TW202024327A

TW202024327A - 促進蘭花產生香味之基因、蛋白質及方法

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Publication number: TW202024327A
Application number: TW107145433A
Authority: TW
Inventors: 陳虹樺; 莊育禎; 蔡文杰; 洪逸筑; 陳文輝
Original assignee: 國立成功大學
Priority date: 2018-12-17
Filing date: 2018-12-17
Publication date: 2020-07-01
Also published as: TWI734060B

Abstract

本發明關於一種促進蘭花產生香味之核酸分子，及包含該核酸分子的一種細胞及一種轉殖蘭花。本發明另關於一種促進蘭花產生香味之聚肽，及一種促進蘭花產生香味之方法。

Description

促進蘭花產生香味之基因、蛋白質及方法

本發明係關於一種促進植物產生香味之基因，特別係關於一種促進蘭花產生香味之基因、蛋白質及方法。

植物花揮發物群中最主要的代表為萜類(Tholl, 2015, Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology 148, 63-106)，其在吸引傳粉者以進行繁殖(Blight等人, 1997, Journal of Chemical Ecology 23, 1715-1727；Byers等人, 2014, The Journal of Experimental Biology 217, 614-623)及抵禦病原體及食花動物(florivore) (Junker等人, 2011, Journal of Chemical Ecology 37, 1323-1331；Huang等人, 2012, New Phytologist 193, 997-1008)等方面皆扮演重要角色。除了其天然作用之外，由於其獨特的香味及風味，萜類廣泛用於化妝品及香料行業，以及用作食品添加劑(Schwab等人, 2008, The Plant Journal 54, 712-732；Caputi及Aprea, 2011, Recent Patents on Food, Nutrition & Agriculture 3, 9-16)。

萜類之生合成起始於基本C5單元異戊烯基二磷酸(isopentenyl diphosphate, IDP)及其異構體二甲基烯丙基二磷酸(dimethylallyl diphosphate, DMADP)之生產，兩種C5單元均由胞溶質中之甲羥戊酸(mevalonate, MVA)路徑或質體中之甲基赤蘚糖醇磷酸(methylerythritol phosphate, MEP)路徑合成。衍生自MVA路徑之C5前驅體優先用於倍半萜類(sesquiterpenoid)之生合成，而由MEP路徑生產之C5前驅體主要用於單萜類及二萜類之生合成。一組稱作短鏈異戊烯基轉移酶的酶負責連續縮合IDP與DMADP以生產萜類合成酶(terpene synthases, TPSs)之中間物，該等合成酶包括生產用於單萜之香葉基二磷酸(GDP，C10)的香葉基二磷酸合成酶(geranyl diphosphate synthase, GDPS)、生產用於倍半萜之法呢基二磷酸(FDP，C15)的法呢基二磷酸合成酶(farnesyl diphosphate synthase)及為二萜供應四異戊二烯基二磷酸(C20)之四異戊二烯基二磷酸合成酶(geranylgeranyl diphosphate synthase) (Dudareva等人, 2004, Plant Physiology 135, 1893-1902)。

儘管現今對花的萜類之生合成的瞭解逐漸增加，但對其調節卻知之甚少。迄今為止，已發現涉及萜類生合成之轉錄因子(transcription factors, TFs)包含多種不同的類型，且大部分對萜類生合成之調節的研究僅止於無性組織及果實。相較之下，對花的萜類生合成之調節則尚未充分研究，僅有一件關於AtMYC2促進芥菜屬中花序的倍半萜生產之研究(Hong等人, 2012, The Plant Cell 24, 2635-2648)。

本發明提供促進蘭花產生香味之一種核酸分子及一種聚肽。

本發明之一目的係提供一種經單離之核酸分子，該核酸分子係選自由下列所組成之群組： (a) 包含如SEQ ID NO: 1所示之核苷酸序列的核酸分子pbbHLH4 ； (b) 包含如SEQ ID NO: 1所示之核苷酸序列的退化序列(degenerate sequences)的一或多個核酸分子； (c) 編碼包含如SEQ ID NO: 2所示之胺基酸序列的聚肽之核酸分子； (d) 編碼包含如SEQ ID NO: 2所示之胺基酸序列且其中一或多個胺基酸經刪除、取代及/或插入修飾的聚肽之核酸分子，其中該聚肽具有促進一蘭花中之單萜及/或倍半萜生產之活性； (e) 編碼包含與SEQ ID NO: 2之相似度為85%以上之胺基酸序列的聚肽之核酸分子，其中該聚肽具有促進一蘭花中之單萜及/或倍半萜生產之活性；及 (f) 於高度嚴苛條件下與(a)至(e)所定義之任一核酸分子雜合的核酸分子。

