TW202317150A - 用於偵測寡核苷酸雙螺旋體中之有義股及反義股之方法 - Google Patents

用於偵測寡核苷酸雙螺旋體中之有義股及反義股之方法 Download PDF

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Abstract

本發明描述一種用於偵測樣本中之寡核苷酸之方法，且特定言之係關於一種用於偵測樣本中之寡核苷酸雙螺旋體之有義股及反義股的方法。

Description

用於偵測寡核苷酸雙螺旋體中之有義股及反義股之方法
本揭示案係關於一種用於偵測或定量樣本中之寡核苷酸之方法，且特定言之係關於一種用於偵測或定量寡核苷酸雙螺旋體之有義股及反義股之方法。
基於核酸之治療劑構成一類有前景的用於藥物療法之候選物，尤其用於習知治療劑（諸如小分子、基於蛋白質或抗體之治療劑）無法獲得的生物目標。基於核酸之治療劑包含抑制DNA或RNA表現以例如減少或預防產生與疾病相關之異常蛋白質的單股或雙股寡核苷酸分子。若干基於核酸之治療劑已經美國食品與藥物管理局（U.S. Food and Drug Administration）批准且更多正在用於治療各種疾病之臨床試驗中進行研究。
核酸為身體中高度帶電、迅速降解及清除之大分子，其可產生較差的藥理學特性。Stoddard等人（2018） 「社論：核酸研究及核酸治療劑（Editorial: Nucleic Acids Research and Nucleic Acid Therapeutics）」《核酸研究（ Nuc. Acids Res. ）》46(4):1563-1564。因此，在研發基於核酸之治療劑時，藥物動力學、組織靶向及組織聚積皆為重要考慮因素。需要高度敏感及定量的分析以表徵核酸藥物動力學。Thayer等人（2020）「POE免疫分析：用於定量生物基質中之核酸的基於培養盤的寡核苷酸電化學發光免疫分析（POE Immunoassay: Plate-based oligonucleotide electrochemiluminescent immunoassay for the quantification of nucleic acids in biological matrices.）」 《科學報告（ Scientific Reports. ）》10(1):10425（doi.org/10.1038/s41598-020-66829-6）。
儘管存在各種基於聚合酶鏈反應（PCR）、尺寸排阻層析（SEC）及液相層析-質譜（LC-MS）之方法來表徵核酸治療劑，但此等方法受分析敏感度及耗時的萃取步驟限制。 同上。寡核苷酸治療劑之獨特生物物理學特性可引起非典型性吸收、分佈、代謝及消除（ADME）過程，以及藥物動力學-藥效動力學（PKPD）解偶聯。難以理解此等關係可導致整個藥物研發過程之低效率，包含動物使用率增加，且可導致人類試驗中之風險增加。 同上。寡核苷酸治療劑之兩個股的定量對於理解寡核苷酸治療劑之穩定性及代謝路徑及研發用以闡明治療劑之藥理學之模型而言可為重要的。 同上。
因此，仍需要用於偵測或定量例如獲自患者之樣本中之寡核苷酸治療劑的敏感分析。
本文描述一種偵測或定量樣本中之寡核苷酸雙螺旋體之有義股及反義股的方法。在一個態樣中，該方法包含： （a）   使該樣本與包含一組探針之組合物接觸，其中該組探針包含： （i）    有義探針，其包含與固定於載體表面上之第一捕獲寡核苷酸之至少一部分互補的第一單股寡核苷酸標籤、能夠與該寡核苷酸雙螺旋體之該有義股之核苷酸序列雜交的有義結合部分，及第一標記；及 （ii）   反義探針，其包含與固定於該載體表面上之第二捕獲寡核苷酸之至少一部分互補的第二單股寡核苷酸標籤、能夠與該寡核苷酸雙螺旋體之該反義股之核苷酸序列雜交的反義結合部分，及第二標記， 其中該有義探針之該有義結合部分具有比該有義股之有義股長度短的有義結合長度，且 其中該反義股之該反義結合部分具有比該反義股之反義股長度短的反義結合長度；及 （b）   將該等探針與該樣本一起培育以形成含有雜交複合物之雜交混合物，該等雜交複合物包括： （i）    有義複合物，其包括與該寡核苷酸雙螺旋體之該有義股雜交的該有義探針；及 （ii）   反義複合物，其包括與該寡核苷酸雙螺旋體之該反義股雜交的該反義探針； （c）   在該等雜交複合物之該等第一及第二寡核苷酸標籤與固定於該載體表面上之該等第一及第二捕獲寡核苷酸雜交的條件下，使該載體表面與該雜交混合物接觸；及使該雜交混合物與單股特異性核酸酶接觸；及 （d）   基於該載體表面上之存在標記來偵測或定量該寡核苷酸雙螺旋體之該有義股及該反義股。
在一個態樣中，（c）包含： （i）    在該等雜交複合物之該等第一及第二寡核苷酸標籤與該載體表面上之該等第一及第二捕獲寡核苷酸雜交以將該等雜交複合物固定於該載體表面上的條件下，使該載體表面與該雜交混合物接觸；及 （ii）   使經固定之雜交複合物與單股特異性核酸酶接觸。 在一個態樣中，（c）包含： （i）    使該雜交混合物與單股特異性核酸酶接觸以形成反應混合物；及 （ii）   在該等有義及反義探針之該等第一及第二寡核苷酸標籤與固定於該載體表面上之該等第一及第二捕獲寡核苷酸雜交的條件下，使該載體表面與（i）之該反應混合物接觸。
在一個態樣中，反義探針之寡核苷酸標籤與固定於載體表面上之捕獲寡核苷酸雜交。在一個態樣中，作為反義複合物之一部分的反義探針之寡核苷酸標籤與固定於載體表面上之捕獲寡核苷酸雜交。在一個態樣中，反義探針之寡核苷酸標籤不為反義複合物之一部分。在一個態樣中，反義探針之寡核苷酸標籤為雜交複合物之一部分。在一個態樣中，雜交複合物不包含寡核苷酸雙螺旋體之反義股。在一個態樣中，雜交複合物為探針-探針複合物。在一個態樣中，探針-探針複合物包含單股突出端。
在一個態樣中，有義探針之寡核苷酸標籤與固定於載體表面上之捕獲寡核苷酸雜交。在一個態樣中，作為有義複合物之一部分的有義探針之寡核苷酸標籤與固定於載體表面上之捕獲寡核苷酸雜交。在一個態樣中，有義探針之寡核苷酸標籤不為有義複合物之一部分。在一個態樣中，有義探針之寡核苷酸標籤為雜交複合物之一部分。在一個態樣中，雜交複合物不包含寡核苷酸雙螺旋體之有義股。在一個態樣中，雜交複合物為探針-探針複合物。在一個態樣中，探針-探針複合物包含單股突出端。
在一個態樣中，寡核苷酸雙螺旋體之有義股及反義股各自分別包含約8至約50個核苷酸。在一個態樣中，寡核苷酸雙螺旋體之有義股及反義股各自分別包含約16至約30個核苷酸。
在一個態樣中，寡核苷酸雙螺旋體之有義股包含DNA。在一個態樣中，寡核苷酸雙螺旋體之有義股包含RNA。在一個態樣中，寡核苷酸雙螺旋體之反義股包含DNA。在一個態樣中，寡核苷酸雙螺旋體之反義股包含RNA。
在一個態樣中，寡核苷酸雙螺旋體包含DNA/DNA雙螺旋體。在一個態樣中，寡核苷酸雙螺旋體包含RNA/RNA雙螺旋體。在一個態樣中，寡核苷酸雙螺旋體包含DNA/RNA異雙螺旋體。
在一個態樣中，寡核苷酸雙螺旋體之有義股、反義股或有義股及反義股兩者分別包含一或多個經修飾之核酸。在一個態樣中，寡核苷酸雙螺旋體之有義股、反義股或有義股及反義股兩者分別包含5'-結合物或3'-結合物。在一個態樣中，結合物包含聚乙二醇（PEG）、N-乙醯半乳胺糖（GalNAc）、細胞穿透肽（CPP）、α-生育酚、適體、抗體、膽固醇、鯊烯（squalene）、脂肪酸或核脂（nucleolipid）。
在一個態樣中，寡核苷酸雙螺旋體之有義股及反義股包含微生物之核酸序列。在一個態樣中，寡核苷酸雙螺旋體之有義股及反義股包含作為人類微生物群落之組分的微生物之核酸序列。在一個態樣中，微生物為細菌、真菌、原蟲（protozoa）或病毒。在一個態樣中，微生物為細菌。在一個態樣中，寡核苷酸雙螺旋體之有義股及反義股包括來自細菌之16S rRNA或rDNA。
在一個態樣中，有義探針之有義結合長度比有義股之有義股長度短至少1個核苷酸。在一個態樣中，有義結合長度為約10至約16個核苷酸長度。在一個態樣中，有義探針之有義結合部分具有與寡核苷酸雙螺旋體之有義股之3'端對準的5'端。
在一個態樣中，反義探針之反義結合長度比反義股之反義股長度短至少1個核苷酸。在一個態樣中，反義結合長度為約10至約16個核苷酸長度。在一個態樣中，反義探針之反義結合部分具有與寡核苷酸雙螺旋體之反義股之3'端對準的5'端。
在一個態樣中，第一寡核苷酸標籤具有第一寡核苷酸標籤長度且第一捕獲寡核苷酸具有第一捕獲寡核苷酸長度，且該第一寡核苷酸標籤長度與該第一捕獲寡核苷酸長度相同。在一個態樣中，第一寡核苷酸標籤具有第一寡核苷酸標籤長度且第一捕獲寡核苷酸具有第一捕獲寡核苷酸長度，且該第一寡核苷酸標籤長度比該第一捕獲寡核苷酸長度短。
在一個態樣中，第二寡核苷酸標籤具有第二寡核苷酸標籤長度且第二捕獲寡核苷酸具有第二捕獲寡核苷酸長度，且該第二寡核苷酸標籤長度與該第二捕獲寡核苷酸長度相同。在一個態樣中，第二寡核苷酸標籤具有第二寡核苷酸標籤長度且第二捕獲寡核苷酸具有第二捕獲寡核苷酸長度，且該第二寡核苷酸標籤長度比該第二捕獲寡核苷酸長度短。
在一個態樣中，有義探針包含DNA。在一個態樣中，有義探針之有義結合部分包含DNA。在一個態樣中，有義探針之第一寡核苷酸標籤包含DNA。在一個態樣中，有義探針之有義結合部分及寡核苷酸標籤包含DNA。在一個態樣中，有義探針之有義結合部分包含DNA且有義探針之寡核苷酸標籤包含RNA。
在一個態樣中，反義探針包含DNA。在一個態樣中，反義探針之反義結合部分包含DNA。在一個態樣中，反義探針之第一寡核苷酸標籤包含DNA。在一個態樣中，反義探針之反義結合部分及寡核苷酸標籤包含DNA。在一個態樣中，反義探針之反義結合部分包含DNA且反義探針之寡核苷酸標籤包含RNA。
在一個態樣中，有義探針包含RNA。在一個態樣中，有義探針之有義結合部分包含RNA。在一個態樣中，有義探針之第一寡核苷酸標籤包含RNA。在一個態樣中，有義探針之有義結合部分及寡核苷酸標籤包含RNA。在一個態樣中，有義探針之有義結合部分包含RNA且有義探針之寡核苷酸標籤包含DNA。
在一個態樣中，反義探針包含RNA。在一個態樣中，反義探針之反義結合部分包含RNA。在一個態樣中，反義探針之第一寡核苷酸標籤包含RNA。在一個態樣中，反義探針之反義結合部分及寡核苷酸標籤包含RNA。在一個態樣中，反義探針之反義結合部分包含RNA且反義探針之寡核苷酸標籤包含DNA。
在一個態樣中，有義探針、反義探針或兩者包含一或多個經修飾之核酸。在一個態樣中，一或多個經修飾之核苷酸包含鎖核酸（LNA）。在一個態樣中，一或多個經修飾之核苷酸係選自磷酸二酯（PO）；硫代磷酸酯（PS）；2'O-甲基（2'OMe）；2'O-甲氧基乙基（MOE）；肽核酸（PNA）；磷醯胺酸(N-
Figure 02_image001
啉基)（PMO）；鎖核酸（LNA）；2'-去氧-2'-氟（2'-F）；或其組合。
在一個態樣中，單股特異性核酸酶包含單股特異性DNA酶。在一個態樣中，單股特異性DNA酶為S1核酸酶、P1核酸酶或綠豆核酸酶（Mung Bean nuclease）。在一個態樣中，單股特異性核酸酶包含單股特異性RNA酶。在一個態樣中，單股特異性RNA酶為RNA酶A、RNA酶H、RNA酶I、RNA酶III、RNA酶L、RNA酶P、RNA酶PhyM、RNA酶T1、RNA酶T2、RNA酶U2、RNA酶V、PNP酶、RNA酶PH、RNA酶R、RNA酶D、RNA酶T、RNA酶ONE、寡核糖核酸酶、核糖核酸外切酶I及核糖核酸外切酶II。
在一個態樣中，（a）至（c）係同時進行。在一個態樣中，（a）至（c）係依序進行。
在一個態樣中，（b）中之雜交條件包含： （i）    將探針與樣本在第一溫度下培育以使寡核苷酸雙螺旋體之有義股及反義股變性；及 （ii）   將探針與寡核苷酸雙螺旋體之經變性有義股及反義股在第二溫度下培育以允許有義探針及反義探針與有義股及反義股雜交。
在一個態樣中，雜交進一步包含在約2℃至約8℃之保持溫度下培育有義及反義複合物。
在一個態樣中，（b）中之雜交條件包含： （i）    將探針與樣本在約60℃至約95℃之第一溫度下培育約1分鐘至約15分鐘； （ii）   將探針與樣本在約10℃至約65℃之第二溫度下培育約30秒至約5分鐘；及 （iii）  將探針與樣本在約2℃至約8℃之保持溫度下培育。
在一個態樣中，（b）中之雜交條件包含： （i）    將探針與樣本在約95℃之第一溫度下培育約2分鐘； （ii）   將探針與樣本在約65℃之第二溫度下培育約1分鐘；及 （iii）  將探針與樣本在約4℃之保持溫度下培育。
在一個態樣中，雜交條件包含在步驟（i）與（ii）之間的約1℃/s至約2℃/s之第一溫度轉變速率。在一個態樣中，雜交條件包含在步驟（i）與（ii）之間的約1.8℃/s之第一溫度轉變速率。在一個態樣中，雜交條件包含在步驟（i）與（ii）之間的約0.05℃/s至約1℃/s之第二溫度轉變速率。在一個態樣中，雜交條件包含在步驟（i）與（ii）之間的約0.1℃/s之第二溫度轉變速率。
在一個態樣中，將探針與樣本一起在包含稀釋劑54之緩衝液或N-PLEX雜交緩衝液1或2中培育。
在一個態樣中，樣本包含複數個寡核苷酸雙螺旋體且（a）中之組合物包含複數組探針，其中各組探針與獨特寡核苷酸雙螺旋體之獨特有義股或反義股雜交。
在一個態樣中，（c）包含將載體表面與有義及反義複合物在約20℃至約40℃的溫度下培育約15分鐘至約12小時。在一個態樣中，（c）包含將載體表面與有義及反義複合物在約20℃至約40℃的溫度下培育約1小時至約2小時。在一個態樣中，將載體表面與有義及反義複合物一起在振盪下培育。在一個態樣中，（c）包含將載體表面與有義及反義複合物在約37℃的溫度下培育約1小時，同時在約705 rpm下振盪。
在一個態樣中，（a）中之組合物包含約20 pM至約10 nM有義探針。在一個態樣中，（a）中之組合物包含約20 pM至約10 nM反義探針。
在一個態樣中，樣本包含生物樣本。在一個態樣中，樣本包含未處理之生物樣本。在一個態樣中，樣本包含經預處理之生物樣本。在一個態樣中，樣本包含純化樣本。在一個態樣中，樣本係藉由沈澱、離心或管柱層析法純化。在一個態樣中，樣本包含經萃取之樣本。在一個態樣中，樣本包含天然存在之RNA酶。在一個態樣中，該方法包含在（a）之前組合樣本與RNA酶抑制劑。在一個態樣中，樣本包含游離DNA。
在一個態樣中，生物樣本包含自生物體獲得之流體。在一個態樣中，生物樣本包含全血、血漿、血清、尿液、糞便、母乳、唾液或羊膜液。在一個態樣中，樣本包含環境樣本。在一個態樣中，樣本包含製造過程樣本。
在一個態樣中，該方法具有小於約200 pg/mL之偵測極限。
在一個態樣中，載體表面包含一或多個電極。在一個態樣中，一或多個電極包含碳電極。在一個態樣中，一或多個電極包含碳墨電極。在一個態樣中，一或多個電極包含於多孔盤中。在一個態樣中，多孔盤之各孔包含電極。
在一個態樣中，標記包含結合對之成員。在一個態樣中，標記包含生物素。
在一個態樣中，標記包含電化學發光（ECL）標記。在一個態樣中，該方法包含藉由使電極與包含電化學發光共反應物之電化學發光讀取緩衝液接觸及向電極施加電位而產生分析信號的步驟。在一個態樣中，共反應物係選自三級胺、三丙胺、N-丁基二乙醇胺及其組合。
在一個態樣中，提供包含一組探針之組合物。在一個態樣中，該組探針包含： （a）   有義探針，其包含與第一捕獲寡核苷酸之至少一部分互補的第一單股寡核苷酸標籤、能夠與寡核苷酸雙螺旋體之有義股之核苷酸序列雜交的有義結合部分，及第一標記；及 （b）   反義探針，其包含與第二捕獲寡核苷酸之至少一部分互補的第二單股寡核苷酸標籤、能夠與寡核苷酸雙螺旋體之反義股之核苷酸序列雜交的反義結合部分，及第二標記， 其中有義探針之有義結合部分具有比有義股之有義股長度短的有義結合長度，且其中反義股之反義結合部分具有比反義股之反義股長度短的反義結合長度。
在一個態樣中，提供一種組合物，其包含： （a）   寡核苷酸雙螺旋體，其包含有義股及反義股；及 （b）   一組探針，其包含： （i）    有義探針，其包含與第一捕獲寡核苷酸之至少一部分互補的第一單股寡核苷酸標籤、能夠與寡核苷酸雙螺旋體之有義股之核苷酸序列雜交的有義結合部分，及第一標記；及 （ii）   反義探針，其包含與第二捕獲寡核苷酸之至少一部分互補的第二單股寡核苷酸標籤、能夠與寡核苷酸雙螺旋體之反義股之核苷酸序列雜交的反義結合部分，及第二標記， 其中有義探針之有義結合部分具有比有義股之有義股長度短的有義結合長度，且其中反義股之反義結合部分具有比反義股之反義股長度短的反義結合長度。
在一個態樣中，提供包含一或多種雜交複合物之組合物。在一個態樣中，雜交複合物包含： （a）   有義複合物，其包含與寡核苷酸雙螺旋體之有義股雜交的有義探針，其中該有義探針包含與第一捕獲寡核苷酸之至少一部分互補的第一單股寡核苷酸標籤、能夠與寡核苷酸雙螺旋體之有義股之核苷酸序列雜交的有義結合部分，及第一標記，其中有義探針之有義結合部分具有比有義股之有義股長度短的有義結合長度； （b）   反義複合物，其包含與寡核苷酸雙螺旋體之反義股雜交的反義探針，其中反義探針包含與第二捕獲寡核苷酸之至少一部分互補的第二單股寡核苷酸標籤、能夠與寡核苷酸雙螺旋體之反義股之核苷酸序列雜交的反義結合部分，及第二標記，其中反義股之反義結合部分具有比反義股之反義股長度短的反義結合長度， 及其組合。
在一個態樣中，組合物中之寡核苷酸雙螺旋體之有義股及反義股各自分別包含約8至約50個核苷酸。在一個態樣中，組合物中之寡核苷酸雙螺旋體之有義股及反義股各自分別包含約16至約30個核苷酸。
在一個態樣中，組合物中之寡核苷酸雙螺旋體之有義股包含DNA。在一個態樣中，寡核苷酸雙螺旋體之有義股包含RNA。在一個態樣中，組合物中之寡核苷酸雙螺旋體之反義股包含DNA。在一個態樣中，寡核苷酸雙螺旋體之反義股包含RNA。在一個態樣中，寡核苷酸雙螺旋體包含DNA/DNA雙螺旋體。在一個態樣中，寡核苷酸雙螺旋體包含RNA/RNA雙螺旋體。在一個態樣中，寡核苷酸雙螺旋體包含DNA/RNA異雙螺旋體。
在一個態樣中，組合物中之寡核苷酸雙螺旋體之有義股、反義股或有義股及反義股兩者分別包含一或多個經修飾之核酸。在一個態樣中，組合物中之寡核苷酸雙螺旋體之有義股、反義股或有義股及反義股兩者分別包含5'-結合物或3'-結合物。在一個態樣中，結合物包含聚乙二醇（PEG）、N-乙醯半乳胺糖（GalNAc）、細胞穿透肽（CPP）、α-生育酚、適體、抗體、膽固醇、鯊烯、脂肪酸或核脂。
在一個態樣中，組合物中之有義探針之有義結合長度比有義股之有義股長度短至少1個核苷酸。在一個態樣中，組合物中之有義探針之有義結合長度為約10至約16個核苷酸長度。在一個態樣中，組合物中之有義探針之有義結合部分具有與寡核苷酸雙螺旋體之有義股之3'端對準的5'端。
在一個態樣中，組合物中之反義探針之反義結合長度比反義股之反義股長度短至少1個核苷酸。在一個態樣中，組合物中之反義探針之反義結合長度為約10至約16個核苷酸長度。在一個態樣中，組合物中之反義探針之反義結合部分具有與寡核苷酸雙螺旋體之反義股之3'端對準的5'端。
在一個態樣中，組合物中之有義探針包含DNA。在一個態樣中，有義探針之有義結合部分包含DNA。在一個態樣中，有義探針之第一寡核苷酸標籤包含DNA。在一個態樣中，有義探針之有義結合部分及寡核苷酸標籤包含DNA。在一個態樣中，有義探針之有義結合部分包含DNA且有義探針之寡核苷酸標籤包含RNA。
在一個態樣中，組合物中之反義探針包含DNA。在一個態樣中，反義探針之反義結合部分包含DNA。在一個態樣中，反義探針之第一寡核苷酸標籤包含DNA。在一個態樣中，反義探針之反義結合部分及寡核苷酸標籤包含DNA。在一個態樣中，反義探針之反義結合部分包含DNA且反義探針之寡核苷酸標籤包含RNA。
在一個態樣中，組合物中之有義探針包含RNA。在一個態樣中，有義探針之有義結合部分包含RNA。在一個態樣中，有義探針之第一寡核苷酸標籤包含RNA。在一個態樣中，有義探針之有義結合部分及寡核苷酸標籤包含RNA。在一個態樣中，有義探針之有義結合部分包含RNA且有義探針之寡核苷酸標籤包含DNA。
在一個態樣中，組合物中之反義探針包含RNA。在一個態樣中，反義探針之反義結合部分包含RNA。在一個態樣中，反義探針之第一寡核苷酸標籤包含RNA。在一個態樣中，反義探針之反義結合部分及寡核苷酸標籤包含RNA。在一個態樣中，反義探針之反義結合部分包含RNA且反義探針之寡核苷酸標籤包含DNA。
在一個態樣中，組合物中之有義探針、反義探針或兩種探針包含一或多個經修飾之核酸。在一個態樣中，一或多個經修飾之核苷酸包含鎖核酸（LNA）。在一個態樣中，一或多個經修飾之核苷酸係選自磷酸二酯（PO）；硫代磷酸酯（PS）；2'O-甲基（2'OMe）；2'O-甲氧基乙基（MOE）；肽核酸（PNA）；磷醯胺酸(N-
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啉基)（PMO）；鎖核酸（LNA）；2'-去氧-2'-氟（2'-F）；或其組合。
在一個態樣中，組合物中之標記包含結合對之成員。在一個態樣中，標記包含生物素。在一個態樣中，組合物中之標記包含電化學發光標記。
在一個態樣中，提供一種用於實施本文所描述之方法的套組。
A. 定義除非另外定義，否則本文所用之科學及技術術語應具有本領域中一般熟習此項技術者通常所理解之含義。此外，除非上下文另外要求，否則單數術語應包含複數，且複數術語應包含單數，例如「一（a/an）」包含複數個，例如「一或多個」或「至少一個」，且除非另外指示，否則術語「或」可意謂「及/或」。術語「包含（including/includes/included）」不係限制性的。本文提供之任何類型之範圍包含在所描述之特定範圍內之所有值及特定範圍之端點附近的值。如本文所用，使用字語「在……與……之間」表述之範圍包含範圍端點。因此，舉例而言，在50℃與70℃之間的範圍包含50℃至70℃，亦即其包含端點50℃及70℃。
如本文所用，術語「約」用於修飾例如組合物中之成分之數量、描述本發明中所採用之濃度、體積、製程溫度、製程時間、產量、流速、壓力及其範圍。術語「約」係指數值數量例如可經由以下所發生之變化：經由通常量測及用於製備化合物、組合物、濃縮物或調配物之操縱程序；經由此等程序中之無意誤差；經由用於實施該等方法之起始材料或成分之製造、來源或純度上之差異；以及類似考慮因素。術語「約」亦涵蓋歸因於調配物之老化而與特定初始濃度或混合物不同的量，及歸因於混合或處理調配物而與特定初始濃度或混合物不同的量。當由術語「約」修飾時，在此隨附之申請專利範圍包含此類等效物。
一般而言，本文中所描述之與細胞及組織培養、分子生物學、及蛋白質及寡核苷酸或聚核苷酸化學及雜交結合使用的命名法及其技術為本領域中熟知及常用之彼等者。胺基酸在本文中可由其通常已知之三字母符號或由IUPAC-IUB生物化學命名法委員會（Biochemical Nomenclature Commission）所推薦之單字母符號來提及。同樣，核苷酸可由其通常可接受之單字母代碼提及。
術語「核苷酸」係指包含核鹼基、糖及一或多個核苷酸間鍵之單體單元。如本文所用，術語「核苷酸」包含天然存在之核苷酸及經修飾之核苷酸。天然存在之核苷酸包含鳥嘌呤、（G）、腺嘌呤、（A）、胞嘧啶、（C）、胸腺嘧啶、（T）及尿嘧啶（U）以及天然存在之鹼基類似物。在去氧核糖核酸（DNA）中，糖為去氧核糖。在核糖核酸（RNA）中，糖為核糖。術語「經修飾之核苷酸」係指包含核鹼基、糖或核苷酸間鍵處之修飾的核苷酸，其中經修飾之核苷酸保持能夠與互補性天然存在或經修飾之核苷酸進行鹼基配對。術語「聚核苷酸」係指兩個或更多個核苷酸藉由核苷間鍵彼此共價連接之聚合物。
如本文所用，術語「寡核苷酸」係指包含藉由核苷間鍵共價連接之兩個或更多個核苷酸，通常約5至約100個核苷酸之短聚合物。在一個態樣中，寡核苷酸為具有約5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或30個核苷酸且至多約30、35、40、45、50或100個核苷酸長度，或約8至約50個核苷酸長度、約10至約40個核苷酸長度、約12至約30個核苷酸長度或約18至約30個核苷酸長度的聚合物。如本文中所用，術語寡核苷酸可指單股寡核苷酸或雙股寡核苷酸，或雙股寡核苷酸之個別寡核苷酸股。在一個態樣中，術語「寡核苷酸」係指雙股寡核苷酸治療劑。
「寡核苷酸治療劑」為包含與目標核酸至少部分互補且且可與目標核酸雜交之至少一個股的寡核苷酸。在一個態樣中，寡核苷酸治療劑包含有義股及反義股。在一個態樣中，寡核苷酸治療劑可與目標核酸雜交且調節目標核酸之表現或量。術語「調節」可包含增加或降低目標核酸之表現或量。術語「表現」係指基因中之資訊用於產生蛋白質所藉由之過程且包含（但不限於）轉錄、剪接、轉錄後修飾及轉譯。在一個態樣中，寡核苷酸治療劑增加目標核酸之表現或量。在一個態樣中，寡核苷酸治療劑降低目標核酸之表現或量。在一個態樣中，寡核苷酸為經化學合成及純化或分離的。在一個態樣中，藉由固相化學合成製備寡核苷酸。用於製備寡核苷酸（包含例如，如本文所描述之有義及反義寡核苷酸、探針、標籤或捕獲寡核苷酸）之方法為已知的。
如本文中所使用，「鹼基配對」係指嘌呤與嘧啶之間的引起形成雙股寡核苷酸之特異性氫鍵結。在DNA中，腺嘌呤（A）與胸腺嘧啶（T）配對，且鳥嘌呤（G）與胞嘧啶（C）配對。在RNA中，腺嘌呤（A）與尿嘧啶（U）配對，且鳥嘌呤（G）與胞嘧啶（C）配對。雖然不限於任何特定機制，但最常見之鹼基配對機制涉及互補核鹼基之間的氫鍵結，其可為華特生-克里克（Watson-Crick）、胡斯坦（Hoogsteen）或反向胡斯坦氫鍵結。
術語「嵌合」係指具有至少兩個化學上不同之區域的化合物。在實施例中，各區域具有複數個次單元。如本文中所使用，術語「嵌合探針」包含衍生自兩個或更多個生物來源之經連接之單股DNA及/或RNA。
「互補」係指藉由例如根據華特生-克里克、胡斯坦或反向胡斯坦氫鍵結鹼基配對模型形成氫鍵而相互作用的核酸分子或寡核苷酸。雜交可發生在兩個互補DNA分子之間（DNA-DNA雜交）、兩個RNA分子之間（RNA-RNA雜交）或互補DNA與RNA分子之間（DNA-RNA雜交）。當與核苷酸結合使用時，術語「互補」係指例如包含彼此能夠鹼基配對之嘌呤及嘧啶的一對核苷酸。一對互補的核苷酸可包含一對天然存在之核苷酸、一對經修飾之核苷酸或包含天然存在之核苷酸及經修飾之核苷酸的對。當與寡核苷酸結合使用時，術語「互補」意謂一個寡核苷酸或其部分之核苷酸能夠與另一寡核苷酸或其部分之核苷酸進行氫鍵結，而非互補核苷酸對齊時。雜交可發生在與較長核苷酸序列之一部分互補的短核苷酸序列之間。雜交可發生在不具有100%「序列互補性」之序列之間（亦即，基於鹼基配對模型，諸如華特生-克里克、胡斯坦或反向胡斯坦氫鍵結鹼基配對模型，其中小於100%之核苷酸對準的序列），但相比於具有較大序列互補性之序列，具有較小序列互補性之序列不太穩定且不太可能雜交。在一個態樣中，基於華特生-克里克模型，互補序列之核苷酸具有100%序列互補性（亦即，一個寡核苷酸序列或區域之各核苷酸可與第二寡核苷酸股或區域之各核苷酸進行氫鍵）。在另一態樣中，基於華特生-克里克模型，互補序列之核苷酸具有至少約90%、約95%、約96%、約97%、約98%或約99%序列互補性。在一個態樣中，「大體上互補」係指部分互補且能夠在生理學相關條件下雜交的序列。在一個態樣中，「大體上互補」係指部分互補且能夠在嚴格雜交條件下雜交的序列。在一個態樣中，互補性係指雙股寡核苷酸治療劑之兩個寡核苷酸之間的互補。在一個態樣中，互補性係指單股寡核苷酸治療劑與單股寡核苷酸探針之間的互補性。在一個態樣中，互補性係指單股寡核苷酸標籤與單股捕獲寡核苷酸之間的互補性。在一個態樣中，互補性係指單股寡核苷酸與嵌合探針之間的互補性。
