TW201925219A - 用於抑制ｃｄ２７９相互作用的組合物和方法 - Google Patents

Abstract

本文披露了用於抑制或干擾(1)程式性死亡-1蛋白(也稱作CD279)和(2)程式性死亡配體1(PD-L1)或程式性死亡配體2(PD-L2)之間的相互作用的方法和組合物。另外，本文還披露了用於增加細胞中IL-2水準的方法和組合物，以及用於預防、治療或改善受試者中癌症的影響的方法和組合物。

Description

用於抑制CD279相互作用的組合物和方法

本發明的領域涉及用於預防、治療或改善各種類型的癌症的影響的某些組合物和方法。尤其是，本發明的領域涉及可用於抑制PD-1/PD-L1或PD-1/PD-L2相互作用的某些組合物和方法，其可進一步用於預防、治療或改善各種類型的癌症的影響。

本申請要求於2016年12月9日提交的美國臨時專利申請序號第15/374,893號的優先權，並將其結合於此作為參考。

程式性死亡-1(PD-1)蛋白也被稱作CD279，其是屬於CD28受體家族的一種抑制性受體。PD-1在活化的T細胞、B細胞和骨髓細胞上表現，並且含有近膜端的免疫受體酪氨酸抑制性基序(immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif；ITIM)和遠膜端的酪氨酸轉換基序(immunoreceptor tyrosine based switch motif；ITSM)。PD-1已作為免疫檢查點被報導，並且在通過阻止T細胞啟動的免疫系統下調(down-regulate)中起到重要作用。已經發現通過其配體連接PD-1產生導致細胞因數產生減少和T細胞存活減少的抑制信號。先前已經鑒定了PD-1的兩種配體，在現有技術中它們被稱作程式性死亡配體1(PD-L1；B7-H1)和程式性死亡配體2(PD-L2；B7-DC)，並且已顯示出在結合於PD-1之後下調T細胞活化。而且，也已經發 現PD-1和PD-L1之間的相互作用導致腫瘤浸潤淋巴細胞減少，T-細胞受體介導的增殖減少，以及癌細胞的免疫逃避(immune evasion)。

鑒於以上，需要鑒定和開發一種或多種肽，其對與用於結合於PD-1的PD-L1或PD-L2競爭有效從而抑制PD-1/PD-L1或PD-1/PD-L2相互作用。這樣的抑制作用較佳之實施方式將被用於預防、治療或改善各種類型的癌症的影響。如下文中將要闡明的，本發明提供了這樣的肽、利用這樣的肽的方法、和本文中所述的其他優點。

根據本發明之發明目的，提供了分離的和純化的肽，其由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2的氨基酸序列，其衍生物(例如SEQ ID NO：3-SEQ ID NO：36)，及其組合表示。另外，本發明包括與SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、其衍生物、及其組合基本上同源的分離的和純化的肽，例如，與SEQ ID NO：1,SEQ ID NO：2,SEQ ID NO：3-SEQ ID NO：36，及其組合至少80%、90%或95%同源。再進一步，本發明包括SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2，和其衍生物的片段和延長形式，以及編碼這樣的肽或其衍生物的核酸序列和載體(例如，病毒載體，例如HSV-1)。而且，藥品級組合物包含由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2的氨基酸序列組成的肽，其衍生物，以及它們的組合(以及其片段，其延長形式、與SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2基本上同源的肽，其衍生物，以及它們的組合)。

根據本發明的另一發明目的，提供了本文中所述的利用該組合物的方法。更具體地，例如，本發明包括透過施用本文中所述的組合物，例如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2的氨基酸序列，其衍生物(例如SEQ ID NO：3-SEQ ID NO：36的衍生物)，與前述的肽基本上同源的肽，或包含任意這樣的肽的藥品級組合物，來抑制一種或多種細胞的PD-1和PD-L1的相互作用的方法。同樣，本發明包括透過施用本文中所述的組合物，例如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2的氨基酸序列，其衍生物，它們的組合，與任意這樣的肽基本上同源的肽，或包含任意這樣的肽的藥品級組合物，來增加一種或多種細胞中的IL-2水準的方法。再進一步，本發明包括透過施用有效量的本文中所述的組合物，例如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2的氨基酸序列，其衍生物，它們的組合，與任意這樣的肽基本上同源的肽，或包含任意這樣的肽的藥品級組合物，來預防、治療或改善受試者癌症的影響的方法。