本發明之另一目的係提供一種載體，包含如前述之核酸分子。

本發明之又一目的係提供一種細胞，其包含如前述之經單離之核酸分子。

本發明之又一目的係提供一種轉殖蘭花，包含如前述之核酸分子。

本發明之又一目的係提供一種蛋白質，其包含選自由下列所組成之群組的聚肽： (a) 包含如SEQ ID NO: 2所示之胺基酸序列的聚肽pbbHLH4； (b) 包含如SEQ ID NO: 2所示之胺基酸序列且其中一或多個胺基酸經刪除、取代及/或插入修飾的聚肽，其中該聚肽具有促進一蘭花中之單萜及/或倍半萜生產之活性；及 (c) 包含與SEQ ID NO: 2之相似度為85%以上之胺基酸序列的聚肽，該聚肽具有促進一蘭花中之單萜及/或倍半萜生產之活性。

本發明之又一目的係提供一種促進蘭花產生香味之方法，其包含增加如前述之蛋白質的表現。

本發明之又一目的係提供一種促進蘭花產生香味之方法，其包含以前述之載體轉殖該蘭花。

於本文中所使用的以下術語，除非另有說明，否則應理解為具有以下含義：

本文中所使用之「經單離之核酸分子」係指一核酸分子(1)其不與其他核酸分子之全部或部分相關(共價或非共價)，但該核酸分子於自然中與其他核酸分子相關；(2)不與一分子相關，該核酸分子於自然中與該分子不相關；或(3)於自然中不存在與其他核酸分子相關。該核酸分子可為基因體DNA、cDNA、mRNA、或其他人造RNA、或其組合。根據本發明之經單離之核酸分子可含有引導序列、編碼區域或非基因序列(exon)及基因序列(intron)，且其可包含不影響該核酸分子功能之外加核苷酸。例如，其5'及3'未轉譯區域可包含不同數目之核苷酸。

本文中所使用之「聚核苷酸」係指長度至少10鹼基之單股或雙股之核酸聚合物。於某些態樣中，該聚核苷酸可為核糖核酸或去氧核糖核酸或其經修飾之形式。該等修飾包含：溴尿苷(bromouridine)及肌苷(inosine)衍生物、如2',3'-雙去氧核糖(2',3'-dideoxyribose)之核糖(ribose)修飾物、如磷化雙硒代酯(phosphorodiselenoate)、磷化苯胺硫醇酯(phosphoroanilothioate)、磷化苯胺酯(phosphoraniladate)或磷化酰胺(phosphoroamidate)之核苷酸間鍵結修飾物及其類似物。本文中所使用之「聚核苷酸」可包含單股或雙股之DNA形式。

於本發明一較佳實施例中，經單離之核酸分子為(a) 包含如SEQ ID NO: 1所示之核苷酸序列的核酸分子pbbHLH4 ，其係衍生自大葉蝴蝶蘭(蝴蝶蘭屬)。本發明之經單離之核酸分子包含編碼由如SEQ ID NO: 1所示之胺基酸序列所組成的蛋白質的基因的等位基因。pbbHLH4 的完整cDNA包含1584個核苷酸，且編碼1581個核苷酸的開放閱讀框架，其對應527個胺基酸之預期的蛋白質。

於本發明一較佳實施例中，經單離之核酸分子為(b) 包含如SEQ ID NO: 1所示之核苷酸序列的退化序列(degenerate sequences)的一或多個核酸分子。本發明經單離之核酸分子具有選自對應pbbHLH4 所編碼之胺基酸殘基的任意密碼組合的核苷酸序列。密碼的選擇係利用慣用的方法完成，例如，選擇密碼可考慮宿主使用密碼出現的頻率。

於本發明一較佳實施例中，經單離之核酸分子為(c) 編碼包含如SEQ ID NO: 2所示之胺基酸序列的聚肽PbbHLH4之核酸分子。雖不願為任何理論所束縛，惟咸信PbbHLH4蛋白可轉活化香葉基二磷酸合成酶及/或萜類合成酶，因此具有促進一蘭花中單萜及/或倍半萜生產之能力。

如本文中所提及，術語「促進一蘭花中之單萜及/或倍半萜生產之活性」意指當在蘭花中表現基因或引入蛋白質時，可增加蘭花中單萜及/或倍半萜之生產。分析此類生產之方式可包括收集蘭花之代謝物，如由Chuang等人所描述(2017, Botanical Studies 58, 50)；及將代謝物藉由己烷溶離且藉由氣相層析法/高解析度質譜法(GC/HRMS)鑑別，如由Hsiao等人所描述(2006, BMC Plant Biology 6, 14；2008, The Plant Journal 55, 719-733)。

於本發明一較佳實施例中，經單離之核酸分子為(d) 編碼包含如SEQ ID NO: 2所示之胺基酸序列且其中一或多個胺基酸經刪除、取代及/或插入修飾的聚肽之核酸分子，其中該聚肽具有促進一蘭花中之單萜及/或倍半萜生產之活性。前述刪除、取代或插入之胺基酸位置是不受限制的，只要含有所得修飾胺基酸序列之聚肽仍呈現促進一蘭花中之單萜及/或倍半萜生產之活性即可。同理，可任意刪除、取代或插入胺基酸的數目亦不受限制，只要所得胺基酸序列所組成之聚肽具有促進一蘭花中之單萜及/或倍半萜生產之活性即可。

