TW202146040A - 脂質代謝之動物模型及治療高脂血症或高脂血症相關疾病的方法 - Google Patents

Abstract

本發明揭示一種經遺傳修飾的非人類動物模型，其於富含脯胺酸酸性蛋白質1 (proline-rich acidic protein 1 ， PRAP1 )基因之外顯子3具有特定的突變。本發明內容同時揭示利用PRAP1抑制劑或修飾的PRAP1多肽來治療高脂血或高脂血相關疾病的方法，及包含該修飾之PRAP1多肽的藥學組成物。

Description

脂質代謝之動物模型及治療高脂血症或高脂血症相關疾病的方法

本揭示內容是關於治療疾病的領域。更具體來說，本揭示內容是關於用以治療高脂血(hyperlipidemia)或高脂血症相關疾病之方法，以及脂質代謝的非人類動物模型。

高脂血(hyperlipidemia)是一種脂質代謝疾病，其特徵在於血液中異常增高的脂質含量。高血脂可能會導致動脈阻塞(亦稱為動脈粥樣硬化)，進而造成心臟病、中風及末梢血管疾病等心血管疾病。此外，高脂血也是急性胰臟炎之常見成因，並與肝脂質變性(亦稱為脂質肝症，fatty liver disease (FLD))的發展相關。依據血液中異常增高之脂質的種類，可將高脂血歸類為不同類型，包含高三酸甘油脂血(hypertriglyceridemia；即，血液中三酸甘油脂(TG)增高)，高膽固醇血(hypercholesterolemia；即，血液中膽固醇增高)，以及綜合型高脂血(combined hyperlipidemia；即，血液中三酸甘油脂與膽固醇皆增高)。

治療高脂血的方法包含維持正常體重、保持均衡的飲食、維持規律的生理活動，及避免酒精與吸菸。處方藥可用來治療某些具有高危險因子的人，例如罹患心血管疾病的病患。常見之降低脂質的藥物包含，斯他汀類藥物(statins)(例如阿托伐他汀(atorvastatin)、弗伐斯他汀(fluvastatin)、洛伐斯他汀(lovastatin)、必達伐斯他汀(pitavastatin)、布洛伐斯他汀(pravastatin)、羅素伐斯他汀(rosuvastatin)及心伐斯汀(simvastatin))、膽酸結合樹脂 (bile-acid-binding resins) (舉例來說，銷膽胺(cholestyramine)、考來維倫(colesevelam)與考來帝博(Colestipol))、菸鹼酸、膽固醇吸收抑制劑(例如依澤替米貝(ezetimibe))，以及纖維酸衍生物(例如非諾貝特(fenofibrate)和吉非羅齊(gemfibrozil))。然而，受限於治療功效不足、不耐性與各種副作用(包含急性冠狀動脈症候群(acute coronary syndrome)、肌病變(myopathy)、皮疹(rashes)、胃腸不適、皮膚血管舒張、潮紅、脹氣與腹瀉)，該些藥物並無法提供令人滿意的治療效果。

有鑑於此，相關領域中亟需一種可更安全且有效地治療高脂血的新穎方法。

以下發明內容呈現本揭示內容的簡化摘要，以使閱讀者對本揭示內容具備基本的理解。此發明內容並非本揭示內容的完整概述，且其用意並非在指出本發明的重要/關鍵元件或界定本發明的範圍。發明內容的唯一目的是以簡化形式呈現本揭示內容的一些概念，作為之後呈現的更詳細說明的基礎。

如同本文具體實施及概括陳述，本揭示內容之一態樣是關於一種治療一個體之高脂血症或高脂血症相關疾病的方法。該方法包括對該個體投予一有效量之PRAP1抑制劑、一修飾的PRAP1多肽，或是一用以編碼該修飾之PRAP1多肽的核酸。

依據使用目的之不同，該PRAP1抑制劑可以是一標的PRAP1的反義寡核苷酸(antisense oligonucleotide)或一小型干擾RNA(small interfering RNA)。

相較於野生型PRAP1多肽，該修飾的PRAP1多肽包含一胺基酸修飾。依據本揭示內容某些實施方式，該個體是一人類，其中該胺基酸修飾是以纈胺酸(valine)來置換(substitute)序列編號：5之野生型PRAP1多肽之第94個胺基酸位置的麩胺酸(glutamic acid，E94V)，或是以纈胺酸置換序列編號：7之野生型PRAP1多肽之第85個胺基酸位置的麩胺酸(E85V)。依據本揭示內容之某些實施方式，該個體是一小鼠，其中該胺基酸修飾是以纈胺酸置換序列編號：1之野生型PRAP1多肽之第88個胺基酸位置的麩胺酸(E88V)，或是以纈胺酸置換序列編號：3之野生型PRAP1多肽之第85個胺基酸位置的麩胺酸(E85V)。

該高脂血相關疾病是肝脂質變性(hepatosteatosis)、動脈粥狀硬化症、心血管疾病、胰腺炎(pancreatitis)或乳糜微粒血症 (chylomicronemia syndrome)。

本揭示內容亦提供一種基因轉殖小鼠，其於PRAP1 基因的外顯子3包含一序列編號：18的外源性核苷酸序列。依據本揭示內容揭示某些實施方式，該外源性核苷酸序列會造成PRAP1 基因的無意義突變(nonsense mutation)。

依據本揭示內容某些實施例，該基因轉殖小鼠的PRAP1 基因的外顯子3包含序列編號：19之核苷酸序列。

本揭示內容的另一態樣是關於一種基因轉殖小鼠，其包含一修飾之PRAP1 基因；相較於野生型PRAP1多肽，該修飾之PRAP1 基因可用以編碼一包含一胺基酸修飾的PRAP1多肽。依據某些實施方式，該胺基酸修飾是以纈胺酸置換序列編號：1之野生型PRAP1多肽之第88個胺基酸位置的麩胺酸(E88V)。依據替代的實施方式，該胺基酸修飾是以纈胺酸置換序列編號：3之野生型PRAP1多肽之第85個胺基酸位置的麩胺酸(E85V)。

本揭示內容也提供一藥物組成物，其包含一修飾之PRAP1多肽及其藥學上可接受之賦形劑，其中，相較於野生型PRAP1多肽，修飾之PRAP1多肽包含一胺基酸修飾。依據一實施方式，該胺基酸修飾是以纈胺酸置換序列編號：5之野生型PRAP1多肽之第94個胺基酸位置的麩胺酸(E94V)。依據另一實施方式，該胺基酸修飾是以纈胺酸置換序列編號：7之野生型PRAP1多肽之第85個胺基酸位置的麩胺酸(E85V)。依據另一實施方式，該胺基酸修飾是以纈胺酸置換序列編號：1之野生型PRAP1多肽之第88個胺基酸位置的麩胺酸(E88V)。依據另一實施方式，該胺基酸修飾是以纈胺酸置換序列編號：3之野生型PRAP1多肽之第85個胺基酸位置的麩胺酸(E85V)。

本發明內容中許多伴隨的特徵與優勢在參考下列對應附帶圖示之詳細描述將變得更容易理解。

為了使本揭示內容的敘述更加詳盡與完備，下文針對了本發明的實施態樣與具體實施例提出了說明性的描述；但這並非實施或運用本發明具體實施例的唯一形式。實施方式中涵蓋了多個具體實施例的特徵以及用以建構與操作這些具體實施例的方法步驟與其順序。然而，亦可利用其他具體實施例來達成相同或均等的功能與步驟順序。

I.  定義

為了便於說明，此處統整性地說明本說明書、實施例以及後附的申請專利範圍中所記載的特定術語。除非本說明書另有定義，此處所用的科學與技術詞彙之含義與本發明所屬技術領域中具有通常知識者所理解與慣用的意義相同。 另外，除非上下文另外要求，否則應理解，單數術語應包括相同的複數形式，而複數術語應包括單數。 具體來說，除非上下文另有明確說明，本文和後附的申請專利範圍所使用的單數形式「一」(a及an)包含複數形式。同樣地，本文和後附的申請專利範圍所使用的術語「至少一個」和「一個或多個」具有相同的含義，並且包括一個，兩個，三個或更多個。

雖然用以界定本發明較廣範圍的數值範圍與參數皆是約略的數值，此處已盡可能精確地呈現具體實施例中的相關數值。然而，任何數值本質上不可避免地含有因個別測試方法所致的標準偏差。在此處，「約」通常係指實際數值在一特定數值或範圍的正負10%、5%、1%或0.5%之內。或者是，「約」一詞代表實際數值落在平均值的可接受標準誤差之內，視本發明所屬技術領域中具有通常知識者的考量而定。除了實驗例之外，或除非另有明確的說明，當可理解此處所用的所有範圍、數量、數值與百分比（例如用以描述材料用量、時間長短、溫度、操作條件、數量比例及其他相似者）均經過「約」的修飾。因此，除非另有相反的說明，本說明書與附隨申請專利範圍所揭示的數值參數皆為約略的數值，且可視需求而更動。至少應將這些數值參數理解為所指出的有效位數與套用一般進位法所得到的數值。

本文使用的「轉基因(transgene)」一詞是指，對被導入的轉基因動物或細胞來說是部分或完全異源的(即外來的)的核酸序列，或是對被導入的轉基因動物或細胞的內源基因來說是同源的核酸序列，但該核酸序列是設計用來要被插入或被插入動物之基因體，如此一來被插入該核酸序列之細胞的基因體將被改變。轉基因可以被操作地連接到一或多個轉錄調控序列和任何其他核酸，例如內含子(intron)，這對於所選之核酸的最佳之表現可能是必需的。因此，「轉基因的(transgenic)」一詞於此用作形容詞來描述帶有轉基因的動物(例如，小鼠)或構件體(construct)此一性質。例如，「一轉基因的動物(a transgenic animal)」是一非人類之動物，較佳地，是一非人類之哺乳類，更佳地，是一囓齒類，其中該動物的一或多個細胞包含由人類干預之方式(例如藉由本領域中所習知之轉基因的技術，包括基因敲入(gene knock-in)技術)所引入的異源核酸。透過刻意的基因操作(例如以顯微注射或以重組病毒感染)並導入細胞的前驅物，核酸被直接地或間接地導入細胞。轉基因的動物包含，但不限於基因敲入動物。

本文使用的「剔除(knock-out，KO)」一詞可為本領域中具有通常知識者了解，且是指在基因序列中之改變，其導致標的基因功能降低，較佳地，該標的基因的表現是無法測定或不顯著。

如本領域中具有通常知識者理解的「敲入(knock-in)」是指轉基因在宿主細胞基因體中有目標的插入，其導致轉基因的表現。「敲入」轉基因學(transgenics)可以包含一轉基因之異型合子的(heterozygous)敲入(例如，不同於被導入之轉基因動物或細胞之內源殘基的核酸殘基)。在某些實施方式中，「敲入」導致一內源基因(或其部分)被一外源基因(或其部分)所置換，例如，導致等位基因(allele)之一或兩者的靶向突變。「敲入」還包含藉由將該動物暴露在促進此表現的一物質下，並藉由在靶向插入(例如，在Cre-Lox系統中的Cre重組酵素)之位點導入促進重組的一酵素，或藉由一些其他方法達成的轉基因表現。

如本領域所習知，真核基因通常同時包含外顯子和內含子。用語「外顯子」是指在基因體DNA中找到的一核酸序列，其在生物資訊上被預期及/或實驗上被確認會對成熟的mRNA轉錄本(transcript)貢獻連續的序列。相比之下，用語「內含子」是指在基因體DNA中找到的一核酸序列，其在生物資訊上被預期及/或實驗上被確認不會對成熟的mRNA轉錄本提供連續的序列，反而在轉錄之過程期間會被「切除」。如同在本揭示內容之第1A圖中描繪的數據，或者參考國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)的科學資料庫中公布的資訊，PRAP1 基因(GeneID：22264；NCBI參考序列：NM_009475.2)包含5個用於編碼PRAP1 的mRNA轉錄本的外顯子，且序列編號：18的一個外源核苷酸序列被插入到PRAP1 基因之第3個外顯子(由5'端末端)中。

