TW202023394A

TW202023394A - 降低魚隻殘食率之方法及組合物

Info

Publication number: TW202023394A
Application number: TW107146683A
Authority: TW
Inventors: 陳宗嶽; 陳逸民; 張嘉修; 陳俊延; 張毓涵
Original assignee: 國立成功大學
Priority date: 2018-12-22
Filing date: 2018-12-22
Publication date: 2020-07-01
Also published as: TWI713960B

Abstract

本發明係關於一種降低魚隻殘食率之方法，其包含投予魚隻有效量之n-3多元不飽和脂肪酸或小球藻藻株。本發明亦關於一種n-3多元不飽和脂肪酸之用途及一種降低魚隻殘食率之組合物。

Description

降低魚隻殘食率之方法及組合物

本發明係關於魚隻飼養之技術。特定言之，本發明係關於一種降低魚隻殘食率之方法及組合物。

由於世界人口不斷增加，以及全球能源及氣候變遷等錯綜複雜之因素交互作用，導致了世界糧食安全危機的產生，提升單一面積生產量及增加附加營養價值成為世界糧食生產的趨勢（陳宗嶽、徐浩軒，2014，免疫抑制技術在飼料添加物之應用。農業生物季刊，40：42-46）。由於陸上食物單位面積生產量之增加已效益有限，食物的供應將難以滿足眾多人口的消耗，自水域中生產食物日趨重要。惟，因對海洋資源毫無節制地過度利用，已造成海洋資源的枯竭，雖目前已警覺到問題之嚴重性，並致力於實施各項保護政策，但短期內仍難恢復海洋的資源量。因此，在海洋資源嚴重缺乏的情況下，水產養殖漁業快速發展，以其可永續管理水產資源的優勢，逐漸取代捕撈漁業，並且成為全球發展最快速的食物生產領域（Bostock, J., McAndrew, B., Richards, R., Kim, J., Telfer, T., Lorenzen, K., & Little, D. 2010. Aquaculture: global status and trends. Philosophical Transactions of Royal Society B 365(1554）: 2897-2912.）。台灣由於地處於亞熱帶區域，為漁業發展提供了優良條件，因此，魚類、蝦類、貝類等水生生物養殖產量皆極為可觀，對於全球水產品供應鏈之貢獻更是名列前茅，其中石斑養殖的技術與產量，是足以使台灣掌握優勢之關鍵。但是依據聯合國農糧組織資料中顯示，目前石斑魚的供應量仍然遠低於未來預期之需求，主要原因在於石斑魚生長速度較其他魚種緩慢，至少需八至十二個月才達上市體型，並且易受氣候變化及病害影響，據統計，台灣石斑魚從卵孵育到最後的收成率平均約只有0.3%。石斑魚養殖度過白身苗階段後，正式進入吋苗階段，其受到高致死之神經壞死病毒感染威脅將大幅降低，然而卻緊接面臨殘食問題。由於石斑魚是典型之肉食性魚類，以獵捕其他的魚、蝦類維生，在高密度、缺乏遮蔽的單一物種養殖環境中，很容易出現獵捕同類的殘食行為（Liao, I. C., Su, H. M., & Chang, E. Y. 2001. Techniques in finfish larviculture in Taiwan.Aquaculture 200(1-2）: 1-31.）。當點帶石斑達體長1至3公分會出現嚴重的殘食行為，若如無執行適當的餵食及分魚措施，可能造成50%以上魚隻的損失（Takeshita, A., & Soyano, K. 2009. Effects of fish size and size-grading on cannibalistic mortality in hatchery-reared orange-spotted grouperEpinephelus coioides juveniles.Fisheries Science 75(5）: 1253-1258.）。石斑吋苗的殘食行為和尺寸差異息息相關，當較大魚隻的體長超過較小魚隻的1.3倍時，就有可能發生大魚吞食小魚行為（Harikrishnan, R., Balasundaram, C., & Heo, M. S. 2010. Molecular studies, disease status and prophylactic measures in grouper aquaculture: Economic importance, diseases and immunology.Aquaculture 309: 1-14.）。為解決肉食性魚類之殘食問題，養殖業者會透過例行性的分魚，將「魚頭」(吞食其他魚隻的大魚）及「魚尾」(發育遲緩、被吞食的小魚）分開，雖可有效降低石斑魚苗之殘食率，然而耗費人力甚鉅，同時容易造成魚皮受傷及緊迫，導致感染及死亡。過去曾有研究指出於飼料內添加1.0%色胺酸，以提高魚隻腦部的血清素含量而降低大魚的攻擊慾望，進而改善殘食率，然而卻因此降低魚隻食慾及延緩魚隻成長，反而提高養殖成本（Hseu, J. R., Lu, F. I., Su, H. M., Wang, L. S., Tsai, C. L., & Hwang, P. P. 2003. Effect of exogenous tryptophan on cannibalism, survival and growth in juvenile grouper,Epinephelus coioides .Aquaculture 218(1-4）: 251-263.），不利於養殖界推廣。

