TW201828981A - 第二型豬環狀病毒（pcv2）之次單位疫苗及其核苷酸序列 - Google Patents

Abstract

本發明係提供一種第二型豬環狀病毒（Porcine Circovirus Type 2, PCV2）之次單位疫苗及其核苷酸序列，其包含組合編碼PCV2 ORF2（Open Reading Frame 2， 開放式讀取框）之DNA片段；藉之，本發明可於豬體內，誘導產生對PCV2之專一性抗體，進而可以保護，可能受PCV2感染之豬隻。

Description

第二型豬環狀病毒（PCV2）之次單位疫苗及其核苷酸序列

本發明係提供一種第二型豬環狀病毒（PCV2）之次單位疫苗及其核苷酸序列，尤指一種用以免疫豬隻被PCV2感染者。

按，離乳後多系統衰竭綜合症（Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome, PMWS）為發生於豬隻之疾病，其最早係1996年加拿大西部的一處無特殊病原（specific-pathogen free; SPF）之養豬場所發現，而後，於亞洲、北美、南美及歐洲亦陸續發生，至今，此疾病仍盛行於世界各地之養豬生產國，而因豬隻為重要的經濟動物，亦為人類主要的動物性蛋白質來源之一，故PMWS業已成為影響養豬業經濟之重要疾病。

PMWS之組織病理變化已經確定可由 PCV2 （Porcine Circovirus Type 2， 第二型豬環狀病毒）之感染所引起，並如前述，若僅有PCV2 單獨感染，則，PMWS 之發病率則僅有15%，再者，由於PCV2廣泛存在於豬隻身上，故並無法僅透過檢測而診斷PMWS；PMWS診斷，必須符合：存在相符的臨床症狀、存在特有的微觀病變，及病灶內有 PCV2存在之三要件，若其一者不符，則無法確診為PMWS。

PCV2被歸類在圓環病毒科（Circoviridae）、環狀病毒屬（Circovirus）的 Porcine Circovirus （PCV）病毒，係能在真核細胞中自主複製最小的動物病毒，其有 type 1 和 type 2 之分，type 1 是沒有致病性的， 而 type 2 則是與 PMWS 相關的病毒類型，二者之間有著約 68~76 % 的同源性，且二者擁有一個以上的共同抗原，故PCV1 和 PCV 2 還是可以藉由「病毒特異性 PCR （virus-specific polymerase chain reaction）」、「限制內切酶片 段長度多態性 （restriction endonuclease fragment length polymorphism; RFLP）」、「原位雜交（in situ hybridization）」，或運用「單株抗體（monoclonal antibodies）」等技術來加以區分；PCV2 係二十面體且無膜套病毒，基因組為環狀的單股 DNA，大小約為20nm，基因組大小約在 1766~1768 個核苷酸，至少有 4 個開放式讀取框（Open Reading Frame， ORF），主要的是 ORF1 及 ORF2，其他則多包含在 ORF1 之內；ORF1 編碼的是與複製相關的 Rep 蛋白，ORF2 則是編碼 capsid（衣殼）蛋白；分別比對 PCV1 和 PCV2 之 ORF，可發現二者之 ORF1 的相似性高達 85 %，而 ORF2 的相似性僅 66 %，說明二病毒之間可以轉譯出複製蛋白的 ORF1 具有高度的保留性。

PCV2 之傳播途徑，主要是藉由豬的口鼻與受感染豬隻之糞便或尿液接觸感染，亦可藉由直接傳染，PCV2 也可通 過胎盤直接從母豬垂直傳染，但此傳播方式較為罕見；PCV2 可經由呼吸道分泌物、口腔分泌物、尿液和糞便進行病毒脫離，又因為 PCV2 是廣泛存在的，故即使於健康豬隻身上，亦能釋放出PCV2，但相對而言，受感染且表現出臨床症狀豬隻的病毒釋出量還是高於無臨床症狀者。