於此使用之，用語「無意義突變(nonsense mutation)」是指DNA中的突變，其將對應於胺基酸的密碼子改變成終止密碼子。具體來說，用語「無意義突變」是指DNA中的突變，其在被轉錄出的mRNA中導致過早的終止密碼子或無意義密碼子，進而發生截短或不完整、一般都是無功能的蛋白質產物。

用語「野生型(wild-type)」是指一基因或基因產物，其具有此一基因或基因產物自天然產生之來源而被分離者的特徵。一野生型基因或基因產物(例如，一多肽)，在一種群中是最常被觀察到的，也因此就這樣地被命名為該基因的「正常(normal)」或「野生型」形式。

用語「多肽(polypeptide)」是指胺基酸的聚合物，並不考慮該聚合物的長度；因此，「胜肽(peptide)」、「寡肽(oligopeptide)」和「蛋白質(protein)」均被囊括在多肽的定義內，並且在本文中可互換使用。雖然該等多肽的化學修飾或表現後修飾可以被涵蓋或排除以作為具體實施例，該用語並未指定或排除本發明之多肽的化學修飾或表現後修飾。因此，例如，對多肽的修飾，包含醣苷基團、乙醯基團、磷酸基團、脂質基團及其類似物的共價結合，均被明確地被用語多肽所涵蓋。此外，具有該等修飾的多肽可被以單獨種類指定而被本發明所包含或排除。本揭示內容之全文中，在多肽中之任何被指定的胺基酸殘基的位置，均自該多肽的N端開始編號。當胺基酸並未被指定為D-或L-胺基酸時，除非上下文要求特定的異構體，否則該胺基酸是L-胺基酸或可以是D-或L-胺基酸。此外，本文使用之多肽胺基酸殘基的符號為本領域一般會使用的那些縮寫。

用語「投予、施用、給藥(administered、administering或administration)」於此可交替使用，是指一種遞送模式，其包括但不限於，靜脈內地、肌肉內地、腹膜內地(intraperitoneally)、動脈內地、顱內地(intracranially)或皮下地(subcutaneously)投予本發明的一藥劑(例如一修飾的PRAP1多肽或一編碼修飾的PRAP1多肽的核酸)。在部份實施例中，為了可與合適的載體(例如緩衝溶液)混合，可在使用前(例如靜脈注射前)先將修飾的PRAP1多肽或一編碼修飾的PRAP1多肽的核酸配製成粉末。

本文使用之用語「治療(treat、treating及treatment)」可交替使用，且該些用語涵蓋部分或完整地預防(preventing)、改善(ameliorating)、減輕(mitigating)及/或控制(managing)與高脂血症有關的症狀(symptom)、繼發性疾病(secondary disorder)或其病症(condition)，其中是透過降低血液脂質(例如，TG及/或磷脂)量而對具有或疑似具有此症狀、疾病或病症之個體產生益處。本文使用之用語「治療(treating)」是指以部分或全部緩和、改善、緩解、延遲發作、抑制其進展、降低其嚴重程度及/或降低與高脂血症有關的一種或多種症狀、繼發性疾病或特徵的發生率為目的，對具有與高脂血症相關之症狀、繼發性疾病或病症的個體，施用或投予本揭示內容的一或多種多肽。與高脂血症有關的症狀、繼發性疾病及/或病症包含，但不限於肝脂質變性(hepatosteatosis)、動脈粥狀硬化症(atherosclerosis)、心血管疾病(cardiovascular disease)、胰腺炎(pancreatitis)或乳糜微粒血症(chylomicronemia syndrome)。為了降低與高脂血症有關的症狀、繼發性疾病及/或病症發展的風險，可以對僅展現出此等症狀、疾病或病症之早期徵兆的個體投予治療。如果一或多種症狀或臨床指標如本文定義之用語地減輕，則治療通常是「有效的」。或者，如果症狀、疾病或病症之進展是減少或停止的，治療是「有效的」。

如本文使用的「有效量(effective amount)」一詞，是指足以產生所欲之反應的成分的量。出於治療之目的，有效量亦為一種治療地有益效果超過該成分之毒性或有害效果的量。有效量的試劑不必需要治癒疾病或病症，但是將提供對疾病或病症的治療，使得疾病或病症的發作被延遲、阻礙或預防，或者疾病或病症的症狀得到改善。有效量可以以適合的形式被切分成一劑、二劑或更多劑量，而在整個指定的期間內投予一次、二次或更多次。具體的有效或充分量會隨著特定被治療的病症、病患的身體狀況(例如，病患的體重、年齡或性別)、接受治療的哺乳類或動物之種類、治療的期間合併療法(如果有的話)的本質、所使用的具體配方以及化合物或其衍生物之結構，等因素而變動。有效量可以用，例如，克、毫克(milligram)或微克(microgram)表示，或以每公斤體重幾毫克 (mg/Kg)表示。或者，有效量可以用活性成分的濃度表示(例如，本揭示內容之修飾的PARP1多肽)，像是莫耳濃度、質量濃度、體積濃度、重量莫耳濃度(molality)、莫耳分率、質量分率或混合比率。具有本領域一般技能者可以根據由動物模型測定的劑量，來計算藥物(像是本揭示內容之修飾的PARP1多肽)的人體等效劑量(human equivalent dose，HED)。例如，具有本領域通常知識者可以遵循美國食品藥品監督管理局(Food and Drug Administration，FDA)發布的產業指南「在初始臨床試驗中對治療成人健康志願者估計最大安全起始劑量(Estimating the Maximum Safe Starting Dose in Initial Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers)」來估計用於人類個體之最大安全劑量。

慣用語「藥學上可接受的(pharmaceutically acceptable)」是指「一般被認為是安全」的分子實體與組成物，例如，那些具有生理上的耐受性與通常不會產生過敏或類似之不良反應者，像是，對人類投予時，不會產生胃部不適、頭暈及其類似現象。較佳地，本文所用之術語「藥學上可接受的」是指由聯邦或州政府的監管機構批准的，或列於美國藥典或其他普遍認可的藥典中用於動物者，尤其是用於人類者。

用語「個體(subject)」指可以用修飾的PRAP1多肽、編碼修飾的PRAP1多肽的核酸及/或本發明之方法來治療的哺乳類，包含人類物種。除非明確指出一種性別，否則用語「個體」意指雄性和雌性。

II. 具體實施方式

PRAP1最初被鑑別為於妊娠中期至晚期在子宮中特異性表現的蛋白，因此被稱為妊娠特異性子宮蛋白(pregnancy-specific uterine protein，PSUP)。之後，PRAP1被發現也有在腸道上皮中表現，且在小腸近端(proximal small intestine)大量表現，且其沿著十二指腸-迴腸軸線(duodenum-ileum axis)有一遞減的表現梯度，在盲腸或結腸中幾乎無法檢測到。PRAP1之人類同源物的過表現將在某些上皮和肝癌細胞株中引起細胞生長抑制。此外，據信PRAP1有涉及DNA損傷後的p53依賴型細胞存活。然而，PRAP1的生理功能仍尚未明瞭。

本揭示內容至少部份基於以下發現，亦即PRAP1藉由與微粒體三酸甘油酯轉移蛋白(microsomal triglyceride transfer protein，MTTP)交互作用來促進脂質吸收和apoB的組裝和分泌，而且PRAP1之缺失與突變會減少個體血漿中磷脂與TG的量。因此，引入修飾的PRAP1等位基因或多肽提供治療與高脂血症有關及/或由其引起的疾病或病症的潛在手段。

因此，本揭示內容是一種帶有弱化或摘除PRAP1活性之遺傳上修飾小鼠模型，該遺傳上修飾的小鼠模型在篩選治療高脂血症之藥物候選物的用途、藉由使用修飾的PRAP1多肽與包含修飾的PRAP1多肽的藥學組成物來治療高脂血症或高脂血症相關疾病的方法。

II-1.  PRAP1 剔除(KO)小鼠

本揭示內容的第一態樣關於一種PRAP1 KO小鼠(即，PRAP1^-/- 小鼠)，其包含在富脯胺酸酸性蛋白1(PRAP1 )基因之外顯子3有插入一外源基因。

產生轉基因小鼠的方法為本領域中具有一般知識者所習知。根據本揭示內容的部分實施例，是以靶向載體，透過同源重組來修飾PRAP1 基因的外顯子3之後，將此修飾的PRAP1 基因轉導入胚胎幹(embryonic stem，ES)細胞，來產生PRAP1^-/- 小鼠。所產生的ES細胞被轉移到囊胚胚胎的囊胚腔空腔之後，囊胚胚胎就被轉移至代孕母體，並於其中完成妊娠，藉此產生由ES細胞衍生的創始小鼠(即，具有野生型(WT)等位基因與突變等位基因之嵌合PRAP^+/- 小鼠))，它們繼承新的序列變異(即敲入突變)，此變異於所選基因座上產生功能獲得型(gain-of-function)等位基因。對嵌合PRAP^+/- 小鼠進行雜交以產生PRAP^-/- 小鼠，其PRAP1 基因的兩個等位基因的外顯子3中都包含外源基因。

轉導該外源基因進入PRAP1 基因之外顯子3的示例性靶向載體包含，但不限於，質粒載體、人工/微小染色體(mini-chromosome)、轉座子(transposon)和病毒載體(例如，腺病毒載體，慢病毒載體或辛德畢斯(sindbis)病毒載體)。靶向載體可以在其核苷酸序列中包含編碼正向選擇標記的基因，例如，新黴素(neomycin)抗性基因或潮黴素(hygromycin)抗性基因。該正向選擇標記的基因可視需求而為重組酶的辨認位點框住，這樣可以允許篩選成功的同源重組事件之後，切除正向選擇標記基因。藉此，可以避免任何正向選擇標記基因的表現去影響PRAP1 基因之表現。重組酶的辨認位點可以選自由flp重組酶之frt位點與cre重組酶之lox位點所組成的群組。根據一具體實施例，正向選擇標記基因為新黴素抗性基因，導入PRAP1 基因外顯子3的外源基因是包含序列編號：18之核苷酸序列的lacZ/新黴素磷酸轉移酶(phosphotransferase)基因卡匣。非必要地，靶向載體更可於其核苷酸序列中包含編碼負向選擇標記的基因，例如，白喉毒素(diphtheria toxin，DT)基因或單純疱疹病毒(herpes simplex virus，HSV)-胸苷激酶 (thymidine kinase)基因。根據一具體實施例，轉導外源基因進入PRAP1 基因外顯子3的靶向載體包含作為負向選擇標記基因的DT基因。

根據本揭示內容的較佳實施方式，轉導外源基因進入PRAP1 基因外顯子3的靶向載體更包含一第一核苷酸序列及一第二核苷酸序列，其分別位於外源基因的5'端和3'端，其中第一核苷酸序列與PRAP1 基因外顯子3的5'端同源，第二核苷酸序列與PRAP1 基因外顯子3的3'端同源。如此，當靶向載體被導入細胞後，在此對重疊序列中間，靶向載體會透過同源重組以預先設計的順序連接在一起，而且透過在PRAP1 基因外顯子3的同源重組，他們會被插入基因體中。

根據本揭示內容的實施方式，外源核苷酸序列的插入導致PRAP1 基因的無意義突變。根據一特定實施方式，PRAP^-/- 小鼠的PRAP1 基因外顯子3包含序列編號：19之核苷酸序列。