於魚類養殖業而言，提供一種降低魚隻殘食率且兼顧魚隻成長之方法至關重要。本揭露係關於一種降低魚隻殘食率之方法，其包含投予魚隻有效量之n-3多元不飽和脂肪酸或小球藻（Chlorella sorokiniana ）SU-9藻株，其中SU-9藻株係寄存於中華民國台灣新竹食品工業發展研究所，寄存編號爲BCRC980050。本揭露係關於一種n-3多元不飽和脂肪酸或小球藻（Chlorella sorokiniana ）SU-9藻株之用途，其係用以製備降低魚隻殘食率之組合物，其中SU-9藻株係寄存於中華民國台灣新竹食品工業發展研究所，寄存編號爲BCRC980050。本揭露係關於一種降低魚隻殘食率之組合物，其包含有效量之n-3多元不飽和脂肪酸或小球藻（Chlorella sorokiniana ）SU-9藻株，其中SU-9藻株係寄存於中華民國台灣新竹食品工業發展研究所，寄存編號爲BCRC980050。上文已相當廣泛地概述本揭露之技術特徵及優點，俾使下文之本揭露詳細描述得以獲得較佳瞭解。構成本揭露之申請專利範圍標的之其它技術特徵及優點將描述於下文。本揭露所屬技術領域中具有通常知識者應瞭解，可相當容易地利用下文揭示之概念與特定實施例可作為修改或設計其它方法或組合物而實現與本揭露相同之目的。本揭露所屬技術領域中具有通常知識者亦應瞭解，這類等效建構無法脫離後附之申請專利範圍所界定之本揭露的精神和範圍。