PMWS存在於現今世界各地的養豬場，然而目前並無可有效治療之藥物，且其疾病發生與許多因素有關，欲減少 PMWS 的發生，一般還是透過豬場管理，透過保持養豬環境的衛生安全、減少緊迫、飼料添加營養劑等方式；雖目前市面上已有分別針對 PCV2之疫苗問世，惟PCV2 疫苗多為不活化疫苗。不活化疫苗係在製造過程中經過不活化處理將病原菌殺死，因此沒有回毒疑慮，缺點為無法在生長體內複製，故僅能引起體液免疫，且抗體產生較慢，時效較短，可能要反覆補強疫苗，造成成本負擔。

有鑑於此，吾等發明人乃潛心進一步研究PCV2，期以一較佳發明以解決上述問題，且在經過不斷試驗及修改後而有本發明之問世。

爰是，為達致以上目的，吾等發明人提供一種第二型豬環狀病毒（PCV2）之次單位疫苗，其包含組合編碼PCV2 ORF（Open Reading Frame， 開放式讀取框）2 DNA片段。

據上所述之第二型豬環狀病毒之次單位疫苗，其中，該PCV2 ORF 2係包含 SEQ ID NOS：1 之核苷酸序列。

據上所述之第二型豬環狀病毒之次單位疫苗，更包含一藥學上可接受之載體。

是由上述說明及設置，顯見本發明主要具有下列數項優點及功效，茲逐一詳述如下：

1.本發明經動物體實驗，在 PCV2專一性抗體的偵測上，經由實驗室自行生產PCV2抗原及Porcine Circovirus 2（PCV2）Antibody Test Kit 商用檢測套組（BioChek, Netherland），利用ELISA 分析，可予以觀察實驗小豬施打本發明之疫苗後，確實可以產生此疫苗的專一性抗體，證明本實驗以PCV2病毒的基因片段製成的次單位疫苗，在動物實驗上確實有能力同時針對此病毒的感染進行免疫防禦；藉此，本發明可產出具有良好免疫原性且可有效預防 PMWS 疾病之感染，藉可提升豬隻之存活率，並有效制止PCV2病毒在全球養豬業造成之經濟影響。

關於吾等發明人之技術手段，茲舉數種較佳實施例配合圖式於下文進行詳細說明，俾供 鈞上深入了解並認同本發明。

PCV2病毒重組基因表現載體的建構：

實施例一：篩選病毒基因片段。

如第1圖所示，本發明係於NCBI （National Center for Biotechnology Information）網站上搜尋其公佈之 PCV2（Porcine Circovirus Type 2， 第二型豬環狀病毒）因次單位疫苗之蛋白需要能回溶於水溶液，故找出近親水端的蛋白質序列，故本發明係分別收集PCV2 ORF2（Open Reading Frame 2，開放式讀取框） 之片段序列，並且此片段序列與大陸病毒株胺基酸序列相似度高，故針對這些病毒株之ORF2進行設計，本實施例中所選擇ORF2之部分序列，係如SEQ ID NOS：1所示，並利用 MEGA （Molecular Evolutionary Genetics Analysis）軟體比對找出此些片段保留性較高之 DNA 序列，並將PCV2之DNA 序列以 ExPASy-Translate tool 轉譯成為胺基酸序列，以比對其親、疏水性，再將此二段胺基酸序列輸入 Hydropathicity Plots軟體，利用其 Hopp-Woods Scale （hydrophilicity）功能找出較偏親水性之片段序列，令製成之蛋白易溶於水溶液中；其中，需特別留意胺基酸能正常摺疊。

實施例二：Tri-system （PCV2）限制酶切確認。

Tri-system （PCV2）以 AgeI進行限制酶切割實驗，膠體電泳初步確認結果如第2圖所示，可見其切割後質體大小分別為5.705kb 、 1.476kb及0.232kb，其中，第2圖中之M為Marker，1為Tri-system-PCV2-ORF2殖株。

