TW202233842A - 腺相關病毒（ａａｖ）樣品中雜質之表徵及使ａａｖ穩定之調配物組成物 - Google Patents

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Abstract

提供用於表徵腺相關病毒（AAV）樣品或生物藥劑中之DNA雜質的方法，其包含使用粒徑篩析層析法及分光光度法。亦提供最大限度地減少AAV載體中經包裝DNA之外漏的方法及組成物，其包含使用賦形劑，諸如糖、胺基酸、界面活性劑或多元醇。

Description

腺相關病毒（AAV）樣品中雜質之表徵及使AAV穩定之調配物組成物
相關申請案之交叉引用
本申請案主張2020年11月2日申請之美國臨時專利申請案第63/108,480號之優先權及權益，該案以引用的方式併入本文中。
本發明大體上係關於使用粒徑篩析層析法及分光光度法表徵包括腺相關病毒（AAV）載體之樣品中之核酸雜質的方法。本申請案亦提供最大限度地減少經包裝DNA自AAV載體外漏的方法及組成物。
基因治療藉由將適量治療性基因遞送至目標組織中且無顯著毒性，同時例如藉由將遺傳物質整合至宿主基因體中實現長期基因表現來介導治療作用。基因治療可包含核酸、質體、病毒、載體或經基因工程改造之微生物。在包含逆轉錄病毒、慢病毒、腺病毒及AAV載體在內的所有當前可用之病毒載體中，AAV載體已被廣泛用於在基因治療中遞送遺傳物質。
基因治療產品之評估包含評估製造製程以確保產品安全性及品質以及在其製造、儲存及分配步驟期間評定產品。由於基因治療產品典型地以冷凍溶液形式儲存，故經由冷凍-解凍循環及攪動壓力證實基因治療產品之穩定性很重要。基於AAV載體之基因治療產品在冷凍-解凍循環期間可經歷降解，產生包含降解之病毒蛋白及DNA雜質之降解產物。載體內經包裝AAV基因體在冷凍-解凍循環或攪動期間會外漏。因此，應研究基因治療產品之各種調配策略以製備出增加產品穩定性且最大限度地減少產品降解之調配物。
將瞭解的是，存在用於表徵在各種儲存條件期間此類基因治療產品中之核酸雜質的方法之需要。此外，亦需要提供包括具有治療性基因之AAV載體的組成物或調配物，該等組成物或調配物最大限度地減少經包裝DNA自AAV載體之外漏。
本申請案提供用於表徵及鑑別包括AAV載體或基因治療產品之樣品中之核酸雜質的方法，其包含使用粒徑篩析層析法及分光光度法。本申請案亦提供最大限度地減少在儲存條件期間，諸如在製造、運輸、儲存及投與期間可能發生的冷凍-解凍循環及攪動壓力下經包裝DNA自AAV載體外漏的方法及組成物。
本揭示文提供一種鑑別含有AAV載體之樣品中之核酸雜質的方法。在一些例示性實施例中，本揭示文提供一種方法，其包括：使含有AAV載體之樣品與粒徑篩析層析（SEC）管柱接觸，使用溶液洗滌該SEC管柱以提供至少一種溶析液，及使用分光光度計鑑別該至少一種溶析液中之核酸雜質。在一方面中，該等核酸雜質係AAV之單股DNA（ssDNA）基因體。在另一方面中，該等核酸雜質係雙股DNA（dsDNA）。在另一方面中，本申請案之方法進一步包括使用分光光度計量測該至少一種溶析液在280 nm下之吸光度及使用分光光度計量測該至少一種溶析液在260/280 nm下之吸光度比。在一方面中，本申請案之方法進一步包括基於核酸標準曲線定量核酸雜質。在一方面中，本申請案之方法進一步包括用特異性結合至ssDNA之螢光染料處理該等核酸雜質。在另一方面中，本申請案之方法進一步包括在使該樣品與該SEC管柱接觸之前，使該樣品與DNA核酸酶接觸。在另一方面中，該SEC系統係粒徑篩析超高效液相層析（SE-UPLC）系統。在另一方面中，本申請案之方法進一步包括對該至少一種溶析液進行下一代定序（next-generation sequencing，NGS）。
本揭示文至少部分地提供一種保護AAV載體以免經包裝核酸外漏之組成物。在一些例示性實施例中，本揭示文提供一種組成物，其包括至少一種AAV載體及至少一種賦形劑；其中該至少一種賦形劑係糖、胺基酸、界面活性劑或多元醇；其中該至少一種AAV載體包括經包裝核酸；且其中該組成物中之該至少一種AAV載體經保護以免該等經包裝核酸外漏。
在一方面中，本申請案之組成物中的AAV載體暴露於至少一個冷凍-解凍循環。在一方面中，該等經包裝核酸係AAV之ssDNA基因體，其中該等經包裝核酸存在於AAV衣殼內。在一方面中，本申請案之組成物中的賦形劑呈約0.001%至約10%之濃度，其中該組成物進一步包括磷酸鹽緩衝鹽水及非離子型界面活性劑。在另一方面中，本申請案之組成物中的糖係蔗糖、海藻糖、甘露糖醇、棉子糖、乳糖、葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、麥芽四糖、麥芽五糖或麥芽七糖。在一方面中，本申請案之組成物中的胺基酸係脯胺酸。在一方面中，本申請案之組成物中的界面活性劑係泊洛沙姆（poloxamer）188（Pluronic® F68）。在一方面中，本申請案之組成物中的界面活性劑係非離子型界面活性劑，其中該界面活性劑係呈約0.001%至約0.2%之濃度。在另一方面中，該組成物包含蔗糖及泊洛沙姆188。在一個特定方面中，該組成物包含呈2.5%至10%之濃度的蔗糖及呈0.001%至0.2%之濃度的泊洛沙姆188。
本揭示文至少部分地提供一種用於保護AAV載體以免經包裝核酸外漏之方法。在一些例示性實施例中，該方法包括：獲得包含至少一種AAV載體之樣品，及將穩定性組成物添加至該樣品中以形成保護性調配物，其中該保護性調配物保護該至少一種AAV載體以免經包裝核酸外漏，該穩定性組成物包括至少一種賦形劑，且該賦形劑係糖、胺基酸、界面活性劑或多元醇。在一方面中，該AAV載體暴露於至少一個冷凍-解凍循環。在一方面中，該等經包裝核酸係AAV之ssDNA基因體，其中該等經包裝核酸存在於AAV衣殼內。
在另一方面中，該賦形劑在該保護性調配物中呈約0.001%至約10%之濃度，其中該穩定性組成物進一步包括磷酸鹽緩衝鹽水及非離子型界面活性劑。在一方面中，該糖係蔗糖、海藻糖、甘露糖醇、棉子糖、乳糖、葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、麥芽四糖、麥芽五糖或麥芽七糖。在又另一方面中，胺基酸係脯胺酸。在一方面中，界面活性劑係泊洛沙姆188（Pluronic® F68）。在一方面中，本申請案之組成物中的界面活性劑係非離子型界面活性劑，其中該界面活性劑在該保護性調配物中呈約0.001%至約0.2%之濃度。在另一方面中，該穩定性組成物包含蔗糖及泊洛沙姆188。在一個特定方面中，該穩定性組成物包含在該保護性調配物中最終濃度為2.5%至10%之蔗糖且該穩定性組成物包含在該保護性調配物中最終濃度為0.001%至0.2%之泊洛沙姆188。
當結合以下描述及附圖考慮時，將更好地瞭解及理解本發明之此等及其他方面。以下描述儘管指示各種實施例及其多個具體細節，但僅作為例證給出，而不作為限制。可在本發明之範圍內作出許多取代、修改、添加或重排。
基因治療為改變、修復或替代受損或突變之基因以改善患者之健康狀況開啟了廣闊前景。腺相關病毒（AAV）載體係基因遞送之理想工具，且其已成為用於人類基因治療之極佳載體。AAV可經工程改造成執行特定功能以在基因治療應用中遞送核酸。AAV之主要優點包含低免疫原性及致病性，以及總體高安全性及穩定性（Naso等人, BioDrugs 31(4) (2017) 317-334；During, Adv Drug Deliv Rev 27(1) (1997) 83-94）。AAV可感染眾多細胞，不管該等細胞是否在活躍細胞分裂，同時引起輕度免疫反應，由此延長轉殖基因表現之持續時間（During; Carter, Curr Opin Biotech 3(5) (1992) 533-539；Daya及Berns, Clin Microbiol Rev 21(4) (2008) 583-593）。此外，AAV與任何已知疾病均無關聯（Naso等人; During; Carter; Daya及Berns; Xiao等人, Adv Drug Deliv Rev 12(3) (1993) 201-215；Muzyczka, Viral Expression Vectors, Springer1992, 第97-129頁）。AAV作為基因遞送媒劑之另一個優點係隨機基因體整合風險較低，而隨機基因體整合可能破壞基因功能並潛在地觸發插入性突變誘發（Goswami等人, Front Oncol 9 (2019) 297；Nguyen等人, Blood 134(增刊1) (2019) 611-611；Lundstrom, Diseases 6(2) (2018) 42）。
