TW201932601A - 提升ｓｕｐｔ４ｈ在細胞中核苷酸重複序列擴張基因之轉錄調控能力的方法 - Google Patents

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Abstract

本發明提供一種調控細胞中含有核苷酸重複序列擴張基因的方法，包含：抑制SPT4或SUPT4H的生物活性；及調控R-loops的形成。抑制步驟能有效減少含有核苷酸重複序列擴張基因的表現及調控步驟能更加強抑制步驟的效果。抑制步驟和調控步驟係透過核苷酸重複序列所產生的R-loops干擾了RNA polymerase Ⅱ轉錄DNA模版的能力，進而達到調控基因表現的目的。

Description

提升SUPT4H在細胞中核苷酸重複序列擴張基因之轉錄調控能力的方法
本發明提供一種調控細胞中核苷酸重複序列擴張基因的方法，包含：抑制SPT4或SUPT4H的生物活性；及調控R-loops的形成。抑制步驟能有效減少含有核苷酸重複序列擴張基因的表現及調控步驟能更加強抑制步驟的效果。抑制步驟和調控步驟係透過核苷酸重複序列所產生的R-loops干擾了RNA polymersse Ⅱ轉錄DNA模版的能力，進而達到調控基因表現的目的。
核苷酸重複序列擴張疾病包括由簡單串聯重複(通常是三核苷酸重複序列)的不穩定性和擴張所引起的遺傳性疾病組，致病性核苷酸重複序列擴張可發生在基因的編碼或非編碼序列中，例如弗裏德賴希共濟失調(Friedreich's Ataxia)之類的疾病中，非編碼序列的擴張引起基因轉錄靜默或下調，造成基因喪失功能，因此為隱性遺傳。相反的，在亨丁頓氏舞蹈症(Huntington disease)的病症中，CAG三核苷酸擴張發生在基因的編碼序列中，因此產生的蛋白質含有異常長度的麩醯胺酸(glutamine)片段，導致蛋白質的功能變異並且對細胞產生毒害，這為顯性遺傳。
三核苷酸重複序列擴張疾病(Trinucleotide Repeat Disorders)(也稱為三核苷酸重複擴張疾病、三聯體重複擴張疾病或密碼子重複疾病)是由三核苷酸重複序列異常擴張引起的一組遺傳性疾病。三核苷酸重複擴張可發生在基因的編碼序列中或內含子中，當核苷酸重複次數超過正常、穩定的閾值就會造成疾病的產生，並且每個基因產生病變所需 的重複次數稍有不同；如果三核苷酸重複擴張存在於基因的編碼序列中，則該突變可能導致缺陷基因，如果三核苷酸重複擴張存在於內含子中，則可能在細胞核中形成RNA焦點，引起毒性作用。在超過一半這個類型的疾病中，重複密碼子是CAG，如果該核苷酸重複擴張存在於編碼區中，這些疾病通常被稱為多麩醯胺酸(或PolyQ)疾病，其餘的被歸類為非多麩醯胺酸疾病。
肌強直萎縮症(DM)是最常見的成人肌肉萎縮症，其特徵為漸進式的肌功能退化、肌強直和多重器官功能受損，迄今為止，已經鑑定了經由相似基因突變機制所引起的兩種不同疾病；第1型肌強直萎縮症(DM1，Steinert病)是由DMPK中的CTG核苷酸序列擴張所引起的，而第2型肌強直萎縮症(DM2)是由CNBP中的CCTG核苷酸序列擴張所引起。此第2型肌強直萎縮症(DM2)是由第三條染色體上CNBP基因突變引起，特徵為CNBP基因中胞嘧啶-胞嘧啶-胸腺嘧啶-鳥苷(CCTG)四核苷酸的序列擴張，由於它涉及四個核苷酸的重複序列，所以它不是三核苷酸重複序列疾病，而是四核苷酸重複序列疾病，DM2的核苷酸重複擴張比DM1大得多，範圍從75次重複到超過11,000次重複。
此外，最近發現C9ORF72基因突變是遺傳性ALS和額顳葉癡呆最常見的原因。C9ORF72基因突變在ALS的致病機制導因於六核苷酸重複序列GGGGCC位於C9ORF72內含子中的異常擴張，從未受影響的個體中的少數重複次數到受影響個體中的數百甚至數千個重複次數。
脊髓小腦運動失調症第10型(SCA10)的特徵在於漸進式小腦運動功能失調，通常始於平衡不良和步態不穩，接著上肢運動失調，構音障礙和吞嚥困難；一些人同時具有認知功能障礙、行為障礙、情緒障礙、輕度錐體束徵和周圍神經性病變，發病年齡從12歲到48歲不等。脊髓小腦運動失調症第10型(SCA10)的診斷可基於臨床發現並通過分子遺傳學檢測確認，以ATXN10是否具有異常的ATTCT五核苷酸重複序列擴張作為評估基準，ATXN10基因突變已知是導致該病症的唯一因子，受影響的個體具有核苷酸序列擴張的等位基因，其重複次數高達4,500個，核苷酸重複次數較 少時(280至850個重複次數)則會有較低的疾病外顯率。
脊髓小腦性運動失調第31型(SCA31)是成人發作的顯性遺傳神經性病變，主要影響浦金氏細胞。最近，科學家發現脊髓小腦性運動失調第31型(SCA31)是一種含有TAAAA、TAGAA和TGGAA的複雜五核苷酸重複序列擴張所造成，該重複序列的大小範圍為2.8至3.5千鹼基對(kb)，在這些重複序列中，TGGAA擴張對於脊髓小腦性運動失調第31型(SCA31)發病機制是至關重要的。
多麩醯胺酸(或PolyQ)疾病是一種遺傳神經退化性疾病，由九種不同的疾病組成，它們包括亨丁頓氏舞蹈症(HD)、齒狀紅核蒼白球肌萎縮症(DRPLA)、脊髓延髓肌肉萎縮症(SBMA)和第1型、第2型、第3型、第6型、第7型和第17型小腦脊髓幹運動失調症候群(SCA1、2、3、6、7、17)，因為這些疾病的基因突變是由編碼序列中的CAG重複序列擴張引起，所以它們也被稱為CAG重複疾病。
在這些多麩醯胺酸(或PolyQ)疾病中共有的病理特徵是這些疾病的患者都被發現在其腦中具有蛋白質沉積物，雖然這些蛋白質沉積物由不同的疾病蛋白質構成，但蛋白質都含有擴張的麩醯胺酸片段，迄今為止，疾病相關蛋白質的多麩醯胺酸(PolyQ)擴張，是所有多麩醯胺酸(PolyQ)疾病中突變基因產物的共同特徵及致病因子。
通常，基因中CAG重複的次數可以從小於36的良性數量到37或更多的病理數量，多次重複的CAG序列與疾病的病理相關，因為含有長鏈麩醯胺酸的蛋白質和多肽具有體外形成澱粉樣蛋白原纖維(蛋白質聚集體與β-折疊結構的聚合)的傾向(Scherzinger等)，導致不同的蛋白質構象，並造成突變蛋白質聚集和最終的神經元細胞死亡(Zoghbi和Orr，2000)。
於人體內，多麩醯胺酸(PolyQ)突變蛋白質在中樞神經系統(CNS)細胞中廣泛地表現，然而神經元之特定群組細胞對前述各個不同疾病蛋白質的感受度及病理反應不盡相同，因此可依照病患神經退化的腦區 與臨床特徵，進而區分為九種不同的疾病。疾病之嚴重程度與CAG序列重複的次數相關，以HD為例，當CAG序列重複次數在28-35個之間仍屬正常，35-40個被認為是低外顯率(reduced penetrance)，而重複次數大於40個則認為是高外顯率(full penetrance)。
表2列出了由於基因中含有擴張的CAG重複序列所衍生的八種疾病，表中標列出這些疾病的突變基因、及其可導致患病之重複序列長度。第6型小腦脊髓幹運動失調症候群(SCA6)不包括在此列表中，因為SCA6與其他多麩醯胺酸(PolyQ)疾病不同，其CAG重複序列的長度不是決定發病時間的決定因子，同時，致病的核苷酸重複序列長度也比其他多麩醯胺酸(PolyQ)疾病短得多，當SCA6的CAG重複序列次數為21~30個之間，即足以引起病理表現型。
上述八種疾病中，亨丁頓氏舞蹈症(HD)對病患之影響較為一般大眾所熟知，該疾病與特定的神經元細胞死亡有關，主要發生在皮層與紋狀體中，這是一種致命的遺傳性疾病，該疾病會逐漸使病患的行動能力喪失及認知失調，造成病患及病患家人承受重大經濟與情感上的負擔。亨丁頓氏舞蹈症(HD)之出現率在西歐人種中特別普遍(約20,000之1)，不幸的是，目前無法治癒這種可怕的疾病。