參考以下對本發明之各態樣、實例、及伴隨相關描述之圖式及表格的詳細描述，可更容易地瞭解本發明。在揭示及描述本發明之化合物、組合物及/或方法之前，應瞭解，除非由申請專利範圍另外特別地指出，否則本發明不受限於特定製備方法、載劑或調配物、或將本發明化合物調配成用於局部、經口或非經腸投予之產物或組合物的特定模式，此係由於熟習相關技術之通常知識者非常清楚此等事情是可以加以變化的。亦應瞭解，本文所用之術語僅用於描述特定態樣之目的而不意欲用於限制性本發明之範疇。本文中所使用之術語僅為描述特定例示實施例之用，並不旨在限制本發明之概念。除非另外指出，否則如本發明所用之以下術語應解釋為具有以下含義。本文中所使用單數形式「一」、「一個」和「該」也意指包括複數形式。還應理解者，當在本說明書中使用時，術語「包括」和「包含」係指所述特徵、整體、步驟、操作、元件或組件之存在，但不排除存在或添加一個或多個其他特徵、整體、步驟、操作、元件或組件。「視情況」或「視情況地」意謂隨後所述之事件或狀況可能發生或可能不發生，且該描述包括該事件或狀況發生之情況及其未發生之情況。舉例而言，「視情況包含藥劑」意謂該藥劑可能存在或可能不存在。術語如本文所提供之化合物的「有效量」意謂該化合物之量足以提供對所需功能之所需調節。如下文所指出，確實的需要量將在個體之間有變化，此視個體之狀況、年齡、性別、物種及體重、組合物之特性及配方等而定。給藥方案可經調整以誘導最佳治療反應。舉例而言，可每日投予若干分次劑量，或可依治療情形之緊急程度按比例減少劑量。因此，很難指定確實的「有效量」。然而，本發明領域中具有通常知識者使用常規實驗即可確定適當的有效量。本揭露係關於一種降低魚隻殘食率之方法，其包含投予魚隻有效量之n-3多元不飽和脂肪酸或小球藻（Chlorella sorokiniana ）SU-9藻株，其中SU-9藻株係寄存於中華民國台灣新竹食品工業發展研究所，寄存編號爲BCRC980050。根據本揭露之方法可適用於各種魚體中；較佳地，該魚體係為硬骨魚綱(Osteichthyes ），目前包括斑馬魚、大西洋鮭魚、莫三比克吳郭魚、條紋鱸魚、金頭鯛魚、虹鱒、河鱒、河鯰、點帶石斑魚及日本真鱸；更佳地，該魚體係為硬骨魚綱鱸行目(Perciforms ）；尤佳地，該魚體係為硬骨魚綱鱸行目鮨科(Serranidae ）；尤佳地，該魚體係為硬骨魚綱鱸行目鮨科石斑亞科(Epinephelinae ）；尤佳地，該魚體係為硬骨魚綱硬骨魚綱鱸行目鮨科石斑亞科石斑屬(Epinephelus ）；最佳地，該魚體係為點帶石斑魚(Epinephelus coioides ）。本文中所指之n-3多元不飽和脂肪酸又稱ω−3脂肪酸，從脂肪酸分子中距離羧基最遠的甲基端（稱為ω端）的碳原子計數，這一類分子的第三個碳原子與第四個碳原子之間為雙鍵（即第三根鍵為雙鍵），因此稱為ω−3脂肪酸。舉例言之，該n-3多元不飽和脂肪酸包括但不限於十六碳三烯酸、α-亞麻酸、硬脂四烯酸、二十碳三烯酸、二十碳四烯酸、二十碳五烯酸、二十一碳五烯酸、二十二碳五烯酸、二十二碳六烯酸、二十四碳五烯酸或二十二碳六烯酸，更佳係為二十二碳六烯酸。目前大部分已知使用的n-3多元不飽和脂肪酸萃取皆來自於深海魚類，其油脂富含n-3多元不飽和脂肪酸，然而，近年於氣候影響下漁獲減少，透過海水魚萃取動物性n-3多元不飽和脂肪酸之成本已逐漸升高，且其作為人類的健康食品需求量極高，遑論成為水產養殖之飼料添加物，也不符合養殖之成本效益。較佳地，本揭露中之n-3多元不飽和脂肪酸係由微藻所提供。舉例言之，該微藻包括但不限於橙壺藻（Aurantiochytrium ）、裂殖壺藻（Schizochytrium ）、破囊壺藻（Thraustochytrium ）或隱甲藻（Crypthecodinium ）。該橙壺藻包含但不限於紅樹橙壺藻(Aurantiochytrium mangrovei ），較佳係為BL10藻株，其係寄存於中華民國台灣新竹食品工業發展研究所，寄存編號爲BCRC980009；該裂殖壺藻較佳係為G13/2S、N-2、S31或SR21藻株；該破囊壺藻較佳係為ATCC34304（購自美國典型培養物保藏中心）或ONC-T18藻株；該隱甲藻較佳係為ATCC30772藻株（購自美國典型培養物保藏中心）。 BL10藻株經分析為一種富含n-3多元不飽和脂肪酸（特別是二十二碳六烯酸）之高含量二十二碳六烯酸異營性微藻。BL10的生產效率高，可以利用發酵槽進行高密度培養，在最佳生長條件下，每公升的培養密度可以達到59g乾重，可生產16.8g的二十二碳六烯酸，同時有極佳的轉換率，換算每消耗100g的培養基能獲得8.4 g的二十二碳六烯酸，這些數據均遠優於其他藻株。於本揭露之一較佳具體實施例中，以添加BL10之方式添加n-3多元不飽和脂肪酸，確實有助於降低幼魚之殘食率，同時恢復族群內弱勢魚的食慾，進而使其與優勢魚間的尺寸差異不至於被進一步拉大，且最終提高魚群養殖的生存率，更克服習知技術中需人工分魚或添加色胺酸降低魚隻食慾而延緩魚隻成長之問題，此外，微藻添加之成本低廉，更具優勢。另一方面，本揭露亦以提高飼料誘引方式，降低魚隻之殘食率，其包含投予魚隻有效量之小球藻（Chlorella sorokiniana ）SU-9藻株，其中SU-9藻株係寄存於中華民國台灣新竹食品工業發展研究所，寄存編號爲BCRC980050。雖不願為理論所限制，但咸信SU-9藻株富含高蛋白及呈味胺基酸，對魚隻具誘引性，其嗜口性及魚隻生長皆不會受到抑制，甚至可作為特殊季節之誘引劑，且因魚隻對飼料之誘引性增加，則對同類的殘食行為大幅減少，而使殘食率降低。根據本揭露之方法，較佳係另包含投予魚隻小球藻（Chlorella vulgaris ）FSP-E藻株，其係寄存於中華民國台灣新竹食品工業發展研究所，寄存編號爲BCRC980051。雖不願為理論所限制，但咸信因藻株具有高蛋白，可作為飼料當中之魚體養分來源，使魚隻順利成長，當魚池中小尺寸之魚苗可順利成長，使大小魚間之尺寸差異可改善，亦可降低殘食率。根據本揭露之藻類可以任何形式提供，較佳係以粉末形式提供。製備藻類粉末之方法包含但不限於乾燥。另一方面，根據本揭露之藻類較佳係經細胞壁破裂處理，細胞壁破裂處理之方法包含但不限於高壓均質化處理。本揭露係關於一種n-3多元不飽和脂肪酸或小球藻（Chlorella sorokiniana ）SU-9藻株之用途，其係用以製備降低魚隻殘食率之組合物，其中SU-9藻株係寄存於中華民國台灣新竹食品工業發展研究所，寄存編號爲BCRC980050。本揭露係關於一種降低魚隻殘食率之組合物，其包含有效量之n-3多元不飽和脂肪酸或小球藻（Chlorella sorokiniana ）SU-9藻株，其中SU-9藻株係寄存於中華民國台灣新竹食品工業發展研究所，寄存編號爲BCRC980050。根據本發明之組合物較佳為醫藥組合物或飼料組合物。本發明之醫藥組合物可藉由本發明領域中已知之任何方法局部或全身投予，包括但不限於藉由肌肉內、皮內、靜脈內、皮下、腹膜內、經口、黏膜或外部途徑投予。適當的投藥途徑、調配方法及投藥時程可由本發明領域中具有通常知識者來決定。在本發明中，醫藥組合物可根據相應投藥途徑以多種方式調配，諸如液體溶液、懸浮液、乳液、糖漿、錠劑、丸劑、膠囊、持續釋放調配物、散劑、顆粒、安瓿、注射液、輸注液、套組、軟膏、洗劑、擦劑、乳膏或其組合。在必要時，其可經滅菌或與任何醫藥學上可接受之載劑或賦形劑混合，其中有許多醫藥學上可接受之載劑或賦形劑已為一般技術者所知。根據本發明之飼料組合物中，該n-3多元不飽和脂肪酸或藻類可在飼料製造過程中，添加於習用之飼料組合物中(亦即可食用之飼料或其前驅物）。幾乎所有之飼料組合物皆可添加根據本發明之該n-3多元不飽和脂肪酸或藻類。以下之非限制性之實例有助於本發明所屬技術領域中具通常知識者實施本發明。該等實例不應視為過度地限制本發明。本發明所屬技術領域中具有通常知識者可在不背離本發明之精神或範疇的情況下對本文所討論之實施例進行修改及變化，而仍屬於本發明之範圍。實例 1 BL10 粉末的生產 紅樹橙壺藻（Aurantiochytrium mangrovei ）BL10藻株透過發酵生產一批BL10細胞後，利用小型滾筒乾燥設備，壓製出20公斤的滾筒乾燥藻粉。 BL10藻粉之規格如下表1所示：表1：規格組成

粗蛋白	18.8
粗脂	54.3
醣類	14.5
灰份	4.4
濕份	8.0

脂肪酸組成（g/100 g粉末）

C14:0	2.31
C16:0	21.97
C18:0	0.65
C18:1n-9	0.16
C18:3n-3	0.01
C20:4n-6	0.38
C20:5n-3	0.18
C22:5n-6	2.15
C22:6n-3	17.20
總計	46.19