AAV係無包膜病毒且為微小病毒（ Parvoviridae）科依賴病毒屬（ Dependovirusgenus）之無致病性成員，其需要輔助物，諸如腺病毒或疱疹病毒來實現感染（Venkatakrishnan等人, Structure and Dynamics of Adeno-Associated Virus Serotype 1 VP1- Unique N-Terminal Domain and Its Role in Capsid Trafficking, Journal of Virology, 2013年5月, 第87卷, 第9期, 第4974-4984頁）。AAV將約4.8千鹼基（kb）大小之ssDNA基因體包封於二十面體衣殼中，該衣殼係由稱為衣殼病毒蛋白之蛋白質外殼構成。圖1顯示AAV1之結構，包含AAV1衣殼VP3單體之晶體結構及AAV1衣殼之表面表示（Venkatakrishnan等人）。除形成外部衣殼外殼外，衣殼病毒蛋白積極地參與細胞結合及內化。
AAV係由三種衣殼蛋白構成，即VP1、VP2及VP3，且在衣殼中包覆有單股DNA（ssDNA）（Agbandje-McKenna及Kleinschmidt, Adeno-Associated Virus, Springer2012, 第47-92頁；Drouin及Agbandje-McKenna, Future virology 8(12) (2013) 1183-1199）。在結合至細胞受體之後，接著，AAV被內吞且自胞內體釋放，隨後運輸至宿主細胞核並脫殼而自其衣殼釋放出ssDNA。邏輯上，轉導效率至少部分取決於經包覆之ssDNA基因體的量及在到達釋放位點之前AAV之完整性（Nonnenmacher及Weber, Gene Ther 19(6) (2012) 649-658；Hauck等人, J Virol 78(24) (2004) 13678-13686；Thomas等人, J Virol 78(6) (2004) 3110-3122）。
為了監測作為基因遞送載體之重組AAV的品質及效率，監測AAV生物藥劑之純度、衣殼身分（identity）、載體粒子力價及空/全比很重要。展示AAV生物藥劑在各種儲存（諸如穩定溫度儲存及冷凍-解凍循環）、稀釋劑（諸如血清及具有不同pH值之溶質）及投與條件下之穩定性亦很重要。基因治療產品，如AAV生物藥劑典型地係以冷凍溶液形式儲存。因此，在製造、產品劑量製備及投與期間，冷凍-解凍循環係不可避免的。在極少數情況下，在運輸期間溫度偏離額定值或在儲存期間冷凍機故障均會使生物製品暴露於額外的冷凍-解凍循環。AAV生物藥劑在儲存條件下冷凍-解凍循環期間可因穩定性降低而經歷降解。
在學術研究實驗室中，在作出諸多嘗試來設計並開發作為基因遞送載體之AAV之後，研究人員一般將該等載體儲存於常用緩衝液，諸如磷酸鹽緩衝鹽水（PBS）中，添加相對較高濃度之甘油作為低溫保護劑，並在-80℃下儲存AAV材料。儘管此在某種程度上已成為標準方案，但此等條件可能會對AAV功能不利（Boyd, Gene Therapy Technologies, Applications and Regulations (1999) 383；Croyle等人, Gene Ther 8(17) (2001) 1281-1290）。在一些情況下，亦可能需要在投與之前進行充分稀釋以降低低溫保護劑之毒性（Lee等人, Journal of Assisted Reproduction and Genetics 23(2) (2006) 87-91；Armitage等人, Cryobiology 50(1) (2005) 17-20）。研究顯示，在多個冷凍-解凍循環之後，AAV之力價及轉導效率降低；然而，此現象出現之原因及在冷凍-解凍循環之後AAV降解之機制尚未得到充分瞭解（Croyle等人；Rodrigues等人, Pharm Res, 2019, 36 (2):29；Howard及Harvey, Human Gene Therapy Methods 28(1) (2017) 39-48）。
本揭示文描述一種表徵AAV樣品中之雜質的方法。使用本發明之方法，對經歷冷凍-解凍循環之AAV8樣品進行表徵並發現，增加冷凍-解凍循環之次數會導致產物相關雜質之增加，該雜質可藉由粒徑篩析超高效液相層析法（SE-UPLC）偵測。對此等AAV8樣品之進一步表徵顯示，該雜質主要由自AAV衣殼外漏之基因體DNA組成。在其他AAV血清型中亦觀察到類似現象。
當AAV之衣殼在冷凍-解凍循環期間受損時，衣殼內之經包裝ssDNA AAV基因體可外漏，如圖2中所示。在AAV生物藥劑中觀察到游離ssDNA之存在表明，在儲存期間，AAV生物藥劑之穩定性降低。可將多種賦形劑添加至基因遞送產物中以增加產物穩定性並最大限度地減少產物降解。該賦形劑可包含緩衝劑、凍乾保護劑、張力劑及界面活性劑（Rodrigues等人）。額外調配物將於下文詳細描述。
需要表徵在各種儲存條件期間AAV樣品或生物藥劑中之DNA雜質的方法。此外，亦應提供AAV生物藥劑之穩定性組成物或調配物以最大限度地減少在儲存條件期間經包裝DNA自AAV載體之外漏。
本申請案提供用於鑑別AAV樣品或生物藥劑中之DNA雜質，諸如AAV之ssDNA基因體的方法，其包含使用SEC 將DNA雜質與AAV載體分離。隨後，使用分光光度計監測SEC流份。本申請案亦提供最大限度地減少AAV載體中經包裝DNA之外漏的方法及組成物，其包含在磷酸鹽緩衝液、鹽及非離子型界面活性劑存在下使用賦形劑。
需要開發用於確定並監測AAV生物藥劑中之雜質的迅速、可靠、靈敏且高通量之方法。經純化之AAV生物藥劑中並非所需產物、並非產物相關物質或並非預期調配物賦形劑之任何組分均可被視為雜質。載體產物相關雜質之實例包含空AAV衣殼粒子及用衣殼包裹非預期核酸片段之AAV粒子。額外DNA雜質可包含在純化期間、在純化之後或在儲存期間自AAV衣殼外漏的AAV基因體之ssDNA。雜質可包含輔助病毒依賴性複製勝任型AAV粒子，其可在載體產生系統之生物合成環境中由重組事件無意地產生。
另外，AAV生物藥劑中之雜質亦可包含來源於細胞培養物的用於產生AAV之殘餘含量之蛋白質及核酸。含量豐富之殘餘蛋白質雜質可包含宿主細胞蛋白質及牛血清白蛋白。含量豐富之殘餘核酸可包含宿主細胞DNA/RNA及來自輔助組分，諸如質體或病毒之DNA。殘餘宿主細胞DNA可呈兩種形式存在，包含核酸酶敏感性程序相關雜質及核酸酶抗性產物相關雜質。核酸酶敏感性程序相關雜質包含與所需AAV載體產物非特異性共純化之核酸。核酸酶抗性產物相關雜質包含用衣殼包裹在AAV粒子內的核酸。最大限度地減少此等不同形式之殘餘宿主細胞DNA需要不同的製造製程最佳化策略。（J. F. Wright, Product-related impurities in clinical-grade recombinant AAV vectors: characterization and risk assessment, Biomedicines, 2014, 2, 80-97）AAV生物藥劑中DNA雜質之移除相當複雜，即使在AAV載體純化期間使用核酸酶處理來移除可接近之核酸亦如此。非所需之DNA片段可經包裝，使其因載體粒子之完整性而對核酸酶處理具有抗性。
由於AAV衣殼將ssDNA基因體包封在由例如衣殼病毒蛋白之類蛋白質外殼構成之二十面體衣殼中，故衣殼應當很穩定以保護AAV基因體，直至適合宿主細胞出現，起始細胞進入以釋放AAV基因體進行複製。AAV之病毒衣殼蛋白之組裝可對病毒感染性及載體效力具有顯著影響（Jin等人, Direct liquid chromatography/mass spectrometry analysis for complete characterization of recombinant adeno-associated virus capsid proteins, Human gene therapy methods, 2017, 第28卷, 第5期, 第255-267頁）。AAV之衣殼病毒蛋白可在起始輸入基因體之第二股合成及轉錄中起到作用（Salganik等人, Adeno-associated virus capsid proteins may play a role in transcription and second-strand synthesis of recombinant genomes, Journal of Virology, 2014年1月, 第88卷, 第2期, 第1071-1079頁）。衣殼蛋白之降解可對AAV之感染性不利，由此可引起AAV ssDNA基因體之外漏。AAV ssDNA基因體亦可在不破壞衣殼之情況下噴出（Bernaud, Julien等人, Characterization of AAV vector particle stability at the single-capsid level. Journal of biological physics, 2018, 第44卷, 第2期, 第181-194頁）。
