應於SEQ ID NO: 1之位置53的位置處經異白胺酸之取代及在對應於SEQ ID NO: 1之位置383的位置處經麩胺酸之取代之外，該經修飾之CFI多肽包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2一致之胺基酸序列；或 (xxiii) 除了該經修飾之CFI多肽包含在對應於SEQ ID NO: 1之位置53的位置處經白胺酸之取代及在對應於SEQ ID NO: 1之位置383的位置處經麩胺酸之取代之外，該經修飾之CFI多肽包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2一致之胺基酸序列；或 (xxiv) 除了該經修飾之CFI多肽包含在對應於SEQ ID NO: 1之位置53的位置處經白胺酸之取代及在對應於SEQ ID NO: 1之位置383的位置處經異白胺酸之取代之外，該經修飾之CFI多肽包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2一致之胺基酸序列；或 (xxv) 除了該經修飾之CFI多肽包含在對應於SEQ ID NO: 1之位置53的位置處經白胺酸之取代及在對應於SEQ ID NO: 1之位置383的位置處經酪胺酸之取代之外，該經修飾之CFI多肽包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2一致之胺基酸序列；或 (xxvi) 除了該經修飾之CFI多肽包含在對應於SEQ ID NO: 1之位置53的位置處經白胺酸之取代及在對應於SEQ ID NO: 1之位置409的位置處經苯丙胺酸之取代之外，該經修飾之CFI多肽包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2一致之胺基酸序列；或 (xxvii) 除了該經修飾之CFI多肽包含在對應於SEQ ID NO: 1之位置53的位置處經白胺酸之取代及在對應於SEQ ID NO: 1之位置401的位置處經酪胺酸之取代之外，該經修飾之CFI多肽包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2一致之胺基酸序列；或 (xxviii) 除了該經修飾之CFI多肽包含在對應於SEQ ID NO: 1之位置53的位置處經白胺酸之取代及在對應於SEQ ID NO: 1之位置479的位置處經天冬胺酸之取代之外，該經修飾之CFI多肽包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2一致之胺基酸序列；或 (xxix) 除了該經修飾之CFI多肽包含在對應於SEQ ID NO: 1之位置53的位置處經酪胺酸之取代及在對應於SEQ ID NO: 1之位置383的位置處經酪胺酸之取代之外，該經修飾之CFI多肽包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2一致之胺基酸序列；或 (xxx) 除了該經修飾之CFI多肽包含在對應於SEQ ID NO: 1之位置53的位置處經酪胺酸之取代及在對應於SEQ ID NO: 1之位置401的位置處經酪胺酸之取代之外，該經修飾之CFI多肽包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2一致之胺基酸序列；或 (xxxi) 除了該經修飾之CFI多肽包含在對應於SEQ ID NO: 1之位置53的位置處經酪胺酸之取代及在對應於SEQ ID NO: 1之位置409的位置處經苯丙胺酸之取代之外，該經修飾之CFI多肽包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2一致之胺基酸序列；或 (xxxii) 除了該經修飾之CFI多肽包含在對應於SEQ ID NO: 1之位置383的位置處經苯丙胺酸之取代及在對應於SEQ ID NO: 1之位置409的位置處經苯丙胺酸之取代之外，該經修飾之CFI多肽包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2一致之胺基酸序列；或 (xxxiii) 除了該經修飾之CFI多肽包含在對應於SEQ ID NO: 1之位置383的位置處經苯丙胺酸之取代及在對應於SEQ ID NO: 1之位置439的位置處經麩胺酸之取代之外，該經修飾之CFI多肽包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2一致之胺基酸序列；或 (xxxiv) 除了該經修飾之CFI多肽包含在對應於SEQ ID NO: 1之位置383的位置處經苯丙胺酸之取代及在對應於SEQ ID NO: 1之位置401的位置處經酪胺酸之取代之外，該經修飾之CFI多肽包含與SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2一致之胺基酸序列。