飼料配製 配製四種等氮、等油脂的配方（粗蛋白含量48%，粗脂含量12%）；詳細的原料組成如表2所示。飼料的製作，是將粉狀原料置於攪拌器中，攪拌均勻後，加入油脂繼續攪拌，直至其均勻散佈於粉狀原料內為止。隨後加入溶於少量水的氯化膽鹼繼續攪拌，讓各原料混合成濕度適中的糰狀飼料後，利用擠壓膨化機擠壓成形，製成2 mm粒徑的飼料後，於室溫風乾，待水份含量低於10%後，移至4°C冰箱保存。表2：4種實驗飼料的配方、粗成分及脂肪酸組成

成分 ¹	飼料	脂肪酸組成 ¹	飼料
0%	2%	4%	6%	0%	2%	4%	6%
BL10粉末	0.00	2.00	4.00	6.00	C14:0	1.32	1.36	1.48	1.44
魚粉	60.63	60.22	59.81	59.40	C16:0	2.53	2.92	3.57	4.12
烏賊肝粉	5.00	5.00	5.00	5.00	C16:1n-7	1.04	1.02	1.03	0.94
干貝粉	5.00	5.00	5.00	5.00	C18:0	0.46	0.46	0.44	0.42
麩質	3.00	3.00	3.00	3.00	C18:1n-9	1.92	1.73	1.60	1.35
魚油	2.17	2.21	2.24	2.28	C18:2n-6	2.69	2.20	1.85	1.30
大豆油	3.00	2.40	1.81	1.21	C18:3n-3	0.41	0.42	0.42	0.35
澱粉	15.00	15.00	15.00	15.00	C20:4n-6	0.19	0.21	0.20	0.16
氯化膽鹼	0.10	0.10	0.10	0.10	C20:5n-3	1.72	1.70	1.73	1.51
維生素預拌物²	1.00	1.00	1.00	1.00	C22:5n-6	0.03	0.08	0.12	0.15
礦物質預拌物³	2.00	2.00	2.00	2.00	C22:5n-3	0.08	0.10	0.09	0.07
纖維素	3.10	2.07	1.04	0.01	C22:6n-3	1.86	2.30	2.79	3.02
			Σ n-3	4.07	4.52	5.03	4.95
		Σ n-6	2.91	2.49	2.17	1.61
					比例
規格組成
粗蛋白	48	48	48	48	飽和/不飽和⁴	0.43	0.49	0.56	0.68
粗脂	12	12	12	12	n-3/n-6	1.4	1.8	2.3	3.1
醣類	15	15	15	15	EPA/DHA	1.1	1.4	1.6	2.0

¹ g/100 g 餵食² 包含0.25%維生素B1、1.00％核黃素、0.05％泛酸鈣、3.75％菸酸、0.20％維生素B6、0.005％葉酸、2.0％肌醇、0.5％L-抗壞血酸-2-單磷酸鎂、0.20％甲萘醌、0.50％α-生育酚乙酸酯、0.10％乙酸視黃酯、0.00025％膽鈣化固醇、0.025％生物素、0.005％維生素B12和91.19％α-纖維素³ 包含32.70％乳酸鈣、23.98％磷酸氫二鉀; 13.58％磷酸氫鈣二水合物、13.20％硫酸鎂七水合物、8.72％磷酸氫二鈉二水合物、4.35％氯化鈉、2.97％檸檬酸鐵、0.3％硫酸鋅七水合物、0.1％氯化鈷六水合物、0.08％一水硫酸錳、0.015％碘化鉀、0.015％氯化鋁六水合物、0.01％氯化銅⁴ 飽和對不飽和脂肪酸之比例動物實驗 將實驗用魚苗置於500 L之玻璃纖維強化塑膠桶內，以一般的商業飼料馴養兩星期。循環水系統內含鹽度26±1 ‰、水溫控制於28±1°C。水表的光照強度為250 Lux，每日光照12小時（9:00 am - 9:00 pm）。待體長接近3.8公分時，篩選體型相近之石斑魚苗（全長介於3.8±0.2公分的魚苗），進行生化分析及殘食實驗。殘食實驗部分，則是將480隻體長符合3.3~3.4公分的魚苗，移入同一個循環水系統內另3個玻璃纖維強化塑膠桶槽內飼養。每個玻璃纖維強化塑膠桶內具網籠，每個籠的尺寸為L x W x H = 36 x 36 x 58 cm（75 L），每個籠移入40隻魚，隨機餵食含0%、2%、4%或6% BL10藻粉的飼料配方，每天早上10點及下午8點各餵食一次，每次餵食石斑魚體重3%的飼料，並詳細記錄魚隻的攝食量。餵養一星期後，將個別魚隻撈出，進行尺寸的量測，作法是將個別魚隻撈起後，以紗布擦乾後，儘速完成體重及體長的量測，並依體重量測結果估算未來一星期的餵食量。在兩星期的餵養期間的餵食前進行例行性的檢查，將網籠由玻璃纖維強化塑膠桶內提起，集中魚隻，以方便進行觀察。觀察重點為：是否有魚隻減少、如有看到未被吞食的死魚，是否有咬傷痕跡、是否有魚隻正在吞食其他個體，或腹部有異常的隆起，由此研判是否出現殘食。統計分析 以t-test程式分析實驗組間包括殘食率是否達差異程度，並以簡單線性迴歸分析程式分析殘食率。殘食率分析 於兩個星期的實驗期間，可觀察到當添加BL10於飼料內，確實可降低魚苗的殘食率：然而是以少量添加的2%效果最佳，而非高量添加的4%及6%，其結果示於圖1。結果證實BL10的添加，確實有助於降低點帶石斑幼魚的殘食率。初步可推論因BL10的添加，恢復族群內弱勢魚的食慾，進而使其與優勢魚間的尺寸差異不至於被進一步拉大。結果證明，2% BL10於飼料中的添加具有良好的抑制殘食率的效果，且BL10的添加不會影響魚苗的生長速率、價格便宜許多，可紓緩魚隻緊迫，進而增加動物福利，可以廣泛應用在海水魚苗的養殖場。實例 2 藻株篩選過程 於台灣內陸區的淡水水塘、湖泊、河流、沿海等可能具有大型藻類、珊瑚礁、海草、紅樹林以及養殖池的地區進行採樣，並根據不同收集藻種特性而選擇不同採樣地點。經由在固態培基上進行四區劃線的純化及初步型態鑑定後得到2株藻種，以BG-11液態培養基依序進行初步馴養，篩選生長較為快速之藻株，將藻體進行離心並經過兩次的去離子水清洗，而後凍乾，接著取25～30 mg 之乾藻粉，加入1 mL 的 6N HCl 在真空玻璃管中持續24小時進行酸水解，最後將水解產物置於55°C乾浴槽中並抽真空至乾燥，隨後加入2 mL之NaN₃ 回溶之後利用胺基酸分析儀進行分析（ICS-5000, Amino Acid Analyzer, DIONEX, USA）。而後利用胺基酸分析結果挑出具有發展誘引劑潛力之藻株後便進行身份鑑定，以23S rDNA基因進行選殖（cloning）及定序，並將定序結果以NCBI GeneBank資料庫中的BLAST軟體進行比對，了解其與資料庫中已知物種的親緣關係之後，再進一步的搜尋相關的分類文獻，利用型態鑑定確認屬名與種名。其結果示於表3。表3：初步分離純化並以型態鑑定之藻種：

