TW201904118A - 植物萃取液作為微生物能源應用電子梭的測試方法 - Google Patents

植物萃取液作為微生物能源應用電子梭的測試方法 Download PDF

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Abstract

一種添加於微生物燃料電池以提高其產電效率的植物萃取液，該萃取液可為中草藥類萃取液，例如：金銀花萃取液、丁香萃取液、麻黃萃取液、乾薑萃取液等，或是茶葉類萃取液，例如：綠茶萃取液、普洱茶萃取液，以及滇紅萃取液等，經循環伏安法測至具有穩定氧化還原峰以及可逆性穩定變化趨勢者。這些萃取液不僅具有抗氧化活性，亦具有電子梭作用，更可生生不息之綠色循環應用。

Description

添加於微生物燃料電池以提高其產電效率的植物萃取液
本發明係與綠色能源有關，特別是關於一種添加於微生物燃料電池以提高其產電效率的植物萃取液。
台灣由於天然資源之貧瘠，長久以來造成仰賴外來能源及相關資源輸入在工業發展上之缺陷。因此如何有效再生利用資源，並同時尋找本土再生性能源，已是刻不容緩的課題。事實上，基於綠色永續發展之理念考量，台灣雖僅占世界總土地面積之0.025%，但根據台灣科技部及中央研究院與農委會之相關調查報告中顯示，台灣本土之微生物多樣性可豐富高達全球之2.5%，極具應用開發潛力。因此基於不引入外來物種及不進行物種基改以減少環境生態負擔之原則下，本研究選定東台灣天然生態為主要場域，自天然環境生態中自行篩選出本土功能性微生物，來進行各種綠色永續資源回收利用之研究評估。近年來研究更發現，在工業上染整廢水處理之過程中，更可同時回收產電，更發掘出多株具電化學活性之純菌，可用來達到此種同時染料廢水處理及回收產電之功效，對未來在染整廢水處理性能提升之相關應用，實具有相當重要之發展潛力。
其中微生物燃料電池(Microbial Fuel Cell,MFC)更是近年來另一種新興替代生質能源之代表。而且大部分目前MFC的研究多考慮結合了微生物產電以及廢水處理以進行能源回收再利用，是以更符合綠色永續 之「搖籃至搖籃」之生態設計理念。再者，由於微生物處理染整廢水多在厭氧條件下操作，先前研究更指出在胞內偶氮還原酵素之催化下，裂解偶氮染料中的偶氮鍵後，會產生脫色代謝芳香胺之中間物(Chen et al.,2010；Hsueh et al.,2008)，此類芳香胺中間物更能藉由好氧條件下進一步經由羥基化(hydroxylation)和開環(ring-opening)反應而進行降解，更可有效將染整廢水完全處理，以期可將環境污染程度降至最低。研究中更推測脫色代謝中間物極可能具有可以作為傳電中介物的能力(Chen et al.,2012)，部分研究中亦提及此類中間物可能亦具有提高微生物脫色效率的可能性，因此本研究將探討此類芳香胺中間物對於MFC會產生之影響，以期瞭解在MFC操作處理染整廢水時，可能將產生之結果。
有文獻曾提出化學物質之抗氧化功能與電子梭能力可能皆是電子轉移相關之電化學特性。而且在先前研究中發現染料微生物脫色代謝物更具有能促進脫色及微生物產電之電子梭能力，但是由於化學染料可能具有微生物毒性，且不具生態友善應用之疑慮。因此基於環境友善性之考慮，自天然可食用之植物中篩選出具有類似電子梭特性以資利用之成分，確實已是目前綠色環境微生物技術上極重要之研究課題。再者，文獻指出中草藥(例如：丁香、金銀花)含有多酚及類黃酮類抗氧化物成分，具有電化學活性存在。文獻更指出電化學分析研究中發現含兒茶素之茶葉，可能亦具有氧化還原峰之電子梭特性，因此合理懷疑天然中草藥中富含的色素，可能亦是電子移轉之發色基團，而且存在著人體需要的營養物質或可能具有豐富的藥膳作用，例如：金銀花(Lonicera japonica)、丁香(Syzygium aromaticum)等常見中草藥，由於其富含天然多酚類黃酮化合物被認為可能 是促進健康的植物化學物質，主因其(1)具有優良的抗氧化活性，抗病毒，抗癌，抗發炎的特性，和(2)優異之清除自由基能力。因此合理推論可用此電化學特性來同時提升微生物產電及脫色效能，所以亦會推論運用到染料廢水處理之可行性。