於本發明一較佳實施例中，經單離之核酸分子為(e) 編碼包含與SEQ ID NO: 2之相似度為85%以上之胺基酸序列的聚肽之核酸分子，其中該聚肽具有促進一蘭花中之單萜及/或倍半萜生產之活性。如本文所述，具有與一參考聚肽(例如SEQ ID NO: 2)之相似度為85%以上之胺基酸序列的聚肽，係指一聚肽因取代、刪除或插入而與該參考聚肽不同。舉例而言，一或多個胺基酸殘基被其他具有類似性質(基於尺寸、極性、疏水性等)的胺基酸殘基取代。胺基酸通常可分為三大類：親水性胺基酸、疏水性胺基酸和半胱胺酸樣胺基酸，主要取決於胺基酸側鏈的特徵。這些主類可以進一步劃分為子類：親水性胺基酸包含具有酸性、鹼性或極性側鏈的胺基酸；疏水性胺基酸包含具有芳香族或非極性側鏈的胺基酸；非極性胺基酸可以進一步細分為包含脂肪族之胺基酸及其他等。本文使用的胺基酸類別的定義如下：

「疏水性氨基酸」是指具有在生理pH值下不帶電並且被水溶液排斥的側鏈的胺基酸。遺傳編碼之疏水性氨基酸的實例包括異白胺酸、白胺酸和纈胺酸；非遺傳編碼之疏水性氨基酸的實例包括叔丁基丙胺酸。

「芳香族氨基酸」是指具有側鏈的疏水性氨基酸，所述側鏈含有至少一個具有共軛π-電子系統（芳香族基團）的環。芳香族基團可進一步被諸如烷基、烯基、炔基、羥基、硫烷基、硝基和氨基等，以及其他基團所取代。遺傳編碼之芳香族氨基酸的實例包括苯丙胺酸、酪胺酸和色胺酸；常見的非遺傳編碼之芳香族氨基酸包括苯基甘胺酸、2-萘基丙胺酸、β-2-噻吩基丙胺酸、1,2,3,4-四氫異喹啉-3-羧酸、4-氯-苯丙胺酸、2-氟苯丙胺酸、3-氟苯丙胺酸和4-氟苯丙胺酸。

「非極性氨基酸」是指具有側鏈的疏水性氨基酸，所述側鏈通常在生理pH下不帶電並且不是極性的。遺傳編碼之非極性氨基酸的實例包括甘胺酸、脯胺酸和甲硫胺酸。非編碼之非極性氨基酸的實例包括環己基丙胺酸。

「脂肪族氨基酸」是指具有飽和或不飽和直鏈、支鍊或環狀烴側鏈的非極性氨基酸。遺傳編碼之脂肪族氨基酸的實例包括丙胺酸，白胺酸、纈胺酸和異白胺酸；非編碼之脂肪族氨基酸的實例包括甘白胺酸。

「親水性氨基酸」是指具有被水溶液吸引的側鏈的氨基酸。遺傳編碼的親水性氨基酸的實例包括絲胺酸和離胺酸；非編碼親水性氨基酸的實例包括瓜胺酸和高半胱胺酸。

「酸性氨基酸」是指側鏈pK值小於7的親水性氨基酸，酸性氨基酸在生理pH下通常會失去氫離子而具有帶負電荷的側鏈。遺傳編碼之酸性氨基酸的實例包括天門冬胺酸和麩胺酸。

「鹼性氨基酸」是指側鏈pK值大於7的親水性氨基酸，鹼性氨基酸在生理pH下通常會與水合氫離子結合而具有帶正電荷的側鏈。遺傳編碼的鹼性氨基酸的實例包括精胺酸、離胺酸和組胺酸。非遺傳編碼的鹼性氨基酸的實例包括非環狀氨基酸鳥胺酸、2,3-二氨基丙酸、2,4-二氨基丁酸和高精胺酸。

「極性氨基酸」是指具有在生理pH下不帶電的側鏈的親水性氨基酸，但其具有兩個原子共有的電子對與其中一個原子更緊密結合的鍵。遺傳編碼之極性氨基酸的實例包括天門冬胺酸、天門冬醯胺、麩胺酸和麩胺醯胺。非遺傳編碼之極性氨基酸的實例包括瓜胺酸、N-乙醯基離胺酸和甲硫胺酸亞碸。

「半胱胺酸樣氨基酸」是指具有能夠與另一個氨基酸殘基的側鏈形成共價鍵的側鏈的氨基酸，例如二硫鍵。通常，半胱胺酸樣氨基酸通常具有含有至少一個硫醇(SH)基團的側鏈。遺傳編碼的半胱胺酸樣氨基酸的實例包括半胱胺酸。非遺傳編碼的半胱胺酸樣氨基酸的實例包括高半胱胺酸和青黴胺。

