TW201805419A - 癌起始細胞及其用途 - Google Patents
癌起始細胞及其用途 Download PDFInfo
- Publication number
- TW201805419A TW201805419A TW105125166A TW105125166A TW201805419A TW 201805419 A TW201805419 A TW 201805419A TW 105125166 A TW105125166 A TW 105125166A TW 105125166 A TW105125166 A TW 105125166A TW 201805419 A TW201805419 A TW 201805419A
- Authority
- TW
- Taiwan
- Prior art keywords
- car
- oct
- cell
- cells
- cancer
- Prior art date
Links
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 title claims abstract description 192
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 title claims abstract description 97
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 title abstract description 34
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 400
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims abstract description 55
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 claims abstract description 11
- 101710126211 POU domain, class 5, transcription factor 1 Proteins 0.000 claims description 92
- 102100035423 POU domain, class 5, transcription factor 1 Human genes 0.000 claims description 76
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 51
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 claims description 41
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 26
- 108020002663 Aldehyde Dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 25
- 102000005369 Aldehyde Dehydrogenase Human genes 0.000 claims description 25
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 claims description 24
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 24
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 claims description 21
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 claims description 21
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 claims description 20
- 102100024616 Platelet endothelial cell adhesion molecule Human genes 0.000 claims description 17
- 101100481408 Danio rerio tie2 gene Proteins 0.000 claims description 15
- 101100481410 Mus musculus Tek gene Proteins 0.000 claims description 15
- 108010084938 adenovirus receptor Proteins 0.000 claims description 12
- 230000002491 angiogenic effect Effects 0.000 claims description 11
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 claims description 11
- 231100000588 tumorigenic Toxicity 0.000 claims description 11
- 230000000381 tumorigenic effect Effects 0.000 claims description 11
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 10
- 230000005747 tumor angiogenesis Effects 0.000 claims description 8
- 102100037241 Endoglin Human genes 0.000 claims description 7
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 7
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 claims description 7
- 230000005740 tumor formation Effects 0.000 claims description 6
- 102100029761 Cadherin-5 Human genes 0.000 claims description 5
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 claims description 5
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 claims description 5
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 claims description 5
- 108010066342 Virus Receptors Proteins 0.000 claims description 4
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000037361 pathway Effects 0.000 claims description 3
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 claims description 2
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 claims description 2
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 claims 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 claims 1
- 102100025278 Coxsackievirus and adenovirus receptor Human genes 0.000 abstract description 270
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 abstract description 17
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 abstract description 17
- 101710176411 Coxsackievirus and adenovirus receptor Proteins 0.000 abstract description 10
- 238000012216 screening Methods 0.000 abstract description 9