根據本發明的又一發明目的，提供了SEQ ID NO：1的特定衍生物(例如，SEQ ID NO：3-SEQ ID NO：36的衍生物)，以及與前述的肽基本上同源的肽。更具體地，本發明的這種實施方式包括由選自SEQ ID NO：3-SEQ ID NO：36的氨基酸序列，以及與其基本上同源的序列組成的肽，和包含這樣的肽的藥品級組合物。再進一步，根據相關的實施方式，本發明包括(i)用於抑制一種或多種細胞中PD-1和PD-L1之間的相互作用的方法，(ii)用於增加一種或多種細胞的IL-2水準的方法，以及(iii)透過向受試者施用有效量的一種或多種這樣的衍生物肽，來預防、治療或改善該受試者中癌症的影響的方法。

在本文的具體實施方式部分中進一步說明了本發明的上述和另外特徵。

序列表的簡要描述

圖1係WT(SEQ ID NO：1)和TF(SEQ ID NO：2)肽的ELISA(Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay)競爭性結果，以及對PD-1/PD-L1相互作用的抑制效力的圖示。

圖2A係WT肽在PD-1/PD-L1相互作用方面的離體測定結果。

圖2B係TF肽在抑制PD-1/PD-L1相互作用方面的離體測定結果的圖示。

圖2C係WT和TF肽的組合在抑制PD-1/PD-L1相互作用方面的離體測定結果的圖示。

圖3A係抑制PD-1/PD-L1相互作用的WT肽治療的細胞水準測定結果的圖示。

圖3B係抑制PD-1/PD-L1相互作用的TF肽治療的細胞水準測定結果的圖示。

圖3C係抑制PD-1/PD-L1相互作用的WT和TF肽治療的細胞水準測定結果的圖示。

圖4係本文中所述的肽陣列結果。

圖5A係總結了ELISA測定的結果，其顯示出通過結合的PD-L1阻斷肽來阻斷PD-L1結合於PD-1。

圖5B係總結細胞水準測定的結果，其顯示出抑制PD-1/PD-L1相互作用的PD-L1阻斷肽的不同組合。

圖6係總結細胞毒性測定的結果，其顯示出經由組合的肽阻斷PD-L1增強了對腫瘤細胞的細胞毒性。

圖7係總結測定的結果，其顯示出不同PD-L1阻滯劑對磷酸化SHP-2水準的影響。

圖8係總結測定的結果，其顯示出額外PD-L1阻滯劑對磷酸化SHP-2水準的影響。

圖9A係總結測定的結果，其顯示出通過小鼠肽來阻斷小鼠PD-L1結合於小鼠PD-1。

圖9B係參照實施例中的人和小鼠WT和TF肽之間氨基酸組成的差異。

圖10A係總結ELISA測定的結果，其顯示出通過不同形式的PD-L1阻斷肽來阻斷PD-L1結合於PD-1。

圖10B係總結細胞水準測定的結果，其顯示出抑制PD-1/PD-L1相互作用的不同形式的PD-L1阻斷肽治療。

圖11係體內實驗的結果，其顯示出D-TW對小鼠荷瘤細胞系LL/2的影響。

圖12係體內實驗結果，其參照圖11顯示出在小鼠模型中D-TW對腫瘤尺寸的影響。

下文將詳細描述本發明的較佳實施方式。這些實施方式僅以解釋說明的方式提供，因此不應不恰當地限制本發明的範圍。事實上，本領域普通技術人員將理解，在閱讀本文說明書和參閱本發明附圖之後教示了許多變體和修改方式，並且可以在不背離本發明範圍情況下採用、利用和做出本發明的許多變體。

根據本發明的實施方式，提供了由SEQ ID NO：1,SEQ ID NO：2氨基酸序列，其組合，及其衍生物(例如SEQ ID NO：3-SEQ ID NO：36的衍生物)表示的分離的和純化的肽。另外，本發明包括與SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2，其組合、其衍生物、其延長形式、及其片段基本上同源的分 離的和純化的肽，包括與SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2，其衍生物(例如SEQ ID NO：3-SEQ ID NO：36的衍生物)至少80%、90%或95%同源的肽，及其組合。再進一步，本發明包括藥品級組合物，其包含由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2的氨基酸序列組成的肽，其組合，其延長形式，其片段，和其衍生物(例如SEQ ID NO：3-SEQ ID NO：36的衍生物)，以及與前述的肽基本上同源的肽。