AAV ssDNA基因體含有三個基因，包含 rep（複製）、 cap（衣殼）及 aap（組裝）。 rep基因與病毒基因體複製及包裝有關。 cap基因編碼衣殼病毒蛋白。表現 cap基因產生包含VP1、VP2及VP3之衣殼病毒蛋白，該等病毒蛋白係由交替剪接的具有共同C末端之mRNA產生。VP3係約61 kDa且佔衣殼蛋白含量之約85%。VP2係約73 kDa。VP1係約87 kDa。VP1及VP2含有N末端延伸（VP1u），其包含磷脂酶A2域及核定位信號（Rayaprolu等人, Comparative analysis of adeno-associated virus capsid stability and dynamics, Journal of Virology, 2013年12月, 第87卷, 第24期, 第13150-13160頁）。AAV之衣殼由包含VP1、VP2及VP3之60個病毒蛋白單體組成。VP3係主要衣殼蛋白。AAV衣殼中有約50個VP3複本。AAV衣殼中有約5個VP1複本及5個VP2複本（Venkatakrishnan等人）。
本申請案提供用於表徵、鑑別及/或定量AAV樣品或生物藥劑中之DNA雜質之方法，其包含使用SEC將DNA雜質與AAV載體分離。隨後，使用分光光度計監測SEC流份。本申請案亦提供最大限度地減少AAV載體中經包裝DNA之外漏的方法及組成物，其包含在PBS及非離子型界面活性劑存在下使用賦形劑。在一些例示性實施例中，本申請案提供一種鑑別含有AAV載體之樣品中之DNA雜質的方法，該方法包括：使該樣品與SEC管柱接觸，使用溶液洗滌該SEC管柱以提供溶析液及使用分光光度計鑑別該等溶析液中之核酸雜質。將含有AAV載體之樣品裝載至SEC管柱上。使用分光光度計監測通過SEC管柱之流份以量測SEC流份在280 nm下之吸光度。在SEC溶析曲線中之SEC流份中可觀察到一個對應於AAV載體的主峰。如使用分光光度計偵測，該主峰在280 nm下具有相當高的吸光度。在SEC溶析曲線中之SEC流份中觀察到一個對應於DNA雜質之小峰。如使用分光光度計偵測，該小峰在280 nm下具有吸光度。
在一方面中，含有AAV載體之樣品中的DNA雜質係AAV之ssDNA基因體。在一方面中，使用分光光度計分析SEC流份以量測在UV 260/280 nm下之吸光度比，以便評定核酸純度。在一方面中，本申請案之方法包括使用分光光度計量測該溶析液在280 nm下之吸光度及量測該溶析液在260/280 nm下之吸光度比。在一方面中，本申請案之方法進一步包括基於核酸標準曲線定量DNA雜質，以及用螢光染料處理DNA雜質。
在一些例示性實施例中，本申請案提供在儲存條件期間，諸如在冷凍-解凍循環及攪動下保護AAV載體以免經包裝核酸外漏的方法及穩定性組成物。在一些方面中，包括AAV載體及賦形劑之穩定性組成物包含糖、胺基酸、界面活性劑或多元醇。在一些方面中，用於保護AAV載體以免經包裝核酸外漏之方法包含將該AAV載體與該穩定性組成物混合。
在一方面中，本申請案之穩定性組成物中的賦形劑係呈約0.001%至約10%之濃度，其中該穩定性組成物進一步包括磷酸鹽緩衝鹽水及非離子型界面活性劑。在一方面中，本申請案之穩定性組成物中的糖係蔗糖、海藻糖、甘露糖醇、棉子糖、乳糖、葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、麥芽四糖、麥芽五糖或麥芽七糖。在另一方面中，本申請案之穩定性組成物中的胺基酸係脯胺酸。在又另一方面中，本申請案之穩定性組成物中的界面活性劑係Pluronic® F68。在一方面中，本申請案之穩定性組成物中的界面活性劑係非離子型界面活性劑，其中該界面活性劑呈約0.001%至約0.2%之濃度。
評估基因遞送產物以確保產物安全性及品質的需求使得對在各種儲存條件期間表徵AAV樣品或生物藥劑中之DNA雜質的需求日益增加。此外，亦需要提供最大限度地減少AAV載體中經包裝DNA之外漏的AAV生物藥劑之組成物或調配物。本文所揭示之例示性實施例藉由提供滿足長久以來之要求的方法及組成物來滿足前述需求。
術語「一個（種）」應理解為意思指「至少一個（種）」；且一般熟習此項技術者應理解，術語「約」及「近似地」應理解為容許標準差；且在提供範圍時，包含終點在內。如本文所使用，術語「包含（include/includes/including）」意圖為非限制性的且應理解為分別意謂「包括（comprise/comprises/comprising）」。
在一些例示性實施例中，本申請案提供一種鑑別含有AAV載體之樣品中之核酸雜質的方法，該方法包括：使該含有AAV載體之樣品與粒徑篩析層析（SEC）管柱接觸，使用溶液洗滌該SEC管柱以提供至少一種溶析液，及使用分光光度計鑑別該至少一種溶析液中之核酸雜質。
如本文所使用，術語「載體」係指在活體外或活體內載運核酸以遞送至宿主細胞中的重組質體或病毒。
對於遞送遺傳物質而言，來源於AAV之載體特別有吸引力，因為(i)其能夠感染（轉導）多種不分裂及分裂細胞類型，包含肌纖維及神經元；(ii)其不含病毒結構性基因，由此消除天然宿主細胞對病毒感染之反應，例如干擾素介導之反應；(iii)野生型病毒從未與人類之任何病變相關聯；(iv)與能夠整合至宿主細胞基因體中之野生型AAV相比，複製缺陷型AAV載體一般保持游離基因體形式，由此限制插入性突變誘發或致癌基因活化之風險；及(v)與其他載體系統相比，AAV載體不會觸發顯著免疫反應（參見ii），由此實現治療性轉殖基因之長期表現（條件為其基因產物不被排斥）。
如本文所使用，術語「雜質」係指經純化之AAV樣品中並非所需產物、並非產物相關物質或並非預期調配物賦形劑之任何組分。DNA雜質可包含在純化期間、在純化之後或在儲存期間自AAV衣殼外漏的AAV基因體之ssDNA。雜質可包含輔助病毒依賴性複製勝任型AAV粒子，其可在載體產生系統之生物合成環境中由重組事件無意地產生。在AAV純化之後殘留之雜質可包含來源於細胞培養物中用於產生AAV之組分的殘餘含量之蛋白質及核酸。殘餘蛋白質雜質可包含宿主細胞蛋白質及牛血清白蛋白。殘餘核酸可包含宿主細胞DNA/RNA及來自輔助組分，諸如質體或病毒之DNA。存在的殘餘宿主細胞DNA可呈兩種形式：(1)核酸酶敏感性程序相關雜質，例如與所需AAV載體產物非特異性共純化之雜質；及(2)核酸酶抗性產物相關雜質，例如用衣殼包裹在AAV粒子內之雜質（J. F. Wright）。
如本文所使用，「核酸」係指DNA或RNA分子。在一些例示性實施例中，術語核酸捕捉包含已知之DNA及RNA鹼基類似物中之任一個的序列，該等鹼基類似物諸如但不限於4-乙醯胞嘧啶、8-羥基-N6-甲基腺苷、氮丙啶基胞嘧啶、假異胞嘧啶、5-(羧基羥甲基)尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羧甲基胺基甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧甲基-胺基甲基尿嘧啶、二氫尿嘧啶、肌苷、N6-異戊烯基腺嘌呤、1-甲基腺嘌呤、1-甲基假尿嘧啶、1-甲基鳥嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基-鳥嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鳥嘌呤、3-甲基-胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-甲基腺嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、5-甲基胺基甲基尿嘧啶、5-甲氧基-胺基-甲基-2-硫代尿嘧啶、β-D-甘露糖苷基Q核苷（queosine）、5'-甲氧基羰基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-異戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧基乙酸、氧丁氧苷、假尿嘧啶、Q核苷、2-硫代胞嘧啶、5-甲基-2-硫代尿嘧啶、2-硫代尿嘧啶、4-硫代尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、-尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧基乙酸、假尿嘧啶、Q核苷、2-硫代胞嘧啶及2,6-二胺基嘌呤。
如本文所使用，術語「粒徑篩析層析法」或「SEC」係指可基於大小（諸如分子量），藉由經基質過濾來分離溶液中之分子的一種層析方法，例如分子篩層析法。該基質，諸如凝膠，由含具有特定大小分佈之孔的球形珠粒組成。當不同大小之分子被納入該等珠粒內之孔內或自該等孔排除時，各分子可依據其大小分開。大小較小之分子可擴散至孔中，由此增加較小分子通過SEC管柱所需之時段。然而，大小較大之分子不進入該等孔。當大分子不進入該等孔中時，其在SEC管柱之空隙體積中溶析。一般而言，相較於較小分子通過SEC管柱之時段，大分子通過SEC管柱之時段較短。因此，由於大小不同之分子通過SEC管柱之時段不同，故分子可根據大小經由SEC管柱分開。SEC可用於分離大分子或巨分子複合物，諸如蛋白質複合物。通常，SEC中使用的緩衝液係調配用於保持生物分子在溶液中之天然結構及構形，由此允許在不干擾天然結構及構形情況下，分離生物分子。