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 36
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 28
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 26
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 25
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 25
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 25
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 24
- 210000003711 chorioallantoic membrane Anatomy 0.000 description 23
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 23
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 22
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 20
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 17
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 17
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 17
- SINQIEAULQKUPD-UHFFFAOYSA-N 4-[4-(6-methoxy-2-naphthalenyl)-2-(4-methylsulfinylphenyl)-1H-imidazol-5-yl]pyridine Chemical compound C1=CC2=CC(OC)=CC=C2C=C1C=1N=C(C=2C=CC(=CC=2)S(C)=O)NC=1C1=CC=NC=C1 SINQIEAULQKUPD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 16
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 15
- 210000002383 alveolar type I cell Anatomy 0.000 description 14
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 13
- 229940000406 drug candidate Drugs 0.000 description 13
- 238000000034 method Methods 0.000 description 13
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 13
- 108010017842 Telomerase Proteins 0.000 description 11
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 11
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 11
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 10
- 108010073929 Vascular Endothelial Growth Factor A Proteins 0.000 description 10
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 10
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 10
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 9
- 229930012538 Paclitaxel Natural products 0.000 description 9
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 9
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 9
- 229960001592 paclitaxel Drugs 0.000 description 9
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 9
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 9
- RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N taxol Chemical compound O([C@@H]1[C@@]2(C[C@@H](C(C)=C(C2(C)C)[C@H](C([C@]2(C)[C@@H](O)C[C@H]3OC[C@]3([C@H]21)OC(C)=O)=O)OC(=O)C)OC(=O)[C@H](O)[C@@H](NC(=O)C=1C=CC=CC=1)C=1C=CC=CC=1)O)C(=O)C1=CC=CC=C1 RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N 0.000 description 9
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 9
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 8
- DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L cisplatin Chemical compound N[Pt](N)(Cl)Cl DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 8
- 229960004316 cisplatin Drugs 0.000 description 8
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 8
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 8
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 8
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 8
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 8
- 102000009088 Angiopoietin-1 Human genes 0.000 description 7
- 108010048154 Angiopoietin-1 Proteins 0.000 description 7
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 7
- 238000011579 SCID mouse model Methods 0.000 description 7
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 7
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 7
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 7
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 7
- 208000010507 Adenocarcinoma of Lung Diseases 0.000 description 6
- 102000009075 Angiopoietin-2 Human genes 0.000 description 6
- 108010048036 Angiopoietin-2 Proteins 0.000 description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 6
- 102000003974 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 6