此外，編碼半胱氨酸殘基的一個或多個密碼子影響特定多肽的二硫鍵，因此缺失半胱氨酸殘基，並且殘基可被另一個氨基酸殘基取代。

相較於前述保守取代氨基酸殘基的情況，當任意取代氨基酸殘基時，所得蛋白質的特徵會略有變化。

於本發明一較佳實施例中，經單離之核酸分子(e) 編碼包含與SEQ ID NO: 2之相似度為95%以上、95%以上或99%以上之胺基酸序列的聚肽之核酸分子，其中該聚肽具有促進一蘭花中之單萜及/或倍半萜生產之活性

上述氨基酸序列的修飾（變異）可通過例如轉譯後的突變或修飾自然發生。天然存在的基因（例如，本發明的PbbHLH4 基因）亦可經人工修飾。本發明包含具有上述特徵的所有經修飾的基因，而不限制此類修飾和變異的形成原因或方法。

上述人工方法的實例包括：基因工程法，例如位點特異性誘變；化學合成法，如磷酸三酯法和磷酸鹽醯胺法；以及上述方法的組合。具體而言，DNA的合成可藉由亞磷醯胺法或三酯法以化學合成進行。或者，可使用市售的自動寡核苷酸合成裝置以進行DNA的合成。雙鏈DNA片段可由單鏈產物產生，所述單鏈產物可藉由在合適條件下退火合成互補鏈；或使用合適的引子序列及DNA聚合酶，添加互補鏈而化學合成。

於本發明一較佳實施例中，經單離之核酸分子為(f) 於高度嚴苛條件下與(a)至(e)所定義之任一核酸分子雜合的核酸分子。所述嚴苛條件並未特別限制，只要該DNA片段可用作為一引子或探針。舉例而言，雜核可於所述條件下進行；例如60℃下，含有0.1% SDS之0.2×SSC；或60℃下，含有0.1% SDS之0.1×SSC。

本發明之另一目的係提供包含前述核酸分子之載體。該載體可用於保存、生產該核酸分子，或用於將該核酸分子導入原核微生物、真核微生物、植物體或植物細胞中；較佳地，該載體係為一穿梭載體(shuttle vector)。本文所使用之「穿梭載體」一詞係指可同時於植物中及便於複製之細胞(通常為原核生物)中操作及選擇之載體。通常該穿梭載體包含可選擇之標記，如可於植物細胞中選擇之抗康納黴素(kanamycin)標記或可於原核生物中選擇之抗放線菌素(actinomycin)標記。此外，該載體亦包含可於原核生物中複製之起始點(origin)；且較佳包含至少一個獨特的限制性位點，或含有獨特限制性位點的多重選殖位(polylinker)，以用於構建。

另一方面，根據本發明之核酸分子較佳係受一啟動子控制。更佳地，該啟動子係可於植物之生殖組織或部器中驅動基因的表現，如花椰菜鑲嵌病毒35S蛋白質啟動子(cauliflower mosaic virus 35S protein promoter)、α-1及β-1微管蛋白(tubulin)啟動子及組織蛋白(histone)啟動子。在本發明之一些具體實施例中，該啟動子為可誘導之啟動子，其包含但不限於熱休克蛋白啟動子、包含葉綠素a/b光之光驅動啟動子。本發明所屬技術領域中具通常知識者根據本發明的教示，即可完成該等載體的構築。

本發明之另一目的係一種細胞，其包含如前述之經單離之核酸分子。

於本發明一較佳實施例中，所述細胞係為原核細胞、真核細胞、植物細胞、單子葉植物細胞、蘭花細胞、蝴蝶蘭細胞及衍生自擬原球體(protocorn-like body)之細胞。本文中所使用之「擬原球體」係為具強分化能力、增生能力且增殖速率快之組織。較佳的，該核酸分子係經轉殖作用(transformation)導入所述細胞中。本文中所使用之「轉殖作用」一詞，係指經由導入一核酸分子，而改變該細胞中之遺傳物質。本發明所屬技術領域中具通常知識者經由本發明之揭示及一般分子生物學之知識可完成此轉殖作用，如將載體導入一細菌時可採用熱休克方式，將載體導入植物細胞時可採用基因槍(gene gun)方式進行。

本發明之以該基因轉殖的植物包含蘭花及蘭花細胞，較佳為蝴蝶蘭屬；其可為野生型，和經化學修飾、X光活化隨機突變、重組技術或體細胞複製變異所產生的人工突變體。

較佳地，所述轉殖蘭花包含以該經單離之核酸分子轉殖的至少一細胞，其可藉由本技術領域中具通常知識者已知的常規方法進行轉殖。

於本發明之一實施例中，可藉由再生經本發明之基因轉殖的植物細胞，其能夠改變該植物之表型，其中該轉殖植物之細胞皆具有相同的遺傳物質。於本發明之另一實施例中，可藉由以本發明之基因轉殖一植物中的部分細胞，例如生殖細胞或組織，以獲得鑲嵌植物(mosaic plant)，其中只有經轉殖之細胞可表現相較於親代植物經修飾的表型。