本發明的肽可以經由本領域公知的化學合成方法來產生。例如，可利用被t-Boc或F-moc化學試劑保護的α-NH2進行固相合成，利用側鏈保護的氨基酸在例如Applied Biosystems Peptide Synthesizer上利用自動化Merrifield技術來化學合成該肽。也可以利用重組DNA(包括核酸分子、載體和/或宿主細胞)技術來產生本發明的肽。因此，本發明也包括編碼本文中所述的肽的核酸分子。類似地，本發明中也包括載體(包括表達載體)、包含核酸分子的載體、以及包含該載體的宿主細胞。

再進一步，本發明提供了由SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：36表示的肽的特定片段和衍生物。例如，可以通過用這樣的肽取代一個或多個氨基酸殘基來對由SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：36表示的肽進行修飾，尤其是所謂的保守氨基酸取代，例如，可以用具有相似性質的替代氨基酸來取代氨基酸(即，在如下總結的相同類別氨基酸殘基中進行取代)。出於說明的目的，可以基於共有側鏈(或“R-基團”)性質和性質上在同源蛋白中取代的最高頻率將取代分成六類，例如，通過標準Dayhoff頻率交換矩陣來確定。類別舉例如下表：

另外，上述每一類別都進一步涉及相關的氨基酸類似物，例如第IV類中的鳥氨酸、高精氨酸、N-甲基賴氨酸、二甲基賴氨酸或三甲基賴氨酸，和第VI類中的鹵代酪氨酸。

此外，可用相同類型的D-氨基酸系統性取代一個或多個氨基酸(例如，用D-賴氨酸替換L-賴氨酸)來修飾本文中所述的肽，透過該修飾以產生更穩定的肽。因此，本發明的肽衍生物或肽模擬物可以是以正向或反向順序的，全部為L、全部為D或混合的D,L肽。N-端或C-端D-氨基酸的存在使肽的體內穩定性增加，因為蛋白酶不能利用D-氨基酸作為基質。反向-D肽是以相對於含有L-氨基酸的肽以反向順序安排的含有D-氨基酸的肽。例如，SEQ ID NO：33代表TF(SEQ ID NO：2)的反向D-氨基酸版本；而SEQ ID NO：34代表WT(SEQ ID NO：1)的反向D-氨基酸版本。因此，L-氨基酸肽的C-端殘基變成D-氨基酸肽的N-端等等。反向D-肽保留了相同的二級構象並且因此保留了類似於L-氨基酸肽的活性，但是對於體外或體內酶降解的耐受性更強，並且因此比原始的肽具有更好的治療效力。類似地，可以利用標準方法來產生反向L肽，其中母體肽(parent peptide)的C-末端替換了反向L肽的N-末端。本發明提供了不具有顯著二級結構的L-氨基酸肽的反向L肽(例如，短肽)，其保留了L-氨基酸肽的側鏈的空間和構象因此通常具 有與原始L-氨基酸肽相似的活性。而且反向肽可以含有L-和D-氨基酸的組合。得以保留氨基酸和側鏈構象之間的空間，從而與原始L-氨基酸肽具有相似活性。

再進一步，可對本發明的肽進行修飾，以包括與其連接的標籤或接頭，其可以用於成像目的、用於藥物遞送目的、或者用於提供額外的治療載荷。例如，可將本發明的肽融合於人IgG C-結構域，其具有設計為靶向並且對抗腫瘤細胞的IgG抗體。再進一步，可將本發明的肽融合於或連接於抗體的可結晶片段(Fc)區。另外，本發明的肽包括由SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：36表示的肽的片段和延長形式。根據進一步的實施方式，本發明的肽可以被化學地或結構地修飾，例如，以增加該肽將在生物系統中保留活性的時間(或者改善該肽的藥代動力學)。例如，可對該肽進行修飾以包括各種化學基團、分子或結構調整，例如糖基化、乙醯化、醯基化、二磷酸腺苷-核糖基化(ADP-ribosylation)、醯胺化、共價結合於聚乙二醇(例如，聚乙二醇化；PEGlyation；PEG化)、黃素的共價結合、血紅素的共價結合、核苷酸或核苷酸衍生物的共價結合、脂質或脂質衍生物的共價結合、磷脂醯肌醇的共價結合、交聯、環化、去甲基化、共價交聯的形成、甲醯化、γ羧化(γ-carboxylation)、多醣磷脂肌醇錨定物(glycosylphosphatidylinositolanchor；GPI anchor)形成、羥基化、碘化、甲基化、豆蔻醯化(myristoylation)、氧化、蛋白水解處理、磷酸化、異戊烯化、外消旋化、硒化(selenoylation)、硫酸化、泛素化、用脂肪酸進行的修飾，以及可被設計為改善該該藥物動力學的各種其他修飾。