藻種	命名	適合鹽度	採樣地區
*Chlorella* sp.	SU-9	淡/海水	台南市安平區

藻株培養方法 目標藻種之最適化培養首先將SU-9於BG-11固態培養基上進行活化，於光照培養箱（配置螢光燈，光強度20 μmol photons m⁻² s⁻¹ ，光週期12小時，溫度27±1°C）活化後，取出單一細胞群聚，接種於含200mL BG-11培養基之250mL血清瓶進行前培養，待生長8天後接種於兩瓶各 1000 mL之BG-11培養基（打氣量0.2 vvm；光照為雙側連續24小時，光強度為各150 μmol photons m⁻² s⁻¹ ，轉速則控制在300 rpm），起始濃度控制在OD₆₈₀ 為0.1。培養至對數生長末期時，將藻液取出，以1/10之接種量加入4個含4L BG-11培養基之5L血清瓶光反應器內進行培養，培養條件同1L血清瓶，並搭配5 g/L之葡萄糖及提升BG-11內NaNO₃ 濃度至2.5 g/L，以提高生長效率。至對數生長末期時，以離心法（5000 x g, 5 min）採收藻細胞，以去離子水潤洗細胞兩次後進行細胞破壁試驗，而後以冷凍乾燥法移除水份，作為飼料添加的材料。藻細胞破壁方法將養成之藻株進行離心（6000 × g，3 min），而後以ddH₂ O潤洗並離心兩次，最後用兩倍體積的ddH₂ O加入濕藻泥中重新將藻體懸浮，以利後續破壁的使用。利用高壓均質機（high pressure homogenizer）（又稱法式細胞破碎機，French press）進行藻之破壁，將機器預先降溫至4°C以下後，以RO水搭配15000 psi潤洗儀器2~3次，待進入正式破壁時，將壓力改成30000 psi，接著並將藻液不斷慢慢倒入樣品乘載槽中進行連續破壁處理，經由破壁之後的微藻許多胞內物質會流至液體中，因此將樣品不經離心，直接全部凍乾以避免流失有效活性物質。根據破壁實驗結果，藻株在經過高壓均質機處理後，細胞壁破損程度估計可達90%以上。細胞濃度之定量以藻體溶液在定波長之吸光度與細胞乾重之相對關係作檢量線，之後生物質重量濃度之測量即採用光學密度(optical density; OD）法，只需測量藻液之OD值，即可求出相對應之藻體重量濃度，針對特殊狀況時，直接將藻液利用紅外線水分分析儀進行烘乾，進而得到實際生物質含量。飼料製作方法 將破壁後的藻粉SU-9以1:1混合後以不同劑量及有無添加草本植物誘引劑配製成四組不同取代烏賊肝粉及干貝粉含量的實驗飼料，實驗總共分成四組，分別為取代0%、50%、100%、50% + 草本物質（50% + HC），飼料組成配方如表4。表4：高蛋白及誘引性藻粉飼料之組成

	微藻粉量（g/kg）
飼料成分（g/kg）	0	50	100	50 + HC
魚粉	606.3	611.6	616.9	613.8
魚油	21.7	21.6	21.5	21.6
大豆油	30	30	30	30
魷魚肝粉	50	25	0	15
干貝粉	50	25	0	15
微藻粉	0	50	100	50
草本物質	-	-	-	20
α-澱粉	120	120	120	120
麩質	30	30	30	30
維生素預拌物	10	10	10	10
礦物質預拌物	20	20	20	20
氯化膽鹼	1	1	1	1
纖維素	61.0	55.8	50.6	53.6