本發明另提供一種製造轉殖蘭花之方法，其步驟包含： (a) 將本發明之核酸分子導入蘭花細胞中，以獲得一蘭花轉殖細胞；及 (b) 再生該蘭花轉殖細胞以製造該轉殖蘭花。

於本發明一實施例中，該轉殖蘭花可藉由營養繁殖或無菌播種時之擬原球體而產生。由擬原球體中分離個別細胞後，其可分別再生成一新擬原球體進而發育成一植株。於步驟(a)中，係將核酸分子（較佳以基因槍）導入擬原球體中。此時，擬原球體中之某些細胞形成轉殖細胞，某些則未導入該分子，可經由載體上之選擇標記篩選經轉殖之細胞。於步驟(b)中，將該轉殖細胞再生為該轉殖植物。本文中所使用之「再生」一詞係指自一植物細胞、一群植物細胞或植物的一部份成長為一植物之方法，此再生之方法為本發明所屬技術領域中具通常知識者所熟知，因此本發明可提供一轉殖蘭花產物。

下列範例僅用於說明本發明，惟本發明之範圍並不以此為限。實例： 材料及方法 植物材料及生長條件

此研究中使用通常用作育種親本之五種蝴蝶蘭屬(Phalaenopsis )蘭花，包括兩種有香味蘭花及三種無香味蘭花。兩種有香味蘭花為大葉蝴蝶蘭及P. Meidarland Bellina Age 'LM128'，其分別購自名卉蘭園(Ming-Hui Orchids Nursery，台灣雲林)及美達蘭業(Meidarland Orchids，台灣台南)。三種無香味蘭花為爪哇蝴蝶蘭，來自彌陀蘭園(Mi-Tuo Orchids，台灣高雄)；版納蝴蝶蘭，來自光豐吉安蘭園(Ji An Guang Feng，台灣花蓮)；及臺灣白花蝴蝶蘭(P. aphrodite subsp. formosana )。有香味蘭花(大葉蝴蝶蘭)的基因組(15.03 pg/2C)較無香味白花蝴蝶蘭的基因組(2.80 pg/2C)大上許多(Lin等人, 2001, Journal of the American Society for Horticultural Science 126, 195-199)。所有植物在自然條件下置於國立成功大學(National Cheng Kung University，台灣台南)之溫室中。對花揮發物之層析分析

在開花後第5日(D+5)收集蝴蝶蘭屬蘭花之花代謝物，持續收集6 h (自10.00 h至16.00 h)，因其代表其最大排放區間(Chuang等人, 2017, Botanical Studies 58, 50)，並將植物之花置於如Chuang等人所描述之香味提取裝置(2017, Botanical Studies 58, 50)中。為分析香味組合物，將代謝物自單朵花中取樣，進行三次生物重複實驗。作為陰性對照，分析源自香味提取裝置之代謝物作為背景。在國立成功大學儀器中心將所收集之揮發物藉由己烷溶離且藉由氣相層析法/高解析度質譜法(GC/HRMS)鑑別，如Hsiao等人所描述(2006, BMC Plant Biology 6, 14；2008, The Plant Journal 55, 719-733)。轉錄組建構、組裝及標註

為大葉蝴蝶蘭之四個開花階段構建轉錄組：開花日(D0)、D+3、D+5及D+7。如先前所描述，自全部花提取總RNA，其中具有重複生物重複序列(Hsiao等人, 2006, BMC Plant Biology 6, 14；2008, The Plant Journal 55, 719-733)，並以RNA 6000奈米檢定(RNA 6000 Nano Assay)及Agilent 2100生物分析儀(Agilent 2100 bioanalyser)進行RNA之品質控管。以北京基因組研究所(Beijing Genomics Institute)之Illumina HiSeq 2000進行四個cDNA庫之製備及後續定序，將來自四個cDNA庫之淨讀數以Trinity(20130225版本)進行整個轉錄組建構之重新(De novo )組裝(Grabherr等人, 2011, Nature Biotechnology 29, 644)，且所得序列為單基因(unigene)。計算各樣品中各單基因的表現量係以每百萬個映射讀數中之每千個鹼基轉錄物(fragments per kilobase of transcript per million mapped reads, FPKM)，基於與各cDNA庫中之單基因唯一對應之片段的數目計算。