如本文中施用的，本發明提供了術語「肽」，其不僅可以包 括其中氨基酸殘基通過常規肽(--CO--NH--)鍵連接的分子，而且還包括其中肽鍵逆轉的分子。可以利用本領域中已知的方法來產生這樣的逆反(retro-inverso)肽模擬物，例如在Meziere等人(1997)J.Immunol.159,3230-3237中的描述，這種方法涉及產生含有與骨架有關的變化而與氨基酸側鏈的假肽取向無關。

本發明提供了可以向靶細胞(或多個細胞)直接施用本發明包含的單個肽，或者可替代地，透過來自編碼序列的表達間接施用。例如，可以向編碼本發明肽的細胞或受試者提供多核苷酸(核酸序列)，例如由SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：36表示的任意肽，及其經修飾的形式。因此，本發明的肽可以產生自或者來自編碼並且能夠表達本發明的肽的多核苷酸的形式。本文中提到施用、遞送或施用本發明的肽的任意參比物意在包括經由編碼該肽的多核苷酸的表達直接使用、遞送或施用這樣的肽。

更具體的說明，本發明的核酸分子可以分離的或純化的形式提供，其編碼本發明的所選肽，當被置於適當的調控序列的控制之下時，其在體內可被轉錄(在DNA的情形下)和翻譯(在mRNA的情形下)為肽。編碼序列的肽的邊界由5’(氨基)末端處的起始密碼子和3’(羧基)末端處的翻譯終止密碼子確定。出於本發明的目的，這樣的核酸序列能夠包括，但不限於，來自病毒、原核或真核mRNA的cDNA，來自病毒或原核DNA或RNA的基因組序列，以及合成的DNA序列。可以根據本領域公知的方法來合成本發明的核酸分子，如Sambrook等人(19104,Molecular Cloning--a laboratory manual；Cold Spring Harbor Press)所揭露。本發明的核酸分子可以表達盒(expression cassette)的形式提供，其包括操作性地連接至肽編碼序列的 控制序列，從而使得本發明可應用肽在靶細胞或受試者中能夠在體內表達。而這些表達盒(expression cassette)又通常在載體中提供，例如，質粒或重組病毒載體，例如單純皰疹病毒1(herpes simplex virus-1；HSV-1)。例如，可將表達盒(expression cassette)直接施用於宿主細胞或受試者，或者，可替代地，可將本發明的肽-編碼核酸施用於宿主細胞或受試者。將外源核酸序列遞送至宿主細胞或受試者的方法是本領域中公知的，如在美國專利第5,399,346號、第5,580,859號和第5,510,466號中所描述的，其結合於本文作為參考。

再進一步，本發明提供了本文中所述的肽，有分離的和純化的形式，包括可將這樣的肽的各種組合和混合物向宿主細胞或受試者直接施用。例如，這樣的肽可以與可藥用的(藥品級)載體、稀釋劑和輔料一起施用，例如達爾伯克氏磷酸鹽緩衝鹽水，pH約7.4；0.9%鹽水(0.9% w/v NaCl)；和5%(w/v)葡萄糖。所述較佳之實施方式，用於將本發明的肽遞送至靶細胞可藥用的(藥品級)載體、稀釋劑和輔料不會在接受肽(並且所述較佳之實施方式以無不當毒性的形式施用)的個體(受試者)中誘導免疫反應。另外的可藥用賦形劑包括，但不限於，水、鹽水、聚乙二醇、透明質酸和乙醇。在本文中，也包括可藥用的鹽，例如，無機酸鹽(例如氫氯酸鹽、氫溴酸鹽、磷酸鹽、硫酸鹽，等等)和有機酸的鹽(例如醋酸鹽、丙酸鹽、丙二酸鹽、苯甲酸鹽，等等)。可藥用載體、稀釋劑和輔料的全面討論來自Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.,N.J.1991)。

如上文所述，本發明包括利用本文中所述的肽的特定方法。更具體的說明，例如，本發明包括通過將一種或多種本文中所述的肽施用 至一種或多種靶細胞而在一種或多種細胞中抑制PD-1和PD-L1之間的相互作用的方法，所述的肽為例如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的氨基酸序列、其組合、其片段、其延長形式、其衍生物(例如SEQ ID NO：3-SEQ ID NO：36的衍生物)、與前述的肽基本上同源的肽、或包含任意這樣的肽的藥品級組合物(例如上文所描述的那些)。類似地，本發明包括通過施用一種或多種本文中所述的肽在一種或多種細胞中增加IL-2水準的方法，所述的肽為例如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的氨基酸序列、其組合、其片段、其延長形式、其衍生物(例如SEQ ID NO：3-SEQ ID NO：36的衍生物)、與前述的肽基本上同源的肽、或包含這樣的肽的藥品級組合物。再進一步，本發明包括通過施用有效量的一種或多種本文中所述的肽來預防、治療或改善受試者中癌症的影響的方法，所述的肽為例如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的氨基酸序列、其組合、其片段、其衍生物(例如SEQ ID NO：3-SEQ ID NO：36的衍生物)、與前述的肽基本上同源的肽、或包含這樣的肽的藥品級組合物。