如本文所使用，術語「分光光度計」包含可根據波長定量地量測吸收光之強度的儀器，諸如吸收分光光度計。分光光度計含有用以產生含所需波長之光束的單色器或稜鏡，以及量測該光束在進入及離開比色管或流槽時強度之比率的構件。在紫外光-可見光分光光度計中，使來自適合紫外光及/或可見光源之光束通過稜鏡或繞射柵單色器。接著，光在達到偵測器之前，通過待分析樣品。分光光度計亦可為SEC-HPLC/UPLC系統之一部分且為偵測器。 例示性實施例
本文所揭示之實施例提供用於表徵及鑑別AAV樣品或生物藥劑中之DNA雜質的方法。本文所揭示之實施例亦提供最大限度地減少經包裝DNA自AAV載體外漏的方法及組成物。
在一些例示性實施例中，本申請案提供一種鑑別含有AAV載體之樣品中之核酸雜質的方法，該方法包括：使該含有AAV載體之樣品與SEC管柱接觸，使用溶液洗滌該SEC管柱以提供至少一種溶析液，及使用分光光度計鑑別該至少一種溶析液中之核酸雜質。在一方面中，該等核酸雜質係AAV之單股DNA基因體。
在一些例示性實施例中，本申請案提供一種保護AAV載體以免經包裝核酸外漏之組成物，其中該組成物包括至少一種賦形劑，該賦形劑包含糖、胺基酸、界面活性劑或多元醇。在一方面中，本申請案之組成物中賦形劑之濃度係約0.001%至約10%、約0.001%至約8%、約0.001%至約6%、約0.05%至約5%、約0.1%至約10%、約0.1%至約8%、約0.1%至約6%、約0.1%至約5%、約5%、約4%、約3%、約2.5%、約2%、約1.5%、約1%、約0.1%、約0.05%或約0.001%。
在一方面中，該組成物進一步包括磷酸鹽緩衝鹽水及非離子型界面活性劑。在另一方面中，本申請案之組成物中的糖係蔗糖、海藻糖、甘露糖醇、棉子糖、乳糖、葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、麥芽四糖、麥芽五糖或麥芽七糖。在另一方面中，本申請案之組成物中的胺基酸係脯胺酸。在又另一方面中，本申請案之組成物中的界面活性劑係Pluronic® F68。在一方面中，本申請案之組成物中的界面活性劑係非離子型界面活性劑，其中該界面活性劑呈約0.001%至約0.2%、約0.1%、約0.05%或約0.001%之濃度。
應理解，該系統不限於前述腺相關病毒、粒徑篩析層析法、分光光度計、ssDNA、AAV載體及賦形劑中的任一種。
本文用編號及/或字母提供的方法步驟之連續標記不打算將該方法或其任何實施例侷限於所指示之特定次序。本說明書通篇引用多項公開案，包含專利、專利申請案、公開之專利申請案、寄存編號、技術論文及學術論文。此等引用之參考文獻各自以全文引用的方式併入本文中且用於所有目的。除非另外描述，否則本文所使用之所有技術及科學術語均具有與本發明所屬領域之一般熟習此項技術者通常所理解相同之含義。參照以下實例將更充分地理解本揭示文，提供該等實例以更詳細地描述本揭示文。其意圖說明本發明之範圍且不應解釋為限制本發明之範圍。 實例
分光光度計：分光光度計被用於偵測及監測自粒徑篩析層析管柱獲得的流份中之蛋白質及核酸。蛋白質偵測係使用在280 nm下之吸光度執行。DNA或RNA偵測係使用在260 nm下之吸光度執行。溶液中之蛋白質吸收紫外光且在280 nm及200 nm下具有吸光度最大值。具有芳族環之胺基酸在280 nm下具有吸光度峰值。核酸可藉由使用分光光度計量測在260 nm下鹼基所吸收之紫外輻射之量來定量。DNA核苷酸含有糖主鏈、鹼基及磷酸酯基。鹼基富含氮，其吸收260 nm之光。對於1 cm之光程長度，以下溶液在260 nm下之光學密度（OD 260，即在260 nm下之吸光度）等於1.0：50 μg/mL之雙股DNA溶液、33 μg/mL之單股DNA溶液、20-30 μg/mL之寡核苷酸溶液或40 μg/mL之RNA溶液。
DNA樣品可含有能影響在260 nm下之吸光度的雜質。對在260/280 nm下之吸光度比進行分析以評定核酸純度。純DNA在260/280 nm下之吸光度比為約1.8-2.0。純RNA在260/280 nm下之吸光度比為約2.0。高品質DNA或RNA樣品在260/280 nm下之吸光度比應高於約1.7。當觀察到DNA或RNA溶液在260/280 nm下之吸光度比較低時，此指示存在由蛋白質或酚引起之污染的可能性。在280 nm下的吸光度最大值指示有蛋白質污染之可能性。在230 nm下的吸光度最大值指示有酚鹽或硫代氰酸酯污染之可能性。在340 nm下的吸光度最大值指示由微粒引起之光散射。
樣品製備 。對於冷凍-解凍研究，將在1 mL玻璃小瓶中之100 µL AAV溶液在-80℃下冷凍至少一小時，且隨後在室溫下解凍至少30分鐘，由此完成一個循環。
為表徵benzonase對SE-UPLC峰1之影響，將Benzonase®（Millipore Sigma, Burlington, MA）以1:50之體積比添加至AAV8.GFP溶液中並充分地混合，隨後進行SE-UPLC分析。
對於調配物篩選研究，將不同AAV血清型調至3.7×10 12vg/mL之基因體力價。接著，將2倍濃縮之調配物緩衝液與不同AAV血清型樣品混合以獲得目標調配物，並使此等樣品經歷冷凍-解凍循環。在t=0時及在1、2、4或10個冷凍-解凍循環之後執行分析。
SE-UPLC。AAV8.GFP樣品係使用在Waters ACQUITY UPLC系統中操作的具有500埃孔徑之Sepax SEC 5 µm、4.6×300 nm管柱分析。藉由注射1 µL、5 µL、10 µL、15 µL及20 µL之1.83×10 12vg/mL標準品來構建校準曲線。隨後，注射10 µL AAV8樣品並用2×DPBS作為流動相，以0.5 mL/min之流動速率溶析。藉由光電二極體陣列偵測器監測溶析，並記錄在210 nm至400 nm範圍內之譜圖以供進一步分析。
為了對SE-UPLC溶析曲線中之不同物種進行部分分離，將Waters Fraction Manager-Analytical連接至ACQUITY UPLC系統並使用其收集在相應滯留時間溶析之流份。執行多次重複注射，並將由多次注射得到之流份彙集在一起，隨後用Amicon Ultra-0.5離心過濾單元濃縮5倍（體積減小）。對收集之流份進行下一代定序（NGS）以確定身分。
下一代定序。使用略微修改的Lecomte等人所描述之方案（Lecomte等人, Molecular Therapy-Nucleic Acids 4 (2015) e260）來執行樣品製備。為了鑑別雜質峰（SE-UPLC曲線中在主溶析峰之前的峰1），在不進行任何脫氧核糖核酸酶處理情況下執行DNA分離。遵循製造商之說明書，使用Nextera XT DNA文庫製備套組來製備Illumina文庫。在NextSeq550中，使用150個循環之中等輸出套組對最終池定序。使用內部資料分析流程分析定序讀段。
基於螢光之游離 DNA 分析。Quant-iT™ OliGreen® ssDNA分析套組（Invitrogen™）係購自Thermo Fisher Scientific。在使用之前，使200×儲備Quant-iT OliGreen ssDNA試劑及100 µg/mL寡核苷酸標準品升溫至室溫。用Milli-Q水將20×儲備TE緩衝液稀釋20倍達到工作濃度（10 mM Tris-HCl、1 mM EDTA，pH 7.5）。接著，根據使用者指南，使用TE緩衝液將該試劑及該寡核苷酸標準品稀釋至工作濃度。使用該使用者指南中的比率，將AAV及寡核苷酸標準品樣品與該試劑混合，並使用由含有不同濃度（0 ng/mL、10 ng/mL、100 ng/mL、500 ng/mL及1000 ng/mL）寡核苷酸標準品之五份樣品生成的標準線性曲線內推AAV樣品中ssDNA。將該等樣品置放於384孔盤中並使用Synergy™ Neo2多模式讀取器（BioTek）進行分析。激發波長及發射波長分別設定為480 nm及520 nm。 實例1. AAV樣品中DNA雜質之表徵
在HEK-293細胞中產生AAV血清型8（AAV8）且據報導，其在含0.001% Pluronic® F68之PBS中含有至少5×10 12個基因體複本/毫升。使用含有效負載GFP（綠色螢光蛋白）之AAV8，例如AAV8-GFP分析DNA雜質。使用SEC管柱分析不同量之AAV8-GFP樣品，諸如1 µL、5 µL、10 µL、15 µL或20 µL樣品。將AAV8-GFP樣品裝載至粒徑篩析層析（SEC）管柱上。使用分光光度計監測通過SEC管柱之流份以量測SEC流份在280 nm下之吸光度，如圖3中所示。在圖3中，Y軸表示在280 nm下之吸光度，以吸光度單位（AU）表示，且X軸表示通過管柱之流份的滯留時間。如圖3中所示，在SEC溶析曲線中之SEC流份中，在介於12分鐘與15分鐘之間之滯留時間時觀察到一個對應於AAV8-GFP病毒粒子的主峰，如使用分光光度計偵測，該主峰在280 nm下具有相當大的吸光度。在SEC溶析曲線中，在介於8分鐘與11分鐘之間之滯留時間時觀察到一個在280 nm下具有吸光度之小峰，例如圖3中之峰1。