目前，針對亨丁頓氏舞蹈症(HD)之治療方法主要是症狀的控制，例如，FDA最近批准的化合物之一，丁苯那嗪(tetrabenazine)，為一種用於減少亨丁頓氏舞蹈症(HD)病患運動機能亢進的藥物；丁苯那嗪(tetrabenazine)為一種囊泡單胺轉運體(VMAT)抑制劑，會促進神經傳導物的降解，因此，此藥物僅能治療症狀，而非根治該疾病。目前用於治療亨丁頓氏舞蹈症(HD)之其他藥物還有抗精神病藥(neuroleptics)與苯二氮平類藥物(benzodiazepines)這二種。隨著病情的發展，針對不同亨丁頓氏舞蹈症(HD)之症狀做治療的藥物，還包括抗精神病藥物(antipsychotics)，以及用於抗運動機能減退之藥物，但是目前並沒有任何的治療方法是可以根治亨丁頓氏舞蹈症(HD)。
如上所述，亨丁頓氏舞蹈症(HD)的根本原因是HTT基因中CAG重複序列的異常擴增。在正常人中，大約有8-25個CAG核苷酸重複序列在HTT基因中，但亨丁頓氏舞蹈症(HD)病患，其CAG重複序列的次數擴大增加至36個或更多，因為這種致病基因是顯性的，所以若一旦經由遺傳而得到一個突變的HTT基因就會發展亨丁頓氏舞蹈症(HD)。
根據2003年及2004年Sanchez及Tanaka等人的細胞模式與動 物研究顯示：在亨丁頓氏舞蹈症(HD)病理發展中，突變HTT基因產物所形成之蛋白質聚集扮演著關鍵角色。當蛋白質水解時，突變的HTT蛋白質可留下包含polyQ擴張的片段；當高度重複之麩醯胺酸(glutamine)片段存在於突變的HTT蛋白質中，蛋白質極性(polar nature)會導致HTT與其他蛋白質產生不良的相互作用。尤其是蛋白質互相形成氫鍵且聚集在一起，如此一來這些蛋白質的結構就會產生變異，無法折疊成具有功能之蛋白質，隨著時間的推移，積累的蛋白質聚集會損害神經細胞，導致病患神經細胞死亡與神經功能缺損。此蛋白質聚集之破壞作用已經由實驗證實，確實會造成人體神經傷害，並且實驗數據顯示藉由抑制蛋白質聚集形成之化學試劑，可增加細胞存活，改善亨丁頓氏舞蹈症(HD)疾病小鼠的病理變化。
除了使用抑制劑來防止蛋白質聚集之外，減少突變亨丁頓(HTT)基因表現也是一種可行的替代方法，用來抑制不溶性蛋白質聚集之發生。根據1999年Scherzinger等人的活體外研究已顯示polyQ蛋白質聚集之程度與蛋白質濃度相關，因此，理論上可藉由降低突變亨丁頓(HTT)基因表現，減少PolyQ擴張蛋白質產出，藉此抑制蛋白質聚集之形成及延緩亨丁頓氏舞蹈症(HD)的發病。
這些結果指出可藉由一種簡單而有效的策略來抑制亨丁頓氏舞蹈症(HD)的發病機制，該策略為降低因HTT基因表達所產生的不溶性蛋白質聚集，例如，一種可調控polyQ突變基因表現或polyQ蛋白質聚集之試劑，該試劑有可能解決polyQ疾病之根本原因，而非僅治療其疾病症狀，但目前仍缺乏能調控突變polyQ基因表現之相關細胞因子與試劑，因此造成此治療策略的發展限制。
在我們早期的研究中，我們發現藉由轉錄延伸因子SPT4/SUPT4H的功能缺失可選擇性抑制含有較長CAG重複序列基因的轉錄作用並降低polyQ蛋白質聚集。然而，在轉錄延伸過程中，為何通過高度重複的核苷酸序列需要SPT4/SUPT4H協助，目前其分子機制仍不清楚。
R-loops(R環)是由轉錄作用產生的mRNA和轉錄過後的DNA模板相互結合的核酸複合物，是轉錄延伸作用的副產物，並且已被證明是基因表達的負向調節因子。
細胞中具有多種蛋白質可調節RNA/DNA雜合體(即R-loops)，研究最為詳細的是RNase H酶，其酵素活性能專一地分解RNA/DNA雜合體中的RNA(Cerritelli和Crouch，2009)。另外，藉由解旋酶的作用也可以移除R-loops；在真核細胞中，RNA/DNA雜合體可以經由Pifl DNA解旋酶(Boule和Zakian，2007)或Sen1/Senataxin(Kim等，1999)解開。有人提出在酵母細胞中，Sen1的主要功能是防止R-loops積累(Mischo等，2011)。此外，在防止R-loops形成的過程中，拓撲異構酶I也具有重要的調節角色(Drolet，2006)。
名詞解釋
在整個揭示內容中，基因名稱係以大寫字母表示，而只有在酵母菌細胞中，與基因有關之蛋白質會以第一個字母大寫表示。例如，關於SPT4基因，「SPT4」一詞表示基因，而「Spt4」一詞表示由該基因所產生之蛋白質。
如本發明文中所使用之基因SPT4係指產生轉錄延伸蛋白質Spt4之基因。該基因係經由(Malone等人，1993)作特徵鑑定，其整個內容係併入本發明內容供參考。該蛋白質Spt4係經由(Malone等人，1993)作特徵鑑定，其整個內容係併入本發明內容供參考。
如本文中所使用，基因SPT5係指產生轉錄延伸蛋白質Spt5之基因。該基因係經由(Swanson等人，1991)作特徵鑑定，其整個內容係併入本發明內容供參考。該蛋白質Spt5係經由(Swanson等人，1991)作特徵鑑定，其整個內容係併入本發明內容供參考。
如本發明文中所使用之基因SUPT4H係指產生哺乳動物 轉錄延伸因子SUPT4H之基因。該基因係經由(Hartzog等人，1996；Chiang等人，1996)作特徵鑑定，其整個內容係併入本發明內容供參考。該蛋白質SUPT4H係經由(Hartzog等人，1996；Chiang等人，1996)作特徵鑑定，其整個內容係併入本發明內容供參考。
如本發明文中所使用，基因SUPT5H係指產生哺乳動物轉錄延伸因子SUPT5H之基因。該基因係經由(Stachora等人，1997；Chiang等人，1998)作特徵鑑定，其整個內容係併入本發明內容供參考。該蛋白質SUPT5H係經由(Stachora等人，1997；Chiang等人，1998)作特徵鑑定，其整個內容係併入本發明內容供參考。
本文所用的名詞“R-loops穩定化合物”描述了具有穩定或提升R-loops結構能力的任何化合物，例如：RNase H、TOP1、SEN1的抑製劑。
本文所用的名詞“生物活性”描述了藉由Spt4或SUPT4H以及其結合配體Spt5或SUPT5H協助RNA聚合酶II在DNA模板上的轉錄作用功能。
本文所用的名詞“基因產物”描述了藉由該基因產生的RNAs以及蛋白質。
RNA/DNA雜合體(R-loops)在擴張的CAG三核苷酸重複序列中可被檢測到。
R-loops也存在於各種重複的DNA序列中。
SPT4缺失不會影響R-loops的形成，但會導致亞優化的RNA聚合酶II對R-loops的轉錄停滯效應敏感並降低其轉錄作用。
提高R-loops增加了藉由SUPT4H失活來抑制突變HTT的轉錄作用，表明共同降低SUPT4H和RNase H功能具有治療亨丁頓舞蹈症(HD)的潛力。
在以酵母菌作為生物模式的實驗中，我們發現在含有擴張的CAG三核苷酸重複序列和其他重複核苷酸序列的片段附近可檢測到 R-loops。此外，我們發現核苷酸序列重複次數越多，R-loops形成的機會越大。我們進一步證實R-loops的形成與SPT4的存在與否無關，但是，在SPT4功能缺失細胞中R-loops會影響及調控CAG核苷酸重複序列擴張基因的轉錄作用。更重要的是，在酵母菌實驗中證實的機制也適用於小鼠紋狀體神經元細胞中具有突變的HTT基因以及亨丁頓氏舞蹈症(HD)的動物模式。
本發明提供一種體外調控細胞中一基因表現之方法，其中該基因含有核苷酸重複序列擴張，該方法包含：抑制SPT4或SUPT4H的生物活性；及調控R-loops的形成。其中該抑制步驟能有效減少含有核苷酸重複序列擴張基因的表現及調控步驟能增加抑制步驟的效果；其中該抑制步驟和該調控步驟係透過增加RNA poymerase Ⅱ自DNA模版分離達到調控基因表現的目的。