動物實驗方法 以250尾約三吋的點帶石斑幼魚，馴養一週後從其中挑出120尾體型較相近的魚隻隨機分成四大組（0%、50%、100%、50% + HC），每組採三重複，整個實驗過程養殖在成功大學安南校區室內之循環水系統，其餵食量以體重之3%為基準，確實記錄水溫、水質、餵食飼料量及餵食時間，實驗時間為8 週，每周皆會量測體重及體長，探討不同藻粉取代量及額外添加草本植物的飼料，對石斑魚成長之影響，並進行各項成長指標包含增重率、飼料轉換率、攝食量、魚體肉片組成成分分析等之數據計算。結果 藻株篩選 篩選之藻株當中以SU-9藻種蛋白含量較高，且呈味胺基酸含量豐富，認為此藻種最具有發展水產飼料誘引劑之潛力，後續便進行藻種身分鑑定。經過定序及型態鑑定後，確認目標藻種為Chlorella sorokiniana 。其胺基酸含量列於下表5及6。表5：不同藻種之蛋白質及胺基酸組成分析（%，乾重）

	SU-9
Arg	11.03
Lys	9.22
Gln	3.93
Asn	N/D
Gly	3.51
Thr	2.44
Ala	1.83
Val	1.15
Ser	1.89
Pro	3.81
Ile	1.06
Leu	3.66
Met	1.20
His	N/D
Phe	2.02
Glu	9.73
Asp	N/D
Cys	N/D
Tyr	1.91
蛋白量	58.38

動物實驗結果 數據顯示，在餵食時間結果，發現到一般情況下四組間的餵食時間並無顯著差異，不過在水溫（下表7）下降時，以藻粉取代全部飼料中誘引性物質時期攝食時間相較於其他組別皆有顯著縮短的情況，推測藻粉的添加可能使魚隻在低溫下依然保有較佳之食慾，可進一步應用於在冬季時改善魚隻食慾之特殊誘引劑，解決此季節生長遲緩之問題。而由存活率分析，四組間雖無顯著差異，然只有在100%之藻粉取代無任何魚隻死亡，從結果也可看到在控制組及添加甜菜萃取物之組別其魚隻個體差異較大，100%藻粉組最小，因此推估藻粉的添加可能使魚隻生長較為均一，因此較不容易產生死亡。表7：每週水質及溫度平均紀錄：

	1 wk	2 wk	3 wk	4 wk	5 wk	6 wk	7 wk	8 wk
NH₃ /NH₄ ⁺ (ppm ）	0.8	0.4	0.4	0.1	0.4	0.4	0.6	0.3
pH	7.2	6.8	6.7	6.7	6.4	6.8	6.4	6.5
溫度 (^O C ）	25.4 ± 1.1	25.4 ± 0.5	23.6 ± 1.6	22.9 ± 2.8	26.1 ± 0.9	24.3 ± 2.0	20.9 ± 0.7	22.6 ± 0.5

經由破壁之富含高蛋白及呈味胺基酸之小球藻SU-9的確可成功取代飼料中具誘引性之動物蛋白質，其嗜口性及魚隻生長皆不會受到抑制，甚至可能可作為特殊季節之誘引劑，且小球藻成本低廉，來源穩定，亦不會受海洋重金屬污染之威脅，為新興之水產飼料誘引劑。實例 3 藻株篩選過程及培養方法 同實例2之方法篩選得Chlorella vulgaris FSP-E藻株。首先將FSP-E取0.2 mL的藻液塗抹於BG-11培養基上，於光照培養箱（配置螢光燈，光強度14 μmol photons m⁻² s⁻¹ ，光週期12小時，溫度27±1°C）活化後，取出單一細胞群聚，接種於含500 mL BG-11培養基的1 L血清瓶內（打氣量0.2 vvm；光照為連續24小時），培養至對數生長末期時，將藻液取出，平均接種於3個50 L之管柱光反應器，培養條件同1 L血清瓶，並搭配2 g/L之醋酸鈉作為有機碳源提高生長效率。至對數生長末期時，以離心法（5000 × g, 5 min）採收藻細胞，以去離子水潤洗細胞兩次後，以冷凍乾燥法移除水份，作為飼料添加的材料。飼料製作及動物實驗方法 飼料原料經粉碎後與不同替代比例的FSP-E藻粉混合，再噴入水潤濕，經打粒機之模孔打粒成型，於室溫風乾，而後儲存於-20°C之冰箱中。選取初重為11.5±1.0克的點帶石斑魚苗180尾，分別置於6桶500L之玻璃纖維強化塑膠桶內，每桶30尾，並將水缸逢機分爲三組，每組採三重複，以一般的商業飼料馴養兩星期。循環水系統內含鹽度28±1 ‰、水溫控制於28±1°C。每天中午12時投餵一次含0%、10%、20%、30%藻粉替代飼料配方，飼育實驗共進行八週，投餵量為魚體重的5%，並詳細記錄每日投餵量，每週稱重一次。實驗結束時，測量魚體長及體重。自每組逢機取三尾魚，將魚解剖取出魚肉，而後儲存於-20°C之冰箱中，以待進行魚肉粗成分分析。並將以上記錄進行各項成長指標包含增重率、飼料轉換率、分析等之數據計算。各項數據分析方法 增重率（Percent weight gain, PWG） PWG(%） =

飼料轉換率（Feed conversion ratio, FCR） FCR =

存活率（Survival rate）存活率（%） =

結果 藻株篩選 已篩選15株以上之藻種，以酸水解的方法測定蛋白質的胺基酸含量，從中選取生長速度較快、蛋白含量較高之藻株FSP-E（下表8），以其作為可替代魚粉之藻株。表8：藻種之蛋白質及胺基酸組成分析

飼料配方比例及粗成分分析 使用的基礎飼料主要蛋白質為魚粉，蛋白質含量為60.12%，脂肪含量為 6.96%。試驗飼料則為FSP-E之藻粉，藻粉再細分為經物理破裂細胞壁以及無任何物理破壁之二類藻粉，以二組之藻粉取代基礎飼料中的魚粉，取代比率為魚粉蛋白的0%、10%、20% 及30%，飼料配方及一般粗成分分析則如下表9至12：表9：無破壁飼料配方