為進一步理解單基因之作用，使用NCBI之非冗餘(non-redundant, Nr)蛋白質資料庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，藉由具有1.0×10^-5 之E值截止的BLASTx標註該等單基因。自Orchidstra (Su等人, 2011, Plant & Cell Physiology 52, 1501-1514；2013a, Plant & Cell Physiology 54, e11；2013b, PLoS ONE 8, e80462)下載白花蝴蝶蘭之花轉錄組及其標註，Orchidstra已升級至Orchidstra 2.0 (http://orchidstra2.abrc.sinica.edu.tw/orchidstra2/index.php)，其中單基因之相對表現來源於花序芽(floral bud)及盛開階段下之微陣列分析。由於使用兩種不同的方法以產生蝴蝶蘭轉錄組資料，因此藉由定量即時PCR以實驗方式驗證最顯著結果。蘭花中轉錄因子 (TF) 之短暫異位表現

質體之構建係如先前所描述(Hsu等人, 2015, Plant Physiology 168, 175-191)，以基因特異性引子自大葉蝴蝶蘭之盛開花擴增PbbHLH4 之編碼序列，且將其轉移至載體p1304NhXb中之重複的CaMV 35S啟動子下。如先前所描述，在開花日(D0)將攜載所得純系之農桿菌(Agrobacterium tumefaciens ) EHA105滲入至白花蝴蝶蘭之無香味花中，進行三重複實驗(Hsu等人, 2015, Plant Physiology 168, 175-191)，並以僅含有GUS之啟動子為陰性對照。與萜類生物合成相關之轉錄因子的鑑別

為分離轉錄因子及調節子，下載PlnTFDB資料庫(版本3.0；Perez-Rodriguez等人, 2010, Nucleic Acids Research 38, D822-D827)中28193個蛋白質以供查詢，使用具有1.0×10^-50 之E值截止的TBLASTn檢索大葉蝴蝶蘭轉錄組，隨後以iTAK (Zheng等人, 2016, Molecular Plant 9, 1667-1670)對所得序列進行分類。其中，分離出335個標註為bHLH、bZIP、ERF、NAC、MYB及WRKY之基因，且將FPKM＞1之165個基因導入至短時間序列表現挖掘(Short Time-series Expression Miner, STEM)軟體(Ernst及Bar-Joseph, 2006)以對其表現圖譜進行分類。對於STEM分析，藉由將四個開花階段(D0、D+3、D+5及D+7)之FPKM含量減去第一階段之值，將時間表現圖譜轉換成以0開始，並以軟體提供之STEM叢集方法將因子根據其表現模式聚集成10個圖譜。定量即時 PCR

以如先前所描述(Hsiao等人, 2006, BMC Plant Biology 6, 14；2008, The Plant Journal 55, 719-733)之方法提取總RNA。對於P. Meidarland Bellina Age 'LM128'、白花蝴蝶蘭、爪哇蝴蝶蘭及版納蝴蝶蘭，在開花D+5階段提取總RNA；對於大葉蝴蝶蘭，在五個開花階段提取總RNA：D-1、D0、D+3、D+5及D+7。以DNA酶(NEB，UK)去除DNA污染之後，使用SuperScript III (ThermoFisher Scientific)將RNA樣品反轉錄成cDNA。基於兩個蘭花轉錄組中之對應轉錄物設計引子，以同時偵測大葉蝴蝶蘭及白花蝴蝶蘭之轉錄物。如先前所描述，使用StepOnePlus 定量即時PCR系統及SYBR Green套組(Applied Biosystems)進行定量即時PCR (Hsu等人, 2015, Plant Physiology 168, 175-191)。根據參考基因PbActin1，將所有基因之表現常態化。進行三次生物重複實驗，且以杜凱氏純正顯著差異檢定在α=0.05下進行組間成對比較。結果 GDPS 可能引起蘭花中單萜之生合成

偵測大葉蝴蝶蘭、P. Meidarland Bellina Age 'LM128'、爪哇蝴蝶蘭、版納蝴蝶蘭及臺灣白花蝴蝶蘭中兩個物種之單朵花的單萜散發量，如圖1A所示；令偵測檢測其中GDPS之表現量，如圖1B所示。

偵測結果顯示在有香味蘭花(例如大葉蝴蝶蘭)與無香味蘭花(例如白花蝴蝶蘭)之間，其GDPS之表現具有顯著性差異。GDPS 之差異性表現模式與單萜之生產相伴，其暗示該等差異性表現模式與有香味蘭花表現型具有強烈關聯。GDPS 提供進一步單萜生合成之前驅體，且GDPS 之增強表現可能引起蘭花中單萜生物合成。因此，無香味白花蝴蝶蘭中缺乏較高表現量之GDPS ，可能即為單萜累積量少之原因。以相關度分析鑑別與 PbGDPS 表現相關聯之轉錄因子