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 6
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 6
- 108010053099 Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-2 Proteins 0.000 description 6
- 102100039037 Vascular endothelial growth factor A Human genes 0.000 description 6
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 6
- BQRGNLJZBFXNCZ-UHFFFAOYSA-N calcein am Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(CN(CC(=O)OCOC(C)=O)CC(=O)OCOC(C)=O)=C(OC(C)=O)C=C1OC1=C2C=C(CN(CC(=O)OCOC(C)=O)CC(=O)OCOC(=O)C)C(OC(C)=O)=C1 BQRGNLJZBFXNCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 6
- 230000006870 function Effects 0.000 description 6
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 6
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 6
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 6
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 6
- 201000005249 lung adenocarcinoma Diseases 0.000 description 6
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 6
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 6
- 210000004043 pneumocyte Anatomy 0.000 description 6
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 6
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 6
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 5
- 102100033177 Vascular endothelial growth factor receptor 2 Human genes 0.000 description 5
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 5
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 5
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 5
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 5
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 5
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 5
- 229940027941 immunoglobulin g Drugs 0.000 description 5
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 5
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- IKHGUXGNUITLKF-UHFFFAOYSA-N Acetaldehyde Chemical compound CC=O IKHGUXGNUITLKF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101100257359 Caenorhabditis elegans sox-2 gene Proteins 0.000 description 4
- 108090000397 Caspase 3 Proteins 0.000 description 4
- 102100029855 Caspase-3 Human genes 0.000 description 4
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 4
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 4
- 102100033067 Growth factor receptor-bound protein 2 Human genes 0.000 description 4
- 108091009389 Growth factor receptor-bound protein 2 Proteins 0.000 description 4
- 101100257363 Mus musculus Sox2 gene Proteins 0.000 description 4
- 206010043276 Teratoma Diseases 0.000 description 4
- 108010000134 Vascular Cell Adhesion Molecule-1 Proteins 0.000 description 4
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 4
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 4
- 102100023543 Vascular cell adhesion protein 1 Human genes 0.000 description 4
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 4
- 108010081577 aldehyde dehydrogenase (NAD(P)+) Proteins 0.000 description 4
- 108010004469 allophycocyanin Proteins 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 239000002870 angiogenesis inducing agent Substances 0.000 description 4
- 230000000711 cancerogenic effect Effects 0.000 description 4
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 4
- 231100000315 carcinogenic Toxicity 0.000 description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 4
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 4
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 4
- 238000011532 immunohistochemical staining Methods 0.000 description 4
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 4
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 4
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 230000024121 nodulation Effects 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- 230000001023 pro-angiogenic effect Effects 0.000 description 4
