TW202128666A

TW202128666A - 氨基嘧啶類化合物甲磺酸鹽的晶型a及其製備方法和應用

Info

Publication number: TW202128666A
Application number: TW109145163A
Authority: TW
Inventors: 湯春; 邁克爾·尼古拉斯格雷科; 邁克爾·約翰科斯坦佐; 張曉霞; 繼榮彭; 東張; 躍列盧
Original assignee: 大陸商倍而達藥業（蘇州）有限公司
Priority date: 2019-12-18
Filing date: 2020-12-18
Publication date: 2021-08-01
Also published as: AR120821A1; CN111100117A; CN111100117B; WO2021121146A1

Abstract

本發明提供了氨基嘧啶類化合物甲磺酸鹽的晶型A，以2θ角度表示的X-射線粉末衍射在11.06±0.2°、12.57±0.2°、13.74±0.2°、14.65±0.2°、15.48±0.2°、16.58±0.2°、17.83±0.2°、19.20±0.2°、19.79±0.2°、20.88±0.2°、22.05±0.2°、23.06±0.2°、24.23±0.2°、25.10±0.2°、25.71±0.2°、26.15±0.2°、27.37±0.2°及27.42±0.2°處具有衍射峰（如圖3）。還提供了該晶型A的製備方法。本發明氨基嘧啶類化合物甲磺酸鹽的晶型A具有良好的溶解度，在動物體內的生物利用度高。其可用於治療或預防在哺乳動物，尤其人類中由表皮生長因子（EGFR）的突變（激活或耐藥型）介導的疾病或醫學病症，特別是癌症。

Description

氨基嘧啶類化合物甲磺酸鹽的晶型A及其製備方法和應用

本發明屬藥物合成領域，具體涉及氨基嘧啶類化合物甲磺酸鹽的晶型A及其製備方法和應用。

表皮生長因子受體（Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR）是人體內的一類跨膜受體酪氨酸激酶。該激酶的激活（即磷酸化）對腫瘤細胞的增殖、血管生成、腫瘤侵襲、轉移及細胞凋亡的抑制有重要意義。EGFR激酶與大部分的癌症的疾病進程有關，這些受體會在許多主要的人體腫瘤中過度表達。這些家族成員的過度表達、突變或者與之結合的配體的高度表達，都會導致一些腫瘤疾病的產生，如非小細胞肺癌、結直腸癌、乳腺癌、頭頸癌、宮頸癌、膀胱癌、甲狀腺癌、胃癌和腎癌等。

近年來表皮生長因子受體酪氨酸激酶已成為當今抗腫瘤藥物研究中最引人注目的靶點之一。2003年，美國FDA批准了第一個表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑（Epidermal Growth Factor Receptor-Tyrosine Kinase Inhibitor，EGFR-TKI）類藥物易瑞沙^® （吉非替尼）來用於治療晚期非小細胞肺癌（Non-Small Cell Lung Cancer，NSCLC），掀開了第一代EGFR抑制劑的開發。眾多臨床試驗證實，對於EGFR陽性突變非小細胞肺癌患者而言，分子標靶藥物治療效果顯著優於傳統化療。

雖然第一代EGFR抑制類標靶藥物對眾多非小細胞肺癌（NSCLC）患者的初期治療響應良好，但大多數患者最終會由於產生抗藥性（如EGFR二級T790M突變）而發生疾病進展。抗藥性的產生是在原有EGFR通路活性突變的基礎上，藉由各種不同的機制所致。針對第一代EGFR抑制劑進行的耐藥研究中，研究前沿的已經是不可逆的第三代EFGR抑制劑。

但截至目前為止，在全球範圍內的第三代EGFR抑制劑中，除了阿斯利康公司的奧希替尼（泰瑞沙^® ）開發成功，尚無其它有效針對T790M耐藥突變患者的藥物獲批，供臨床治療使用；若干針對T790M突變的候選藥物正處於臨床開發階段。這類第三代EGFR抑制劑化學結構與第一代截然不同。與第一代EGFR抑制劑的主要不同點在於，它們均使用高選擇性核心結構替代第一、二代EGFR-TKI的低選擇性氨基喹啉核心結構。相對於野生型EGFR，這些第三代化合物均對EGFR陽性耐藥後T790M突變具有高度特異選擇性。

中國專利申請號CN201580067776.8揭露如下式I結構化合物，該化合物亦屬第三代EGFR-TKI類小分子標靶藥物。該化合物對於具有單活性突變及T790M雙突變EGFR的非小細胞肺癌（NSCLC）細胞均有高度抑制作用，其有效抑制濃度顯著低於抑制野生型EGFR酪氨酸激酶活性所需的濃度，具有選擇性好，毒副作用較低，安全性好的特點。

中國專利申請號CN201780050034.3亦揭露如上式I結構的化合物的各種鹽及對應晶型，其實施例2揭露了式I化合物甲磺酸鹽的兩種晶體形式，分別為2A和2B。

本發明的目的在於提供氨基嘧啶類化合物甲磺酸鹽的新的晶型及其製備方法和應用。因此本發明涉及式I化合物的甲磺酸鹽的基本上純的新晶型。

與中國專利申請號CN201780050034.3（CN109937043A）實施例2揭露的晶體2A和2B對比，本申請晶型從X光粉末繞射儀（X-Ray Powder Diffractometer，XPRD）特徵峰數目、位置及強度均有不同，熔點和熔化範圍亦具有顯著差異，本申請的製備製程下得到的晶型A具有純度更高、更穩定的性質，更有利於其在醫藥領域的應用。

為了實現上述目的，本發明採用以下技術方案：

本發明提供了氨基嘧啶類化合物甲磺酸鹽的晶型A，所述氨基嘧啶類化合物為式I化合物，該晶型的XRPD圖譜在2θ(±0.2°)為11.06、12.57、13.74、14.65、15.48、16.58、17.83、19.20、19.79、20.88、22.05、23.06、24.23、25.10、25.71、26.15、27.37及27.42（相對強度大於10%）處有衍射峰，

。

較佳地，所述晶型A的XRPD圖譜如圖3所示。

較佳地，所述晶型A的紅外光譜圖如圖6所示。

較佳地，所述晶型A具有242-244℃的熔點。

較佳地，所述晶型A在熱重分析法（Thermogravimetric Analysis，TGA）測量中在33.4-120℃範圍內具有-0.035%的熱失重。

本發明還提供了氨基嘧啶類化合物甲磺酸鹽的晶型A的製備方法，包括：用有機溶劑溶解式I化合物的甲磺酸鹽，攪拌析晶、過濾、乾燥後得目標晶型A，所述有機溶劑包括二甲基亞碸、四氫呋喃、N-甲基吡咯烷酮、N,N-二甲基甲醯胺和N,N-二甲基乙醯胺。

較佳地，還包括：將式I化合物和甲磺酸按照投料莫耳比1.05-0.97，較佳等莫耳比製得式I化合物的甲磺酸鹽。

較佳地，加入反溶劑進行攪拌析晶，所述反溶劑包括甲基叔丁基醚、乙酸異丙酯、乙酸乙酯、甲基異丁基酮、乙腈、甲苯、丙酮和水。

較佳地，過濾後在30-70℃（更佳地在40-50℃）下進行常壓或真空乾燥。

本發明還提供了一種藥物組合物，包含氨基嘧啶類化合物甲磺酸鹽的晶型A和藥學上可接受的載體。

本發明又提供了氨基嘧啶類化合物甲磺酸鹽的晶型A，上述藥物組合物或聯合用藥在製備抗腫瘤藥物中的應用。

本發明另外還提供了治療或預防哺乳動物，尤其是人類中由EGFR突變介導的疾病或醫學病症，較佳為腫瘤的方法，包括向對有此需要的個體給予治療有效量的氨基嘧啶類化合物甲磺酸鹽的晶型A或包含氨基嘧啶類化合物甲磺酸鹽的晶型A和藥學上可接受的載體的藥物組合物。