亦監測在280 nm激發及350 nm發射下SEC流份之螢光強度，如圖4中所示。在圖4中，Y軸表示正規化之螢光強度且X軸表示通過SEC管柱之流份的滯留時間。對應於圖3中之主峰的流份呈現為在相同滯留時間，即在介於12分鐘與15分鐘之間之滯留時間時具有相當高螢光強度之類似峰，如圖4中所示。對應於圖3中之峰1的流份在相應滯留時間，即在介於8分鐘與11分鐘之間之滯留時間時未顯示可偵測之螢光強度（在280 nm激發及350 nm發射下），如圖4中所示。
另外，使用分光光度計分析SEC流份之峰1及主峰以量測在UV 260/280 nm下之吸光度比，以便評定核酸純度。如表1中所示，SEC流份之峰1顯示UV 260/280 nm之讀數為1.7，指示DNA具有較佳純度且無蛋白質污染。SEC流份之主峰顯示UV 260/280 nm之讀數為1.3，指示存在蛋白質。整體DS（含有AAV生物藥劑之原料藥）的UV-vis顯示UV 260/280 nm之讀數為1.3，對應於純化之AAV載體。當用核酸酶處理AAV8-GFP樣品時，峰1之強度明顯減小。結果指示，對應於峰1之SEC流份含有DNA。結果進一步指示，SEC流份之峰1可含有AAV基因體之ssDNA。 表1. SEC流份在260/280 nm下之吸光度比
樣品 UV 260/280 nm
SEC峰1 1.7
SEC主峰 1.3
整體DS之UV-vis 1.3
由於結果指示，峰1含有高純度DNA且無蛋白質污染，故使用SEC與量測吸光度之組合可有效地定量AAV樣品中之ssDNA雜質。可將AAV樣品裝載至SEC管柱上以將DNA雜質與AAV載體分離。可監測SEC流份在280 nm下之吸光度以鑑別SEC溶析曲線中之DNA雜質及AAV載體。隨後，可藉由量測在260 nm下之吸光度來定量含有DNA雜質之SEC流份。可藉由量測在260/280 nm下之吸光度比來評定DNA之純度。經純化之AAV樣品中的DNA雜質可包含在諸如冷凍-解凍循環及攪動之類非標準儲存條件期間自AAV衣殼外漏之ssDNA。 實例2.在冷凍-解凍循環處理之後ssDNA外漏之表徵
當前，AAV基因治療藥品係以冷凍液體形式儲存以保持產品之品質及穩定性；因此，AAV粒子在製造、運送、儲存及投與期間經歷多個冷凍-解凍循環。因此，在表徵及穩定性研究中選擇多個冷凍-解凍循環作為一個壓力條件以理解AAV8調配物之穩定性並確定潛在的降解路徑。
使用含GFP有效負載之AAV8作為原材料以表徵在冷凍-解凍循環處理之後ssDNA的外漏情況。使用在pH 7.4含0.001% pluronic F68之PBS中含有8.34×10 12vg/mL AAV8-GFP之原材料進行此分析。使用該原材料製備含有不同AAV力價之樣品。使用Amicon離心機過濾器濃縮原材料以達到所需目標濃度（較高濃度），諸如在2×（濃縮2倍）、4×及10×下之力價。藉由將含有AAV載體之樣品在-80℃下冷凍一小時或更長時間，隨後在室溫下解凍0.5小時或更長時間，來進行冷凍-解凍循環。除非另有描述，否則進行八個冷凍-解凍循環用於樣品處理。
將用八個冷凍-解凍循環處理之AAV8-GFP樣品裝載至包含原材料（圖5中之AAV8.GFP）以及諸如在2×、4×及10×下之力價的不同力價之樣品的SEC管柱上，如圖5中之SEC層析圖中所示。使用分光光度計監測通過SEC管柱之流份以量測SEC流份在280 nm下之吸光度。在圖5中，Y軸表示正規化的在280 nm（UV）下之吸光度且X軸表示通過SEC管柱之流份的滯留時間。如圖5中所示，在SEC溶析曲線中之SEC流份中，在介於12分鐘與15分鐘之間的滯留時間時觀察到對應於AAV8-GFP病毒粒子之一個主峰。如使用分光光度計偵測，該主峰在280 nm下具有相當高的吸光度。在SEC溶析曲線中，在介於8分鐘與11分鐘之間之滯留時間時觀察到在280 nm下具有吸光度之一個小峰，在圖5中標為峰1。
在八個冷凍-解凍循環處理後，AAV8-GFP樣品之SEC溶析曲線中峰1之大小明顯增加。峰1大小之增加取決於AAV8-GFP之濃度，例如AAV之力價。表2顯示在八個冷凍-解凍循環處理前後SEC溶析曲線中峰1之大小變化。結果顯示，在冷凍-解凍處理之後，峰1之大小明顯增加，指示在冷凍-解凍處理之後，AAV基因體之ssDNA自病毒衣殼釋放。另外，使用分光光度計分析SEC流份之峰1及主峰以量測在UV 260/280 nm下之吸光度比，以便評定核酸純度。如表3中所示，SEC流份之峰1顯示UV 260/280 nm之讀數為2.1，指示DNA具有較佳純度且含有極少蛋白質。SEC流份之主峰顯示UV 260/280 nm之讀數為1.4，指示存在蛋白質。整體DS之UV-vis顯示UV 260/280 nm之讀數為1.3，對應於病毒粒子。
此外，亦使用動態光散射（DLS）確定樣品中AAV載體球體之大小分佈曲線。表4顯示藉由DLS偵測的八個冷凍-解凍（F/T）循環處理前後AAV載體之流體動力半徑（以nm為單位）。 表2.在冷凍-解凍處理前後峰1之大小變化
SEC流份中峰1之大小變化
力價 處理前之峰1百分比 處理後之峰1百分比 峰1量（mg）%
原材料 7.8% 27.9% 0.008
2× 6.8% 11.0% 0.011
4× 6.8% 10.7% 0.013
10× 4.8% 8.5% 0.049
表3. SEC流份在UV 260/280 nm下之吸光度比。
樣品 UV 260/280 nm
SEC峰1 2.1
SEC主峰 1.4
整體DS之UV-Vis 1.3
表4. AAV載體之流體動力半徑
藉由DLS測定之流體動力半徑（nm）
力價 處理前8× F/T 處理後8× F/T
原材料 13.1 13.4
2× 13.1 12.6
4× 13.0 12.3
10× 13.2 12.7
使用特異性結合至ssDNA之螢光染料表徵並定量在冷凍-解凍處理之後ssDNA自AAV病毒衣殼之釋放情況。在冷凍-解凍（F/T）處理之後，將螢光染料摻加至AAV8-GFP樣品中。製備含有不同濃度之合成寡核苷酸的樣品作為標準品以生成標準曲線。藉由將25 µL ssDNA標準溶液與25 µL之1×染料溶液混合以獲得濃度在10 ng/mL至1000 ng/mL範圍內之ssDNA來製備標準曲線。對標準品進行分析以在480 nm激發及520 nm發射下偵測384孔盤中50 µL樣品之螢光。
對AAV8-GFP樣品中之ssDNA濃度進行定量，該等樣品藉由多個冷凍-解凍循環，諸如五個冷凍-解凍循環（F/T 5×）或十個冷凍-解凍循環（F/T 10×），或藉由水平振盪48小時進行處理。圖6顯示在冷凍-解凍處理及48小時振盪之後AAV8-GFP樣品中ssDNA濃度之定量。如圖6中所示，AAV8-GFP樣品中之ssDNA數量在冷凍-解凍處理及振盪之後增加。圖6中之Y軸表示ssDNA濃度，以ng/mL為單位。
為進一步評定冷凍-解凍循環對ssDNA外漏之影響，使用SE-UPLC量測由冷凍-解凍壓力引起的AAV8.GFP樣品中大小變異體含量之變化。未處理之AAV8.GFP樣品在t=0時之SE-UPLC溶析曲線在約7.9分鐘之滯留時間顯示主峰，且在約6.3分鐘時顯示溶析前峰，在本文中稱為峰1，如圖7中所示。值得關注的是，在十個冷凍-解凍循環之後，峰1之峰面積及峰高度增加。由於在SE-UPLC曲線中峰1要早於主峰溶析，關於此情形之可能解釋為，在約6.3分鐘時的峰係高分子量物種，諸如AAV衣殼之聚集物。
為進一步表徵峰1物種，對在260 nm及280 nm下自AAV8.GFP樣品之SE-UPLC層析圖收集之UV信號進行分析。一般而言，UV260/280比率為0.6之樣品被視為「純」蛋白質，且UV260/280比率為1.8之樣品被視為「純」DNA（Wilfinger等人, Biotechniques 22(3) (1997) 474-481；Porterfield及Zlotnick, Virology 407(2) (2010) 281-288）。對於藉由SE-UPLC分析之AAV8樣品，峰1之UV260/280比率係1.8，且主峰之UV260/280比率係1.2（表5）。觀察到的主峰之UV260/280比率指示蛋白質及DNA兩者對UV吸光度之貢獻，此與主峰表示包覆ssDNA基因體之AAV衣殼相符。觀察到的峰1之UV260/280比率表明DNA雜質而非AAV聚集物，歸因於蛋白質在280 nm下之吸光度的貢獻，該等AAV聚集物實際上具有較低的UV260/280比率。 表5 .AAV8.GFP之SE-UPLC層析圖中前峰及主峰之UV260/280比率