- 239000000700 radioactive tracer Substances 0.000 description 4
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 4
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 4
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 4
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000004392 Aquaporin 5 Human genes 0.000 description 3
- 108090000976 Aquaporin 5 Proteins 0.000 description 3
- 102100021663 Baculoviral IAP repeat-containing protein 5 Human genes 0.000 description 3
- 102000004039 Caspase-9 Human genes 0.000 description 3
- 108090000566 Caspase-9 Proteins 0.000 description 3
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 3
- 238000010824 Kaplan-Meier survival analysis Methods 0.000 description 3
- 102000005711 Keratin-7 Human genes 0.000 description 3
- 108010070507 Keratin-7 Proteins 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N Oxalic acid Chemical compound OC(=O)C(O)=O MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010002687 Survivin Proteins 0.000 description 3
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 3
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 3
- 230000005757 colony formation Effects 0.000 description 3
- 238000010293 colony formation assay Methods 0.000 description 3
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 3
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 3
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 208000037841 lung tumor Diseases 0.000 description 3
- 239000007758 minimum essential medium Substances 0.000 description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- 210000002706 plastid Anatomy 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 3
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 3
- 208000011581 secondary neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 208000002491 severe combined immunodeficiency Diseases 0.000 description 3
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 3
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 230000002485 urinary effect Effects 0.000 description 3
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- 102000009840 Angiopoietins Human genes 0.000 description 2
- 108010009906 Angiopoietins Proteins 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000006311 Cyclin D1 Human genes 0.000 description 2
- 108010058546 Cyclin D1 Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 241000283074 Equus asinus Species 0.000 description 2
- 102000007665 Extracellular Signal-Regulated MAP Kinases Human genes 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 2
- 108010020382 Hepatocyte Nuclear Factor 1-alpha Proteins 0.000 description 2
- 102100022057 Hepatocyte nuclear factor 1-alpha Human genes 0.000 description 2
- 229920000209 Hexadimethrine bromide Polymers 0.000 description 2
- 101000595923 Homo sapiens Placenta growth factor Proteins 0.000 description 2
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 2
- 208000029462 Immunodeficiency disease Diseases 0.000 description 2
- 102000011782 Keratins Human genes 0.000 description 2
- 108010076876 Keratins Proteins 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 102100038895 Myc proto-oncogene protein Human genes 0.000 description 2
- 101710135898 Myc proto-oncogene protein Proteins 0.000 description 2
- NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N Mytomycin Chemical compound C1N2C(C(C(C)=C(N)C3=O)=O)=C3[C@@H](COC(N)=O)[C@@]2(OC)[C@@H]2[C@H]1N2 NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N 0.000 description 2
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000135194 Pione Species 0.000 description 2
- 102100035194 Placenta growth factor Human genes 0.000 description 2
- 241000315672 SARS coronavirus Species 0.000 description 2
- BUGBHKTXTAQXES-UHFFFAOYSA-N Selenium Chemical compound [Se] BUGBHKTXTAQXES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 2