本發明一最佳實施例中該抑制步驟降低SPT4或SUPT4H方法係選自由提供一siRNA,shRNA,anti-sense oligonucleotide和使用CRISPR/Cas9技術的方法所組成之群組，能降低SPT4或SUPT4H表現或能阻止SPT4/SPT5複合體和SUPT4H/SUPT5H複合體的形成。
本發明一最佳實施例中該基因包含一核苷酸重複序列擴張片段，該基因會促使R-loops形成。而該核苷酸重複序列擴張片段為三核苷酸重複序列。
本發明提供一種R-loops調控化合物用於製備抑制細胞中含有核苷酸重複序列擴張基因轉錄作用之醫藥組合物之用途，其中該醫藥組合物包含：一SPT4或SUPT4H抑制劑；及一R-loops調控化合物。
本發明一最佳實施例中該R-loops調控化合物為一種R-loops穩定劑，該R-loops穩定劑可促進R-loops形成或避免已經形成的R-loops解離和一種RNase H抑制劑，該RNase H抑制劑可抑制RNase H酵素活性和避免已經形成的R-loops解離。
本發明一最佳實施例中該SPT4或SUPT4H抑制劑係選自 由抗體、化合物、胜肽和核苷酸所組成之群組，該抑制劑可降低SPT4或SUPT4H表現或有效抑制SPT4/SPT5複合體之形成或有效抑制SUPT4H/SUPT5H複合體之形成。
本發明一最佳實施例中該R-loops調控化合物係選自由抗體、化合物、胜肽和核苷酸試劑所組成之群組。
本發明一最佳實施例中該基因包含一核苷酸重複序列擴張片段，該基因會促使R-loops形成，其中該核苷酸重複序列擴張片段為三核苷酸重複序列。
本發明提供一種治療核苷酸重複序列擴張疾病的醫藥組合物，包含：一R-loops調控化合物和一SPT4或SUPT4H抑制劑。且該R-loops調控化合物係選自由一R-loops穩定劑和一RNase H抑制劑。
本發明一最佳實施例中該R-loops穩定劑係為拓撲異構酶(Topoisomerase)抑制劑。
本發明一最佳實施例中該RNase H抑制劑為Tropolone。
本發明一最佳實施例中該SPT4或SUPT4H抑制劑係選自由抗體、化合物、胜肽和核苷酸所組成之群組。
本發明一最佳實施例中該R-loops調控化合物係選自由抗體、化合物、胜肽和核苷酸所組成之群組。
本發明提供一種R-loops調控化合物用於製備增加核苷酸重複序列擴張疾病的藥物治療效果之醫藥組合物之用途，其中該醫藥組合物包含：一R-loops調控化合物；以及一治療核苷酸重複序列擴張疾病的藥物。該核苷酸重複序列擴張疾病藥物包含SPT4或SUPT4H抑制劑。
本發明一最佳實施例中該R-loops調控化合物係選自由抗體、化合物、胜肽和核苷酸所組成之群組。
本發明一最佳實施例中該核苷酸重複序列擴張疾病包含第一型、第二型、第三型、第七型或第十七型小腦脊髓幹運動失調症候群 (Spinocerebellar ataxia type 1、2、3、7或17)、齒狀紅核蒼白球肌萎縮症(Dentatorubral-pallidoluysian atrophy，簡稱DRPLA)、脊髓延髓肌肉萎縮症(Spinal and bulbar muscular atrophy)、第一型、第二型肌強直性萎縮症(Myotonic atrophy type 1、2)、C9orf72肌萎縮側索硬化症(C9orf72 amyotrophic lateral sclerosis)、第八型、第十型、第十二型、第三十一型、第三十六型小腦脊髓幹運動失調症候群(Spinocerebellar ataxia type 8、10、12、31、36)或亨丁頓氏舞蹈症(Huntington’s Disease)。
在圖式和以下描述中闡述了一個或多個實施例的細節，根據說明書、圖式以及權利要求，實施例的其他特徵、目的和優點將顯而易見。
第1圖顯示基因中含有一段短的或長的核苷酸重複序列其轉錄延伸過程，藍色橢圓代表RNA polymerase II(RNAP II)，紅色線段代表核苷酸重複序列。
第2圖顯示轉錄作用中R-loops的形成受到CAG重複序列數量的影響，但不受酵母細胞中SPT4的影響。第2A圖顯示藉由引子組B和引子組Amp在(CAG)n-ADE2質體上的擴增子；第2B圖顯示藉由RNA/DNA雜交沉澱(DIP)法分析轉錄作用中(CAG)n-ADE2上的R-loops信號；第2C圖為檢查SPT4缺失對R-loops形成的影響；第2D圖藉由北方點墨法評估在野生型(WT)和SPT4△(△S)細胞中(CAG)n-ADE2 mRNA的表達。
第3圖顯示在Spt4缺失細胞中，提昇R-loops的形成降低了CAG重複序列的轉錄作用。第3A圖顯示在野生型(WT)、RNH1△(△1)、SPT4△(△S)和RNH1△SPT4△雙缺失(△1△S)細胞中R-loops的信號；第3B圖顯示在WT，△1，△S和△1△S細胞中使用北方點墨法(Northern blotting)測量(CAG)n-ADE2 mRNA表現量；第3C圖為藉由引子組A和引子組B所形成的擴增子示意圖；第3D圖藉由反轉錄和即時定量聚合酶連鎖反應分析具有CAG重複序列下游與上游的轉錄產物。
第4圖顯示在Spt4缺失細胞中，降低R-loops的形成提昇了CAG重複序列基因的轉錄產物。第4A圖顯示99 CAG和97 CAG/CAA之間核苷酸組合差異的示意圖；第4B圖顯示在表達(CAG)99-ADE2和(CAG/CAA)97-ADE2的WT細胞中，使用DIP分析重複序列中R-loops信號；第4C圖顯示在野生型(WT)和SPT4△(△S)細胞中，使用北方點墨法(Northern blotting)評估(CAG)99-ADE2和(CAG/CAA)97-ADE2表現量；第4D圖顯示在具有異位(ectopic)表達SEN1的SPT4△細胞中，使用北方點墨法測量(CAG)n-ADE2 mRNA表現量；第4E圖顯示在具有異位(ectopic)表達TOP1的SPT4△細胞中，使用北方點墨法測量(CAG)n-ADE2 mRNA表現量。
第5圖顯示R-loops在多種核苷酸重複序列的轉錄作用中被偵測及其對Spt4缺失細胞中基因表現的影響。第5A圖顯示以DIP分析法偵測，在WT細胞中，ADE2報導基因的R-loops信號；第5B圖顯示以北方點墨法分析野生型(WT)和SPT4△細胞中(CA)n-ADE2的表現量；第5C圖顯示以北方點墨法分析野生型(WT)和SPT4△細胞中(CAA)n-ADE2的表現量；第5D圖顯示以北方點墨法分析野生型(WT)和SPT4△細胞中(CAAC)n-ADE2的表現量；第5E圖顯示以北方點墨法分析野生型(WT)和SPT4△細胞中(CAACCA)n-ADE2的表現量。
第6圖顯示在SUPT4H基因抑制細胞中，R-loops增加導致具有擴張CAG重複序列基因的轉錄減少。第6A圖顯示GFP和Amp引子在(CAG)n-GFP質體上的位置示意圖；第6B圖顯示在ST14A細胞中表現Q7-GFP或Q81-GFP並且使用DIP分析R-loops；第6C圖顯示用SUPT4H siRNA(4H si)基因抑制結合托酚酮(TRO)處理ST14A細胞並且分析(CAG)n-GFP mRNA的表現量；第6D圖顯示使用SUPT4H siRNA(4H si)基因抑制加托酚酮(TRO)處理後，分析ST14A細胞中的Q81-GFP蛋白質聚集物。