較佳地，所述腫瘤為肺癌。

本發明的有益效果如下：

經實驗發現，本發明的氨基嘧啶類化合物甲磺酸鹽的晶型A純度高，且性質穩定，具有良好的溶解度，在動物體內的生物利用度高。其可用於治療或預防哺乳動物尤其人類由表皮生長因子（EGFR）的突變（激活或耐藥型）介導的疾病或醫學病症，特別是腫瘤或癌症，尤其是非小細胞肺癌。並且可以製成藥物組合物，以及應用於聯合用藥中。藉由本申請中的試驗可以證實，本發明的氨基嘧啶類化合物甲磺酸鹽的晶型A相對於中國專利申請號CN201780050034.3實施例2所揭露的甲磺酸鹽形式2A和2B而言，具有更有利的理化性質。經臨床試驗證實，與已上市藥物奧希替尼相比，本發明的晶型A針對非小細胞肺癌患者在疾病控制率和疾病緩解率方面更高，而不良反應發生率（比例和種類）明顯更低。

現藉由以下實施例來進一步描述本發明的有益效果，實施例僅用於例證的目的，不限制本發明的範圍，同時本領域普通技術人員根據本發明所做的顯而易見的改變和修飾，也包含在本發明範圍之内。

以下各實施例中「室溫」在15-25℃均可。

（一）N-(2-(2-(二甲基氨基)乙氧基)-4-甲氧基-5-((4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)丙烯醯胺（式I化合物）的製備

已知的（例如可參見CN201580067776.8）N-(2-(2-(二甲基氨基)乙氧基)-4-甲氧基-5-((4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)丙烯醯胺（式I化合物）可藉由下述合成路線製備得到：

步驟1-中間體J的製備：

製備：10L反應瓶中，加入6L無水四氫呋喃溶劑，氮氣保護，冷卻至0℃。攪拌狀態下，緩慢加入101g氫化鈉（101g，2.52mol），內溫不超過10℃，加入234g二甲氨基乙醇（234g，2.62mol）。加畢，溫度調整至室溫，製備得到醇鈉溶液。

30L反應瓶中，加入N-(4-氟-2-甲氧基-5-硝基苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-2-嘧啶胺（起始物料B）（430g，1.10mol），然後加入9L的四氫呋喃，開啟攪拌下，溶清，控制溫度在10±10℃，緩慢滴加製備好的醇鈉溶液。控制溫度在10±10℃，保溫5.0h。當原料含量≤0.5%，反應結束。控制溫度在10±10℃，緩慢滴加3%鹽酸溶液，調整溶液pH值至6-7，攪拌1.5h後靜置分層，分出有機相，濃縮至15-20L。降溫至20±5℃後，緩慢滴加4.3kg的水，過濾，烘乾，得497g黃色粉末中間體J，收率為98.0%，高效液相層析（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）純度為99.3%。MS m/z：463.2[M+1]。

核磁數據：¹ HNMR (d₆ -DMSO): δppm: 8.78 (s, 1H); 8.42-8.28 (m, 3H); 8.16(s, 1H); 7.53 (d, 1H, J=8.28); 7.29-7.20 (m, 2H); 7.13-7.07 (m, 1H); 7.01(s, 1H); 4.33(t, 2H, J=5.65); 4.02 (s, 3H); 3.88 (s, 3H); 2.71 (t, 2H, J=5.77); 2.27 (s, 6H)。

步驟2-中間體K的製備：

製備：10L氫化反應釜中，加入5L四氫呋喃和中間體J（350g，108mmol），加入濕鈀炭17.5g，對氫化反應釜進行氫氣置換，調整壓力值0.2MPa，控制溫度在25℃，保溫反應9h，HPLC監控反應進度，在底物≤0.5%時，停止反應。過濾，濾液減壓濃縮，至溶劑體積剩餘約2L，調整內溫至室溫，在4-7小時內緩慢滴加4L正庚烷，過濾並將固體減壓乾燥，得285g類白色粉末中間體K，收率為86％，HPLC純度為99.60％。MS m/z：433.3[M+1]。

核磁數據：¹ HNMR (CDCl₃ ): δppm: 8.42 (d, 1H, J=7.78), 8.28 (s, 1H), 8.26-8.23 (m, 1H), 7.78 (s, 1H), 7.51 (d, 1H, J=8.28), 7.41 (s, 1H), 7.26-7.23 (m, 1H), 7.19-7.11 (m, 2H), 6.72 (s, 1H), 4.38 (br, 2H), 4.06 (t, 2H, J=5.77), 3.88 (s, 3H), 3.75 (s, 3H), 2.63 (t, 2H, J=5.77), 2.26 (s, 6H)。

步驟3-式I化合物的製備：

向反應瓶中加入250mL無水四氫呋喃溶劑和中間體K（14g，32mmol）攪拌，冷卻至0-5℃，加入10%鹽酸（12ml），攪拌20分鐘。0-5℃下，緩慢滴加3-氯丙醯氯（5.6g，45mmol）到反應瓶中。攪拌3小時，取樣測試(K/(U+K)≤0.5%)合格後，加入36%氫氧化鉀水溶液（75ml，480mmol），升溫至23-25℃，攪拌12小時。升溫至50-60℃，攪拌4小時。取樣測試（U/(U+L)≤0.1%）合格後，靜置分液。分出有機相，10%食鹽水洗滌三次後，乾燥，過濾，濃縮有機相至150ml。升溫至40℃，緩慢滴加正庚烷150ml，降至室溫，析出晶體。過濾，乾燥，得到淺棕色固體（式I化合物）10.71 g，產率68%，HPLC純度：99.8%（所有單雜不超過0.15%）。MS m/z：487.3[M+1]。

核磁數據（圖1）：¹ HNMR (d₆ -DMSO): δppm: 9.84 (s, 1H), 8.90-8.82 (m, 1H), 8.32-8.25 (m, 2H), 7.89 (s, 1H), 7.51 (d, 1H, J = 8.25), 7.27-7.10 (m, 1H), 6.94 (s, 1H), 6.49 (dd, 1H, J=16.88,10.13), 6.25 (dd, 1H, J=16.95,1.81), 5.80-5.75 (m, 1H), 4.19 (t, 2H, J=5.57), 3.88 (d, 6H, J=14.63, 6H), 3.34 (s, 3H), 2.58 (d, 2H, J=5.5), 2.28 (s, 6H)。

（二）N-( 2-( 2-(二甲基氨基)乙氧基)-4-甲氧基-5-(( 4-( 1-甲基-1H-吲哚-3-基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)丙烯醯胺甲磺酸鹽（晶型A）的製備

