TW202320839A - hGH融合蛋白的高濃度給藥劑型 - Google Patents

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Abstract

本發明涉及含有泊洛沙姆188（Poloxamer 188）和聚山梨醇酯80（Polysorbate 80）的hGH融合蛋白的高濃度給藥劑型，根據本發明，可製備當含有泊洛沙姆188和聚山梨醇酯80時凝集反應明顯減少、貯存穩定性提高的高濃度的hGH融合蛋白劑型。

Description

hGH融合蛋白的高濃度給藥劑型
本發明涉及hGH（human Growth Hormone，人生長激素）融合蛋白的高濃度給藥劑型，更詳細而言，涉及通過含有泊洛沙姆188（Poloxamer 188）和聚山梨醇酯80（Polysorbate 80）以能夠在融合有免疫球蛋白Fc多肽（以下，與「hyFc」混合標記）的hGH的高濃度劑型中凝集反應也明顯減少的hGH融合蛋白的高濃度給藥劑型。
生長激素是由191個胺基酸組成的多肽，是由腦下垂體前葉分泌的激素。通過與生長激素受體結合來表達IGF-1（Insulin like Growth Factor-1），從而參與細胞的生長和再生。據悉，生長激素在正常人的身體中是由腦下垂體生產，直到青春期產量增加，隨著年齡增長，產量逐漸減少。
典型的生長激素缺乏症狀有成人生長激素缺乏症（adult growth hormone deficiency，AGHD）和小兒生長激素缺乏症（pediatric growth hormone deficiency，PGHD）。對於成人生長激素缺乏症，是在腦腫瘤、腦出血等治療過程中因放射線或手術而損傷患者的腦下垂體發生，或特發性發生。若生長激素的分泌不正常，則會出現體重下降、骨骼無機物密度減少、脂肪增加、HDL減少、LDL增加、肌肉強度減少等症狀，導致生活品質下降。與同年齡段正常人相比，成人生長激素缺乏症患者血清內IGF-1的濃度的標準差分數（standard deviation score，SDS）屬於-2以下（≤-2SDS）或百分位2.5以內（≤2.5percentile）。血液中生長激素的反應值可通過胰島素耐性檢查（Insulin tolerance test，ITT）、精胺酸耐量（Growth hormone-releasing hormone + Arginine，GHRH+ARG）試驗、胰高血糖素（Glucagon）試驗、L-DOPA試驗、可尼丁（Clonidine）試驗等刺激試驗（stimulation test）測定。當生長激素的最大值（peak GH）在身體質量指數（BMI）小於25kg/m 2的患者中為11.0μg/L以下，在身體質量指數25～30kg/m 2患者中為8.0μg/L以下，或者在大於身體質量指數30kg/m 2的患者中為4.0μg/L以下時，判定為缺乏症（Guidelines for Use of Growth Hormone in Clinical Practice，Endocr. Pract. 2009;15（Suppl 2））。小兒生長激素缺乏症發生在腦下垂體的損傷或發育障礙的情況下。若有生長激素的分泌障礙，則出現身材矮小症，身高在同齡人的生長曲線上呈下位3%或一年5cm以下的生長，還會出現低血糖、體力下降、憂鬱症及精神不成熟等症狀。對於同一年齡段，身高比平均低3SD（Standard deviation，標準差）以上的情況、父母身高比平均低1.5SD以上的情況、比平均身高低2SD以上且比同齡人的生長1年以上低1SD以上的情況、2歲以上或SD值低0.5以上的情況、或者雖未出現低身材矮小症狀但1年以上小於2SD或2年以上保持1.5的情況下，可判定為小兒生長激素缺乏症（Consensus guideline for the diagnosis and treatment of GH deficiency in childhood and adolescence: summary statement of the GH Research Society. GH Research Society，J. Clin. Endocrinol. Metab.，2000 Nov; 85（11）: 3990-3）。
生長激素缺乏症主要是使用生長激素進行治療，在20世紀50年代首次開始生長激素治療時，生長激素從人屍體的腦下垂體中提取，從一人中提取的生長激素的量非常少，因此供應非常有限，而且價格很高。隨著基因重組技術的發展，由大腸菌合成的生長激素上市（Somatropin，1981，美國基因泰克（Genentech）公司）。目前在美國市售的重組生長激素（recombinant growth hormone）治療藥物為輝瑞（Pfizer）的健高靈（Genotropin）、禮來（Eli Lilly）的優猛茁（Humatrope）、基因泰克（Genentech）的Nutropin、諾和諾德（Novo Nordisk）的諾澤（Norditropin）等。
目前，生長激素製劑為一日劑型，特別是對於小兒患者，在3-4年的長期治療期間，存在每天都要注射藥物的不便性，據悉，因注射引起的精神壓力會降低患者的生活品質。並且，患者無意中無法注射的問題頻繁發生，成為阻礙治療效果的最大因素。並且，據悉，隨著治療年數的增加，不履行給藥的次數明顯增加（Endocrine practice, 2008 Mar; 14(2): 143-54）。據悉，約2/3的患者因不履行而降低順應性，實際因此而減慢身高增長速度（PloS one, 2011 Jan; 6(1): e16223）。
由於這些問題，人們一直在嘗試使用各種技術開發持續型生長激素。Ascendis pharma公司使用Transcon PEG平臺，OPKO/Pfizer公司在hGH中融合CTP，並且Novo Nordisk公司融合albumin，增加了hGH的半衰期，這種技術使每天注射生長激素的患者每週可以注射一次。
相關於此，本申請人曾申請在hGH中對組合IgD和IgG4的hyFc進行融合以使機體依賴性和抗體依賴性毒性低且hGH持續性提高的GX-H9物質的專利並授權（美國授權專利第8529899號）。接著，申請了GX-H9可以每週給藥一次或每兩周給藥一次的用量用法專利（美國公開號第2021-0177945號和美國公開號第2019-0224281號）。
另一方面，GX-H9的臨床試驗初期將濃度製成30mg/ml來供應。此後，在每兩週一次給藥GX-H9的過程中，GX-H9給藥量（volume）增加，由此對高濃度劑型的必要性凸顯出來。
專利文獻
專利文獻1：美國授權專利第8529899號
專利文獻2：美國公開專利第2021-0177945號
專利文獻3：美國公開專利第2019-0224281號
非專利文獻
非專利文獻1：Guidelines for Use of Growth Hormone in Clinical Practice,Endocr. Pract. 2009; 15(Suppl 2)
非專利文獻2：J. Clin. Endocrinol. Metab., 2000 Nov; 85(11): 3990-3
非專利文獻3：Endocrine practice, 2008 Mar; 14(2): 143-54
非專利文獻4：PloS one, 2011 Jan; 6(1): e16223
對此，本發明人著眼於通過GX-H9的序列分析來預測結構特徵，hGH具有大量疏水性補丁（hydrophobic patch），蛋白質本身可以形成由疏水性相互作用形成的凝集體（agglutination）的一種觀點、以及DP（Drug Product）容器內的氣體/油/固體表面等吸附蛋白質而形成一種蛋白質膜，這些蛋白質膜剝離形成的補丁可以形成不溶性粒子凝集體的一種觀點，來致力於開發能夠防止如上所述的凝集體的形成的劑型，並且確認在同時添加聚山梨醇酯80和泊洛沙姆188來作為表面活性劑的液體劑型中顯著改善凝集體的形成，由此完成了本發明。
本發明的目的在於提供在製備hGH融合蛋白的高濃度劑型時蛋白質凝集反應顯著減少且保持貯存穩定性的hGH-hyFc融合蛋白的高濃度劑型。