緣是，本發明之主要發明目的在於提供一種添加於微生物燃料電池以提高其產電效率的植物萃取液。
為達成前述之發明目的，本發明所提供之添加於微生物燃料電池以提高其產電效率的植物萃取液，該植物萃取液是由取預定重量的植物樣本，經切碎磨細後，置於一預定體積與濃度的萃取劑中，浸泡一定時間，再經減壓濃縮以及抽氣過濾，而得之；且以該植物萃取液進行循環伏安法測試後，其電子轉移均數(equivalent number of electron transfer,nc)大於0.04，其中，nc=57mV/｜Epa-Epc｜，Epa：氧化峰電位Epc：還原峰電位。
在一實施例中，該植物萃取液係選自於金銀花(Lonicera japonica)萃取液、枇杷葉(Eriobotrya japonica)萃取液、豬苓(Polyporus umbellatus)萃取液、麻黃(Ephedra sinica)萃取液、丁香(Syzygium aromaticum)萃取液、青皮(Citrus reticulate)萃取液、荊芥(Schizonepeta tenuifolia)萃取液、綠茶(Camellia sinensis(L.)Kuntze)萃取液、普洱茶(Camellia assamica(Mast.)Chang)萃取液，以及滇紅(Camelliaboreali-yunnanica)萃取液。
所加入的中草藥類或是茶葉類萃取液，不僅具有抗氧化活性，亦具有電子梭作用，更可生生不息之綠色循環應用。
第1圖為本發明一較佳實施例中各種中草藥萃取液在未微生物脫色前之循環伏安比較圖譜。
第2圖為本發明一較佳實施例中各種中草藥萃取液經100圈循環伏安圖譜之變化。
第3圖為本發明一較佳實施例中陳皮萃取液在不同劑量下的循環伏安圖譜變化。
第4圖為本發明一較佳實施例中丁香萃取液在不同pH環境下循環伏安圖譜之變化比較圖。
第5圖為本發明一較佳實施例中將中草藥萃液加入微生物燃料電池之功率密度圖。
第6圖為本發明一較佳實施例中將中草藥萃液加入微生物燃料電池之交流阻抗圖。
第7圖為本發明一較佳實施例中綠茶水萃與酒萃的循環伏安的比較圖。
第8圖為本發明一較佳實施例中不同濃度的茶葉萃取液在30分鐘時之清除DPPH自由基的劑量反應曲線比較圖。
本發明主要是提供一種植物萃取液，其可添加於一微生物燃料電池中，據以提高該微生物燃料電池的產電效率。其中，該微生物燃料電池可為用空氣陰極一單槽式微生物燃料電池(single-chamber MFCs,SC-MFCs)或是取聚甲基烯酸甲酯(Poly(methyl methacrylate),PMMA)材質 槽體自行組裝成雙槽式微生物燃料電池。微生物燃料電池之培養液為液體LB培養基(Luria-Bertani broth medium)，組成之成分含有10gL-1的胰蛋白酶(tryptone)、5gL-1的酵母萃取物(yeast extract)及10gL-1的氯化鈉(NaCl)，pH值為7.0±0.2。
本發明所提供之植物萃取液，主要可分為中草藥類萃取液與茶葉類萃取液，說明如下：
一、中草藥類萃取液：
在本發明中，發明人選取了金銀花(Lonicera japonica)、丁香(Syzygium aromaticum)、麻黃(Ephedra sinica)、乾薑(Zingiber officinale)、葛根(Pueraria montana)等數十種常見之中草藥，萃取液的製備步驟為先以新鮮2.5g切碎磨細，溶於50mL的50%乙醇溶液中(酒萃)，浸泡30分鐘，再以減壓濃縮在攝氏65℃下煮沸2小時，進行抽氣過濾，取其藥萃液，再以去離子水將其定量至50mL。