實施例三：Tri- PCV2 以SDS-PAGE 及 Western blot分析。

第3圖所示之PCV2-ORF2純化蛋白及大腸桿菌粗萃取物之SDS-PAGE分析圖，其中，M為蛋白質標準液（protein marker）；lane 1-6為純化的PCV2蛋白抗原，以2X連續稀釋之純化PCV2蛋白；lane 7-9為PCV2蛋白的粗萃取物。經計算後，目標蛋白（含報導基因）的分子量為78 kDa。

第4圖所示者，為PCV2-ORF2的純化蛋白及大腸桿菌粗萃取物，使用His-tag的抗體，進行Western blot分析；因為建構Tri-system-PCV2-ORF2的載體上，其報導基因帶有8個His-tag，可用來純化與偵測 PCV2-ORF2 融合蛋白（fusion protein）；其中，M為蛋白質標準液；lane 1-6為PCV2-ORF2的純化蛋白（以2X連續稀釋之純化蛋白）；lane 7-9為PCV2-ORF2蛋白；而目標蛋白（含報導基因），經計算後的分子量，應為78 kDa。

實施例四：本發明之PCV2疫苗測試動物實驗。

使用本發明之PCV2疫苗（50 ug/dose）進行免疫測試。免疫小豬為6週齡，共5頭。

採用肌肉注射，免疫前第 0 天（免疫前）即進行第一次抽 血，而後第 7、14、28、42、56 天各再進行一次抽血，抽血次數總共 6 次。觀查小豬是抗體產生情況。

實施例五：ELISA 分析小豬血清抗體含量。

（1）利用 PCV2純化蛋白加入coating buffer（塗覆液），配成蛋白濃度為 20 μg/ml 的溶液。

（2）將上述溶液分別塗覆在 96 孔盤上 4 ℃ 一整夜；且各溶液及blank皆重複塗覆於三個well（井），且各 50 μl/well。

（3）倒掉 coating buffer，以 200 μl PBST 清洗3 次，每次 5至10 分鐘。

（4）每格加 50 μl blocking buffer （封閉液）（PBST 中含 1 % BSA）室溫搖晃 30分鐘至 1小時。

（5）倒掉 blocking buffer，以 200 μl PBST清洗3 次，每次5至10 分鐘。

（6）利用 ELISA一級抗體稀釋液（PBST 中含 0.1 % BSA）分別配製各小豬血清之一級抗體（primary antibody；血清：稀釋液= 1:200），依小豬組別加入 100 μl 與之對應小豬之血清配成的一級抗體溶液（blank 加 PBST；各重複三次），並室溫搖晃 1至2小時。

（7）倒掉一級抗體，以 200 μl PBST 清洗3 次，每次5至10 分鐘。

（8）利用 ELISA 二級抗體稀釋液（PBST 中含 3 % BSA）配製二級抗體（second antibody = horse anti-pig IgG conjugated HRP；antibody：稀釋液 = 1:10000），每格加 100 μl 此二級抗體溶液（包括 blank），室溫搖晃 1 小時。

（9）倒掉二級抗體，以 200 μl PBST清洗3 次，每次5至10 分鐘。

（10）加入 50 μl TMB substrate （四甲基聯苯胺）（NEB；棕瓶）避光呈色 5 分鐘。

（11）加入 50 μl stop solution （反應停止液）（NEB；白瓶）中止呈色反應。

（12）透過ELISA reader 量測 A450吸光值。

（13）利用 excel 分析數據，且各樣品溶液重複三次之平均值需扣除 blank重複三次之平均值，並製成圖表。

使用6週齡小豬進行免疫試驗。施打免疫實驗開始前第 0 天（免疫前）第一次抽血，而後第 7、14、28、 42、56 天各再抽血一次，抽血次數總共 6 次，進行 ELISA 檢測小鼠血清抗體含量，ELISA檢測 PCV2純化蛋白抗原之專一性抗體；本實施例係以PCV2抗原蛋白作為疫苗施打材料，如第5圖所示者，以PCV2純化抗原，做ELISA分析，檢測本發明之PCV2疫苗，免疫誘導6週齡小豬，產生PCV2抗體；免疫後之小豬，其PCV2抗體，在第四週，達到高峰（血清稀釋200X）。