如上文所述，根據本發明的進一步實施方式，SEQ ID NO：1的某些衍生物可被用於前述的方法中。更具體說明，由選自SEQ ID NO：3-SEQ ID NO：36的氨基酸序列、或其組合、其片段、其延長形式、包含與其基本上同源的氨基酸序列的肽組成的肽(或者，在其他實施方式中，包含選自SEQ ID NO：3-SEQ ID NO：36的氨基酸序列、或其組合、其片段、其延長形式、包含與其基本上同源的氨基酸序列的肽)、和包含這樣的肽的藥品級組合物可以用於前述的方法中。更具體地，這樣的衍生物肽可透過施用有效量的一種或多種這樣的衍生物肽來實施(i)抑制一種或多種細胞中的PD-1和PD-L1之間的相互作用，(ii)增加一種或多種細胞中的IL-2水準，以及(iii) 用於預防、治療或改善受試者中癌症的影響的方法。

本發明提供了本發明的肽、或編碼本發明的一種或多種肽的核酸序列，其應以有效達到所期望終點的量向細胞或受試者施用。尤其是本發明的肽、或編碼，本發明的一種或多種肽的核酸序列，應該以有效(i)抑制靶細胞中PD-1和PD-L1之間的相互作用，(ii)增加靶細胞中的IL-2水準，或(iii)預防、治療或改善靶受試者中的癌症的影響的量向細胞或受試者施用。本發明提供了本文中所述的肽，其可以與表現出類似性質的其他試劑組合或者順序向細胞或受試者施用(例如，當施用本文中所述的肽以預防、治療或改善癌症的影響時，可將該肽與有效預防、治療或改善癌症的影響的其他試劑組合或順序施用於細胞或受試者)。

適用於細胞或受試者的量取決於各種因素。例如，在該肽的治療用途的情況下，該量可以根據受試者的體型或體重以及施用途徑而不同，該施用途徑例如口服(例如，片劑、錠劑、糖錠、水性或油性懸液、可分散的粉末或顆粒)形式，尤其是腸胃外、經表皮、皮下、經由吸入、靜脈內、肌肉內、胸骨內、經皮、皮內、舌下、鼻內、經口頰或通過灌注技術施用。作為進一步說明而不受限於其施用的(一種或多種)肽的量的範圍可以是約5μg至約100mg，或約300μg至約1mg；或者該用量的範圍為300μg、350μg、400μg、450μg、500μg、550μg、600μg、650μg、700μg、750μg、800μg、850μg、900μg、950μg或1mg可應用肽(或肽的混合物)。

實施例

利用肽陣列方法，發現了和化學合成了兩種肽(SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2)，它們在本文中被分別稱作WT和TF。SEQ ID NO：1/WT代表序列WYRMSPSNQT。SEQ ID NO：2/TF代表序列TAHPSPSPRPAGQF。如在下文中將要說明的，WT和TF(及其各種衍生物)結合於PD-L1並且阻止PD-L1與PD-1發生相互作用。更具體地說明，如下文中進一步所述，進行了一系列實驗來判斷WT和TF肽(及其某些衍生物)對於PD-1/PD-L1相互作用(以及這種抑制對於IL-2水準的影響)的抑制效力。

圖1係WT和TF肽的ELISA競爭性結果。經由競爭性ELISA測試WT或TF肽與人PD-L1的結合。將各種濃度的每一種肽(0.008μg/ml至10μg/ml)與固定濃度的重組人PD-1 Fc(10ng/ml)混合，並且結合於人PD-L1 Fc塗布的96-孔Immuno Maxisorp平底微量滴定板。經由生物素化的抗-PD-1抗體、鏈黴親和素-辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase；HRP)和3,3’,5,5’-四甲基聯苯胺(Tetramethylbenzidine；TMB)基質來檢測結合。在450nm處經由讀板器(ELISA reader)來收集吸光值。以吸光值對測試肽濃度作圖。如圖1所示，隨著測試肽(WT、TF)濃度增加，抑制百分比(%)增加，(即，測試肽對PD-1/PD-L1相互作用的干擾能力增加)。