為了實現上述的目的，本發明提供包含hGH（human Growth Hormone）融合蛋白、泊洛沙姆188（Poloxamer 188）以及聚山梨醇酯80（Polysorbate 80）的液體藥物劑型。
本發明的特徵可以在於，所述hGH融合蛋白包含hGH和免疫球蛋白Fc多肽。
本發明的特徵可以在於，所述hGH具有SEQ ID NO: 2的胺基酸序列。
本發明的特徵可以在於，所述免疫球蛋白Fc多肽具有SEQ ID NO: 3的胺基酸序列。
本發明的特徵可以在於，所述hGH融合蛋白具有SEQ ID NO: 1的胺基酸序列。
本發明的特徵可以在於，所述劑型包含30mg/mL至150mg/mL的hGH融合蛋白。
本發明的特徵可以在於，所述劑型包含0.01%至0.2%（w/v）泊洛沙姆188。
本發明的特徵可以在於，所述劑型包含0.01%至0.2%（w/v）聚山梨醇酯80。
本發明的特徵可以在於，所述劑型還包含選自由組胺酸（Histidine）、精胺酸（Arginine）、麩胺酸（Glutamic acid）以及氯化鈉（NaCl）組成的組中的一種以上的賦形劑。
本發明的特徵可以在於，所述劑型還包含防腐劑。
本發明的特徵可以在於，所述防腐劑為選自由間甲酚（m-cresol）、苯酚（phenol）以及苯甲醇（benzyl alcohol）組成的組中的一種以上。
本發明的特徵可以在於，所述防腐劑為1mg/mL至2mg/mL的苯酚。
本發明的特徵可以在於，所述劑型包含1mM至20mM的組胺酸。
本發明的特徵可以在於，所述劑型包含40mM至70mM的精胺酸。
本發明的特徵可以在於，所述劑型包含40mM至70mM的麩胺酸。
本發明的特徵可以在於，所述劑型包含80mM至100mM的氯化鈉。
本發明的特徵可以在於，所述劑型為pH5.5至pH7.0。
本發明的特徵可以在於，所述劑型優選為pH6.0至pH6.9，更優選為pH6.0至6.2。
本發明的特徵可以在於，所述劑型在冷藏貯存6個月時形成小於1.5%的凝集體。
本發明的特徵可以在於，所述劑型用於皮下給藥或肌肉給藥。
本發明的特徵可以在於，所述劑型貯存在選自由瓶（bottle）、微管（microtube）、袋（bag）、小瓶（vial）、卡式瓶（cartridge）、注射器（injector）以及注射筒（syringe）組成的組中的容器中。
當含有根據本發明的泊洛沙姆188和聚山梨醇酯80時，製備凝集反應明顯減少、貯存穩定性提高的高濃度的hGH融合蛋白劑型。
除非以其他方式定義，本文中使用的所有技術術語和科學術語具有與本發明所屬技術領域的具有通常知識者通常理解的含義相同。通常，本文中使用的命名法在本技術領域中是眾所周知的，並且是常規使用的。
在本發明中確認，製備GX-H9的高濃度劑型時同時含有聚山梨醇酯80和泊洛沙姆188來作為表面活性劑的情況下凝集體的形成顯著減少。
因此，本發明的一觀點涉及包含hGH融合蛋白、泊洛沙姆188（Poloxamer 188）及聚山梨醇酯80（Polysorbate 80）的液體藥物劑型。
本發明的特徵可以在於，所述hGH融合蛋白包含hGH和免疫球蛋白Fc多肽。
本發明中使用的hGH融合蛋白「GX-H9」是在人生長激素（hGH）中融合混合Fc而製備的作為人生長激素融合蛋白質的hGH-hyFc。作為hGH融合蛋白的GX-H9可根據美國專利第8529899號中公開的方法製備。
本發明的特徵可以在於，所述hGH具有SEQ ID NO: 2的胺基酸序列，但不限定於此。
本發明的特徵可以在於，所述免疫球蛋白Fc多肽可具有SEQ ID NO: 3的胺基酸序列，但不限定於此。
本發明的特徵可以在於，所述hGH融合蛋白具有SEQ ID NO: 1的胺基酸序列，但不限定於此。
本發明的特徵可以在於，所述劑型包含30mg/mL至150mg/mL的hGH融合蛋白，優選地，包含60mg/mL至120mg/mL的GX-H9，但不限定於此。所述劑型例如可以包含30mg/mL、40mg/mL、50mg/mL、60mg/mL、70mg/mL、80mg/mL、90mg/mL、100mg/mL、110mg/mL、120mg/mL、130mg/mL、140mg/mL或150mg/mL的GX-H9。
本發明的特徵可以在於，所述劑型包含0.01%（w/v）至0.2%（w/v）泊洛沙姆188，優選地，包含0.05%（w/v）至0.15%（w/v），或包含0.08%（w/v）至0.12%（w/v），更優選地，包含0.10%（w/v）的泊洛沙姆188，但不限定於此。
本發明的特徵可以在於，所述劑型包含0.01%（w/v）至0.2%（w/v）聚山梨醇酯80，優選地，包含0.05%（w/v）至0.15%（w/v），或包含0.05%（w/v）至0.10%（w/v），更優選地，包含0.07%（w/v）的聚山梨醇酯80，但不限定於此。
本發明的特徵可以在於，所述劑型還包含選自由組胺酸（Histidine）、精胺酸（Arginine）、麩胺酸（Glutamic acid）以及氯化鈉（NaCl）組成的組中的一種以上的賦形劑。
本發明的特徵可以在於，所述劑型還包含防腐劑。
本發明的特徵可以在於，所述防腐劑為選自由間甲酚（m-cresol）、苯酚（phenol）以及苯甲醇（benzyl alcohol）組成的組中的任意一種以上，但不限定於此。
本發明的特徵可以在於，所述防腐劑為1mg/mL至2mg/mL的苯酚，優選地，為1mg/mL的苯酚，但不限定於此。
本發明的特徵可以在於，所述劑型包含1mM至20mM的組胺酸，優選地，包含5mM至15mM，更優選地，包含10mM的組胺酸，但不限定於此。
本發明的特徵可以在於，所述劑型包含40mM至70mM的精胺酸，優選地，包含50mM至60mM，更優選地，包含55mM的精胺酸，但不限定於此。
本發明的特徵可以在於，所述劑型包含40mM至70mM的麩胺酸，優選地，包含50mM至60mM，更優選地，包含55mM的麩胺酸，但不限定於此。
本發明的特徵可以在於，所述劑型包含80mM至100mM的氯化鈉，優選地，包含85mM至95mM，更優選地，包含90mM的氯化鈉，但不限定於此。
本發明的特徵可以在於，所述劑型為pH5.5至pH7.0，優選地，為pH5.9至pH6.9，更優選地，為pH6.0至pH6.5，進一步優選地，為pH6.0至pH6.2，最優選地，為pH6.1，但不限定於此。
本發明的特徵可以在於，所述劑型在冷藏例如在2℃至8℃下，優選地，在4℃至6℃下貯存約6個月時，形成小於3.0%，優選地，小於2.0%，更優選地，小於1.5%，例如0%至1.5%的凝集體，但不限定於此。
本發明的特徵可以在於，所述劑型用於皮下給藥或肌肉給藥。
本發明的特徵可以在於，所述劑型為注射用劑型。
本發明的特徵可以在於，所述劑型貯存在選自由瓶（bottle）、微管（microtube）、袋（bag）、小瓶（vial）、卡式瓶（cartridge）、注射器（injector）以及注射筒（syringe）組成的組中的容器中，但不限定於此。
本發明的特徵可以在於，例如，劑型貯存在選自由玻璃小瓶、玻璃卡式瓶、塑膠卡式瓶、載藥注射筒（prefilled syringe）、筆式注射器（pen injector）及自動注射器（autoinjector）組成的組中的容器，但不限定於此。
根據本發明的高濃度GX-H9藥物劑型可施用於缺乏生長激素的成人或小兒。根據本發明的高濃度GX-H9藥物劑型可通過各種方法給藥到物件體中。
在本發明中，所述物件體可以為哺乳動物，但不限定於此，優選地，所述物件體可以為人類。
例如，所述劑型可以腸胃外給藥，其例為皮下或肌肉內。
在本發明中，術語「藥物劑型」是指以使GX-H9的生物活性有效的形式含有GX-H9，並且劑型對給藥的受試者表現出毒性的成分不超過可接受的劑量的製劑。