另外，如第6圖所示，本發明之PCV2疫苗，誘導小豬產生之PCV2抗體，可以被商業化PCV2 抗體檢測套組（antibody test kit） ELISA（BioChek, Netherland）所檢測。其PCV2抗體的高峰，出現在第6週（血清稀釋200X）。此結果證明，本發明之PCV2疫苗，可誘導小豬產生專一性的PCV2抗體。

綜上所述，本發明所揭露之技術手段確能有效解決習知等問題，並達致預期之目的與功效，且申請前未見諸於刊物、未曾公開使用且具長遠進步性，誠屬專利法所稱之發明無誤，爰依法提出申請，懇祈 鈞上惠予詳審並賜准發明專利，至感德馨。

惟以上所述者，僅為本發明之數種較佳實施例，當不能以此限定本發明實施之範圍，即大凡依本發明申請專利範圍及發明說明書內容所作之等效變化與修飾，皆應仍屬本發明專利涵蓋之範圍內。

無

第1圖係本發明Tri-system （PCV2-ORF2）之構建示意圖。 第2圖係本發明Tri-system （PCV2-ORF2）之重組載體經限制酶作用後的電泳分析圖。 第3圖係本發明Tri-system （PCV2-ORF2）表現蛋白的SDS-PAGE分析圖。 第4圖係本發明Tri-system （PCV2-ORF2）表現蛋白的Western blot分析圖。 第5圖係本發明次單位疫苗動物實驗，實驗室PCV2生產之抗原經ELISA分析後之結果分析圖。 第6圖係本發明次單位疫苗動物實驗，經商用檢測套組（BioChek, Netherland）ELISA分析後之結果分析圖。

＜110＞　凱亞生物科技股份有限公司 ＜120＞　第二型豬環狀病毒（PCV2）之次單位疫苗及其核苷酸序列 ＜160＞　1 ＜210＞　1 ＜211＞　699 ＜212＞　DNA ＜213＞　人工序列 ＜220＞　 ＜223＞　本發明所選取PCV2 ORF2之片段序列 ＜400＞　1 1 atgacctatc cgcgtcgtcg ctatcgtcgt cgccgccatc gtccgcgttc acatctgggc 60 61 caaattctgc gtcgccgtcc gtggctggtt catccgcgtc accgctaccg ttggcgccgc 120 121 aaaaacggta tttttaatac gcgcctgagt cgtacgttcg gctataccat caaacgtacc 180 181 accgtgaaga ccccgtcctg ggccgttgat atgatgcgtt ttaacatcaa tgacttcctg 240 241 ccgccgggcg gtggcagcaa cccacgctct gtcccgtttg aatattaccg cattcgtaaa 300 301 gtgaaggttg aattctggcc gtgcagcccg atcacccagg gtgaccgtgg tgttggcagc 360 361 agcgcggtga ttctggatga caactttgtc accaaagcga cggccctgac ctatgatccg 420 421 tacgtgaatt atagttcccg ccataccatc acgcaaccgt tttcatacca ctcgcgttat 480 481 ttcacgccga aaccggtgct ggatagcacc attgactatt ttcaaccgaa caataagcgc 540 541 aaccaactgt ggctgcgtct gcaaacggca ggcaatgtcg atcatgtggg tctgggcacc 600 601 gctttcgaaa actctattta cgaccaagaa tataatatcc gtgtgacgat gtatgtccaa 660 661 ttccgtgaat ttaatctgaa agacccgccg ctgaatccg 699

Claims (3)

1. 一種第二型豬環狀病毒（PCV2）之次單位疫苗，其包含組合編碼PCV2 ORF2（Open Reading Frame 2， 開放式讀取框）DNA片段。
2. 如申請專利範圍第1項所述之第二型豬環狀病毒之次單位疫苗，其中，該PCV2 ORF2係包含 SEQ ID NOS：1 之核苷酸序列。
3. 如申請專利範圍第1或2項所述之第二型豬環狀病毒之次單位疫苗，更包含一藥學上可接受之載體。