圖2係WT、TF、或組合的WT和TF肽對於抑制PD-1/PD-L1相互作用(以及對IL-2濃度的所得影響)的體外測定結果。用1μg/ml的植物血凝素(Phytohaemagglutinin；PHA)和50ng/ml的佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯(Phorbol12-Myristate13-Acetate；PMA)活化5×10⁴個Jurkat T細胞，並與重組人PD-L1 Fc(8μg/ml)+1-10μg/ml的WT肽(圖2A)、1-10μg/ml的TF肽(圖2B)或者1-10μg/ml的組合WT和TF(圖2C)肽在37℃共培養48小時。收取細胞培養物懸液，並通過IL-2ELISA來判斷Jurkat T細胞的白細胞介素-2 (IL-2)的產生。圖2中的每個柱上方示出的數字代表IL-2濃度。如圖2中所示，當與PD-L1 Fc一起施用時，TF肽、以及組合WT和TF肽的存在使得IL-2濃度增加。

圖3係抑制PD-1/PD-L1相互作用的WT、TF、或組合的WT和TF肽處理的細胞水準測定結果。在本實施例中，用1μ/ml PHA和50ng/ml PMA活化5×10⁴個Jurkat T細胞，並且將其與混合了不同濃度WT(圖3A)、TF(圖3B)、或組合的WT和TF(圖3C)肽的3×10⁵個表達PD-L1的U87腫瘤細胞在37℃共培養48小時。收穫細胞培養物上清，並通過IL-2ELISA來判斷Jurkat T細胞的白細胞介素-2(IL-2)的產生。圖3A-圖3C中的每個柱上方示出的數字代表IL-2濃度。如圖3A-圖3C中所示，當與PD-L1 Fc一起施用時，WT肽、TF肽以及組合的WT和TF肽的存在使得IL-2濃度增加。而且，如圖3A-圖3C中所示，隨著測試肽濃度增加，觀察到IL-2濃度增加。

前述測定結果證明了WT和TF肽均能夠阻斷PD-1/PD-L1相互作用。另外，當WT和TF肽聯用時，觀察到增加的抑制效應(相對於單個測試肽處理)。為了改善WT肽的結合親和力，在WT肽每個位置處取代單個氨基酸，並且經由肽陣列針對每個PD-L1來檢查這樣的衍生物肽的結合親和力。更具體地，通過將含有衍生物測試肽的膜與15μg/ml陰性對照人IgG或重組人PD-L1 Fc在4℃一起孵育過夜來生成肽陣列結果。通過HRP-綴合的抗人IgG和HRP基質來檢測所得信號。現在參見圖4，其中示出的每個點代表來自測試衍生物肽和人PD-L1 Fc之間相互作用的檢測信號，黑色的深度表示結合親和力的水準。基於圖4中的肽陣列結果，發現了衍生物肽的以下序列作為WT肽的替代物：

圖5A係通過特定的PD-L1阻斷肽(及其特定其組合)阻斷PD-L1結合於PD-1。更具體地，在本實施例中並且參見圖5A和圖5B，WT代表SEQ ID NO：1；TF代表SEQ ID NO：2；ET代表SEQ ID NO：25；YT代表SEQ ID NO：28；以及TW代表具有D-氨基酸的WT的反向序列SEQ ID NO：34(在本文中也被稱作“D-TW”)。將這樣的PD-L1阻斷肽的不同組合(3μM和10μM)與重組人PD-1 Fc混合，並將其結合於人PD-L1 Fc塗布的96-孔Immuno Maxisorp平底微量滴定板。經由生物素化的抗-PD-1抗體、鏈黴親和素-辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase；HRP)和3,3’,5,5’-四甲基聯苯胺(Tetramethylbenzidine；TMB)基質來檢測結合。經由讀板器(ELISA reader)在450nm處收集吸光度測量結果。將人PD-1/PD-L1抑制的增加百分比(%)與未提供測試肽的樣品進行比較。在圖5A中總結了結果。

圖5B係抑制PD-1/PD-L1相互作用的不同PD-L1阻斷肽處理的細胞水準測定結果。在本實施例中，用1μ/ml PHA和50ng/ml PMA活化5×10⁴個Jurkat T細胞，並且將其與混合了不同組合的PD-L1阻斷肽的1×10⁵個表達PD-L1的腫瘤細胞在37℃共培養48小時。然後收集細胞培養物上清，並通過IL-2 ELISA來評價IL-2產生(來自Jurkat T細胞)。如圖5A和圖5B中所示，該測試PD-L1阻斷肽(及其測試組合)並未表現出PD-1/PD-L1相互作用的抑制。