兩個互補序列是否雜交可視雜交條件之嚴格性而定，其可視諸如溫度、溶劑、離子強度及其他參數之條件而變化。可選擇雜交條件之嚴格性以在其他潛在交叉反應或干擾序列存在下選擇性形成或維持兩個互補核酸序列之所需雜交產物。嚴格條件為序列依賴性的，通常較長互補序列在比較短互補序列更高的溫度下特異性雜交。一般而言，對於在所定義的離子強度、化學變性劑濃度、pH及雜交搭配物濃度下之特定核苷酸序列，嚴格雜交條件比熱熔點（T m）（亦即，50%之序列與大體上互補序列雜交之溫度）低約5℃至約10℃。一般而言，與具有較低百分比之G及C鹼基之核苷酸序列相比，具有較高百分比之G及C鹼基之核苷酸序列在更嚴格條件下雜交。一般而言，可藉由增加溫度、增加pH、降低離子強度或增加化學核酸變性劑（諸如甲醯胺、二甲基甲醯胺、二甲亞碸、乙二醇、丙二醇及碳酸伸乙酯）之濃度來增加嚴格性。嚴格雜交條件通常包含小於約1 M、約500 mM或約200 mM之鹽濃度；高於約20℃、約30℃、約40℃、約60℃或約80℃之雜交溫度；及高於約10%、約20%、約30%、約40%或約50%之化學變性劑濃度。由於許多因素可影響雜交嚴格性，因此參數之組合可能比任何單獨參數之絕對值更重要。
在一個態樣中，互補性係指寡核苷酸與目標核酸序列之間的互補性。在一個態樣中，目標核酸包含DNA或RNA。在一個態樣中，目標RNA包含mRNA、前驅mRNA、非編碼RNA、初級微小RNA（pri-microRNA）、前驅微小RNA、成熟微小RNA或啟動子導引之RNA。在一個態樣中，目標核酸為細胞基因或由其表現與特定病症或疾病相關之基因轉錄的mRNA。在一個態樣中，目標核酸為來自感染物之核酸分子。在一個態樣中，目標核酸為病毒或細菌核酸。
如本文中所使用，「雜交（hybridize/hybridizing/hybridization）」係指兩個互補寡核苷酸之間的鹼基配對。在一個態樣中，雙股寡核苷酸治療劑之單股寡核苷酸股可與目標核酸雜交。在一個態樣中，雙股寡核苷酸之兩個單股寡核苷酸股彼此雜交。在一個態樣中，寡核苷酸探針與雙股寡核苷酸之單股寡核苷酸股雜交。在一個態樣中，單股寡核苷酸標籤與單股捕獲寡核苷酸雜交。「特異性雜交」係指兩個互補寡核苷酸之間的雜交，其一較大親和力發生且與樣本中之其他寡核苷酸無顯著交叉雜交。在一個態樣中，互補寡核苷酸在生理學相關條件（諸如細胞之細胞質中發現的條件）下進行特異性雜交。在另一態樣中，互補寡核苷酸在嚴格雜交條件下進行特異性雜交。
如本文所用，「寡核苷酸雙螺旋體」係指藉由彼此至少部分互補且經由互補核鹼基之間的鹼基配對彼此雜交之兩個單股寡核苷酸之雜交所形成的雙股寡核苷酸。在一個態樣中，寡核苷酸雙螺旋體之至少一個股包含DNA。在一個態樣中，寡核苷酸雙螺旋體之至少一個股包含RNA。在一個態樣中，寡核苷酸雙螺旋體之兩個股包含DNA。在一個態樣中，寡核苷酸雙螺旋體之兩個股包含RNA。在一個態樣中，雙股寡核苷酸為包含作為DNA之一個股及作為RNA之一個股的異雙螺旋體。在一個態樣中，寡核苷酸雙螺旋體之兩個寡核苷酸股之糖-磷酸酯主鏈以相反方向定向（亦即，一個股自5'延伸至3'且另一者自3'延伸至5'），其稱作「反向平行」。在一個態樣中，寡核苷酸雙螺旋體之兩個寡核苷酸股之長度彼此相同，使得寡核苷酸雙螺旋體在其整個長度上為雙股，亦即，寡核苷酸雙螺旋體具有平端。在一個態樣中，寡核苷酸雙螺旋體之兩個寡核苷酸股之長度彼此相同，但以使得寡核苷酸雙螺旋體在其整個長度上不為雙股的方式對齊，亦即，寡核苷酸雙螺旋體在雙螺旋體之兩端具有單股3'突出端或單股5'突出端。在一個態樣中，寡核苷酸雙螺旋體之兩個寡核苷酸股之長度彼此不同，使得寡核苷酸雙螺旋體在其整個長度上不為雙股，亦即，寡核苷酸雙螺旋體在寡核苷酸雙螺旋體之一或兩個端處具有單股3'突出端或單股5'突出端。在一個態樣中，單股突出端為約1至約5、約1至約4、約1至約3，或約1至約2個核苷酸。在一個態樣中，寡核苷酸雙螺旋體具有一個平端及一個包含單股突出端的端。當與寡核苷酸結合使用時，術語「長度」係指單股寡核苷酸之聚合主鏈中的核苷酸殘基之數目。
如本文所用，術語「突出端」係指其中一個股之至少一個末端比另一股之對應末端長的雙股寡核苷酸。在一個態樣中，單股突出端位於雙股寡核苷酸之一個股或兩個股之3'-端處。在一個態樣中，單股突出端位於雙股寡核苷酸之一個股或兩個股之5'-端處。在一個態樣中，單股突出端包含約1至約5個核苷酸、約1至約4個核苷酸、約1至約3個核苷酸，或約1至約2個核苷酸。在一個態樣中，雙股寡核苷酸之一個末端為平端且另一端包含3'突出端或5'突出端。在一個態樣中，雙股寡核苷酸之兩端包含單股突出端。
術語「反義」係指具有相對於轉錄目標核酸所需之取向反向之核酸序列的寡核苷酸，使得反義寡核苷酸可例如經由華特生-克里克鹼基配對與目標核酸雜交。寡核苷酸雙螺旋體之「有義股」與反義股互補且因此對於目標核酸之至少一部分而言為「有義」的。在一個態樣中，寡核苷酸雙螺旋體之反義股及有義股彼此具有至少約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或約100%互補性。
單股寡核苷酸具有「方向」或「方向性」，此係由於相鄰核苷酸藉由核苷間鍵（諸如其5'碳原子與3'碳原子之間的磷酸二酯鍵）接合，使得寡核苷酸之任一端處的末端5'及3'碳暴露，其可稱作分子之5'-(磷醯基)端及3'-(羥基)端。
術語「一致」意謂寡核苷酸序列在比較窗內之相同位置處包含一致的核酸鹼基。術語「序列一致性%」可藉由以下來測定：在比較窗內比較兩條比對序列；測定兩條序列中存在一致核酸鹼基之位置數以得到匹配位置數；將匹配位置數除以比較窗中之總位置數；且將結果乘以100，得到序列一致性之百分比。比較窗可包含全長序列或可為較大序列之子部分。已知用於測定兩條或更多條序列之間的一致性百分比之多種方法及演算法，包含（但不限於）MEGALIGN（DNASTAR, Inc.，威斯康星州麥迪遜）、FASTA、BLAST或ENTREZ。
在一個態樣中，本文所描述之寡核苷酸之核苷酸包含具有非天然存在之亦可參與雜交反應之化學結構的結構性類似物。在一個實例中，核苷酸或核酸可包含將其與標記連接或提供可例如經由使用經胺或硫醇基修飾之核苷酸鹼基、磷酸酯或糖與標記連接之反應性官能基的化學修飾。術語「反應性官能基」係指可進行另一化學反應，例如以與另一官能基形成共價鍵之原子或一組相關原子。反應性官能基之實例包含（但不限於）胺基、硫醇基、羥基及羰基。在一個態樣中，反應性官能基包含硫醇基。可經由此等化學修飾連接至核苷酸或核酸之標記包含（但不限於）可偵測部分，諸如生物素、半抗原、螢光團及電化學發光（ECL）標記。
術語「經修飾之寡核苷酸」係指包含至少一個核苷修飾，例如糖修飾或核鹼基修飾；或核苷間鍵修飾的寡核苷酸。在一個態樣中，經修飾之寡核苷酸包含一或多個修飾，其包含（但不限於）磷酸二酯（PO）；硫代磷酸酯（PS）；2'O-甲基（2'OMe）；2'O-甲氧基乙基（MOE）；硫代磷酸酯受限乙基（cEt）；肽核酸（PNA）；磷醯胺酸(N-
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啉基)（PMO）；鎖核酸（LNA）；2'-去氧-2'-氟（2'-F）；或其組合。「鎖核酸核苷」或「LNA」係指包含具有4'-CH 2-O-2'橋鍵之雙環糖部分的核苷。「硫代磷酸酯」係指其中非橋接氧中之一者經硫置換的核苷酸間鍵。
術語「結合物」係指直接地或間接地與寡核苷酸連接之原子或原子團。在一個態樣中，結合物經由穩定連接子或可裂解連接子連接至寡核苷酸。在一個態樣中，結合物改變與其連接之寡核苷酸之一或多個特性，包含（但不限於）藥效動力學、藥物動力學、鍵結、吸收、細胞分佈、細胞吸收、電荷或清除特性。結合物之實例包含（但不限於）聚乙二醇（PEG）、N-乙醯半乳糖胺（GalNAc）、細胞穿透肽（CPP）、維生素E（亦稱為α-生育酚）、適體、抗體、膽固醇或膽固醇衍生物、鯊烯、脂肪酸、核脂及球形核酸。
術語「核酸酶」係指可裂解寡核苷酸聚合物之主鏈的酶，例如水解酶。在一個態樣中，核酸酶為裂解寡核苷酸之主鏈中之磷酸二酯鍵的磷酸二酯酶。「核糖核酸酶」或「RNA酶」係指優先裂解核糖核酸（RNA）之酶。「去氧核糖核酸酶」或「DNA酶」係指優先裂解去氧核糖核酸（DNA）之酶。在一個態樣中，核酸酶為優先裂解單股寡核苷酸或雙股寡核苷酸之單股區的「單股特異性核酸酶」。單股特異性RNA酶為優先裂解單股RNA之酶。單股特異性DNA酶為優先裂解單股DNA之酶。
「目標核酸」係指具有已知序列之所關注核酸，寡核苷酸經設計以與該已知序列雜交。在一個態樣中，目標核酸為具有已知序列之核酸，寡核苷酸治療劑經設計以與該已知序列雜交。在一個態樣中，目標核酸為原核或真核生物體之DNA或RNA中發現之序列。在一個態樣中，目標核酸包含miRNA、治療劑RNA、mRNA、RNA病毒或其組合。在一個態樣中，寡核苷酸與細胞中之目標核酸之雜交改變由該細胞表現之基因之活性。在一個態樣中，寡核苷酸與目標核酸之雜交增加基因之活性。在一個態樣中，反義寡核苷酸與目標核酸之雜交降低基因之活性。
在一個態樣中，目標核酸包含16S核糖體DNA（16S rDNA）或16核糖體RNA（16S rRNA）。16s rRNA為原核生物之核糖體之小次單元之核糖體RNA組分，其負責經由mRNA至蛋白質之轉譯而將遺傳訊息轉化至功能細胞組分的基本過程。基因16s rDNA編碼16S rRNA序列。16S rRNA基因在細菌中為保守的，且含有可提供物種特異性標記序列之高變區且廣泛用於鑑別細菌及譜系學、鑑別、分類及定量研究。
術語「個體」或「患者」係指出於實驗、診斷、防治性或治療目的而投與寡核苷酸組合物之生物體且包含（但不限於）動物，例如哺乳動物，諸如小鼠、大鼠、兔子、非人類靈長類動物及人類；昆蟲；蠕蟲；及植物。在一個態樣中，個體可能罹患或易患疾病或病症。
如本文所用，術語「人類微生物群落」係指天然地存活於人體上及人體內之所有微生物，諸如細菌、真菌、病毒及其基因之集合。在一個態樣中，人類微生物群落之微生物存活於人類器官、組織及體液上或人類器官、組織及體液內，該等人類器官、組織及體液包含皮膚、乳腺、鼻道、精液、子宮、卵泡、肺、唾液、口腔黏膜、結膜、膽道及胃腸道。在一個態樣中，人類微生物群落由共生且共存而不傷害人類之微生物組成。在一個態樣中，人類微生物群落由對人體有幫助之微生物組成。在一個態樣中，人類微生物群落由對人體有害之微生物組成。在一個態樣中，人類微生物群落由對人體有幫助及有害之微生物群組成。在一個態樣中，人類微生物群落由共生之微生物組成，其中人體及微生物群兩者均受益。
「探針」係指包含能夠與寡核苷酸雙螺旋體之單股雜交之單股寡核苷酸序列的試劑。在一個態樣中，探針包含能夠與寡核苷酸雙螺旋體之有義股或反義股雜交的單股寡核苷酸序列。「有義探針」為包含能夠與寡核苷酸雙螺旋體之有義股雜交之單股寡核苷酸序列的寡核苷酸。「反義探針」為包含能夠與寡核苷酸雙螺旋體之反義股雜交之單股寡核苷酸序列的寡核苷酸。在一個態樣中，探針包含與寡核苷酸雙螺旋體之有義股或反義股互補或實質上互補的單股寡核苷酸序列。在一個態樣中，探針包含與捕獲寡核苷酸之序列互補之寡核苷酸標籤（其可稱作靶向序列）。探針可包含DNA或RNA或DNA及RNA序列之組合且可包含一或多個經修飾之核苷酸或經修飾之核苷酸間鍵聯。探針可藉由本領域中已知的任何適合之方法製備，包含（但不限於）化學或酶促合成。
「連接子」係指將一個化學部分連接至另一化學部分之一或多個原子。在一個態樣中，連接子將反應性官能基或標記連接至寡核苷酸。連接子可為包含一或多個原子，例如約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9或約10個原子至約11、約12、約13、約14、約15、約16、約17、約18、約19或約20個原子且可包含諸如碳、氧、硫、氮及磷及其組合之原子的核苷酸或非核苷酸化合物。連接子之實例包含：低分子量基團，諸如醯胺、酯基、碳酸根及乙醚基；以及較高分子量連接基團，諸如聚乙二醇（PEG）及烷基鏈。連接子可包含一或多個原子、單元或分子。
「標記」係指具有可偵測物理特性或能夠使化學基團或部分呈現可偵測物理特性之化學基團或部分，包含例如催化受質轉化為可偵測產物之酶。標記可藉由光譜學、光化學、生物化學、免疫化學、電學、光學、化學或其他方法來偵測。標記之實例包含（但不限於）放射性同位素、酶、受質、螢光分子、化學發光部分、電化學發光部分、磁性粒子及生物發光部分。在另一態樣中，標記為作為結合對之成員的化合物，其中結合對之第一成員（其可稱為「一級結合試劑」）與受質（例如寡核苷酸）連接，且結合對之另一成員（其可稱為「二級結合試劑」）具有可偵測物理特性或與具有可偵測物理特性之部分連接。結合對之非限制性實例包含生物素及抗生蛋白鏈菌素或抗生物素蛋白；互補寡核苷酸；半抗原及半抗原結合搭配物；及抗體/抗原結合對。
如本文中所使用，「同時」與本文所描述之方法步驟結合使用時係指其中各步驟實質上同時執行的方法，亦即，其中一個方法步驟之至少一部分之執行在時間上與另一方法步驟之一部分之執行重疊。「同時」不需要精確的同步活動，亦即，不需要所有方法步驟同時開始或結束。在一個態樣中，「同時」可意謂將方法步驟所需之所有試劑併入至相同反應混合物中使得反應在相同的反應體積中或在相同的培育期期間進行。
如本文中所使用，「依序」結合本文所描述之方法步驟使用時係指其中各在不同時間點執行的方法，例如其中在方法之實踐中發生各別事件。在一個態樣中，在各別培育時段期間執行依序步驟。在一個態樣中，在不同反應混合物中執行依序步驟。在一個態樣中，在不同時間執行依序的方法步驟。在一個態樣中，依序的方法步驟在不同時間，但在相同的反應細胞中或在相同表面上執行。
「捕獲寡核苷酸」係指可固定於載體表面上且設計成與互補寡核苷酸標籤雜交（且因此在表面上捕獲）之寡核苷酸試劑。在一個態樣中，捕獲寡核苷酸為可例如在嚴格雜交條件下與存在於寡核苷酸探針上之單股寡核苷酸標籤選擇性地雜交的單股序列。捕獲寡核苷酸可以固體形式（例如凍乾）、溶液形式提供，或固定至載體表面，例如粒子（例如微粒、珠粒）上或陣列中。
「偵測」可指基於是否存在標記，偵測物質（諸如寡核苷酸）之存在或定量該物質。在一個態樣中，「偵測」係指測定是否存在物質（諸如寡核苷酸）之過程。在一個態樣中，「定量」係指測定物質（諸如寡核苷酸）之量的過程。
「對應」可用於指捕獲寡核苷酸與寡核苷酸標籤之間的關係，其中寡核苷酸標籤經設計以在嚴格雜交條件下與特定捕獲寡核苷酸序列特異性結合。在一個態樣中，寡核苷酸標籤在嚴格條件下與其對應的捕獲寡核苷酸特異性結合且不與其他捕獲寡核苷酸結合或不與其他捕獲寡核苷酸交叉反應。在一個態樣中，寡核苷酸標籤在嚴格條件下與其對應的捕獲寡核苷酸特異性結合且不與陣列中之其他捕獲寡核苷酸結合或不與其他捕獲寡核苷酸交叉反應。在一個態樣中，寡核苷酸標籤為具有與其「對應」捕獲寡核苷酸之序列之至少一部分互補之序列的單股寡核苷酸。在一個態樣中，基於華特生-克里克模型，「對應」寡核苷酸標籤之核苷酸與捕獲寡核苷酸序列具有100%序列互補性。在另一態樣中，基於華特生-克里克模型，對應序列之核苷酸具有至少約90%、95%、96%、97%、98%或99%序列互補性。
「對應」可用於指有義探針之有義結合部分或反義探針之反義結合部分與寡核苷酸雙螺旋體之各別有義股或反義股之間的關係。在一個態樣中，有義探針之有義結合部分與其寡核苷酸雙螺旋體之對應有義股特異性結合且不與樣本中之其他寡核苷酸雙螺旋體之有義股、寡核苷酸雙螺旋體之反義股或樣本中之寡核苷酸標籤結合或交叉反應。在一個態樣中，反義探針之反義結合部分與其寡核苷酸雙螺旋體之對應反義股特異性結合且不與樣本中之其他寡核苷酸雙螺旋體之反義股、寡核苷酸雙螺旋體之有義股或樣本中之寡核苷酸結合或交叉反應。在一個態樣中，基於華特生-克里克模型，「對應」有義結合部分或反義結合部分之核苷酸與有義寡核苷酸或反義寡核苷酸各別具有100%序列互補性。在另一態樣中，基於華特生-克里克模型，「對應」有義結合部分或反義結合部分之核苷酸與有義寡核苷酸或反義寡核苷酸各別具有至少約90%、95%、96%、97%、98%或99%序列互補性。
「交叉反應」或「交叉反應性」係指寡核苷酸序列與樣本中之多於一種其他寡核苷酸序列雜交之能力。在一個態樣中，術語「交叉反應」係指第一寡核苷酸序列與樣本中之第二寡核苷酸序列雜交之能力，其中第二寡核苷酸序列不與第一寡核苷酸序列互補或實質上互補。在一個態樣中，術語「交叉反應」或「交叉反應性」係指捕獲寡核苷酸與樣本中之多於一種寡核苷酸標籤或多於一種加標籤之目標核苷酸序列雜交之能力。在一個態樣中，交叉反應性捕獲寡核苷酸在嚴格捕獲雜交條件下與樣本中之一或多種寡核苷酸標籤雜交。「非交叉反應性（Non-cross - reactive/non-cross-reacting）」係指僅與樣本中之特定寡核苷酸序列雜交之第一寡核苷酸序列，例如第一寡核苷酸序列僅與樣本中之其對應互補序列雜交之能力。在一個態樣中，術語「非交叉反應性」係指捕獲寡核苷酸僅與樣本中之一種寡核苷酸標籤雜交之能力，該樣本包含多於一種寡核苷酸標籤或多於一種加標籤之目標核苷酸序列。在一個態樣中，非交叉反應性捕獲寡核苷酸在嚴格雜交條件下僅與樣本中之一種寡核苷酸標籤雜交。在一個態樣中，非交叉反應性意謂，第一寡核苷酸在嚴格雜交條件下與除樣本中之其互補序列以外之序列結合的比率小於0.05%。在一個態樣中，嚴格捕獲雜交條件包含在27℃與47℃之間的溫度、在21%與41%之間的甲醯胺濃度、在300 mM與500 mM之間的鹽濃度及在7.5與8.5之間的pH。在一個態樣中，嚴格捕獲雜交條件包含約37℃之溫度、約31%之甲醯胺濃度、約400 mM之鹽濃度及8.0之pH。
「陣列」係指具有多於一個空間不同（亦即，不重疊）的可尋址位置之一或多個載體表面，該等位置在本文中被稱作結合域或陣列元件。在一個態樣中，各可尋址位置包含分析試劑，包含例如捕獲寡核苷酸。
「載體表面」係指在其上可固定各種物質，例如一或多種捕獲寡核苷酸的表面材料。「載體表面」可為平面或非平面。在一個態樣中，載體表面包含平坦表面。在一個態樣中，載體表面為具有複數個孔之培養盤，亦即「多孔盤」。多孔盤可包含任何數目之以任何模式或組態排列之任何大小或形狀的孔。在另一態樣中，載體表面具有彎曲表面。在一個態樣中，載體表面係由一或多個粒子、珠粒或微球體提供。除非另外指示，否則術語粒子、珠粒或微球體可可互換地使用。在一個態樣中，載體表面包含顏色編碼的粒子、珠粒或微球體。在一個態樣中，載體表面包含分析模組，諸如分析培養盤、載玻片、料筒、珠粒或晶片。在一個態樣中，載體表面包含分析流動池或分析流體。
在一個態樣中，載體表面包含複數個可尋址位置（其可稱作「斑點」），例如如通常在「基因晶片」裝置中一樣。在另一態樣中，陣列包含複數個各自具有一個可尋址位置之載體表面，如在「珠粒陣列」方法中，其中珠粒懸浮液中之各珠粒代表一可尋址位置（其例如可使用流動式細胞測量術或顯微偵測技術尋址）。在另一態樣中，陣列包含每個表面各自具有一或多個或兩個或更多個可尋址位置之複數個載體表面。載體表面上之可尋址位置可以均一列及行排列，或可形成其他模式。陣列上之可尋址位置的數目可不同，例如自小於約10至大於約50、約100、約200、約500或約1000個。「多工（Multiplexing）」係指在單一分析中同時分析多於一個分析目標。
在分析中量測之分析物或分析中所使用之試劑的上下文下，術語「複數種」意謂超過一種結構上及/或功能上不同的分析物或試劑（例如試劑A及試劑B），而非僅僅分析物或試劑之超過一個複本（例如試劑A及試劑A之另一複本）。舉例而言，術語「複數種偵測試劑」意謂分析中存在超過一種結構上或功能上不同的偵測試劑，例如不同偵測試劑各自特異性結合不同目標分析物且不描述存在一種試劑之多個複本的情況。然而，在此上下文中使用術語「複數種」不排除存在複數種分析物或試劑中之任一者之多個複本的可能性。舉例而言，複數種固定靶向試劑補體可指包含靶向試劑補體A之一或多個複本及靶向試劑補體B之一或多個複本的固定靶向試劑補體。當提及複數種分析物或試劑時，術語「第一」、「第二」、「第三」等或「額外」可用於區分獨特的分析物或試劑。舉例而言，「第一」偵測試劑與「第一」目標分析物結合且「第二」偵測試劑與「第二」目標分析物或目標分析物之不同部分結合。
「獨特」為視組合物或混合物中存在之其他組分而定的相對術語。舉例而言，當結合核苷酸序列，例如探針之分析物結合部分之核苷酸序列使用時，術語「獨特」意謂一個分析物結合部分之核苷酸序列不同於組合物或混合物中之其他探針之分析物結合部分之核苷酸序列。類似地，當結合靶向試劑或寡核苷酸標籤使用時，術語「獨特」意謂靶向試劑寡核苷酸寡核苷酸標籤之核苷酸序列不同於組合物或混合物中之其他靶向試劑或標籤之核苷酸序列。術語「獨特」不排除「獨特」分析物或試劑之多個複本可存在於分析或樣本中的可能性。
「碳基」係指含有單質碳（C）作為主組分之材料。含碳或碳基材料之實例包含（但不限於）碳、碳黑、石墨碳、玻璃樣碳、碳奈米管、碳纖絲、石墨、碳纖維及其混合物。碳基材料可包含單質碳，包含例如石墨、碳黑或碳奈米管。在一個態樣中，碳基材料包含分散於基質中之導電碳-聚合物複合物、導電聚合物或導電粒子，例如碳墨、碳糊或金屬墨。導電碳粒子包含例如分散於基質中之碳纖絲、碳黑或石墨碳，該基質例如聚合物基質，諸如乙烯乙酸乙烯酯（ethylene vinyl acetate；EVA）、聚苯乙烯、聚乙烯、聚乙烯醇、聚乙酸乙烯酯、聚氯乙烯或丙烯腈丁二烯苯乙烯（acrylonitrile butadiene styrene；ABS）。此類聚合物基質亦可包含具有多於一個類型之組分單體之共聚物，該等組分單體可包含選自以下之單體：乙酸乙烯酯、乙烯、乙烯醇、氯乙烯、丙烯腈、丁二烯、苯乙烯或其他單體。
B. 概述本文提供一種用於偵測或定量樣本中之寡核苷酸雙螺旋體的方法。在一個態樣中，提供一種用於偵測或定量樣本中之寡核苷酸雙螺旋體之第一股及第二股的方法。在一個態樣中，提供一種用於偵測或定量樣本中之寡核苷酸雙螺旋體之有義股及反義股的方法。在一個態樣中，該方法用於偵測或定量雙股寡核苷酸治療劑之有義股及反義股。
本文所描述之方法提供一種用於表徵多種複雜生物樣本中之寡核苷酸治療劑的穩固及敏感方法，該等生物樣本包含例如生物流體，包含（但不限於）血漿、血清、全血、尿液、糞便、母乳、唾液及羊膜液；及組織或組織勻漿，包含（但不限於）器官或器官勻漿，諸如腦、肝臟、脾臟、心臟、肺及腎臟或其他組織，例如肌肉、皮膚、或骨髓。在一個態樣中，樣本為環境樣本。在一個態樣中，樣本包含製造過程樣本。
在一個態樣中，該方法可用於表徵治療劑寡核苷酸之例如藥物動力學、生物分佈及細胞吸收，包含（但不限於）藥物動力學（PK）、藥效動力學（PD）、清除、半衰期、峰值濃度、暴露-反應關係、生物分佈、組織靶向、組織聚積、組織生物可用性，或其組合。在一個態樣中，該方法可用於偵測或定量寡核苷酸雙螺旋體之兩個股，例如以評估雙螺旋體之穩定性以及寡核苷酸雙螺旋體之個別股之藥物動力學、生物分佈及細胞吸收。
在一個態樣中，方法或套組用於鑑別、偵測或定量微生物之一或多個核苷酸序列或變體。在一個態樣中，方法或套組用於鑑別、偵測或定量細菌、真菌、原蟲或病毒之一或多個核苷酸序列或變體。在一個態樣中，，方法或套組用於鑑別、偵測或定量作為人類微生物群落之組分的細菌、真菌、原蟲或病毒之一或多個核苷酸序列。在一個態樣中，方法或套組用於鑑別、偵測或定量來自細菌之16S rRNA或rDNA之一或多個核苷酸序列或變體。
在一個態樣中，細菌為無色桿菌屬（ Achromobacter）、胺基酸球菌屬（ Acidaminococcus ）、不動桿菌屬（ Acinetobacter）、放線菌目（ Actinomycetales）、氣球菌屬（ Aerococcus）、厭氧球菌屬（ Anaerococcus）、凝集桿菌屬（ Aggregatibacter）、氣單胞菌屬（ Aeromonas）、產鹼桿菌屬（ Alcaligenes）、厭氧螺菌屬（ Anaerobiospirillum）、奇異菌屬（ Atopobium）、芽孢桿菌屬（ Bacillus）、厚壁菌門（ Bacillota）、擬桿菌屬（ Bacteroides）、絲桿菌屬（ Bacterionema）、巴爾通體菌（ Bartonella）、雙岐桿菌屬（ Bifidobacterium）、博德特氏桿菌屬（ Bordetella）、螺旋體屬（ Borrelia）、布氏桿菌屬（ Brucella）、伯克霍爾德氏菌（ Burkholderia）、黑草屬（ Buchnera）、丁酸弧菌屬（ Butyriviberio）、曲狀桿菌屬（ Campylobacter）、嗜二氧化碳噬纖細菌屬（ Capnocytophaga）、心桿菌屬（ Cardiobacterium）、披衣菌屬（ Chlamydia）、嗜衣原體屬（ Chlamydophila）、柯林斯菌屬（ Collinsella）、檸檬酸桿菌屬（ Citrobacter）、梭菌屬（ Clostridium）、棒狀桿菌屬（ Corynebacterium）、痤瘡丙酸桿菌屬（ Cutibacterium）、小桿菌屬（ Dialister）、蠕形蟎屬（ Demodex）、埃格特菌屬（ Eggerthella）、艾肯菌屬（ Eikenella）、腸球菌屬（ Enterococcus）、腸桿菌屬（Enterobacter）、艾氏菌屬（ Escherichia）、真桿菌屬（ Eubacterium）、糞桿菌屬（ Faecalibacterium）、芬戈爾德菌屬（ Finegoldia ）、壁門菌屬（ Firmicutes）、黃桿菌屬（ Flavobacterium）、弗朗西斯氏菌屬（ Francisella）、梭桿菌屬（ Fusobacterium）、加德納菌屬（ Gardnerella ）、戈登氏菌屬（ Gordonia）、嗜血桿菌屬（ Haemophilus）、螺旋桿菌屬（ Helicobacter）、金氏菌屬（ Kingella）、克雷伯氏菌屬（ Klebsiella）、乳桿菌屬（ Lactobacillus）、退伍軍人桿菌屬（ Legionella）、鉤端螺旋體屬（ Leptospira）、纖毛菌屬（ Leptotrichia）、李氏菌屬（ Listeria）、巨型球菌屬（ Megasphaera）、甲烷短桿菌屬（ Methanobrevibacter）、微桿菌屬（ Microbacterium）、微球菌屬（ Micrococcus）、動彎桿菌屬（ Mobiluncus）、摩根氏菌屬（ Morganella）、莫拉菌屬（ Moraxella）、分支桿菌屬（ Mycobacterium）、微漿菌屬（ Mycoplasma）、奈瑟氏菌屬（ Neisseria）、消化球菌屬（ Peptococcus）、嗜腖菌屬（ Peptoniphilus）、消化鏈球菌屬（ Peptostreptococcus）、鄰單胞菌屬（ Plesiomonas）、卟啉單胞菌屬（ Porphyromonas）、普氏菌屬（ Prevotella）、丙酸桿菌屬（ Propionibacterium）、變形桿菌屬（ Proteus）、普羅威登斯菌屬（ Providencia）、假單胞菌屬（ Pseudomonas）、假單胞菌門（ Pseudomonadota）、立克次體菌（ Rickettsia）、羅氏菌屬（ Roseburia）、羅思氏菌屬（ Rothia）、瘤胃球菌屬（ Ruminococcus）、八疊球菌屬（ Sarcina）、沙門氏菌屬（ Salmonella）、月形單胞菌（ Selenomonas）、志賀桿菌屬（ Shigella）、小真桿菌屬（ Slackia）、斯尼思菌屬（ Sneathia）、螺旋體屬（ Spirochaeta）、葡萄球菌屬（ Staphylococcus）、鏈桿菌屬（ Streptobacillus）、鏈球菌屬（ Streptococcus）、鏈黴菌屬（ Streptomyces）、坦納菌屬（ Tannerella）、密螺旋體屬（ Treponema）、毛癬菌屬（ Trichophyton）、尿素微漿菌（ Ureaplasma）、範永氏球菌（ Veillonella）、弧菌屬（ Vibrio）、沃廉菌屬（ Wolinella）或耶爾森菌屬（ Yersinia）細菌。