實施例1

式I化合物（3g，6.1mmol）溶解在24ml二甲基亞碸（Dimethyl Sulfoxide，DMSO）溶劑中，升溫至65℃，攪拌溶清。向體系中加入等當量甲磺酸（0.59g，6.1mmol）。降溫至50℃，緩慢加入12ml醋酸異丙酯（Isopropyl Acetate，IPAC）。50℃下攪拌1小時，然後降溫至15℃。在4小時加入21ml IPAC。溶液在15℃下攪拌析晶，減壓抽濾，醋酸異丙酯洗滌濾餅，丙酮打漿洗滌，降低DMSO溶劑殘留。50℃下鼓風乾燥（或50℃真空減壓乾燥），得到淡黃色固體（晶型A）3.16g。HPLC純度100%，收率88%，DMSO：＜100ppm，IPAC：＜100ppm。MS m/z：487.2[M+1-MsOH]。熔點：242-244℃。

核磁數據（圖2）：¹ HNMR (d₆ -DMSO): δppm: 9.57 (brs, 1H), 9.40 (s, 1H), 8.71 (s, 1H), 8.48 (s, 1H), 8.32 (d, 1H, J=7.9), 8.29 (d, 1H, J=5.3), 7.96 (s, 1H), 7.51 (d, 1H, J=8.2),7.23 (ddd, 1H, J=7.9,7.1,0.8), 7.19 (d, 1H, J=5.4), 7.15 (ddd, 1H, J=7.8,7.3,0.5),6.94 (s, 1H), 6.67 (dd, 1H, J=16.9,10.2), 6.27 (dd, 1H, J=16.9,1.8), 5.57 (dd, 1H, J=16.9,1.7), 4.44(t, 2H, J=4.6), 3.89 (s, 3H), 3.88 (s, 3H), 3.58(t, 2H, J=4.6), 2.93 (s, 6H), 2.39 (s, 3H)。

經檢測，本實施例得到晶型A粉末X衍射圖在衍射角2θ值為11.06±0.2°、12.57±0.2°、13.74±0.2°、14.65±0.2°、15.48±0.2°、16.58±0.2°、17.83±0.2°、19.20±0.2°、19.79±0.2°、20.88±0.2°、22.05±0.2°、23.06±0.2°、24.23±0.2°、25.10±0.2°、25.71±0.2°、26.15±0.2°、27.37±0.2°及27.42±0.2°處具有特徵峰，其XRPD圖譜如圖3及附表所示，DSC圖如圖4所示，TGA圖如圖5所示，紅外光譜IR圖如圖6所示。

實施例2

式I化合物（28.25g，58.1mmol）溶解在224ml二甲基亞碸DMSO溶劑中，升溫至15-35℃，攪拌溶清。向體系中分批加入0.97當量的甲磺酸（5.4g，0.97mmol）。緩慢加入448ml甲基異丁基酮（Methyl Isobutyl Ketone，MIBK）。攪拌1小時，然後降溫至10-15℃。溶液在10-15℃下成鹽反應，取樣，HPLC檢測母液中式I化合物殘留（≤0.4%）。反應結束，減壓抽濾，得到式I化合物甲磺酸鹽粗品32g。

將式I化合物甲磺酸鹽粗品3g加入24ml二甲基亞碸DMSO溶劑中，65℃攪拌溶清後，降溫，緩慢滴加48ml甲基異丁基酮（MIBK），攪拌析晶6-8小時，減壓抽濾，60℃下鼓風乾燥（或60℃真空減壓乾燥）得到目標晶型A。熔點：242-244℃。其晶型XRPD圖譜與圖3吻合（圖7），所有特徵峰均在誤差範圍內。

實施例3

將式I化合物甲磺酸鹽粗品（參考實施例2製得）3g加入24ml二甲基亞碸DMSO溶劑中，65℃攪拌溶清後，降溫，緩慢滴加48ml乙酸乙酯，攪拌析晶6-8小時，減壓抽濾，乙酸乙酯洗滌濾餅，70℃下鼓風乾燥（或60℃真空減壓乾燥）得到目標2.8g晶型A。熔點：242-244℃。其晶型XRPD圖譜與圖3吻合，所有特徵峰均在誤差範圍內。

實施例4

將式I化合物甲磺酸鹽粗品3g加入24ml二甲基亞碸DMSO溶劑中，65℃攪拌溶清後，降溫，緩慢滴加12ml甲基叔丁基醚（Methyl Tert-butyl Ether，MTBE），攪拌析晶6-8小時，減壓抽濾，50℃下鼓風乾燥（或30℃真空減壓乾燥）得到目標晶型A。熔點：242-244℃。其晶型XRPD圖譜與圖3吻合，所有特徵峰均在誤差範圍內。

實施例5

將式I化合物甲磺酸鹽粗品3g加入24ml二甲基亞碸DMSO溶劑中，65℃攪拌溶清後，降溫，緩慢滴加48ml乙腈（Acetonitrile，ACN），攪拌析晶6-8小時，減壓抽濾，50℃下鼓風乾燥（或60℃真空減壓乾燥）得到目標晶型A。熔點：242-244℃。其晶型XRPD圖譜與圖3吻合，所有特徵峰均在誤差範圍內。

實施例6

將式I化合物甲磺酸鹽粗品3g加入24ml二甲基亞碸DMSO溶劑中，65℃攪拌溶清後，降溫，緩慢滴加48ml甲苯（Methylbenzene，PhMe)，攪拌析晶6-8小時，減壓抽濾，50℃下鼓風乾燥（或50℃真空減壓乾燥）得到目標晶型A。熔點：242-244℃。其晶型XRPD圖譜與圖3吻合，所有特徵峰均在誤差範圍內。

實施例7

將式I化合物甲磺酸鹽粗品10g加入100ml四氫呋喃（Tetrahydrofuran，THF）溶劑中，65℃攪拌溶清後，降溫至室溫，攪拌析晶6-8小時，過濾，50℃乾燥得到8.8g目標晶型A。熔點：242-244℃。其晶型XRPD圖譜與圖3吻合，所有特徵峰均在誤差範圍內。

實施例8

將式I化合物甲磺酸鹽粗品2g加入20ml N-甲基吡咯烷酮（N-methyl Pyrrolidone，NMP）溶劑中，65℃攪拌溶清後，降溫至室溫，攪拌析晶6-8小時，減壓抽濾，50℃下鼓風乾燥（或50℃真空減壓乾燥）得到目標晶型A。熔點：242-244℃。其晶型XRPD圖譜與圖3吻合，所有特徵峰均在誤差範圍內。

實施例9

將式I化合物甲磺酸鹽粗品2g加入30ml N,N-二甲基甲醯胺（N,N-dimethylformide，DMF）溶劑中，65℃攪拌溶清後，降溫至室溫，攪拌析晶6-8小時，減壓抽濾，65℃下鼓風乾燥（或60℃真空減壓乾燥）得到目標晶型A。熔點：242-244℃。其晶型XRPD圖譜與圖3吻合，所有特徵峰均在誤差範圍內。

實施例10

將式I化合物甲磺酸鹽粗品2g加入50ml N,N-二甲基乙醯胺（Dimethylacetamide，DMAc）溶劑中，65℃攪拌溶清後，降溫至室溫，攪拌析晶6-8小時，減壓抽濾，60℃下鼓風乾燥（或60℃真空減壓乾燥）得到目標晶型A。熔點：242-244℃。其晶型XRPD圖譜與圖3吻合，所有特徵峰均在誤差範圍內。

實施例11

將式I化合物甲磺酸鹽粗品2g加入50ml丙酮/水混合溶劑（丙酮/水=1/1 v/v）中，升溫至50℃攪拌打漿，降溫至室溫，攪拌析晶6-8小時，減壓抽濾，50℃下鼓風乾燥（或50℃真空減壓乾燥）得到目標晶型A。熔點：242-244℃。其晶型XRPD圖譜與圖3吻合，所有特徵峰均在誤差範圍內。