圖6係通過本文所述的組合肽阻斷PD-L1增強了針對腫瘤細胞的細胞毒性。在本實施例中，用抗-CD3抗體(OKT-3)+IL-2刺激外周血單核細胞(PBMC)24小時，並隨後將其與PD-L1阻滯劑/肽(參見圖6中的阻滯劑/肽)和鈣黃綠素-AM標記的H460細胞(大細胞肺癌)一起孵育24小時。在孵育後收穫上清，然後經由微量讀板器(ELISA reader)(發射485nm，激發525nm)測量釋放的鈣黃綠素-AM螢光。基於下列算式來計算細胞毒性的百分比(圖6中所示)：[(樣品讀數-最小釋放)(最大釋放-最小釋放)]×100。如圖6中所示，當以10μg/ml(相比於3μg/ml)施用這樣的肽時，對於受試者腫瘤細胞表現出增強細胞毒性的測試PD-L1阻斷肽(相對於對照，「無肽」)，並且這樣的活性尤其明顯。

現在參見圖7和圖8，在本實施例中，在無血清培養基中將 Jurkat細胞饑餓培養過夜。隨後，在預塗有抗-CD3單克隆抗體和PD-L1 Fc的96-孔板中將細胞與不同組合的PD-L1阻滯劑/肽一起培養(參見圖7和圖8)或僅在培養基中在37℃培養10分鐘。向每個孔中加入冷凍磷酸鹽緩衝溶液(Phosphate-bufferedsaline；PBS)以中止反應並製備用抗-磷酸化的SHP-2和抗-β-肌動蛋白抗體進行印記分析的細胞裂解液。基於β-肌動蛋白表達來標準化磷酸化的SHP-2(含有細胞質SH2結構域的蛋白質酪氨酸磷酸酯酶)的表達水準，並且利用僅培養基的樣品來歸一化磷酸化的SHP-2針對不同PD-L1阻滯劑的相對表達水準。如圖7和圖8中所示，大部分的測試PD-L1阻滯劑/肽對於增加磷酸化的SHP-2的相對表達水準有效。

圖9A係阻斷小鼠PD-L1結合於小鼠PD1的影響。更具體的說明，將小鼠和人WT和TF肽(3μM和10μM)與重組小鼠PD-1 Fc混合並結合于塗布有小鼠PD-L1 Fc的96-孔Immuno Maxisorp平底微量滴定板。經由生物素化的抗小鼠PD-1抗體、鏈黴親和素-辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase；HRP)和3,3’,5,5’-四甲基聯苯胺(Tetramethylbenzidine；TMB)基質來測試結合。經由讀板器(ELISA reader)在450nm處收集吸光度測量結果。將小鼠(和人)PD-1/PD L1抑制的增加百分比(%)與(無肽)樣品進行比較。結果顯示，肽(具體地，人的肽)的特異性不具有如小鼠肽對小鼠PD-L1那樣的阻斷效應。圖9B中顯示出人和小鼠的肽之間的差異。

圖10A係通過不同形式的PD-L1阻斷肽阻斷PD-L1結合於PD-1。更具體地，在本實施例中並且參見圖10A和圖10B，3TF3ET代表連接於接頭的TF(SEQ ID NO：2)的三個拷貝，其後為ET(SEQ ID NO：25)的三個拷貝；代表3ET3TF連接於接頭的ET肽的三個拷貝，其後為TF肽的三個拷 貝；以及TF-Fc代表連接於人IgG4的可結晶片段(Fc)區的TF。用PD-L1阻斷肽編碼的病毒載體感染293FT細胞48小時。由感染的細胞表達和分泌每一種肽(或肽組合)(該肽或肽組合經由融合的5’信號肽分泌)。將來自感染的293FT細胞或合成的TF肽的含有所收穫的PD-L1阻斷肽的上清與重組人PD-1 Fc混合並結合於塗布有人PD-L1 Fc的96-孔Immuno Maxisorp平底微量滴定板。經由生物素化的抗-PD-1抗體、鏈黴親和素、辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase；HRP)3,3’,5,5’-四甲基聯苯胺(Tetramethylbenzidine；TMB)基質來檢測結合。經由讀板器(ELISA reader)在450nm處收集吸光度測量結果。將人PD-1/PDL1抑制的增加百分比(%)與對照(無肽)樣品進行比較。