- 101710150448 Transcriptional regulator Myc Proteins 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 101150063416 add gene Proteins 0.000 description 2
- 208000009956 adenocarcinoma Diseases 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 2
- 210000002469 basement membrane Anatomy 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 239000003560 cancer drug Substances 0.000 description 2
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 2
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 2
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 2
- 238000007490 hematoxylin and eosin (H&E) staining Methods 0.000 description 2
- 230000007813 immunodeficiency Effects 0.000 description 2
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 2
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 2
- 238000005462 in vivo assay Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000005265 lung cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 2
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 125000001446 muramyl group Chemical group N[C@@H](C=O)[C@@H](O[C@@H](C(=O)*)C)[C@H](O)[C@H](O)CO 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 108010017843 platelet-derived growth factor A Proteins 0.000 description 2
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 229910052711 selenium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011669 selenium Substances 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 2
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 2
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 2
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 2
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 2
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 2
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 2
- 238000011179 visual inspection Methods 0.000 description 2
- PRDFBSVERLRRMY-UHFFFAOYSA-N 2'-(4-ethoxyphenyl)-5-(4-methylpiperazin-1-yl)-2,5'-bibenzimidazole Chemical compound C1=CC(OCC)=CC=C1C1=NC2=CC=C(C=3NC4=CC(=CC=C4N=3)N3CCN(C)CC3)C=C2N1 PRDFBSVERLRRMY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FLCWJWNCSHIREG-UHFFFAOYSA-N 2-(diethylamino)benzaldehyde Chemical compound CCN(CC)C1=CC=CC=C1C=O FLCWJWNCSHIREG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]propane-1-sulfonate Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)NCCC[N+](C)(C)CCCS([O-])(=O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 0.000 description 1
- UYIWPVOKZZKUMC-UHFFFAOYSA-N 4-(3,4-diaminophenyl)benzene-1,2-diamine Chemical compound C1=C(N)C(N)=CC=C1C1=CC=C(N)C(N)=C1.C1=C(N)C(N)=CC=C1C1=CC=C(N)C(N)=C1 UYIWPVOKZZKUMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 108091006146 Channels Proteins 0.000 description 1
- 102000012422 Collagen Type I Human genes 0.000 description 1
- 108010022452 Collagen Type I Proteins 0.000 description 1
- 241000709687 Coxsackievirus Species 0.000 description 1
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 1
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 1
- 108010066486 EGF Family of Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018386 EGF Family of Proteins Human genes 0.000 description 1
- 102100022086 GRB2-related adapter protein 2 Human genes 0.000 description 1
- 101710113436 GTPase KRas Proteins 0.000 description 1
- 101000900690 Homo sapiens GRB2-related adapter protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 206010064912 Malignant transformation Diseases 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 101000900711 Mus musculus GRB2-related adaptor protein 2 Proteins 0.000 description 1
- -1 NAPSA Proteins 0.000 description 1
- 206010061309 Neoplasm progression Diseases 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 102000002584 Octamer Transcription Factor-3 Human genes 0.000 description 1
- 108010068425 Octamer Transcription Factor-3 Proteins 0.000 description 1
- 102000043276 Oncogene Human genes 0.000 description 1