（三）N-( 2-( 2-(二甲基氨基)乙氧基)-4-甲氧基-5-(( 4-( 1-甲基-1H-吲哚-3-基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)丙烯醯胺甲磺酸鹽（晶型A）的結構確認研究

採用實施例2方法製備的晶型A（純度大於99.80%），採用以下實例方法，進行晶型A的結構確定測試。

測試例1

採用元素分析法，分別測試晶型A中含有的C、H、N、S元素的百分含量，平行測試兩次，取其平均值。

CHN測試儀器：ElementarVario EL III型元素分析儀（C、H、N測定）；

CHN測試方法：樣品經燃燒分解，定量轉換，檢測，再經數據處理得到C、H、N的百分含量；

S滴定方法：精密稱取晶型A樣品，分別用無灰濾紙包緊，經燃燒法進行分解，用純水和30% H2O2作為吸收液吸收。吸收完全後轉移至250mL容量瓶中，用乙醇沖洗燃燒瓶，沖洗液也轉移至250mL容量瓶中。然後加入一定量的已知濃度的HNO3和偶氮氯膦III指示劑，然後用已知濃度的Ba(ClO₄ )₂ ·3H₂ O滴定，直到溶液顔色由紫紅色變為藍色。記錄Ba(ClO₄ )₂ ·3H₂ O消耗體積，計算S的百分含量。表 1. 晶型 A 的元素分析測試結果

測試元素	C	H	N	S
理論值(%)	57.72	5.88	14.42	5.50
實測值（%）	第一次	57.83	5.85	14.48	5.56
第二次	57.69	5.85	14.42	5.64
平均值	57.76	5.85	14.45	5.60

測定結果表明，晶型A（C₂₇ H₃₀ N₆ O₃ •CH₄ O₃ S）樣品的C、H、N和S含量的實測值與理論值之差均小於0.3%，表明實測值與理論值一致，是帶有1分子甲磺酸的鹽。與中國專利申請號CN201780050034.3實施例2報道值數據吻合。

測試例2

目的：採用粉末X-射線衍射分析法，測試晶型A的特定晶體結構。

儀器：Bruker D8 Advance 粉末X-射線衍射儀。表 2. 測試條件參數表

X-射線發生器	Cu, k-Alpha1, (λ=1.54060Ǻ)	發生器電壓 (kV)	40
發生器電流(mA)	40	發射狹縫(mm)	0.60
初級Soller狹縫 (deg)	2.5	次級Soller狹縫 (deg)	2.5
探測器狹縫(mm)	10.50	防散射狹縫(mm)	7.10
掃描軸	2-Theta/Theta	步徑(deg)	0.02
掃描速度(deg/min)	10	掃描範圍 (deg)	4-40
檢測器	PSD: LynxEye	使用默認值	3.0
掃描類型	Locked Coupled	掃描模式	連續掃描
樣品旋轉速度（rpm）	15	步長	0.12

測定結果和解析：由晶型A的粉末X-射線衍射圖（圖3及附表）可知，本化合物具有特定的晶體結構。其2θ角（°）在11.06、12.57、13.74、14.65、15.48、16.58、17.83、19.20、19.79、20.88、22.05、23.06、24.23、25.10、25.71、26.15、27.37及27.42有較強峰（相對強度大於10%）。表 3. 與中國專利申請號 CN201780050034.3 實施例 2 的比較表

甲磺酸鹽的不同晶型	含特徵峰總數目	相對強度大於10%的特徵峰數目
晶型A	44	18
2A	36	16
2B	12	12

測試例3

目的：採用差熱分析DSC法，測試晶型A的熔點。

儀器：TA Q2000差示量熱掃描儀。

參數：升溫範圍：30-300℃；升溫速率：10℃/min。

測定結果和解析：由DSC曲線圖（圖4）可知，晶型A的熔點為242-244℃。表 4. 與中國專利申請號 CN201780050034.3 實施例 2 甲磺酸鹽的比較

甲磺酸鹽的不同晶型	熔點
晶型A	242-244℃
2A	233.3-238.1℃
2B	157.3-180.2℃

測試例4

目的：採用熱重分析法，測試晶型A是否含水或溶劑化合物。

儀器：TA Q5000型熱重分析儀。

參數：升溫範圍：30-300℃；升溫速率：10℃/min。

測定結果和解析：由TSA曲線圖（圖5）可知，晶型A在33.40℃～120.00℃失重很小，結合DSC和元素分析表明，晶型A不含水或溶劑。表 5. 與中國專利申請號 CN201780050034.3 實施例 2 甲磺酸鹽的比較

甲磺酸鹽的不同晶型	熱失重（重量損失wt%）
晶型A	-0.035%（33.4-120℃）
2A	-0.435%（32.8-210.0℃）
2B	-8.063%（29.7-193.4℃）

測試例5

目的：採用紅外吸收光譜法，測試晶型A的紅外譜圖。

儀器：Nicolet 380 FT-IR型紅外光譜儀，YP-2壓片機。

方法：KBr壓片法。

測定結果和解析：由紅外吸收光譜圖（圖6）可知，本品結構中含芳環、芳雜環、烯基、-CH₃ -、-CH₂ -、胺基、胺鹽、醯胺、醚基和磺酸鹽結構等。上述紅外IR光譜結果與晶型A結構相符。

測試例6

目的：考察本專利方法實施例2製備得到的晶型A化合物的物質穩定性。

方法：參考中國藥典（2015版）對原料藥穩定性試驗的要求，採用影響因素和加速/長期穩定性考察方法，測試晶型A的物質穩定性數據（試驗設計如下表6）。

儀器：氣候條件箱、光照箱。表 6. 穩定性試驗設計

項目	放置條件	考察時間	考察項目	樣品包裝
影響因素試驗	高溫^*	40℃，60℃，敞口暴露	5，10，30天	外觀、含量測定、水分含量、有關物質、吸濕增重、晶型（可選）	供試品開口放置
高濕^*	RH90%，RH75%；敞口暴露	5，10，30天
光照	4500lx±500lx；敞口暴露	5，10天
加速試驗	40℃±2℃，75%±5%	0，1，3，6月	雙層低密度聚乙烯袋扎帶包裝（模擬出廠包裝）
長期試驗	25℃±2℃，60%±10%	0，1，3，6，9，12，18，24，36月

*備註：影響因素實驗只有當60℃的檢測結果不符合接受標準才檢測40℃的樣品。只有當25℃/90%RH的檢測結果不符合接受標準才檢測25℃/75%RH的樣品。表 7. 影響因素實驗結果－高溫試驗

考察項目	高溫試驗； 60℃ （天）
0 天	5 天	10 天	30 天
外觀	米黃色粉末	米黃色粉末	米黃色粉末	米黃色粉末
CKF （ w/w ）	0.03%	0.02%	0.02%	0.02%
單個雜質	所有單個雜質≤0.05%	所有單個雜質≤0.05%	所有單個雜質≤0.05%	所有單個雜質≤0.05%
總雜質	0.0%	0.0%	0.0%	0.05%
含量	100%	100%	100%	99%
XPRD （可選項）	一致	一致	一致	一致