在一個態樣中，提供一種用於偵測或定量樣本中之寡核苷酸雙螺旋體之有義股及反義股的方法。在一個態樣中，該方法包含使樣本與包含一組探針之組合物接觸，該組探針包含有義探針及反義探針。在一個態樣中，有義探針包含與固定於載體表面上之捕獲寡核苷酸之至少一部分互補的單股寡核苷酸標籤、能夠與寡核苷酸雙螺旋體之有義股之核苷酸序列雜交的有義結合部分，及一標記。在一個態樣中，反義探針包含與固定於載體表面上之第二捕獲寡核苷酸之至少一部分互補的單股寡核苷酸標籤、能夠與寡核苷酸雙螺旋體之反義股之核苷酸序列雜交的反義結合部分，及一標記。在一個態樣中，有義探針之有義結合部分具有比有義股之有義股長度短的有義結合長度。在一個態樣中，反義股之反義結合部分具有比反義股之反義股長度短的反義結合長度。
在一個態樣中，該方法進一步包含將探針與樣本一起培育以形成雜交混合物之步驟。在一個態樣中，雜交混合物包含「有效性」或「合乎需要的」雜交複合物，其中有義探針與寡核苷酸雙螺旋體之有義股雜交以形成有義複合物且反義探針與寡核苷酸雙螺旋體之反義股雜交以形成反義複合物。在一個態樣中，雜交混合物包含一或多種「非有效性」或不合需要的雜交複合物。非有效性雜交複合物之一個實例為當有義探針不能與寡核苷酸之有義股雜交時或當反義探針不能與寡核苷酸之反義股雜交時。非有效性雜交複合物之另一實例為當有義探針及反義探針彼此雜交以形成探針-探針複合物時。
圖1A為包含寡核苷酸雙螺旋體之反義股11及反義探針12的反義複合物10之示意圖，其中反義探針12包含寡核苷酸標籤13、反義結合部分14及標記15。圖1B為包含來自寡核苷酸雙螺旋體之有義股21及有義探針22的有義複合物20之示意圖，其中有義探針22包含寡核苷酸標籤23、有義結合部分24及標記25。
當嘗試偵測寡核苷酸雙螺旋體之有義股及反義股時出現的一個困難為由於探針-探針雜交而導致的潛在非有效性結合。雜交混合物中可能存在的含有寡核苷酸雙螺旋體之有義股及反義股以及有義及反義探針的雜交複合物展示於圖2A至圖2C（使用具有短結合部分之探針）及圖3A至圖3C（使用具有全長結合部分之探針）中。
圖2A為包含寡核苷酸雙螺旋體之反義股11及反義探針12的反義複合物10之示意圖，其中反義探針12包含寡核苷酸標籤13、「短」反義結合部分14及標記15。圖2B為包含來自寡核苷酸雙螺旋體之有義股21及有義探針22的有義複合物20之示意圖，其中有義探針22包含寡核苷酸標籤23、「短」有義結合部分24及標記25。如本文中所使用，術語「短」結合部分意謂反義及有義探針之結合部分具有分別比寡核苷酸雙螺旋體之反義股及有義股短（亦即，包含少至少一個核苷酸）的長度，使得反義複合物10中存在單股突出端16且有義複合物22中存在單股突出端26。
在一個態樣中，反義複合物10之反義股11之末端部分為單股。在一個態樣中，反義複合物10之反義股11之3'末端部分為單股。在一個態樣中，反義複合物10之反義股11之5'末端部分為單股。在一個態樣中，有義複合物20之有義股21之末端部分為單股。在一個態樣中，有義複合物20之有義股21之3'末端部分為單股。在一個態樣中，有義複合物20之有義股21之5'末端部分為單股。在一個態樣中，單股突出端為約1至約10個核苷酸長度、約1至約5個核苷酸長度、約1至約3個核苷酸長度，或約1至約2個核苷酸長度。在一個態樣中，單股突出端為約1、約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9或約10個核苷酸長度。
圖2C為探針-探針結合複合物40之示意圖，其中反義探針12之「短」反義結合部分14與有義探針22之「短」有義結合部分24雜交。在此情況下，當反義探針10具有「短」反義結合部分14且有義探針20具有「短」有義結合部分24時，探針-探針複合物40中存在暴露之單股突出端17及27。在一個態樣中，探針-探針複合物40中的反義探針12之反義結合部分14之5'端為單股。在一個態樣中，探針-探針複合物40中的有義探針22之有義結合部分24之5'端為單股。在一個態樣中，探針-探針複合物40中的反義探針12之反義結合部分14之5'端及有義探針22之有義結合部分24之5'端各自為單股。在一個態樣中，探針-探針複合物40中的反義探針12之反義結合部分14之3'端為單股。在一個態樣中，探針-探針複合物40中的有義探針22之有義結合部分24之3'端為單股。在一個態樣中，探針-探針複合物40中的反義探針12之反義結合部分14之3'端及有義探針22之有義結合部分24之3'端各自為單股。在一個態樣中，單股突出端為約1至約10個核苷酸長度、約1至約5個核苷酸長度、約1至約3個核苷酸長度，或約1至約2個核苷酸長度。在一個態樣中，單股突出端為約1、約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9或約10個核苷酸長度。
圖3A為包含寡核苷酸雙螺旋體之反義股11及反義探針12'的反義複合物10'之示意圖，其中反義探針12'包含寡核苷酸標籤13、「全長」反義結合部分14'及標記15。圖3B為包含來自寡核苷酸雙螺旋體之有義股21及有義探針22'的有義複合物20'之示意圖，其中有義探針22'包含寡核苷酸標籤23、「全長」有義結合部分24'及標記25。如本文中所使用，術語「全長」結合部分意謂反義及有義探針之結合部分具有分別與寡核苷酸雙螺旋體之反義股及有義股相同的長度（亦即，包含相同的核苷酸鹼基數目），使得反義10'或有義複合物20'中不存在單股突出端。圖3C為探針-探針結合複合物40'之示意圖，其中反義探針12'之「全長」反義結合部分14'與有義探針22'之「全長」有義部分24'雜交，其中不存在單股突出端。
在一個態樣中，在有義或反義探針之寡核苷酸標籤與固定於載體表面上之捕獲寡核苷酸雜交的條件下使載體表面與雜交混合物接觸。在一個態樣中，作為反義複合物之一部分的反義探針之寡核苷酸標籤與固定於載體表面上之捕獲寡核苷酸雜交。在一個態樣中，作為有義複合物之一部分的有義探針之寡核苷酸標籤與固定於載體表面上之捕獲寡核苷酸雜交。在圖4A中，反義探針之反義結合部分為「短的」，使得反義複合物之反義股部分包含單股突出端且有義探針之有義結合部分為「短的」使得有義複合物之有義股部分包含單股突出端。在圖4B中，反義探針之反義結合部分為「全長」使得反義複合物之反義股部分不包含單股突出端且有義探針之有義結合部分為「全長」使得有義複合物之有義股部分不包含單股突出端。反義或有義複合物分別經由反義或有義探針之寡核苷酸標籤與載體表面雜交的情況在本文中稱為「有效性」。
在一個態樣中，反義或有義探針之寡核苷酸標籤不分別為反義或有義複合物之一部分。不為反義複合物或有義複合物之雜交複合物經由反義探針之寡核苷酸標籤與載體表面雜交的情況在本文中稱為「非有效性」。在一個態樣中，如圖4C中所示，反義探針12或有義探針22之寡核苷酸標籤僅將反義探針12或有義探針22與載體表面30結合。在此情況下，反義探針12或有義探針22之反義結合部分14及有義結合部分24分別保持單股。
在一個態樣中，反義或有義探針之寡核苷酸標籤為探針-探針複合物之一部分且反義探針12或有義探針22之寡核苷酸標籤將探針-探針複合物40'固定於載體表面30上。在一個態樣中，如圖4D中所示，探針之反義結合部分及有義結合部分為「短的」使得探針-探針複合物40之結合部分中存在單股突出端。在一個態樣中，如圖4E中所示，探針之反義結合部分及有義結合部分為「全長」使得探針-探針複合物40'之結合部分中不存在單股突出端。
在一個態樣中，樣本包含複數個寡核苷酸雙螺旋體且組合物包含複數組探針，其中各組探針與獨特寡核苷酸雙螺旋體之獨特有義股或反義股雜交。
在一個態樣中，該方法包含逐步降低雜交條件，其中探針在退火溫度逐漸降低期間與其各別有義股或反義股雜交。在一個態樣中，雜交條件包含變性步驟，其中將樣本在第一溫度下培育以使寡核苷酸雙螺旋體之有義股及反義股變性。在一個態樣中，雜交條件包含退火步驟，其中將探針與寡核苷酸雙螺旋體之變性有義股及反義股在第二溫度下培育以允許有義及反義探針與有義股及反義股雜交。在一個態樣中，該方法包含在約2℃至約8℃之保持溫度下培育有義及反義複合物。
在一個態樣中，變性步驟包含在約60℃至約95℃之第一溫度下培育樣本以使寡核苷酸雙螺旋體之有義股及反義股變性。在一個態樣中，變性步驟包含在至少約60℃、約65℃、約70℃、約75℃、或約80℃且至多約85℃、約90℃、約95℃或約100℃之第一溫度下培育樣本。在一個態樣中，變性步驟包含在約60℃、約65℃、約70℃、約75℃、約80℃、約85℃、約90℃、約95℃或約100℃之第一溫度下培育樣本。在一個態樣中，雜交條件包含在約80℃至約95℃之第一溫度下培育樣本以使寡核苷酸雙螺旋體之有義股及反義股變性。在一個態樣中，雜交條件包含在約90℃至約95℃之第一溫度下培育樣本以使寡核苷酸雙螺旋體之有義股及反義股變性。在一個態樣中，雜交條件包含在約95℃之第一溫度下培育樣本以使寡核苷酸雙螺旋體之有義股及反義股變性。在一個態樣中，將樣本培育約1分鐘至約15分鐘。在一個態樣中，將樣本培育至少約30秒、約1分鐘、約2分鐘、約3分鐘、約4分鐘或約5分鐘且至多約10分鐘或約15分鐘。在一個態樣中，將樣本培育約30秒、約1分鐘、約2分鐘、約3分鐘、約4分鐘、約5分鐘、約10分鐘或約15分鐘。在一個態樣中，將樣本培育約1分鐘至約5分鐘。在一個態樣中，將樣本培育約1分鐘至約2分鐘。在一個態樣中，將樣本培育約2分鐘。在一個態樣中，變性步驟包含將探針與樣本在約60℃至約95℃之第一溫度下培育約1分鐘至約15分鐘以使寡核苷酸雙螺旋體之有義股及反義股變性。在一個態樣中，雜交條件包含將探針與樣本在約80℃至約95℃之第一溫度下培育約1分鐘至約5分鐘以使寡核苷酸雙螺旋體之有義股及反義股變性。在一個態樣中，雜交條件包含將探針與樣本在約95℃之第一溫度下培育約2分鐘以使寡核苷酸雙螺旋體之有義股及反義股變性。
在一個態樣中，退火步驟包含將探針與樣本在約10℃至約65℃之第二溫度下培育以允許有義及反義探針與有義股及反義股雜交。在一個態樣中，退火步驟包含將探針與樣本在至少約10℃、約15℃、約20℃、約25℃、約30℃、約35℃或約40℃且至多約45℃、約50℃、約55℃、約60℃或約65℃之第二溫度下培育以允許有義及反義探針與有義股及反義股雜交。在一個態樣中，退火步驟包含將探針與樣本在約10℃、約15℃、約20℃、約25℃、約30℃、約35℃、約40℃、約45℃、約50℃、約55℃、約60℃或約65℃之第二溫度下培育以允許有義及反義探針與有義股及反義股雜交。在一個態樣中，雜交條件包含將探針與樣本在約40℃與約65℃之第二溫度下培育以允許有義及反義探針與有義股及反義股雜交。在一個態樣中，雜交條件包含將探針與樣本在60℃至約65℃之第二溫度下培育以允許有義及反義探針與有義股及反義股雜交。在一個態樣中，雜交條件包含將探針與樣本在約65℃之第二溫度下培育以允許有義及反義探針與有義股及反義股雜交。在一個態樣中，退火步驟包含將探針與樣本在第二溫度下培育約30秒至約5分鐘以允許有義及反義探針與有義股及反義股雜交。在一個態樣中，退火步驟包含將探針與樣本在第二溫度下培育至少約30秒、約60秒、約90秒且至多約2分鐘、約3分鐘、約4分鐘或約5分鐘以允許有義及反義探針與有義股及反義股雜交。在一個態樣中，雜交條件包含將探針與樣本在第二溫度下培育約1分鐘至約2分鐘以允許有義及反義探針與有義股及反義股雜交。在一個態樣中，雜交條件包含將探針與樣本在第二溫度下培育以允許有義及反義探針與有義股及反義股雜交。在一個態樣中，退火步驟包含將探針與樣本在約10℃至約65℃之第二溫度下培育約30秒至約5分鐘以允許有義及反義探針與有義股及反義股雜交。在一個態樣中，雜交條件包含將探針與樣本在約40℃與約65℃之第二溫度下培育約1分鐘至約2分鐘以允許有義及反義探針與有義股及反義股雜交。在一個態樣中，雜交條件包含將探針與樣本在約65℃之第二溫度下培育約1分鐘以允許有義及反義探針與有義股及反義股雜交。在一個態樣中，雜交條件包含將探針與樣本在約2℃至約8℃之保持溫度下培育。在一個態樣中，雜交條件包含將探針與樣本在約4℃之保持溫度下培育。
在一個態樣中，退火步驟與保持之間的溫度轉變速率為約0.05℃/s至約0.5℃/s。在一個態樣中，退火步驟與固定之間的溫度轉變速率為約0.1℃ /s。
在一個態樣中，將探針與樣本在包含稀釋劑54之緩衝液或N-PLEX雜交緩衝液1或2中培育。
在一個態樣中，使含有雜交複合物之雜交混合物與單股特異性核酸酶接觸。在一個態樣中，首先在有義及反義探針之第一及第二寡核苷酸標籤與載體表面上之第一及第二捕獲寡核苷酸雜交以將雜交複合物固定於載體表面上的條件下使載體表面與雜交混合物接觸；及隨後使載體表面與單股特異性核酸酶接觸。在一個態樣中，使含有雜交複合物之雜交混合物與單股特異性核酸酶接觸以形成反應混合物；及隨後在有義及反義探針之寡核苷酸標籤與固定於載體表面上之捕獲寡核苷酸雜交的條件下使載體表面與反應混合物接觸。
在一個態樣中，單股特異性核酸酶包含單股特異性DNA酶。在一個態樣中，單股特異性DNA酶為S1核酸酶、P1核酸酶或綠豆核酸酶。在一個態樣中，單股特異性核酸酶包含單股特異性RNA酶。在一個態樣中，單股特異性RNA酶為RNA酶A、RNA酶H、RNA酶I、RNA酶III、RNA酶L、RNA酶P、RNA酶PhyM、RNA酶T1、RNA酶T2、RNA酶U2、RNA酶V、PNP酶、RNA酶PH、RNA酶R、RNA酶D、RNA酶T、RNA酶ONE、寡核糖核酸酶、核糖核酸外切酶I及核糖核酸外切酶II。
在一個態樣中，如圖4C中所示，單股核酸酶裂解未結合雜交複合物中之單股探針，從而使標記自探針脫離。有利地，此自探針移除標記且減少由未結合探針固定至載體表面所引起之背景。
在一個態樣中，如圖4D中所示，單股核酸酶自使用「短」探針形成之探針-探針複合物裂解單股突出端，自探針-探針複合物移除標記且藉此降低背景含量。
在一個態樣中，如圖4E中所示，探針-探針複合物係由FL探針形成，使得不存在單股突出端。在此情況下，標記保持固定於載體表面上，導致高背景含量。
在一個態樣中，使樣本與包含該組探針之組合物接觸、將探針與樣本一起培育以形成包含有義複合物及反義複合物之雜交複合物、使載體表面與包含雜交複合物之雜交混合物接觸及使載體表面與單股特異性核酸酶接觸的方法步驟中之一或多者係同時進行。在一個態樣中，使樣本與包含該組探針之組合物接觸、將探針與樣本一起培育以形成包含有義複合物及反義複合物之雜交複合物、使載體表面與包含雜交複合物之雜交混合物接觸及使雜交複合物與單股特異性核酸酶接觸的方法步驟均同時進行。
在一個態樣中，使樣本與包含該組探針之組合物接觸、將探針與樣本一起培育以形成包含雜交複合物（其包含有義複合物及反義複合物）之雜交混合物、使載體表面與雜交混合物接觸及使雜交複合物與單股特異性核酸酶接觸的方法步驟中之一或多者係依序進行。在一個態樣中，使樣本與包含該組探針之組合物接觸、將探針與樣本一起培育以形成包含雜交複合物（其包含有義複合物及反義複合物）之雜交混合物、使載體表面與雜交混合物接觸及使雜交複合物與單股特異性核酸酶接觸的方法步驟各自依序進行。
在一個態樣中，將載體表面與雜交複合物一起培育約15分鐘至約12小時。在一個態樣中，將載體表面與雜交複合物一起培育至少約15分鐘、約30分鐘、約1小時、約2小時、約3小時、約4小時、約5小時或約6小時且至多約6小時或約12小時。在一個態樣中，將載體表面與雜交複合物一起培育約30分鐘至約3小時。在一個態樣中，將載體表面與雜交複合物一起培育約1小時至約2小時。
在一個態樣中，將載體表面與雜交複合物一起在約20℃至約40℃之溫度下培育。在一個態樣中，將載體表面與雜交複合物一起在至少約20℃、約25℃、或約30℃且至多約25℃、或約40℃之溫度下培育。在一個態樣中，將載體表面與雜交複合物一起在約20℃至約40℃之溫度下培育。在一個態樣中，將載體表面與雜交複合物一起在約30℃至約40℃之溫度下培育。在一個態樣中，將載體表面與雜交複合物一起在約35℃至約40℃之溫度下培育。在一個態樣中，將載體表面與雜交複合物一起在約35℃、約36℃、約37℃、約38℃、約39℃或約40℃之溫度下培育。在一個態樣中，將載體表面與有義及反義複合物一起在約37℃之溫度下培育。
在一個態樣中，將載體表面與雜交複合物一起在振盪下，在約700 rpm至約900 rpm之振盪下培育。在一個態樣中，將載體表面與雜交複合物一起在振盪下，在約700 rpm、705 rpm、710 rpm、725 rpm、750 rpm且至多約800 rpm、約850 rpm或約900 rpm之振盪下培育。在一個態樣中，將載體表面與雜交複合物一起在約705 rpm之振盪下培育。
在一個態樣中，將載體表面與雜交複合物一起在約20℃至約40℃之溫度下培育約15分鐘至約12小時。在一個態樣中，將載體表面與雜交複合物一起在約20℃至約40℃之溫度下培育約1小時至約2小時。在一個態樣中，將載體表面與有義及反義複合物一起在振盪下培育。在一個態樣中，將載體表面與有義及反義複合物一起在約37℃之溫度下，同時在約705 rpm之振盪下培育約1小時。
在一個態樣中，樣本包含複數個寡核苷酸雙螺旋體且探針組合物包含複數組探針，其中各組探針與獨特寡核苷酸雙螺旋體之獨特有義股或反義股雜交。在一個態樣中，探針組合物包含約20 pM至約10 nM有義探針。在一個態樣中，探針組合物包含約20 pM、約50 pM、約100 pM、約150 pM、約200 pM或約250 pM且至多約0.5 nM、約1 nM、約5 nM或約10 nM有義探針。在一個態樣中，探針組合物包含約100 pM至約500 pM有義探針。在一個態樣中，探針組合物包含約20 pM至約200 pM有義探針。在一個態樣中，探針組合物包含約20 pM至約100 pM有義探針。在一個態樣中，探針組合物包含約20 pM、約50 pM、約100 pM、約150 pM、約200 pM或約250 pM且至多約0.5 nM、約1 nM、約5 nM或約10 nM反義探針。在一個態樣中，探針組合物包含約100 pM至約500 pM反義探針。在一個態樣中，探針組合物包含約20 pM至約200 pM反義探針。
在一個態樣中，該方法包含基於固定於載體表面上之標記之存在來偵測或定量寡核苷酸雙螺旋體之有義股及反義股。在一個態樣中，該方法具有小於約200 pg/mL之偵測極限（LLOD）。
C. 寡核苷酸雙螺旋體在一個態樣中，本文所描述之方法用於偵測樣本中之寡核苷酸雙螺旋體。在一個態樣中，本文所描述之方法用於偵測寡核苷酸雙螺旋體之第一股及第二股。在一個態樣中，寡核苷酸雙螺旋體為雙股寡核苷酸治療劑。在一個態樣中，寡核苷酸治療劑包含有義股及反義股。
在一個態樣中，寡核苷酸雙螺旋體之兩個股包含DNA。在一個態樣中，寡核苷酸雙螺旋體為DNA/DNA雙螺旋體。在一個態樣中，寡核苷酸雙螺旋體之兩個股包含RNA。在一個態樣中，寡核苷酸雙螺旋體為RNA/RNA雙螺旋體。在一個態樣中，寡核苷酸雙螺旋體之一個股包含DNA且寡核苷酸雙螺旋體之一個股包含RNA。在一個態樣中，寡核苷酸雙螺旋體為DNA/RNA異雙螺旋體。在一個態樣中，寡核苷酸雙螺旋體之有義股包含DNA。在一個態樣中，寡核苷酸雙螺旋體之有義股包含RNA。在一個態樣中，寡核苷酸雙螺旋體之反義股包含DNA。在一個態樣中，寡核苷酸雙螺旋體之反義股包含RNA。
在一個態樣中，寡核苷酸雙螺旋體之一個股或兩個股包含一或多個經修飾之核苷酸。在一個態樣中，寡核苷酸雙螺旋體之一個股包含DNA及一或多個經修飾之核苷酸。在一個態樣中，寡核苷酸雙螺旋體之一個股包含RNA及一或多個經修飾之核苷酸。在一個態樣中，寡核苷酸雙螺旋體之反義股包含DNA及一或多個經修飾之核苷酸。在一個態樣中，寡核苷酸雙螺旋體之反義股包含RNA及一或多個經修飾之核苷酸。在一個態樣中，寡核苷酸雙螺旋體之有義股包含DNA及一或多個經修飾之核苷酸。在一個態樣中，寡核苷酸雙螺旋體之有義股包含RNA及一或多個經修飾之核苷酸。在一個態樣中，經修飾之核苷酸包含核鹼基、糖或核苷酸間鍵處之修飾。在一個態樣中，寡核苷酸雙螺旋體之有義股、反義股或有義股及反義股兩者分別包含一或多個經修飾之核酸。在一個態樣中，寡核苷酸雙螺旋體之有義股、反義股或有義股及反義股兩者分別包含5'-生物結合物或3'-生物結合物。在一個態樣中，生物結合物包含聚乙二醇（PEG）、N-乙醯半乳胺糖（GalNAc）、細胞穿透肽（CPP）、α-生育酚、適體、抗體、膽固醇、鯊烯、脂肪酸或核脂。
在一個態樣中，寡核苷酸雙螺旋體之各股獨立地包含約5至約100個核苷酸。在一個態樣中，寡核苷酸雙螺旋體之各股獨立地包含約5、約6、約7、約8、約9、約10、約11、約12、約13、約14、約15、約20、約25或約30個核苷酸且至多約30、約35、約40、約45、約50或約100個核苷酸長度。在一個態樣中，寡核苷酸雙螺旋體之各股包含約8至約50個核苷酸、約10至約40個核苷酸、約10至約30個核苷酸、約12至約30個核苷酸、約16至約30或約18至約30個核苷酸。
D. 寡核苷酸探針在一個態樣中，提供能夠與寡核苷酸雙螺旋體之有義股雜交的有義探針。在一個態樣中，提供能夠與寡核苷酸雙螺旋體之反義股雜交的反義探針。在一個態樣中，提供一種反義探針，其包含寡核苷酸標籤、反義結合部分及標記。在一個態樣中，提供一種有義探針，其包含寡核苷酸標籤、有義結合部分及標記。
1. 寡核苷酸標籤在一個態樣中，有義及反義探針包含具有與捕獲寡核苷酸之寡核苷酸序列雜交之核酸序列的寡核苷酸標籤。在一個態樣中，寡核苷酸標籤包含與單股捕獲寡核苷酸之核苷酸序列之至少一部分互補的單股寡核苷酸。在一個態樣中，寡核苷酸標籤與其對應捕獲寡核苷酸雜交。
在一個態樣中，寡核苷酸標籤不與不為其對應捕獲寡核苷酸之捕獲寡核苷酸交叉反應或雜交。在一個態樣中，寡核苷酸標籤在嚴格雜交條件下不與不為其對應捕獲寡核苷酸之捕獲寡核苷酸交叉反應或雜交。在一個態樣中，寡核苷酸標籤不與寡核苷酸雙螺旋體之有義股或反義股雜交。在一個態樣中，有義探針之寡核苷酸標籤不與反義探針之反義結合部分雜交，或反之亦然。在一個態樣中，有義探針之寡核苷酸標籤在生理學相關或嚴格條件下不與反義探針之反義結合部分雜交。在一個態樣中，反義探針之寡核苷酸標籤在生理學相關或嚴格條件下不與有義探針之有義結合部分雜交。在一個態樣中，寡核苷酸標籤在生理學相關或嚴格條件下不與寡核苷酸雙螺旋體之有義股或反義股雜交。
在一個態樣中，基於華特生-克里克模型，寡核苷酸標籤及其對應捕獲寡核苷酸具有100%「序列互補性」。在一個態樣中，寡核苷酸標籤及捕獲寡核苷酸具有基於華特生-克里克模型具有至少約90%、約95%、約96%、約97%、約98%或約99%序列互補性的序列。
在一個態樣中，寡核苷酸標籤係以重組方式產生的。在一個態樣中，寡核苷酸標籤係化學合成的。在一個態樣中，寡核苷酸標籤不係天然存在之序列。在一個態樣中，寡核苷酸標籤包含單股DNA序列。在一個態樣中，寡核苷酸標籤包含單股RNA序列。在一個態樣中，有義探針之寡核苷酸標籤包含RNA。在一個態樣中，反義探針之寡核苷酸標籤包含RNA。在一個態樣中，有義探針之寡核苷酸標籤包含DNA。在一個態樣中，反義探針之寡核苷酸標籤包含DNA。
在一個態樣中，反義探針之寡核苷酸標籤包含一或多個經修飾之核酸。在一個態樣中，反義探針之寡核苷酸標籤包含一或多個經修飾之核苷酸，其選自磷酸二酯（PO）；硫代磷酸酯（PS）；2'O-甲基（2'OMe）；2'O-甲氧基乙基（MOE）；肽核酸（PNA）；磷醯胺酸(N-
Figure 02_image001
啉基)（PMO）；鎖核酸（LNA）；2'-去氧-2'-氟（2'-F）；或其組合。在一個態樣中，反義探針之寡核苷酸標籤包含鎖核酸（LNA）。
在一個態樣中，有義探針之寡核苷酸標籤包含一或多個經修飾之核酸。在一個態樣中，有義探針之寡核苷酸標籤包含一或多個經修飾之核苷酸，其選自磷酸二酯（PO）；硫代磷酸酯（PS）；2'O-甲基（2'OMe）；2'O-甲氧基乙基（MOE）；肽核酸（PNA）；磷醯胺酸(N-
Figure 02_image001
啉基)（PMO）；鎖核酸（LNA）；2'-去氧-2'-氟（2'-F）；或其組合。在一個態樣中，有義探針之寡核苷酸標籤包含鎖核酸（LNA）。
在一個態樣中，寡核苷酸標籤包含一或多個經修飾之核苷酸。
在一個態樣中，寡核苷酸標籤與反義探針之5'端連接。在一個態樣中，寡核苷酸標籤與反義探針之3'端連接。在一個態樣中，寡核苷酸標籤與有義探針之5'端連接。在另一態樣中，寡核苷酸標籤與有義探針之3'端連接。在一個態樣中，寡核苷酸標籤不與寡核苷酸雙螺旋體之有義股或反義股互補且不與其雜交。