  UV260/280前峰 UV260/280主峰
AAV8 t=0 1.8 1.2
AAV8 10×冷凍-解凍 1.9 1.1
為了確認此雜質峰之身分，使用與螢光偵測器連接之SE-HPLC（SE-HPLC-FLR）、核酸酶處理及下一代定序（NGS）執行額外表徵。首先，將螢光偵測器連接至液相層析圖系統，並在280 nm激發及350 nm發射下收集螢光信號。利用螢光偵測器，僅觀察到主峰，且在UV層析圖中未觀察到峰1。此觀察結果進一步確認雜質峰之組成為DNA，而非含蛋白質之物種。其次，使用benzonase處理AAV8.GFP樣品。Benzonase係熟知之DNA核酸酶且已被廣泛用於消化用於多種目的之樣品中之DNA（Sastry等人, Human Gene Therapy 15(2) (2004) 221-226；Antonioli等人, Journal of Chromatography A 1216(17) (2009) 3606-3612；Konz等人, Biotechnology Progress 21(2) (2005) 466-472）。如圖8中所示，在約6.3分鐘時的峰1之強度明顯降低（降低至約基線水準），且同時主峰高度減小。此等資料指示，SE-UPLC中在主要物種之前溶析的雜質峰實際上為DNA。
為了在分子層面上確定峰1之身分，使用Illumina平台，藉由收集自5.8分鐘至7.2分鐘溶析之流份並將所彙集之流份濃縮5倍，對其進行選擇性富集以用於NGS分析（表6）。根據Lecomte等人關於單股DNA病毒定序（SSV-Seq）之方案（Lecomte等人, Adeno-Associated Virus Vectors, Springer2019, 第85-106頁），使用濃縮池製備NGS文庫。SSV-Seq方案由四個實驗步驟組成：（步驟1）自AAV池提取DNA；（步驟2）合成第二股DNA；（步驟3）製備Illumina定序文庫；及（步驟4）基於Illumina平台進行之高通量定序。使用內部專用生物資訊學流程執行資料分析。SSV-Seq係一項序列不可知技術（sequence-agnostic technique）（例如相對於qPCR），因為該技術可在無任何先驗知識（例如產生引子所需的知識）情況下偵測並鑑別DNA物種。 表6. AAV8.GFP之SE-UPLC層析圖中富集之前峰的NGS結果
複本# 總原始讀段 總經過濾之映射讀段 參考名稱 映射至參考之讀段 經映射讀段之百分比
複本1 18410428 17716518      
pAdHelper_VVT 69904 0.61
Rep-Cap8_VVT 129735 1.13
CAG-eGFP 11158267 96.98
CAG-eGFP-主鏈 148288 1.29
Ad5_E1AB 0  
複本2 18526989 17876959      
pAdHelper_VVT 69957 0.59
Rep-Cap8_VVT 126958 1.07
CAG-eGFP 11534278 97.12
CAG-eGFP-主鏈 145542 1.23
Ad5_E1AB 0  
複本3 18835821 18179263      
pAdHelper_VVT 71006 0.59
Rep-Cap8_VVT 130130 1.08
CAG-eGFP 11672300 97.09
CAG-eGFP-主鏈 148659 1.24
Ad5_E1AB 0  
鑒於觀察到benzonase處理可消除雜質峰，在無任何脫氧核糖核酸酶處理情況下執行DNA分離。將讀段分配至以下參考序列中之每一個：(i)含有ITR之CAG-eGFP bGHpA基因體；(ii)載體質體之細菌主鏈；(iii)完整Rep-Cap8質體；(iv)完整輔助質體；(v)整合至HEK293包裝細胞株基因體中之Ad5基因體之片段；及(vi)人類基因體主要組裝體GRCh38。
由NGS得到的絕大部分讀段均映射至CAG-eGFP基因體（約97%），隨後較低數量匹配載體質體主鏈（約1.2%）、Rep-Cap8（約1-1.1%）及輔助質體（0.6%）。並無讀段映射至人類基因體。此等觀察結果明確地將DNA雜質鑑別為AAV載體基因體。
為了定量AAV樣品中游離DNA之絕對量，使用公認之Quant-iT ssDNA分析。在此分析中，將外部螢光染料添加至測試樣品中，以放大在激發後ssDNA之螢光信號。建立具有各種濃度之寡核苷酸的標準曲線並使用該標準曲線計算未知樣品中之DNA濃度。如圖9中所示，Quant-iT ssDNA偵測分析展示，在十個冷凍-解凍循環之後，基礎調配物（1×DPBS、0.001% Pluronic F68）中AAV8.GFP樣品中之游離ssDNA的絕對量有3.6倍增加，自364 ng/mL增加至1303 ng/mL。在基礎調配物中之AAV8.GFP的對照樣品在95℃下加熱10分鐘時含有34000 ng/mL ssDNA。假定在95℃下熱處理釋放出100%的經包覆ssDNA，此等資料指示，在十個冷凍-解凍循環之後，游離ssDNA之濃度自AAV8.GFP樣品中總包覆ssDNA之約1%增加至4%。近來，Bee等人報導，藉由類似的基於染料之方法，在冷凍-解凍循環之後其AAV8-X樣品中之游離DNA增加（Bee等人, Journal of Pharmaceutical Sciences, 2021）。在DPBS緩衝液加泊洛沙姆188中觀察到對於每個冷凍-解凍循環，游離DNA有0.38%±0.08%之增加。其在初始樣品中觀察到接近1%之游離DNA且在5個冷凍-解凍循環之後觀察到接近3%之游離DNA，此與本文所描述之資料相符。總體而言，在SE-UPLC曲線中呈現為前峰，即峰1之產物相關雜質係自AAV衣殼外漏之ssDNA。 實例 3. 其他 AAV 血清型中 ssDNA 之 外漏情況
為了確定ssDNA外漏是否為AAV8.GFP特有的，對一組不同的AAV血清型執行前述分析：AAV2、AAV3b、AAV5、AAV7及AAVDJ。將所有樣品調至與相同基礎調配物中之AAV8樣品相同的力價。接著，使此等樣品經歷十個冷凍-解凍循環並藉由Quant-iT分析及SE-UPLC進行分析。如圖10中所示，所有測試之AAV血清型最初均顯示出極低的游離DNA含量。在十個冷凍-解凍循環之後，在除AAV2外的所有樣品中觀察到峰1雜質之UV信號（SE-UPLC）及螢光信號（Quant-iT分析）的顯著增加。儘管該等樣品中因冷凍-解凍而外漏的總ssDNA之絕對量不同，但對於除AAV2外的所有AAV血清型均偵測到ssDNA外漏。此結果表明，由於冷凍-解凍壓力而自AAV8衣殼釋放ssDNA的機制適用於其他血清型。
在不同AAV血清型中，衣殼蛋白序列之主要差異係在高變表面區中，由此使其能夠以不同效率結合至不同類型的細胞（Snyder及Moullier, Adeno-associated virus: methods and protocols, Springer2011）。產生衣殼蛋白之複製及結構基因在各血清型間一般具有高保守性，由此可能使其類似地易受冷凍-解凍壓力影響。因此，賦形劑對AAV在冷凍-解凍壓力期間之穩定性的影響可適用於此等AAV血清型中之每一種。 實例 4. 用於減少 DNA 外漏之賦形劑篩選
由於經包覆ssDNA之完整性及成功遞送對於基於AAV之基因治療至關重要，故最大限度地減少在包含冷凍-解凍壓力在內之各種條件下AAV衣殼中ssDNA之外漏很關鍵。將蛋白質穩定性賦形劑添加至AAV調配物中可促成AAV針對冷凍-解凍壓力之穩定性且亦可有助於理解ssDNA外漏機制。因此，設計出包含蛋白質穩定性賦形劑之調配物，以測試使衣殼蛋白穩定是否能減少在冷凍-解凍循環期間ssDNA之外漏。由於DPBS緩衝液因與生理條件相適應而常用於AAV，故選擇DPBS緩衝液作為基礎調配物。選擇若干常用類別之賦形劑來評定其保護蛋白質針對冷凍-解凍壓力之穩定性（例如AAV衣殼完整性），由此潛在地減少ssDNA外漏的能力，該等賦形劑包含多元醇（蔗糖、海藻糖、甘露糖醇、甘油、丙二醇及聚乙二醇）、胺基酸（脯胺酸）及界面活性劑（Pluronic™ F68（泊洛沙姆188））。
由基於螢光之游離DNA分析及SE-UPLC分析得到的結果顯示，在十個冷凍-解凍循環之後，相較於基礎調配物（基礎），所設計之調配物顯示ssDNA外漏減少，如圖9中所示。舉例而言，如藉由SE-UPLC所偵測，添加5%蔗糖或5%海藻糖將ssDNA外漏自4倍增加減少至不到2倍增加，如圖9A及表7中所示。如藉由螢光游離DNA分析所偵測，添加5%蔗糖或5%海藻糖使ssDNA外漏自3.6倍增加減少至不到50%增加，如圖9B及表8中所示。然而，5%甘露糖醇在減少ssDNA外漏方面不如蔗糖及海藻糖有效。與蔗糖及海藻糖類似，如藉由SE-UPLC所偵測，5%甘油、5%丙二醇或5%聚乙二醇400（PEG 400）使ssDNA外漏自4倍增加減少至不到50%增加，且如藉由螢光游離DNA分析所偵測，使ssDNA外漏自3.6倍增加減少至約50%增加。0.1% Pluronic F68作為常用於AAV產物調配物中的一種界面活性劑，所展示的保護AAV以免ssDNA外漏之能力與蔗糖及海藻糖相當。基於螢光游離ssDNA分析及SE-UPLC分析，作為胺基酸低溫保護劑之脯胺酸針對ssDNA外漏亦顯示出顯著保護作用。另外，使用DLS分析樣品中病毒粒子之流體動力半徑，如圖11及表9中所示。 表7.使用SEC表徵AAV8-GFP樣品中之DNA雜質