表 8. 影響因素實驗結果－高濕試驗

考察項目	高濕試驗（ 25℃/RH90% ）
0 天	5 天	10 天	30 天
外觀	米黃色粉末	米黃色粉末	米黃色粉末	米黃色粉末
CKF （ w/w ）	0.03%	0.03%	0.04%	0.03%
單個雜質	≤0.05%	≤0.05%	RRT(1.64)：0.05%	RRT(1.64)：0.05%
總雜質	0.0%	0.0%	0.05%	0.05%
含量	100%	100%	100%	100%
吸濕增重	N/A	0.3%	1%	0.2%
XPRD （可選項）	一致	一致	一致	一致

表 9. 影響因素實驗結果 -- 光照試驗

考察項目	光照實驗（天）
0	5	10
外觀	米黃色粉末	米黃色粉末	米黃色粉末
水分	0.03%	0.02%	0.02%
單個雜質	所有單個非指定雜質≤0.05%	RRT0.91：0.07%	RRT0.83：0.05%
總雜質	0.0%	0.07%	0.05%
含量	100%	100%	100%
XPRD （可選項）	一致	一致	一致

表 10. 影響因素實驗結果－光照試驗

考察項目	加速穩定性試驗（ 40℃/RH75% ）
0 月	1 月	2 月	3 月	6 月
外觀	米黃色粉末	米黃色粉末	米黃色粉末	米黃色粉末	米黃色粉末
CKF 測定的水分含量（ w/w ）	0.1%	0.04%	0.04%	0.02%	0.02%
最大單個雜質（ HPLC ）	0.05%	＜0.05%	＜0.05%	0.05%	0.06%
總雜質（ HPLC ）	0.05%	0.0%	0.0%	0.05%	0.06%
HPLC 測定的含量（ w/w ）	100%	100%	100%	100%	99%
XPRD （可選項）	一致	無	無	無	一致

表 11. 影響因素實驗結果－長期試驗

考察項目	長期穩定性試驗（ 25℃/RH60% ）
0 月	1 月	2 月	3 月	6 月	9 月	12 月	18 月	24 月	36 月
外觀	米黃色粉末	米黃色粉末	米黃色粉末	米黃色粉末	米黃色粉末	米黃色粉末	米黃色粉末	米黃色粉末	米黃色粉末	米黃色粉末
CKF 測定的水分含量（ w/w ）	0.1%	0.04%	0.05%	0.04%	0.03%	0.03%	0.1%	0.04%	0.1%	0.1%
最大單個雜質（ HPLC ）	0.05%	＜0.05%	＜0.05%	＜0.05%	0.06%	0.05%	0.05%	0.11%	0.05%	0.05%
總雜質（ HPLC ）	0.05%	0.0%	0.0%	0.0%	0.11%	0.05	0.05%	0.2%	0.05%	0.05%
HPLC 測定的含量（ w/w ）	100%	100%	100%	100%	99%	100%	100%	100%	100%	100%
XPRD （可選項）	一致	無	無	無	一致	無	一致	一致	一致	一致

測定結果和解析：影響因素、長期和加速穩定性研究數據表明，晶型A長期放置36個月，各項檢測指標與0天比較均無顯著變化，所有檢測指標符合既定標準且沒有出現明顯不良趨勢。說明本製程製備得到晶型A在現有包裝條件下穩定性良好，各項檢測指標能符合質量標準的要求。

（四）晶型A的成藥性研究

試驗例1

目的：評價晶型A在不同生物媒介中的溶解度比較試驗。

實驗設計：分別稱取約2.5mg式I化合物、晶型A（式I化合物甲磺酸鹽）到3個玻璃瓶中，向瓶中分別加入200μL的模擬胃液（Simulated Gastric Fluid，SGF）、禁食後小腸腸液（Fasted-state Simulated Intestinal Fluid，FaSSIF）和進食後小腸腸液（Fed-state Simulated Intestinal Fluid，FeSSIF）。攪拌混懸液約30min，37℃。（1）如果變成澄清溶液，繼續加入化合物直至成為混懸液；（2）如果不是，繼續攪拌混懸液24h。在24h，需要測量pH值及目測其外觀。如果24h後還是混懸液，離心分離其中的固體，上清液用50%的乙腈水溶液進行稀釋，然後稀釋液用HPLC測定濃度，進行含量檢測。結果見下表。表 12. 式 I 化合物和晶型 A 在不同生物媒介中的溶解度比較結果

化合物溶劑	式I化合物	晶型A
純水	0.05mg/ml	＞50mg/ml
模擬禁食腸液FaSSIF（PH=6.5)	0.02mg/ml	0.36mg/ml
模擬進食腸液FeSSIF（PH=4.8)	0.05mg/ml	1.1mg/ml
模擬胃液SGF（PH=1.2)	0.09mg/ml	＞95.5mg/ml

結論：式I化合物甲磺酸鹽的晶型A顯示在生物相關介質中的溶解度優於式I化合物，尤其在模擬胃液SGF介質中有顯著改善。提示，該晶型A適合於開發口服胃溶速釋固體製劑。

試驗例2

目的：評價SD大鼠單次口服晶型A和式I化合物後藥代動力學參數的比較。

實驗設計：健康SD大鼠，隨機分為式I化合物組（游離鹼）和式I化合物甲磺酸鹽晶型A組，兩組均為雄性，每組21隻，體重190-210g。禁食狀態下分別單次口服給予60mg/kg的各受試化合物，給藥後的0.5、1、2、4、8、12和24小時不同時間點靜脉採集全血並分離血漿，採用液相色譜/串聯質譜法（Liquid Chromatography-mass Spectrometry，LC-MS/MS）檢測血漿中的晶型A或式I化合物的藥物濃度，並使用非房室模型計算相關藥代動力學參數。其主要的藥物動力學參數如下表所示：表 13. 式 I 化合物組和式 I 化合物甲磺酸鹽晶型 A 組主要的藥物動力學參數表

藥動學參數	游離鹼	晶型A
C_max (ng/mL)	496	622
T_max (h)	4.00	2.00
T_1/2 (h)	5.02	3.31
AUC_0- ₂₄ (ng·h/ml)	5899	6754
AUC_0-∞ (ng·h/ml)	6236	6846
MRT_0- ₂₄ (h)	8.29	7.46
MRT0-_∞ (h)	9.53	7.75

C_max 血漿中藥物的最高濃度；T_max ：藥物最高濃度達峰時間；T_1/2 ：消除半衰期；AUC：血藥濃度-時間曲線下面積；MRT：藥物平均滯留時間

由上表和圖8可以得到結論：晶型A的生物利用度明顯優於游離鹼的生物利用度。

試驗例3

目的：評價晶型A作為肺癌藥物的藥物活性測試試驗。

1）對於特定細胞生長的抑制和選擇特異性實驗

方法：採用螢光細胞增殖技術以及細胞的顯微鏡可視化檢測技術（阿爾瑪藍法），檢測晶型A對人表皮癌細胞（A431，野生型EGFR）、人肺癌細胞（HCC827，EGFR 19號外顯子缺失型激活突變）、人肺癌細胞（H1975，EGFR L858R/T790M耐藥型突變）是否具有抗增殖活性。

實驗設計：取處於對數生長期的細胞接種在96孔板中（細胞濃度為2000個/孔；細胞懸液200μl/孔），30℃、5％CO₂ 培養24小時使細胞貼壁。將受試化合物的DMSO溶液用細胞培養基溶液從高到低稀釋到不同濃度，每次稀釋3倍，共得到9個不同濃度。將不同濃度的受試藥物溶液加入到有上述癌細胞的96孔細胞板中，每個濃度設3個複孔。同時設一個僅含DMSO的細胞培養基溶液的細胞對照孔。繼續在37℃、5％CO₂ 中繼續培養72小時後，終止培養。