循環伏安法
前述的萃取液將進行循環伏安法以測定其電化學狀況。該循環伏安法包含有以下步驟：將中草藥汁液以氮氣去氧曝氣15分鐘，後掃描1.5V到-1.5V，速率為10mV‧s-1。由於中草藥本是多元複雜之混合物，因此以六次掃描觀察是否具有穩定氧化還原峰，再將具有此特性之樣品，再進行循環伏安100圈，以觀察其峰隨時間之可逆性穩定變化趨勢。
在經過循環伏安法的測試後，發現出許多中草藥在未經過生物處理前，即已具有氧化還原峰(第1圖)，而關於各種中草藥依據氧化還原峰之檢測值估算電子轉移量化之電化學特性比較，請參閱下表。
nc：電子轉移均數(equivalent number of electron transfer)
nc=57mV/｜Epa-Epc｜，Epa：氧化峰電位Epc：還原峰電位
整體而言，當電子轉移數目(nc)值大於0.04該萃取液即可用來添加於MFC。根據表1，符合前述特性的的中草藥類萃取液包括：金銀花(Lonicera japonica)萃取液、陳皮(Citrus reticulate)、葛根(Pueraria montana)萃取液、枇杷葉(Eriobotrya japonica)萃取液、豬苓(Polyporus umbellatus)萃取液、麻黃(Ephedra sinica)萃取液、丁香(Syzygium aromaticum)萃取液、青皮(Citrus reticulate)萃取液、荊芥(Schizonepeta tenuifolia)萃取液。
為瞭解氧化還原峰之電子梭能力是否具只有可逆性，且特性上表現穩定，因此經百次循環掃描(第2圖)亦可看出隨著循環伏安掃描次數的增加，氧化還原峰亦逐漸隨之遞減，甚至於在初期遞減最為顯著，到第80圈後幾乎沒有變化，代表在氧化還原過程可能部分產生不可逆的化學物種累積使然。電化學特性之衰減，事實上亦可能代表抗氧化活性可能占優勢之結果，電子梭特性由於是觸媒特性，因此在百次掃描中會逐漸呈現穩定可逆之表現特性，更代表具有更高電子梭特性之應用可行性。由上述的比較中遞減較不明顯之中草藥樣品，推測其電子梭成份仍可能具有相對穩 定性，可能可增加促進染料降解及微生物產電。由於此種特性之天然中草藥，中草藥之廢棄物，不只是有機堆肥，極可能被運用到廢水處理以及在食物保鮮或醫療上之能量生物技術上之精煉應用上，後續將進行微生物脫色，以比較其間的能量萃取上之程度差異，定義出工程應用上之效率。
菌株前培養及脫色
此外，該等萃取液會再進一步比較微生物脫色前後之生物電化學特性變化差異分析。本發明取定自行篩選之脫色菌株Shewanella haliotis WLP72,Aeromonas sp NIU01，加入經滅菌後LB培養基配成之培養液(25g/L)，再將菌株分別加入培養液中，進行兩次活化12小時之搖瓶前培養，以利後續染料脫色使用。為檢測其天然植物脫色代謝物是否具促進脫色之能力，將活化後的菌株菌液取1ml及篩選出的有色植物汁液50ml，加入含50ml，兩倍之LB(1：1 V：V)稀釋後搖瓶培養，再以30℃、125rpm條件下搖瓶培養12小時後，開始靜置脫色20hr以上，分別量測不同時間下菌體密度及染料濃度，由時間曲線估算出微生物生長及脫色效能。
毒性測試
眾所皆知，藥物在閥值濃度以上且在生理上可接受濃度以下方為藥，在過高濃度反成“毒“。中草藥雖然富含天然抗氧化成分，但可能具有抑菌之成份，隨著中草藥濃度的提高，其電子梭之功效雖然提高，但抑菌之能力亦隨之提高，抗菌能力亦可能是其生物抑制毒性所致，因此須找出菌體能承受之最佳電子梭劑量條件，因此進行生物抑制毒性測試，以觀察其生長變化情形。