SEC結果 t0（%） 10× F/T（%）
F1基礎 6.05 24.48
F2 5%蔗糖 6.61 10.16
F3 5%海藻糖 5.76 10.27
F4 5%甘露糖醇 6.44 19.81
F5 2.5%脯胺酸 5.36 13.16
F6 5%甘油 6.66 6.91
F7 0.1% F68 2.72 9.21
F8 5% PG 4.19 5.94
表8.使用螢光染料標記來定量AAV8-GFP樣品中之ssDNA雜質
ssDNA（螢光） t0（ng/mL） 10× F/T（ng/mL）
F1基礎 363.9 1302.9
F2 5%蔗糖 363.2 520.8
F3 5%海藻糖 395.9 565.8
F4 5%甘露糖醇 399.8 917.0
F5 2.5%脯胺酸 392.1 490.6
F6 5%甘油 407.2 356.2
F7 0.1% F68 383.3 451.8
F8 5% PG 408.9 401.1
變性之std n/a 10246.6
表9.使用DLS分析AAV8-GFP樣品中病毒粒子之流體動力半徑
DLS t0 10× F/T
F1基礎 13.1 12.4
F2 5%蔗糖 9.1 7.7
F3 5%海藻糖 7.4 8.5
F4 5%甘露糖醇 11.3 10
F5 2.5%脯胺酸 12.5 11.7
F6 5%甘油 13.4 12.8
F7 0.1% F68 11.2 11.1
F8 5% PG 14.7 14
已發現，有幾種賦形劑可有效地最大限度減少在冷凍-解凍循環處理之後AAV衣殼中ssDNA之外漏。可有效地減少測試期間ssDNA外漏之賦形劑包含蔗糖、海藻糖、甘露糖醇、脯胺酸、甘油、Pluronic F68及丙二醇。基於此等結果，選出蔗糖、丙二醇及Pluronic F68進行進一步分析。選擇含不同濃度之蔗糖（2.5%、5%及10%）、丙二醇（2.5%、5%及10%）及Pluronic F68（0.001%、0.01%及0.1%）的調配物在1、2或4個冷凍-解凍循環之後進行分析，該等冷凍-解凍循環次數反映在一種或多種AAV藥品之開發、製造及投與中冷凍-解凍循環之代表性次數。如圖12中所示，當對F1中之AAV施加的冷凍-解凍循環次數增加時，觀察到ssDNA外漏增加。在四個冷凍-解凍循環之後，三種測試濃度（2.5%、5%及10%）的蔗糖及丙二醇針對ssDNA外漏展現出顯著且相當的保護作用。利用較高濃度的蔗糖及丙二醇觀察到略微減少的ssDNA外漏。Pluronic F68在防止ssDNA外漏方面不如蔗糖及丙二醇有效。儘管如此，增加Pluronic F68濃度亦逐漸減少ssDNA外漏。
低溫保護劑及界面活性劑通常一起用於生物調配物中以提供針對各種類型壓力之保護。為了測試組合賦形劑針對冷凍-解凍壓力之作用且為了測試蛋白質穩定性賦形劑是否能減少其他血清型中之ssDNA外漏，設計出含蔗糖及Pluronic F68兩者之調配物並利用各種AAV血清型對其進行評估。
在圖13中，基礎調配物（BF）係DPBS，而最佳化調配物（OF）在DPBS中含有10%蔗糖及0.1% Pluronic F68。在10個冷凍-解凍循環之後，相較於不含蔗糖及Pluronic F68之基礎調配物，最佳化調配物明顯抑制AAV3b、AAV5、AAV7、AAV8及AAVDJ之ssDNA外漏。藉由基於螢光之游離DNA分析，ssDNA外漏之減少係在10倍與20倍之間；藉由SE-UPLC測定，ssDNA雜質峰面積之減小在3倍至10倍之範圍內，其中關於AAVDJ觀察到40倍減小。值得關注的是，對於AAV2之保護作用極小，此可能因為相較於其他血清型，在無低溫保護劑及界面活性劑存在下其游離DNA之外漏係可忽略的。基於此等發現，含低溫保護劑及界面活性劑之最佳化調配物可保護各種AAV血清型免受冷凍-解凍壓力影響。
賦形劑係基於其特性及已確定之蛋白質穩定化機制選擇。作為多元醇之亞型，蔗糖及海藻糖係最常用於使蛋白質穩定的基於糖之賦形劑（Singh, Challenges in Protein Product Development, Springer2018, 第63-95頁）。甘油、丙二醇及聚乙二醇（在此等實驗中為PEG 400）亦為用於蛋白質分子之習知多元醇低溫保護劑。低溫保護劑藉由各種機制發揮作用，包含優先自蛋白質表面除去、在蛋白質分子周圍形成玻璃狀基質或與蛋白質形成氫鍵（Timasheff, Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure 22(1) (1993) 67-97；Corradini等人, Scientific Reports 3(1) (2013) 1-10；Markarian等人, Cryobiology 49(1) (2004) 1-9）。Pluronic F68係作為界面活性劑添加於AAV調配物中以抵抗在製造及運輸期間之機械壓力以及在冷凍-解凍循環期間之界面壓力，且出於此等目的，其常被用於蛋白質醫藥中（Nail及Akers, Development and manufacture of protein pharmaceuticals, Springer Science & Business Media2012）。作為非離子型界面活性劑，Pluronic F68可減小在由機械擾動及冷凍-解凍循環產生之界面處的表面張力，並因此抑制由於與界面活性劑競爭而在界面處引起之蛋白質吸附（Kasimbeg等人, Journal of Pharmaceutical Sciences 108(1) (2019) 155-161；Khan等人, European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 97 (2015) 60-67；Dixit等人, Pharmaceutical Research 30(7) (2013) 1848-1859）。鑒於此等賦形劑在使蛋白質結構穩定及維持穩定性中之作用，此等發現亦有利於闡明AAV衣殼中ssDNA外漏之機制。
在此等穩定性研究中，觀察到在冷凍-解凍循環之後AAV溶液中游離ssDNA之含量增加。在冷凍-解凍處理之前整體原料藥中之游離ssDNA可為由細胞培養或純化殘留之殘餘DNA，而在多個冷凍-解凍循環之後增加之ssDNA係基因體ssDNA，經顯示，該基因體ssDNA係自AAV衣殼外漏的。此發現得到NGS表徵結果之支持，且與蛋白質穩定性賦形劑抑制冷凍-解凍壓力後ssDNA之外漏的觀察結果一致。下文將進一步論述ssDNA外漏係經由基因體噴出（亦即，衣殼保持完整）抑或經由AAV衣殼分解發生。
已在單一病毒衣殼層面上研究AAV8及AAV9以探索在熱壓力下，諸如在50至80℃下培育之降解機制（Bernaud等人, Journal of Biological Physics 44(2) (2018) 181-194）。如藉由原子力顯微術（AFM）所觀測，經包覆之DNA基因體係自完整或部分展開之衣殼噴出。假設若噴出係ssDNA外漏之主要機制，則完整衣殼力價應減小且伴隨空衣殼力價之增加，且完整衣殼與空衣殼之和應在壓力前後保持恆定。或者，若ssDNA外漏係因AAV分解（亦即，衣殼破裂）而發生，則總衣殼力價在壓力後應當因完整衣殼力價減小而減小（空衣殼力價應當保持不受影響）。由於游離ssDNA係未處理之AAV樣品中總包覆ssDNA之約1%且在10個冷凍-解凍循環之後增加至約5%，故完整衣殼力價/空衣殼力價之變化應在類似的量值水準。
不幸的是，由於在關於衣殼力價之酶聯結免疫吸附分析（ELISA）中變異係數（CV%）典型地為10-20%，故難以確定衣殼力價之1%至5%變化是否伴隨游離ssDNA之1%至5%變化發生。類似地，在260 nm及280 nm下進行之SE-UPLC分析由於方法之變化以及近似值與估計值之極限值（例如ssDNA及衣殼蛋白之消光係數及分子質量以及UV偵測器中流槽之路徑長度）而在確定降解機制方面無說服力。利用動態光散射（DLS）作為SE-UPLC之替代方法來監測大小變異體，且未觀察到明顯AAV聚集或斷裂。仔細的檢查SE-UPLC溶析曲線亦未揭露在AAV衣殼之後有任何明顯的VP蛋白質峰。總體而言，DLS及SE-UPLC（以及可能地，ELISA）方法之變化性阻礙了對AAV中ssDNA之外漏機制的結論性闡明。可能需要用更準確且更精確之力價方法進行進一步研究以更好地理解ssDNA外漏機制。如先前所述，AFM之類觀測工具亦可提供對冷凍-解凍循環後衣殼完整性之觀測且有助於對機制之理解。