- 如前述請求項中任一項之經修飾之CFI多肽，其中： (i) 該經修飾之CFI多肽包含信號肽；或 (ii) 該經修飾之CFI多肽包含信號肽，其中該信號肽之胺基酸序列為野生型CFI信號肽之胺基酸序列；或 (iii) 該經修飾之CFI多肽包含信號肽，其中該信號肽之胺基酸序列為並非野生型CFI信號肽之信號肽的胺基酸序列；或 (iv) 該經修飾之CFI多肽包含信號肽，其中該信號肽為異源信號肽；或 (v) 該經修飾之CFI多肽包含信號肽，其中該信號肽來自另一多肽；或 (vi) 該經修飾之CFI多肽包含信號肽，其中該信號肽為經修飾之CFI信號肽；或 (vii) 該經修飾之CFI多肽包含信號肽，其中該信號肽為合成信號肽。
- 一種包含CFI核苷酸序列之聚核苷酸，其中該CFI核苷酸序列編碼如前述請求項中任一項之經修飾之CFI多肽。
- 如請求項19之聚核苷酸，其中： (i) 該CFI核苷酸序列包含與SEQ ID NO: 16、17、18或19中之任一者的至少1200個、至少1400個、至少1500個、1698個或更少個、1752個或更少個、在1200與1698個之間、在1200與1752個之間、在1500與1698個之間、在1500與1752個之間、約1698個或約1752個核苷酸之片段具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.5%或至少99.8%一致性的序列； (ii) 該CFI核苷酸序列包含與SEQ ID NO: 28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51或52中之任一者的至少1200個、至少1400個、至少1500個、1698個或更少個、1752個或更少個、在1200與1698個之間、在1200與1752個之間、在1500與1698個之間、在1500與1752個之間、約1698個或約1752個核苷酸之片段具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.5%或至少99.8%一致性的序列； (iii) 該CFI核苷酸序列包含與SEQ ID NO: 4或3中之任一者的至少1200個、至少1400個、至少1500個、1698個或更少個、1752個或更少個、在1200與1698個之間、在1200與1752個之間、在1500與1698個之間、在1500與1752個之間、約1698個或約1752個核苷酸之片段具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.5%或至少99.8%一致性的序列； (iv) 除了編碼提供較高CFI活性之一或多個突變或包含對應於選自由SEQ ID NO: 1之53、60、383、384、400、401、407、408、409、439、440、441、479及482組成之群的位置的位置處之突變的一或多個突變的密碼子之外，該CFI核苷酸序列包含與SEQ ID NO: 18或19具有100%一致性之序列； (v) 除了編碼提供較高CFI活性之一或多個突變或包含對應於選自由SEQ ID NO: 1之53、60、383、384、400、401、407、408、409、439、440、441、479及482組成之群的位置的位置處之突變的一或多個突變的密碼子之外，該CFI核苷酸序列包含與SEQ ID NO: 30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51或52具有100%一致性之序列； (vi) 除了編碼提供較高CFI活性之一或多個突變或包含對應於選自由SEQ ID NO: 1之53、60、383、384、400、401、407、408、409、439、440、441、479及482組成之群的位置的位置處之突變的一或多個突變的密碼子之外，該CFI核苷酸序列包含與SEQ ID NO: 