	無破壁藻粉取代魚粉量（ % ）
成分（ % ）	控制組	藻 10 %	藻 20 %	藻 30 %
	g/kg
魚粉	606.26	545.64	485.01	424.38
藻粉	0	76.63	153.26	229.89
魚油	21.72	27.05	32.39	37.72
大豆油	30	30	30	30
魷魚肝粉	50	50	50	50
干貝粉	50	50	50	50
α- 澱粉	120	120	120	120
麩質	30	30	30	30
維生素預拌物	10	10	10	10
礦物質預拌物	20	20	20	20
氯化膽鹼	1	1	1	1
纖維素	61.02	39.68	18.34	0

表9：破壁飼料配方

	無破壁藻粉取代魚粉量（ % ）
成分（ % ）	控制組	藻 10 %	藻 20 %	藻 30 %
	g/kg
魚粉	606.26	516.84	427.41	337.99
藻粉	0	100	200	300
魚油	21.72	22.63	23.54	24.45
大豆油	30	30	30	30
魷魚肝粉	50	50	50	50
干貝粉	50	50	50	50
α- 澱粉	120	120	120	120
麩質	30	30	30	30
維生素預拌物	10	10	10	10
礦物質預拌物	20	20	20	20
氯化膽鹼	1	1	1	1
纖維素	61.02	49.53	38.05	26.56

表11：無破壁實驗飼料之粗成分：

成分	無破壁藻粉（ % ）
控制組	藻 10%	藻 20%	藻 30%
濕份	8.77	9.01	9.44	8.69
灰份	11.2	10.53	9.96	9.38
粗蛋白	48.19	47.85	48.06	47.47
粗脂	11.13	11.27	12.1	13.08

表12：破壁實驗飼料之粗成分：

成分	破壁藻粉（ % ）
控制組	藻 10%	藻 20%	藻 30%
濕份	8.77	8.55	8.80	8.67
灰份	11.2	10.18	9.35	8.03
粗蛋白	48.19	48.88	48.85	49.85
粗脂	11.13	12.48	11.23	11.06

動物實驗結果 餵食無破壁藻粉實驗飼料之結果如下表13及14，石斑魚餵食飼料八週，各組之存活率皆為100%。石斑魚餵食控制組飼料由初重17.57±0.40 g成長至約38.83±0.55 g，增重率為121.1±2.95 g。無破壁藻粉取代量為10%、20%、 30%時，實驗組相較控制組有顯著成長低落情況，分別為81.86±18.31g、60.80±3.89g及49.99±9.03g。而在飼料轉換率方面，控制組為1.34±0.05，而當藻粉取代量為10%，20%和30%時，飼料轉換率分別爲1.97±0.23，2.52±0.30及3.14±0.39。最後在魚肉組成分分析方面，實驗組相較於控制組在水分、灰分、粗蛋白及粗脂肪等皆無顯著差異，顯示藻粉的添加不會影響魚隻肌肉組成。表13：石斑魚苗餵食無破壁實驗飼料八週後之增重率、飼料轉換率：

餵食	初始體重（g）	最終體重（g）	增加體重（g）	PWG （%）	食物攝取（g）	FCR	存活（%）
控制組	17.57±0.40	38.83±0.55	21.27±0.55	121.1±2.95	28.589±1.43	1.34±0.05	100
藻10%	17.50±0.44	31.80±2.88	14.30±3.03	81.86±18.31	27.81±3.07	1.97±0.23	100
藻20%	17.27±0.21	27.77±0.80	10.50±0.80	60.80±3.89	26.39±1.52	2.52±0.30	100
藻30%	17.53±0.12	26.30±1.65	8.77±1.65	49.99±9.03	27.13±1.87	3.14±0.39	100

表14：無破壁藻粉替代魚粉飼料對於點帶石斑幼魚之魚肉組成分的影響：

成分	無破壁藻粉（ % ）
控制組	藻 10%	藻 20%	藻 30%
濕份	76.94±0.20	77.09±0.20	77.31±0.60	77.69±0.24
灰份	1.17±0.01	1.24±0.05	1.24±0.02	1.20±0.14
粗蛋白	21.46±0.13	21.18±0.44	20.75±0.48	20.38±0.12
粗脂	1.19±0.10	1.11±0.12	1.26±0.06	1.10±0.06

餵食破壁藻粉實驗飼料之結果如下表15及16，石斑魚餵食飼料八週，各組之存活率皆為100%。石斑魚餵食控制組飼料由初重11.57±1.01 g成長至約20.39±3.32 g，增重率為76.38±3.38%；而在藻粉（破壁）取代量為10%和20%時，實驗組和控制組在成長上無顯著差異，分別為81.55±5.26g及76.69±5.89g；然而當藻粉取代量為30%時，藻30%組較控制組則有顯著成長低落情況。而在飼料轉換率方面，控制組為2.6±0.1，而當藻粉取代量為10%，20%和30%時，飼料轉換率分別為2.96±0.21、3.32±0.16及5.22±0.43。最後在魚肉組成分分析方面，實驗組相較於控制組在水分、灰分及粗蛋白等皆無顯著差異，顯示藻粉的添加不會影響魚肉組成。表15：石斑魚苗餵食破壁實驗飼料八週後之增重率、飼料轉換率：