在部分實施方式，相較於遺傳上未修飾的小鼠(即，WT小鼠)，本揭示內容的PRAP^-/- 小鼠表現較少的PRAP1蛋白，例如，相較於遺傳上未修飾的小鼠，該PRAP^-/- 小鼠可能少表現約99%至約50%(例如，99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、84%、83%、82%、81%、80%、79%、78%、77%、76%、75%、74%、73%、72%、71%、70%、69%、68%、67%、66%、65%、64%、63%、62%、61%、60%、59%、58%、57%、56%、55%、54%、53%、52%、51%或50%)的PRAP1蛋白。在部分較佳實施方式，本揭示內容的PRAP^-/- 小鼠不表現PRAP1蛋白。

根據本揭示內容的一個具體實施例，PRAP1的缺失降低脂質吸收，因此，相較於WT對照組小鼠(即，PRAP^+/+ 小鼠)，PRAP^-/- 小鼠具有較低的血漿TG與磷脂量，並在其糞便中有較高的脂質與卡路里含量。根據本揭示內容的部分具體實施例，WT對照組與PRAP^+/+ 小鼠均以高脂肪飲食(HFD)來餵食。

II-2. PRAP敲入小鼠

本揭示內容的另一態樣是關於被命名為「E85V敲入小鼠」的PRAP1敲入小鼠，E85V敲入小鼠包含編碼一修飾PRAP1多肽的一修飾PRAP1 基因。修飾PRAP1多肽包含與野生型(WT)PRAP1多肽一樣的胺基酸序列，不同之處僅在於修飾PRAP1多肽的胺基酸序列有一個胺基酸修飾。具體而言，與WT PRAP1多肽相比，修飾PRAP1多肽之胺基酸修飾為麩胺酸 (E)被纈胺酸(V)所置換，即，在WT PRAP1多肽中特定位置的一個「E」殘基，在修飾PRAP1多肽的相應位置處被換成一個「V」殘基。

目前已知小鼠PRAP1多肽由於不同的剪切，存在有兩種同功型(isoform)，包含同功型CRA a(基因銀行登錄號：EDL17907；序列編號：1)與同功型CRA b(基因銀行登錄號：EDL17908；序列編號：3)，其中胺基酸序列「GRV」存在於同功型CRA a(長度為152個胺基酸) 胺基酸序列的第45至47個位置，且不存在於同功型CRA b(長度為149個胺基酸)的胺基酸序列中。「GRV」序列的存在與否影響前述「E」殘基在WT PRAP1多肽中的位置(即，前述「E」殘基是在同功型CRA a胺基酸序列的第88個位置，且在同功型CRA b胺基酸序列是位於第85個位置)，也影響修飾PRAP1多肽中前述「V」殘基置換的相應位置。

如表1統整之，同功型CRA a具有序列編號：1的胺基酸序列。如此，修飾PRAP1多肽具有序列編號：1的胺基酸序列，其在88殘基處具有一個由V殘基置換E殘基的置換(E88V)。在本揭示內容中，帶有E88V突變之修飾PRAP1多肽被命名為「小鼠E88V突變體PRAP1」，並具有序列編號：2的胺基酸序列。

關於同功型CRA b，它具有序列編號：3的胺基酸序列。於此情況下，修飾PRAP1多肽具有序列編號：3的胺基酸序列，其中在85殘基處具有一個以V殘基置換E殘基的置換(E85V)。在本揭示內容中，帶有E85V突變之修飾PRAP1多肽被命名為「小鼠E85V突變體PRAP1」，且其具有序列編號：4的胺基酸序列。

表 1  小鼠PRAP1之胺基酸序列

名稱	胺基酸序列	序列編號
WT PRAP1 (同功型CRA a)	MKRFLLATCLVAALLWEAGAAPAHQVPVKTKGKHVFPEQETEKVGRVWDTRALEPLEKDNQLGPLLPEPKQKPAAAEEKRPDAMTWV E TEDILSHLRSPLQGPELDLDSIDHPMSDDVQDEEVPQSRPILYRQVLQGPEEDLDHLAHSMEDS	1
小鼠E88V突變體PRAP1	MKRFLLATCLVAALLWEAGAAPAHQVPVKTKGKHVFPEQETEKVGRVWDTRALEPLEKDNQLGPLLPEPKQKPAAAEEKRPDAMTWV V TEDILSHLRSPLQGPELDLDSIDHPMSDDVQDEEVPQSRPILYRQVLQGPEEDLDHLAHSMEDS	2
WT PRAP1 (同功型CRA b)	MKRFLLATCLVAALLWEAGAAPAHQVPVKTKGKHVFPEQETEKVWDTRALEPLEKDNQLGPLLPEPKQKPAAAEEKRPDAMTWV E TEDILSHLRSPLQGPELDLDSIDHPMSDDVQDEEVPQSRPILYRQVLQGPEEDLDHLAHSMEDS	3
小鼠E85V突變體PRAP1	MKRFLLATCLVAALLWEAGAAPAHQVPVKTKGKHVFPEQETEKVWDTRALEPLEKDNQLGPLLPEPKQKPAAAEEKRPDAMTWV V TEDILSHLRSPLQGPELDLDSIDHPMSDDVQDEEVPQSRPILYRQVLQGPEEDLDHLAHSMEDS	4

修飾PRAP1多肽 (即，小鼠E88V突變體與小鼠E85V突變體)與其所相應的WT PRAP1多肽(即，同功型CRA a與同功型CRA b)殘基中的置換均以粗體與下底線標示。

根據本揭示內容的部分實施方式，E85V敲入小鼠包含一修飾PRAP1 基因，其在選擇性剪接(alternative splicing)過程期間，編碼修飾PRAP1多肽的兩種同功型，其中，相較於WT PRAP1多肽同功型CRA a，修飾PRAP1多肽的第一種同功型包含含有一個E88V置換之序列編號：2的胺基酸序列，且，相較於WT PRAP1同功型CRA b，修飾PRAP1多肽的第二種同功型包含含有一個E85V置換的序列編號：4的胺基酸序列。

產生基因敲入小鼠的方法為本領域中具有一般知識者所習知。根據本揭示內容的部分實施方式，是透過CRISPR/Cas技術產生E85V敲入小鼠。具體而言，包含該突變的核苷酸序列被與PRAP1- 靶向之小嚮導RNA(small guide RNA，sgRNA)及Cas9 mRNA共同注射進入小鼠胚胎(例如，原核期之單細胞胚胎)，藉此產生該E85V敲入小鼠。

或者，如本文所揭露，在PRAP1多肽的遺傳突變(在同功型中之E85V或其等效物)可以在遺傳上突變的小鼠被有條件地敲入。本文所使用之「有條件敲入」意指該突變的PRAP1 基因只會表現在特定器官或組織。例如，突變的PRAP1 基因專一性地表現於遺傳上修飾小鼠的腸道(例如，在腸上皮細胞(intestinal epithelial cells，IECs))，而正常的PRAP1則表現與其他器官與組織。舉例來說，有條件之遺傳修飾的小鼠可以是可藉由建構一個可受四環素誘導的啟動子或一發育特定之啟動子以驅使PRAP1 基因表現而為可誘導的。使用可誘導啟動子可以允許在任何時間或在特定時間消除或抑制基因/蛋白質的表現。例如，以受四環素誘導之啟動子的例子來說，分娩後的任何時間都可以將四環素施用於非人類動物。如果非人類動物是在子宮中發育的，那麼可以通過在懷孕期間給予母體四環素來誘導啟動子。如果非人類動物是在卵中發育的，啟動子可以透過注射或是使卵置於四環素中來誘導。一旦四環素施予該非人類動物，四環素導致cre重組酶的表現，並導致目標基因的切除。cre/lox系統也可置於發育專一性啟動子的控制下。舉例來說，部分啟動子在出生後啟動，或甚至青春期開始後啟動。該等啟動子可以被用來控制cre重組酶的表現，因此可以被用於發育專一性剔除。可結合剔除技術的任何組合也是可以被合理預期的。例如，組織專一性剔除可以與誘導技術結合，產生組織專一性的、可誘導的剔除。此外，其他系統，諸如發育專一性啟動子，可以與組織專一性啟動子及/或可誘導剔除結合使用。

根據本揭示內容的一個具體實施例，PRAP1的缺陷降低脂質吸收，據此，相較於WT對照組小鼠(即，PRAP1^+/+ 小鼠)，E85V敲入小鼠具有較低的血漿TG與磷脂量，及在其糞便中較高的脂質與卡路里含量。根據部分實驗例，WT對照組小鼠與E85V敲入小鼠均以HFD餵食。

II-3.本揭示內容轉基因小鼠用於篩選治療藥物之用途

本揭示內容的轉基因小鼠，包含PRAP1^-/- 小鼠與E85V敲入小鼠，可用於各種目的。舉例來說，該轉基因小鼠可做為用於研究血脂異常(dyslipidemia)相關疾病以及/或是鑑別用於治療血脂異常及/或血脂異常相關疾病之候選藥物的疾病模型。

根據部分實施方式，該轉基因小鼠或自其所取得之細胞可以用於鑑別用於治療血脂異常及/或血脂異常有關之疾病的藥物。根據本揭示內容之任何態樣或實施方式，藉由使用轉基因小鼠來篩選用於治療血脂異常相關之疾病之藥物候選物的方法包括： (a) 對轉基因小鼠投予一或多種候選藥物；以及 (b) 由一或多種候選藥物中選擇藥物候選物，其中該藥物候選物改善轉基因小鼠與血脂異常相關之疾病有關的表現型。

根據部分實施方式，血脂異常相關的疾病為動脈粥狀硬化症、高脂血症、高三酸甘油脂血症或高膽固醇血症(hypercholesterolemia)。在該等實施方式中，以HFD或西方飲食(Western diet)餵食轉基因小鼠。HFD是指包含60%的能量是來自脂肪的飲食，例如，TESTDIET^® 58Y1。西方飲食是指包含17%千卡的蛋白質、40%千卡的脂肪、43%千卡的碳水化合物，能量密度為4.67千卡/克的飲食；西方飲食的例子包含市售的(Research Diets公司)配方飼料D12079B。在轉基因小鼠，含有高能量與脂肪的食物將導致與血脂異常相關之疾病(例如，高膽固醇血症、動脈粥狀硬化症)的發展。接著對具與血脂異常相關之疾病的轉基因小鼠投予候選藥物。可以在投予藥物之前、投予藥物期間與投予藥物之後監測與疾病相關之症狀的發展與變化。與疾病相關之一或多種症狀的減輕或改善表明該候選藥物對抗該疾病的潛在治療效果。

亦可以是，血脂異常相關之疾病為低脂血症(hypolipidemia)、低三酸甘油酯血症(hypotriglyceridemia)或無β脂蛋白血症(abetalipoproteinemia)。如前述，相較於WT對照組小鼠，本揭示內容之轉基因小鼠展現較低的血漿TG含量與磷脂含量，因此可以作為動物模型以鑑定用以增強脂質吸收及/或增加血漿TG與磷脂含量的候選藥物，藉以減輕及/或改善血脂異常相關疾病之有關症狀。可以在投予藥物之前、投予藥物期間與投予藥物之後監測與疾病相關症狀的發展與變化。與疾病相關之一或多種症狀的減輕或改善表明該候選藥物對抗該疾病的潛在治療效果。舉例來說，藥物候選物可能會增加轉基因小鼠的脂肪組織；增加轉基因小鼠的血漿脂質、磷脂、TG、apoB48及/或apoB100的含量；及/或減少在轉基因小鼠之糞便中脂質或卡路里的含量。

候選藥物可以是任何形式的分子，例如，蛋白質、多肽、胜肽、核酸、寡核苷酸、脂質、醣類、多醣或小分子。在部分例子，候選藥劑是小分子化合物，其具有小於2,500道爾吞的分子量。