細胞增殖採用Alamar Blue阿爾瑪藍試劑（刃天青）染色後檢測。刃天青（resazurin）會被細胞還原為試鹵靈試劑（resorufin）而成為螢光物質（544nm激發，612nm顯色），且螢光強度與細胞數成正比。刃天青試劑溶解在PBS溶液中，配製成濃度為440μM的儲備溶液。細胞培養板中加入40μl的440μM刃天青儲備液，共孵育5小時後，將細胞培養板恢復到正常培養條件，並使用Cytation3多模式酶標儀（Biotek）在72小時後讀取螢光測量值。

螢光檢測以無細胞（背景）孔讀數進行標準化（normalization），確定72小時內的總生長與溶媒對照孔的平均值（n=3）。結果見下表所示：表 14. 晶型 A 和奧希替尼對於特定細胞生長的抑制和選擇特異性實驗結果

測試藥物	H1975	HCC827	野生型	H1975選擇性（相對於A431）	HCC827選擇性（相對於A431）
晶型A	11.4	6.3	＞1000	＞87	＞159
奧希替尼^*	11	40	650	59	16

*數據來源：Table 4，P21，PHARMACOLOGY REVIEW(S)，APPLICATION NUMBER:208065Orig1s000， CDER of FDA; https://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/nda/2015/208065Orig1s000PharmR.pdf

結果顯示，晶型A化合物對於H1975、HCC827均顯示出了優異的抑制癌細胞增殖生長活性，對野生型細胞抑制生長不明顯，和國外上市產品（奧希替尼）相當；但晶型A顯示出對於H1975和HCC827細胞的更優越的抑制選擇性（相對於野生型A431癌細胞）。

2）對於不同激酶靶點的抑制選擇性

激酶抑制劑作為藥物進行臨床治療，需要避免抑制劑除了標靶激酶以外，還會同時抑制其他一些非標靶激酶，並有可能引起一些細胞毒性反應（即所謂的「脫靶效應」）。本實驗藉由KINOMEscan's體外競爭結合分析法^*1 對97種激酶（與人類疾病相關的突變位點激酶酶譜）進行了高通量篩選（kinase profiling）。表 15. 晶型 A 和奧希替尼對 97 種激酶酶譜進行高通量篩選的結果

測試藥物	激酶譜數目	結果	脫靶數目
晶型A	97種	10 µM濃度下僅對BTK，JAK3，ERBB2，ERBB4激酶有高度抑制作用。	4
奧希替尼^*2	未知	10 µM濃度，對ACK1，ALK，BLK，BMX，BRK，BTK，ERBB2，ERBB4，FAK，FGFR1，FLT3，FLT4，JAK3等24種激酶均有較高的抑制活性。	24

*1體外結合分析法詳細介紹參考：Fabian,M.A. et al. A small molecule-kinase interaction map for clinical kinase inhibitors. Nat. Biotechnol. 23, 329-336 (2005). *2數據來源：P15，P43，PHARMACOLOGY REVIEW(S)，APPLICATION NUMBER:208065Orig1s000， CDER of FDA; https://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/nda/2015/208065Orig1s000PharmR.pdf

結果顯示，晶型A化合物非靶標激酶的抑制活性的選擇性要優於已上市藥物奧希替尼。

試驗例4 晶型A的藥物安全性評價

1）安全藥理學試驗

目的：模擬臨床用藥途徑，經單次口服晶型A配製的口服給藥製劑後，觀察對SD大鼠中樞神經系統、SD大鼠呼吸系統和比格犬心血管系統的影響。旨在研究晶型A化合物在治療範圍內或治療範圍以上劑量時，潜在的不期望出現的對生理（中樞神經系統、呼吸系統和心血管系統）的潜在不良影響。

方法：「中樞神經實驗設計」取7周齡SD大鼠，雌雄各半，體重170-235g之間，共40隻SD大鼠（雌雄各20隻），隨機分成4組，每組雌雄各5隻。動物單次口服給予溶媒（0.5%（w/v）甲基纖維素），10、40或160mg/kg的溶解於1%（w/v）甲基纖維素（溶媒）的晶型A化合物混懸液，對照組動物僅給予溶媒。所有動物給藥體積為10mL/kg。使用功能性觀察組合（FOB），包括對動物的運動功能，行為改變，協調功能，感覺/運動反射和體溫的測試，評估不同劑量供試品對動物中樞神經系統功能的影響。實驗前、給藥後約2小時，4小時及24小時各進行了一次功能性觀察組合試驗（Functional Observation Battery，FOB）。「呼吸系統實驗設計」取7-8周齡SD大鼠，雌雄各半，體重168-287g之間，共40隻大鼠（雌雄各20隻）大鼠隨機分成4組，每組雌雄各5隻。動物單次口服給予溶媒（0.5%（w/v）甲基纖維素），10，40或160 mg/kg的溶解於0.5%（w/v）甲基纖維素（溶媒）的晶型A化合物混懸液，對照組動物僅給予溶媒。所有動物給藥體積為10 mL/kg。給藥當天，動物先在數據採集前放置「露頭式」的體積描記器中適應至少5分鐘，適應後，立刻進行呼吸數據（呼吸頻率、潮氣量、每分通氣量）採集，採集時間點為給藥前，給藥後約2小時（±10min），4小時（±10min）和24小時，每次採集持續時間為連續約15分鐘。記錄給藥前後潮氣量、呼吸量和呼吸頻率的變化。設0h、2h、4h和24h時間點。給藥後的各指標與自身對照比較，並進行統計分析。「心血管系統實驗設計」取22-24月齡比格犬，雌雄各半，體重9.3-10.5kg之間，共計6隻比格犬，預先植入遙感子設備。按照劑量遞增方式設計，每隻犬給予1次溶媒及10、30、100 mg/kg的溶解於0.5%（w/v）甲基纖維素（溶媒）的晶型A化合物混懸液，對照組動物僅給予溶媒。兩個劑量之間的間隔為3天（對照除外，對照之間的間隔為2天）。給藥體積為5ml/kg，實際給藥劑量基於動物最近稱量的體重。使用遙測方法，採集給藥前、給藥後2小時，4小時，6小時，8小時和24小時的心電圖數據，其獲得心電圖數據交由心電圖專家獸醫評價。

結果：口服晶型A，毒性低，對實驗動物的中樞神經系統、呼吸系統及心血管系統試驗結果均為陰性，提示不良反應較小，有較高的安全性。

2）遺傳毒性試驗

目的：遺傳毒性試驗可用於檢測體細胞誘變劑、生殖細胞誘變劑和潜在的致癌物。採用體外和體內遺傳毒性試驗組合的方法，選擇了細菌（包括鼠傷寒沙門氏杆菌和大腸杆菌）回復突變體外試驗（Ames試驗）、中國倉鼠卵巢細胞染色體畸變體外試驗和大鼠灌胃給藥骨髓微核體內試驗三部分試驗對晶型A給藥製劑潜在的遺傳毒性進行全面的評價。