圖10B係PD-1/PD-L1相互作用的不同形式的PD-L1阻斷肽處理的細胞水準測定結果。用1μ/ml PHA和50ng/ml PMA活化5×10⁴個Jurkat T細胞，並且將其與混合含有PD-L1阻斷肽的上清或合成的TF肽的1×10⁵個表達PD-L1的腫瘤細胞在37℃共培養48小時。48小時後，收穫細胞培養物上清並通過IL-2 ELISA來評價由Jurkat T細胞的IL-2產生。

圖11係體內實驗的結果，其中顯示出D-TW對荷載腫瘤細胞系LL/2的小鼠的影響。更具體的說明，將小鼠品系C57Bl/6(雄性，4周齡，初始體重~20-22g)與腫瘤細胞系LL/2在S.C.一起孵育(10⁵/小鼠)。植入14天后，用D-TW或D-TW-Scrambled處理小鼠7天(200mg/kg)，經由腹膜內(IP)注射。圖12顯示出參照圖11中的小鼠中D-TW對腫瘤尺寸的影響。如圖12中所示，發現D-TW肽對於C57Bl/6小鼠品系通常是無毒性的。另外，結果顯示，D-TW肽(200mg/kg)孵育對於顯著抑制腫瘤生長是有效的(相對於對照以及相對於D-TW-Scrambled肽)。

本說明書詳細描述出本發明的發明目的和益處，以下申請專利範圍意在涵蓋落入本發明的範圍精神內所有發明目的和益處。另外，由於本領域技術人員能夠明顯地和容易地做出大量改變和變化，因此申請專利範圍不應被認為是將本發明限制為本文所說明和描述的具體構造和操作。因此，所有適合的變化和等同替代都應被理解為落入如本文申請專利範圍所述的本發明的範圍內。

<110> 加拿大商復諾健生物技術加拿大有限公司(Virogin Biotech Canada Ltd)

<120> 用於抑制CD279相互作用的組合物和方法

<130> CQWNP1710002

<150> US 15/374,893

<151> 2016-12-09

<160> 36

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<223> 合成的

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Claims (17)

1. 一種肽，其中該肽係選自SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：36的氨基酸序列組成的肽。
2. 如申請專利範圍第1項所述的肽，其中，所述肽由選自於由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：34的一種或多種氨基酸序列組成。
3. 如申請專利範圍第1或2項所述的肽，其中，所述肽在藥品級組合物中。
4. 如申請專利範圍第1或2項所述的肽，其中，所述肽連接至抗體的可結晶片段(Fc)區。
5. 如申請專利範圍第1或2項所述的肽，其中，所述肽配製成經由局部組織注射、靜脈注射或腹腔內注射，施用於哺乳動物。
6. 如申請專利範圍第1或2項所述的肽，其中，所述肽由病毒或非病毒載體編碼並且被分泌到細胞外間隙中。
7. 如申請專利範圍第1或2項所述的肽，其中，所述肽被配製為(a)待施用於哺乳動物以在所述哺乳動物中產生免疫反應以及(b)針對PD-L1產生抗體。
8. 一種或多種肽在製備用於抑制細胞中PD-1和PD-L1相互作用的藥物中的用途，其中，該肽選自SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：36的氨基酸序列所組成。
9. 如申請專利範圍第8項所述的用途，其中，每一種所述肽由選自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：34的一種或多種氨基酸序列組成。
10. 如申請專利範圍第8或9項所述的用途，其中，所述肽在藥品級組合物中。
11. 如申請專利範圍第8或9項所述的用途，其中，所述肽被配製成經由局部組織注射、靜脈注射或腹腔內注射，施用於哺乳動物。
12. 如申請專利範圍第8或9項所述的用途，其中，所述肽由病毒或非病毒載體編碼並且被分泌到細胞外間隙中。
13. 一種或多種肽在製備用於預防、治療或改善受試者中癌症的影響的藥物中的用途，其中，該肽選自SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：36的一種或多種氨基酸序列組成。
14. 如申請專利範圍第13項所述的用途，其中，每一種所述肽由選自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：34的一種或多種氨基酸序列組成。
15. 如申請專利範圍第13或14項所述的用途，其中，所述肽在藥品級組合物中。
16. 如申請專利範圍第13或14項所述的用途，其中，所述肽被配製成經由局部組織注射、靜脈注射或腹腔內注射向哺乳動物施用。
17. 如申請專利範圍第13或14項所述的用途，其中，所述肽由病毒或非病毒載體編碼並且被分泌到細胞外間隙中。