候選藥物可由多種來源獲得，包含合成或天然化合物的資料庫。例如，許多手段可用於多種有機化合物和生物分子的隨機和定向合成，包括隨機寡核苷酸和寡肽的表現。抑或是可取得或能輕易產生之細菌、真菌、植物和動物萃取物形式的天然化合物資料庫。此外，天然或合成產生的資料庫和化合物可通過常規化學、物理和生化手段輕易地修飾，並可用於產生組合資料庫。

較佳地，前述篩選將包括負對照組(例如，不含化合物)和正對照組(例如，已知對疾病有治療作用的化合物)。

II-4. 高脂血症或高脂血症相關疾病的治療方法

本揭示內容還關於一種治療高脂血症或與高脂血症相關之疾病的方法。該方法包含對個體投予一有效量的PRAP1抑制劑、修飾的PRAP1多肽或編碼修飾的PRAP1多肽之核酸。

取決於期望目的，PRAP1抑制劑可以是反義寡核苷酸、PRAP1靶向之小干擾RNA，或對PRAP1的表現及/或活性表現出抑制或壓制作用的任何其他分子。

在本揭示內容中，修飾的PRAP1多肽包含與WT PRAP1多肽相同的胺基酸序列，除了在其胺基酸序列中有一胺基酸修飾之外。具體來說，相較於WT PRAP1多肽，修飾的PRAP1多肽的胺基酸修飾是以纈胺酸(V)置換麩胺酸(E)，即，在WT PRAP1多肽特定位置的「E」殘基，在修飾的PRAP1多肽的對應位置被改變成為「V」殘基。

根據部分實施方式，個體為小鼠，其中，將具有序列編號：1之胺基酸序列並帶有一E88V置換(即，序列編號：2之小鼠E88V突變PRAP1)之修飾的PRAP1多肽，或是具有序列編號：3之胺基酸序列並帶有一E85V置換(即，序列編號：4之小鼠E85V突變PRAP1)之修飾的PRAP1多肽投與至該個體，藉此在個體中引起治療效果。

根據替選實施方式，個體為人類。與本揭示內容II-2 小節所述的小鼠的PRAP1多肽相似，由於選擇式剪接的過程，在人體內鑑別出PRAP1多肽的兩種轉錄本變異體，包含人類PRAP1轉錄本變異體1(基因銀行登錄號：NP_660203；序列編號：5)以及人類PRAP1轉錄本變異體2(基因銀行登錄號：NP_001138673；序列編號：7)。如表2，胺基酸序列「QGRGPILPG」(序列編號：9)存在於轉錄本變異體1胺基酸序列(長度為151個的胺基酸殘基)之第80至88個位置，且不存在於轉錄本變異體2的胺基酸序列 (長度為142個的胺基酸殘基) 中。「QGRGPILPG」(序列編號：9)序列存在與否影響在WT PRAP1多肽的前述「E」殘基的位置(即，該「E」殘基位於轉錄本變異體1之胺基酸序列的第94個位置，且位於轉錄本變異體2之胺基酸序列的第85個位置)，以及在修飾的PRAP1多肽中之前述「V」殘基置換的對應位置。

具體來說，PRAP1轉錄本變異體1具有序列編號：5的胺基酸序列。在此情況下，修飾的PRAP1多肽具有序列編號：5的胺基酸序列，另在第94個殘基位置，將E殘基置換成V殘基(E94V)。在本揭示內容中，帶有E94V突變的修飾的PRAP1多肽被命名為「人類E94V突變體PRAP1」，並具有序列編號：6的胺基酸序列。

PRAP1轉錄本變異體2具有序列編號：7的胺基酸序列。在此情況下，修飾的PRAP1多肽具有序列編號：7的胺基酸序列，另在第85個殘基位置將E殘基置換成V殘基(E85V)。在本揭示內容中，帶有E85V突變的修飾的PRAP1多肽被命名為「人類E85V突變體PRAP1」，並具有序列編號：8的胺基酸序列。

表 2  人類PRAP1的胺基酸序列

名稱	胺基酸序列	序列編號
WT PRAP1 (變異體1)	MRRLLLVTSLVVVLLWEAGAVPAPKVPIKMQVKHWPSEQDPEKAWGARVVEPPEKDDQLVVLFPVQKPKLLTTEEKPRGQGRGPILPGTKAWM E TEDTLGHVLSPEPDHDSLYHPPPEEDQGEERPRLWVMP NHQVLLGPEEDQDHIYHPQ	5
人類E94V突變體PRAP1	MRRLLLVTSLVVVLLWEAGAVPAPKVPIKMQVKHWPSEQDPEKAWGARVVEPPEKDDQLVVLFPVQKPKLLTTEEKPRGQGRGPILPGTKAWM V TEDTLGHVLSPEPDHDSLYHPPPEEDQGEERPRLWVMPNHQVLLGPEEDQDHIYHPQ	6
WT PRAP1 (變異體2)	MRRLLLVTSLVVVLLWEAGAVPAPKVPIKMQVKHWPSEQDPEKAWGARVVEPPEKDDQLVVLFPVQKPKLLTTEEKPRGTKAWM E TEDTLGHVLSPEPDHDSLYHPPPEEDQGEERPRLWVMPNHQVLLGPEEDQDHIYHPQ	7
人類E85V突變體PRAP1	MRRLLLVTSLVVVLLWEAGAVPAPKVPIKMQVKHWPSEQDPEKAWGARVVEPPEKDDQLVVLFPVQKPKLLTTEEKPRGTKAWM V TEDTLGHVLSPEPDHDSLYHPPPEEDQGEERPRLWVMPNHQVLLGPEEDQDHIYHPQ	8

修飾PRAP1多肽 (即，人類E94V突變體與人類E85V突變體PRAP1)與其所相應的WT PRAP1多肽(即，轉錄本變異體1以及轉錄本變異體2)殘基中的置換均以粗體與下底線標示。

在以人類為個體的實施方式中，對個體投予具有序列編號：6或8的胺基酸序列之修飾的PRAP1多肽，用以降低在個體血液中脂質(例如，總脂質含量、磷脂及/或TG)的量，及/或減輕或改善與高脂血症相關之疾病有關的症狀。

根據期望目的，可以透過適合的途徑將該修飾的PRAP1多肽投予個體，例如，口服的、經鼻的或非經口的注射，像是，皮下的(subcutaneous)、靜脈的(intravenous)、動脈內的(intra-arterial)、肌肉內的(intramuscular)或腹膜內的(intraperitoneal)注射。根據一具體實施例，該修飾的PRAP1多肽是口服投予至個體。

可以透過傳統的重組技術來生產本揭示內容之修飾的PRAP1多肽。舉例來說，可使用PCR技術或是本技術領域中具有通常知識者所熟知的任何其他方法或程序來製備包含修飾的PRAP1多肽之編碼序列的核酸。所得之核酸分子可以被插入至適合的表現載體，使被編碼的重組蛋白得以在適合的宿主中表現。在部分實施方式中，表現載體可能會包含其他額外序列，讓該載體在原核或真核細胞中適於複製及整合。額外或替代地，該表現載體可能包含轉錄及轉譯起始序列(initiation sequences)(例如，啟動子或強化子)以及轉錄及轉譯終止子(例如，多腺苷酸化訊號)。示例性的表現載體包含，但不限於：細菌表現載體、酵母菌表現載體、桿狀病毒表現載體與哺乳類表現載體。編碼該修飾的PRAP1多肽的任何核酸，包含該核酸的載體(例如，表現載體)和包含該載體的宿主細胞亦屬於本揭示內容之範疇內。

多種原核或真核細胞可用作宿主-表現系統以表現該修飾的PRAP1多肽。表現系統的例子包括但不限於微生物，像是細菌，酵母菌、植物細胞、真核細胞(例如哺乳類細胞或CHO細胞)等。用來將表現載體轉導進入宿主-表現系統中的方法已為本領域技術人員所習知，例如穩定或瞬時(transient)轉染(transfection)、脂質轉染(lipofection)、電穿孔(electroporation)和以重組病毒載體感染。

II-5. 藥學組成物

本揭示內容還提供一種用於治療疾病(例如血脂異常相關之疾病)的藥學組成物。該藥學組成物包含一第一修飾的PRAP1多肽與一藥學上可接受的賦形劑，其中該第一修飾的PRAP1多肽為本揭示內容於II-2 與II-4 小節所述的小鼠E88V突變體PRAP1(序列編號：2)、小鼠E85V突變體PRAP1(序列編號：4)、人類E94V突變體PRAP1(序列編號：6)或人類E85V突變體PRAP1(序列編號：8)的任一種。

為了增進治療效果，在該第一修飾的PRAP1多肽之外，該藥學組成物更包含一第二修飾的PRAP1多肽，其選自由小鼠E88V突變體PRAP1(序列編號：2)、小鼠E85V突變體PRAP1(序列編號：4)、人類E94V突變體PRAP1(序列編號：6)或人類E85V突變PRAP1(序列編號：8)所組成的群組，其中該第一修飾的PRAP1多肽與該第二修飾的PRAP1多肽不同。例如，該藥學組成物可包含小鼠E88V突變體PRAP1作為該第一修飾的PRAP1多肽，以及小鼠E85V突變體PRAP1作為該第二修飾的PRAP1多肽，藉此增進在小鼠個體的治療效果。或者，該藥學組成物可以包含人類E94V突變體PRAP1作為該第一修飾的PRAP1多肽，以及人類E85V突變體PRAP1作為該第二修飾的PRAP1多肽，藉此增進在人類個體的治療效果。

該藥學組成物可以被配製為固體、半固體或液體形式，像是錠劑、膠囊、粉劑、顆粒、軟膏(ointment)、溶液、栓劑(suppository)和注射劑。如此，可以不同的方式達成修飾的PRAP1多肽之投予，包含口服、口頰、直腸、非經口/腸胃道外(parenteral)、腹膜內等投予方式。適用於每種途徑的各種劑型為本領域中具有一般知識者所熟悉。要注意的是，在任何給定的情況下，最合適的途徑將取決於所治療疾病或病症的性質或嚴重性。

在部分實施方式，本揭示內容的藥學組成物是用於口服投予的固體劑型。這樣的固體劑型可以是膠囊、袋型粉劑(sachet)、錠劑、藥丸，口含錠(lozengens)、粉劑或顆粒。於該等形式，諸如任何前述之化合物的活性成分可與至少一種藥學上可接受的賦形劑混合。任何揭露之固體劑型可視需求地包含膜衣或外殼，像是腸溶衣(enteric coating)，以及用於改變任何成分之釋放速度的膜衣。該等膜衣的例子於本技術領域中已為通常知識。口服用途之製劑也可以硬質明膠膠囊的形式存在，其中活性成分與惰性固體稀釋劑，例如碳酸鈣、磷酸鈣或高嶺土，混合，或者也可以軟質明膠膠囊的形式存在，其中活性成分和可與水混溶之溶劑，例如丙二醇、聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)及乙醇，或與油性介質，例如花生油，液態石蠟或橄欖油，混合。

在部分實施方式，本揭示內容的藥學組成物是用於口服投予的液體劑型。液體製劑可進一步包含緩衝劑以維持所欲之pH值。液體製劑可能被填充於軟質明膠膠囊。例如，其液體可包含溶液、懸浮液、乳液、微乳液(micro-emulsion)、析出物或攜帶前述任何化合物、或藥學上可接受的衍生物、鹽類或其溶劑合物、或其組合的任何所需之液體介質。其液體可以被設計來改善如前述之活性化合物的溶解度，以在釋放時形成含有藥物的乳劑或分散相。