「穩定的」劑型是指在儲存、貯存及流通時基本保留GX-H9的生理穩定性和/或化學穩定性和/或生物活性。在一方面，劑型在儲存時不僅基本保留生理穩定性及化學穩定性，還基本保留其的生物活性。儲存時間一般是基於劑型的所需貯存壽命來選擇。穩定性可在選定的時間段內、在選定的溫度下測定。例如，作為一方面，液體劑型在約25℃下穩定約2周至4周、至少約3個月、至少約6個月、至少約9個月、至少約12個月或至少約18個月。作為另一例，液體劑型在約5℃下穩定約2周至4周、至少約3個月、至少約6個月、至少約9個月、至少約12個月、至少約18個月、至少約24個月、至少約30個月或至少約36個月。
用於測定蛋白質穩定性的分析方法具有多種，參考了現有文獻（Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs.(1991)以及Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90(1993)）等。
液體劑型的穩定性在對包括二聚體、多聚體和/或凝聚物形成的評價（例如，尺寸排阻超高效液相層析（size exclusion ultra-high performance liquid chromatography，SE-UPLC）、尺寸排阻高效液相層析（size exclusion high performance liquid chromatography，SE-HPLC）、反相超高效液相層析（reversed-phase ultra-high performance liquid chromatography，RP-UPLC）、反相高效液相層析（reversed-phase high performance liquid chromatography，RP-HPLC）等液相層析法）、基質輔助雷射解析電離飛行時間質譜（matrix-assisted laser desorption-ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）、分析超離心、光散射（使用光子相關光譜法、動態光散射（dynamic light scattering，DLS）、靜態光散射、多角度雷射光散射（multi-angle laser light scattering，MALLS）、基於流動的顯微鏡成像、電子阻抗（庫爾特（coulter））計數儀、光阻斷或其他液體粒子測量系統，通過混濁度測量和/或通過視覺檢查）；陽離子交換層析（cation exchange chromatography，CEX）、等電聚焦（isoelectric focusing：IEF），例如使用毛細管方法（capillary technique，cIEF），或毛細管區帶電泳（capillary zone electrophoresis）評價電荷異質性；進行胺基末端或羧基末端序列分析；品質斑點肽映射（例如使用胰蛋白酶/LYS-C）分析；抗體的生物活性或抗原結合功能等評價的各種不同方法中定性和/或定量評價。
在本發明中，所述藥物劑型可為等張性劑型，「等張性」劑型基本上與人類血液具有相同的滲透壓。等張性劑型通常可能具有約250mOsm/kg至350mOsm/kg的滲透壓。等張性例如可使用水蒸汽壓或冰冷型滲透壓計測定。
在本發明中，「緩衝劑」是指在其的酸鹼共軛組合的作用下抵抗pH值變化的緩衝劑。在一些實施方式中，本發明的緩衝劑將劑型的pH調節為約5.0至約7.5、約5.8至約7.0、約6.0至約6.5或約6.0至約6.3的pH。在一方面，以單獨或組合的方式控制pH的緩衝劑的示例可包括醋酸（acetate）、琥珀酸（succinate）、葡糖酸（gluconate）、組胺酸（histidine）、檸檬酸（citrate）、磷酸（phosphate）、馬來酸（maleate）、二甲砷酸（cacodylate）、2-(N-嗎啡啉)乙磺酸（2-[N-morpholino]ethanesulfonic acid，MES）、雙(2-羥乙基)胺基(三羥甲基)甲烷(bis-tris)（bis(2-hydroxyethyl)iminotris[Hydroxymethyl]methane（bis-tris））、N-(2-乙醯胺基)-2-亞胺基二醋酸（N-[2-acetamido]-2-iminodiacetic acid，ADA）、甘胺醯甘胺酸（glycylglycine）或其他有機酸緩衝劑。
另一方面，在本發明中，緩衝劑可使用生物緩衝劑，即生物系統或其脈絡中使用的由現有技術公知的緩衝劑，例如，本發明中使用的緩衝液可為含無機鹽和有機鹽的混合緩衝液。
並且，可在本發明中使用的優選混合緩衝液是生物緩衝液，其可包含胺基酸。可在本發明中使用的優選胺基酸可以為選自由組胺酸、精胺酸以及麩胺酸組成的組中的一種以上，優選地，將組胺酸、精胺酸以及麩胺酸全部包含。
在本發明中，「表面活性劑」是指降低液體表面張力的促效劑。在一方面，表面活性劑可為非離子性表面活性劑。作為優選方式，本發明可將聚山梨醇酯80和泊洛沙姆188全部包含以作為表面活性劑，但不限於此。本發明中還可包含的表面活性劑的示例包括選自由聚山梨醇酯（聚氧乙烯山梨醇酐單月桂酸酯，例如，聚山梨醇酯20）；TRITON（三級辛基苯氧基聚乙氧基乙醇，非離子性清潔劑，位於密西根州米德蘭的陶氏化學公司的聯合碳化物（Union Carbide）子公司）；十二烷基硫酸納（sodium dodecyl sulfate:SDS）；月桂硫酸酯鈉；辛基葡糖苷鈉；月桂醯-、肉豆蔻醯-、亞油醯-或硬脂醯-磺基甜菜鹼；月桂醯-、肉豆蔻醯-、亞油醯-或硬脂醯糖苷；亞油醯-、肉豆蔻醯-或十六烷基甜菜鹼；月桂醯胺基丙基-、可哥醯胺基丙基-、亞油醯胺基丙基-、肉豆醯胺基丙基-、棕櫚醯丙基-、或異硬脂醯胺基丙基甜菜鹼（例如，月桂醯胺基丙基）；肉豆醯胺基丙基-、棕櫚醯丙基-、或異硬脂醯胺基丙基二甲胺；甲基環己基鈉-、或二甲基油醯基牛磺酸鈉；山梨醇酐單棕櫚酸酯；以及MONAQUAT系列（位元於新澤西州派特森的Mona Industries, Inc.）；聚乙二醇（polyethyl glycol，PEG）、聚丙二醇（PPG）及聚氧乙烯和聚氧丙烯二醇共聚物（例如，Pluronics/Poloxamer，PF68等）組成的組中的表面活性劑。
作為一實施方式，根據本發明的劑型進行滅菌，並且不包含防腐劑。在另一實施方式中，根據本發明的劑型可包含任意防腐劑，所述防腐劑可為不含對羥基苯甲酸酯類防腐劑。對羥基苯甲酸酯是一系列對羥基苯甲酸酯或對羥基苯甲酸的酯，眾所周知，這會引起細胞介素釋放和刺激，並且與多種類型的癌症有關。對羥基苯甲酸酯的示例包括對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯、對羥基苯甲酸丁酯、對羥基苯甲酸庚酯、對羥基苯甲酸異丁酯、異丙基對羥基苯甲酸酯、苄基對羥基苯甲酸酯及它們的鈉鹽。
示例性的不含對羥基苯甲酸酯防腐劑包括甲基苯酚（甲酚），例如3-甲基苯酚（間甲苯酚或間甲酚）、苯酚、苯乙醇、辛甘醇、苯氧基乙醇、山梨酸、山梨酸鉀、山梨酸鈉、山梨酸、苯甲酸鈉、苯甲酸、乙醯化甘露聚糖、橄欖苦甙、香芹酚、蔓越莓提取物、葡萄糖酸內酯、綠茶提取物、向日葵（Helianthus annuus）種子油、乳酸桿菌（Lactobacillus）發酵物、鬚松蘿（Usnea barbata）提取物、聚胺基丙基雙胍、聚甘油-3棕櫚酸酯、聚甘油-6辛酸酯、石榴提取物、歐洲山楊（Populus tremuloides）樹皮提取物、白藜蘆醇、迷迭香（Rosmarinus officinalis）葉提取物、苯甲醇、或它們的任意組合。
根據本發明的劑型還可包含抗氧化劑。「抗氧化劑」是指抑制其他分子的氧化促效劑，在本發明中，抗氧化劑的示例包括檸檬酸鹽、硫辛酸、尿酸、麩胱甘肽、生育酚、胡蘿蔔素、番茄紅素、半胱胺酸、膦酸酯化合物，例如，依替膦酸、去鐵胺及蘋果酸。
本發明中使用的GX-H9基本上可以是純的（即，無污染蛋白質等），基本上可以是同類。「基本上純的」GX-H9意味著基於藥物劑型中蛋白質的總重量包含至少約90重量%，可替代地包含至少約95重量%或97重量%。
GX-H9可包含「基本上同類」GX-H9，所述「基本上同類」GX-H9意味著具有與本發明中使用的GX-H9等同活性的變異。上述的基本上同類可意味著作為一方面與GX-H9胺基酸序列基本上相同，基本上相同的序列是指如下的序列，即，對準本發明的GX-H9胺基酸序列與任意其他序列以使最大限度地對應，當分析使用本領域中常規使用的演算法比對的序列時，表現至少90%的同源性，最優選地表現至少95%的同源性，表現96%以上、97%以上、98%以上、99%以上的同源性。