在一個態樣中，寡核苷酸標籤具有至少約15、約16、約17、約18、約19、約20、約21、約22、約23、約24或約25且至多約25、約26、約27、約28、約29、約30、約31、約32、約33、約34、約35、約36、約37、約38、約39或約40、或約15及約40、或約20及約30個核苷酸長度的核苷酸序列。在一個態樣中，寡核苷酸標籤包含比互補捕獲寡核苷酸序列短至少約1、約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9或約10且至多約11、約12、約13、約14、約15、約16、約17、約18、約19或約20或約1至約20、約10至約15或約12至約13個核苷酸的核苷酸序列。在一個態樣中，標籤具有至少約24、約30或約36個核苷酸長度之核苷酸序列。在一個態樣中，寡核苷酸標籤具有與對應捕獲寡核苷酸之長度相同的的長度。在一個態樣中，寡核苷酸標籤具有比對應捕獲寡核苷酸之長度短的長度。
2. 結合部分在一個態樣中，反義探針包含反義結合部分。在一個態樣中，反義探針之反義結合部分具有與寡核苷酸雙螺旋體之反義股之核酸序列互補的核酸序列。在一個態樣中，反義探針之反義結合部分能夠與寡核苷酸雙螺旋體之反義股雜交。在一個態樣中，基於華特生-克里克模型，寡核苷酸雙螺旋體之反義結合部分及反義股具有100%「序列互補性」。在一個態樣中，寡核苷酸雙螺旋體之反義結合部分及反義股具有基於華特生-克里克模型具有至少約90%、約95%、約96%、約97%、約98%或約99%序列互補性的序列。
在一個態樣中，有義探針包含有義結合部分。在一個態樣中，有義探針之有義結合部分具有與寡核苷酸雙螺旋體之有義股之核酸序列互補的核酸序列。在一個態樣中，有義探針之有義結合部分能夠與寡核苷酸雙螺旋體之有義股雜交。在一個態樣中，基於華特生-克里克模型，寡核苷酸雙螺旋體之有義結合部分及有義股具有100%「序列互補性」。在一個態樣中，寡核苷酸雙螺旋體之有義結合部分及有義股具有基於華特生-克里克模型具有至少約90%、約95%、約96%、約97%、約98%或約99%序列互補性的序列。
在一個態樣中，反義探針之反義結合長度比反義股之反義股長度短至少1個核苷酸。在一個態樣中，反義結合部分具有比寡核苷酸雙螺旋體之反義股短約1至約10個核苷酸的長度。在一個態樣中，反義結合部分具有比寡核苷酸雙螺旋體之反義股短約1至約5個核苷酸的長度。在一個態樣中，反義結合部分之長度為約10至約25個核苷酸、或約10至約20個核苷酸、或約10至約16個核苷酸長度。在一個態樣中，反義探針之反義結合部分之長度為寡核苷酸雙螺旋體之反義股之長度之約50%至約99%。在一個態樣中，反義探針之反義結合部分之長度為寡核苷酸雙螺旋體之反義股之長度的約75%至約95%。
在一個態樣中，有義探針之有義結合長度比有義股之有義股長度短至少1個核苷酸。在一個態樣中，有義結合部分具有比寡核苷酸雙螺旋體之有義股短約1至約10個核苷酸的長度。在一個態樣中，有義結合部分具有比寡核苷酸雙螺旋體之有義股短約1至約5個核苷酸的長度。在一個態樣中，有義結合部分之長度為約10至約25個核苷酸、或約10至約20個核苷酸、或約10至約16個核苷酸長度。在一個態樣中，有義探針之有義結合部分之長度為寡核苷酸雙螺旋體之有義股之長度的約50%至約99%。在一個態樣中，有義探針之有義結合部分之長度為寡核苷酸雙螺旋體之有義股之長度的約75%至約95%。
在一個態樣中，有義探針之有義結合部分具有與寡核苷酸雙螺旋體之有義股之3'端對準的5'端。在一個態樣中，有義探針之有義結合部分具有與寡核苷酸雙螺旋體之有義股之5'端對準的3'端。在一個態樣中，反義探針之反義結合部分具有與寡核苷酸雙螺旋體之反義股之3'端對準的5'端。在一個態樣中，反義探針之反義結合部分具有與寡核苷酸雙螺旋體之反義股之5'端對準的3'端。
在一個態樣中，反義探針之反義結合部分包含DNA。在一個態樣中，反義探針之反義結合部分包含RNA。在一個態樣中，有義探針之有義結合部分包含DNA。在一個態樣中，有義探針之有義結合部分包含RNA。
在一個態樣中，反義探針之反義結合部分及寡核苷酸標籤包含DNA。在一個態樣中，反義探針之反義結合部分及寡核苷酸標籤包含RNA。在一個態樣中，反義探針之反義結合部分包含DNA且反義探針之寡核苷酸標籤包含RNA。在一個態樣中，反義探針之反義結合部分包含RNA且反義探針之寡核苷酸標籤包含DNA。
在一個態樣中，有義探針之有義結合部分及寡核苷酸標籤包含DNA。在一個態樣中，有義探針之有義結合部分及寡核苷酸標籤包含RNA。在一個態樣中，有義探針之有義結合部分包含DNA且有義探針之寡核苷酸標籤包含RNA。在一個態樣中，有義探針之有義結合部分包含RNA且有義探針之寡核苷酸標籤包含DNA。
在一個態樣中，反義探針為嵌合探針，其包含：包含DNA之反義結合部分及包含RNA之寡核苷酸標籤，其中反義探針之反義結合部分具有比寡核苷酸雙螺旋體之反義股之反義股長度短至少1個核苷酸的反義結合長度。在一個態樣中，反義探針為嵌合探針，其包含：包含RNA之反義結合部分及包含DNA之寡核苷酸標籤，其中反義探針之反義結合部分具有比寡核苷酸雙螺旋體之反義股之反義股長度短至少1個核苷酸的反義結合長度。在一個態樣中，有義探針為嵌合探針，其包含：包含DNA之有義結合部分及包含RNA之寡核苷酸標籤，其中有義探針之有義結合部分具有比寡核苷酸雙螺旋體之有義股之有義股長度短至少1個核苷酸的有義結合長度。在一個態樣中，有義探針是嵌合探針，其包含：包含RNA之有義結合部分及包含DNA之寡核苷酸標籤，其中有義探針之有義結合部分具有比寡核苷酸雙螺旋體之有義股之有義股長度短至少1個核苷酸的有義結合長度。
在一個態樣中，反義探針之結合部分包含一或多個經修飾之核酸。在一個態樣中，反義探針之結合部分包含一或多個經修飾之核苷酸，其選自磷酸二酯（PO）；硫代磷酸酯（PS）；2'O-甲基（2'OMe）；2'O-甲氧基乙基（MOE）；肽核酸（PNA）；磷醯胺酸(N-
Figure 02_image001
啉基)（PMO）；鎖核酸（LNA）；2'-去氧-2'-氟（2'-F）；或其組合。在一個態樣中，反義探針之結合部分包含鎖核酸（LNA）。
在一個態樣中，有義探針之結合部分包含一或多個經修飾之核酸。在一個態樣中，有義探針之結合部分包含一或多個經修飾之核苷酸，其選自磷酸二酯（PO）；硫代磷酸酯（PS）；2'O-甲基（2'OMe）；2'O-甲氧基乙基（MOE）；肽核酸（PNA）；磷醯胺酸(N-
Figure 02_image001
啉基)（PMO）；鎖核酸（LNA）；2'-去氧-2'-氟（2'-F）；或其組合。在一個態樣中，有義探針之結合部分包含鎖核酸（LNA）。
3. 標記在一個態樣中，探針包含標記。在一個態樣中，標記直接與探針連接。在另一態樣中，標記經由連接子與探針連接。在一個態樣中，標記與探針之5'端連接。在一個態樣中，標記與探針之3'端連接。在一個態樣中，標記為初級標記。在一個態樣中，初級標記具有可偵測物理特性。初級標記之實例包含（但不限於）放射性同位素、酶、受質、螢光分子、化學發光部分、電化學發光（ECL）部分、磁性粒子及生物發光部分。在一個態樣中，初級標記為電化學發光（ECL）標記。在一個態樣中，ECL標記為包含過渡金屬（例如釕）之有機金屬錯合物。在一個態樣中，初級標記為MSD SULFO-TAG標記（Meso Scale Diagnostics, LLC，美國馬里蘭州羅克維爾市（Rockville, MD, U.S.A.））。
在一個態樣中，標記為結合對之成員的化合物，其中結合對之第一成員（其可稱作「初級結合試劑」）與受質（例如寡核苷酸）連接，且結合對之另一成員（其可稱作「次級結合試劑」）具有可偵測物理特性或與具有可偵測物理特性之部分連接。結合對之非限制性實例包含生物素及抗生蛋白鏈菌素或抗生物素蛋白；互補寡核苷酸；半抗原及半抗原結合搭配物；及抗體-抗原結合對。在一個態樣中，標記為包含生物素之初級結合劑。在一個態樣中，次級結合試劑包含抗生蛋白鏈菌素。在一個態樣中，次級結合試劑包含MSD SULFO-TAG標記（Meso Scale Diagnostics, LLC，美國馬里蘭州羅克維爾市）。
E. 樣本在一個態樣中，寡核苷酸雙螺旋體係在樣本中。在一個態樣中，樣本為自所關注之來源獲得或衍生的生物樣本。在一個態樣中，樣本為生物體或獲自生物體。在一個態樣中，樣本為植物或獲自植物。在一個態樣中，樣本為動物或獲自動物。在一個態樣中，樣本係獲自哺乳動物。在一個態樣中，樣本係獲自人類。在一個態樣中，所關注之來源包含生物反應器。在一個態樣中，樣本為製造過程樣本。在一個態樣中，樣本為環境樣本。在一個態樣中，環境樣本包含水樣本，包含例如含水層樣本、地下水樣本或廢水樣本。在一個態樣中，環境樣本包含土壤樣本。在一個態樣中，環境樣本包含土壤微生物樣本。在一個態樣中，樣本包含游離DNA。
在一個態樣中，樣本包含生物樣本。在一個態樣中，樣本包含未處理之生物樣本。在一個態樣中，樣本包含經預處理之生物樣本。在一個態樣中，樣本經預處理以例如移除一或多種組分或添加一或多種試劑。在一個態樣中，樣本包含純化樣本。自生物樣本純化寡核苷酸之方法為已知的且包含例如沈澱、離心及管柱層析法。在一個態樣中，管柱層析法包含高效液相層析（HPLC），例如逆相高效液相層析（RP-HPLC）、陰離子交換高壓液相層析（AEX HPLC）或聚丙烯醯胺凝膠電泳（PAGE）。在一個態樣中，樣本為經萃取之樣本。在一個態樣中，例如使用半透膜過濾樣本。在一個態樣中，樣本包含自樣本萃取或藉由使樣本經受諸如mRNA之擴增或反轉錄的技術而獲得的寡核苷酸。
在一個態樣中，樣本包含一或多個目標寡核苷酸序列。在一個態樣中，樣本包含一或多個經擴增之目標寡核苷酸序列。在一個態樣中，樣本包含藉由包含（但不限於）聚合酶鏈反應（PCR）或滾環擴增（RCA）之方法而獲得的一或多個經擴增之目標寡核苷酸序列。
在一個態樣中，生物樣本包含生物組織或流體，包含例如體液、分泌物、排泄物、細胞、組織或器官或其勻漿。在一個態樣中，生物流體包含血漿、血清、全血、淋巴、尿液、糞便、母乳、痰液、唾液、腹水、腦脊髓液、腹膜液、胸膜液及羊膜液。在一個態樣中，生物組織包含組織或組織勻漿，包含（但不限於）器官或器官勻漿，諸如腦、肝臟、脾臟、心臟、肺及腎臟或其他組織，例如肌肉、皮膚或骨髓。在一個態樣中，生物樣本包含組織或細針穿刺生檢樣本、含細胞之體液、游離漂浮核酸、婦科流體、皮膚拭子、陰道拭子、口腔拭子、經鼻拭子、沖洗或灌洗（諸如導管灌洗或支氣管肺泡灌洗）、抽吸、刮片；手術標本。
在一個態樣中，生物樣本包含自人體之一部分分離的樣本。在一個態樣中，生物樣本包含自鼻道、口腔、皮膚、耳、黏液膜、胃腸道、泌尿生殖道、呼吸道、眼睛或其組合分離之樣本。在一個態樣中，生物樣本包含使用本領域中已知的方法（包含（但不限於）擦拭、穿刺採樣及血清採樣）自人體之一部分獲得的樣本。
在一個態樣中，樣本包含天然存在之RNA酶。對於包含天然存在之RNA酶的樣本，可能需要在使樣本與有義及反義探針接觸之前，使樣本與RNA酶抑制劑接觸。
F. 捕獲寡核苷酸在一個態樣中，該方法或套組包含固定於或可固定於載體表面上之分散結合域中之一或多個捕獲寡核苷酸。在一個態樣中，捕獲寡核苷酸不為天然存在之序列。在另一態樣中，捕獲寡核苷酸係以重組方式產生的。在一個態樣中，捕獲寡核苷酸係化學合成的。
在一個態樣中，捕獲寡核苷酸為具有與單股寡核苷酸標籤之核苷酸序列互補之核苷酸序列的單股捕獲寡核苷酸。在一個態樣中，寡核苷酸標籤與有義或反義探針連接。
在一個態樣中，該方法或套組包含所關注之寡核苷酸雙螺旋體之有義股及反義股之獨特捕獲寡核苷酸。在一個態樣中，將捕獲寡核苷酸固定於載體表面上。在一個態樣中，將捕獲寡核苷酸固定於陣列中。在一個態樣中，陣列包含兩個或更多個捕獲寡核苷酸。在一個態樣中，陣列包含約2至約150個或更多個捕獲寡核苷酸。
在一個態樣中，一或多個捕獲寡核苷酸包含單股核酸序列，包含例如含去氧核糖核酸（DNA）、核糖核酸（RNA）或包含亦可參與雜交反應之非天然存在之化學結構之結構類似物的核酸序列。
在一個態樣中，特定陣列中所使用之捕獲寡核苷酸具有類似結合能或解鏈溫度（Tm），例如彼此在至少約0.5℃、約1℃、約2℃、約3℃、約4℃或約5℃內，其中寡核苷酸之解鏈溫度（T m）係指50%之寡核苷酸與其互補序列雜交且50%游離於溶液中之溫度。可使用已知方法，例如藉由量測隨溫度變化之具有其互補序列之寡核苷酸之吸光度變化，來測定T m。在一個態樣中，捕獲寡核苷酸在50 mM NaCl下具有約50℃與約70℃之間、約55℃與約65℃之間或至少約50℃、約55℃、或約60℃且至多約60℃、約65℃或約70℃之解鏈溫度（T m）。在一個態樣中，捕獲寡核苷酸具有約40%與約60%之間或約40%與約50%之間的GC含量。
在一個態樣中，捕獲寡核苷酸之長度在約20與約100、約30與約50、或約35與約40個核苷酸之間，例如至少約20、約21、約22、約23、約24、約25、約26、約27、約28、約29、約30、約31、約32、約33、約34、約35或約36且至多約36、約37、約38、約39、約40、約41、約42、約43、約44、約45、約46、約47、約48、約49、約50、約75或約100個核苷酸長度。在一個態樣中，捕獲寡核苷酸包含至少20、約24、約30或約36個核苷酸。在一個態樣中，陣列中之一或多個捕獲寡核苷酸之長度與其互補寡核苷酸標籤之核酸序列不一致。在一個態樣中，捕獲寡核苷酸具有比其互補單股寡核苷酸標籤之序列長例如至多約5、約10、約15、約20或約25個鹼基的序列。
在一個態樣中，將一或多個捕獲寡核苷酸共價或非共價固定至載體表面。在一個態樣中，將一或多個捕獲寡核苷酸共價或非共價固定至載體表面上之一或多個結合域。在一個態樣中，捕獲寡核苷酸經由例如寡核苷酸上之帶負電磷酸酯基團與載體表面上之正電荷之間的靜電相互作用而吸附至載體表面。在一個態樣中，一或多個捕獲寡核苷酸經由與捕獲寡核苷酸連接（直接或經由連接子部分）之第一結合搭配物與固定於表面上之第二結合搭配物之結合而固定至載體表面。在一個態樣中，將一或多個捕獲寡核苷酸共價固定至載體表面。在一個態樣中，將一或多個捕獲寡核苷酸直接固定至載體表面。在另一態樣中，捕獲寡核苷酸經由連接子固定至載體表面。
捕獲寡核苷酸揭示於名稱為「用於偵測樣本中之一或多個目標核酸分析物之套組及其製備及使用方法（KITS FOR DETECTING ONE OR MORE TARGET NUCLEIC ACID ANALYTES IN A SAMPLE AND METHOD OF MAKING AND USING THE SAME）」（Meso Scale Technologies, LLC.，美國馬里蘭州羅克維爾市）的國際申請公開案第WO 2020/227016號中，其揭示內容以全文引用的方式併入本文中。
G. 載體表面在一個態樣中，將一或多個捕獲寡核苷酸固定於載體表面上。可將捕獲寡核苷酸固定於多種載體表面上，包含習知結合分析中使用之載體表面。在一個態樣中，載體表面具有平坦表面。在另一態樣中，載體表面具有彎曲表面。在一個態樣中，載體表面包含分析模組，諸如分析培養盤、載玻片、料筒、珠粒或晶片。在一個態樣中，載體表面包含顏色編碼的微球體。參見例如Yang等人 (2001) 《BADGE，偵測基因表現之珠粒陣列，一種高通量診斷性生物分析（BADGE, BeadsArray for the Detection of Gene Expression, a High-Throughput Diagnostic Bioassay）》.《基因體研究（ Genome Res）》. 11(11):1888-1898。在一個態樣中，載體表面包含其上固定一或多個捕獲寡核苷酸之一或多個珠粒。
載體表面可由各種適合材料製成，該等材料包含聚合物，諸如聚苯乙烯及聚丙烯；陶瓷；玻璃；複合材料，包含例如碳-聚合物複合物，諸如碳基墨。在一個態樣中，載體表面為碳基載體表面。
在一個態樣中，載體表面係由一或多個粒子或「珠粒」提供。在一個態樣中，珠粒可具有至多約1 cm（或約10,000 µm）、約5,000 µm、約1,000 µm、約500 µm或約100 µm之直徑。在一個態樣中，珠粒具有在約10 nm與約100 µm之間、在約100 nm與約10 µm之間或在約0.5 µm與約5 µm之間的直徑。在一個態樣中，珠粒為順磁性的，提供經由使用磁場捕獲珠粒之能力。在一個態樣中，載體表面係藉由抗生蛋白鏈菌素或抗生物素蛋白塗覆之磁性珠粒提供，且將經生物素標記之捕獲寡核苷酸固定於珠粒上。
在一個態樣中，載體表面為具有複數個孔之培養盤，亦即「多孔盤」。多孔盤可包含任何數目之以任何模式或組態排列之任何大小或形狀的孔。在一個態樣中，多孔盤包含約1與約10,000個之間的孔。在一個態樣中，多孔分析培養盤之培養盤及孔之數目、大小、形狀及組態使用行業標準型式。標準型式之實例包含96孔、384孔、1536孔及9600孔盤，其中孔組態於二維陣列中。其他多孔型式包含單孔、兩孔、六孔及二十四孔及6144孔盤。在一個態樣中，載體表面包含96孔盤。
在一個態樣中，載體表面包含二維圖案化陣列，其中捕獲寡核苷酸印刷在已知位置（被稱作結合域）處。在一個態樣中，載體表面包含其中固定捕獲寡核苷酸之分散、不重疊、可尋址結合域之圖案化陣列，其中各結合域中之捕獲寡核苷酸之序列為已知的且可與適當目標分析物有關。在一個態樣中，特定結合域中之所有捕獲寡核苷酸具有相同序列，且一個結合域中之捕獲寡核苷酸具有不同於其他結合域中之捕獲寡核苷酸的序列。在一個態樣中，多個結合域在載體表面上以有序的列及行排列，且將各結合域之精確位置及序列記錄在電腦資料庫中。在一個態樣中，陣列以對稱柵格圖案排列。在其他態樣中，陣列以另一圖案排列，包含（但不限於）徑向分佈線、螺旋線或有序簇。在另一態樣中，各結合域位於一或多個微米粒子或珠粒之表面上，其中對微米粒子或珠粒進行編碼以允許對不同結合域之間進行區別。
在一個態樣中，載體表面為在各孔內包含對應於一或多個捕獲寡核苷酸之一或多個分散可尋址結合域之多孔盤。在一個態樣中，載體表面包含用於偵測野生型核苷酸序列之至少一個結合域及用於偵測突變型核苷酸序列之各別結合域。在一個態樣中，各孔包含至少約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9、約10、約11、約12、約13、約14、約15、約16、約17、約18、約19、約20、約21、約22、約23、約24或約25個結合域。在一個態樣中，各孔包含至少約7、約10、約16或約25個結合域。
在一個態樣中，載體表面為包含至少24、96或384個孔且各孔包含至多10個結合域之陣列之多孔盤，其中不同捕獲寡核苷酸固定於分散結合域中。在一更特定態樣中，載體表面為96孔盤，其中各孔包含具有至多10個結合域之陣列。在一個態樣中，96孔盤之各孔包含至多個10個結合域，其上固定有至多10種不同捕獲寡核苷酸。在一個態樣中，各孔包含具有相同捕獲寡核苷酸之相同圖案化陣列。在另一態樣中，不同孔可包含捕獲寡核苷酸之不同圖案化陣列。
H. 核酸酶保護分析（ NPA ）在一個態樣中，提供一種使用核酸酶保護分析偵測或定量樣本中之寡核苷酸雙螺旋體之有義及反義股的方法在一個態樣中，使樣本與一組探針接觸，其中該組探針包含有義探針及反義探針。在一個態樣中，有義探針包含與固定於載體表面上之捕獲寡核苷酸之至少一部分互補的單股寡核苷酸標籤、能夠與寡核苷酸雙螺旋體之有義股之核苷酸序列雜交的有義結合部分，及一標記。在一個態樣中，反義探針包含與固定於載體表面上之捕獲寡核苷酸之至少一部分互補的單股寡核苷酸標籤、能夠與寡核苷酸雙螺旋體之反義股之核苷酸序列雜交的反義結合部分，及一標記。在一個態樣中，該方法包含將探針與樣本一起培育以形成含有雜交複合物之雜交混合物。在一個態樣中，該方法包含在雜交複合物之寡核苷酸標籤與固定於載體表面上之捕獲寡核苷酸雜交的條件下，使載體表面與雜交混合物接觸。在一個態樣中，該方法包含基於固定於載體表面上之標記之存在來偵測或定量寡核苷酸雙螺旋體之有義股及反義股。在一個態樣中，該方法包含基於固定於載體表面上之經標記之有義及反義雜交複合物之存在來偵測或定量寡核苷酸雙螺旋體之有義股及反義股。
在一個態樣中，有義探針之有義結合部分具有比有義股之有義股長度短的有義結合長度。在一個態樣中，有義探針之有義結合部分具有比有義股之有義股長度短至少1個核苷酸的有義結合長度。在一個態樣中，反義股之反義結合部分具有比反義股之反義股長度短的反義結合長度。在一個態樣中，反義股之反義結合部分具有比反義股之反義股長度短至少1個核苷酸的反義結合長度。
在一個態樣中，有義探針包含DNA。在一個態樣中，有義探針之有義結合部分包含DNA。在一個態樣中，有義探針之寡核苷酸標籤包含DNA。在一個態樣中，有義探針之有義結合部分及寡核苷酸標籤包含DNA。
在一個態樣中，有義探針包含RNA。在一個態樣中，有義探針之有義結合部分包含RNA。在一個態樣中，有義探針之寡核苷酸標籤包含RNA。在一個態樣中，有義探針之有義結合部分及寡核苷酸標籤包含RNA。
在一個態樣中，有義探針之有義結合部分包含DNA且有義探針之寡核苷酸標籤包含RNA。在一個態樣中，有義探針之有義結合部分包含RNA且有義探針之寡核苷酸標籤包含DNA。
在一個態樣中，反義探針包含DNA。在一個態樣中，反義探針之反義結合部分包含DNA。在一個態樣中，反義探針之寡核苷酸標籤包含DNA。在一個態樣中，反義探針之反義結合部分及寡核苷酸標籤包含DNA。
在一個態樣中，反義探針包含RNA。在一個態樣中，反義探針之反義結合部分包含RNA。在一個態樣中，反義探針之寡核苷酸標籤包含RNA。在一個態樣中，反義探針之反義結合部分及寡核苷酸標籤包含RNA。
在一個態樣中，反義探針之反義結合部分包含DNA且反義探針之寡核苷酸標籤包含RNA。在一個態樣中，反義探針之反義結合部分包含RNA且反義探針之寡核苷酸標籤包含DNA。
在一個態樣中，反義探針為嵌合探針，其包含：包含DNA之反義結合部分及包含RNA之寡核苷酸標籤，其中反義探針之反義結合部分具有比寡核苷酸雙螺旋體之反義股之反義股長度短至少1個核苷酸的反義結合長度。在一個態樣中，反義探針為嵌合探針，其包含：包含RNA之反義結合部分及包含DNA之寡核苷酸標籤，其中反義探針之反義結合部分具有比寡核苷酸雙螺旋體之反義股之反義股長度短至少1個核苷酸的反義結合長度。在一個態樣中，有義探針為嵌合探針，其包含：包含DNA之有義結合部分及包含RNA之寡核苷酸標籤，其中有義探針之有義結合部分具有比寡核苷酸雙螺旋體之有義股之有義股長度短至少1個核苷酸的有義結合長度。在一個態樣中，有義探針是嵌合探針，其包含：包含RNA之有義結合部分及包含DNA之寡核苷酸標籤，其中有義探針之有義結合部分具有比寡核苷酸雙螺旋體之有義股之有義股長度短至少1個核苷酸的有義結合長度。
在一個態樣中，該方法包含將該組探針與樣本一起培育以形成雜交混合物。在一個態樣中，雜交混合物含有包含有義複合物及反義複合物之雜交複合物。在一個態樣中，雜交混合物包含：包含與寡核苷酸雙螺旋體之有義股雜交之有義探針的有義複合物；及包含與寡核苷酸雙螺旋體之反義股雜交之反義探針的反義複合物。
在一個態樣中，雜交混合物進一步含有以下非有效性雜交複合物中之一或多者：不與寡核苷酸雙螺旋體之有義股雜交之有義探針；不與寡核苷酸雙螺旋體之反義股雜交之反義探針；或有義探針與反義探針彼此雜交之探針-探針複合物。在一個態樣中，非有效性雜交複合物包含單股突出端。在一個態樣中，非有效性雜交複合物包含單股寡核苷酸序列。在一個態樣中，非有效性雜交複合物包含單股RNA序列。在一個態樣中，非有效性雜交複合物包含單股DNA序列。
在一個態樣中，非有效性雜交複合物中之單股突出端或單股寡核苷酸序列經單股特異性核酸酶消化。在一個態樣中，單股突出端或單股寡核苷酸序列為DNA序列，其經單股特異性DNA酶消化。在一個態樣中，單股突出端或單股寡核苷酸序列為RNA序列，其經單股特異性RNA酶消化。
在一個態樣中，當雜交複合物在溶液中時（亦即，在其經由有義或反義探針之寡核苷酸標籤將雜交複合物固定至載體表面之前），進行非有效性雜交複合物中之單股突出端或單股寡核苷酸序列之消化。在一個態樣中，在雜交複合物經由有義或反義探針之寡核苷酸標籤固定於載體表面上之後，進行非有效性雜交複合物中之單股突出端或單股寡核苷酸序列之消化。在一個態樣中，該方法包含在單股突出端或單股寡核苷酸序列經單股特異性RNA酶消化之後的洗滌步驟。在一個態樣中，該方法包含在單股突出端或單股寡核苷酸序列經單股特異性RNA酶消化且固定於載體表面上之後的洗滌步驟。在一個態樣中，基於固定於載體表面上之標記之存在來偵測或定量寡核苷酸雙螺旋體之有義股及反義股。在一個態樣中，基於固定於載體表面上之經標記之有義或反義複合物之存在來偵測或定量寡核苷酸雙螺旋體之有義股及反義股。
I. 電極在一個態樣中，使用電化學發光（ECL）來偵測或定量寡核苷酸雙螺旋體之有義股或反義股。使用電化學發光多工量測分析物描述於美國專利第7,842,246號及第6,977,722號中，其揭示內容以全文引用之方式併入本文中。
在一個態樣中，載體表面包含一或多個電極。在一個態樣中，載體表面包含一或多個工作電極及一或多個相對電極。在一個態樣中，載體表面包含形成於一或多個電極上之用於電化學或電化學發光分析之一或多個結合域。
在一個態樣中，藉由將塗覆有捕獲寡核苷酸之珠粒彙集至電極表面上形成結合域。在一個態樣中，珠粒為順磁性的，且珠粒經由使用磁場彙集在電極上。
在一個態樣中，電極係提供於分析模組內，該分析模組提供分析容器、分析流動池、分析流體或適用於進行分析之其他組分。用於進行電化學發光分析之分析模組之實例包含例如多陣列情況、分析培養盤情況、料筒情況及其類似者。在一個態樣中，電極係提供於分析模組內，該分析模組提供分析容器、分析流動池、分析流體或適用於進行分析之其他組分。用於進行電化學發光分析之分析模組之實例可見於美國專利第6,673,533號、第7,842,246號、第9,731,297號及第8,298834號中。在一個態樣中，載體表面為包含至少一個電極之多孔盤。在一個態樣中，多孔分析培養盤之各孔包含至少一個電極。在一個態樣中，多孔分析培養盤之至少一個孔包含工作電極。在另一態樣中，多孔分析培養盤之至少一個孔包含工作電極及相對電極。在另一態樣中，多孔分析培養盤之各孔包含工作電極及相對電極。在一個態樣中，工作電極相鄰，但不與相對電極電接觸。