在部分實施方式，本揭示內容的藥學組成物是適於非經口投予的劑型，例如透過注射投予，此注射包含，但不限於皮下的、肌肉內的、腹膜內的及靜脈的注射。該藥學組成物可以配製成在油性或水性賦形物(vehicle)中的等張懸浮液、溶液或乳劑，並且可以包含處方藥劑，例如懸浮劑、穩定劑或分散劑。或者是，該組成物可以製成乾燥形式，例如粉末、晶體或冷凍乾燥的固體，並附與使用前為無菌且無熱原(pyrogen-free)的水或等張生理食鹽水。組成物亦可置於無菌的安瓿瓶或小藥瓶中。當修飾的PRAP1多肽被配製為透過非經口途徑投予時，該多肽為一無熱源、非經口可接受水性溶液的形式。本領域之技術範圍涵蓋，有適當考慮到pH、等張性、穩定性及其類似性質的非經口可接受多肽之製備。除了修飾的PRAP1多肽之外，用於非經口投予的較佳藥學組成物還應包含等張賦形物，例如氯化鈉注射液、林格氏注射液、右旋糖注射液、右旋糖及氯化鈉注射液、乳酸林格氏注射液或其他本領域習知的賦形物。本發明的藥學組成物還可以包含穩定劑、防腐劑、緩衝劑、抗氧化劑，或其本領域習知的添加物。

可為本揭示內容之修飾的PRAP1多肽、藥學組成物及/或方法治療的個體為哺乳類，例如，人類、小鼠、猴子、大鼠、貓、狗、綿羊、山羊或兔子。較佳地，個體為人類。

以下的實施例是來說明本發明中的某些態樣，以利本發明所屬技術領域中具有通常知識者實施本發明。不應將這些實施例視為對本發明範圍的限制。無須進一步說明，據信所屬技術領域中具有通常知識者可根據上述描述，最大限度地利用本發明。本文所提到的全部公開文獻係藉由引用而將其全文併入。

實施例

材料及方法

產生PRAP1剔除(PRAP1^-/- )與E85V敲入小鼠

為產生PRAP1^-/- 小鼠，首先從129/Svj小鼠基因體庫中分離出兩個帶有Prap1 基因體之基因座的重疊基因體片段，並用於構建靶向載體。該靶向載體是藉由PCR輔助選殖而建構的，其方式為，在同源重組後，與側位的(floxed)Neo標記(LacZ-Neo卡匣；序列編號：18)連接的LacZ報導基因則被插至PRAP1 基因座的外顯子3(第1A圖)中。將該靶向載體以電穿孔方式送入R1胚胎幹細胞，並使用適當的探針進行南方墨點法以篩選已經在Prap1 基因座同源重組的細胞殖株。將帶有突變等位基因的兩正向細胞殖株：#159及#318顯微注射到C57BL/6小鼠之胚囊中以產生嵌合小鼠。

其雄性嵌合小鼠與雌性C57BL/6小鼠回交(backcross)以產生PRAP1^+/- 小鼠。對與C57BL/6背景品系回交10代以上之PRAP1^+/- 小鼠進行異質雜交(intercross)以產生本研究之PRAP1^+/+ 小鼠(同窩對照組(littermate control))與PRAP1^-/- 小鼠(剔除)。從小鼠尾巴中分離出基因體DNA，藉由PCR進行基因分型。以p1(5’-TCCAGCACACCAGGTATGCAAGG-3’；序列編號：10)與p3(5’-AGGGTCCTCAAGGGCAAGGGAGT-3’；序列編號：11)作為野生型等位基因的PCR引子，並以p1與p2(5’-TCGATAGCTTGGCTGCAGGTCG-3’；序列編號：12)作為突變等位基因的PCR引子。根據序列分析，LacZ-Neo卡匣(序列編號：18)被插在PRAP1 基因的外顯子3(序列編號：20)之第20個位置的「G」核苷酸殘基與第21個位置的「C」核苷酸殘基之間；以此獲得之PRAP1^-/- 小鼠的外顯子3包含序列編號：19的核苷酸序列。

執行CRISPR/Cas介導之基因體工程系統來產生E85V敲入突變小鼠。簡言之，在單鏈突變DNA寡聚體(5’-GTGGGAAGGATCTTGTGAGGGAGGCTATATCTACGTCTCCTTCTCCACAGATGCCATGACA TGGGTA GT GACTGAGGATATCCTGAGCCATCTTCGCAGTCCTCTTCAGGGTCCAGAACTGGATCTTGA-3’；序列編號：13；突變位點以下底線標示)、PRAP1 靶向之sgRNA(靶向位置：5’-GATATCCTCAGTCTCCACCC-3’；序列編號：14)及Cas9 mRNA共同注射進入原核期之單細胞C57BL/6小鼠胚胎後，透過同源導向修復介導的基因體編輯，將E85V突變引入PRAP1 基因。藉由對所產生之23隻小鼠的PCR基因分型與基因體定序，分別發現有四隻(＃6、＃8、＃15與＃19)小鼠攜帶雙等位基因突變，而有五隻(＃2、＃4、＃13、＃14與＃18)小鼠攜帶單等位基因突變。隨後將＃2(單等位基因)和＃19(雙等位基因)小鼠分別與C57BL/6小鼠交配以產生PRAP1^+/E85V 小鼠。對PRAP1^+/E85V 小鼠進行異質雜交以產生本研究之PRAP1^+/+ (同窩對照組)以及PRAP1^E85V/E85V (命名為E85V小鼠)。來自兩個品系(＃2和＃19)的E85V小鼠表現出非常相似的表現型，並以統計學分析一起進行分析(每個品系約50％)。PRAP1-I3-F (5’-TACCTACTCCCTTGCCCTTG-3’；序列編號：15)與PRAP1-反向(5’-CAGTCTCCACCCAGGTCATG-3’；序列編號：16)作為野生型等位基因的PCR引子，而PRAP1-I3-F與E85V-反向(5’-CAGTCACTACCCATGTCATG-3’；序列編號：17) 作為突變等位基因的PCR引子。

小鼠被飼養在具有12小時光/暗週期(在上午7:00亮燈)的房間中，可以隨意獲取食物和水。除非另有說明，否則在所有研究中使用的雄性小鼠為8至12週齡。所有動物實驗均按照中央研究院實驗動物保護與使用委員會所制定的指導原則進行。

來自細菌之重組PRAP1的誘發突變、生產與純化

pGEX4T-1-PRAP1△N20是一種細菌表現載體，其主掌缺少N端20個胺基酸之訊號肽(PRAP1△N20)C端融合至麩胱甘肽S-轉移酶(GST)蛋白的PRAP1合成。另外以標準的PCR輔助誘發突變耦合選殖方法(PCR-assisted mutagenesis-coupled cloning method)採用pGEX4T-1-PRAP1△N20為模板，來建構表現多種PRAP1突變體(例如，E38V、E51、54V等)的其他細菌表現載體(也在pGEX4T-1載體中)。pGEX4T-1-PRAP1 21-40、pGEX4T-1-PRAP1 21-76與pGEX4T-1-PRAP1 21-110是額外的細菌表現載體，該些細菌表現載體主掌N端GST標籤之PRAP1突變體的合成，該突變體所涵蓋PRAP1的胺基酸殘基如其名稱所示。

為純化重組PRAP1△N20(在本實施例中稱為WT rPRAP1)與前述各種其他突變體，使用麩胱甘肽SEPHAROSE^® 4B珠粒純化細菌產生的GST融合蛋白，並用凝血酶(thrombin)進行切除以移除GST部分，然後藉由添加苯甲基磺醯氟(phenylmethylsulfonyl，PMSF)達到最終濃度為1 mM之PMSF使凝血酶失去活性。除非另有說明，否則本實施例中提及的所有重組PRAP1(無論具有或不具有GST標籤的WT或突變體)均指沒有N端20個胺基酸訊號肽的蛋白質。

小腸脂質吸收之測量

僅在晚上7點至早上7點間提供食物給受測小鼠，為期三天。在第四天晚上7點，對小鼠靜脈注射對體重每公斤500毫克(mg/kg)的泰洛沙泊(以阻礙富含三酸甘油脂(TG)之脂蛋白的水解)，隨後胃內推注0.5 ml含有5 µCi之[¹⁴ C]-三油酸酯與1 μCi之[³ H]-β-穀固醇(作為對照組，因為它幾乎不能被小腸吸收)的玉米油。1至3小時後，收集小腸中段部分，測量在細胞裂解物中的放射性含量，並測定[¹⁴ C]/[³ H]的放射性比率並作圖。在某些情況下，在投予脂質後的1至3小時收集血液樣品，並測定全血中[¹⁴ C]-三油酸酯衍生之放射性。為了計算小腸或血液樣本中的放射性，組織樣本在添加閃爍液(scintillation cocktail)之前先被溶解。

脂質結合分析

以緩衝溶液A(50 mM、pH7.4的Tris-HCl與150 mM 之NaCl)沖洗與麩胱甘肽SEPHAROSE^® 4B珠粒結合之約0.7 μg的GST或GST-PRAP1蛋白(除非另有說明，否則WT或突變體均不含訊號肽)三次，然後重新懸浮於含有所指數量之[³ H]-TG的100 μL緩衝溶液A中。在室溫(room temperature，RT)下反應4小時後，將珠粒以800 μL緩衝溶液A離心沖洗三次，然後重新懸浮於500 μL緩衝溶液E(10 mM、pH 7.4之Tris-HCl、150 mM之NaCl、1 mM之EDTA以及1％TRITON^TM X-100)內，並使用閃爍計數器(scintillation counter)分析保留下來的放射性。

密度梯度超高速離心

以apoB48、MTTP跟PRAP1-WT或E85V表現載體一起對海拉細胞株(在6公分盤中6 × 10⁵ 個細胞)共轉染。24小時後，吸出培養基，用4.5 ml富含脂質的培養基(含有1％無脂肪酸的牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)、0.8 mM油酸鈉、1 mM甘油與0.05 mg/ml膽固醇的達爾伯克氏必需基本培養基(Dulbecco's modified Eagle medium，DMEM))替換，再培養24小時。收取後，培養基被調整為含有1 mM之PMSF、0.02%之EDTA、0.02%之NaN₃ 與蛋白酶抑制劑，並且以1200 rpm離心5分鐘以移除細胞碎片。以密度梯度超高速離心分離條件培養基中的含apoB的脂蛋白。簡言之，被固態KBr(0.565 g) 將其密度調整為1.12 g/ml的4 ml培養基，在離心管中依順序被以密度為1.063 g/ml者3 ml、密度為1.019 g/ml者3 ml與密度為1.006 g/ml者的2 ml溶液覆蓋。在以40,000 rpm，在15°C下離心33分鐘後，收集上端的1 ml作為區分部分1。該梯度之後被以密度為1.006 g/ml者2 ml的溶液覆蓋。隨後以40,000 rpm，15°C下離心3小時又30分鐘後，收集上端的1 ml作為區分部分2。以密度為1.006 g/ml之1 ml溶液覆蓋該試管，然後，以40,000 rpm，在15°C下離心17小時。從上端收集其他脂蛋白至12個一毫升的區分部分。接著處理各區分部分的蛋白質，藉由冷的丙酮沉澱蛋白質以移除脂質。被沉澱的蛋白以包含20 mM之Tris、1 mM之EDTA、1%之SDS、pH為7.4的緩衝溶液重新懸浮，隨後進行SDS-PAGE並使用MTTP、apoB與PRAP1專一之抗體的免疫墨點分析。