方法：「Ames實驗設計」藉由檢測不同劑量晶型A化合物在加和不加外源性代謝活化系統（Aroclor1254 誘導的大鼠肝臟 S9）的條件下誘導選擇的四種組氨酸缺陷型的鼠傷寒沙門氏菌（TA98、TA100、TA1535和TA1537）和色氨酸缺陷型的大腸杆菌（Escherichia Coli WP2 uvrA）產生回復突變的能力，以評價其潜在的致突變能力。同時還設置了陰性/溶劑對照組及陽性對照組。實驗劑量設置為：對於TA98、TA100、TA1535和TA1537的加和不加S9系列為10、25、50、100、250和1000µg/皿；對於WP2 uvrA的加和不加S9系列為100、250、500、1000、2500 和5000µg/皿。「染色體畸變實驗設計」藉由檢測不同劑量晶型A化合物在加和不加外源性代謝活化系統（Aroclor1254 誘導的大鼠肝臟 S9）的條件下，誘導中國倉鼠卵巢細胞（CHO-WBL）產生染色體畸變的能力。加S9活化實驗系統中，細胞給藥處理3小時；不加S9實驗系統，細胞給藥處理3小時和22小時。在給藥後培養22小時後，收穫所有細胞。同時還設置了陰性/溶劑對照組及陽性對照組。實驗劑量設置為：加S9活化系統為：2、5、12和14µg/ml；不加S9非活化系列為1、3和6µg/ml。「骨髓微核實驗設計」取7-8周齡大鼠，體重241-306g之間，共46隻大鼠雄性大鼠隨機分成7組，每組6隻動物（其中5和6組為8隻）。分別單次口服給予溶媒（0.5%（w/v）甲基纖維素）（1、2組），500、1000、2000或2000mg/kg的溶解於0.5%（w/v）甲基纖維素（溶媒）的晶型A化合物混懸液（3-6組），和20mg/kg的陽性對照藥（環磷醯胺一水合物的生理鹽水溶液，經腹腔單次注射給藥）（7組）。所有動物給藥體積為10mL/kg。1、3、4、5和7組動物在給藥後約24小時剖殺，2和6組動物在給藥後約48小時剖殺後，檢測其骨髓中含微核的嗜多染紅細胞（Micronucleated PCE，MN-PCE）的形成率。

結果：晶型A化合物在所有遺傳毒性研究中均未發現遺傳毒性（Ames試驗，小鼠微核試驗及染色體畸變試驗）結果均為陰性。可以推斷晶型A不具有致突變性和明顯的遺傳危害。表明晶型A無明顯的遺傳毒性和致突變性作用。

臨床應用例1 晶型A的人體臨床試驗

目的：評估晶型A製備的口服製劑對既往接受過EGFR-TKI治療後疾病進展的局部晚期或轉移性非小細胞肺癌中國患者體內的服藥安全性和療效。

材料和方法：採用晶型A製備的膠囊劑（輔料為微晶纖維素、乳糖、交聯羧甲基纖維素鈉、膠態二氧化矽、硬脂酸鎂；混勻後按照所需藥物劑量直接充填灌裝3號明膠空心膠囊），對共計128例入組非小細胞肺癌患者進行了安全性和療效評估。

結果：已經完成了30、60、120、180、240、300mg等6個劑量組的單次和多次口服給藥後的臨床安全性研究，結果顯示30mg-300mg的劑量是安全的。

臨床試驗中期療效分析顯示從30-300mg每天一次QD，最低開始劑量30mg就顯示出療效（疾病控制率DCR80.0%），推薦II期劑量180mg的疾病緩解率ORR=73.1%，高於已上市藥物奧希替尼（66.1%）；疾病緩解率DCR為96.2%，亦高於已上市藥物奧希替尼（91%）。具體療效評價如下表：表 16. 不同劑量組的療效評價結果

劑量	30 mg	60 mg	120 mg	180 mg	240 mg	300 mg	Total
入組例數	10	6	26	52	3	2	128
CR	0	0	0	0	0	0	0
PR	4(40.0)	1(16.7)	16(61.5)	29(55.8)	11(34.4)	1(50.0)	62(48.4)
SD	4(40.0)	3(50.0)	6(23.1)	12(23.1)	13(40.6)	1(50.0)	39(30.5)
PD	2(20.0)	1(16.7)	2(7.7)	2(3.8)	1(3.1)	0	8(6.3)
ORR， n (%)	4(40.0)	2(33.3)	18(69.2)	38(73.1)	18(56.3)	1(50.0)	81(63.3)
DCR， n (%)	8(80.0)	5(83.3)	24(92.3)	50(96.2)	31(96.9)	2(100)	120(93.8)

以上涉及的術語，其精確解釋為，CR：完全緩解，PR：部分緩解，SD：疾病穩定，PD：疾病進展，ORR：客觀緩解率，DCR：疾病控制率。

臨床試驗中期療效分析顯示從30-300mg每天一次QD，不良反應發生率（比例和種類）明顯低於已上市藥物奧希替尼。具體安全性評價如下表：表 17. 晶型 A 和奧希替尼不良反應 AE 發生率對比表

不良反應AE	晶型A	奧希替尼^*
皮症Rash	任何級別：8.6% 3級以上：1.9%	任何級別：41% 3級以上：0.5%
腹瀉	任何級別：3.7% 3級以上：0%	任何級別：42% 3級以上：1%
QT延長	任何級別：1.9% 3級以上：0%	任何級別：2.7% 3級以上：0.2%
間質性肺炎	0%	1-3%
白細胞減少	任何級別：31.5% 3級以上：0.6%	任何級別：63% 3級以上：3.3%
中性粒細胞減少	任何級別：26.5% 3級以上：1.9%	任何級別：33% 3級以上：3.4%

表 18. 晶型 A 和奧希替尼大於 10% 的不良事件 TEAE 種類對比列表

受試藥品	患者數目	劑量	大於 10% 的不良事件 TEAE	種類數目
晶型A	128	30-300mg	上呼吸道感染(21%)，白細胞減少(19.3%)，中性粒細胞減少(17.6%)，淋巴細胞減少(12.6%)，貧血(11.8%)，血小板減少(10.1%)	4種
奧希替尼^*	未知	20-300mg	腹瀉（42%），噁心（17%），納差（16%），便秘（15%），口腔炎（12%），皮疹（41%），皮膚乾燥（31%），指甲毒性（25%），瘙癢（14%），眼病（18%），咳嗽（14%），疲勞（14%），背痛（13%），頭痛（10%），血小板減少（17%），白細胞減少（15%）	16種

*數據來源：Page 4，甲磺酸奧希替尼片藥品使用說明書及Page 89，MEDICAL & STATISTICAL REVIEW(S)，APPLICATION NUMBER: 208065Orig1s000，CDER of FDA; https://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/nda/2015/208065Orig1s000MedR.pdf

臨床應用例2晶型A的聯合用藥研究的應用

目的：觀察本發明實施例2製備得到的晶型A和化合物BPI-7722（N-(5-((4-乙基呱嗪-1-基)甲基)吡啶-2-基)-5-氟-4-(3-異丙基-2-甲基-2H-吲唑-5-基)嘧啶-2-胺鹽酸鹽）單藥或聯合用藥對人肺癌H1975裸小鼠皮下移植瘤的抑制作用。

材料和方法：

化合物BPI-7722的游離鹼形式可以由中國專利申請號CN201580047916.5（公開號CN106687454A）實例1合成並且具有下式結構：

。

細胞培養：H1975（人肺腺癌）購自中國科學院細胞庫，細胞培養於CO2恆溫培養箱中。細胞培養基為改良型RPMI；10%胎牛血清；100U/ml青黴素和100μg/ml鏈黴素。細胞使用0.25%胰酶進行消化處理，隔天傳代。待細胞擴增至所需細胞數且細胞處於對數生長期，收集細胞計數，以供接種。