在一個態樣中，電極係由導電材料構築成，該導電材料包含例如金屬，諸如金、銀、鉑、鎳、鋼、銥、銅、鋁、導電合金或其組合。在另一態樣中，電極包含：半導電材料，諸如矽及鍺；或半導電膜，諸如氧化銦錫（indium tin oxide；ITO）及氧化銻錫（antimony tin oxide；ATO）。在另一態樣中，電極包含氧化物塗層金屬，諸如氧化鋁塗層鋁。在一個態樣中，電極包含碳基材料。在一個態樣中，電極包含含有導電複合物、墨、糊料、聚合物摻合物及金屬/非金屬複合物之材料混合物，包含例如導電或半導電材料與非導電材料之混合物。在一個態樣中，電極包含碳基材料，諸如碳、玻璃樣碳、碳黑、石墨碳、碳奈米管、碳纖絲、石墨、碳纖維及其混合物。在一個態樣中，電極包含分散於基質中之導電碳-聚合物複合物、導電聚合物或導電粒子，例如碳墨、碳糊或金屬墨。在一個態樣中，工作電極係由碳-聚合物複合材料製成，該碳-聚合物複合材料包含例如分散於基質中之導電碳粒子，諸如碳纖絲、碳黑或石墨碳，該基質例如聚合物基質，諸如乙烯乙酸乙烯酯（EVA）、聚苯乙烯、聚乙烯、聚乙烯醇乙酸酯、聚氯乙烯、聚乙烯醇、丙烯腈丁二烯苯乙烯（ABS）或此等聚合物中之一或多者之共聚物。
在一個態樣中，工作電極係由連續導電片材或一或多種導電材料之膜製成，其可被擠壓、壓製或模製。在另一態樣中，工作電極係由沈積或圖案化於基板上之導電材料製成，例如藉由印刷、塗刷、塗覆、旋塗、蒸鍍、化學氣相沈積、電解沈積、無電沈積、光刻或其他電子微型製造技術。在一個態樣中，工作電極包含印刷在聚合物載體上之導電碳墨，例如藉由噴墨印刷、雷射印刷或網版印刷。碳墨為已知的且包含由Acheson Colloids Co.（例如Acheson 440B、423ss、PF407A、PF407C、PM-003A、30D071、435A、Electrodag 505SS及Aquadag™）、E. I. Du Pont de Nemours and Co.（例如Dupont 7105、7101、7102、7103、7144、7082、7861D及CB050）、Conductive Compounds Inc（例如C-100）及Ercon Inc.（例如G-451）製造之材料。
在一個態樣中，工作電極為連續膜。在另一態樣中，工作電極包含一或多個分散區或分散區圖案。可替代地，工作電極可包含複數個連接的區。工作電極上之暴露的電極表面之一或多個區可由覆蓋工作電極之經圖案化絕緣層限定，例如藉由將經圖案化介電墨層網版印刷在工作電極上，或藉由附著模切絕緣膜。暴露區可限定印刷在工作電極上之試劑陣列之陣列元件，且可呈如上文所描述之陣列形狀及圖案。在一個態樣中，絕緣層限定暴露工作電極表面之一系列環狀區（或「斑點」）。
相對電極可具有上文一般針對工作電極所描述之特性中之一或多者。在一個態樣中，工作電極及相對電極係由相同材料構築而成。在另一態樣中，工作電極及相對電極不係由相同材料構築而成，例如工作電極可為碳電極而相對電極可為金屬電極。
在一個態樣中，藉由被動吸附將一或多個捕獲寡核苷酸固定於一或多個電極上。在另一態樣中，將一或多個捕獲寡核苷酸共價固定於電極上。在一個態樣中，對電極進行衍生或修改例如以將諸如捕獲寡核苷酸之試劑固定在電極表面上。在一個態樣中，電極藉由化學或機械處理進行修改，以改良試劑之固定（例如引入用於固定試劑之官能基）或以增強其吸附特性。可引入之官能基之實例包含（但不限於）羧酸（COOH）、羥基（OH）、胺基（NH 2）、活化的羧基（例如N-羥基丁二醯亞胺(NHS)-酯）、聚(乙二醇)、硫醇基、烷基（(CH 2) n）或其組合）。在一個態樣中，藉由共價或非共價手段將一或多種試劑，例如捕獲寡核苷酸固定至含碳電極，例如分散於另一材料中之碳黑、纖絲或碳。已發現，具有硫醇基之捕獲寡核苷酸可與含碳電極（例如，網版印刷的碳墨電極）共價結合，而不必首先沈積額外硫醇基-反應性層，諸如蛋白質層或化學交聯層。在一個態樣中，提供用於具有硫醇基之捕獲寡核苷酸（諸如經硫醇基修飾之寡核苷酸）與電極直接連接之方法，其提供用於在電極上形成捕獲表面及陣列之簡單、穩固、有效及可再現方法。在一個態樣中，經由硫醇基與電極之反應，將具有硫醇基之一或多個捕獲寡核苷酸直接固定於含碳電極（諸如絲網印刷的碳墨電極）上，而無需首先向電極添加硫醇基-反應性層。
在一個態樣中，電極用電漿處理，例如低溫電漿，諸如輝光放電電漿，以改變電極之物理特性、化學組成或表面化學特性，例如來輔助諸如捕獲寡核苷酸之試劑之固定或減少雜質，改良與其他材料之附著，改變表面之可濕性，促進材料之沈積，產生圖案，或改良均一性。適用電漿之實例包含氧、氮、氬、氨、氫、氟碳化物、水及其組合。在一個態樣中，氧電漿用於處理具有含碳粒子之碳-聚合物複合材料材料之電極。在另一態樣中，氧用於將羧酸或其他氧化的碳官能基引入至碳或有機材料（例如活化的酯或醯氯）中，以便於試劑之偶合。在另一態樣中，含氨電漿可用於引入用於偶合分析試劑之胺基。在一個態樣中，電極不進行預處理以輔助一或多個捕獲寡核苷酸之固定。
在一個態樣中，載體表面包含分析模組，諸如各孔中具有一或多個工作電極或相對電極之多孔盤。在一個態樣中，多孔盤在各孔中包含複數個工作電極或相對電極。在一個態樣中，多孔盤之工作電極或相對電極包含碳，例如網版印刷的碳墨層。在一個態樣中，經由捕獲寡核苷酸上之硫醇基部分，將一或多個捕獲寡核苷酸固定於網版印刷的碳墨上。在一個態樣中，工作電極用於自ECL標記誘導ECL信號。在一個態樣中，ECL信號係在共反應物（諸如三級烷基胺，例如三丙基胺或丁基二乙醇胺）存在下自三聯吡啶釕發射。
在一個態樣中，電極含有如上文所描述之由介電墨（亦即，電絕緣墨）限定之結合域。電極為其上在限定上文所描述之結合域之圖案中印刷有介電質之工作電極。在一個態樣中，結合域為暴露的工作電極之大約環狀區域（或「斑點」）。電極係在藉由將注射模製之96孔盤頂部附著至限定孔之底部之聚酯薄膜片材形成之96孔盤中。聚酯薄膜片材之頂部表面具有印刷在其上之網版印刷的碳墨電極，使得各孔包含大約在孔中心中之碳墨工作電極及大約朝向孔之兩個邊緣的兩個碳墨相對電極。印刷在聚酯薄膜片材之底部上、經由導電穿孔與片材之頂部連接之電極，為向工作電極及相對電極施加電壓提供接觸。
J. 偵測在一個態樣中，基於偵測固定於載體表面上之標記來偵測或定量一或多個寡核苷酸序列之存在。在一個態樣中，基於偵測固定於載體表面上之雜交複合物上的標記來偵測或定量一或多個寡核苷酸序列之存在。在一個態樣中，基於偵測固定於載體表面上之有義複合物上的標記來偵測或定量一或多個目標寡核苷酸序列之存在。在一個態樣中，基於偵測固定於載體表面上之反義複合物上的標記來偵測或定量一或多個目標寡核苷酸序列之存在。在一個態樣中，以陣列方式偵測或定量寡核苷酸序列。
在一個態樣中，藉由監測標記之發光偵測雜交複合物（例如反義或有義複合物）之存在，包含（但不限於）螢光、時差式螢光、螢光共振能量轉移（fluorescence resonance energy transfer；FRET）、螢光偏振（fluorescence polarization；FP）、發光、化學發光、生物發光、磷光、光散射或電極誘導之螢光。在另一態樣中，標記包含具有化學活性之酶或其他化學反應性物質，其產生可量測信號，諸如光散射、吸光度、螢光等。酶標記之實例包含（但不限於）辣根過氧化酶或鹼性磷酸酶。在一個態樣中，標記為可偵測半抗原，包含（但不限於）生物素、螢光素或地高辛。在一個態樣中，標記包含生物素。
在一個態樣中，雜交複合物，例如反義複合物或有義複合物固定於位於載體表面上之一或多個結合結構域上。在一個態樣中，一或多個結合域位於一或多個電極上，且偵測或定量包含向一或多個電極施加電壓波形以刺激捕獲的反應產物上之標記產生電化學或發光信號。在一個態樣中，偵測或定量包含量測ECL信號，及使信號與樣本中之有義或反義寡核苷酸之存在或量相關聯。在一個態樣中，所發射光之強度與樣本中之有義或反義寡核苷酸之量成比例，使得所發射光可提供樣本中之有義或反義寡核苷酸之量的定量測定。
在一個態樣中，在將雜交複合物固定於載體表面上之後，使載體表面與偵測混合物接觸。在一個態樣中，在將有義或反義複合物固定於載體表面上之後，使載體表面與偵測混合物接觸。在一個態樣中，在任何非有效性雜交複合物中之單股突出端經單股核酸酶消化之後，使載體表面與偵測混合物接觸。在一個態樣中，當雜交複合物在溶液中時（亦即，在其經由有義或反義探針之寡核苷酸標籤將雜交複合物固定至載體表面之前），進行非有效性雜交複合物中之單股突出端之消化。在一個態樣中，在雜交複合物經由有義或反義探針之寡核苷酸標籤固定於載體表面上之後，進行非有效性雜交複合物中之單股突出端之消化。在一個態樣中，偵測混合物包含ECL標記。ECL標記之實例包含：i）有機金屬化合物，其中金屬來自例如第VIII族之貴金屬，包含含Ru及含Os之有機金屬化合物，諸如三聯吡啶基釕（RuBpy）部分；及ii）流明諾及相關化合物。在一個態樣中，偵測混合物亦包含一或多種電化學發光共反應物及一或多個額外組分，諸如pH緩衝劑、清潔劑、防腐劑、消泡劑、鹽、金屬離子或金屬螯合劑。術語「電化學發光共反應物」係指以下物種：參與電化學發光標記且包含（但不限於）三級胺，諸如三丙胺（TPA）、草酸根離子、抗壞血酸及過硫酸鹽（對於RuBpy）及過氧化氫（對於流明諾）。用於量測電化學發光之方法為已知的，且用於進行量測之儀器為可商購的。舉例而言，使用電化學發光進行之分析物之多工量測用於Meso Scale Diagnostics, LLC、MULTI-ARRAY®及SECTOR® Imager產線或產物中（參見例如美國專利第7,842,246號及第6,977,722號，其揭示內容以全文引用之方式併入本文中）。
在一個態樣中，生物素與雜交複合物共價連接，且偵測混合物包含抗生蛋白鏈菌素結合之標記，該標記經由抗生物素蛋白部分與固定的雜交複合物結合。在一個態樣中，抗生蛋白鏈菌素結合之標記為電化學發光（ECL）標記。在一個態樣中，電化學發光標記為n-羥基丁二醯亞胺酯，諸如Sulfo-TAG NHS-酯（Meso Scale Diagnostics，美國馬里蘭州羅克維爾市）。
K. 套組在一個態樣中，提供一種用於進行本文所描述之方法的套組。「套組」係指經提供或聚集以待一起使用例如來產生組合物、製造裝置或進行方法的組分集合。套組可包含一或多種組分。套組之組分可以一個封裝或多個封裝提供，其中之每一者可含有組分中之一或多者。套組之所列舉組分轉而亦可作為單一物理部分或作為套組組合使用之多個部分來提供。舉例而言，套組之儀器組分可被完全組裝的提供或作為在使用之前組裝之多個儀器部分提供。類似地，套組之液體試劑組分可作為容器中之完全液體調配物、作為待組合以提供完全液體調配物之一或多種乾燥試劑及一或多種液體稀釋劑、或作為待組合以提供完全液體調配物之兩種或更多種液體溶液來提供。如本領域中已知，用於分析之套組組分歸因於具有不同儲存需求，例如4℃與-70℃之儲存溫度而通常分開運送及儲存。
在一個態樣中，套組包含載體表面。在一個態樣中，套組包含可固定於載體表面上之捕獲寡核苷酸。在一個態樣中，套組包含固定於載體表面上之捕獲寡核苷酸。在一個態樣中，套組包含以陣列方式固定於載體表面上之捕獲寡核苷酸。在一個態樣中，套組包含固定至位置在陣列內已知之一或多個分散結合域之一或多個捕獲寡核苷酸。在一個態樣中，套組包含固定於珠粒陣列上之兩個或更多個捕獲寡核苷酸。
在一個態樣中，套組包含碳基載體表面。在一個態樣中，載體表面包含至少一個電極。在一個態樣中，電極為碳基電極。在一個態樣中，載體表面包含一或多個碳墨電極。在一個態樣中，載體表面包含至少一個工作電極及至少一個相對電極。
在一個態樣中，套組包含含多孔分析培養盤之載體表面。在一個態樣中，多孔盤之一或多個孔包含一或多個電極。在一個態樣中，載體表面包含多孔盤，其中一或多個孔包含一或多個工作電極及一或多個相對電極。在一個態樣中，載體表面包含一或多個參考電極。
在一個態樣中，套組包含標準格式多孔盤，其在本領域中為已知的且可包含（但不限於）24、96及384孔盤。在一個態樣中，套組包含一或多個96孔盤。在一個態樣中，套組包含一個多孔盤。在另一態樣中，套組包含10個多孔盤。在另一態樣中，套組包含10與100個之間的多孔盤。
在一個態樣中，套組包含具有其上印刷捕獲寡核苷酸之一或多個陣列之一或多個電極的載體表面。在一個態樣中，套組包含其上已印刷捕獲寡核苷酸之一或多個陣列之一或多個多孔盤。在另一態樣中，套組包含一或多個多孔盤及包含一或多個捕獲寡核苷酸之一或多個小瓶，其中可將捕獲寡核苷酸印刷至多孔盤上。
在一個態樣中，套組包含固定至載體表面上之一或多個結合域之一或多個捕獲寡核苷酸。在一個態樣中，套組包含固定於多孔盤之孔內之一或多個結合域上之一或多個捕獲寡核苷酸。在一個態樣中，套組包含固定於電極上之一或多個結合域上之一或多個捕獲寡核苷酸。在一個態樣中，套組包含固定於多孔盤之一或多個孔內之電極上之一或多個結合域上的一或多個捕獲寡核苷酸。
在另一態樣中，套組包含一或多個寡核苷酸標籤。在一個態樣中，套組包含容器中提供之一或多個寡核苷酸標籤，其中容器中之寡核苷酸標籤具有相同序列，且各容器含有具有不同於其他容器中之寡核苷酸標籤之序列（且不與其互補）之序列的寡核苷酸標籤。在一個態樣中，套組在單獨的容器中包含至少約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9、約10、約11、約12、約13、約14、約15、約16、約17、約18、約19、約20、約21、約22、約23、約24或約25且至多約64個獨特寡核苷酸標籤。在一個態樣中，套組包含至多10個獨特寡核苷酸標籤之集合。
在一個態樣中，套組包含一或多個多孔盤，其中將至多10個捕獲寡核苷酸固定於多孔盤之孔內之一或多個結合域中，其中各結合域包含具有不同於孔內之其他結合域中之捕獲寡核苷酸之序列之序列的捕獲寡核苷酸。在一個態樣中，套組包含具有至少約1、約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9、約10、約15、約20或約25個固定於至少約1、約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9、約10、約15、約20或約25個獨特結合域中之不同捕獲寡核苷酸的載體表面。在一個態樣中，套組包含一或多個孔中具有至少約1、約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9、約10、約15、約20或約25個固定於至少約1、約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9、約10、約15、約20或約25個獨特結合域中之不同捕獲寡核苷酸的多孔盤。在一個態樣中，套組包含一或多個多孔盤，其中各孔包含至多約10個固定於陣列中之捕獲寡核苷酸。在一個態樣中，多孔盤可經組態以在多孔盤之各孔內產生約1與約10個之間的偵測分析。
在一個態樣中，套組包含單股核酸酶。在一個態樣中，套組包含容器中提供之單股核酸酶標籤。在一個態樣中，單股特異性核酸酶包含單股特異性DNA酶。在一個態樣中，單股特異性DNA酶為S1核酸酶、P1核酸酶或綠豆核酸酶。在一個態樣中，單股特異性核酸酶包含單股特異性RNA酶。在一個態樣中，單股特異性RNA酶為RNA酶A、RNA酶H、RNA酶I、RNA酶III、RNA酶L、RNA酶P、RNA酶PhyM、RNA酶T1、RNA酶T2、RNA酶U2、RNA酶V、PNP酶、RNA酶PH、RNA酶R、RNA酶D、RNA酶T、RNA酶ONE、寡核糖核酸酶、核糖核酸外切酶I及核糖核酸外切酶II。
在一個態樣中，提供一種用於進行發光分析，例如電化學發光分析，以偵測或定量樣本中之一或多個目標核苷酸序列之套組。在一個態樣中，套組包含適用於進行電化學發光分析之一或多個分析組分。
在一個態樣中，套組包含可用於為寡核苷酸標籤與其對應互補捕獲寡核苷酸序列之雜交提供適當條件（例如嚴格條件）之雜交緩衝液。在一個態樣中，雜交緩衝液包含稀釋劑54（Meso Scale Diagnostics, LLC，美國馬里蘭州羅克維爾市）。在一個態樣中，雜交緩衝液包含雜交緩衝液1或雜交緩衝液2（Meso Scale Diagnostics, LLC，美國馬里蘭州羅克維爾市）。
在一個態樣中，套組包含一或多個包含標記之容器。在一個態樣中，標記係選自放射性、螢光、化學發光、電化學發光、光吸收、光散射、電化學、磁性及酶標記。在一個態樣中，標記包含電化學發光標記。在一個態樣中，標記包含含過渡金屬之有機金屬錯合物。在一個態樣中，過渡金屬包含釕。在一個態樣中，標記為MSD SULFO-TAG TM標記（Meso Scale Diagnostics, LLC，美國馬里蘭州羅克維爾市）。
在一個態樣中，標記包含一級結合試劑，該初級結合試劑為二級結合試劑之結合搭配物。在一個態樣中，二級結合試劑包含生物素、抗生蛋白鏈菌素、抗生物素蛋白或抗體。在一個態樣中，二級結合試劑包含抗生物素蛋白、抗生蛋白鏈菌素或抗體。   在一個態樣中，標記包含選自生物素、螢光素及地高辛之半抗原。在一個態樣中，標記為包含第一寡核苷酸序列之一級結合劑，且二級結合試劑包含與一級結合劑之第一寡核苷酸序列互補之第二寡核苷酸序列。
在一個態樣中，套組包含一或多個包含電化學發光標記之容器。在一更特定態樣中，套組包含一或多個含有含Ru或含Os有機金屬化合物，諸如三聯吡啶釕（RuBpy）之容器。在一個態樣中，標記包含含過渡金屬之有機金屬錯合物。在一個態樣中，過渡金屬包含釕。在一個態樣中，標記包含MSD SULFO-TAG TM標記（Meso Scale Diagnostics, LLC，美國馬里蘭州羅克維爾市）。在另一態樣中，套組包含一或多個含有流明諾或其他相關化合物之容器。
在一個態樣中，套組包含一或多個具有一或多種電化學發光共反應物之容器。在一個態樣中，將一或多種電化學發光共反應物共價或非共價固定於載體表面上。在一個態樣中，將一或多種電化學發光共反應物固定於載體表面之一或多個工作電極上。
在一個態樣中，套組中包含之標記包含一級結合試劑及二級結合試劑。在一個態樣中，二級結合試劑包含生物素、抗生蛋白鏈菌素、抗生物素蛋白或抗體。
在一個態樣中，套組包含以下分析組分中之一或多者：一或多個捕獲寡核苷酸；及一或多種緩衝液，例如洗滌緩衝液、雜交緩衝液、結合緩衝液或讀取緩衝液。
在一個態樣中，套組包含一或多種分析組分，諸如標記。在一個態樣中，標記為發光標記，諸如電化學發光標記。在一個態樣中，套組包含至少一種電化學發光共反應物。在一個態樣中，電化學發光共反應物包含三級胺、三丙胺或N-丁基二乙醇胺。
在一個態樣中，套組包含一或多種其他分析組分。在一個態樣中，套組包含一或多個分析，包含（但不限於）稀釋劑、阻斷劑、穩定劑、清潔劑、鹽、pH緩衝液及防腐劑。在一個態樣中，套組包含一或多種此類組分之容器。在另一態樣中，在套組提供之分析載體表面上包含一或多種試劑。
L. 參考文獻併入本文中所引用之全部參考文獻（包含專利、專利申請案、論文、課本及其類似者）及其中引用之參考文獻在其尚未引用之程度上，出於所有目的在此以全文引用之方式併入本文中。
工作實例 實例 1. 使用全長探針之 RNA 酶保護分析（ RPA ）偵測下限（ LLOD ）
在不存在相反股的情況下使用RNA酶保護分析（RPA）測定模型16-聚體異雙螺旋體反義寡核苷酸（ASO）之有義（SS）及反義（AS）股（一個DNA股及一個RNA股；兩者均經修飾）之偵測極限。
產生含有具有與基於核酸之治療性分子互補之序列之RNA股及具有與捕獲寡核苷酸互補之序列之DNA股的嵌合全長反義探針且其包含單股寡核苷酸標籤、全長（16-聚體）反義結合部分及生物素標記。產生含有具有與教育核酸之治療性分子互補之序列之RNA股及具有與捕獲寡核苷酸互補之序列之DNA股的嵌合全長有義探針且其包含單股寡核苷酸標籤、全長（16-聚體）有義結合部分及生物素標記。
簡言之，個別反義（AS）或有義（SS）股（10 mg/mL）經稀釋至200 µg/mL且藉由將ASO摻入最高校準劑濃度為40,000 pg/mL之稀釋劑54中使用如表1中所示之4倍連續稀釋（加2個空白孔）產生個別反義或有義股之10-點校準曲線。
表 1. 校準曲線
校準劑 濃度 （ pg/mL ）
Cal-1 40000
Cal-2 10000
Cal-3 2500
Cal-4 625
Cal-5 156
Cal-6 39.1
Cal-7 9.77
Cal-8 2.44
Cal-9 0.610
Cal-10 0.153
空白 0
空白 0
使用兩個濃度之全長探針評估對陽性信號及背景之影響：50 pM或200 pM（4×）。使用 表 2中所示之雜交方案使嵌合探針在稀釋劑54（Meso Scale Diagnostics，美國馬里蘭州羅克維爾市）中與反義股或有義股雜交：
表 2. 雜交方案
步驟 溫度 時間
1 80℃ 2分鐘
2 65℃ 5分鐘 隨後以1℃降低至50℃，各自持續5分鐘
3 37℃ 保持 在37℃、振盪下持續30分鐘
其上固定有單股捕獲寡核苷酸（具有與嵌合有義及反義探針之寡核苷酸標籤序列互補之序列）之96孔N-PLEX ®培養盤（Meso Scale Discovery，美國馬里蘭州羅克維爾市（「MSD」））用N-PLEX™阻斷緩衝液（MSD）阻斷且用最小150μL/孔之杜爾貝寇氏磷酸鹽緩衝鹽水（DPBS）洗滌3次。在探針與其目標股雜交之後，將探針/分析物複合物稀釋於緩衝液中，添加至培育盤中且使其在37℃下同時在振盪下雜交1小時。使用兩種不同緩衝液測定對與培育盤之雜交的影響：稀釋劑54或NPLEX™雜交緩衝液1及2（MSD）呈2:3比率之摻合物。
再洗滌培養盤（用最小150μL/孔DPBS洗滌3次）且將含RNA酶混合物（RNA酶A、RNA酶I及RNA酶T1）之稀釋劑54添加至培養盤中且在37℃下在振盪下培育30分鐘。
再洗滌培養盤且將SULFO-TAG™抗生蛋白鏈菌素（MSD）添加至培育盤中之稀釋劑54 + 1%阻斷劑A（MSD）中且在室溫下在振盪下培育30分鐘。洗滌培養盤、添加MSDGOLD™讀取緩衝液A（MSD）且使用SECTOR ®S6000或MESO ®SECTOR ®S600成像儀（MSD）讀取培養盤。
反義股及探針之ECL信號展示於 表 3中且有義股及探針之ECL信號展示於 表 4中。在稀釋劑54中及在雜交緩衝液摻合物中，針對反義（DNA）股之探針具有比針對有義（RNA）股之探針更高的ECL讀數。增加探針之量會增加陽性及陰性信號，其中信號飽和度為約10,000 pg/mL（10 ng/mL）。
圖5A及圖5B展示反義（AS）股稀釋劑54培養盤雜交（圖5A）及經摻合之雜交緩衝液培養盤雜交（圖5B）及有義（SS）稀釋劑54培養盤雜交（圖6A）及經摻合之雜交緩衝液培養盤雜交（圖6B）之ECL信號曲線。
表 5及表 6展示反義（AS）探針及反義股及有義（SS）探針及有義股各別之偵測下限（LLOD）。
結果顯示兩種分析得到良好結果，但反義探針具有比有義探針更高的ECL信號及更低的LLOD，且背景在有義探針之情況下往往會更高。稀釋劑54及雜交緩衝液摻合物之結果類似。
表 3.ECL 信號 - 反義（ AS ）探針及反義股
校準劑 濃度 （ pg/mL ） 1x 探針 / 稀釋劑 54 1x 探針 / 雜交緩衝液 4x 探針 / 稀釋劑 54 4x 探針 / 雜交緩衝液
Cal-1 40000 131701 105904 396886 370824
Cal-2 10000 130806 93823 384167 332165
Cal-3 2500 118400 70690 329414 232325
Cal-4 625 53291 31619 122887 82766
Cal-5 156 15306 9263 35245 23374
Cal-6 39.1 4548 2652 10220 6558
Cal-7 9.77 1259 817 2781 2054
Cal-8 2.44 456 395 1072 1006
Cal-9 0.610 282 278 693 749
Cal-10 0.153 240 260 613 733
空白 0 247 261 600 720
表 4.ECL 信號 – 有義（ SS ）探針及有義股
校準劑 濃度 （ pg/mL ） 1x 探針 / 稀釋劑 54 1x 探針 / 雜交緩衝液 4x 探針 / 稀釋劑 54 4x 探針 / 雜交緩衝液
Cal-1 40000 16178 20896 111291 143937
Cal-2 10000 23008 26874 108890 145697
Cal-3 2500 23328 28933 57900 114503
Cal-4 625 6981 14050 10419 17989
Cal-5 156 1651 3011 2664 3127
Cal-6 39.1 661 866 1405 1199
Cal-7 9.77 425 371 1137 903
Cal-8 2.44 358 294 1010 811
Cal-9 0.610 306 247 989 750
Cal-10 0.153 329 288 955 838
空白 0 362 297 1015 813
表 5. 反義（ AS ）探針及反義股偵測下限（ LLOD ）
1x 探針 / 稀釋劑 54 1x 探針 / 雜交緩衝液 4x 探針 / 稀釋劑 54 4x 探針 / 雜交緩衝液
希爾斜率（Hill Slope） 1.06 1.04 1.06 1.06
r 2值 0.990 1.00 0.989 0.998
LLOD est（pg/mL） 0.88 1.41 0.42 0.65
表 6. 有義（ SS ）探針及有義股偵測下限（ LLOD ）
1x 探針 / 稀釋劑 54 1x 探針 / 雜交緩衝液 4x 探針 / 稀釋劑 54 4x 探針 / 雜交緩衝液
希爾斜率 1.40 1.42 1.46 1.67
r 2值 0.921 0.940 0.993 0.984
LLOD est（pg/mL） 17.9 10.3 19.6 26.6
實例 2. 縮短探針之雜交在RNA酶保護分析（RPA）中評估縮短探針（12-聚體、11-聚體及10-聚體）與來自實例1之模型16核苷酸異雙螺旋體反義寡核苷酸（ASO）之有義（SS）及反義（AS）股在不存在相對股之情況下雜交的能力。在3'端縮短探針。
簡言之，使用ASO之個別反義（AS）或有義（SS）股在4倍連續稀釋及40,000 pg/mL之最高校準劑下產生10-點校準曲線（加2個空白孔）。
評估四種不同探針長度以遵循上文實例1中所描述之方法進行偵測：使用200 pM探針濃度的全長（FL）、12-聚體、11-聚體及10-聚體探針。探針與稀釋劑54中之反義股或有義股雜交且與稀釋劑54或雜交緩衝液1中之培育盤雜交。在單孔而非重複孔中分離稀釋劑54或雜交緩衝液1之間的校準曲線。
產生四種嵌合反義（AS）探針，其包含單股寡核苷酸標籤、反義結合部分（全長16-聚體（FL）、12-聚體、11-聚體或10-聚體）及生物素標記。
產生四種嵌合有義（SS）探針，其包含單股寡核苷酸標籤、有義結合部分（全長16-聚體（FL）、12-聚體、11-聚體或10-聚體）及生物素標記。
表 7及 表 8分別展示反義探針及反義股在稀釋劑54中或在雜交緩衝液中雜交之ECL信號。 表 9及 表 10分別展示有義探針及有義股在稀釋劑54中或在雜交緩衝液中雜交之ECL信號。 表 7 至 10之資料以圖形方式展示於圖7A至圖7B中。