血漿脂蛋白之分級分離

以快速蛋白質液相層析(fast protein liquid chromatography，FPLC)分離來自指定基因型(300 μl)(實際注射進樣量200 μl)三隻小鼠的合併血漿。在含有0.01%之EDTA與0.02%之NaN₃ 之磷酸鹽緩衝生理鹽水(phosphate-buffered saline，PBS)中進行洗脫，對每一區分部分收集約0.6 ml。收集區分部分12至31進行脂質和蛋白質分析。在部分狀況，藉由密度梯度超高速離心對來自所指基因型之3至5隻小鼠的合併血漿(0.6至1 ml)進行分級分離。簡言之，用固體NaCl(140.4 mg)將1 ml血漿調整到密度為1.10 g/ml，並在離心管中與3 ml密度為1.1 g/ml之NaCl混合。將由3 ml密度為1.065 g/ml之NaCl、3 ml密度為1.02 g/ml之NaCl和2 ml密度為1.006 g/ml之NaCl所組成的密度梯度依次置於血漿頂部。以40,000 rpm，15°C下離心33分鐘後，收集上端的1 ml作為區分部分1(大乳糜微粒，密度約為0.96 g/ml)。該梯度之後被以密度為1.006 g/ml之1 ml的溶液覆蓋，並再次以40,000 rpm離心3小時及30分鐘(15°C)。收集上端的1 ml作為區分部分2(小乳糜微粒)。以密度為1.006 g/ml的溶液補充該梯度，並再次離心(40,000 rpm，15°C，17小時)。收集上端1 ml作為區分部分3(VLDL大小的顆粒)。收集將其餘的梯度成為10個一毫升的區分部分。

彈式熱量測定法(Bomb calorimetry)

從單獨飼養的小鼠收集過去48小時內的糞便，在60°C下乾燥兩天，均質化並使用半微型氧氣彈式熱量計(semimicro oxygen bomb calorimeter)進行一式三份(每份0.2 μg)的分析。然後計算乾重之每克的能量含量。

糞便脂質含量之測定

從單獨飼養的，已經以HFD餵食兩週的小鼠收集過去2至4天內的糞便。

動物研究

同時對由8週齡起開始HFD的野生型C57BL/6小鼠(對每一群體，n = 10)口服投予rE85V蛋白(序列編號：4；10 mg/Kg，每天一次)，或只口服投予賦形物(PBS)。一週後，測量體重增長(相對於初始體重之百分增長率)。在HFD的第5至9天，收集糞便並測定總糞便脂質含量。

統計學

使用t檢定對兩組進行比較，或者使用單因子變異數分析(one-way analysis of variance)(杜凱氏事後檢驗)以軟體比較多個實驗群體，來進行統計分析

實施例 1  PRAP1缺陷小鼠表現出小腸的長度增加

小鼠PRAP1 基因編碼149個胺基酸(amino acid，aa)的富含脯胺酸之酸性多肽，其帶有20個推定為訊號肽的胺基酸。透過使用編碼C端有HA或旗標(FLAG)標籤之PRAP1的表現載體所進行的瞬時轉染分析，則揭露出帶有兩種標籤的分子都被外泌到轉染細胞的培養基中，這顯示PRAP1是外泌的蛋白(數據未呈現)。

為了勾勒出PRAP1的生理功能，藉由傳統的基因靶向(gene-targeting)方法(第1A圖)產生PRAP1 KO小鼠(PRAP1^-/- )。第1B圖中的數據證實PRAP1^-/- 小鼠無法表現PRAP1蛋白。同型合子(homozygous)突變體以預期中的孟德爾頻率產生，且牠們肉眼外型上看似正常(數據未呈現)。在正常的飲食中，PRAP1^-/- 小鼠增加的體重與對照組小鼠所增加的體重非常相似(數據未呈現)。以PRAP1專一抗體對來自對照組小鼠之小腸切片的免疫組織化學分析顯示，PRAP1蛋白表現在幾乎所有上皮細胞譜系中(數據未呈現)。在剔除小鼠，PRAP1的上皮專一性表現被完全消除(數據未呈現)。藉由使用增生標記物(Ki-67)(數據未呈現)或各種細胞譜系之標記物(數據未呈現)的組織切片染色顯示，PRAP1的缺陷並未顯著影響小腸上皮的整體形態、增生或分化。以溴脫氧尿苷(bromodeoxyuridine，BrdU)對小鼠的脈衝標記(pulse-labeling)也顯示腸上皮細胞(intestinal epithelial cell，IEC)的遷移在對照組與PRAP1^-/- 小鼠間沒有顯著差異(數據未呈現)。然而，有趣的是，PRAP1^-/- 小鼠的小腸長度被觀察到明顯長於對照小鼠的小腸長度(第1C圖)。

實施例 2  PRAP1與MTTP交互作用並促進MTTP介導之脂質轉移及apoB48外泌

為了探索PRAP1的功能，使用缺乏N端20個aa訊號肽且含GST標籤的重組PRAP1(GST-PRAP1△N20)，以及從PRAP1^-/- 小鼠之IEC製備的細胞裂解物來進行沉降分析(pull-down assay)。被GST-PRAP1△N20所沉降之蛋白的質譜分析顯示MTTP是與PRAP1交互作用的首要候選物。無論使用PRAP1或MTTP專一性抗體進一步進行免疫共沉澱法(co-immunoprecipitation，co-IP)證實在來自對照組IEC中的PRAP1可以與MTTP在內源性量之下進行免疫共沉澱(第2A圖)，而來自E85V敲入突變體小鼠IEC中的PRAP1則無法達成。免疫染色證實，PRAP1與MTTP部分地都位於在腸道上皮的內質網(endoplasmic reticulum，ER)處(以鈣聯結蛋白(calnexin)為標記物)(數據未呈現)。該結果促使檢視PRAP1是否能夠調節MTTP的脂質轉移活性。儘管兩種基因型的腸道細胞中MTTP量非常相似(第2D圖)，但第2B與2C圖的數據指出，與來自對照小鼠的細胞相比(比較第2B和2C圖中的第一長條和第二長條)，來自PRAP1^-/- 小鼠的IEC展現出顯著降低的三酸甘油脂(TG)和磷脂轉移活性。有趣的是，缺乏N端訊號肽(即PRAP1△ N20，此後稱為WT rPRAP1)的重組PRAP1(rPRAP1)可以挽回在PRAP1^-/- IEC中MTTP的TG與磷脂之轉移活性，其中最大活性可以達到使用對照組IEC裂解物(第2B與2C圖)時所觀察到的非常相似之量。藉由使用這樣的分析，辨認出在位置85之麩胺酸(Glu)殘基對於PRAP1促進MTTP脂質轉移功能非常重要，如同在PRAP1△ N20中該殘基的突變為纈胺酸(Val)(E85V)顯著地減弱在活體外(in vitro )MTTP轉移TG(第2E與2G圖)與磷脂(第2F與2H圖)兩者的活性。

然後，使用表現內源性蛋白質二硫鍵異構酶(protein disulfide isomerase，PDI)的海拉細胞株來檢視PRAP1對MTTP介導之apoB48組裝和外泌的影響。結果顯示出，PRAP1的共表現確實加強MTTP介導的apoB48進到培養基之外泌(數據未呈現)。與活體外分析結果一致，在此以細胞為基礎的分析中，PRAP1的E85V突變體對促進apoB48的外泌展現出較弱的活性(數據未呈現)。透過密度梯度超高速離心對培養基進一步分級分離揭示，在此瞬時表現系統中，當PRAP1在同樣的細胞中與apoB48共表現時(數據未呈現)，apoB48被外泌到HDL(高密度脂蛋白，high-density lipoprotein)大小的區分部分。

實施例 3  PRAP1與TG結合並以三元複合物(ternary complex)與MTTP交互作用

接下來，在本實施例中檢驗PRAP1是脂質結合蛋白的假設。第3A與3B圖的數據指出GST-PRAP1△N20(標記為GST-WT)確實以可飽和的方式與³ H標記的TG結合(第3A圖)，而且在胺基酸第40個殘基至其C端之間的區域似乎對於TG結合很重要(第3B圖)。值得注意的是，在全長的重組蛋白(標記為PRAP1-FL)中，訊號肽的存在並不會進一步增加PRAP1△N20的脂質結合活性(比較第3B圖中的PRAP1-FL和PRAP1△N20)。有趣的是，雖然保留類似WT之活性的PRAP1突變體(E118-119V突變體)在促進MTTP介導之脂質轉移中表現出與WT蛋白相似的脂質結合特性，但E85V突變體表現出獨特的特性，與WT或E118-119V突變體相比(第3A圖)，E85V突變體與TG的結合能力顯著地增加。

使用過量無標記脂質的進一步競爭實驗揭示，磷脂(phospholipid，PL)可以顯著地與TG競爭對於PRAP1的結合(第3C圖)，表明PRAP1對於這兩種脂質的結合位點彼此顯著地重疊。值得注意的是，在此分析(第3C圖)，並未能觀察到二酸甘油酯(diacylgyceride，DG)、膽固醇(cholesterol)或膽固醇油酸酯(cholesteryl oleate，CE)的顯著或邊際競爭(marginal competition)。

E85V突變體以比WT對照組更強的能力去結合TG(相較於第3A圖中描繪的GST-E85V與GST-WT)，但E85V突變體無法促進MTTP的脂質轉移活性(第2E至2H圖)。這些結果顯示出一個可能性，MTTP可能會將結合PRAP1的TG辨認為貨物(cargo)，然後將TG轉運至像是apoB的脂質受體，而且，與E85V結合的脂質並不如與WT蛋白結合的脂質那麼地易於被MTTP接近。如果這樣的模型是正確的，一種含有MTTP和負載脂質之PRAP1的三元複合物應該要可以被檢測到，但E85V的突變將大大損害這種三元複合物的形成。為了檢驗此一假設，來自海拉細胞株受免疫沉澱之帶有旗標標籤的MTTP被拿來與重組WT(GST-WT)，或與有預載、或與無預載增加劑量的³ H標記之TG的PRAP1之E85V突變體(GST-E85V)結合。此分析包括在上述各種分析中表現類似於WT蛋白的PRAP1之E118-119V突變體。第3D圖的數據指出，相較於在含有GST-E85V的反應中，在含有GST-WT或GST-E118-119V的結合反應中，顯然有較多³ H標記之TG與帶有旗標標記之MTTP共沉澱。而且，有脂質(在分析條件下為40至80 pmol的³ H-TG)時，相較於GST-E85V，顯然有較多GST-WT或GST-E118-119V與帶有旗標標記之MTTP共沉澱，但沒有脂質時卻並非如此(第3E圖)。與此結果一致，MTTP抗體可以與內源性WT免疫共沉澱，但無法與在IEC裂解物中PARP1之E85V突變體免疫共沉澱(第2A圖)。

綜上，該等結果支持PRAP1與TG交互作用的模型，在MTTP轉移反應期間，此交互作用讓TG更可被MTTP接近。

實施例 4  PRAP1在小鼠促進脂質吸收、apoB的組裝與外泌

在此實施例，檢視PRAP1是否與小鼠的脂質吸收有關。第4A與4B圖的數據表明，推注脂質的口服投予後兩小時，與對照組小鼠相比(第4A圖)，在PRAP1^-/- 小鼠的小腸組織中檢測到明顯更多的脂質，然而，相比於對照組小鼠(第4B圖)，PRAP1^-/- 小鼠在血液中可檢測到的來自[¹⁴ C]-三油酸酯之放射性則低得多。與此結果一致，在投予脂質4小時後，從PRAP1^-/- 小鼠收集的血漿不如從對照組小鼠收集的血漿那麼地乳白色(第4C圖)，表明PRAP1缺陷降低脂質吸收。