第7圖顯示小鼠紋狀體神經細胞中，藉由SUPT4H基因抑 制所造成的突變HTT轉錄作用減少可透過R-loops調控藥物進一步提升。第7A圖顯示在Tropolone(TRO)處理後，分析HdhQ7/7和HdhQ111/111細胞中R-loops的變化；第7B圖顯示分別單獨或共同使用SUPT4H siRNA(4H si)和托酚酮(TRO)處理HdhQ7/7和HdhQ111/111細胞，並分析細胞中HTT mRNA的表達；第7C圖顯示用SUPT4H siRNA(4H si)單獨或與托酚酮(TRO)一起處理之HdhQ7/7和HdhQ111/111細胞中HTT蛋白質的表現量；第7D圖顯示單獨用sUPT4H siRNA(4H si)或合併托普迪肯Topotecan(Topo)處理HdhQ7/7和HdhQ111/111細胞，並分析細胞中HTT蛋白質的表現量。
第8圖顯示HD-果蠅表型治療反應證實共同處理托酚酮可加強SUPT4H抑製劑的效果。第8A圖顯示HD-果蠅rough eye(粗糙眼)表型的分析結果，rough eye表型是由於表達HTT97Q突變基因所造成；第8B圖顯示HD-果蠅中mHTT蛋白質表達的狀況。
基因中含有一段短的或長的核苷酸重複序列其轉錄延伸過程示意圖(圖1)。因轉錄作用RNA/DNA雜合體(R-loops)會發生在具有核苷酸重複序列擴張的DNA模板上，導致轉錄作用中RNApolymerase Ⅱ(RNAP II)的停滯，當酵母菌細胞缺乏SPT4或哺乳動物細胞缺乏SUPT4H時，RNAP II的持續延伸作用能力是次優的，並且由於R-loops所衍生的停滯效應，轉錄作用中的RNAP II較易從DNA模板上脫離；SPT4/SUPT4H不影響R-loops在具有核苷酸重複序列DNA模板上的形成，然而，在SUPT4H缺失細胞中，轉錄模板上R-loops的增強可以強化抑制核苷酸重複序列擴張基因的轉錄延伸作用，藍色橢圓代表RNA polymerase II(RNAP II)，紅色線段代表核苷酸重複序列。
實施例1. 實驗材料和方法：
A. 酵母菌株和質體
藉由基因置換法(one-step gene replacement method)來產生具有基因缺失的酵母菌株，並用PCR做確認(Liu等，2012)，分別藉由KanMX和NatMX取代W303-1A細胞中SPT4和RNH1的ORF來取得SPT4△(SPT4基因剃除)或RNH1△(RNH1基因剃除)菌株。
藉由(Liu等人，2012)揭露的技術方法，製備具有不同長度及核苷酸序列的質體，其包括重複序列CA、CAA、CAG、CAAC和CAACCA。使用酵母菌染色體DNA作為模板，藉由PCR擴增全長TOP1基因編碼序列和SEN1的N端部分(編碼胺基酸殘基1至1017)，將TOP1的擴增產物(藉由SmaI-TOP1F和TOP1-NotI R引子)和SEN1的擴增產物(藉由SmaI-SENIF和SEN1-NotI R引子)接到基因表現載體pRS423-Cup1-3HA中以分別產生pRS423-Cup1-TOP1和pRS423-Cup1-SEN1。
B. 抗體
S9.6是一種能辨識RNA/DNA雜合結構的單株抗體，由Stephen H.Leppla博士(美國國家衛生研究院)提供；偵測抗體，微管蛋白質(來源：DM1A，Sigma)、HA-抗原表位(來源：3F10，Roche)、SUPT4H(來源：64828，Cell Signaling Technology)、Huntingtin(來源：MAB2166，Chemicon)和TATA-結合蛋白質(來源：58C6，Sigma)購自廠商。
C. RNA/DNA免疫沉澱(DIP)分析
在含2%半乳糖的培養基中培養12小時後收集酵母細胞，然後在300μl萃取緩衝液(10mM Tris-HCl pH8.0，10mM EDTA，200mM NaCl，1% SDS，2% Triton X-100，25 units RNase抑制劑)中用玻璃珠研磨酵母細胞，將核酸混合物進行音波振動處理(Bioruptor UCD-200)並用苯酚(pH 8.0)萃取，分別使用或不用RNase H處理90分鐘，將染色質DNA和 RNA的混合液與protein G瓊脂糖珠結合的單株抗體S9.6進行免疫沉澱。用四種不同的緩衝液洗滌該沉澱物兩次(緩衝液1：50mM HEPES-KOH pH 7.5，50mM NaCl，1mM EDTA，1% Triton X-100，0.2% SDS；緩衝液2：50mM HEPES-KOH pH 7.5，500mM NaCl，1mM EDTA，1% Triton X-100，0.1% sodiumdeoxycholate；緩衝液3：10mM Tris-HCl pH 8.0，250mM LiCl，1mM EDTA，0.5% NP-40，0.5% sodium deoxycholate和緩衝液4：TE buffer)，然後再用苯酚萃取。通過qPCR和Quantitative-Comparative CT(△△CT)分析RNA/DNA雜合體(即R-loops)信號，在酵母菌實驗中，使用一對引子(Primer-B F和Primer-B R)來定量CAG重複序列附近的R-loops信號，並將引子組AMP作為對照組；或者，使用Primer-B’F和Primer-B R檢測CAG和非CAG重複序列的R-loops。在ST14A中，引子組ST14A eGFP用於檢測R-loops信號和引子組AMP作為對照組；在HdhQ7/7和HdhQ111/111,，使用小鼠HTT DIP引子組來定量CAG重複區的R-loops信號，並且用Tuba1a DIP引子組作為對照組。
D. 北方點墨法
使用熱酸酚法(hot acid phenol method)從酵母細胞中萃取total RNA(Liu等人，2012)，以等量的RNA在含有1%甲醛的MOPS緩衝液所配置的1%瓊脂糖凝膠上進行電泳分離，然後轉移到尼龍膜(PerkinElmer)上，之後將該尼龍膜與ADE2探針雜交以檢測不含或含有不同核苷酸重複序列長度的基因轉錄產物，並使用SCR1作為校正組(loading control)，ADE2和SCR1探針以ADE2-F和ADE2-R引子以及SCR1-F和SCR1-R引子來合成(DIG Northern Starter Kit，Roche)。
E. 哺乳動物細胞培養和轉染
將ST14A、HdhQ7/7和HdhQ111/111培養在含有15%胎牛血清的DMEM(HyClone)，在33℃和5%二氧化碳濃度下進行培養，ST14Atet是一基因改造細胞株(stable line)，其將pTet-Off嵌入到ST14A細胞的染色體 中，可以在沒有四環素存在的情況下誘導pTRE2-(CAG)n-eGFP質體的表達。Lipofectamine 2000(Invitrogen)轉染試劑用於將siRNA、pTRE2-(CAG)n-eGFP單獨或一起遞送到細胞中，使用100nM SUPT4H siRNA(DHARMACON，ON-TARGET plus SMART pool，L-048866-01)和(DHARMACON，J-086342-10，5’-UGGCCUACAAAUCGAGAGAUU-3’ and 5’-UCUCUCGAUUUGUAGGCCAUU-3’)分別在小鼠和大鼠細胞中減弱SUPT4H的表達。
F. 顯微鏡
用pTRE2-(CAG)n-eGFP質體和siRNA共同轉染ST14Atet細胞，轉染後6小時，將生長培養液更換為DMEM，進行12小時的細胞培養，細胞培養後，再加入或不加入60μM托酚酮(T89702，Sigma)培養細胞12小時，然後使用Nikon TS100螢光顯微鏡觀察GFP信號，並通過Nikon D5200照相機拍攝圖像。
G. 反轉錄(RT)和定量PCR(qPCR)