表 11展示16-聚體（FL）探針及12-聚體探針之反義（AS）探針及反義股在稀釋劑54及雜交緩衝液中之偵測下限（LLOD）。 表 12及 表 13分別展示16-聚體（FL）、12-聚體、11-聚體及10-聚體探針之有義（SS）探針及有義股在稀釋劑54及雜交緩衝液中之LLOD。
資料指示相較於稀釋劑54，在雜交緩衝液之情況下的雜交在12-聚體探針中引起針對反義（AS）股之信號損失。對於反義股，縮短探針對ECL信號及LLOD est具有負面影響。對於有義股，縮短探針對ECL信號及LLODest具有極小影響。雜交緩衝液之類型對分析不具有影響。
表 7 ：稀釋劑 54 雜交 - 反義（ AS ）探針及反義股
校準劑 濃度（ pg/mL ） FL 探針 12- 聚體探針 11- 聚體探針 10- 聚體探針
Cal-1 40000 345329 54562 1016 844
Cal-2 10000 477705 29524 905 764
Cal-3 2500 414430 5049 870 809
Cal-4 625 203586 1103 861 770
Cal-5 156 50989 749 866 781
Cal-6 39.1 8054 787 904 775
Cal-7 9.77 3574 786 864 822
Cal-8 2.44 1411 757 887 798
Cal-9 0.610 827 777 915 869
Cal-10 0.153 755 759 882 811
空白 0 705 784 862 894
表 8 ：雜交緩衝液 - 反義（ AS ）探針及反義股
校準劑 濃度（ pg/mL ） FL 探針 12- 聚體探針 11- 聚體探針 10- 聚體探針
Cal-1 40000 230756 5368 1164 1031
Cal-2 10000 360035 1206 1114 764
Cal-3 2500 297142 1004 1112 997
Cal-4 625 115269 1018 902 921
Cal-5 156 33152 908 1128 1031
Cal-6 39.1 11240 1058 1214 986
Cal-7 9.77 3077 1063 1144 1014
Cal-8 2.44 1365 994 1087 848
Cal-9 0.610 906 927 1125 987
Cal-10 0.153 915 980 1073 965
空白 0 976 1131 1164 1080
表 9 ：稀釋劑 54 雜交 - 有義（ SS ）探針及有義股
校準劑 濃度（ pg/mL ） FL 探針 12- 聚體探針 11- 聚體探針 10- 聚體探針
Cal-1 40000 104668 96844 79642 128029
Cal-2 10000 98109 103383 82916 133309
Cal-3 2500 76763 58215 47668 59987
Cal-4 625 15942 14514 11904 14247
Cal-5 156 3513 4357 4374 4180
Cal-6 39.1 1440 2283 2474 1472
Cal-7 9.77 1150 1782 2305 996
Cal-8 2.44 1083 1787 2044 994
Cal-9 0.610 1029 1563 2078 893
Cal-10 0.153 1025 1567 2066 926
空白 0 1043 1643 2105 911
表 10 ：雜交緩衝液 - 有義（ SS ）探針及有義股
校準劑 濃度（ pg/mL ） FL 探針 12- 聚體探針 11- 聚體探針 10- 聚體探針
Cal-1 40000 138021 229349 129664 88682
Cal-2 10000 120157 188366 89150 30794
Cal-3 2500 137402 113197 52769 16766
Cal-4 625 26606 29127 12014 2849
Cal-5 156 4034 7469 3986 1169
Cal-6 39.1 1386 2670 2540 1031
Cal-7 9.77 1030 1863 1786 787
Cal-8 2.44 969 1603 1556 685
Cal-9 0.610 779 1285 1388 754
Cal-10 0.153 897 1615 1715 817
空白 0 921 1545 1851 789
表 11. 反義探針及反義股
稀釋劑 54 雜交緩衝液
FL 探針 12- 聚體探針 FL 探針 12- 聚體探針
希爾斜率 1.25 1.86 1.092 2.83
r 2值 0.957 1.00 0.923 0.998
LLOD est（pg/mL） 1.07 273.8 0.47 9077
表 12. 有義探針及有義股（稀釋劑 54 ）
FL 探針 12- 聚體探針 11- 聚體探針 10- 聚體探針
希爾斜率 1.51 1.32 1.36 1.24
r 2值 0.991 0.987 0.991 0.982
LLOD est（pg/mL） 23.1 23.6 32.5 8.02
表 13. 有義探針及有義股（雜交緩衝液）
FL 探針 12- 聚體探針 11- 聚體探針 10- 聚體探針
希爾斜率 1.70 1.22 1.16 1.09
r 2值 0.960 0.998 0.993 0.989
LLOD est（pg/mL） 19.2 11.8 18.3 31.7
實例 3. 反義股及有義股之異雙螺旋體偵測使用實例2之全長（16-聚體）或12-聚體縮短嵌合探針測定實例1之模型ASO之反義（AS）股及有義（SS）股針對RNA酶保護分析（RPA）之偵測極限。
使用個別AS、SS或異雙螺旋體股在40,000 pg/mL之最高校準劑濃度下使用4倍連續稀釋（加2個空白孔）產生10-點校準曲線。
評估兩種不同探針長度：濃度為200 pM之全長16-聚體（FL）及12-聚體。
探針在稀釋劑54中與反義股或有義股雜交且添加至重複孔中之稀釋劑54中之96孔盤中，基本上如實例2中所描述。
反義股偵測及有義股偵測之ECL信號分別展示於 表 14及 表 15中。 表 14之資料以圖形方式展示於圖8A至圖8B中且 表 15之資料以圖形方式展示於圖9A至圖9B中。
表 16展示使用單獨或異雙螺旋體中之16-聚體（FL）探針及12-聚體探針之反義（AS）股之偵測下限（LLOD）。 表 17展示使用單獨或異雙螺旋體中之16-聚體（FL）探針及12-聚體探針之有義（SS）股之LLOD。
結果展示12-聚體探針減少反義股而非有義股中之ECL信號。全長探針針對兩個股（無論係個別股或於異雙螺旋體中）具有類似的ECL信號。12-聚體探針減少異雙螺旋體中之反義股及有義股兩者之ECL信號。當針對反義股及有義股兩者使用全長探針時，異雙螺旋體並不影響ECL信號或LLOD est。對於異雙螺旋體中之反義股及有義股兩者，12-聚體探針減少ECL信號且增加LLOD est。
表 14. 反義偵測
單獨的AS股 異雙螺旋體
校準劑 濃度（ pg/mL ） FL 探針 12- 聚體探針 FL 探針 12- 聚體探針
Cal-1 40000 436522 36684 430618 5626
Cal-2 10000 413134 21066 421128 1716
Cal-3 2500 385432 3213 327599 980
Cal-4 625 180946 826 161471 726
Cal-5 156 48504 630 51140 668
Cal-6 39.1 12506 628 14699 689
Cal-7 9.77 3533 670 4164 738
Cal-8 2.44 1271 646 1476 728
Cal-9 0.610 741 607 884 673
Cal-10 0.153 731 665 748 750
空白 0 731 697 678 693
表 15. 有義偵測
單獨的AS股 異雙螺旋體
校準劑 濃度（ pg/mL ） FL 探針 12- 聚體探針 FL 探針 12- 聚體探針
Cal-1 40000 79174 68893 69891 14864
Cal-2 10000 75868 80815 62486 15216
Cal-3 2500 65654 47818 37580 13855
Cal-4 625 13041 10549 13124 8512
Cal-5 156 3031 3727 3620 3839
Cal-6 39.1 1359 2001 1543 2153
Cal-7 9.77 962 1546 1056 1698
Cal-8 2.44 877 1471 894 1497
Cal-9 0.610 830 1400 834 1408
Cal-10 0.153 882 1413 888 1483
空白 0 906 1508 914 1471
表 16 ：單獨或異雙螺旋體中之反義股偵測
單獨的 AS 股 異雙螺旋體
FL 探針 12- 聚體探針 FL 探針 12- 聚體探針
希爾斜率 1.12 2.00 1.03 1.11
r 2值 0.993 1.000 0.999 0.999
LLOD est（pg/mL） 0.42 411 0.26 945
表 17 ：單獨或異雙螺旋體中之有義股偵測
單獨的 AS 股 異雙螺旋體
FL 探針 12- 聚體探針 FL 探針 12- 聚體探針
希爾斜率 1.46 1.34 1.14 1.11
r 2值 0.978 0.973 1.000 0.997
LLOD est（pg/mL） 12.1 23.4 6.99 12.8
實例 4. 使用全長（ 16- 聚體）探針之偵測下限（ LLOD ）使用16-聚體全長（FL）探針測定來自實例1之個別反義（AS）股或有義（SS）股或全模型異雙螺旋體ASO針對實例1之RNA酶保護分析（RPA）之偵測極限。
簡言之，使用4倍連續稀釋（加2個空白孔）產生個別反義股、有義股或異雙螺旋體股在40,000 pg/mL之最高校準劑濃度下之10-點校準曲線。個別股具有針對各校準劑或個別股使用之2個孔及針對異雙螺旋體之各校準劑使用的4個孔，其中24個單獨空白孔用於全LLOD測定。評估兩種探針長度：濃度為200 pM之全長16-聚體（FL）及12-聚體。探針與反義（AS）或有義（SS）股雜交且與稀釋劑54中之培育盤雜交。
如 表 18中所示，個別反義或有義股與及異雙螺旋體之間的ECL信號類似。表 19中所示之結果指示，針對反義股之單重分析之LLOD對於個別股及異雙螺旋體兩者而言低於0.5 pg/mL，針對有義股之單重分析之LLOD對於個別股及異雙螺旋體而言分別為25 pg/mL及14 pg/mL。針對Cal-3之變異係數（CV）皆低於15%，其中反義股之CV比有義股之彼等CV低得多。
表 18 ： ECL 信號 - 16- 聚體全長（ FL ）反義或有義探針
FL 反義探針 FL 有義探針
校準劑 濃度（ pg/mL ） 反義股 異雙螺旋體 有義股 異雙螺旋體
Cal-1 40000 411846 381867 100429 92338
Cal-2 10000 402206 345787 114521 74490
Cal-3 2500 362468 255147 89301 40525
Cal-4 625 173784 120117 17994 10785
Cal-5 156 56156 41165 4384 3590
Cal-6 39.1 15325 11862 1264 1637
Cal-7 9.77 4263 3357 1227 1142
Cal-8 2.44 1546 1163 1060 969
Cal-9 0.610 835 784 1016 881
Cal-10 0.153 696 650 928 939
空白 0 616 605 979 960
表 19 ：個體股或異雙螺旋體之 LLOD 測定
FL AS 探針 FL SS 探針
個別AS 異雙螺旋體 個別SS 異雙螺旋體
希爾斜率 1.04 1.02 1.53 1.08
r 2值 0.994 1.000 0.977 0.978
LLOD（pg/mL） 0.37 0.47 25.3 14.3
空白CV（%） 7.71 8.07 7.11 8.40
Cal-3 CV（%） 1.71 5.75 11.3 12.0
實例 5. 異雙螺旋體之多重偵測此實驗經設計以測定實例1之模型異雙螺旋體反義寡核苷酸（ASO）之反義（AS）及有義（SS）股是否可使用實例1之RNA酶保護分析（RPA）以多重格式偵測。
簡言之,使用4倍連續稀釋（加2個空白孔）在40,000 pg/mL之最高校準劑濃度下產生個別反義（AS）股、有義（SS）股或異雙螺旋體股的10-點校準曲線。包含具有僅探針之孔以測定反義及有義探針是否將發生探針-探針相互作用及是否可用縮短12-聚體探針消除探針-探針相互作用。
評估兩種探針長度：濃度為200 pM之全長16-聚體（FL）及12-聚體（探針序列展示於實例2中）。
探針與反義或有義股雜交且與重複孔中稀釋劑54中之96孔盤雜交。
使用16-聚體（FL）及12-聚體探針之反義股偵測之ECL信號分別展示於 表 20及 表 21中。使用16-聚體（FL）及12-聚體探針之有義股偵測之ECL信號分別展示於 表 22及 表 23中。ECL資料以圖形方式展示於圖10A及圖10B中。 表 24展示針對單獨或異雙螺旋體中之反義（AS）及有義（SS）股，使用12-聚體探針之多重偵測之偵測下限（LLOD）。
結果展示當在多重分析中使用全長探針時，反義及有義探針交叉反應，導致背景信號高度升高。在高濃度下，存在反義股（個別或異雙螺旋體）之累加效應，而有義股在反義斑點信號上存在反相關且反之亦然（可能歸因於與探針之目標結合缺失探針-探針相互作用）。
在單重分析（實例2）或多重分析（當前實例）中使用12-聚體探針得到類似的ECL含量，從而指示對探針進行多重分析無不利影響。
表 20 ： ECL 信號 - 反義  
FL 探針
校準劑 濃度（ pg/mL ） 反義股 有義股 異雙螺旋體 空白
Cal-1 40000 445564 38268 428453 253738
Cal-2 10000 417321 106092 417266 265647
Cal-3 2500 410957 188466 367584 255043
Cal-4 625 319217 235504 301552 255697
Cal-5 156 264762 250846 259345 238399
Cal-6 39.1 267705 258659 253933 247750
Cal-7 9.77 264975 259514 254619 246520
Cal-8 2.44 259803 260489 250511 256856
Cal-9 0.610 249089 247304 231383 240383
Cal-10 0.153 266104 262336 253636 252661
空白 0 269205 269493 260503 263732
表 21 ： ECL 信號 - 反義
12- 聚體探針
校準劑 濃度（ pg/mL ） 反義股 有義股 異雙螺旋體 空白
Cal-1 40000 43389 674 4775 624
Cal-2 10000 21803 716 1736 627
Cal-3 2500 3088 660 867 642
Cal-4 625 806 662 686 621
Cal-5 156 670 619 663 623
Cal-6 39.1 667 641 646 618
Cal-7 9.77 683 666 697 679
Cal-8 2.44 673 664 675 647
Cal-9 0.610 609 625 622 630
Cal-10 0.153 675 654 634 652
空白 0 703 684 664 685
表 22 ： ECL 信號 – 有義  
FL 探針
校準劑 濃度（ pg/mL ） 反義股 有義股 異雙螺旋體 空白
Cal-1 40000 70169 138232 126624 265355
Cal-2 10000 124831 193101 166476 273025
Cal-3 2500 211483 251805 214333 266967
Cal-4 625 250605 246399 245508 260377
Cal-5 156 263716 266637 252830 246284
Cal-6 39.1 278373 274500 263248 259176
Cal-7 9.77 290189 282544 266020 262873
Cal-8 2.44 275351 263998 263776 256705
Cal-9 0.610 275655 255402 244191 242755
Cal-10 0.153 283794 277184 257911 267708
空白 0 288126 282058 276128 285388
表 23 ： ECL 信號 – 有義
12- 聚體探針
校準劑 濃度（ pg/mL ） 反義股 有義股 異雙螺旋體 空白
Cal-1 40000 1485 93077 21051 1373
Cal-2 10000 1467 104926 22860 1800
Cal-3 2500 1570 58004 17875 1516
Cal-4 625 1491 13992 9372 1484
Cal-5 156 1593 4042 4201 1457
Cal-6 39.1 1583 2252 2185 2009
Cal-7 9.77 1641 1751 1733 1589
Cal-8 2.44 1584 1599 1668 1486
Cal-9 0.610 1504 1479 1517 1435
Cal-10 0.153 1544 1496 1551 1527
空白 0 1630 1539 1608 1567
表 24 ：藉由 12- 聚體探針之多重偵測 LLOD
反義斑點 有義斑點
個別反義 異雙螺旋體 個別有義 異雙螺旋體
希爾斜率 1.99 1.25 1.34 1.10
r 2值 1.000 1.000 0.981 0.994
LLOD est（pg/mL） 429 1083 27.0 7.71
實例 6. 雜交時間對異雙螺旋體之偵測的影響測定雜交時間減少對實例1之模型ASO之反義（AS）及有義（SS）股之偵測極限的影響。
簡言之，使用異雙螺旋體在40,000 pg/mL之最高校準劑濃度下使用4倍連續稀釋（加2個空白孔）產生10-點校準曲線。評估兩種探針長度：濃度為200 pM之全長16-聚體（FL）及12-聚體。使用「長雜交」方案（ 表 25）及「短雜交」方案（ 表 26），探針與稀釋劑54中之反義或有義股雜交。在稀釋劑54中，探針與96孔盤之重複孔雜交。
針對異雙螺旋體中之反義（AS）及有義（SS）股兩者之偵測，全長（FL）探針具有比12-聚體探針更佳的信號。結果以圖形方式展示於圖11A及圖11B中。雜交時間之變化對ECL信號產生不具有較大影響。
異雙螺旋體之ASO或SO股之偵測靈敏度不受探針與其對應股雜交之時間量減少的影響。為縮短分析時間，吾等建議在縮短雜交條件下進行探針/股雜交。
表 25 ：「長」雜交條件
步驟 溫度 時間
1 80℃ 2分鐘   
2 65℃ 5分鐘 以1℃降低至50℃，各自持續5分鐘
3 37℃ 保持   
表 26 ：「短」雜交條件
步驟 溫度 時間
1 95℃ 2分鐘
2 65℃ 1分鐘 （下降50%）
3 4℃ 保持 （下降3%）
實例 7. 血漿中之反義股及有義股之偵測測定實例1之模型ASO之反義（AS）或有義（SS）股摻入小鼠血漿中時之偵測極限。
簡言之，使用4倍連續稀釋（加2個空白孔）產生個別反義股、有義股或異雙螺旋體在40,000 pg/mL之最高校準劑濃度下之10-點校準曲線。小鼠血漿及稀釋劑校準曲線皆在60℃下用RNAsecure™ RNA酶失活試劑預處理10 min，且保持在4℃。
將RNAsecure™試劑以1:1比率添加於稀釋劑54中（20 µL校準劑或空白：20 µL RNAsecure™試劑）。以200 pM之最終濃度使用全長16-聚體（FL）探針。將5×探針以用稀釋劑54製備之10 µL體積添加，總共50 µL體積。使用 表 26中所示之縮短雜交方案，使探針與重複孔中之稀釋劑54中或血漿中之反義或有義股雜交。
資料（圖中未示）表明，由反義股偵測產生之ECL信號在血漿作為基質（個別股或作為異雙螺旋體之部分）時變化不大。如圖12A及圖12B中所示，ECL信號在將個別有義股（RNA）添加至小鼠血漿中時缺失且在將異雙螺旋體之有義股添加至小鼠血漿中時減少。此可能歸因於血漿中降解ssRNA之內源性RNA酶。 表 27展示稀釋劑54或血漿中之反義股之偵測下限（LLOD）。 表 28展示稀釋劑54或血漿中之有義股之偵測下限（LLOD）。
結果顯示以高靈敏度偵測反義股（DNA）之能力在血漿中量測時並不改變。對於反義（DNA）股，個別股及異雙螺旋體之反義股兩者在稀釋劑及血漿具有類似的LLOD est。然而，在血漿中量測時，偵測有義股（RNA）之能力改變：個別有義股不可偵測；且異雙螺旋體之有義股可偵測，但敏感度降低且動態範圍減少。
表 27 ：反義股偵測下限（ LLOD ）
單獨的反義股 異雙螺旋體
稀釋劑 54 血漿 稀釋劑 54 血漿
希爾斜率 1.02 0.99 1.01 0.95
r 2值 0.996 0.997 1.000 1.000
LLOD est（pg/mL） 0.40 0.53 0.44 0.19
表 28 ：有義股偵測偵測下限（ LLOD ）
單獨的反義股 異雙螺旋體
稀釋劑 54 血漿 稀釋劑 54 血漿
希爾斜率 1.32 n/a 0.96 0.93
r 2值 0.975 n/a 0.994 0.997
LLOD est（pg/mL） 19.9 n/a 9.92 37.1
實例 8. 小鼠血漿中之反義股及有義股之單重偵測使用實例1中基本上描述之RNA酶保護分析（RPA） （具有下文所提供之修改）、使用小鼠血漿中之全長（16-聚體）探針測定實例1之反義及有義股或全模型異雙螺旋體ASO之偵測極限。
簡言之，在小鼠血漿中使用異雙螺旋體股在40,000 pg/mL之最高校準劑濃度下使用4倍連續稀釋（加2個空白孔）產生10-點校準曲線。4個孔用於各校準劑，其中24個空白孔用於全偵測下限（LLOD）測定。校準劑樣本及空白用如實例7中所描述之RNAsecure™進行預處理。
探針在實例6中所描述之縮短雜交方案下與反義或有義股雜交，具有一個修改：將變性溫度降低至80℃，此係由於將血漿加熱至95℃以用於變性致使血漿太黏稠而不容易移液。經修訂之方案展示於 表 29中。
表 29 ：雜交條件
步驟 溫度 時間
1 80℃ 2分鐘
2 65℃ 1分鐘 （下降50%）
3 4℃ 保持 （下降3%）
結果（圖中未示）指示ECL信號與實例7中之血漿實驗一致。相較於有義股（RNA），反義股（DNA）之曲線頂部（TOC）信號高得多。在單重分析中，異雙螺旋體之反義股（DNA）之LLOD為約1 pg/mL且有義（RNA）股之LLOD為約31 pg/mL。Cal-3及空白之CV皆低於10%，從而展示低信號可變性。
實例 9. 阻斷劑 S1 對背景之影響針對與反義（AS）及有義（SS）單重分析相關之背景的影響，評估價阻斷劑S1添加至N-PLEX™阻斷緩衝液中之作用。
簡言之，使用4倍連續稀釋（加2個空白孔）在40,000 pg/mL之最高校準劑濃度下產生異雙螺旋體股之10-點校準曲線。基本上遵循實例8中所描述之單重反義及有義分析之方法，以200 pM之濃度使用全長（16-聚體）探針。將阻斷劑S1（MSD）添加至N-PLEX™阻斷劑（MSD）中。在稀釋劑54（MSD）下，探針與有義或反義股雜交。
結果指示N-PLEX™阻斷劑中包含阻斷劑S1對單重分析中之AS或SS股之陽性或背景信號產生無影響。
實例 10. 雙 RNA 酶消化對背景之影響針對與實例1中所描述之反義（AS）及有義（SS）單重分析相關之背景的影響，評估進行兩個RNA酶消化步驟之作用。
簡言之，使用4倍連續稀釋（加2個空白孔）在40,000 pg/mL之最高校準劑濃度下產生異雙螺旋體股之10-點校準曲線。基本上遵循實例8中所描述之單重反義及有義分析之方法，以200 pM之濃度使用全長（16-聚體）探針。RNA酶消化步驟進行一次或兩次。RNA酶消化步驟進行一次的孔在第二RNA酶消化步驟與稀釋劑54一起培育。在稀釋劑54下，探針與反義或有義股雜交。
資料（圖中未示）指示，添加額外的RNA酶消化步驟對陽性或背景ECL信號或LLOD est量測具有極小影響。
實例 11. 腦溶胞物中之反義股及有義股之偵測使用實例8中基本上描述之RNA酶保護分析（RPA） （具有下文所提供之修改）、使用腦溶胞物中之全長（16-聚體）探針測定實例1之反義及有義股或全模型異雙螺旋體ASO之偵測極限。
簡言之，使用摻入經稀釋之腦溶胞物中之反義、有義及異雙螺旋體股在40,000 pg/mL之最高校準劑濃度下使用4倍連續稀釋（加2個空白孔）產生10-點校準曲線。以200 pM之濃度使用全長16-聚體（FL）探針。 遵循實例8中所描述之方案，探針與反義或有義股雜交。將腦（BioIVT，Westbury，美國紐約韋斯特伯里（Westbury, NY, U.S.A.））均質化且溶解於稀釋劑54中。將均質物離心，且收集裂解物且將其1:4稀釋於稀釋劑54中。
資料（圖中未示）指示，AS股（個別的或作為異雙螺旋體之部分）之ECL信號產生在稀釋劑54或1:4稀釋之腦溶胞物之間非常類似。如圖13A及圖13B中所示，相較於稀釋劑54，腦溶胞物中之有義（SS）股（個別的或作為異雙螺旋體之部分）的ECL信號低得多。相比於實例8中展示血漿中之結果的結果，個別有義（SS）股產生比腦溶胞物中之異雙螺旋體之有義（SS）股更高的ECL信號。此可歸因於在腦細胞溶解後，RNA酶H之釋放。
單獨或異雙螺旋體中之反義（AS）及有義（SS）股在稀釋劑54或腦溶胞物中之LLOD展示於 表 30及 表 31中。此等結果展示可在經稀釋之腦溶胞物中容易地量測反義（DNA）股。
表 30 ：稀釋劑 54 或腦溶胞物中之反義股偵測（ LLOD ）
單獨的反義股 異雙螺旋體
稀釋劑 54 腦溶胞物 稀釋劑 54 腦溶胞物
希爾斜率 1.05 1.07 1.01 0.99
r 2值 0.996 0.996 0.999 1.000
LLOD est（pg/mL） 0.26 0.42 0.25 0.16