接下來，由於MTTP對於含有apoB之脂蛋白的生物合成是必要的，因此檢驗PRAP1是否會影響apoB的組裝以及從兩種主要生產apoB之細胞類型的外泌。短暫標記與放射標記實驗揭示，相比於對照組小鼠(第4D圖)，來自PRAP1^-/- 或E85V突變體小鼠之經純化所得之初級IEC中，新合成之apoB48的合成與外泌有顯著的降低，儘管PRAP1缺陷或E85V突變並沒有顯著影響apoB之mRNA的表現(數據未呈現)。在使用初級肝細胞的實驗中觀察至類似的結果，與對照組細胞相比，由PRAP1^-/- 和E85V突變體之肝細胞合成和外泌的apoB48和apoB100明顯更少(第4E與4F圖)。

接下來，檢查小鼠之血漿中apoB的含量與脂質化，其中小鼠被禁食16小時，然後被靜脈注射泰洛沙泊(一種脂蛋白脂肪酶抑製劑)，並被胃內推注含有因特立滋(Intralipid)與玉米油的脂質乳劑。使用FPLC對投予脂質4小時後之小鼠血漿的分級分離揭示，相較於來自對照組小鼠血漿之相同區分部分(圖5A至5C)，明顯較少的apoB48和apoB100分布在PRAP1^-/- 小鼠血漿之富含CM/VLDL的區分部分(圖5A至5C中區分部分14至16)。以密度梯度超高速離心從禁食16小時的小鼠中進一步分離血漿顯示，PRAP1缺陷會稍微減少apoB的脂化與外泌到肝的VLDL中(數據未呈現)，表明肝臟中很低的PRAP1量仍然對MTTP介導的apoB組裝與外泌有所影響。使用來自投予脂質3小時後之小鼠血漿的額外之類似分級分離實驗表明，E85V突變體小鼠展現出與PRAP1^-/- 小鼠非常類似的表現型，即，與對照血漿相比(第6A至6D圖)，明顯較少的apoB48、apoB100與TG分布在PRAP1^-/- 及E85V突變體小鼠血漿之富含CM/VLDL的區分部分(區分部分1至3)。

值得注意的是，在第5圖與第6圖所呈現的實驗中，在投予脂質3-4小時後小鼠的血漿中很容易檢測到PRAP1。如果以免疫墨點分析法分析更多的血漿(數據未呈現)，則可以檢測到0小時此時間點(禁食4小時後)的基礎量。有趣的是，儘管通過免疫組織化學分析很容易在腸道上皮中檢測到E85V突變體蛋白(數據未呈現)，但與WT蛋白相比，它較少被外泌到血流中或具有較慢的外泌動力學(數據未呈現)。

這些數據證明，PRAP1缺陷降低脂質吸收，因此，與對照組小鼠相比，在PRAP1^-/- 小鼠和E85V突變體小鼠的血漿中檢測到較低量的apoB48、apoB100和TG。

實施例 5  PRAP1^-/- 和E85V突變體小鼠的體重和脂肪量均增加得較少，並且在高脂飲食中可預防肝脂質變性

儘管以飼料餵食，對照組與基因剔除小鼠的體重增加非常相似(數據未呈現)，但在HFD下(TESTDIET^® 58Y1中脂肪的能量佔60％；表3中概述該等成分)與對照組小鼠相比，PRAP1^-/- 小鼠體重的增加明顯較少(第7A圖)。時域核磁共振(time-domain nuclear magnetic resonance，TD-NMR) 分析證實，在HFD下12週後，與對照小組鼠相比，基因剔除小鼠的脂肪質量百分比顯著降低(第7B圖)。與此結果一致，與對照小鼠的相應組織相比(第7C圖)，PRAP1^-/- 小鼠的兩種受檢脂肪組織(iWAT、eWAT)的尺寸均明顯較小，而且PRAP1^-/- 之脂肪細胞明顯小於對照組細胞(第7D圖)。最後，在12週的HFD後，在PRAP1^-/- 小鼠中觀察到在穩態血漿(可自由獲取食物和水)中TG與磷脂的量顯著下降(第7E圖與第7F圖)，儘管來自兩組小鼠之血漿中的總膽固醇(total cholesterol，TCHO)或游離脂肪酸(free fatty acid，FFA)量似乎非常相似(數據未呈現)。

表 3  HFD的成分

成分	重量/體積之百分比
豬油	31.66
受測酪蛋白-維生素	25.85
麥芽糊精	16.15
蔗糖	8.85
粉狀纖維素	6.46
大豆油	3.23
檸檬酸鉀三元一水化合物	2.13
磷酸鈣	1.68
DIO(diet induced obesity，飲食所致脂肥胖)礦物質混合物	1.29
AIN-76A維生素混合物*	1.29
碳酸鈣	0.71
L-半胱胺酸	0.39
酒石酸氫膽生僉( choline bitartrate)	0.26

*AIN-76A維生素混合物包括0.6g之鹽酸硫胺素(tiamine hydrochloride)、0.6g之核黃素、0.7g之鹽酸吡哆醇(pyridoxine hydrochloride)、3.0g之菸鹼酸、1.6g之D-泛酸鈣、0.2g之葉酸、0.02g之D-生物素、0.001g之維生素B12、1.6g之維生素A、20.0g之乙酸DL-α-生育醇酯、0.25g之膽鈣化醇、0.05g之甲萘醌與971.38g之蔗糖。

考慮到對照組和PRAP1^-/- 小鼠在HFD下的食物攝入非常相似(數據未呈現)，那麼對它們的能量消耗和糞便脂質含量進行比較。兩組小鼠展現出非常相似的能量消耗，如綜合實驗室動物監測系統(Comprehensive Laboratory Animal Monitoring System，CLAMS)所示(數據未呈現)。然而，相較於對照組小鼠的糞便，PRAP1^-/- 小鼠的糞便含有較多的脂質(第8A至8B圖；第8A圖：以飼料餵食小鼠；第8A圖：以HFD餵食小鼠)。彈式熱量測定法也揭示，PRAP1^-/- 小鼠的糞便比對照組小鼠的糞便保留更多卡路里，這顯示在HFD下PRAP1^-/- 小鼠的較瘦表現型主要是由於脂質吸收缺陷所致。

有趣的是，E85V突變體小鼠在許多方面表現出與剔除小鼠非常相似的表現型。例如，E85V突變體小鼠的小腸始終比同窩對照組的小腸長(第9A圖，以飼料餵食)。餵食管口服脂質後，與對照組小鼠相比，E85V突變體小鼠的小腸組織中積累更多的脂質(數據未呈現)。此外，在12週HFD下，與對照小鼠相比，E85V突變體小鼠的體重增加得顯著較少(第9B圖)，而且展現出較小的脂肪組織(iWAT與eWAT)(圖9C)和較低的血漿TG量(第9D圖)。

最後，檢查PRAP1缺陷或E85V突變對HFD誘導之肝臟脂質堆積(肝脂質變性)的影響。對於該實驗，在對小鼠的肝臟進行處理並分析形態和脂質含量之前，先以HFD餵食12週(第10A至10C圖)或8週(第10D與10E圖)。結果顯示，與對照組相比，在PRAP1^-/- 和E85V突變體小鼠肝臟中，脂滴(以油紅色O染色，第10D圖)、帶空泡的肝細胞(以H&E染色，第10A圖)、肝臟對體重的比例(第10B圖)與肝的TG含量(第10C與10E圖)均顯著降低，表明PRAP1缺陷或E85V突變減少HFD所引起的肝脂質變性。

實施例 6  重組E85V多肽(rE85V)在減少脂質吸收的作用

鑑於在脂質吸收方面，E85V突變體小鼠表現出與PRAP1剔除小鼠相似的表現型，在本實施例中檢視rE85V的投予是否會影響體重增加和以HFD餵食之小鼠的脂質排泄。

第11A和11B圖的數據表明，在HFD下，與僅餵食賦形物(PBS)的小鼠相比，口服投予rE85V(10 毫克/公斤/天)的小鼠體重增加顯著較少，且糞便中的脂質排泄趨向增加。這些結果證明，rE85V多肽的投予顯著地降低脂質吸收，因此，提供治療高脂血症或高脂血症相關疾病的潛在手段。

應當理解的是，前述對實施方式的描述僅是以實施例的方式給出，且本領域所屬技術領域中具有通常知識者可進行各種修改。以上說明書、實施例及實驗結果提供本發明之例示性實施方式之結構與用途的完整描述。雖然上文實施方式中揭露了本發明的各種具體實施例，然其並非用以限定本發明，本發明所屬技術領域中具有通常知識者，在不悖離本發明之原理與精神的情形下，當可對其進行各種更動與修飾，因此本發明之保護範圍當以附隨申請專利範圍所界定者為準。

無

配合附圖將能更好地理解本說明書之實施方式，圖式說明如下：

第1A圖至第1C圖是依據本揭示內容實施例1所繪示關於PRAP1缺失小鼠的建構及分析結果。第1A圖：野生(wild-type, wt)小鼠的PRAP1 基因座(gene locus)的基因體結構及限制酶圖譜。以數字及實心方條來呈現外顯子。基因圖譜下方為標的載體及同源性重組後突變等位基因的結構。DT基因與lacZ-neo卡匣(cassette)分別用以進行負向及正向篩選；相關限制酶切位如圖所示(A：ApaI；E：EcoRI；S：SalI；Ev：EcoRV；N：NdeI)。5’端與3’端探針及以南方點墨法分析EcoRI限制酶截切後預期的片段長度如圖所示。第1B圖：源自代表性PRAP1^+/+ 與PRAP1^-/- 小鼠之小腸萃取物的免疫點墨法分析結果。以抗-PRAP1抗體免疫沉澱特定基因型小鼠的小腸萃取物。以相同抗體藉由免疫點墨法分析來分析經沉澱的免疫複合物。PRAP1的訊號與免疫球蛋白輕鏈如圖所示。第1C圖：控制組(PRAP1^+/+ ) 與PRAP1^-/- 小鼠之小腸長度。SI：small intestine。*，p值＜ 0.05。

第2A至2H圖係依據本揭示內容實施例2繪製關於PRAP1與微粒體三酸甘油酯轉移蛋白(microsomal triglyceride transfer protein，MTTP)形成的複合體，且PRAP1涉及MTTP介導的(MTTP-mediated)脂質轉運。第2A圖：以MTTP-專一或PRAP1-專一的抗體對源自對照組(WT)、PRAP1^-/- (KO)或E85V突變小鼠(E85V)之總腸道細胞裂解物(lysate)進行免疫沉澱，並且，使用MTTP或PRAP抗體藉由免疫墨點法伴隨如指定的1/50輸入細胞裂解物來分析免疫複合物(第4道至第6道)。第2B及2C圖：重組PRAP1(rPRAP1，即PRAP1△N20；在第2B及2C圖中標示為「rWT」)刺激從PRAP1^-/- 小鼠純化而得之腸上皮細胞(intestinal epithelial cell，IEC)中，MTTP之三酸甘油酯(TG)轉移活性(第2B圖)與磷脂轉移活性(第2C圖)。第2D圖：在對照組(PRAP1^+/+ )或PRAP1^-/- 小鼠小腸細胞裂解物中MTTP表現的免疫墨點分析。第2E及2F圖：在已經與10 μg重組之WT PRAP1或圖上所示之PRAP1突變(全部欠缺N端20個胺基酸)預反應的PRAP1缺陷(PRAP1^-/- )IEC均質物(homogenate)中，測定TG的MTTP介導轉移(第2E圖)或磷脂的MTTP介導轉移(第2F圖)。第2G及2H圖：所有測試劑量下，於PRAP1^-/- 小鼠純化而得之IEC中，PRAP1的E85V(rE85V)無法刺激TG轉移活性(第2G圖)及磷脂轉移活性(第2H圖)。每圖，N=3至4。*指p 值 ＜ 0.05、**指p 值 ＜ 0.01、***指p 值 ＜ 0.001、n.s.指p 值 ＞ 0.05。第2B、2C、2G及2H圖：與PRAP1^+/+ (第1條長條)的活性相比。第2E及2F圖：與PRAP1^-/- (第2條長條)的活性相比。