按照廠商說明書(Invitrogen)以TRIzol試劑取得哺乳動物細胞total RNA，使用SuperScript III反轉錄酶(Invitrogen)和oligo dT、snRNA U6 rt引子將2μg total RNA反轉錄成cDNA，藉由StepOnePlus即時qPCR系統(Applied Biosystems)定量cDNA，並使用Quantitative-Comparative CT(△△CT)軟體進行分析，使用表3中所示的寡核苷酸引子組測量大鼠SUPT4H、eGFP、小鼠SUPT4H和小鼠HTT，並以snRNA U6作為校正組(loading control)。
對於酵母細胞，利用一組特異性引子將5μg total RNA轉化為cDNA，該特異性引子包括5'end CAG rt、3'end CAG rt和SCR1rt引子，藉由引子組(5'CAG F和5'CAG R)測量含有CAG重複序列上游的cDNA，而藉由3'CAG F和3'CAG R引子檢測具有CAG重複序列下游的cDNA，以SCR1做為校正組(loading control)。
H. 小鼠紋狀體神經細胞株的藥物處置
用控制組siRNA或專一性的SUPT4HsiRNA轉染HdhQ7/7 and HdhQ111/111神經細胞株，轉染後，將細胞與30μM托酚酮(tropolone)(T89702，Sigma)培育12小時或與0.3μM托泊替康(topotecan)(T2705，Sigma)培育24小時。托酚酮(tropolone)是一化學藥物，可抑制人類RNases H的酵素活性，其IC50在5.7μM(Budihas等，2005)，而托泊替康(topotecan)是一種抑制拓撲異構酶(Topoisomerases)的抗癌藥物(Bali et al.2018)。
I. 西方墨點法
在RIPA緩衝液(50mM Tris-HCl pH 7.5，150mM NaCl，1%NP-40，0.1% SDS和1%脫氧膽酸鈉)外加1mM Na3VO4、1mM DTT、1mM PMSF和蛋白酶抑製劑(Sigma)將HdhQ7/7 and HdhQ111/111神經細胞溶解，於高速離心後收集上清液作為蛋白質溶解物。
在樣品緩衝液(60mM Tris-HCl pH 6.8，25%甘油，4%SDS，14.4mMβ-巰基乙醇和0.1%溴酚藍)中加入等量的蛋白質溶解物並加熱處 理，以SDS-polyacrylamide gel進行電泳分離，然後轉移到硝酸纖維素(NC)膜上；使用Tris-acetate polyacrylamide gels(Liu等，2012)來分析具有不同polyQ長度的HTT蛋白質。用含有5%脫脂乳的TBST(1X TBS，0.05% tween20)來前處理膜，然後用抗體作用1小時，以TBST洗滌三次，每次各10分鐘，再與二級抗體作用1小時，接著用TBST洗滌三次後，使用Western Lighting(PerkinElmer Life Sciences)來檢測信號。
對於果蠅樣品，在每次藥物處理後收集15隻雄性和15隻雌性HD果蠅的頭，並用1×緩衝液(50mM Tris-HCl pH 7.5，150mM NaCl，1% NP-40，0.1% sodium dodecyl sulfate(SDS)，1% sodium deoxycholate和blue dye)均質化，再收集蛋白質溶解物。使用12%SDS-polyacrylamide gel電泳分離等量的蛋白質溶解物，然後轉移至NC膜(GE Healthcare Life Science)，接著如上所述進行HTT和α-tubulin蛋白質的檢測。
J. 果蠅品系(Fly stock)
Gmr-gal4-UAS-HTT97Q/cyo品系由國立台灣師範大學蘇銘燦老師提供，該品係能在果蠅複眼中表達HTT97Q。果蠅在25℃以及使用標準cornmeal yeast agar培養。
K. HD果蠅的藥物處置
在每個藥物實驗中，將15個Gmr-gal4-UAS-HTT97Q/cyo雄性果蠅與15個Gmr-gal4-UAS-HTT-97Q/cyo雌性果蠅培育在含有10mL培養基以及測試藥物(最終濃度為10μM 6-氯嘌呤核苷(6CR)(Sigma)或/和100μM托酚酮(Tropolone)(Sigma)的小瓶中雜交。6-氯嘌呤核苷(6CR)是藉由阻止SUPT4H/SUPT5H複合體的形成來抑制SUPT4H活性的化學試劑(專利號：US2018/0064744A1)。7天後，移除父母親果蠅，接著收集帶有一個Gmrgal4-UAS-HTT97Q等位基因的4日齡後代並檢查眼睛形態特徵，使用Leica DMR直立顯微鏡(CoolSNAP 5.0，Photometrics)取得複眼圖像，以及使用Helicon Focus(HeliconSoft)增加景深並加強圖像效果。每個藥物處 理組，共分析10隻果蠅並與控制組果蠅進行比較，控制組果蠅在含有DMSO(Sigma)的培養基中培養，每組實驗會獨立進行三次。
實施例2：轉錄作用中R-loops的形成受到CAG重複序列數量的影響，但不受酵母細胞中SPT4的影響。
第2A圖顯示藉由引子組B和引子組Amp在(CAG)n-ADE2質體上的擴增子；第2B圖顯示藉由RNA/DNA雜交沉澱(DIP)法分析轉錄作用中(CAG)n-ADE2上的R-loops信號，以輸入DNA作為標準化基準，將Amp-RNase H+樣品的信號設定為1，誤差值表示平均值±標準差(N=3；*表示P<0.05；**表示P<0.01；***表示P<0.001，student’s t test)。第2C圖為檢查SPT4缺失對R-loops形成的影響，用(CAG)10-ADE2、(CAG)25-ADE2或(CAG)49-ADE2送入野生型(WT)和SPT4基因剃除(△S)細胞，並如第2B圖中所述進行分析。第2D圖藉由北方點墨法評估在野生型(WT)和SPT4△(△S)細胞中(CAG)n-ADE2 mRNA的表達，收集如第2C圖中所描述的細胞並進行分析，藉由ADE2探針檢測(CAG)n-ADE2 mRNA，並且用SCR1作為內部的校正組，校正後，將野生型(WT)細胞中(CAG)10-ADE2 mRNA的表現量設定為100%。在這項研究中，藉由RNase H前處理，移除RNA/DNA雜交體中的RNA部分來減少R-loops信號(Cerritelli和Crouch，2009)，此結果證實了DIP分析對R-loops檢測的有效性。實驗結果顯示在轉錄作用中，49或99個CAG重複序列的模板上可檢測到R-loops，但R-loops訊號並不存在10或25個CAG重複序列的轉錄模板上。此外，99個CAG重複序列的R-loops信號大於49個CAG重複序列的R-loops信號。此實驗結果顯示R-loops的形成取決於CAG重複單元的數量；但是CAG重複序列中R-loops的程度不受SPT4的影響。SPT4缺失細胞中，含有CAG重複序列基因轉錄作用減少僅發生在具有R-loops信號的DNA模板中。
實施例3：在Spt4缺失細胞中，提昇R-loops的形成降低了CAG重複序列的轉錄作用。