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000032236 Predisposition to disease Diseases 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 101710132582 Protein D1 Proteins 0.000 description 1
- 239000012083 RIPA buffer Substances 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- 108010057966 Thyroid Nuclear Factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 102000002658 Thyroid Nuclear Factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 1
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000009484 Vascular Endothelial Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010034265 Vascular Endothelial Growth Factor Receptors Proteins 0.000 description 1
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 210000004504 adult stem cell Anatomy 0.000 description 1
- OENHQHLEOONYIE-UKMVMLAPSA-N all-trans beta-carotene Natural products CC=1CCCC(C)(C)C=1/C=C/C(/C)=C/C=C/C(/C)=C/C=C/C=C(C)C=CC=C(C)C=CC1=C(C)CCCC1(C)C OENHQHLEOONYIE-UKMVMLAPSA-N 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000011122 anti-angiogenic therapy Methods 0.000 description 1
- 230000002424 anti-apoptotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 239000012131 assay buffer Substances 0.000 description 1
- 238000011888 autopsy Methods 0.000 description 1
- TUPZEYHYWIEDIH-WAIFQNFQSA-N beta-carotene Natural products CC(=C/C=C/C=C(C)/C=C/C=C(C)/C=C/C1=C(C)CCCC1(C)C)C=CC=C(/C)C=CC2=CCCCC2(C)C TUPZEYHYWIEDIH-WAIFQNFQSA-N 0.000 description 1
- 235000013734 beta-carotene Nutrition 0.000 description 1
- 239000011648 beta-carotene Substances 0.000 description 1
- 229960002747 betacarotene Drugs 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 230000005773 cancer-related death Effects 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000005056 cell body Anatomy 0.000 description 1
- 230000006369 cell cycle progression Effects 0.000 description 1
- 230000004709 cell invasion Effects 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 239000002771 cell marker Substances 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000002458 cell surface marker Substances 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005660 chlorination reaction Methods 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- 210000001728 clone cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000004624 confocal microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 1
- 230000009849 deactivation Effects 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000003412 degenerative effect Effects 0.000 description 1
- 238000006356 dehydrogenation reaction Methods 0.000 description 1
- 150000004985 diamines Chemical class 0.000 description 1
- 125000003963 dichloro group Chemical group Cl* 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 1
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 1
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 1
- 238000001378 electrochemiluminescence detection Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol bis(2-aminoethyl)tetraacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCOCCOCCN(CC(O)=O)CC(O)=O DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000036433 growing body Effects 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 238000010562 histological examination Methods 0.000 description 1
- 238000007489 histopathology method Methods 0.000 description 1
- 206010020718 hyperplasia Diseases 0.000 description 1
- 238000002991 immunohistochemical analysis Methods 0.000 description 1
- 238000012309 immunohistochemistry technique Methods 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 210000004692 intercellular junction Anatomy 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940043355 kinase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000036212 malign transformation Effects 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 238000003358 metastasis assay Methods 0.000 description 1
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 1
- 229960004857 mitomycin Drugs 0.000 description 1