由生長曲線(數據未列)中可看出隨著丁香濃度之增加，菌體 生長飽和菌體最大值隨之降低，並且當劑量高於6gL-1，菌體之濃度無法隨著時間增長而增加，甚至減少。可推測菌體無法承受毒性已然被抑制。在0小時，濃度隨著丁香濃度增加而增加，因其受到丁香萃取液之顏色及其中雜質所影響，故與無添加丁香之值有顯著差異。後續會再以生物呼吸儀或是BOD/COD作為生物分解性指標來定義其毒性作用表徵。
劑量效應
即便是中草藥中可能含有具氧化還原峰之化學物質，但是其劑量仍需高於閥值才可有效顯現生物電化學特性之能力，否則其峰值仍無法顯現出來。因此在此對各中草藥作劑量分析探討如(第3圖所示)。第3圖即可明顯看出，陳皮在高劑量(大於40gL-1)時才具有較明顯之氧化還原峰，若低於其閥值，其氧化還原峰不易觀察，甚至有消失現象，若要使其有效發現電子梭之功效，必須提高劑量高於其閥值，才具有作用。因此除了考慮中草藥有效物種外，其劑量條件亦是必要條件才能起電子梭作用。但是中草藥既是藥，在過高劑量下，仍可能對生物體產生負面效果之抑制毒性，因此有必要進行後續毒性評估以利於優化評價分析。
酸鹼值影響
pH值可能會影響抗氧化物質(即多酚類)清除自由基之能力，而且pH值會使循環伏安之氧化還原峰產生顯著改變，故需考量不同pH事實上值下是否對中草藥產生之影響進行評價分析。，由第4圖指出中草藥之萃液大多偏屬酸性，雖然此特性有利於生物體胃腸消化吸收，但在電化學活性表現上，似乎不偏好有利。尤其以丁香為例，其萃液未經處理之pH值約在3.63，因此不利微生物燃料電池的合適操作pH中性偏弱酸條件。抗 氧化成分在接近中性偏鹼性時，其氧化還原峰變更為顯著，若將其加入MFCs中，有效pH值調控對其氧化還原能力表現會有所增強可應用性提高。在一實施例中，該植物萃取液pH值在4.76與7.25之間。
微生物電池-交流阻抗與極化曲線
為了評價電池產電之效率，使用線性掃描伏安法(LSV)測量MFC的功率密度(P)和電流密度(I)，並使用萬用表記錄相應的電壓。通過公式P=V2/(A×R)和I=V/(A×R)分別計算功率密度(P)和電流密度(I)，電化學阻抗譜(EIS)(HIOKI 3522-50，Japan)測量。EIS以二極法MFCs陽極為工作電極，陰極為參考電極與輔助電極，在穩定電壓，擾動振幅為10.0mV，頻率範圍為104~5×10-2Hz。阻抗圖(EIS curve)與x軸的截距則為實際阻抗(real impedance,Zre)，可作為電解質電阻(electrolyte resistance,Rele)；而阻抗圖中的曲線在x軸交點後的曲線投影長度是反應動力電阻(kinetic resistance)與質傳電阻(diffusion resistance)之和(Rkin+Rdiff)將三者總和值則為電池內阻Rin(Relec+Rkin+Rdiff)，使用Nyquist圖軟件(Zview 2.6b，Jiehan Tech)收集數據和分析估算電化學特性。
第5圖顯示將中草藥類萃取液加入微生物燃料電池之功率密度的變化，第6圖則顯示將中草藥類萃取液加入微生物燃料電池之交流阻抗的變化，由圖可知，電池功率密度圖來觀察，將丁香與陳皮萃取液分別添加進入MFCs中，其產電功率可由12.56mWm-2提升至18.21mWm-2和15.22mWm-2提升45.0%和21.2%的產電效率。下表為微生物燃料電池添加不同中草藥萃取液之交流阻抗比較表：
由表可看出添加中草藥萃取液後，其電池內阻下降，可由621.74Ω下降到481.35Ω和593.30Ω，下降比例22.6%和4.57%。因此可確定中草藥萃液確實具有能促進產電之電子梭功效，但如前述，中草藥之電子梭效應屬於較溫和者。值得一提的是，功率密度增加的比例與內阻減少的比例不甚平行，可能是因為萃液中存在著其他不具備電子梭功效雜質之結果，反可能被用作生長或生理代謝基質，因而導致電池電壓上升，內阻未相對顯著下降之結果。