已在多種植物物種中，偵測到用於萜類生合成之數種類型的轉錄因子，包括bHLH、bZIP、ERF、NAC、MYB及WRKY。以PlnTFDB (Perez-Rodriguez等人, 2010, Nucleic Acids Research 38, D822-D827)之BLAST檢索，並藉由iTAK (Zheng等人, 2016, Molecular Plant 9, 1667-1670)分類，在大葉蝴蝶蘭轉錄組中鑑定出前述類型中共335種轉錄因子。由於PbGDPS在大葉蝴蝶蘭轉錄組中高度表現(FPKM＞30)，故選擇FPKM值＞1之165個TF基因以進一步分析。應用下述二項標準，以鑑別調節用於單萜生物合成之GDPS 的候轉錄因子：(1) 在花發育期間，轉錄因子必須在PbGDPS 表現模式之前出現或與其同時出現；及(2) 轉錄因子之表現必須在大葉蝴蝶蘭中上調(up-regulated)但在白花蝴蝶蘭中下調(down-regulated)。其中，可發現一種轉錄因子PbbHLH4 ，其在兩個轉錄組之間展示更強的差異性表現。bHLH4 之 表現伴隨蝴蝶蘭屬蘭花中之單萜生物合成

進一步檢測有香味蘭花及無香味蘭花中bHLH4 之表現量，如圖1C所示。bHLH4 基因在商業有香味栽培品種P. Meidarland Bellina Age 'LM128'中高度上調，該栽培品種為散發高含量單萜類之大葉蝴蝶蘭的後代。相較之下，在爪哇蝴蝶蘭及版納蝴蝶蘭中這兩種無香味蘭花中，其基因之表現量皆下調。bHLH4 之差異性表現模式與單萜之生產相伴，暗示該等差異性表現模式與有香味蘭花表現型具有強烈關聯。無香味蘭花中 PbbHLH4 之短暫異位表現

依據前述，可假設白花蝴蝶蘭中PbbHLH4 之異位表現可能誘導有香味之表現型。蝴蝶蘭屬蘭花缺少高效穩定轉型系統，可用的此類系統的轉型效率低且再生時間長。因此，為測試前述假設，係以農桿菌滲入白花蝴蝶蘭之花中，以用於高效且快速的短暫表現分析(Hsu等人, 2015, Plant Physiology 168, 175-191)。將PbbHLH4 之編碼序列構建於雙CaMV 35S啟動子之控制下，且在開花日(D0)引入至白花蝴蝶蘭之花中。藉由定量即時PCR，測定表現PbbHLH4 之白花蝴蝶蘭的花中bHLH4之表現量，如圖2A所示。在滲入後4天時量測這些花發出之花香，且使用GC-MS分析對其進行鑑別。可偵測到相較於GUS 對照組中之一組單萜類及倍半萜類的排放(每花0.002 μg h-1)，表現PbbHLH4 之白花蝴蝶蘭的花中之單萜類及倍半萜類的排放(每花1.89 μg)顯著增加(約950倍)，如圖2B所示。單萜類中主要為松香醇衍生物，諸如α-松香醇(主要組分)、β-松香醇、γ-松香醇、1-松香醇及異松油烯，其伴隨痕量之1,4-桉葉素、檸檬烯、葑酮及樟腦；亦於經滲入之花中偵測到兩種倍半萜類，α-雪松烯及β-雪松烯。

上述實施例僅為說明本發明之原理及其功效，而非限制本發明。因此，習於此技術之人士對上述實施例所做之修改及變化仍不違背本發明之精神。本發明之權利範圍應如後述之申請專利範圍所列。

圖1.蘭花中GDPS 及bHLH4 表現模式。(A) 在D+5開花階段 (開花之後5天)時，有香味大葉蝴蝶蘭(P. bellina ) (根據圖1B)及P. Meidarland Bellina Age 'LM128' (標記為LM128)，以及無香味白花蝴蝶蘭(P. aphrodite ) (根據圖1B)、版納蝴蝶蘭(P. mannii )及爪哇蝴蝶蘭(P. javanica )中單萜散發量。(B、C) D+5花中GDPS (B)及bHLH4 (C)之表現。表現量係依據Actin1 之表現量進行常態化，資料係來為三重複實驗之平均值(±SE)。使用杜凱氏純正顯著差異檢定(Tukey's honestly significant difference test)進行組間成對比較，且不同字母顯示於α =0.05下具有顯著差異。

圖2顯示藉由在無香味白花蝴蝶蘭之花中短暫異位表現PbbHLH4 而產生的香味化合物。在滲入後5天時，對短暫異位表現GUS 及PbbHLH4 之花所散發的萜類含量進行分析，以GUS 為對照，資料係為三次滲入之平均值(±SE)。(B) 表現PbbHLH4 之白花蝴蝶蘭之花中bHLH4 的表現量，其係以定量即時PCR所測定。表現量以Actin1之表現量常態化，資料係為三重複實驗之平均值(±SE)。