- 230000011278 mitosis Effects 0.000 description 1
- 230000000394 mitotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 208000002154 non-small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 230000006508 oncogene activation Effects 0.000 description 1
- 238000000399 optical microscopy Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 235000006408 oxalic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 239000003757 phosphotransferase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 1
- CLSUSRZJUQMOHH-UHFFFAOYSA-L platinum dichloride Chemical compound Cl[Pt]Cl CLSUSRZJUQMOHH-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005381 potential energy Methods 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000012342 propidium iodide staining Methods 0.000 description 1
- 238000002331 protein detection Methods 0.000 description 1
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000011127 radiochemotherapy Methods 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 102200006539 rs121913529 Human genes 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 230000037380 skin damage Effects 0.000 description 1
- JUJBNYBVVQSIOU-UHFFFAOYSA-M sodium;4-[2-(4-iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)tetrazol-2-ium-5-yl]benzene-1,3-disulfonate Chemical compound [Na+].C1=CC([N+](=O)[O-])=CC=C1N1[N+](C=2C=CC(I)=CC=2)=NC(C=2C(=CC(=CC=2)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)=N1 JUJBNYBVVQSIOU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 230000005748 tumor development Effects 0.000 description 1
- 230000005751 tumor progression Effects 0.000 description 1
- 208000029729 tumor suppressor gene on chromosome 11 Diseases 0.000 description 1
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 1
- 230000007998 vessel formation Effects 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- OENHQHLEOONYIE-JLTXGRSLSA-N β-Carotene Chemical compound CC=1CCCC(C)(C)C=1\C=C\C(\C)=C\C=C\C(\C)=C\C=C\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C OENHQHLEOONYIE-JLTXGRSLSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本發明係關於一種癌起始細胞，其包含過量表現Oct-4之分離的克沙奇病毒及腺病毒受體陽性之老鼠肺部幹細胞/先驅細胞。本發明亦關於一種具有腫瘤的老鼠用於抗癌藥物篩選的用途，其中該腫瘤係由癌起始細胞所誘導，其中該癌起始細胞包含過量表現Oct-4之分離的克沙奇病毒及腺病毒受體陽性之老鼠肺部幹細胞/先驅細胞。
Description
本發明係關於一種癌起始細胞，其包含過量表現Oct-4之分離的克沙奇病毒及腺病毒受體陽性之老鼠肺部幹細胞/先驅細胞與其用途。
肺癌是全世界癌症相關死亡的主因之一，且五年整體存活率依然小於14%。越來越多的證據顯示癌幹細胞(cancer stem cell)，亦稱為癌起始細胞(cancer initiating cells；CICs)在腫瘤生長與傳統化療抗性中扮演關鍵的角色，且可能導致癌症轉移及復發。癌幹細胞：引述，希望與挑戰。
癌起始細胞(CICs)可利用不同的體外測定法和細胞標記物鑑定，如側群細胞分析(side population analysis)、球體形成試驗(sphere forming assay)、化療抗性、乙醛脫氫酶(aldehyde dehydrogenase；ALDH)活性及細胞標記CD133。然而，單獨使用以上的體外測定法並無法證實所檢測細胞確實為癌起始細胞。因此，特定的體內測定法，如動物模型之限制性稀釋移植實驗(limiting dilution transplantation experiment)，被用來確認體外測定的結果。不幸地，在不同的癌症種類中，癌起始細胞(CICs)的鑑定結果常有衝突。癌起始細胞(CICs)鑑定的不一致性可能起因於所
研究之細胞源自不同的癌細胞株或成熟腫瘤，臨床腫瘤樣本的表型或功能上的異質性可能加重癌起始細胞(CICs)鑑定上的困難。
現今已有不同的假說提出對於癌起始細胞(CICs)形成的解釋，例如成人幹細胞/先驅細胞(stem/progenitor cell)的突變或分化細胞獲得類似幹細胞的特性；然而，細胞來源與有關癌起始細胞(CICs)發展的過程仍然不明。在K-ras G12D 突變的老鼠模型中，位於支氣管肺泡交界(bronchioalveolar duct junction)的幹細胞被檢測為經Cre/lox調控之活化後之腺癌的潛在起源。另一個研究證明受IGF-IR信號介導的Oct-4可與β-胡蘿蔔素及Sox-2形成一複合物，其在肺腺癌中對於癌起始細胞(CICs)之自我更新與致癌潛能扮演重要的角色。另外，在肺腺癌細胞株A549同時表現Oct-4與Nanog可控制上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transdifferentiation)、調控腫瘤起始能力及促進轉移作用。此外，表現高量Oct-4的非小細胞肺癌病人與癌症轉移及較低的存活率相關。雖然這些研究證實某些多能基因(pluripotent genes)，如Oct-4、Sox-2及Nanog，與腫瘤起始特性密切相關，但異常多能基因的表現與癌起始細胞(CICs)生成之間的關聯仍不明，有待進一步釐清。
本發明涉及一種癌起始細胞(CICs)，其包含過量表現Oct-4之分離的克沙奇病毒及腺病毒受體陽性之老鼠肺部幹細胞/先驅細胞(coxsackievirus and adenovirus receptor positive mouse pulmonary stem/progenitor cells；CAR+/mPSCs)(CAR+/mPSCOct-4_hi)；本發明物亦涉及
一種具有腫瘤的老鼠用於抗癌藥物篩選的方法，其中該腫瘤係由癌起始細胞(CIC)誘導，其中該癌起始細胞包含過量表現Oct-4之分離的克沙奇病毒及腺病毒受體陽性之老鼠肺部幹細胞/先驅細胞(CAR+/mPSCOct-4_hi)。
固態腫瘤(Solid tumors)被認為起因於含有幹細胞族群之器官，這些器官的腫瘤包括癌細胞之異質族群，其增生與形成新腫瘤的能力顯著不同；已報導指出此腫瘤形成能力之差別，例如乳癌細胞及中樞神經系統之腫瘤。儘管大部分癌細胞的分裂能力有限，近期研究指出一群名為癌幹細胞(cancer stem cells)或癌起始細胞(cancer initiating cells；CICs)的癌細胞群具有廣泛的自我更新及形成新腫瘤之能力；越來越多的證據表明調節正常幹細胞自我更新的途徑於癌幹細胞中不受控制或被改變，導致自我更新之癌細胞不斷擴張且形成腫瘤。