第3A圖顯示在野生型(WT)、RNH1△(△1)、SPT4△(△S)和RNH1△SPT4△雙缺失(△1△S)細胞中R-loops的信號，將這些細胞送入(CAG)99-ADE2，在含有半乳糖的培養基中生長，然後藉由DIP分析R-loops信號。實驗數據進行標準化後與Amp-RNase H+樣品作比較，如第2B圖所述(N=3；*代表P<0.05；**代表P<0.01，student’s t test)。第3B圖顯示在WT，△1，△S和△1△S細胞中使用北方點墨法(Northern blotting)測量(CAG)n-ADE2mRNA表現量。將(CAG)25-ADE2或(CAG)99-ADE2轉染(transformed)至細胞中，然後取得RNA進行量化分析。如第2D圖所述，校正後，WT細胞中的(CAG)99-ADE2 mRNA的表現量設定為100%(N=3)。第3C圖為藉由引子組A和引子組B所形成的擴增子示意圖，引子組A檢測重複序列上游50bp的區域至前三個CAG重複單元，引子組B檢測CAG重複序列下游的DNA區段，如第2A圖所示。第3D圖藉由反轉錄和即時定量聚合酶連鎖反應分析具有CAG重複序列下游與上游的轉錄產物。從表達(CAG)99-ADE2的細胞中分離total RNA，並通過反轉錄(RT)引子轉化成cDNA，如第3C圖中所述，用引子組A和引子組B通過即時定量聚合酶連鎖反應分析cDNA，B/A比值標註在下圖中。
評估R-loops對於核苷酸重複序列轉錄作用的影響，將WT和SPT4△細胞進行RNH1基因剃除，Rnh1蛋白質能分解RNA/DNA雜合體中RNA的部分(Cerritelli和Crouch，2009)。如實驗預期，當RNH1基因剃除時，99個CAG重複序列的R-loops信號顯著增加，並且在WT和SPT4△細胞中R-loops增加的程度相似。實驗結果顯示，相較於SPT4△細胞，RNH1△SPT4△細胞中(CAG)99-ADE2 mRNA的表達量會進一步降低；轉錄機制實驗，結果也顯示在SPT4缺失細胞中，轉錄作用通過99 CAG重複序列的能力會因R-loops的增加而下降。然而，在具有SPT4的細胞中，(CAG)99-ADE2的轉錄作用僅受R-loops輕微影響。
實施例4：在Spt4缺失細胞中，降低R-loops的形成提昇了 CAG重複序列基因的轉錄產物。
第4A圖顯示99 CAG和97 CAG/CAA之間核苷酸組合差異的示意圖。第4B圖顯示在表達(CAG)99-ADE2和(CAG/CAA)97-ADE2的WT細胞中，使用DIP分析重複序列中R-loops信號，如第2B圖所述。第4C圖顯示在野生型(WT)和SPT4△(△S)細胞中，使用北方點墨法(Northern blotting)評估(CAG)99-ADE2和(CAG/CAA)97-ADE2表現量。使用ADE2探針檢測(CAG)99-ADE2和(CAG/CAA)97-ADE2 mRNA，以SCR1作為內部校正組。校正後，將WT細胞的轉錄表現量設定為100%。第4D圖顯示在具有異位(ectopic)表達SEN1(D)或TOP1(E)的SPT4△細胞中，使用北方點墨法測量(CAG)n-ADE2 mRNA表現量。Sen1/Senataxin和Top1是R-loops的負調節因子(Kim等，1999；Drolet等，2006)。將細胞培養在含有CuSO4(Cu2+)情況下，使用西方點墨法(Western blot)確認HA-tagged Sen1和Top1的表達(左圖)；使用ADE2探針檢測(CAG)n-ADE2 mRNA，並且用SCR1作為內部校正組。校正後，不具有Cu2+情況下的(CAG)25-ADE2 mRNA表現量設定為100%(數值表示為平均值±標準差)。
為了進一步評估R-loops對於擴張的核苷酸重複序列在轉錄作用的影響，在WT和SPT4△細胞中送入低R-loops信號的DNA模板，實驗結果顯示，相較於具有高R-loops信號的DNA模板，因SPT4缺失所造成的轉錄作用下降會顯著改善。此外，透過R-loops負調節因子的異位表現，也發現在SPT4△細胞中，含有擴張CAG重複序列基因的轉錄作用顯著提升。綜合圖3和圖4所示，實驗結果揭露了，在Spt4缺失的細胞中，R-loops可影響和調控含有擴張的核苷酸重複序列基因的轉錄作用；但在Spt4功能正常的細胞中則不會。
實施例5：R-loops在多種核苷酸重複序列的轉錄作用中被偵測及其對Spt4缺失細胞中基因表現的影響。
第5A圖顯示以DIP分析法偵測，在WT細胞中，ADE2報導基 因的R-loops信號，報導基因包含none、70 CA、54 CAA或41 CAAC重複序列。樣品的製備和分析如圖2B所述，標準化後，將Amp-RNase H+樣品的信號設定為1(N=3，表示為平均值±標準差)。第5B圖顯示以北方點墨法分析野生型(WT)和SPT4△細胞中(CA)n-ADE2的表現量。使用ADE2探針檢測(CA)n-ADE2 mRNA，SCR1作為校正組。校正後，個別(CA)n-ADE2轉錄產物在SPT4△與WT細胞中的定量比值，顯示在下圖中。同樣地，分別在(C)，(D)和(E)中分析(CAA)n-ADE2，(CAAC)n-ADE2和(CAACCA)n-ADE2。
實驗結果顯示R-loops也存在於其他不同類型的核苷酸重複序列。此外，因SPT4缺失所造成的轉錄作用減少會隨著重複核苷酸序列單元數量的增加而逐漸明顯。
實施例6：在SUPT4H基因抑制細胞中，R-loops增加導致具有擴張CAG重複序列基因的轉錄減少。
第6A圖顯示GFP和Amp引子在(CAG)n-GFP質體上的位置示意圖。(CAG)n-GFP包含GFP序列與7或81個CAG重複序列融合，融合基因在Tet-R啟動子的控制下。引子組GFP擴增CAG重複序列的DNA片段，引子組Amp擴增ampR基因作為對照組。第6B圖顯示在ST14A細胞中表現Q7-GFP或Q81-GFP並且使用DIP分析R-loops。將pTRE2-(CAG)7-eGFP或pTRE2-(CAG)81-eGFP送入ST14Atet，然後用托酚酮(60μM)處理12小時。托酚酮是一種抑制RNase H酵素活性的化學試劑(Budihas等，2005)。如圖2B所述，將Amp-RNase H+樣品的信號設定為1(N=3；NS代表無統計學意義；*代表P<0.05，student’s t test)。雖然在(CAG)7-eGFP中檢測到相對高的R-loops信號，但是托酚酮不會增加該R-loops信號；另一方面，經托酚酮處理後，(CAG)81-eGFP的R-loops信號顯著增加。第6C圖顯示用SUPT4H siRNA(4H si)基因抑制結合托酚酮(TRO)處理ST14A細胞並且分析(CAG)n-GFP mRNA的表現量。ST14Atet細胞共同轉染pTRE2-(CAG)n-GFP與SUPT4H siRNA(4H si)或pTRE2-(CAG)n-GFP與Control siRNA(Ctr si)作為對照組，然後再進行托酚酮(tropolone)處理。RNA自細胞提取後，通過即時聚合酶連鎖反應(RT-qPCR)以測量(CAG)n-GFP、SUPT4H和snRNA U6的表現量。所有樣品均使用snRNA U6作為定量校正，因為snRNA U6係使用RNA聚合酶III進行轉錄作用。將沒有SUPT4H siRNA基因抑制和托酚酮(tropolone)處理的RNA表現量設定為1(N=3；**表示p<0.01，student’s t test)。第6D圖顯示使用SUPT4H siRNA(4Hsi)基因抑制加托酚酮(TRO)處理後，分析ST14A細胞中的Q81-GFP蛋白質聚集物。通過螢光顯微鏡檢查如圖6C中ST14A細胞，Q81-GFP的聚集定量顯示在下圖中。
實施例7：小鼠紋狀體神經細胞中，藉由SUPT4H基因抑制所造成的突變HTT轉錄作用減少可透過R-loops調控藥物進一步提升。