表 31 ：稀釋劑 54 或腦溶胞物中之有義股偵測（ LLOD ）
單獨的有義股 異雙螺旋體
稀釋劑 54 腦溶胞物 稀釋劑 54 腦溶胞物
希爾斜率 1.18 1.10 1.02 0.70
r 2值 0.985 1.000 1.000 0.995
LLOD est（pg/mL） 11.3 226 2.70 341
實例 12. 向探針中添加 LNA針對在單重分析中測定實例1之模型ASO之反義或有義股之偵測的影響，評估12-聚體RNA酶保護探針中包含鎖核酸（LNA）之影響。該方法基本上如實例8中所描述進行。
簡言之，使用摻入之反義、有義及異雙螺旋體股在40,000 pg/mL之最高校準劑濃度下使用4倍連續稀釋（加2個空白孔）產生10-點校準曲線。以200 pM之濃度使用具有LNA之全長16-聚體（FL）或12-聚體探針。在稀釋劑54下，探針與模型ASO之反義或有義股雜交。
圖14A及圖14B展示16-聚體（FL）或12-聚體RNA酶探針中之LNA對於偵測單獨或異雙螺旋體中之反義（AS）股的影響。表 32展示16-聚體（FL）或12-聚體RNA酶探針中之LNA對於偵測單獨或異雙螺旋體中之有義（SS）股的影響。 表 33展示具有及不具有LNA之FL或12-聚體反義探針之LLOD。 表 34展示具有及不具有LNA之FL或12-聚體有義探針之LLOD。
結果展示全長16-聚體（FL）探針產生針對AS及SS單重分析兩者之較高陽性及較低背景信號。LNA探針觀測到之較高背景可能係歸因於LNA寡核苷酸對核酸酶降解之抗性。儘管探針中降解之目標為RNA殘基，但LNA有助於保護整個寡核苷酸以避免RNA酶。
表 32 ： ECL 信號 - 藉由 FL 或 LNA 12- 聚體探針之有義偵測
單獨的有義股 異雙螺旋體
校準劑 濃度（ pg/mL ） FL 探針 LNA 12- 聚體 FL 探針 LNA 12- 聚體
Cal-1 40000 129219 92954 85283 81086
Cal-2 10000 117400 75898 66956 61790
Cal-3 2500 47186 37943 36465 31961
Cal-4 625 10107 10023 12307 11572
Cal-5 156 3179 4572 4335 5453
Cal-6 39.1 1559 3561 1717 3660
Cal-7 9.77 1137 3252 1138 3098
Cal-8 2.44 1043 2986 1079 2966
Cal-9 0.610 1027 3042 927 2916
Cal-10 0.153 1026 3135 917 3029
空白 0 1061 3220 943 3084
表 33 ：反義股偵測（ LLOD ） - LNA 探針
單獨的反義股 異雙螺旋體
FL 探針 LNA 12- 聚體 FL 探針 LNA 12- 聚體
希爾斜率 1.03 0.99 1.04 0.73
r 2值 0.984 0.999 0.995 1.000
LLOD est（pg/mL） 0.42 57.8 0.48 7.17
表 34 ：有義股偵測（ LLOD ） - LNA 探針
單獨的有義股 異雙螺旋體
FL 探針 LNA 12- 聚體 FL 探針 LNA 12- 聚體
希爾斜率 1.24 1.35 1.01 1.03
r 2值 0.989 1.000 1.000 1.000
LLOD est（pg/mL） 12.7 84.4 3.63 31.1
實例 13.LNA 探針之濃度測試針對實例1之模型ASO評估LNA探針之濃度降低對單重AS及SS分析之背景含量及敏感度的影響。
簡言之，使用4倍連續稀釋（加2個空白孔）在40,000 pg/mL之最高校準劑濃度下使用異雙螺旋體股產生10-點校準曲線。在單重分析中進行AS及SS分析且針對AS及SS分析兩者使用4個濃度的具有LNA之12-聚體探針：200 pM（0.2 nM）；100 pM（0.1 nM）；50 pM（0.05 nM）；及20 pM（0.02 nM）。在稀釋劑54下，探針與反義（AS）或有義（SS）股雜交。
圖15A及圖15B展示用於異雙螺旋體之AS或SS股之LNA探針之濃度降低會減少陽性及背景ECL信號兩者，其中探針濃度分別為0.02 mM及0.1 nM，從而提供提高之陽性及背景信號。
表 35及 表 36分別展示用於偵測異雙螺旋體中之反義股或有義股的不同LNA探針濃度之LLOD。
表 35 ：反義股異雙螺旋體偵測（ LLOD ）
0.2 nM 0.1 nM 0.05 nM 0.02 nM
希爾斜率 0.92 0.71 0.81 0.79
r 2值 0.976 0.998 0.997 0.998
LLOD est（pg/mL） 15.9 50.9 191 81.7
表 36 ：有義股異雙螺旋體偵測（ LLOD ）
0.2 nM 0.1 nM 0.05 nM 0.02 nM
希爾斜率 1.07 0.99 1.10 1.21
r 2值 0.995 0.992 0.995 0.996
LLOD est（pg/mL） 29.6 17.7 10.7 7.76
實例 14. 反義股及有義股之多重偵測中之 LNA 探針使用LNA探針評估實例1之模型異雙螺旋體之AS及SS股之多重偵測。
簡言之，使用4倍連續稀釋（加2個空白孔）使用個別反義（AS）、有義（SS）或異雙螺旋體股在40,000 pg/mL之最高校準劑濃度下產生10-點校準曲線。分析包含僅測定反義探針與有義探針之間是否發生探針-探針相互作用之探針的孔。
評估兩種不同探針類型：未修飾之12-聚體探針或LNA12-聚體探針。未修飾之12-聚體探針之200 pM探針濃度。針對AS，以20 pM之濃度使用12-聚體AS探針且以100 pM之濃度使用12-聚體SS探針。亦以100 pM之濃度使用SS LNA探針。改變LNA探針之濃度以解釋較高背景。在稀釋劑54下，探針與反義或有義股雜交。
圖16A及圖16B展示未修飾之12-聚體探針或LNA 12-聚體探針不存在脫靶信號，從而指示在任一情況下都不發生探針-探針相互作用，但針對AS股，LNA探針產生相對於未修飾之12-聚體探針較低的陽性ECL信號及類似的背景。
圖17A及圖17B展示未修飾之12-聚體探針或LNA 12-聚體探針不存在脫靶信號，從而指示在針對SS探針之任一情況下都不發生探針-探針相互作用。
表 37展示用未經修飾及經LNA修飾之12-聚體探針多重偵測個別反義（AS）股或異雙螺旋體中之反義股的LLOD。 表 38展示用未經修飾及經LNA修飾之12-聚體探針多重偵測個別有義（SS）股或異雙螺旋體中之有義股的LLOD。
LNA探針能夠偵測作為個別股或作為異雙螺旋體之一部分的AS及SS股兩者。在單重分析中，相對於全長探針，不存在使用12-聚體LNA探針之優勢。LNA探針在兩種分析中具有較高背景且必須經稀釋以使背景達至可接受之含量。亦犧牲了特定信號。針對AS及SS股之多重偵測，未修飾之12-聚體探針優於12-聚體LNA探針。
表 37 ：反義多重偵測（ LLOD ）
   12- 聚體反義探針 12- 聚體 LNA 反義探針
個別反義 異雙螺旋體 個別反義 異雙螺旋體
希爾斜率 1.73 0.95 1.12 0.80
r 2值 1.000 1.000 0.997 0.999
LLOD est（pg/mL） 432 186 180 61.6
表 38 ：有義多重偵測（ LLOD ）
   12- 聚體有義探針 12- 聚體 LNA 有義探針
個別有義 異雙螺旋體 個別有義 異雙螺旋體
希爾斜率 1.36 1.33 1.18 1.10
r 2值 0.986 0.977 0.998 0.987
LLOD est（pg/mL） 30.0 19.6 32.5 9.30
實例 15. 使用 13- 聚體及 14- 聚體探針對反義及有義股之單重偵測遵循實例8中所描述之方法使用13-聚體及14-聚體探針評估實例1之模型異雙螺旋體之個別反義（AS）及有義（SS）股之偵測。
簡言之，使用4倍連續稀釋（加2個空白孔）在40,000 pg/mL之最高校準劑濃度下使用異雙螺旋體股產生10-點校準曲線。評估四種不同探針類型：濃度為200 pM之未修飾之全長（FL）探針、14-聚體、13-聚體及12-聚體探針。在稀釋劑54下，探針與反義或有義股雜交。
圖18A及圖18B展示針對反義及有義股偵測，14-聚體探針之ECL信號類似於FL探針，同時用13-聚體探針觀測到輕微的信號損失。相較於FL探針，用12-聚體探針觀測到更明顯的損失。背景在12-聚體及13-聚體探針下增加。
表 39及表 40展示用全長（FL）探針、14-聚體、13-聚體或12-聚體探針偵測反義（AS）或有義（SS）股的LLOD。
表 39 ：反義偵測（ LLOD ）
FL 探針 14- 聚體 13- 聚體 12- 聚體
希爾斜率 1.05 1.02 1.06 1.81
r 2值 0.994 0.994 0.998 1.000
LLOD est（pg/mL） 0.69 0.41 2.23 267
表 40 ：有義偵測（ LLOD ）
FL 探針 14- 聚體 13- 聚體 12- 聚體
希爾斜率 1.31 1.27 1.32 1.36
r 2值 0.987 0.978 0.985 0.989
LLOD est（pg/mL） 13.6 19.9 24.6 31.20
實例 16. 使用 13- 聚體及 14- 聚體探針對反義及有義股之異雙螺旋體偵測使用基本上在實例8中所描述之13-聚體及14-聚體探針評估實例1之模型異雙螺旋體之反義（AS）及有義（SS）股之偵測。
簡言之，使用4倍連續稀釋（加2個空白孔）在40,000 pg/mL之最高校準劑濃度下使用異雙螺旋體股產生10-點校準曲線。評估四種不同探針類型：濃度為200 pM之未修飾之全長（FL）探針、14-聚體、13-聚體及12-聚體探針。在稀釋劑54下，探針與反義或有義股雜交。
如圖19A及圖19B中所示，當量測異雙螺旋體之AS股時，FL及14-聚體探針產生類似的信號。當量測異雙螺旋體之AS股時，13-聚體探針展示信號顯著損失且12-聚體探針不能產生足夠的信號。背景在13-聚體探針下增加。針對SS探針及股偵測，14-聚體及13-聚體探針類似於FL探針，而在12-聚體探針下存在一些信號損失。背景在12-聚體探針下增加。
表 41及 表 42展示用全長（FL）探針、14-聚體、13-聚體或12-聚體探針異雙螺旋體偵測反義（AS）或有義（SS）股的LLOD。
表 41 ：反義股偵測（ LLOD ）
FL 探針 14- 聚體 13- 聚體 12- 聚體
希爾斜率 1.09 1.06 1.00 0.78
r 2值 1.000 0.996 0.999 0.714
LLOD est（pg/mL） 0.94 0.91 1.98 223
表 42 ：有義偵測（ LLOD ）
FL 探針 14- 聚體 13- 聚體 12- 聚體
希爾斜率 1.02 0.94 0.98 0.90
r 2值 1.000 0.998 0.992 0.995
LLOD est（pg/mL） 3.94 4.87 3.17 4.31
實例 17. 使用 13- 聚體及 14- 聚體探針對反義及有義股之多重偵測此實驗經設計以測定13-聚體或14-聚體探針是否允許對實例1之反義（AS）及有義（SS）股或模型異雙螺旋體的多重偵測。
簡言之，使用4倍連續稀釋（加2個空白孔）在40,000 pg/mL之最高校準劑濃度下使用異雙螺旋體股產生10-點校準曲線。包含僅探針孔以評估探針-探針相互作用。
評估兩種不同探針類型：濃度為200 pM之14-聚體及13-聚體探針。在稀釋劑54中，探針與反義或有義股雜交。
如 表 43及 表 44中所示，14-聚體探針允許偵測個別AS股及異雙螺旋體之AS股兩者，但相較於個別股，14-聚體探針在量測異雙螺旋體時展示信號輕微降低。13-聚體探針亦允許偵測個別AS股及異雙螺旋體之AS股，但觀測到信號下降。重要地是，14-聚體及13-聚體探針兩者均與異雙螺旋體之AS股之多重偵測相容且並不引起探針-探針相互作用。
如 表 45及 表 46中所示，14-聚體及13-聚體探針兩者均允許偵測異雙螺旋體之SS股，但相較於13-聚體探針，14-聚體探針產生略微較高的信號。重要地是，14-聚體及13-聚體探針兩者均與異雙螺旋體之SS股之多重偵測相容且並不引起探針-探針相互作用。
表 47及 表 48展示用14-聚體及13-聚體探針偵測單獨或作為異雙螺旋體之一部分的反義（AS）或有義（SS）股的LLOD。
因此，14-聚體探針為針對反義股之最佳探針，而13-聚體或14-聚體探針可用於偵測有義股。
表 43 ： ECL 信號 - 用 14- 聚體探針偵測反義（ AS ）股
校準劑 濃度（ pg/mL ） AS 股 SS 股 異雙螺旋體 空白 （僅探針）
Cal-1 40000 491963 670 409536 674
Cal-2 10000 370227 639 307180 705
Cal-3 2500 270123 674 185649 697
Cal-4 625 97312 704 75888 726
Cal-5 156 25190 678 24355 696
Cal-6 39.1 6479 681 6257 743
Cal-7 9.77 1932 638 2295 725
Cal-8 2.44 931 655 1114 721
Cal-9 0.610 718 607 775 731
Cal-10 0.153 714 650 747 728
空白 0 691 688 704 747
表 44 ： ECL 信號 - 用 13- 聚體探針偵測反義（ AS ）股
校準劑 濃度（ pg/mL ） AS 股 SS 股 異雙螺旋體 空白 （僅探針）
Cal-1 40000 280311 1628 182534 1577
Cal-2 10000 236813 1464 116301 1486
Cal-3 2500 125262 1559 65630 1448
Cal-4 625 37176 1466 26445 1379
Cal-5 156 10311 1492 7678 1434
Cal-6 39.1 3950 1458 3703 1462
Cal-7 9.77 2151 1471 1782 1384
Cal-8 2.44 1705 1486 1506 1425
Cal-9 0.610 1160 1393 1401 1343
Cal-10 0.153 1490 1450 1464 1379
空白 0 1547 1508 1572 1498
表 45 ： ECL 信號 - 用 14- 聚體探針偵測有義（ SS ）股
校準劑 濃度（ pg/mL ） AS 股 SS 股 異雙螺旋體 空白 （僅探針）
Cal-1 40000 1211 123111 65819 1454
Cal-2 10000 1165 121003 63842 1543
Cal-3 2500 1238 61737 41795 1478
Cal-4 625 1198 14349 15469 1473
Cal-5 156 1221 5029 5811 1478
Cal-6 39.1 1222 2355 2222 1622
Cal-7 9.77 1419 1863 1713 1535
Cal-8 2.44 1298 1403 1527 1519
Cal-9 0.610 1308 1276 1477 1476
Cal-10 0.153 1243 1401 1433 1515
空白 0 1270 1301 1407 1518
表 46 ： ECL 信號 - 用 13- 聚體探針偵測有義（ SS ）股
校準劑 濃度（ pg/mL ） AS 股 SS 股 異雙螺旋體 空白 （僅探針）
Cal-1 40000 967 80842 54354 1037
Cal-2 10000 1039 106108 52571 1028
Cal-3 2500 1097 59334 32456 1011
Cal-4 625 1036 12920 12531 992
Cal-5 156 1036 4100 4668 983
Cal-6 39.1 1036 1643 1967 1003
Cal-7 9.77 1118 1306 1250 1028
Cal-8 2.44 1114 1103 1113 986
Cal-9 0.610 961 1050 1038 983
Cal-10 0.153 1061 1070 1042 977
空白 0 1100 1082 1082 1083
表 47 ：反義（ AS ）股偵測（ LLOD ）
   14- 聚體探針 13- 聚體探針
單獨的 AS 異雙螺旋體之 AS 單獨的 AS 異雙螺旋體之 AS
希爾斜率 1.10 0.98 1.04 0.94
r 2值 0.993 0.997 0.997 0.993
LLOD est（pg/mL） 0.77 0.43 3.85 2.32
表 48 ：有義（ SS ）股偵測（ LLOD ）
   14- 聚體探針 13- 聚體探針
單獨的 SS 異雙螺旋體之 SS 單獨的 SS 異雙螺旋體之 SS
希爾斜率 1.12 1.10 1.29 1.02
r 2值 0.981 0.997 0.951 0.996
LLOD est（pg/mL） 14.5 9.78 15.30 3.44
實例 18. 針對多重偵測之探針交叉檢查此實驗經設計以評估用於異雙螺旋體之兩個股之多重偵測的AS及SS探針之不同組合。
簡言之，使用4倍連續稀釋（加2個空白孔）在40,000 pg/mL之最高校準劑濃度下使用異雙螺旋體股產生10-點校準曲線。評估三種不同探針類型：濃度為200 pM之14-聚體、13-聚體及12-聚體探針。在稀釋劑54下，探針與反義或有義股雜交。
各探針與其他兩種探針交叉如下： ●   14-聚體AS與14-聚體SS ●   14-聚體AS與13-聚體SS ●   14-聚體AS與12-聚體SS ●   13-聚體AS與14-聚體SS ●   13-聚體AS與13-聚體SS ●   13-聚體AS與12-聚體SS ●   12-聚體AS與14-聚體SS ●   12-聚體AS與13-聚體SS
不評估12-聚體AS與12-聚體SS。
如圖20A中所示，無論SS探針之長度如何，既定AS探針長度之ECL信號為恆定的。14-聚體AS探針展示比13-聚體及12-聚體AS探針低的信號損失。如圖20B中所示，相較於對AS探針長度之改變，改變SS探針之長度對ECL信號具有不太顯著的影響。SS信號隨AS探針減少（尤其12-聚體AS探針）而降低。重要地是，14-聚體或13-聚體SS探針針對多重偵測起良好的作用。
表 49提供探針組合之LLOD及希爾斜率量測。
表 49 ：曲線擬合及限值
AS探針 14- 聚體 13- 聚體 12- 聚體
SS探針 14- 聚體 13- 聚體 12- 聚體 14- 聚體 13- 聚體 12- 聚體 14- 聚體 13- 聚體
AS希爾斜率 1.01 0.99 1.00 0.95 0.94 0.91 1.13 1.16
AS r 2值 0.995 0.997 0.999 0.997 0.990 0.995 1.000 1.000
AS LLOD est（pg/mL） 0.88 0.54 0.46 1.92 2.03 4.07 377 408
SS希爾斜率 1.03 1.00 1.00 1.04 1.09 1.07 1.05 1.04
SS r 2值 0.999 1.000 0.999 0.999 1.000 0.996 1.000 1.000
SS LLOD est（pg/mL） 7.38 3.60 6.50 3.58 4.88 10.94 4.13 8.06
此等資料指示，有可能藉由使用縮短探針以高靈敏度量測同一孔中之異雙螺旋體之有義股及反義股兩者。
[圖1A]為反義結合複合物之示意性圖示，其中本文所描述之反義結合探針與反義寡核苷酸序列雜交。 [圖1B]為有義結合複合物之示意性圖示，其中本文所描述之有義結合探針與有義寡核苷酸序列雜交。 [圖2A]為在寡核苷酸雙螺旋體之反義結合股與「短」反義結合探針之間形成的反義結合複合物之示意性圖示。 [圖2B]為在寡核苷酸雙螺旋體之有義結合股與「短」有義結合探針之間形成的有義結合複合物之示意性圖示。 [圖2C]為展示在「短」有義結合探針與「短」反義結合探針之間形成的「非有效性」結合複合物之示意性圖示。 [圖3A]為在寡核苷酸雙螺旋體之反義結合股與「全長」反義結合探針之間形成的反義結合複合物之示意性圖示。 [圖3B]為在寡核苷酸雙螺旋體之有義結合股與「全長」有義結合探針之間形成的有義結合複合物之示意性圖示。 [圖3C]為展示在「全長」有義結合探針與「全長」反義結合探針之間形成的「非有效性」結合複合物之示意性圖示。 [圖4A]為與固定於載體表面上之捕獲寡核苷酸雜交之探針之寡核苷酸標籤的示意圖，其中該探針為具有單股突出端之反義或有義複合物之一部分。 [圖4B]為與固定於載體表面上之捕獲寡核苷酸雜交之探針之寡核苷酸標籤的示意圖，其中該探針為不具有單股突出端之反義或有義複合物之一部分。 [圖4C]為與固定於載體表面上之捕獲寡核苷酸雜交之探針之寡核苷酸標籤的示意圖，其中該探針不為反義或有義複合物之一部分。 [圖4D]為與固定於載體表面上之捕獲寡核苷酸雜交之探針之寡核苷酸標籤的示意圖，其中該探針為包含單股突出端之探針-探針複合物之一部分。 [圖4E]為與固定於載體表面上之捕獲寡核苷酸雜交之探針之寡核苷酸標籤的示意圖，其中該探針為不包含單股突出端之探針-探針複合物之一部分。 [圖5A]為展示在稀釋劑54中雜交之1×及4×濃度之反義（AS）探針之ECL信號曲線的圖式。 [圖5B]為展示在雜交緩衝液中雜交之1×及4×濃度之反義（AS）探針之ECL信號曲線的圖式。 [圖6A]為展示在稀釋劑54中雜交之1×及4×濃度之有義（SS）探針之ECL信號曲線的圖式。 [圖6B]為展示在雜交緩衝液中雜交之1×及4×濃度之有義（SS）探針之ECL信號曲線的圖式。 [圖7A]為展示在稀釋劑54中雜交之16-聚體（FL）及12-聚體反義（AS）探針之ECL信號曲線的圖式。 [圖7B]為展示在雜交緩衝液中雜交之16-聚體（FL）及12-聚體反義（AS）探針之ECL信號曲線的圖式。 [圖8A]為展示與單獨或異雙螺旋體中之反義（AS）股雜交之16-聚體（FL）探針之ECL信號曲線的圖式。 [圖8B]為展示與單獨或異雙螺旋體中之反義（AS）股雜交之12-聚體探針之ECL信號曲線的圖式。 [圖9A]為展示與單獨或異雙螺旋體中之有義（SS）股雜交之16-聚體（FL）探針之ECL信號曲線的圖式。 [圖9B]為展示與單獨或異雙螺旋體中之有義（SS）股雜交之12-聚體探針之ECL信號曲線的圖式。 [圖10A]為展示與單獨或異雙螺旋體中之反義（AS）股雜交之12-聚體探針之ECL信號曲線的圖式。 [圖10B]為展示與單獨或異雙螺旋體中之有義（SS）股雜交之12-聚體探針之ECL信號曲線的圖式。 [圖11A]為展示在長或短雜交條件下與反義（AS）股雜交之16-聚體（FL）探針之ECL信號曲線的圖式。 [圖11B]為展示在長或短雜交條件下與反義（AS）股雜交之12-聚體探針之ECL信號曲線的圖式。 [圖12A]為展示稀釋劑54及血漿中之個別有義（SS）股之ECL信號曲線的圖式。 [圖12B]為展示稀釋劑54及血漿中之異雙螺旋體中之有義（SS）股之ECL信號曲線的圖式。 [圖13A]為展示稀釋劑54或腦溶胞物中之個別有義（SS）股之ECL信號曲線的圖式。 [圖13B]為展示稀釋劑54或腦溶胞物中之異雙螺旋體之有義（SS）股之ECL信號曲線的圖式。 [圖14A]為展示具有或不具有LNA之個別反義（AS）股之ECL信號曲線的圖式。 [圖14B]為展示具有或不具有LNA之異雙螺旋體之反義（AS）股之ECL信號曲線的圖式。 [圖15A]為展示反義（AS）LNA探針在不同濃度下之ECL信號曲線的圖式。 [圖15B]為展示有義（SS）LNA探針在不同濃度下之ECL信號曲線的圖式。 [圖16A]為展示用未經修飾或經LNA修飾之12-聚體探針多重偵測個別反義（AS）股之ECL信號曲線的圖式。 [圖16B]為展示用未經修飾或經LNA修飾之12-聚體探針多重偵測異雙螺旋體之反義（AS）股之ECL信號曲線的圖式。 [圖17A]為展示用未經修飾或經LNA修飾之12-聚體探針多重偵測個別有義（SS）股之ECL信號曲線的圖式。 [圖17B]為展示用未經修飾或經LNA修飾之12-聚體探針多重偵測異雙螺旋體之有義（SS）股之ECL信號曲線的圖式。 [圖18A]為展示使用FL、14-聚體、13-聚體及12-聚體探針偵測之個別反義（AS）股之ECL信號曲線的圖式。 [圖18B]為展示使用FL、14-聚體、13-聚體及12-聚體探針偵測之個別有義（SS）股之ECL信號曲線的圖式。 [圖19A]為展示使用FL、14-聚體、13-聚體及12-聚體探針偵測之異雙螺旋體之反義（AS）股之ECL信號曲線的圖式。 [圖19B]為展示使用FL、14-聚體、13-聚體及12-聚體探針偵測之異雙螺旋體之有義（SS）股之ECL信號曲線的圖式。 [圖20A]為展示當使用反義（AS）及有義（SS）探針長度之組合偵測時的異雙螺旋體中之反義（AS）股之ECL信號曲線的圖式。 [圖20B]為展示當使用反義（AS）及有義（SS）探針長度之組合偵測時的異雙螺旋體中之有義（SS）股之ECL信號曲線的圖式。
10:反義複合物
11:反義股
12:反義探針
13:寡核苷酸標籤
14:反義結合部分
15:標記
20:有義複合物
21:有義股
22:有義探針
23:寡核苷酸標籤
24:有義結合部分
25:標記

Claims (151)

  1. 一種偵測或定量樣本中之寡核苷酸雙螺旋體之有義股及反義股的方法，該方法包括： （a）   使該樣本與包括一組探針之組合物接觸，其中該組探針包括： （i）    有義探針，其包括與固定於載體表面上之第一捕獲寡核苷酸之至少一部分互補的第一單股寡核苷酸標籤、能夠與該寡核苷酸雙螺旋體之該有義股之核苷酸序列雜交的有義結合部分，及第一標記；及 （ii）   反義探針，其包括與固定於該載體表面上之第二捕獲寡核苷酸之至少一部分互補的第二單股寡核苷酸標籤、能夠與該寡核苷酸雙螺旋體之該反義股之核苷酸序列雜交的反義結合部分，及第二標記， 其中該有義探針之該有義結合部分具有比該有義股之有義股長度短的有義結合長度，且 其中該反義股之該反義結合部分具有比該反義股之反義股長度短的反義結合長度；及 （b）   將該等探針與該樣本一起培育以形成包括雜交複合物之雜交混合物，該等雜交複合物包括： （i）    有義複合物，其包括與該寡核苷酸雙螺旋體之該有義股雜交的該有義探針；及 （ii）   反義複合物，其包括與該寡核苷酸雙螺旋體之該反義股雜交的該反義探針；及 （c）   使該載體表面與該雜交混合物接觸，其中該等有義及反義探針之該等第一及第二寡核苷酸標籤與固定於該載體表面上之該等第一及第二捕獲寡核苷酸雜交；及使該雜交混合物中之該等雜交複合物與單股特異性核酸酶接觸；及 （d）   基於該載體表面上之該標記之存在來偵測或定量該寡核苷酸雙螺旋體之該有義股及該反義股。