第3A至3E圖係依據本揭示內容實施例3繪製PRAP1直接與TG結合並與MTTP形成三元複合體。第3A圖：細菌生產之麩胱甘肽S-轉移酶(glutathione S-transferase，GST)、或含有WT的GST融合蛋白、或含有指定之PRAP1突變的GST融合蛋白(約各0.7 μg)之脂質(³ H標記之TG，[³ H]-TG)結合曲線。第3B圖：含有WT或PRAP1截斷形式(約各0.7 μg，下方)的GST融合蛋白的脂質結合能力。第3C圖：PRAP1與磷脂結合。在缺乏或存在圖指超量未標記的脂質(10 nM)時，接近0.7 μg的指定蛋白與40 pmole之[³ H]-TG反應。數據以平均±標準誤差來呈現(mean ± SEM)。全部的結合活性以其於缺乏任何競爭物時，對GST的結合來進行標準化(第1條長條)，該數據設定為100。第3D及3E圖：由海拉細胞株(Hela cells)免疫沉澱而得之旗標(Flag)標籤標記的MTTP與重組WT結合，或與有或沒有預先裝載增加劑量之[³ H]-TG的特定突變蛋白結合。反應4小時後，免疫複合物經沖洗、洗脫(elute)，並對半數樣品進行[³ H]-TG同位素計數(第3D圖)，另半數樣品，如圖所示(第3E圖)，以旗標或GST抗體進行免疫墨點分析。*指p 值 ＜ 0.05、**指p 值 ＜ 0.01、***指p 值 ＜ 0.001、n.s.指p 值 ＞ 0.05。除了PRAP1全長(PRAP1-FL)，在此實施例中所用全部的PRAP1(WT或突變)均無N端訊號肽。

第4A至4F圖依據本揭示內容實施例4繪製PRAP1促進小鼠的脂質吸收、apoB(Apolipoprotein B，載脂蛋白B)載脂蛋白組裝與外泌。第4A及4B圖：在PRAP1^-/- 小鼠之小腸，脂質吸收的減少。對照組(WT)或PRAP1^-/- (KO)小鼠禁食12小時後，接受含有5 μCi(microcurie，微居禮)之[¹⁴ C]-三油酸酯(triolein)與1 μCi之[³ H]-β-穀固醇(β-sitostanol)之0.5 ml玉米油的胃內推注(各群組中，n=5)。投予脂質2小時(第4A圖)或1至3小時(第4B圖)後，對在由小腸中段取得之細胞裂解物中(如[¹⁴ C]/ [³ H]放射性之比例，第4A圖)，或血液樣品中(第4B圖)，之[¹⁴ C]-三油酸甘油酯衍生之放射性被測量與作圖。第4C圖：具指定基因型之小鼠禁食16小時後，接受管餵食脂質。投予脂質4小時後，收集血漿並拍照。第4D圖：PRAP1缺陷(KO)或E85V突變降低apoB的外泌。使用分離自具有指定基因型之小鼠的初級腸上皮細胞(primary enterocyte)進行短暫標記(pulse chase)實驗，並且，由培養基與細胞裂解物免疫沉澱所得之³⁵ S標記的apoB，被用來進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)與螢光成像。第4E及4F圖：PRAP1缺陷(KO)或E85V突變降低apoB的外泌。使用分離自具有指定基因型之小鼠的初級肝細胞進行代謝標記(metabolic labelling)實驗，並且，由培養基與細胞裂解物免疫沉澱所得之³⁵ S標記的apoB48與apoB100，被用來進行SDS-PAGE、螢光成像並且定量特定訊號。所有的訊號會以在WT細胞中一式三份之訊號的平均值進行標準化。*指p 值 ＜ 0.05、**指p 值 ＜ 0.01、***指p 值 ＜ 0.001。

第5A至5C圖依據本揭示內容實施例4繪製PRAP1降低apoB組裝，以及降低進入富含乳糜微粒(chylomicron)/極低密度脂蛋白(very low density lipoprotein)(CM/VLDL)之區分部分的外泌。對照組(PRAP1^+/+ )或PRAP1^-/- 小鼠禁食16小時後，注射泰洛沙泊(tyloxapol)並使其接受口服脂質推注。4小時後，將由三隻相同基因型小鼠提供的血漿，透過快速蛋白質液相層析(fast protein liquid chromatography，FPLC)進行分級區分，接著進行每一區分部分的免疫墨點分析。第5A及5B圖：以相對於來自WT血漿全部20個區分(fraction)之apoB總量的百分率，對每一區分之apoB 100(第5A圖)及apoB 48的蛋白質訊號定量(第5B圖)與作圖。第5C圖：在每個區分中的TG量。

第6A至6D圖依據本揭示內容實施例4繪製E85V突變降低apoB載脂蛋白組裝並降低進入富含CM/VLDL之區分部分的外泌。具指定基因型的小鼠禁食16小時後，注射泰洛沙泊並使其接受包含10 μCi [³ H]-三油酸甘油酯之口服脂質推注。3小時後，透過密度梯度超高速離心(density gradient ultracentrifugation) 區分來自三隻相同基因型小鼠所提供的血漿，接著透過免疫墨點法分析apoB100與apoB48。第6A與6B圖：以來自WT血漿全部14個區分之apoB總量的相對百分率，對在每一區分中的apoB100(第6A圖)與apoB48(第6B圖)蛋白訊號定量與作圖。第6C與6D圖：在每一區分中，TG質量(第6C圖)或[³ H]之放射性(第6D圖)。

第7A至7F圖依據本揭示內容實施例5繪製PRAP1缺陷的小鼠在高脂肪飲食(high fat diet，HFD)下增加較少的體重和脂肪量。第7A圖：為期12週，對餵食HFD之對照組(WT)或PRAP1^-/- 小鼠(KO)的體重進行測量，並對時間作圖。每個基因型，n = 10。第7B圖：實驗結束時，對第7A圖分析之小鼠的瘦肉與脂肪質量進行時域核磁共振(time domain nuclear magnetic resonance，TD-NMR)分析。第7C圖：由指定小鼠所得之腹股溝(iWAT)和附睾(eWAT)脂肪組織的平均重量。第7D圖：每一高倍率視野(high power field，HPF)中指定小鼠的平均脂肪細胞數。第7E及7F圖：在HFD下，12週後指定小鼠血漿TG(第7E圖)與磷脂(第7F圖)量。每數據點表示一隻小鼠個體，而長條表示mean ± SEM。*指p 值 ＜ 0.05、**指p 值 ＜ 0.01、***指p 值 ＜ 0.001。

第8A至8C圖依據本揭示內容實施例5繪製PRAP1^-/- 小鼠糞便脂質含量增加，並且從飲食中吸收較少的卡路里。第8A圖：以飼料餵食下，指定小鼠的糞便脂質含量。第8B圖：以HFD餵食，指定小鼠的糞便脂質含量。第8C圖：從以HFD餵食的指定小鼠收集其糞便的一部分，均質化並以卡計分析。對每日總糞便熱量做圖。數據為來自3組獨立實驗的累積結果，每組實驗以來自同一窩的1至2隻WT或KO小鼠進行。*指p 值 ＜ 0.05、**指p 值 ＜ 0.01、***指p 值 ＜ 0.001。

第9A至9D圖依據本揭示內容實施例5繪製E85V突變體小鼠在HFD下，增加較少的體重與脂肪質量。第9A圖：以飼料餵食之E85V突變體小鼠的小腸比對照組(WT)小鼠的小腸更長。第9B圖：對以HFD餵食12週之對照組(WT)或E85V突變體小鼠的體重進行測量，並對時間作圖。每個基因型，n = 10。第9C圖：由指定小鼠所得之iWAT和eWAT脂肪組織的平均重量。第9D圖：在HFD下，12週後指定小鼠血漿TG量。每個數據點表示一隻小鼠個體，而長條表示mean ± SEM。**指p 值 ＜ 0.01、***指p 值 ＜ 0.001。

第10A至10E圖依據本揭示內容實施例5繪製PRAP1缺陷或E85V突變降低HFD誘導的肝脂質變性。第10A至10C圖：以HFD餵食對照組(WT)與PRAP1^-/- (KO)小鼠12週。由指定小鼠之肝的代表性蘇木素-伊紅(hematoxylin and eosin，H&E)染色切片呈現於第10A圖，且指定小鼠的肝臟/體重比例與肝臟TG含量分別呈現於第10B及10C圖。第10D圖：指定小鼠肝臟中脂質滴的定量結果。第10E圖：以HFD餵食8週，指定小鼠的肝臟TG含量。每個數據點表示一隻小鼠個體，而長條表示mean ± SEM。*指p 值 ＜ 0.05、**指p 值 ＜ 0.01、***指p 值 ＜ 0.001。

第11A至11B圖為依據本揭示內容實施例6分別繪製之直方圖，其呈現餵食HFD與僅投予載體(磷酸鹽緩衝生理鹽水，Phosphate buffered saline，PBS)或投予重組E85V多肽(rE85V；序列編號：4)之小鼠的增加的體重(相較於初始體重之增加百分比，第11A圖)以及總糞便脂質含量(第11B圖)。*指p 值 ＜ 0.05。

Claims (6)

1. 一種PRAP1抑制劑、一種修飾的PRAP1多肽或一種用以編碼該修飾的PRAP1多肽的核酸於製備一藥物之用途，其中該藥物是用以治療一個體之高脂血或高脂血相關疾病，其中相較於一野生型PRAP1多肽，該修飾的PRAP1多肽包含一胺基酸修飾，且該胺基酸修飾是 以纈胺酸置換序列編號：1之野生型PRAP1多肽之第88個胺基酸位置的麩胺酸(E88V)； 以纈胺酸置換序列編號：3或7之野生型PRAP1多肽之第85個胺基酸位置的麩 胺酸(E85V)；或 以纈胺酸置換序列編號：5之野生型PRAP1多肽之第94個胺基酸位置的麩胺 酸(E94V)。
2. 如請求項1所述之用途，其中該PRAP1抑制劑是一標的PRAP1的反義寡核苷酸或小型干擾RNA (small interfering RNA)。
3. 如請求項1所述之用途，其中該個體是人類，且該胺基酸修飾是該序列編號：5之野生型PRAP1多肽的該E94V置換，或是該序列編號：7之野生型PRAP1多肽的該E85V置換。
4. 如請求項1所述之用途，其中該個體是一小鼠，且該胺基酸修飾是序列編號：1之野生型PRAP1多肽的該E88V置換，或是該序列編號：3之野生型PRAP1多肽的該E85V置換。
5. 如請求項1所述之用途，其中該高血脂相關疾病是肝脂質變性 (hepatosteatosis)、動脈粥狀硬化症(atherosclerosis)、心血管疾病(cardiovascular disease)、胰臟炎(pancreatitis)或乳糜微粒血症(chylomicronemia syndrome)。
6. 一種包含一修飾之PRAP1多肽及一藥學上可接受之賦形劑的藥學組成物，其中相較於一野生型PRAP1多肽，該修飾的PRAP1多肽包含一胺基酸修飾，且該胺基酸修飾是 以纈胺酸置換序列編號：1之野生型PRAP1多肽之第88個胺基酸位置的麩胺 酸(E88V)； 以纈胺酸置換序列編號：3或7之野生型PRAP1多肽之第85個胺基酸位置的麩 胺酸(E85V)；或 以纈胺酸置換序列編號：5之野生型PRAP1多肽之第94個胺基酸位置的麩胺 酸(E94V)。

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