基於AAV之基因治療藥品通常在製造、運輸、儲存及投與期間經歷一個或多個冷凍-解凍循環。本發明對在DPBS緩衝液中之AAV8的表徵已揭露，在甚至一個冷凍-解凍循環之後，亦有部分的經包覆ssDNA自AAV8外漏。經確認，外漏之ssDNA的身分係最初包覆在衣殼中之基因體DNA。基因體外漏之程度隨冷凍-解凍循環次數增加而增加。在包含AAV2、AAV3b、AAV5、AAV7及AAVDJ在內之其他測試血清型中亦觀察到不同程度的基因體外漏。
調配物篩選研究鑑別出有效抑制AAV中基因體DNA外漏之賦形劑，諸如多元醇、胺基酸及界面活性劑。用蔗糖、丙二醇及Pluronic F68進行之進一步研究使得更好地理解其對AAV在ssDNA外漏方面之穩定性的作用。此等結果提供對於在利用來自冷凍及解凍之壓力作為降解路徑情況下AAV中ssDNA外漏之瞭解。另外，此等發現對於未來穩定AAV原料藥及藥品調配物之開發極有價值。
圖1顯示根據Venkatakrishnan等人的AAV1載體之結構，包含AAV1衣殼VP3單體之晶體結構及AAV1衣殼之表面表示。
圖2示出根據一個例示性實施例，在保護性調配物存在或不存在下對AAV載體進行冷凍-解凍之影響。
圖3顯示根據一個例示性實施例，AAV8-GFP樣品之SEC流份在280 nm下之吸光度。根據一個例示性實施例，將不同量之AAV8-GFP樣品裝載至SEC管柱中，諸如1 µL、5 µL、10 µl、15 µL或20 µL之樣品。
圖4顯示根據一個例示性實施例，在280 nm激發及350 nm發射下監測的AAV8-GFP樣品之SEC流份的螢光強度。
圖5顯示根據一個例示性實施例，AAV8-GFP樣品之SEC流份在280 nm下之吸光度。根據一個例示性實施例，將不同濃度（力價）之AAV8-GFP樣品裝載至SEC管柱中。
圖6顯示根據一個例示性實施例，在不同數量之冷凍-解凍循環及攪動處理之後，AAV8-GFP樣品中ssDNA濃度之定量。
圖7顯示根據一個例示性實施例，在t=0時（粗線）及在十個冷凍-解凍（F/T）循環之後（虛線）AAV8.GFP之SE-UPLC層析圖。
圖8顯示根據一個例示性實施例，在利用（虛線）及不利用（粗線）benzonase處理情況下AAV8.GFP之SE-UPLC層析圖。
圖9A顯示根據一個例示性實施例，在十個冷凍-解凍（F/T）循環之後各種調配物中之AAV8.GFP的SE-UPLC層析圖中DNA峰之雜質百分比。圖9B顯示根據一個例示性實施例，在十個冷凍-解凍（F/T）循環之後自各種調配物中之AAV8.GFP外漏之ssDNA的量。
圖10A顯示根據一個例示性實施例，藉由Quant-iT ssDNA套組量測的在十個冷凍-解凍（F/T）循環之後自AAV2、AAV3b、AAV5、AAV7及AAVDJ外漏之游離ssDNA的量。圖10B顯示根據一個例示性實施例，在十個冷凍-解凍（F/T）循環之後AAV2、AAV3b、AAV5、AAV7及AAVDJ之SE-UPLC層析圖中DNA峰之雜質百分比。
圖11顯示根據一個實施例，使用DLS分析AAV8-GFP樣品中病毒粒子之流體動力半徑，使用不同調配物來篩選各種賦形劑以減少AAV衣殼中DNA之外漏。根據一個例示性實施例，對在十個冷凍-解凍（F/T）循環之處理前後AAV8-GFP樣品中之DNA雜質進行表徵。
圖12A顯示根據一個例示性實施例，在1、2或4個冷凍-解凍（F/T）循環之後，自含不同濃度之蔗糖、丙二醇或Pluronic F68之調配物中之AAV8.GFP外漏之游離ssDNA的量。圖12B顯示根據一個例示性實施例，在1、2或4個冷凍-解凍（F/T）循環之後，含不同濃度之蔗糖、丙二醇或Pluronic F68之調配物中之AAV8.GFP的SE-UPLC層析圖中DNA峰之雜質百分比。
圖13A顯示根據一個例示性實施例，在十個冷凍-解凍（F/T)循環之後自基礎調配物（base formulation，BF）或最佳化調配物（optimized formulation，OF）中之AAV2、AAV3b、AAV5、AAV7、AAV8及AAVDJ外漏之游離ssDNA的量。圖13B顯示根據一個例示性實施例，在十個冷凍-解凍（F/T）循環之後基礎調配物（BF）或最佳化調配物（OF）中之AAV2、AAV3b、AAV5、AAV7、AAV8及AAVDJ的SE-UPLC層析圖中DNA峰之雜質百分比。

Claims (29)

  1. 一種鑑別含有腺相關病毒（AAV）載體之樣品中之核酸雜質的方法，該方法包括： 使含有腺相關病毒（AAV）載體之樣品與粒徑篩析層析（SEC）管柱接觸； 使用溶液洗滌該SEC管柱以提供至少一種溶析液；及 使用分光光度計鑑別該至少一種溶析液中之核酸雜質。
  2. 如請求項1之方法，其中該等核酸雜質係AAV之單股DNA基因體。
  3. 如請求項1之方法，其進一步包括用螢光染料處理該等核酸雜質。
  4. 如請求項1之方法，其進一步包括使用該分光光度計量測該至少一種溶析液在280 nm下之吸光度。
  5. 如請求項1之方法，其進一步包括使用該分光光度計量測該至少一種溶析液在260/280 nm下之吸光度比。
  6. 如請求項1之方法，其進一步包括基於核酸標準曲線定量該等核酸雜質。
  7. 如請求項1之方法，其進一步包括在使該樣品與該SEC管柱接觸之前，使該樣品與DNA核酸酶接觸。
  8. 如請求項1之方法，其中該SEC系統係粒徑篩析超高效液相層析（SE-UPLC）系統。
  9. 如請求項1之方法，其進一步包括對該至少一種溶析液進行下一代定序（NGS）。
  10. 一種組成物，其包括至少一種腺相關病毒（AAV）載體及至少一種賦形劑，其中該至少一種賦形劑係糖、胺基酸、界面活性劑或多元醇，其中該至少一種AAV載體包括經包裝核酸；且其中該組成物中之該至少一種AAV載體經保護以防該等經包裝核酸外漏。
  11. 如請求項10之組成物，其中該至少一種AAV載體暴露於至少一個冷凍-解凍循環。
  12. 如請求項10之組成物，其中該等經包裝核酸係來自AAV基因體之單股DNA，其中該等經包裝核酸存在於AAV衣殼內。
  13. 如請求項10之組成物，其中該賦形劑係呈約0.001%至約10%之濃度，其中該組成物進一步包括磷酸鹽緩衝鹽水及非離子型界面活性劑。
  14. 如請求項10之組成物，其中該糖係蔗糖、海藻糖、甘露糖醇、棉子糖、乳糖、葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、麥芽四糖、麥芽五糖或麥芽七糖。
  15. 如請求項10之組成物，其中該胺基酸係脯胺酸。
  16. 如請求項10之組成物，其中該界面活性劑係泊洛沙姆（poloxamer）188。
  17. 如請求項10之組成物，其中該界面活性劑係非離子型界面活性劑，其中該界面活性劑係呈約0.001%至約0.2%之濃度。
  18. 如請求項10之組成物，其中該組成物包含蔗糖及泊洛沙姆188。
  19. 如請求項18之組成物，其中該蔗糖係呈2.5%至10%之濃度且該泊洛沙姆188係呈0.001%至0.2%之濃度。
  20. 一種用於保護腺相關病毒（AAV）載體以免經包裝核酸外漏的方法，其包括： 獲得包含至少一種AAV載體之樣品；及 將穩定性組成物添加至該樣品中以形成保護性調配物， 其中該保護性調配物保護該至少一種AAV載體以免經包裝核酸外漏，該穩定性組成物包括至少一種賦形劑，且該賦形劑係糖、胺基酸、界面活性劑或多元醇。
  21. 如請求項20之方法，其中該AAV載體暴露於至少一個冷凍-解凍循環。
  22. 如請求項20之方法，其中該等經包裝核酸係AAV之單股DNA基因體，其中該等經包裝核酸存在於AAV衣殼內。
  23. 如請求項20之方法，其中該賦形劑在該保護性調配物中呈約0.001%至約10%之濃度，其中該穩定性組成物進一步包括磷酸鹽緩衝鹽水及非離子型界面活性劑。
  24. 如請求項20之方法，其中該糖係蔗糖、海藻糖、甘露糖醇、棉子糖、乳糖、葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、麥芽四糖、麥芽五糖或麥芽七糖。
  25. 如請求項20之方法，其中該胺基酸係脯胺酸。
  26. 如請求項20之方法，其中該界面活性劑係泊洛沙姆188。
  27. 如請求項20之方法，其中該界面活性劑係非離子型界面活性劑，其中該界面活性劑在該保護性調配物中呈約0.001%至約0.2%之濃度。
  28. 如請求項20之方法，其中該穩定性組成物包含蔗糖及泊洛沙姆188。
  29. 如請求項28之方法，其中該蔗糖在該保護性調配物中呈2.5%至10%之濃度，且該泊洛沙姆188在該保護性調配物中呈0.001%至0.2%之濃度。
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