4或3具有100%一致性之序列； (vii) 該CFI核苷酸序列或該CFI核苷酸序列中經密碼子最佳化之部分經密碼子最佳化以表現於人類肝細胞、人類視網膜細胞或人類腎細胞中； (viii) 該CFI核苷酸序列或該CFI核苷酸序列中經密碼子最佳化之該部分相比於參考CFI核苷酸序列之對應部分包含數目減少的CpG，視情況其中該參考CFI核苷酸序列為野生型CFI核苷酸序列； (ix) 該CFI核苷酸序列包含5個或更少CpG； (x) 該CFI核苷酸序列編碼信號肽； (xi) 該CFI核苷酸序列編碼信號肽，且該信號肽之胺基酸序列為並非野生型CFI信號肽之信號肽的胺基酸序列； (xii) 該CFI核苷酸序列編碼信號肽，且該信號肽為異源信號肽；及/或 (xiii) 該聚核苷酸進一步包含轉錄調節元件，視情況其中該轉錄調節元件包含(a)肝特異性啟動子、(b)眼部特異性啟動子及/或強化子、(c)視網膜細胞特異性啟動子及/或強化子、(d)腎特異性啟動子及/或強化子、(e)足細胞細胞特異性啟動子及/或強化子，或(f)非組織特異性轉錄調節元件。
- 一種包含重組基因組之病毒粒子，其包含如請求項19或20之聚核苷酸。
- 如請求項21之病毒粒子： (i) 其為AAV、腺病毒或慢病毒病毒粒子； (ii) 其為AAV病毒粒子； (iii) 其中該病毒粒子包含衣殼； (iv) 其中該病毒粒子包含衣殼，且該衣殼包含與SEQ ID NO:7至10中任一者之至少600個、至少650個、至少700個、在600與734個之間、在600與736個之間、在650與734個之間、在650與736個之間、在700與734個之間、在700與736個之間、約734個或約736個胺基酸的片段具有至少98%、至少99%、至少99.5%或100%一致性的序列； (v) 其中該病毒粒子包含嗜肝性衣殼； (vi) 其中該病毒粒子包含嗜肝性衣殼，且該嗜肝性衣殼包含與SEQ ID NO:7至10中任一者之至少600個、至少650個、至少700個、在600與734個之間、在600與736個之間、在650與734個之間、在650與736個之間、在700與734個之間、在700與736個之間、約734個或約736個胺基酸的片段具有至少98%、至少99%、至少99.5%或100%一致性的序列； (vii) 其中該病毒粒子包含衣殼且該衣殼包含與SEQ ID NO: 26或27具有至少99%或100%一致性之序列； (viii) 其中該病毒粒子包含嗜腎性衣殼； (ix) 其中該重組基因體為單股；及/或 (x) 其中該病毒粒子進一步包含： a) AAV2 ITR； b) polyA序列；及/或 c)內含子。
- 一種組合物，其包含如前述請求項中任一項之經修飾之CFI多肽、聚核苷酸或病毒粒子，及醫藥學上可接受之賦形劑。
- 如請求項1至18中任一項之經修飾之CFI多肽、如請求項19或20之聚核苷酸、如請求項21或22之病毒粒子或如請求項23之組合物，其用於治療方法中，視情況其中該治療方法包含向患者投與有效量之多肽、聚核苷酸、病毒粒子或組合物。
- 如請求項24所使用之經修飾之CFI多肽、聚核苷酸、病毒粒子或組合物，其中該治療方法： (i) 為基因治療方法； (ii) 為藉由增加該CFI多肽之表現進行之治療方法； (iii) 為治療補體介導之病症的方法；及/或 (iv) 為治療眼部病症之方法。
- 如請求項24所使用之經修飾之CFI多肽、聚核苷酸、病毒粒子或組合物，其中該補體介導之病症為： (i) C3介導之病症； (ii) 腎臟病症； (iii) 與補體C3b回饋循環之過度活性相關； (iv) 選自C3腎絲球病變、IgA腎病、狼瘡性腎炎、全身性紅斑性狼瘡症、膜性腎病、膜增生性絲球體腎炎、陣發性夜間血紅素尿症、非典型性溶血性尿毒性症候群、自體免疫溶血性貧血、ANCA相關血管炎、高歇氏病(Gaucher disease)、腹膜炎、年齡相關之黃斑部變性(包括乾性AMD及地圖狀萎縮)、糖尿病性視網膜病變、密度沈積病、年齡相關之發炎性或自體發炎性疾病、自體免疫關節炎(諸如類風濕性關節炎)、動脈粥樣硬化、慢性心血管疾病、阿茲海默症(Alzheimer's disease)、全身性血管炎、格-巴二氏症候群(Guillain-Barre syndrome)及亨偌-絲奇恩賴紫癜(Henoch-Schonlein purpura)；及/或 (v) 腎絲球或腎小管病症。
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