二、茶葉類萃取液：
本發明先取定未使用過之茶葉來進行評價。首先將不同發酵程度的茶葉，例如：綠茶(Camellia sinensis(L.)Kuntze)、普洱茶(Camellia assamica(Mast.)Chang)、滇紅(Camelliaboreali-yunnanica)，先取新鮮2.5g切碎磨細，分別溶於50mL的50%乙醇溶液(Ethanol extract)與50mL的蒸餾水(Water extract)兩種萃取劑中，浸泡30分鐘，再以減壓濃縮在65℃下煮沸2小時，進行抽氣過濾，取其萃液，再以去離子水將其定量至50mL，以利後續評估分析。
循環伏安法
將茶葉萃取液以氮氣去氧曝氣15分鐘，後掃描1.5V到-1.5V，速率為10mV．s-1。由於茶葉本為多元複方之混合物，因此以六次掃 描觀察是否具有氧化還原峰，再將具有此特性之樣品，再進行循環伏安100圈以觀察其峰隨時間是否具有可逆性穩定變化趨勢。之後再比較微生物脫色前後之電化學特性變化差異，以利於比較分析。
茶葉萃取方法評估
首先評估不同萃取方法(水萃與酒萃)是否對茶萃取效果有所影響，何者方能萃取出較高含量之多酚類成分，以利於後續促進電子移轉相關評估研究。首先將水萃與酒萃的茶葉萃取汁液分別進行循環伏安法測試，來確認是否具有促進電子轉移的氧化還原峰。依據第7圖的結果發現無論是水萃或是酒萃皆具有促進電子轉移的氧化還原峰，但是水萃顯然更優於酒萃，具有較顯著的氧化還原峰，其原因可能為水浴萃取能提取較多較親水之酚類分子，另外酚類結構式中含有一OH鍵，因此較易親水形成氫鍵而溶解，故對水溶解度高，後續萃取皆採用水浴萃取為標準作業程序。
微生物降解茶葉萃取液之電化學評估
由於茶葉之品質差異可能在於發酵程度，因此為評估各種不同發酵程度茶葉萃取液經微生物轉化後是否具電子梭之特性以促進電子轉移。先將茶葉萃取汁液與經WLP72希瓦氏菌微生物處理後之茶葉萃取液分別進行循環伏安法測試，來觀察是否具有或增加促進電子轉移的氧化還原峰大小。結果顯示經過微生物處理後的萃液皆優於未經微生物處理。
茶葉萃取液-抗氧化能力評估
為確定抗氧化與電子轉移之關聯性，故將不同濃度(0.1、0.5、1、10、50gL-1)的綠茶與滇紅萃取液進行清除DPPH自由基的抗氧化能力試驗，由圖4可看出當茶萃液濃度增加，隨著多酚類化合物濃度增大，其 DPPH自由基之清除效率亦隨之上升。第8圖及表一更指出以茶葉在約0.2~0.4g L-1即具EC50之清除效果，由B值大於1更可看出茶葉自由基清除效果是相當有效的。而且未發酵茶(綠茶)無論在何種濃度下其抗氧化能力皆優於發酵茶(滇紅)，第8圖之劑量響應曲線亦明顯指出綠茶(位於右邊之曲線)具較高之抗氧化消除活性(EC50：0.203gL-1(綠茶)<0.408gL-1(滇紅))，兩者之響應曲線方程式分別為Y=6.74+2.51 logZ(綠茶)Y=5.69+1.77 logZ(滇紅)，而該結果也與預期猜測具有較強氧化還原電子梭特性之茶葉其抗氧化能力也越強相符，其原因可能為抗氧化是電子轉移的過程，而具有較強電子梭特性的茶葉其電子轉移能力也更強，故兩者之間為正相關之趨勢，代表富含多酚化合物之抗氧化活性確實具有電化學特性。
綜上，根據本發明的研究成果，在本研究證實多種中草藥與茶葉的萃取液確實具有電化學活性，不僅具有抗氧化活性，亦可能具有電子梭作用，更可生生不息之綠色循環應用。
上述實施例僅為例示性說明本發明之技術及其功效，而非用於限制本發明。任何熟於此項技術人士均可在不違背本發明之技術原理及精神的情況下，對上述實施例進行修改及變化，因此本發明之權利保護範圍應如後所述之申請專利範圍所列。

Claims (10)