以下，通過實施例進一步詳細描述本發明。這些實施例僅用於舉例說明本發明，並且本發明的範圍不能解釋為受這些實施例的限制，這對於本領域普通技術人員而言是顯而易見的。
實施例 1 ． hGH-hyFc 的高濃度劑型 12 周穩定性評價
1-1 ．預實驗結果摘要
在對於hGH-hyFc（以下，與「GX-H9」混合標記）的高劑量劑型的預實驗中，與其他pH範圍相比，在pH6.0至6.5範圍內對溫度應激的抗聚集性更大。並且，與磷酸鹽緩衝劑相比，使用組胺酸緩衝劑時，可以確認到更高水準的穩定性。另一方面，在凍結/解凍、攪拌條件下，使用泊洛沙姆188和聚山梨醇酯80時可獲得高穩定性。
總體而言，確認SE-HPLC結果在pH6.1中表現出更高的穩定性，而RP-UPLC結果在含氯化鈉的pH6.5劑型中表現出更高的穩定性（資料未示出）。
1-2 ．實驗設計
以下進一步包含磷酸鹽緩衝液pH6.9劑型，對總共5個互不相同的劑型進行了溫度（-70℃、2℃至8℃、25℃、45℃）應激、凍結/解凍應激、輕微搖動應激的穩定性的評價。表1示出GX-H9和賦形劑濃度及種類的劑型條件。
表1
pH 濃度 (mg/mL) 10 mM 組胺酸 15 mM 磷酸鈉 精胺酸 (mM) 麩胺酸 (mM) 氯化鈉 (mM) 蔗糖% (w/v) 0.1% (w/v) 泊洛沙姆188
6.1 150 + 55 55 90 +
6.1 100 + 55 55 90 +
6.5 150 + 80 4 +
6.9 150 + 200 mM +
6.9 30 + 50 5 +
使用表1中提到的劑型條件（不包括泊洛沙姆（Poloxamer）188）的每個緩衝液對包含GX-H9的溶液進行了超濾（ultrafiltration，UF）/定容過濾（diafiltration，DF）。測定pH和電導率（conductivity）以確認緩衝液已充分達到平衡，然後濃縮至所需濃度，然後添加泊洛沙姆188以調整到目標濃度。
在無菌條件下，將製成每個劑型的GX-H9樣品通過0.2μm聚偏氟乙烯（polyvinylidene difluoride，PVDF）膜過濾之後，分配到預先滅菌的熱滅熱硼硅酸小瓶（depyrogenated borosilicate vials）中，蓋上蓋子後用鋁封口軋蓋（crimping）。接著，將每個小瓶置於穩定性試驗的應激條件下，在所需時間點上提取樣品並進行了穩定性評價（表2）。為了適當的分析，樣品的分取量根據需要稀釋使用，剩餘樣品保持在-70℃以用於備份測試。表2示出應激條件和分析項目的實驗條件。
表2
條件 取樣時間點 A280 nm, 試管 A330 nm, 稀釋 外觀 (liq) RP-UPLC SE-U/HPLC pH
-70 °C T=0 1 1 1 1 1 1
3天搖動應激(2-8 °C) 3天 1 1 1 1 1 1
5個迴圈凍結(-70°C) /解凍(環境) 1周 1 1 1 1 1 1
2-8 °C 1周 1 1 1 1 1 1
25 °C 1周 1 1 1 1 1 1
45 °C 1周 1 1 1 1 1 1
2-8 °C 3周 1 1 1 1 1 1
25 °C 3周 1 1 1 1 1 1
45°C 3周 1 1 1 1 1 1
-70 °C 6周 1 1 1 1 1 1
2-8 °C 6周 1 1 1 1 1 1
25 °C 6周 1 1 1 1 1 1
-70 °C 12周 1 1 1 1 1 1
2-8 °C 12周 1 1 1 1 1 1
25 °C 12周 1 1 1 1 1 1
1-3 ．濃度（ A280 ）、混濁度（ A330 ）、外觀及 pH 變化
確認了應激條件下的各個劑型的濃度、混濁度、通過肉眼觀察的外觀以及pH變化。
使用1.0mg/mL=1.04AU的吸光係數在280nm下通過吸光度測定確定了樣品的濃度。確認的最終蛋白質濃度相對於散射校正（（A280-A330）/ε280=校正的蛋白質濃度）。
在各種應激條件之後，樣品的蛋白質濃度、混濁度、外觀及pH的確認結果如表3和表4中所示。關於根據各種應激條件的蛋白質濃度、混濁度及pH，沒有觀察到明顯的差異。在各種應激條件下，所有劑型中均未觀察到可見的微粒。5×凍結/解凍或2-8℃下進行的3天搖動應激結果，在任何劑型中均未確認到能夠識別的分析性變化。
表3示出溫度應激後的濃度、混濁度、外觀及pH變化。
表3
樣品組成 GX-H9濃度(mg/mL)
混濁度(A330)-稀釋
視覺外觀*
量測的pH
t=0 -70 °C 2-8 °C 25 °C 45°C
t=6 數周 t=12 數周 t=1 周 t=3 數周 t=6 數周 t=12 數周 t=1 周 t=3 數周 t=6 數周 t=12 數周 t=1 周 t=3 數周
10 mM 組胺酸, 0.1% 泊洛沙姆188 55 mM 精胺酸, 55 mM 麩胺酸, 90 mM NaCl, pH 6.1 149.9 152.3 152 152 154.8 151.6 154.7 151.4 155.7 146.4 150.3 150.9 157
0.004 0.004 0.005 0.005 0.004 0.005 0.005 0.007 0.004 0.003 0.005 0.007 0.011
O, LY, NP O, LY, NP O, LY, NP O, LY, NP O, LY, NP O, LY, NP O, LY, NP O, LY, NP O, LY, NP O, LY, NP O, LY, NP O, LY, NP O, LY, NP
6.1 6.1 6 6.1 6 6.1 6 6.1 6.1 6.1 6 6.1 6.1
55 mM精胺酸, 55 mM麩胺酸, 90 mM NaCl, pH 6.1 105.3 103.6 104.9 106.2 107.1 103.4 104.1 105.3 107.6 102.1 104.4 106.5 101.9
0.003 0.003 0.003 0.004 0.003 0.003 0.003 0.005 0.003 0.003 0.004 0.006 0.006
O, LY, NP O, LY, NP O, LY, NP O, LY, NP O, LY, NP O, LY, NP O, LY, NP O, LY, NP O, LY, NP O, LY, NP O, LY, NP O, LY, NP O, LY, NP
6.1 6.1 6 6.1 6.1 6.1 6 6.1 6.1 6.1 6 6.1 6.1
80 mM NaCl, 4%蔗糖, pH 6.5 144.2 141.7 145.4 140.6 146.2 142.7 133.4 146.2 147.5 141.6 137.7 145.2 146.1
0.001 0.009 0.003 0.005 0.003 0.005 0.005 0.006 0.008 0.003 0.004 0.006 0.004
C, LY, NP C, LY, NP C, LY, NP C, LY, NP C, LY, NP C, LY, NP C, LY, NP C, LY, NP C, LY, NP C, LY, NP C, LY, NP C, LY, NP C, LY, NP
6.5 6.5 6.5 6.5 6.5 6.5 6.5 6.5 6.5 6.5 6.5 6.5 6.5
15 mM 磷酸鈉, 0.1%泊洛沙姆188 200 mM (6.8%) 蔗糖, pH 6.9 156.4 154.3 157.6 157.7 161.8 154.6 157.6 158.5 160.9 154.9 151.1 155.5 153
0.003 0.005 0.006 0.008 0.004 0.005 0.006 0.007 0.007 0.004 0.006 0.008 0.006