  2. 如請求項1之方法，其中（c）包括： （i）    在該等雜交複合物之該等第一及第二寡核苷酸標籤與該載體表面上之該等第一及第二捕獲寡核苷酸雜交以將該等雜交複合物固定於該載體表面上的條件下，使該載體表面與該雜交混合物接觸；及 （ii）   使經固定之雜交複合物與單股特異性核酸酶接觸。
  3. 如請求項1之方法，其中（c）包括： （i）    使該雜交混合物與單股特異性核酸酶接觸以形成反應混合物；及 （ii）   在該等雜交複合物之該等第一及第二寡核苷酸標籤與固定於該載體表面上之該等第一及第二捕獲寡核苷酸雜交的條件下，使該載體表面與（i）之該反應混合物接觸。
  4. 如請求項1之方法，其中該寡核苷酸雙螺旋體之該有義股及該反義股各自分別包括約8至約50個核苷酸。
  5. 如請求項1至4中任一項之方法，其中該寡核苷酸雙螺旋體之該有義股及該反義股各自分別包括約16至約30個核苷酸。
  6. 如請求項1至5中任一項之方法，其中該寡核苷酸雙螺旋體之該有義股包括DNA。
  7. 如請求項1至5中任一項之方法，其中該寡核苷酸雙螺旋體之該有義股包括RNA。
  8. 如請求項1至5中任一項之方法，其中該寡核苷酸雙螺旋體之該反義股包括DNA。
  9. 如請求項1至5中任一項之方法，其中該寡核苷酸雙螺旋體之該反義股包括RNA。
  10. 如請求項1至5中任一項之方法，其中該寡核苷酸雙螺旋體包括DNA/DNA雙螺旋體。
  11. 如請求項1至5中任一項之方法，其中該寡核苷酸雙螺旋體包括RNA/RNA雙螺旋體。
  12. 如請求項1至5中任一項之方法，其中該寡核苷酸雙螺旋體包括DNA/RNA異雙螺旋體。
  13. 如請求項1至12中任一項之方法，其中該寡核苷酸雙螺旋體之該有義股、該反義股或該有義股及該反義股兩者分別包括一或多個經修飾之核酸。
  14. 如請求項1至13中任一項之方法，其中該寡核苷酸雙螺旋體之該有義股、該反義股或該有義股及該反義股兩者分別包括5'-結合物或3'-結合物。
  15. 如請求項14之方法，其中該結合物包括聚乙二醇（PEG）、N-乙醯半乳胺糖（GalNAc）、細胞穿透肽（CPP）、α-生育酚、適體、抗體、膽固醇、鯊烯（squalene）、脂肪酸或核脂質（nucleolipid）。
  16. 如請求項1至15中任一項之方法，其中該有義探針之該有義結合長度比該有義股之該有義股長度短至少1個核苷酸。
  17. 如請求項1至16中任一項之方法，其中該有義結合長度為約10至約16個核苷酸長度。
  18. 如請求項1至17中任一項之方法，其中該有義探針之該有義結合部分具有與該寡核苷酸雙螺旋體之該有義股之3'端對準的5'端。
  19. 如請求項1至18中任一項之方法，其中該反義探針之該反義結合長度比該反義股之該反義股長度短至少1個核苷酸。
  20. 如請求項1至19中任一項之方法，其中該反義結合長度為約10至約16個核苷酸長度。
  21. 如請求項1至20中任一項之方法，其中該反義探針之該反義結合部分具有與該寡核苷酸雙螺旋體之該反義股之3'端對準的5'端。
  22. 如請求項1至21中任一項之方法，其中該第一寡核苷酸標籤具有第一寡核苷酸標籤長度且該第一捕獲寡核苷酸具有第一捕獲寡核苷酸長度，且該第一寡核苷酸標籤長度與該第一捕獲寡核苷酸長度相同。
  23. 如請求項1至21中任一項之方法，其中該第一寡核苷酸標籤具有第一寡核苷酸標籤長度且該第一捕獲寡核苷酸具有第一捕獲寡核苷酸長度，且該第一寡核苷酸標籤長度比該第一捕獲寡核苷酸長度短。
  24. 如請求項1至21中任一項之方法，其中該第二寡核苷酸標籤具有第二寡核苷酸標籤長度且該第二捕獲寡核苷酸具有第二捕獲寡核苷酸長度，且該第二寡核苷酸標籤長度與該第二捕獲寡核苷酸長度相同。
  25. 如請求項1至21中任一項之方法，其中該第二寡核苷酸標籤具有第二寡核苷酸標籤長度且該第二捕獲寡核苷酸具有第二捕獲寡核苷酸長度，且該第二寡核苷酸標籤長度比該第二捕獲寡核苷酸長度短。
  26. 如請求項1至25中任一項之方法，其中該有義探針包括DNA。
  27. 如請求項26之方法，其中該有義探針之該有義結合部分包括DNA。
  28. 如請求項26之方法，其中該有義探針之該第一寡核苷酸標籤包括DNA。
  29. 如請求項26之方法，其中該有義探針之該有義結合部分及該寡核苷酸標籤包括DNA。
  30. 如請求項29之方法，其中該有義探針之該有義結合部分包括DNA且該有義探針之該寡核苷酸標籤包括RNA。
  31. 如請求項1至25中任一項之方法，其中該反義探針包括DNA。
  32. 如請求項31之方法，其中該反義探針之該反義結合部分包括DNA。
  33. 如請求項31之方法，其中該反義探針之該第一寡核苷酸標籤包括DNA。
  34. 如請求項31之方法，其中該反義探針之該反義結合部分及該寡核苷酸標籤包括DNA。
  35. 如請求項31之方法，其中該反義探針之該反義結合部分包括DNA且該反義探針之該寡核苷酸標籤包括RNA。
  36. 如請求項1至25中任一項之方法，其中該有義探針包括RNA。
  37. 如請求項36之方法，其中該有義探針之該有義結合部分包括RNA。
  38. 如請求項36之方法，其中該有義探針之該第一寡核苷酸標籤包括RNA。
  39. 如請求項36之方法，其中該有義探針之該有義結合部分及該寡核苷酸標籤包括RNA。
  40. 如請求項36之方法，其中該有義探針之該有義結合部分包括RNA且該有義探針之該寡核苷酸標籤包括DNA。
  41. 如請求項1至25中任一項之方法，其中該反義探針包括RNA。
  42. 如請求項41之方法，其中該反義探針之該反義結合部分包括RNA。
  43. 如請求項41之方法，其中該反義探針之該第一寡核苷酸標籤包括RNA。
  44. 如請求項41之方法，其中該反義探針之該反義結合部分及該寡核苷酸標籤包括RNA。
  45. 如請求項41之方法，其中該反義探針之該反義結合部分包括RNA且該反義探針之該寡核苷酸標籤包括DNA。
  46. 如請求項1至45中任一項之方法，其中該有義探針、該反義探針或兩者包括一或多個經修飾之核酸。
  47. 如請求項46之方法，其中一或多個經修飾之核苷酸包括鎖核酸（LNA）。
  48. 如請求項46之方法，其中一或多個經修飾之核苷酸係選自磷酸二酯（PO）；硫代磷酸酯（PS）；2'O-甲基（2'OMe）；2'O-甲氧基乙基（MOE）；肽核酸（PNA）；磷醯胺酸(N-
    Figure 03_image001
    啉基)（PMO）；鎖核酸（LNA）；2'-去氧-2'-氟（2'-F）；或其組合。
  49. 如請求項26至35中任一項之方法，其中該單股特異性核酸酶包括單股特異性DNA酶。
  50. 如請求項49之方法，其中該單股特異性DNA酶為S1核酸酶、P1核酸酶或綠豆核酸酶（Mung Bean nuclease）。
  51. 如請求項36至45中任一項之方法，其中該單股特異性核酸酶包括單股特異性RNA酶。
  52. 如請求項51之方法，其中該單股特異性RNA酶係選自RNA酶A、RNA酶H、RNA酶I、RNA酶III、RNA酶L、RNA酶P、RNA酶PhyM、RNA酶T1、RNA酶T2、RNA酶U2、RNA酶V、PNP酶、RNA酶PH、RNA酶R、RNA酶D、RNA酶T、RNA酶ONE、寡核糖核酸酶、核糖核酸外切酶I及核糖核酸外切酶II。
  53. 如請求項1之方法，其中（a）至（c）係同時進行。
  54. 如請求項之方法，其中（a）至（c）係依序進行。
  55. 如請求項1至54中任一項之方法，其中（b）中之該等雜交條件包括： （i）    將該等探針與該樣本在第一溫度下培育以使該寡核苷酸雙螺旋體之該有義股及該反義股變性；及 （ii）   將該等探針與該寡核苷酸雙螺旋體之經變性有義股及反義股在第二溫度下培育以允許該有義探針及該反義探針與該有義股及該反義股雜交。
  56. 如請求項55之方法，其進一步包括在約2℃至約8℃之保持溫度下培育該等有義及反義複合物。
  57. 如請求項1至56中任一項之方法，其中（b）中之該等雜交條件包括： （i）    將該等探針與該樣本在約60℃至約95℃之第一溫度下培育約1分鐘至約15分鐘； （ii）   將該等探針與該樣本在約10℃至約65℃之第二溫度下培育約30秒至約5分鐘；及 （iii）  將該等探針與該樣本在約2℃至約8℃之保持溫度下培育。
  58. 如請求項57之方法，其中（b）中之該等雜交條件包括： （i）    將該等探針與該樣本在約95℃之第一溫度下培育約2分鐘； （ii）   將該等探針與該樣本在約65℃之第二溫度下培育約1分鐘；及 （iii）  將該等探針與該樣本在約4℃之保持溫度下培育。
  59. 如請求項57或58之方法，其包括在步驟（i）與（ii）之間的約1℃/s至約2℃/s之第一溫度轉變速率。
  60. 如請求項57或58之方法，其包括在步驟（i）與（ii）之間的約1.8℃/s之溫度溫度轉變速率。
  61. 如請求項57或58之方法，其包括在步驟（ii）與（iii）之間的約0.05℃/s至約1℃/s之第二溫度轉變速率。
  62. 如請求項57或58之方法，其包括在步驟（ii）與（iii）之間的約0.1℃/s之第二溫度轉變速率。
  63. 如請求項1至62中任一項之方法，其中該等探針與該樣本在包括稀釋劑54之緩衝液或N-PLEX雜交緩衝液1或2中培育。
  64. 如請求項1至63中任一項之方法，其中該樣本包括複數個寡核苷酸雙螺旋體且（a）中之該組合物包括複數組探針，其中各組探針與獨特寡核苷酸雙螺旋體之獨特有義股或反義股雜交。
  65. 如請求項1至64中任一項之方法，其中（c）包括將該載體表面與該等有義及反義複合物在約20℃至約40℃之溫度下培育約15分鐘至約12小時。
  66. 如請求項1至65中任一項之方法，其中（c）包括將該載體表面與該等有義及反義複合物在約20℃至約40℃之溫度下培育約1小時至約2小時。
  67. 如請求項65或66之方法，其中該載體表面與該等有義及反義複合物在振盪下培育。
  68. 如請求項1至67中任一項之方法，其中（c）包括將該載體表面與該等有義及反義複合物在約37℃之溫度下培育約1小時，同時在約705 rpm下振盪。
  69. 如請求項1至68中任一項之方法，其中（a）中之該組合物包括約20 pM至約10 nM有義探針。
  70. 如請求項1至69中任一項之方法，其中（a）中之該組合物包括約20 pM至約10 nM反義探針。
  71. 如請求項1至70中任一項之方法，其中該樣本包括生物樣本。
  72. 如請求項71之方法，其中該樣本包括未經處理之生物樣本。
  73. 如請求項71之方法，其中該樣本包括經預處理之生物樣本。
  74. 如請求項71之方法，其中該樣本包括純化樣本。
  75. 如請求項74之方法，其中該樣本係藉由沈澱、離心或管柱層析法純化。
  76. 如請求項74之方法，其中該樣本包括經萃取之樣本。
  77. 如請求項71之方法，其中該樣本包括天然存在之RNA酶。
  78. 如請求項77之方法，其中該方法包括在（a）之前組合該樣本與RNA酶抑制劑。
  79. 如請求項71之方法，其中該樣本包括游離DNA。
  80. 如請求項71之方法，其中該生物樣本包括獲自生物體之流體。
  81. 如請求項80之方法，其中該生物樣本包括全血、血漿、血清、尿液、糞便、母乳、唾液或羊膜液。
  82. 如請求項1至70中任一項之方法，其中該樣本包括4}環境樣本。
  83. 如請求項1至70中任一項之方法，其中該樣本包括製造過程樣本。
  84. 如請求項1至83中任一項之方法，其中該方法具有小於約200 pg/mL之偵測極限。
  85. 如請求項1至84中任一項之方法，其中該載體表面包括一或多個電極。
  86. 如請求項85之方法，其中一或多個電極包括碳電極。
  87. 如請求項85或86之方法，其中一或多個電極包括碳墨電極。
  88. 如請求項85至87中任一項之方法，其中一或多個電極包含於多孔盤中。
  89. 如請求項88之方法，其中該多孔盤之各孔包含電極。
  90. 如請求項1至89中任一項之方法，其中該標記包括結合對之成員。
  91. 如請求項90之方法，其中該標記包括生物素。
  92. 如請求項1至89中任一項之方法，其中該標記包括電化學發光標記。
  93. 如請求項92之方法，其包括藉由使該等電極與包括電化學發光共反應物之電化學發光讀取緩衝液接觸及向該等電極施加電位而產生分析信號的步驟。
  94. 如請求項93之方法，其中該共反應物係選自三級胺、三丙胺、N-丁基二乙醇胺及其組合。
  95. 一種組合物，其包括一組探針，其中該組探針包括： （a）   有義探針，其包括與第一捕獲寡核苷酸之至少一部分互補的第一單股寡核苷酸標籤、能夠與該寡核苷酸雙螺旋體之有義股之核苷酸序列雜交的有義結合部分，及第一標記；及 （b）   反義探針，其包括與第二捕獲寡核苷酸之至少一部分互補的第二單股寡核苷酸標籤、能夠與該寡核苷酸雙螺旋體之反義股之核苷酸序列雜交的反義結合部分，及第二標記， 其中該有義探針之該有義結合部分具有比該有義股之有義股長度短的有義結合長度，且 其中該反義股之該反義結合部分具有比該反義股之反義股長度短的反義結合長度。
  96. 一種組合物，其包括： （a）   寡核苷酸雙螺旋體，其包括有義股及反義股；及 （b）   一組探針，其包括： （i）    有義探針，其包括與第一捕獲寡核苷酸之至少一部分互補的第一單股寡核苷酸標籤、能夠與寡核苷酸雙螺旋體之有義股之核苷酸序列雜交的有義結合部分，及第一標記；及 （ii）   反義探針，其包括與第二捕獲寡核苷酸之至少一部分互補的第二單股寡核苷酸標籤、能夠與該寡核苷酸雙螺旋體之反義股之核苷酸序列雜交的反義結合部分，及第二標記， 其中該有義探針之該有義結合部分具有比該有義股之有義股長度短的有義結合長度，且 其中該反義股之該反義結合部分具有比該反義股之反義股長度短的反義結合長度。
  97. 一種組合物，其包括一或多種雜交複合物，該等雜交複合物包括： （a）   有義複合物，其包括與寡核苷酸雙螺旋體之有義股雜交的有義探針，其中該有義探針包括與第一捕獲寡核苷酸之至少一部分互補的第一單股寡核苷酸標籤、能夠與該寡核苷酸雙螺旋體之該有義股之核苷酸序列雜交的有義結合部分，及第一標記，其中該有義探針之該有義結合部分具有比該有義股之有義股長度短的有義結合長度； （b）   反義複合物，其包括與該寡核苷酸雙螺旋體之反義股雜交的反義探針，其中該反義探針包括與第二捕獲寡核苷酸之至少一部分互補的第二單股寡核苷酸標籤、能夠與該寡核苷酸雙螺旋體之該反義股之核苷酸序列雜交的反義結合部分，及第二標記，其中該反義股之該反義結合部分具有比該反義股之反義股長度短的反義結合長度， 及其組合。
  98. 如請求項95至97中任一項之組合物，其中該寡核苷酸雙螺旋體之該有義股及該反義股各自分別包括約8至約50個核苷酸。
  99. 如請求項95至98中任一項之組合物，其中該寡核苷酸雙螺旋體之該有義股及該反義股各自分別包括約16至約30個核苷酸。
  100. 如請求項95至99中任一項之組合物，其中該寡核苷酸雙螺旋體之該有義股包括DNA。
  101. 如請求項95至99中任一項之組合物，其中該寡核苷酸雙螺旋體之該有義股包括RNA。
  102. 如請求項95至99中任一項之組合物，其中該寡核苷酸雙螺旋體之該反義股包括DNA。
  103. 如請求項95至99中任一項之組合物，其中該寡核苷酸雙螺旋體之該反義股包括RNA。
  104. 如請求項95至99中任一項之組合物，其中該寡核苷酸雙螺旋體包括DNA/DNA雙螺旋體。
  105. 如請求項95至99中任一項之組合物，其中該寡核苷酸雙螺旋體包括RNA/RNA雙螺旋體。
  106. 如請求項95至99中任一項之組合物，其中該寡核苷酸雙螺旋體包括DNA/RNA異雙螺旋體。
  107. 如請求項95至106中任一項之組合物，其中該寡核苷酸雙螺旋體之該有義股、該反義股或該有義股及該反義股兩者分別包括一或多個經修飾之核酸。
  108. 如請求項95至107中任一項之組合物，其中該寡核苷酸雙螺旋體之該有義股、該反義股或該有義股及該反義股兩者分別包括5'-結合物或3'-結合物。
  109. 如請求項108之組合物，其中該結合物包括聚乙二醇（PEG）、N-乙醯半乳胺糖（GalNAc）、細胞穿透肽（CPP）、α-生育酚、適體、抗體、膽固醇、鯊烯、脂肪酸或核質。
  110. 如請求項95至109中任一項之組合物，其中該有義探針之該有義結合長度比該有義股之該有義股長度短至少1個核苷酸。
  111. 如請求項95至110中任一項之組合物，其中該有義結合長度為約10至約16個核苷酸長度。
  112. 如請求項95至111中任一項之組合物，其中該有義探針之該有義結合部分具有與該寡核苷酸雙螺旋體之該有義股之3'端對準的5'端。
  113. 如請求項95至112中任一項之組合物，其中該反義探針之該反義結合長度比該反義股之該反義股長度短至少1個核苷酸。
  114. 如請求項95至113中任一項之組合物，其中該反義結合長度為約10至約16個核苷酸長度。
  115. 如請求項95至114中任一項之組合物，其中該反義探針之該反義結合部分具有與該寡核苷酸雙螺旋體之該反義股之3'端對準的5'端。
  116. 如請求項95至115中任一項之組合物，其中該有義探針包括DNA。
  117. 如請求項116之組合物，其中該有義探針之該有義結合部分包括DNA。
  118. 如請求項116之組合物，其中該有義探針之該第一寡核苷酸標籤包括DNA。
  119. 如請求項116之組合物，其中該有義探針之該有義結合部分及該寡核苷酸標籤包括DNA。
  120. 如請求項116之組合物，其中該有義探針之該有義結合部分包括DNA且該有義探針之該寡核苷酸標籤包括RNA。
  121. 如請求項95至115中任一項之組合物，其中該反義探針包括DNA。
  122. 如請求項121之組合物，其中該反義探針之該反義結合部分包括DNA。
  123. 如請求項121之組合物，其中該反義探針之該第一寡核苷酸標籤包括DNA。
  124. 如請求項121之組合物，其中該反義探針之該反義結合部分及該寡核苷酸標籤包括DNA。
  125. 如請求項121之組合物，其中該反義探針之該反義結合部分包括DNA且該反義探針之該寡核苷酸標籤包括RNA。
  126. 如請求項95至115中任一項之組合物，其中該有義探針包括RNA。
  127. 如請求項126之組合物，其中該有義探針之該有義結合部分包括RNA。
  128. 如請求項126之組合物，其中該有義探針之該第一寡核苷酸標籤包括RNA。
  129. 如請求項126之組合物，其中該有義探針之該有義結合部分及該寡核苷酸標籤包括RNA。
  130. 如請求項126之組合物，其中該有義探針之該有義結合部分包括RNA且該有義探針之該寡核苷酸標籤包括DNA。
  131. 如請求項95至115中任一項之組合物，其中該反義探針包括RNA。
  132. 如請求項131之組合物，其中該反義探針之該反義結合部分包括RNA。
  133. 如請求項131之組合物，其中該反義探針之該第一寡核苷酸標籤包括RNA。
  134. 如請求項131之組合物，其中該反義探針之該反義結合部分及該寡核苷酸標籤包括RNA。
  135. 如請求項131之組合物，其中該反義探針之該反義結合部分包括RNA且該反義探針之該寡核苷酸標籤包括DNA。
  136. 如請求項95至135中任一項之組合物，其中該有義探針、該反義探針或兩者包括一或多個經修飾之核酸。
  137. 如請求項136之組合物，其中一或多個經修飾之核苷酸包括鎖核酸（LNA）。
  138. 如請求項136之組合物，其中一或多個經修飾之核苷酸係選自磷酸二酯（PO）；硫代磷酸酯（PS）；2'O-甲基（2'OMe）；2'O-甲氧基乙基（MOE）；肽核酸（PNA）；磷醯胺酸(N-
    Figure 03_image001
    啉基)（PMO）；鎖核酸（LNA）；2'-去氧-2'-氟（2'-F）；或其組合。
  139. 如請求項95至138中任一項之組合物，其中該標記包括結合對之成員。
  140. 如請求項139之組合物，其中該標記包括生物素。
  141. 如請求項95至138中任一項之組合物，其中該標記包括電化學發光標記。
  142. 一種套組，其用於實施如請求項1至94中任一項之方法。
  143. 如請求項1至94中任一項之方法，其中該寡核苷酸雙螺旋體之該有義股及該反義股包括微生物之核酸序列。
  144. 如請求項143之方法，其中該微生物為人類微生物群落之組分。
  145. 如請求項143或144之方法，其中該微生物為細菌、真菌、原蟲或病毒。
  146. 如請求項145之方法，其中該微生物為細菌。
  147. 如請求項146之方法，其中該寡核苷酸雙螺旋體之該有義股及該反義股包括來自細菌之16S rRNA或rDNA。
  148. 如請求項147之方法，其中該細菌為無色桿菌屬（Achromobacter）、胺基酸球菌屬（Acidaminococcus）、不動桿菌屬（Acinetobacter）、放線菌目（Actinomycetales）、氣球菌屬（Aerococcus）、厭氧球菌屬（Anaerococcus）、凝集桿菌屬（Aggregatibacter）、氣單胞菌屬（Aeromonas）、產鹼桿菌屬（Alcaligenes）、厭氧螺菌屬（Anaerobiospirillum）、奇異菌屬（Atopobium）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、厚壁菌門（Bacillota）、擬桿菌屬（Bacteroides）、絲桿菌屬（Bacterionema）、巴爾通體菌（Bartonella）、雙岐桿菌屬（Bifidobacterium）、博德特氏桿菌屬（Bordetella）、螺旋體屬（Borrelia）、布氏桿菌屬（Brucella）、伯克霍爾德氏菌（Burkholderia）、黑草屬（Buchnera）、丁酸弧菌屬（Butyriviberio）、曲狀桿菌屬（Campylobacter）、嗜二氧化碳噬纖細菌屬（Capnocytophaga）、心桿菌屬（Cardiobacterium）、披衣菌屬（Chlamydia）、嗜衣原體屬（Chlamydophila）、柯林斯菌屬（Collinsella）、檸檬酸桿菌屬（Citrobacter）、梭菌屬（Clostridium）、棒狀桿菌屬（Corynebacterium）、痤瘡丙酸桿菌屬（Cutibacterium）、小桿菌屬（Dialister）、蠕形蟎屬（Demodex）、埃格特菌屬（Eggerthella）、艾肯菌屬（Eikenella）、腸球菌屬（Enterococcus）、腸桿菌屬（Enterobacter）、艾氏菌屬（Escherichia）、真桿菌屬（Eubacterium）、糞桿菌屬（Faecalibacterium）、芬戈爾德菌屬（Finegoldia）、壁門菌屬（Firmicutes）、黃桿菌屬（Flavobacterium）、弗朗西斯氏菌屬（Francisella）、梭桿菌屬（Fusobacterium）、加德納菌屬（Gardnerella）、戈登氏菌屬（Gordonia）、嗜血桿菌屬（Haemophilus）、螺旋桿菌屬（Helicobacter）、金氏菌屬（Kingella）、克雷伯氏菌屬（Klebsiella）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、退伍軍人桿菌屬（Legionella）、鉤端螺旋體屬（Leptospira）、纖毛菌屬（Leptotrichia）、李氏菌屬（Listeria）、巨型球菌屬（Megasphaera）、甲烷短桿菌屬（Methanobrevibacter）、微桿菌屬（Microbacterium）、微球菌屬（Micrococcus）、動彎桿菌屬（Mobiluncus）、摩根氏菌屬（Morganella）、莫拉菌屬（Moraxella）、分支桿菌屬（Mycobacterium）、微漿菌屬（Mycoplasma）、奈瑟氏菌屬（Neisseria）、消化球菌屬（Peptococcus）、嗜腖菌屬（Peptoniphilus）、消化鏈球菌屬（Peptostreptococcus）、鄰單胞菌屬（Plesiomonas）、卟啉單胞菌屬（Porphyromonas）、普氏菌屬（Prevotella）、丙酸桿菌屬（Propionibacterium）、變形桿菌屬（Proteus）、普羅威登斯菌屬（Providencia）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、假單胞菌門（Pseudomonadota）、立克次體菌（Rickettsia）、羅氏菌屬（Roseburia）、羅思氏菌屬（Rothia）、瘤胃球菌屬（Ruminococcus）、八疊球菌屬（Sarcina）、沙門氏菌屬（Salmonella）、月形單胞菌（Selenomonas）、志賀桿菌屬（Shigella）、小真桿菌屬（Slackia）、斯尼思菌屬（Sneathia）、螺旋體屬（Spirochaeta）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、鏈桿菌屬（Streptobacillus）、鏈球菌屬（Streptococcus）、鏈黴菌屬（Streptomyces）、坦納菌屬（Tannerella）、密螺旋體屬（Treponema）、毛癬菌屬（Trichophyton）、尿素微漿菌（Ureaplasma）、範永氏球菌（Veillonella）、弧菌屬（Vibrio）、沃廉菌屬（Wolinella）或耶爾森菌屬（Yersinia）細菌。
  149. 如請求項143至148中任一項之方法，其中該樣本包括生物樣本。
  150. 如請求項149之方法，其中該生物樣本包括自人體之一部分分離的樣本。
  151. 如請求項150之方法，其中該身體之該部分為鼻道、口腔、皮膚、耳、黏液膜、胃腸道、泌尿生殖道、呼吸道、眼睛或其組合。
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