實驗動物：BALB/c nude雄性裸鼠，24隻，6-7周，16-18g，每組6隻，購自上海靈暢生物科技有限公司。裸鼠接種H1975細胞後21天，選擇腫瘤體積在80-254mm3的24隻小鼠，根據腫瘤體積和體重隨機分成4組，每組6隻動物。分別為：組1：0.5％羧甲基纖維素鈉溶劑對照組；組2：實施例2晶型A（5mg/kg）單藥組；組3：BPI-7722（100mg/kg）單藥組；組4：晶型A（5mg/kg）/BPI-7722（25mg/kg）聯合用藥組。

實驗方法：人肺癌H1975細胞株（5×106個/隻）接種於實驗小鼠於右側背部皮下，定期觀察腫瘤生長情况，用游標卡尺測量移植瘤直徑，接種21天后，待腫瘤生長至平均（80-254mm3）時根據腫瘤大小和小鼠體重隨機分組。各組按上述劑量灌胃給藥，根據小鼠最新體重計算給藥量，給藥體積10ml/kg。每天給藥一次，連續21天。整個實驗過程中，每周測量三次小鼠的體重和腫瘤的大小，觀察是否出現毒性反應。腫瘤體積計算公式：腫瘤體積TV(mm3)＝0.5×(腫瘤長徑×腫瘤短徑2)。各實驗組腫瘤增長生長曲線見下表及圖9，體重曲線見下表及圖10。表 19. 各劑量組平均體腫瘤體積 - 時間關係匯總表

瘤體積(mm³ )	組 1- 空白對照 ^* （ 0.5%CMCNa ）	組 2- 實施例 2 （ 5mg/kg ）	組 3-BPI-7722 （ 100mg/kg ）	組 4- 聯合用藥
D0	152.59±60.66	153.77±56.70	152.36±50.05	150.84±50.55
D3	376.04±220.66	228.07±99.79	304.33±119.03	101.33±37.09
D7	632.59±205.15	233.86±160.71	415.12±271.05	31.02±4.58
D10	1026.29±398.49	286.94±202.00	451.54±307.56	21.92±3.78
D14	1881.69±721.92	367.72±335.00	549.95±389.04	19.28±4.50
D17	2712.36±1227.70	459.93±409.57	528.19±408.65	18.81±8.16
D21		588.33±536.12	520.81±456.22	11.62 ±3.14

*空白組由於腫瘤負荷過大，動物已經進行了安樂死，故第21天未進行數據採集。表 20. 各劑量組平均體重 - 時間關係匯總表

體重（ g ）	組 1- 空白對照（ 0.5%CMCNa ）	組 2- 實施例 2 （ 5mg/kg ）	組 3-BPI-7722 （ 100mg/kg ）	組 4- 聯合用藥
D0	20.79±1.47	20.98±0.79	21.02±0.83	21.40±0.62
D3	20.77±1.34	20.62±0.79	18.72±0.61	20.33±0.96
D7	21.13±1.53	20.99±0.65	18.33±0.85	19.97±1.11
D10	21.87±1.08	21.19±0.85	18.24±0.83	20.01±0.90
D14	22.69±1.90	21.12±1.21	18.14±1.22	20.45±0.87
D17	23.6±1.29	20.61±1.93	17.43±1.12	19.88±1.07
D21		20.00±1.85	17.19±1.52	19.21±1.35

*空白組由於腫瘤負荷過大，動物已經進行了安樂死，故第21天未進行數據採集。

結論：本發明實施例2的晶型A化合物單藥對人肺癌H1975裸小鼠皮下移植瘤的生長具有良好的抑制作用，聯合BPI-7722用藥後抑制效果明顯優於單藥抑制腫瘤的生長作用，並且顯示良好的安全性。

儘管本發明已藉由其實施方式連同參考附圖進行了一定程度的描述，但是值得注意的是，在閱讀了本申請的上述揭露內容之後，本領域技術人員可以無需背離本發明的精神和範圍，對本發明作出各種修飾、改動或修改，這樣的變化和修改都應該包括在本發明所附權利要求的範圍內。

無

圖1是式I化合物的核磁氫譜1H NMR圖譜。圖2是晶型A的核磁氫譜1H NMR圖譜。圖3是晶型A的XRPD圖譜及記載各個峰的數據的表格。圖4是晶型A的差示掃描量熱法（Differential Scanning Calorimetry，DSC）圖譜。圖5是晶型A熱重分析法（TGA）圖譜。圖6是晶型A的紅外光譜圖（Infrared，IR）圖譜。圖7是藉由不同製備方法得到晶型A的粉末X-射線衍射圖（XPRD）對比圖。圖8是SD大鼠單次給藥後血藥濃度-時間曲線圖。圖9是實施例2製備得到式I化合物的甲磺酸鹽（即晶型A）在單次和聯合給藥下的人肺癌H1975裸小鼠皮下移植瘤的腫瘤體積變化-時間曲線圖。圖10是實施例2製備得到式I化合物的甲磺酸鹽（即晶型A）在單次和聯合給藥下的人肺癌H1975裸小鼠的體重變化-時間曲線圖。

Claims

一種氨基嘧啶類化合物甲磺酸鹽的晶型A，所述氨基嘧啶類化合物為式I化合物，所述晶型A的XRPD圖譜具有在2θ(±0.2°)為12.57、13.74、14.65、15.48、16.58、17.83、19.20、19.79、22.05、24.23、25.10、26.15、27.37及27.42處的衍射峰，
。
如請求項1所述之氨基嘧啶類化合物甲磺酸鹽的晶型A，其中所述晶型A的XRPD圖譜如圖3所示。
如請求項1所述之氨基嘧啶類化合物甲磺酸鹽的晶型A，其中所述晶型A的紅外光譜圖如圖6所示。
一種請求項1至3任一項所述之氨基嘧啶類化合物甲磺酸鹽的晶型A的製備方法，包括：用有機溶劑溶解式I化合物的甲磺酸鹽，攪拌析晶、過濾、乾燥後得目標晶型A，所述有機溶劑包括二甲基亞碸、四氫呋喃、N-甲基吡咯烷酮、N，N-二甲基甲醯胺和N，N-二甲基乙醯胺。
如請求項4所述之製備方法，還包括：將式I化合物和甲磺酸按照投料莫耳比1.05-0.97製得式I化合物的甲磺酸鹽。
如請求項4所述之製備方法，其中加入反溶劑進行攪拌析晶，所述反溶劑包括甲基叔丁基醚、乙酸異丙酯、乙酸乙酯、甲基異丁基酮、乙腈、甲苯、丙酮和水。
如請求項4所述之製備方法，其中過濾後在30-70℃下進行常壓或真空乾燥。
一種藥物組合物，包含請求項1至3任一項所述之氨基嘧啶類化合物甲磺酸鹽的晶型A和藥學上可接受的載體。
一種請求項1至3任一項所述之氨基嘧啶類化合物甲磺酸鹽的晶型A、請求項8所述之藥物組合物或請求項1至3任一項所述之氨基嘧啶類化合物甲磺酸鹽的晶型A與BPI-7722聯合用藥在製備抗腫瘤藥物中的應用。
如請求項9所述之應用，其中所述腫瘤為肺癌，較佳為非小細胞肺癌。
一種治療或預防哺乳動物，尤其是人類中由EGFR突變介導的疾病或醫學病症，較佳為腫瘤的方法，包括向對有此需要的個體給予治療有效量的氨基嘧啶類化合物甲磺酸鹽的晶型A或包含氨基嘧啶類化合物甲磺酸鹽的晶型A和藥學上可接受的載體的藥物組合物。