C, LY, NP C, LY, NP C, LY, NP C, LY, NP C, LY, NP C, LY, NP C, LY, NP C, LY, NP C, LY, NP C, LY, NP C, LY, NP C, LY, NP C, LY, NP
6.8 6.9 6.8 6.9 6.9 6.9 6.8 6.9 6.8 6.9 6.8 6.9 6.9
50 mM NaCl, 5%蔗糖, pH 6.9 30.7 30.4 31.1 30.5 32.5 30.4 30.6 30.5 31.3 30.8 31.1 30.3 31.9
0.005 0.005 0.005 0.007 0.003 0.003 0.005 0.006 0.004 0.004 0.006 0.005 0.006
C, NC, NP C, NC, NP C, NC, NP C, NC, NP C, NC, NP C, NC, NP C, NC, NP C, NC, NP C, NC, NP C, NC, NP C, NC, NP C, NC, NP C, NC, NP
6.8 6.8 6.8 6.8 6.8 6.8 6.8 6.8 6.8 6.8 6.8 6.9 6.8
*C= Clear; T=Turbid; O= Opalescent（translucent）; LY=Light Yellow; NC=No Color; NP=No Particles
表4示出凍結/解凍和搖動應激後的濃度、混濁度、外觀及pH變化。
表4
樣品組成 GX-H9濃度(mg/mL) 混濁度(A330) 視覺外觀* 量測的pH
t=0 F/T, 5x 搖動3天
10 mM組胺酸, 0.1%泊洛沙姆188 55 mM 精胺酸, 55 mM 麩胺酸, 90 mM NaCl, pH 6.1 149.9 0.004 O, LY, NP 6.1 149.8 0.004 O, LY, NP 6.1 152.0 0.004 O, LY, NP 6.1
55 mM 精胺酸, 55 mM麩胺酸, 90 mM NaCl, pH 6.1 105.3 0.003 O, LY, NP 6.1 103.2 0.002 O, LY, NP 6.1 104.3 0.003 O, LY, NP 6.1
80 mM NaCl, 4%蔗糖, pH 6.5 144.2 0.001 C, LY, NP 6.5 145.4 0.006 C, LY, NP 6.5 141.1 0.004 C, LY, NP 6.5
15 mM 磷酸鈉, 0.1%泊洛沙姆 188 200 mM (6.8%)蔗糖, pH 6.9 156.4 0.003 C, LY, NP 6.8 162.6 0.005 C, LY, NP 6.8 156.7 0.008 C, LY, NP 6.8
50 mM NaCl, 5%蔗糖, pH 6.9 30.7 0.005 C, NC, NP 6.8 31.1 0.003 C, NC, NP 6.8 30.6 0.005 C, NC, NP 6.8
*C= Clear; T=Turbid; O= Opalescent（translucent）; LY=Light Yellow; NC=No Color; NP=No Particles
在所有測試劑型中均實現了GX-H9的目標濃度，準備後對大部分的劑型顯示＜1%的散射水準。應激反應後，確認了樣品的蛋白質濃度、混濁度、外觀及pH，其結果，所有測試劑型中均未觀察到關於根據多種應激條件下的蛋白質濃度、混濁度及pH的明顯差異。
1-4 ． SE-UPLC
SE-UPLC（又稱凝膠過濾層析）根據大小分離蛋白質的分子構象。在該方法中，聚合物物種（例如，凝集體、IgG二聚體及寡聚體）比所需的（單體）IgG物種更早溶離為峰前（pre-peaks）。低分子物種（例如，降解產物和片段）隨後溶離為峰後（post-peaks）。
使用Waters Acquity UPLC BEH SEC、200A（4.6×300mm，1.7μm）和100mM的磷酸鈉、200mM的精胺酸-HCl、pH7.0、流動相進行SE-UPLC。
表5示出根據溫度應激的SE-UPLC結果。
表5
樣品組成 SE-UPLC (%純度) HMW 主峰 LMW
t=0 -70 °C 2-8 °C 25 °C 45°C
t=6 數周 t=12 數周 t=1 周 t=3 數周 t=6 數周 t=12 數周 t=1 周 t=3 數周 t=6 數周 t=12 數周 t=1 周 t=3 數周
10 mM組胺酸, 0.1%泊洛沙姆188 55 mM精胺酸, 55 mM麩胺酸, 90 mM NaCl, pH 6.1 0.9 93.7 5.4 0.8 91.8 7.4 0.9 91.6 7.5 1.1 93.2 5.7 1.0 91.6 7.4 1.4 90.6 8.0 1.8 89.6 8.6 1.7 92.2 6.1 2.1 89.5 8.4 2.9 86.5 10.5 4.1 83.4 12.5 7.9 85.8 6.3 13.1 77.8 9.1
55 mM精胺酸, 55 mM麩胺酸, 90 mM NaCl, pH 6.1 0.9 93.8 5.3 0.7 91.9 7.4 0.8 91.7 7.6 0.9 93.7 5.4 0.9 91.7 7.4 1.2 90.8 7.9 1.6 90.0 8.4 1.4 92.3 6.3 1.8 90.0 8.2 2.4 87.3 10.3 3.4 84.8 11.8 6.7 86.9 6.4 10.9 79.8 9.2
80 mM NaCl, 4%蔗糖, pH 6.5 0.8 93.9 5.3 0.8 91.9 7.3 0.8 91.7 7.6 1.1 93.5 5.3 1.3 91.2 7.5 1.6 90.3 8.2 1.8 89.2 9.1 2.0 92.2 5.9 2.7 88.6 8.7 3.5 86.0 10.5 4.6 82.1 13.3 8.1 85.1 6.8 13.1 76.7 10.2
15 mM磷酸鈉, 0.1%泊洛沙姆188 200 mM (6.8%)蔗糖, pH 6.9 1.1 93.4 5.4 1.0 91.8 7.3 1.0 91.4 7.6 1.5 92.9 5.6 1.6 90.4 7.9 2.0 89.2 8.8 2.2 87.5 10.2 2.5 90.7 6.8 3.4 85.8 10.8 4.4 80.8 14.8 5.5 74.5 20.0 8.7 82.8 8.5 13.7 72.8 13.5
50 mM NaCl, 5%蔗糖, pH 6.9 0.7 93.9 5.3 0.7 92.1 7.2 0.6 91.8 7.6 0.9 93.7 5.4 1.0 91.2 7.8 1.2 90.3 8.5 1.3 89.2 9.5 1.2 93.1 5.7 1.7 88.2 10.1 2.1 83.6 14.2 2.6 78.6 18.7 3.5 87.8 8.6 5.9 79.2 14.8
表6示出根據凍結/解凍和搖動應激的SE-UPLC結果。
表6
樣品組成 SE-UPLC (%純度) HMW 主峰 LMW
t=0 F/T, 5x 搖動3天
10 mM 組胺酸, 0.1%泊洛沙姆188 55 mM 精胺酸, 55 mM 麩胺酸, 90 mM NaCl, pH 6.1 0.9 93.7 5.4 0.7 92.1 7.2 1.2 93.5 5.4
55 mM精胺酸, 55 mM麩胺酸, 90 mM NaCl, pH 6.1 0.9 93.8 5.3 0.7 92.1 7.2 1.0 93.6 5.4
80 mM NaCl, 4%蔗糖, pH 6.5 0.8 93.9 5.3 0.8 91.9 7.3 1.0 93.6 5.4
15 mM 磷酸鈉, 0.1% 泊洛沙姆188 200 mM (6.8%) 蔗糖, pH 6.9 1.1 93.4 5.4 1.1 91.6 7.3 1.1 93.5 5.4
50 mM NaCl, 5%蔗糖, pH 6.9 0.7 93.9 5.3 0.7 92.0 7.3 0.8 93.8 5.4