Claims

一種經單離之核酸分子，該核酸分子係選自由下列所組成之群組： (a) 包含如SEQ ID NO: 1所示之核苷酸序列的核酸分子pbbHLH4 ； (b) 包含如SEQ ID NO: 1所示之核苷酸序列的退化序列(degenerate sequences)的一或多個核酸分子； (c) 編碼包含如SEQ ID NO: 2所示之胺基酸序列的聚肽之核酸分子； (d) 編碼包含如SEQ ID NO: 2所示之胺基酸序列且其中一或多個胺基酸經刪除、取代及/或插入修飾的聚肽之核酸分子，其中該聚肽具有促進一蘭花中之單萜及/或倍半萜生產之活性； (e) 編碼包含與SEQ ID NO: 2之相似度為85%以上之胺基酸序列的聚肽之核酸分子，其中該聚肽具有促進一蘭花中之單萜及/或倍半萜生產之活性；及 (f) 於高度嚴苛條件下與(a)至(e)所定義之任一核酸分子雜合的核酸分子。
如請求項1之經單離之核酸分子，其中(e)之核酸分子編碼包含與SEQ ID NO: 2之相似度為95%以上之胺基酸序列的聚肽，該聚肽具有促進一蘭花中之單萜及/或倍半萜生產之活性。
一種載體，包含如請求項1之核酸分子。
如請求項3之載體，其係為可於植物體中表現該核酸分子之穿梭載體。
如請求項3之載體，其包含可誘導之啟動子。
一種細胞，其包含如請求項1之經單離之核酸分子。
如請求項6之細胞，其係為原核細胞。
一種轉殖蘭花，包含如請求項1之核酸分子。
如請求項8之轉殖蘭花，其係為蝴蝶蘭(Phalaenopsis spp.)。
一種蛋白質，其包含選自由下列所組成之群組的聚肽： (a) 包含如SEQ ID NO: 2所示之胺基酸序列的聚肽pbbHLH4； (b) 包含如SEQ ID NO: 2所示之胺基酸序列且其中一或多個胺基酸經刪除、取代及/或插入修飾的聚肽，其中該聚肽具有促進一蘭花中之單萜及/或倍半萜生產之活性；及 (c) 包含與SEQ ID NO: 2之相似度為85%以上之胺基酸序列的聚肽，該聚肽具有促進一蘭花中之單萜及/或倍半萜生產之活性。
如請求項10之蛋白質，其中(c)之聚肽編碼包含與SEQ ID NO: 2之相似度為95%以上之胺基酸序列的聚肽，該聚肽具有促進一蘭花中之單萜及/或倍半萜生產之活性。
一種促進蘭花產生香味之方法，其包含增加如請求項10之蛋白質的表現。
如請求項12之方法，其中係藉由增加該蘭花之至少一細胞中編碼該蛋白質之核酸分子的套數，以增加該蛋白質的表現。
如請求項12之方法，其中該香味包含單萜及倍半萜。
一種促進蘭花產生香味之方法，其包含增加一蛋白質的表現，該蛋白質包含選自由下列所組成之群組的聚肽： (a) 包含如SEQ ID NO: 2所示之胺基酸序列的聚肽pbbHLH4； (b) 包含如SEQ ID NO: 2所示之胺基酸序列且其中一或多個胺基酸經刪除、取代及/或插入修飾的聚肽，其中該聚肽具有促進一蘭花中之單萜及/或倍半萜生產之活性；及 (c) 包含與SEQ ID NO: 2之相似度為85%以上之胺基酸序列的聚肽，該聚肽具有促進一蘭花中之單萜及/或倍半萜生產之活性。
如請求項15之方法，其中係藉由增加該蘭花之至少一細胞中編碼該蛋白質之核酸分子的套數，以增加該蛋白質的表現。
一種促進蘭花產生香味之方法，其包含以一載體轉殖該蘭花，該載體包含一經單離之核酸分子，該核酸分子係選自由下列所組成之群組： (a) 包含如SEQ ID NO: 1所示之核苷酸序列的核酸分子pbbHLH4 ； (b) 包含如SEQ ID NO: 1所示之核苷酸序列的退化序列的一或多個核酸分子； (c) 編碼包含如SEQ ID NO: 2所示之胺基酸序列的聚肽之核酸分子； (d) 編碼包含如SEQ ID NO: 2所示之胺基酸序列且其中一或多個胺基酸經刪除、取代及/或插入修飾的聚肽之核酸分子，其中該聚肽具有促進一蘭花中之單萜及/或倍半萜生產之活性； (e) 編碼包含與SEQ ID NO: 2之相似度為85%以上之胺基酸序列的聚肽之核酸分子，其中該聚肽具有促進一蘭花中之單萜及/或倍半萜生產之活性；及 (f) 於高度嚴苛條件下與(a)至(e)所定義之任一核酸分子雜合的核酸分子。
如請求項17之方法，其中該載體係為可於植物體中表現該核酸分子之穿梭載體。
如請求項17之方法，其中該載體包含可誘導之啟動子。
如請求項17之方法，其包含以包含於農桿菌(Agrobacterium tumefaciens )中之該載體轉殖該蘭花。