  1. 一種植物萃取液，係用於添加入一微生物燃料電池中，用以提高該微生物燃料電池的產電效率，其特徵在於：該植物萃取液是由取預定重量的植物樣本，經切碎磨細後，置於一預定體積與濃度的萃取劑中，浸泡一定時間，再經減壓濃縮以及抽氣過濾，而得之；且以該植物萃取液進行循環伏安法測試後，其電子轉移均數(equivalent number of electron transfer,n c)大於0.04，其中，n c=57mV/｜E pa-E pc｜，E pa：氧化峰電位E pc：還原峰電位。
  2. 依據請求項1所述之植物萃取液，其中該植物萃取液係選自於金銀花( Lonicera japonica)萃取液、陳皮( Citrus reticulate)、葛根( Pueraria montana)萃取液、枇杷葉( Eriobotrya japonica)萃取液、豬苓( Polyporus umbellatus)萃取液、麻黃( Ephedra sinica)萃取液、丁香( Syzygium aromaticum)萃取液、青皮( Citrus reticulate)萃取液、荊芥( Schizonepeta tenuifolia)萃取液。
  3. 依據請求項1所述之植物萃取液，其中該植物萃取液pH值在4.76與7.25之間。
  4. 依據請求項1所述之植物萃取液，其中該萃取劑係選自50%乙醇溶液(Ethanol extract)與蒸餾水(Water extract)。
  5. 依據請求項1所述之植物萃取液，其中該循環伏安法為以一循環電位，1.5V到-1.5V，速率為10mV．s -1循環施加於該植物萃取液以取得該等氧化還原峰。
  6. 依據請求項1所述之植物萃取液，其中該植物萃取液係選自於經WLP72希瓦氏菌微生物處理後之綠茶( Camellia sinensis(L.)Kuntze)萃取液、普 洱茶( Camellia assamica(Mast.)Chang)萃取液，以及滇紅( Camelliaboreali-yunnanica)萃取液。
  7. 依據請求項1所述之植物萃取液，其中該植物萃取液係選自於綠茶( Camellia sinensis(L.)Kuntze)萃取液、普洱茶( Camellia assamica(Mast.)Chang)萃取液，以及滇紅( Camelliaboreali-yunnanica)萃取液，且該萃取劑為蒸餾水(Water extract)。
  8. 依據請求項1所述之植物萃取液，其中該植物萃取液係為陳皮( Citrus reticulate)萃取液，且其劑量大於40gL -1。
  9. 依據請求項1所述之植物萃取液，其中該植物萃取液係為丁香( Syzygium aromaticum)萃取液，且其劑量小於6gL -1。
  10. 一種植物萃取液，係用於添加入一微生物燃料電池中，用以提高該微生物燃料電池的產電效率，其特徵在於：該植物萃取液係選自於金銀花( Lonicera japonica)萃取液、陳皮( Citrus reticulate)、葛根( Pueraria montana)萃取液、枇杷葉( Eriobotrya japonica)萃取液、豬苓( Polyporus umbellatus)萃取液、麻黃( Ephedra sinica)萃取液、丁香( Syzygium aromaticum)萃取液、青皮( Citrus reticulate)萃取液、荊芥( Schizonepeta tenuifolia)萃取液、綠茶( Camellia sinensis(L.)Kuntze)萃取液、普洱茶( Camellia assamica(Mast.)Chang)萃取液，以及滇紅( Camelliaboreali-yunnanica)萃取液。
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