樣品在-70℃、2-8℃、25℃及45℃下貯存12周的SE-UPLC結果，如表5及表6所示，聚合物物種和低分子物種均有所增加。穩定性終點比較結果示出，與更高的pH相比，在pH6.1時GX-H9穩定性更高。另一方面，在相同的pH6.1劑型中，100mg/mL劑型比150mg/mL劑型更加穩定。當暴露於凍結/解凍和2-8℃搖動應激時，所有測試劑型之間均未觀察到可識別的趨勢，其原因是結果資料在t=0結果和檢驗變異性內相似（表5及表6）。
1-5 ． RP-UPLC
RP-UPLC根據疏水性的差異分離分子。分離根據對於固定相的固定疏水性配體的流動相的溶質結合而不同。洗脫通常以分子疏水性增加的順序通過有機溶劑的流動相的疏水性變化進行。與Waters Acquity UPLC Protein BEH300 C4柱（2.1×150mm）一起使用在220nm處監測的UV檢測器（A220）和安裝有整合式軟體（Chromeleon 7.2）的超高效液相層析系統（Waters Acquity H-Class UPLC）進行了溶劑梯度分離。
表7示出根據溫度應激的RP-UPLC結果。
表7
樣品組成 RP-UPLC (%純度) 親水性1 親水性2 親水性3 主峰 主峰肩 疏水性1
t=0 -70 °C 2-8 °C 25 °C 45°C
t=6 數周 t=12 數周 t=1 周 t=3 數周 t=6 數周 t=12 數周 t=1 周 t=3 數周 t=6 數周 t=12 數周 t=1 周 t=3 數周
10 mM組胺酸, 0.1%泊洛沙姆188 55 mM 精胺酸, 55 mM 麩胺酸, 90 mM NaCl, pH 6.1 1.81 0.85 2.33 94.10 n.a. 0.91 1.86 0.89 2.88 93.45 n.a. 0.91 1.89 0.67 2.61 93.68 n.a. 1.15 1.89 0.86 2.35 93.99 n.a. 0.91 2.09 0.80 2.43 93.77 n.a. 0.91 2.29 0.88 2.84 93.06 n.a. 0.93 2.76 0.67 2.54 91.64 1.23 1.17 2.21 0.84 2.30 93.75 n.a. 0.91 3.06 0.87 2.32 90.28 2.56 0.90 4.14 1.08 2.22 87.53 4.16 0.87 6.05 1.29 2.26 86.19 3.15 1.06 2.72 0.81 3.07 92.40 n.a. 0.99 4.29 1.71 4.50 82.84 5.55 1.12
55 mM 精胺酸, 55 mM 麩胺酸, 90 mM NaCl,  pH 6.1 1.81 0.86 2.35 94.07 n.a. 0.91 1.84 0.90 2.89 93.45 n.a. 0.92 1.89 0.67 2.62 93.65 n.a. 1.16 1.86 0.84 2.35 94.02 n.a. 0.92 2.04 0.8 2.43 93.80 n.a. 0.92 2.22 0.89 2.85 93.11 n.a. 0.94 2.62 0.67 2.54 91.71 1.28 1.17 2.14 0.84 2.30 93.80 n.a. 0.91 2.89 0.87 2.32 90.71 2.29 0.91 3.83 1.06 2.24 87.97 4.03 0.88 5.55 1.26 2.29 86.92 2.94 1.04 2.64 0.77 3.06 92.57 n.a. 0.97 4.17 1.63 4.39 83.67 5.04 1.10
80 mM NaCl, 4%蔗糖, pH 6.5 1.87 0.88 2.30 94.04 n.a. 0.91 1.91 0.90 2.86 93.40 n.a. 0.93 1.93 0.66 2.59 93.62 n.a. 1.19 1.99 0.87 2.31 93.91 n.a. 0.92 2.31 0.81 2.40 93.56 n.a. 0.93 2.65 0.89 2.83 90.17 2.54 0.92 3.35 0.66 2.51 90.75 1.53 1.19 2.37 0.84 2.29 93.59 n.a. 0.92 3.32 0.83 2.31 89.83 2.82 0.89 4.57 0.95 2.25 86.84 4.52 0.87 6.60 1.06 2.24 85.86 3.16 1.08 2.95 0.78 3.18 88.49 3.67 0.94 4.83 1.53 4.42 82.52 5.71 0.99
15 mM磷酸鈉, 0.1%泊洛沙姆188 200 mM (6.8%) 蔗糖, pH 6.9 1.90 0.86 2.30 94.02 n.a. 0.92 1.94 0.89 2.86 93.37 n.a. 0.94 1.99 0.70 2.60 93.47 n.a. 1.25 2.10 0.87 2.31 93.80 n.a. 0.93 2.57 0.81 2.38 91.45 1.87 0.93 3.13 0.89 2.88 89.12 3.06 0.92 4.27 0.70 2.52 89.31 1.94 1.26 3.00 0.85 2.25 90.20 2.80 0.91 5.00 0.83 2.28 87.06 3.95 0.87 7.40 0.96 2.95 81.20 6.66 0.83 11.37 1.10 2.15 79.30 5.00 1.08 3.97 0.76 3.30 86.07 5.02 0.87 6.61 1.55 4.95 78.57 7.43 0.89
50 mM NaCl, 5%蔗糖, pH 6.9 1.87 0.88 2.31 94.02 n.a. 0.93 1.91 0.90 2.87 93.38 n.a. 0.94 1.96 0.69 2.62 93.48 n.a. 1.24 2.02 0.88 2.30 93.88 n.a. 0.92 2.42 0.85 2.36 91.69 1.76 0.93 2.89 0.89 2.84 89.70 2.76 0.92 3.89 0.70 2.54 89.75 1.88 1.23 3.01 0.84 2.26 90.48 2.51 0.89 4.54 0.83 2.31 87.94 3.51 0.88 6.70 0.94 3.03 82.76 5.72 0.84 10.20 1.05 2.19 80.61 4.91 1.05 3.73 0.71 3.68 87.38 3.65 0.84 6.81 1.51 5.54 74.99 10.35 0.81
表8示出根據凍結/解凍和搖動應激的RP-UPLC結果。
表8
樣品組成 RP-UPLC (%純度) 親水性1 親水性2 親水性3 主峰 主峰肩 疏水性1
t=0 F/T, 5x 搖動3天
10 mM 組胺酸, 0.1%泊洛沙姆188 55 mM精胺酸, 55 mM麩胺酸, 90 mM NaCl, pH 6.1 1.81 0.85 2.33 94.10 n.a. 0.91 1.87 0.81 2.44 93.97 n.a. 0.92 1.86 0.85 2.35 94.02 n.a. 0.92
55 mM精胺酸, 55 mM麩胺酸, 90 mM NaCl, pH 6.1 1.81 0.86 2.35 94.07 n.a. 0.91 1.87 0.80 2.45 93.96 n.a. 0.92 1.83 0.87 2.33 94.04 n.a. 0.93
80 mM NaCl, 4%蔗糖, pH 6.5 1.87 0.88 2.30 94.04 n.a. 0.91 1.94 0.81 2.42 93.91 n.a. 0.92 1.92 0.88 2.31 93.98 n.a. 0.91
15 mM 磷酸鈉, 0.1%泊洛沙姆188 200 mM (6.8%)蔗糖, pH 6.9 1.90 0.86 2.30 94.02 n.a. 0.92 1.98 0.80 2.40 93.88 n.a. 0.93 2.00 0.88 2.31 93.88 n.a. 0.93