第7A圖顯示在Tropolone(TRO)處理後，分析HdhQ7/7和HdhQ111/111細胞中R-loops的變化。HdhQ7/7和HdhQ111/111是分別具有純合野生型(homozygous wild-type)和突變亨廷頓蛋白質(mutant huntingtin)(HTT)等位(alleles)基因的小鼠紋狀體神經元細胞(striatal neuronal cells)。將這些細胞處理30μM托酚酮12小時，然後進行DIP測定。HTT擴增子用於偵測HTT基因中CAG重複序列的R-loops信號，並使用Tuba1a作為對照組。與圖6B類似，Tuba1a-RNase H+樣品的信號設定為1(N=3；NS，無統計學顯著性；*，P<0.05，student’s t test)。第7B圖顯示分別單獨或共同使用SUPT4H siRNA(4H si)和托酚酮(TRO)處理HdhQ7/7和HdhQ111/111細胞，並分析細胞中HTT mRNA的表達。HdhQ7/7和HdhQ111/111細胞轉染SUPT4H siRNA(4H si)或Control siRNA(Ctr si)作為對照組，然後再進行托酚酮處理。RNA自細胞提取後，通過RT-qPCR分析HTT，SUPT4H和snRNA U6的量。所有樣品用snRNA U6定量校正，將沒有SUPT4H siRNA和托酚酮處理的RNA水平設定為1(N=3；**，p<0.01，student‘s test)。第7C圖顯示用SUPT4H siRNA(4H si)單獨或與托酚酮(TRO)一起處理之HdhQ7/7和HdhQ111/111細胞中HTT蛋白質的表現量。收集如第7B圖中所描述的細胞，並且使用西方點墨法(Western blot) 測量HTT，SUPT4H，TATA-box結合蛋白質(TBP)。在使用α-tubulin蛋白質定量校正後，將沒有SUPT4H siRNA和托酚酮處理的HTT表現水平設定為1(N=3；**，p<0.01，student’s t test)。第7D圖顯示單獨用SUPT4H siRNA(4H si)或合併托普迪肯Topotecan(Topo)處理HdhQ7/7和HdhQ111/111細胞，並分析細胞中HTT蛋白質的表現量。拓撲異構酶是預防轉錄誘導R-loop生成的重要細胞酶(Drolet，2006)，而托普迪肯是抑制DNA拓撲異構酶的抗癌藥物(Bali等，2018)。類似於圖7C，HTT蛋白質表現的定量圖顯示在下方。
在圖6和7中，我們證明了化合物托酚酮能夠在老鼠神經元細胞中增加含有較長CAG重複序列(包括突變HTT)基因中的R-loops，並且透過托酚酮的處理，可以增強SUPT4H siRNA對於具有擴張重複核苷酸序列基因的轉錄抑制效果。因此，本發明證實要強化抑制哺乳動物細胞中突變基因(具有擴張的重複核苷酸序列)的轉錄作用，可以透過同時抑制SUPT4H和提升R-loops的化學藥物。
實施例8：HD-果蠅表型治療反應證實共同處理托酚酮可加強SUPT4H抑製劑的效果。
第8A圖顯示HD-果蠅rough eye(粗糙眼)表型的分析結果，rough cye表型是由於表達HTT97Q突變基因所造成。將15個Gmr-gal4-UAS-HTT97Q/cyo雄性果蠅與15個Gmr-gal4-UAS-HTT-97Q/cyo雌性果蠅培育在培養基含有6-氯嘌呤核苷(6CR)或/和托酚酮(TRO)的小瓶中雜交。6-氯嘌呤核苷(6CR)是一個抑制SUPT4H活性的化合物，可以阻止SUPT4H/SUPT5H複合體的形成(專利號：US2018/0064744A1)。在除去親代果蠅後，收集具有一個Gmr-gal4-UAS-HTT97Q等位基因的4日齡後代並分析其眼睛表型形態，每組檢查10隻果蠅，控制組rough eye的表型設定為100%。控制組在含有DMSO的培養基中生長。第8B圖顯示HD-果蠅中mHTT蛋白質表達的狀況。收集如上所述的4日齡後代，並使用西方點墨法分析突變HTT蛋白質的表現。α-微管蛋白質作為定量校正，校正後，未經藥物處理的HD-果蠅中的突變HTT表現量設定為100%。
HD-果蠅模式已被廣泛認可並且運用在評估化學試劑對HD 的治療效果(Marsh等，2003)。在本發明實驗中，基因轉殖果蠅(Drosophila melanogaster)，Gmr-HTT97Q，表達具有97個CAG核苷酸重複序列的人類HTT外顯子1(exon1)，用以模擬HD疾病中的突變HTT。HTT97Q主要在果蠅複眼的神經元細胞中表達，導致感光神經元細胞的嚴重退化和rough eye表型特徵。由神經元病變所引起的這些表型缺陷類似於HD患者腦中突變HTT所引起的神經元損失。實驗結果證實SUPT4H抑製劑6-氯嘌呤核苷(6CR)對rough eye的表型具有治療效果，並且透過給予托酚酮(TRO)的共同處理可以得到進一步地改善；實驗結果同時也發現突變HTT的表現量會相對地降低。因此，本發明證實要加強抑制動物細胞中突變基因(具有擴張的重複核苷酸序列)的轉錄作用，可以透過同時抑制SUPT4H和抑制移除R-loops的化學藥物。
其他實施例
本說明書中揭露的所有技術特徵可以做任何的組合呈現。本說明書中揭露的每個特徵可以均等於具有相同功效的置換技術手段，包含等同或類似目的的取代。因此，除非另有明確說明，否則所公開的每個特徵僅是一系列等效或類似特徵的例子。
由上述的描述中，本領域技術人員可以容易地確定所描述的實施例的基本特徵，並且在不脫離其精神和範圍的情況下，可以對實施例進行各種改變和修改以使其適應各種用途和條件。因此，其他實施例也包含在本發明專利權利要求內。
<110> 國立陽明大學
<120> 提升SUPT4H在細胞中核苷酸重複序列擴張基因之轉錄調控能力的方法
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> is used to knock-down SUPT4H expression in mice
<400> 1
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> is used to knock-down SUPT4H expression in rat cells
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<223> ADE2-F primer
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<223> Primer-B R primer
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<223> Mouse Tuba1a DIP R primer
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<212> DNA
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<223> 5' end CAG rt primer
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<223> rat SUPT4H F primer
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<223> SmaI-TOP1 F primer
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<223> SmaI-SEN1 F primer
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<223> SEN1-NotI R primer
<400> 43

Claims (25)

  1. 一種體外調控細胞中一基因表現之方法，其中該基因含有核苷酸重複序列擴張，該方法包含：抑制SPT4或SUPT4H的生物活性；及調控R-loops的形成。