餵食	初始體重（g）	最終體重（g）	增加體重（g）	PWG （%）	食物攝取（g）	FCR	存活（%）
控制組	11.57±1.01	20.39±3.32	8.83±1.50	76.38±3.38	19.58±3.50	2.60±0.10	100
藻10%	11.17±1.90	20.58±2.46	9.08±1.20	81.55±5.26	20.57±3.90	2.96±0.21	100
藻20%	11.67±0.90	20.01±2.05	8.94±1.40	76.69±5.89	20.89±4.30	3.32±0.16	100
藻30%	11.7±0.90	17.28±2.39	5.58±1.30	47.71±4.07	20.75±4.70	5.22±0.43	100

表16：破壁藻粉替代魚粉飼料對於點帶石斑幼魚之魚肉組成分的影響：

成分	破壁藻粉（ % ）
控制組	控制組	控制組	控制組
濕份	76.43±0.04	76.45±0.07	77.40±0.46	77.69±0.31
灰份	1.50±0.04	1.56±0.07	1.39±0.10	1.45±0.05
粗蛋白	19.05±0.64	19.83±1.20	19.83±0.04	19.75±0.68
粗脂	2.10±0.09	2.13±0.73	1.05±0.25	0.72±0.08

雖然已詳述本揭露及其優點，然而應理解可進行各種變化、取代與替代而不脫離申請專利範圍所定義之本揭露的精神與範圍。例如，可用不同的方法實施上述的許多製程，並且以其他製程或其組合替代上述的許多製程。再者，本申請案的範圍並不受限於說明書中所述之製程、機械、製造、物質組成物、手段、方法與步驟之特定實施例。該技藝之技術人士可自本揭露的揭示內容理解可根據本揭露而使用與本文所述之對應實施例具有相同功能或是達到實質相同結果之現存或是未來發展之製程、機械、製造、物質組成物、手段、方法、或步驟。據此，此等製程、機械、製造、物質組成物、手段、方法、或步驟係包含於本申請案之申請專利範圍內。雖然已結合上文闡述之特定實施例描述本發明，但一般技術者將明白本發明之許多替代方案及其修改及變更。所有此等替代方案、修改及變更被視為落入本發明之範疇內。

圖1顯示添加BL10於飼料對石斑魚苗殘食率影響。顯示均值±標準誤差（N = 3）。根據T-test，不同標籤顯示平均值有顯著差異（p ＜0.05）。

Claims

一種降低魚隻殘食率之方法，其包含投予魚隻有效量之n-3多元不飽和脂肪酸或小球藻（Chlorella sorokiniana ）SU-9藻株，其中SU-9藻株係寄存於中華民國台灣新竹食品工業發展研究所，寄存編號爲BCRC980050。
如請求項1之方法，其中該n-3多元不飽和脂肪酸包含二十二碳六烯酸。
如請求項1之方法，其中該n-3多元不飽和脂肪酸係由微藻所提供，其中該微藻係為橙壺藻（Aurantiochytrium ）、裂殖壺藻（Schizochytrium ）、破囊壺藻（Thraustochytrium ）或隱甲藻（Crypthecodinium ）。
如請求項3之方法，其中該微藻係為紅樹橙壺藻(Aurantiochytrium mangrovei ）BL10藻株，其係寄存於中華民國台灣新竹食品工業發展研究所，寄存編號爲BCRC980009。
如請求項1至4任何一項之方法，其另包含投予魚隻小球藻（Chlorella vulgaris ）FSP-E藻株，其係寄存於中華民國台灣新竹食品工業發展研究所，寄存編號爲BCRC980051。
一種n-3多元不飽和脂肪酸或小球藻（Chlorella sorokiniana ）SU-9藻株之用途，其係用以製備降低魚隻殘食率之組合物，其中SU-9藻株係寄存於中華民國台灣新竹食品工業發展研究所，寄存編號爲BCRC980050。
如請求項6之用途，其中該n-3多元不飽和脂肪酸包含二十二碳六烯酸。
如請求項6之用途，其中該n-3多元不飽和脂肪酸係由微藻所提供，其中該微藻係為橙壺藻（Aurantiochytrium ）、裂殖壺藻（Schizochytrium ）、破囊壺藻（Thraustochytrium ）或隱甲藻（Crypthecodinium ）。
如請求項8之用途，其中該微藻係為紅樹橙壺藻(Aurantiochytrium mangrovei ）BL10藻株，其係寄存於中華民國台灣新竹食品工業發展研究所，寄存編號爲BCRC980009。
如請求項6至9任何一項之用途，其中該組合物另包含小球藻（Chlorella vulgaris ）FSP-E藻株，其係寄存於中華民國台灣新竹食品工業發展研究所，寄存編號爲BCRC980051。
一種降低魚隻殘食率之組合物，其包含有效量之n-3多元不飽和脂肪酸或小球藻（Chlorella sorokiniana ）SU-9藻株，其中SU-9藻株係寄存於中華民國台灣新竹食品工業發展研究所，寄存編號爲BCRC980050。
如請求項11之組合物，其中該n-3多元不飽和脂肪酸包含二十二碳六烯酸。
如請求項11之組合物，其另包含微藻，其中該微藻係為橙壺藻（Aurantiochytrium ）、裂殖壺藻（Schizochytrium ）、破囊壺藻（Thraustochytrium ）或隱甲藻（Crypthecodinium ）。
如請求項13之組合物，其中該微藻係為紅樹橙壺藻(Aurantiochytrium mangrovei ）BL10藻株，其係寄存於中華民國台灣新竹食品工業發展研究所，寄存編號爲BCRC980009。
如請求項11至14任何一項之組合物，其另包含小球藻（Chlorella vulgaris ）FSP-E藻株，其係寄存於中華民國台灣新竹食品工業發展研究所，寄存編號爲BCRC980051。