50 mM NaCl, 5%蔗糖, pH 6.9 1.87 0.88 2.31 94.02 n.a. 0.93 1.95 0.81 2.42 93.90 n.a. 0.93 1.95 0.88 2.32 93.93 n.a. 0.93
樣品在-70℃、2-8℃、25℃下貯存12周或在45℃下貯存3周的RP-UPLC，其結果，含有精胺酸和麩胺酸的pH6.1劑型與其他高pH劑型比較時示出更優異的穩定性。當暴露於凍結/解凍和2-8℃搖動應激時，所有測試劑型之間均未觀察到可識別的趨勢，其原因是結果資料在t=0結果和檢驗變異性內相似（表7及表8）。
實施例 2 ．根據有無聚山梨醇酯 80 的 hGH-hyFc 劑型穩定性評價
通過實施例1選定為最佳劑型的10mM的組胺酸（Histidine）、0.1%（w/v）的泊洛沙姆188（Poloxamer 188）、55mM的精胺酸（Arginine）、55mM的麩胺酸（Glutamic acid）、90mM的NaCl，在pH6.1條件下也表現出不溶性異物生成和微粒增加趨勢，GX-H9的hGH具有大量疏水性補丁（hydrophobic patch），因此蛋白質本身可形成因疏水性相互作用而形成的凝集體，並且DP容器內氣體/油/固體表面等中吸附有蛋白質，因此形成一種蛋白質膜，因該蛋白質膜脫離而形成的補丁可形成凝集體以作為不溶性粒子，鑒於這些，為了開發出能夠防止形成如上所述的凝集體的劑型，試圖確認在同時添加泊洛沙姆188和聚山梨醇酯80以作為表面活性劑的液體劑型中的凝集體的形成的顯著改善。
與僅使用泊洛沙姆188的情況相比，聯合使用泊洛沙姆188和聚山梨醇酯80時，基於更好地阻礙不溶性異物和微粒的產生的結果，在4種包含60mg/mL的hGH-hyFc的劑型組合物中將泊洛沙姆188的濃度固定為0.10%（w/v），添加0.03%（w/v）的聚山梨醇酯80，對共8種劑型進行了外觀、微粒分析、SE-UPLC、RP-HPLC（reversed-phase high performance liquid chromatography）分析。
2-1 ．外觀分析（不溶性異物肉眼試驗）
使用hGH-hyFc原液（Drug Substance，DS）配製各種劑型組合物，在生物安全櫃（Biosafety cabinet）中用0.22μm的PES過濾器過濾之後，在玻璃小瓶中分裝約0.8mL，以確保不含外源灰塵等。取出正在貯存在冷藏（5℃）和室溫（25℃）下的樣品容器，使之適應室溫約30分鐘，然後在異物檢測臺上用酒精等擦拭乾淨容器外部表面，然後直接用肉眼觀察容器，確認是否存在不溶性異物6個月。
其結果，如圖1所示，確認了冷藏（5℃）貯存時，在包含聚山梨醇酯80的條件下，6個月期間未產生不溶性異物，但在不包含聚山梨醇酯80的條件下，冷藏6個月期間，10個樣品之中相當數量的樣品中產生了不溶性異物。另一方面，室溫（25℃）貯存時，在包含聚山梨醇酯80的條件下，與不包含其的條件相比，大體上顯示阻礙不溶性異物生成。特別是，候選（Candidate）#1和候選（Candidate）#4在3個月內未產生不溶性異物。然而，在不包含聚山梨醇酯80的劑型條件下，在室溫下貯存6個月期間，所有小瓶中都確認了不溶性異物的生成。
2-2 ．微粒（ Sub-visible particle ）分析
將樣品按照各個條件各取1mL於玻璃小瓶中備用，委託外部單位（KBIO,劑型技術支持組），使用Microflow Imaging設備（MFI 5200，Proteinsimple）和MFI View System Software（MVSS）Version 2-R4.1.0.40.4816、MFI View Analysis Suite（MVAS）Version 1.4.0進行了微粒分析。
其結果，如圖2所示，冷藏（5℃）貯存6個月期間，觀察到包含聚山梨醇酯80的候選#1、#2、#4及#6很好地阻礙微粒的產生。關於微粒的產生，可知，冷藏和室溫中均在不同時包含聚山梨醇酯80的劑型中產生很高的微粒。
2-3 ． SE-UPLC 分析
使用ACQUITY UPLC Protein BEH200（4.6*300 mm）（Waters，186005226）柱，使100mM sodium phosphate（pH7.0）、200mM Arginine-HCl、流動相溶液以0.25mL/分鐘的速度流動，按照各個條件，將樣品注入10μg，在吸光度280nm下確認了GX-H9蛋白質的峰值。
其結果，如圖3所示，在冷藏（5℃）貯存及室溫（25℃）貯存6個月中確認了候選#2、#3及#5的純度優異。特別是，在包含聚山梨醇酯80的劑型中，候選#2的純度最優異。在作為不包含聚山梨醇酯80的劑型的候選#3、#5的情況下，與候選#2相比，確認了冷藏貯存6個月中的純度相似，但在室溫貯存6個月中純度相對低。
2-4 ． RP-HPLC
使用Proteonavi C4 300Å 5μm（Shiseido，80205）柱，以0.5mL/分鐘的速度以及表9的梯度條件，使0.05% Trifluoroacetic acid（TFA）in Water（MPA）、0.05% Trifluoroacetic acid（TFA）in Acetonitrile（MPB）流動相溶液流動，注入20μg的樣品以在吸光度220nm下確認了GX-H9蛋白質的峰值。
表9
梯度
時間 流量 % MPA % MPB
最初 0.5 49.0 51.0
30.0 0.5 30.0 70.0
30.5 0.5 0.0 100.0
31.0 0.5 49.0 51.0
40.0 0.5 49.0 51.0
其結果，如圖4所示，在冷藏（5℃）貯存6個月中，所有劑型之間純度相似，但在室溫（25℃）貯存6個月中，候選#4表現出相對最優異的純度。
實施例 3 ．根據聚山梨醇酯 80 含量的 hGH-hyFc 劑型穩定性評價
在綜合實施例2來判斷為最合適的劑型的候選#2中，改變聚山梨醇酯80的濃度並以與實施例2相同的實驗方法進行了hGH-hyFc的劑型穩定性（外觀分析、微粒分析、SE-UPLC分析、RP-HPLC分析）。
其結果確認，在外觀分析中，進一步含有0.07%（w/v）以上的聚山梨醇酯80的劑型適合在室溫（25℃）下貯存3個月以上（圖5）。並且，在微粒分析中，在0.03%（w/v）至0.15%（w/v）的聚山梨醇酯80濃度範圍內確認了大體相似的微粒（圖6）。在SE-UPLC、RP-HPLC結果中，冷藏（5℃）貯存時，不存在根據聚山梨醇酯80的濃度的顯著差異，在SE-UPLC結果中，室溫貯存時，當聚山梨醇酯80的濃度為0.10%（w/v）以上時，純度下降，在RP-HPLC結果中，室溫貯存時，根據聚山梨醇酯80的濃度的純度之差並不大（圖7）。
實施例 4 ．高劑量 hGH-hyFc 劑型穩定性評價
綜合所述實施例，（i）將聚山梨醇酯80固定為0.07%（w/v），將hGH-hyFc分別處理為60mg/mL、80mg/mL、100mg/mL、120mg/mL並貯存在玻璃卡式瓶中時，（ii）將hGH-hyFc固定為120mg/ml，並將聚山梨醇酯80分別處理為0.03%（w/v）、0.05%（w/v）、0.07%（w/v）、0.10%（w/v）、0.15%（w/v）以貯存在玻璃卡式瓶中時，（iii）將hGH-hyFc固定為60mg/ml以及聚山梨醇酯80的0.07%（w/v），並分別處理間甲酚（m-cresol）、苯酚（phenol）或苄醇（benzyl alcohol）的防腐劑，貯存在玻璃小瓶中，試圖通過根據冷藏（5℃）和室溫（25℃）貯存的外觀分析，確認是否觀察到不溶性異物，確認純度變化以評價劑型穩定性。
4-1 ．外觀分析（不溶性異物肉眼試驗）
使用hGH-hyFc原液（DS）配製各種劑型組合物，在生物安全櫃（Biosafety cabinet）中用0.22μm的PES過濾器過濾之後，在玻璃小瓶中分裝約1.0mL，以確保不含外源灰塵等。取出正在貯存在冷藏（5℃）和室溫（25℃）下的樣品容器，使之適應室溫約30分鐘，然後在異物檢測臺上用酒精等擦拭乾淨容器外部表面，然後直接用肉眼觀察容器，確認是否存在不溶性異物6個月。