  2. 如專利範圍第1項之方法，其中該抑制步驟能有效減少該基因的表現及調控步驟能增加抑制步驟的效果。
  3. 如專利範圍第1項之方法，其中該抑制步驟降低SPT4或SUPT4H表現量的方法係選自由提供一siRNA,shRNA,anti-sense oligonucleotide和使用CRISPR/Cas9技術的方法所組成之群組。
  4. 如專利範圍第1項之方法，其中該抑制步驟係包含阻止SPT4/SPT5複合體或SUPT4H/SUPT5H複合體的形成。
  5. 如專利範圍第1項之方法，其中該抑制步驟和該調控步驟係透過增加RNA polymerase Ⅱ自DNA模版脫離達到調控基因表現的目的。
  6. 如專利範圍第1項之方法，其中該基因包含一核苷酸重複序列擴張片段，該基因會促使R-loops形成。
  7. 如專利範圍第6項之方法，其中該核苷酸重複序列擴張片段係為三核苷酸重複序列。
  8. 一種R-loops調控化合物用於製備抑制細胞中含有核苷酸重複序列擴張基因轉錄作用之醫藥組合物之用途，其中該醫藥組合物包含：一SPT4或SUPT4H抑制劑；及一R-loops調控化合物。
  9. 如專利範圍第8項之用途，其中該R-loops調控化合物係選自由一R-loops穩定劑和一RNase H抑制劑所組成之群組。
  10. 如專利範圍第9項之用途，其中該R-loops穩定劑可促進R-loops形成或避免已經形成的R-loops解離。
  11. 如專利範圍第9項之用途，其中該RNase H抑制劑可抑制RNase H酵素活性和避免已經形成的R-loops解離。
  12. 如專利範圍第8項之用途，其中該SPT4或SUPT4H抑制劑係選自由抗體、化合物、胜肽和核苷酸所組成之群組，該抑制劑可降低SPT4或SUPT4H表現或有效抑制SPT4/SPT5複合體之形成或有效抑制SUPT4H/SUPT5H複合體之形成。
  13. 如專利範圍第8項之用途，其中該R-loops調控化合物係選自由抗體、化合物、胜肽和核苷酸所組成之群組。
  14. 如專利範圍第8項之用途，其中該基因包含一核苷酸重複序列擴張片段，該基因片段會促使R-loops形成。
  15. 如專利範圍第8項之用途，其中該核苷酸重複序列擴張片段係為三核苷酸重複序列。
  16. 一種治療核苷酸重複序列擴張疾病的醫藥組合物，包含：一R-loops調控化合物和一SPT4或SUPT4H抑制劑。
  17. 如專利範圍第16項之組合物，其中該R-loops調控化合物係選自由一R-loops穩定劑和一RNase H抑制劑所組成之群組。
  18. 如專利範圍第17項之組合物，其中該R-loops穩定劑係為拓撲異構酶(Topoisomerase)抑制劑。
  19. 如專利範圍第17項之組合物，其中該RNaseH抑制劑為Tropolone。
  20. 如專利範圍第16項之組合物，其中該SPT4或SUPT4H抑制劑係選自由抗體、化合物、胜肽和核苷酸所組成之群組。
  21. 如專利範圍第16項之組合物，其中該R-loops調控化合物係選自由抗體、化合物、胜肽和核苷酸所組成之群組。
  22. 一種R-loops調控化合物用於製備增加核苷酸重複序列擴張疾病的藥物治療效果之醫藥組合物之用途，其中該醫藥組合物包含：一R-loops調控化合物；以及一治療核苷酸重複序列擴張疾病的藥物。
  23. 如專利範圍第22項之用途，其中該治療核苷酸重複序列擴張疾病的藥物包含SPT4或SUPT4H抑制劑。
  24. 如專利範圍第22項之用途，其中該R-loops調控化合物係選自由抗體、化合物、胜肽和核苷酸所組成之群組。
  25. 如專利範圍第22項之用途，其中該核苷酸重複序列擴張疾病包含第一型、第二型、第三型、第七型或第十七型小腦脊髓幹運動失調症候群(Spinocerebellar ataxia typel、2、3、7或17)、齒狀紅核蒼白球肌萎縮症(Dentatorubral-pallidoluysian atrophy，簡稱DRPLA)、脊髓延髓肌肉萎縮症(Spinal and bulbar muscular atrophy)、第一型、第二型肌強直性萎縮症(Myotonic atrophy type 1、2)、C9orf72肌萎縮側索硬化症(C9orf72amyotrophic lateral sclerosis)、第八型、第十型、第十二型、第三十一型、第三十六型小腦脊髓幹運動失調症候群(Spinocerebellar ataxia type 8、10、12、31或36)或亨丁頓氏舞蹈症(Huntington’s Disease)。
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Rong et al. Quantitative studies of muscleblind proteins and their interaction with TCF4 RNA foci support involvement in the mechanism of Fuchs' dystrophy
Wang et al. The polymorphism of rs11614913 T/T in pri-miR-196a-2 alters the miRNA expression and associates with recurrent spontaneous abortion in a Han-Chinese population
Chen et al. Spinocerebellar ataxia type 8 larger triplet expansion alters histone modification and induces RNA foci
Jiang et al. Identification of a novel missense mutation of MIP in a Chinese family with congenital cataracts by target region capture sequencing
Chen et al. TGS1 impacts snRNA 3′-end processing, ameliorates survival motor neuron-dependent neurological phenotypes in vivo and prevents neurodegeneration
Chi et al. Upregulation of miRNA-26a enhances the apoptosis of cerebral neurons by targeting EphA2 and inhibiting the MAPK pathway
Tillotson et al. A new mouse model of ATR-X syndrome carrying a common patient mutation exhibits neurological and morphological defects
Holbling Identifying modulators of C9orf72 DPRs and STMN2 levels in ALS/FTD using high throughput screening
Beauchamp et al. Mis-splicing of Mdm2 leads to Increased P53-Activity and Craniofacial Defects in a MFDM Eftud2 Mutant Mouse Model