其結果，（i）將聚山梨醇酯80固定為0.07%（w/v），將hGH-hyFc處理為60-100mg/mL並貯存在玻璃卡式瓶中時，確認了在冷藏和室溫下6個月期間不產生不溶性異物，（ii）將hGH-hyFc固定為120mg/ml，並將聚山梨醇酯80分別處理為0.05-0.15%（w/v）並貯存在玻璃卡式瓶中時，確認了在冷藏和室溫下6個月期間不產生不溶性異物，（iii）將hGH-hyFc固定為60mg/ml以及將聚山梨醇酯80固定為0.07%（w/v），並將1mg/mL的苯酚用防腐劑處理以貯存在玻璃小瓶中時，確認了在冷藏和室溫下6個月期間不產生不溶性異物（圖8）。
4-2 ． SE-UPLC 和 RP-HPLC 分析
從玻璃卡式瓶或玻璃小瓶取根據各個條件的樣品，用流動相緩衝液和劑型緩衝液稀釋為2mg/mL，然後用0.22μm的醋酸纖維素離心管篩檢程序過濾，然後放入LC小瓶中以進行了SE-UPLC或RP-HPLC分析。
對於SE-UPLC，使用ACQUITY UPLC Protein BEH200（4.6*300mm）（Waters，186005226）柱，以0.25mL/分鐘的速度使100mM的磷酸鈉（sodium phosphate，pH7.0）、200mM的精胺酸-鹽酸（Arginine-HCl）及流動相溶液流動，注入10μg，在吸光度280nm下確認了GX-H9蛋白質的峰值。
對於RP-HPLC，使用Proteonavi C4 300Å 5μm（Shiseido，80205）柱，以0.5mL/分鐘的速度及表9的梯度條件，使於水中為0.05%的三氟乙酸（Trifluoroacetic acid，TFA）（MPA）、於乙腈（Acetonitrile）中為0.05%的三氟乙酸（Trifluoroacetic acid，TFA）（MPB）流動相溶液流動，注入20μg的樣品，在吸光度220nm下確認了GX-H9蛋白質的峰值。
其結果，（i）在將聚山梨醇酯80固定為0.07%（w/v），將hGH-hyFc處理為60-120mg/ml並貯存在玻璃卡式瓶中時，SE-UPLC中，冷藏（5℃）貯存時，hGH-hyFc劑量60mg/mL與120mg/mL之間純度之差確認為微小的0.5%，但在室溫（25℃）貯存時，hGH-hyFc劑量60mg/mL與120mg/mL之間純度之差確認為3.6%。另一方面，室溫貯存時，hGH-hyFc劑量60mg/mL與120mg/mL之間的RP-HPLC的純度之差為微小的0.8%（圖9a）。
（ii）將hGH-hyFc固定為120mg/ml，將聚山梨醇酯80分別處理為0.03-0.15%（w/v）並貯存在玻璃卡式瓶中時，冷藏貯存時，聚山梨醇酯80濃度0.03%（w/v）與0.15%（w/v）之間不存在純度之差，室溫貯存時，聚山梨醇酯80濃度0.03%（w/v）與0.15%（w/v）之差也微小（圖9b）。
（iii）將hGH-hyFc固定為60mg/ml以及固定為聚山梨醇酯80的0.07%（w/v），分別處理間甲酚（m-cresol）、苯酚（phenol）或苯甲醇（benzyl alcohol）的防腐劑並貯存在玻璃卡式瓶中時，SE-UPLC的結果中，含1mg/ml苯酚的條件下純度減少最少，RP-HPLC結果中，所有防腐劑中，純度上未出現顯著差異（圖9c）。
以上，詳細描述了本發明內容的特定部分，對於本領域的具有通常知識者而言清楚的是，這種具體描述僅為優選實施方式，因此本發明的範圍並不受其限制。因此，本發明的實質性範圍將由附加的申請專利範圍及其的等價物來定義。
無
圖1是為了評價GX-H9的各種劑型中根據是否添加聚山梨醇酯80的劑型穩定性而進行外觀分析（不溶性異物肉眼試驗）的結果。
圖2是為了評價GX-H9的各種劑型中根據是否添加聚山梨醇酯80的劑型穩定性而分析微粒（不溶性微粒）的結果。
圖3是為了評價GX-H9的各種劑型中根據是否添加聚山梨醇酯80的劑型穩定性而進行SE-UPLC分析的結果。
圖4是為了評價GX-H9的各種劑型中根據是否添加聚山梨醇酯80的劑型穩定性而進行RP-HPLC分析的結果。
圖5是為了評價GX-H9劑型中根據聚山梨醇酯80濃度的劑型穩定性而進行外觀分析（不溶性異物肉眼試驗）的結果。
圖6是為了評價GX-H9劑型中根據聚山梨醇酯80濃度的劑型穩定性而進行微粒分析的結果。
圖7是為了評價GX-H9劑型中根據聚山梨醇酯80濃度的劑型穩定性而進行純度（SE-UPLC、RP-HPLC）分析的結果。
圖8是為了評價在各種GX-H9濃度、聚山梨醇酯80濃度、防腐劑條件下劑型穩定性而進行外觀分析（不溶性異物肉眼試驗）的結果。
圖9a是為了評價在各種GX-H9濃度條件下劑型穩定性而進行的純度（SE-UPLC，RP-HPLC）分析的結果。
圖9b是為了評價在各種聚山梨醇酯80濃度條件下GX-H9劑型穩定性而進行的純度（SE-UPLC、RP-HPLC）分析的結果。
圖9c是為了評價根據各種防腐劑處理的GX-H9劑型穩定性而進行的純度（SE-UPLC RP-HPLC）分析的結果。
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Claims (21)

  1. 一種液體藥物劑型，包含：人生長激素（hGH）融合蛋白、泊洛沙姆188以及聚山梨醇酯80。
  2. 如請求項1所述之液體藥物劑型，其中，所述hGH融合蛋白包含hGH和免疫球蛋白Fc多肽。
  3. 如請求項2所述之液體藥物劑型，其中，所述hGH具有SEQ ID NO: 2的胺基酸序列。
  4. 如請求項2所述之液體藥物劑型，其中，所述免疫球蛋白Fc多肽具有SEQ ID NO: 3的胺基酸序列。
  5. 如請求項1所述之液體藥物劑型，其中，所述hGH融合蛋白具有SEQ ID NO: 1的胺基酸序列。
  6. 如請求項1所述之液體藥物劑型，其中，所述液體藥物劑型包含30mg/mL至150mg/mL的hGH融合蛋白。
  7. 如請求項1所述之液體藥物劑型，其中，所述液體藥物劑型包含0.01%至0.2%（w/v）泊洛沙姆188。
  8. 如請求項1所述之液體藥物劑型，其中，所述液體藥物劑型包含0.01%至0.2%（w/v）聚山梨醇酯80。
  9. 如請求項1所述之液體藥物劑型，其中，所述液體藥物劑型更包含選自由組胺酸、精胺酸、麩胺酸以及氯化鈉組成的組中的一種以上的賦形劑。
  10. 如請求項1所述之液體藥物劑型，其中，所述液體藥物劑型更包含防腐劑。
  11. 如請求項10所述之液體藥物劑型，其中，所述防腐劑為選自由間甲酚、苯酚以及苯甲醇組成的組中的一種以上。
  12. 如請求項11所述之液體藥物劑型，其中，所述防腐劑為1mg/mL至2mg/mL的苯酚。
  13. 如請求項9所述之液體藥物劑型，其中，所述液體藥物劑型包含1mM至20mM的組胺酸。
  14. 如請求項9所述之液體藥物劑型，其中，所述液體藥物劑型包含40mM至70mM的精胺酸。
  15. 如請求項9所述之液體藥物劑型，其中，所述液體藥物劑型包含40mM至70mM的麩胺酸。
  16. 如請求項9所述之液體藥物劑型，其中，所述液體藥物劑型包含80mM至100mM的氯化鈉。
  17. 如請求項1所述之液體藥物劑型，其中，所述液體藥物劑型為pH5.5至pH7.0。
  18. 如請求項17所述之液體藥物劑型，其中，所述液體藥物劑型為pH6.0至pH6.2。
  19. 如請求項1所述之液體藥物劑型，其中，所述液體藥物劑型在冷藏貯存6個月時形成小於1.5%的凝集體。
  20. 如請求項1所述之液體藥物劑型，其中，所述液體藥物劑型用於皮下給藥或肌肉給藥。
  21. 如請求項1所述之液體藥物劑型，其中，所述液體藥物劑型貯存在選自由瓶、微管、袋、小瓶、卡式瓶、注射器以及注射筒組成的組中的容器中。
TW111145284A 2021-11-26 2022-11-25 hGH融合蛋白的高濃度給藥劑型 TW202320839A (zh)

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