本發明中，癌起始細胞(CICs)在動物模型中生產，以深入了解癌起始細胞(CICs)之性質與特性，這些發現可以幫助癌症研究以提供肺癌早期診斷與治療之洞悉。在以往的研究中，老鼠肺部幹細胞/先驅細胞(mouse pulmonary stem/progenitor cells；mPSCs)係以無血清之初步篩選培養，隨後利用培養中的克沙奇病毒及腺病毒受體(coxsackievirus and adenovirus receptor；CAR)作為陽性篩選標記利用流式細胞儀進行分離。此克沙奇病毒及腺病毒受體陽性之老鼠肺部幹細胞/先驅細胞(coxsackievirus and adenovirus receptor positive mouse pulmonary stem/progenitor cells；CAR+/mPSCs)展現幹細胞/先驅細胞之特性，能夠分化為第一型肺胞壁細胞(type-I pneumocytes)且具有血管增生潛能。本發
明可識別呈Oct-4陽性之肺部幹細胞/先驅細胞，且於體外證實其對SARS冠狀病毒(SARS-CoV)之感受性。肺部幹細胞/先驅細胞分化為肺胞壁細胞(alveolar pneumocytes)，而血管新生係於三維明膠-微泡支架(3D gelatin--microbubble scaffold)中誘導。本發明證實CAR+/mPSCs可透過Oct-4的過量表現而轉化，並發展為典型的癌起始細胞(CICs)表型，由CAR+/mPSCs衍生之第一型肺胞壁細胞(type-I pneumocytes)亦經測試。在本文所述的實驗中，轉化細胞之特性係由體外測定法測定，包含細胞週期與端粒酶(telomerase)活性分析、球體形成試驗(sphere forming assay)、CD133表現測定、乙醛脫氫酶(aldehyde dehydrogenase；ALDH)活性及化療抗性試驗。另外，體內測定法包括重症聯合免疫缺陷小鼠(Severe Combined Immunodeficiency Mice；SCID mice)之限制性稀釋移植(limiting dilution transplantation)及腫瘤轉移試驗，用於進一步研究轉化細胞之特性。因誘導血管新生能力乃癌起始細胞(CICs)之另一特性，內皮管道形成試驗(endothelial tube formation)及雞胚胎尿絨毛膜(chicken chorioallantoic membrane；CAM)試驗係用於評估轉化細胞之血管新生潛能。
在本發明中，證實於CAR+/mPSCs中過量表現多能轉錄因子Oct-4可生成轉化細胞，其稱為CAR+/mPSCsOct-4_hi。這些轉化細胞具有癌症/腫瘤之起始能力、化療抗性並顯著表現某些促血管新生因子，包括血管生成素(angiopoietins；ANGs)和血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor；VEGF)，以及增強的血管生成潛能。此外，CAR+/mPSCsOct-4_hi表現內皮細胞標誌，包括CD31、CD105、CD34及CD144。此外，
CAR+/mPSCsOct-4_hi主動參與腫瘤血管形成、活化ANGs/Tie2訊息途徑；這些發現提供癌起始細胞(CICs)可能起源與生成之新穎見解，並有助於闡明藉由癌起始細胞(CICs)所負責介導之血管形成之途徑、提供肺癌之抗血管生成治療的新策略。
本文中所使用之「一」可指一個或多個，本文之申請專利範圍中與「包含」字詞之連接使用時，「一」可指一個或一個以上。
因此，本發明提供一種癌起始細胞(CIC)，其包含過量表現Oct-4之分離的克沙奇病毒及腺病毒受體陽性之老鼠肺部幹細胞/先驅細胞(coxsackievirus and adenovirus receptor positive mouse pulmonary stem/progenitor cell；CAR+/mPSC)(CAR+/mPSCOct-4_hi)。
本說明書與申請專利範圍中，所使用的術語「癌起始細胞(cancer initiating cell；CIC)」可互換，並指稱為一種固體癌幹細胞(solid cancer stem cell)。癌起始細胞之定義與功能表徵為腫瘤之一小群細胞，其可在體外之適當條件下無限增長(有自我更新能力)，且僅使用少量細胞(<102個細胞)即能於活體內形成腫瘤。其他常見辨識癌起始細胞(CIC)特性的方法涉及形態學、細胞表面標記之檢查、轉錄圖譜(transcriptional profile)及藥物反應。
過量表現Oct-4之CAR+/mPSC代表在CAR+/mPSC中的Oct-4表現量高於正常細胞10倍。在一較佳具體實施例中，CAR+/mPSC中的Oct-4表現量高於正常細胞16倍，在一更佳實施例中，CAR+/mPSC中的Oct-4表現量高於正常細胞20倍。本文之「正常細胞」乃指正常
CAR+/mPSC。該表現量是指一DNA、RNA或蛋白質的表現量。在一較佳具體實施例中，該表現量係指蛋白質的表現量。該蛋白質係由Oct-4的基因編碼而得。在一更佳具體實施例中，Oct-4基因之序列由SEQ ID NO：1組成。另一具體實施例中，Oct-4基因為Oct-4的cDNA。
在另一具體實施例中，該CAR+/mPSC包含一載體，其中該載體包含一種能編碼Oct-4基因的核酸序列。在一較佳具體實施例中，該Oct-4基因之序列為SEQ ID NO：1。
在一具體實施例中，該CAR+/mPSCOct-4_hi展現軟瓊脂細胞群落形成(softagar colony formation)、球體形成(sphere formation)及不朽特性。
在另一具體實施例中，該CAR+/mPSCOct-4_hi具有癌細胞功能，其中該癌細胞功能包含細胞增生、細胞轉移、細胞侵襲或其組合。
在一具體實施例中，該CAR+/mPSCOct-4_hi具有腫瘤起始能力(tumor initiating capacity)。在一較佳具體實施例中，該CAR+/mPSCOct-4_hi具有致瘤能力(tumorigenic capacity)，其中該致瘤能力包含腫瘤形成、腫瘤再生、轉移能力或其組合。本發明之CAR+/mPSCOct-4_hi於某些實施例可無限生長，且於體外可從<103個細胞生成腫瘤。在一較佳具體實施例中，該CAR+/mPSCOct-4_hi無限生長，且於體外從<102個細胞生成腫瘤。
針對肺部癌起始細胞，已有不同的生物標識被提出，包含CD133的表現、乙醛脫氫酶(aldehyde dehydrogenase；ALDH)活性及化療
抗性。在一具體實施例中，CAR+/mPSCOct-4_hi表現CD133、乙醛脫氫酶(aldehyde dehydrogenase；ALDH)活性、化療抗性及其組合。該化療抗性(chemoresistance)意指CAR+/mPSCOct-4_hi對於化學放射治療或化療藥具有抗性。因此，該癌起始細胞為一肺癌起始細胞。在一具體實施例中，該CAR+/mPSCOct-4_hi為一肺癌起始細胞。
在一具體實施例中，該CAR+/mPSCOct-4_hi具有血管新生(angiogenesis)的功能。在一較佳具體實施例中，該CAR+/mPSCOct-4_hi具有參與血管形成的功能。因此，該CAR+/mPSCOct-4_hi不僅具有血管新生潛能，亦參與腫瘤血管形成。在另一具體實施例中，該CAR+/mPSCOct-t_hi具有活化ANG/Tie2訊息途徑而加強血管新生的功能。在一較佳實施例中，CAR+/mPSCOct-4_hi擁有活化Tie2訊息途徑而加強血管新生的功能。
在另一具體實施例中，該CAR+/mPSCOct-4_hi表現內皮細胞之表面標記，其中該內皮細胞之表面標記包含CD31、CD105、CD34、CD144或其組合。
此發明亦提供一種具有腫瘤的老鼠用於篩選抗癌藥物之用途，其中所述之腫瘤係由癌起始細胞(CIC)誘導，其中該癌起始細胞(CIC)包含過量表現Oct-4之分離的克沙奇病毒及腺病毒受體陽性之老鼠肺部幹細胞/先驅細胞(coxsackievirus and adenovirus receptor positive mouse pulmonary stem/progenitor cell；CAR+/mPSC)(CAR+/mPSCOct-4_hi)。
在一具體實施例中，該動物為一老鼠。
此處「分離(isolated)」之詞是指材料，其本質上或實質上不包含天然狀態中所發現之伴隨成分。
「抗癌藥物(Anti-cancer drug)」是指包含具有抗腫瘤活性之活性成分的組合物，「抗腫瘤活性」係指一抑制腫瘤生長的效果，一腫瘤細胞毒性及/或腫瘤退化效果。
過量表現Oct-4之CAR+/mPSC代表在CAR+/mPSC中Oct-4表現量高於正常細胞10倍。在一較佳具體實施例中，Oct-4於CAR+/mPSC之表現量高於正常細胞16倍。在一更佳具體實施例中，Oct-4於CAR+/mPSC之表現量高於正常細胞20倍。本文之「正常細胞」為正常CAR+/mPSC。該表現量係指一DNA、RNA或蛋白質的表現量。在一較佳具體實施例中，該表現量係指蛋白質的表現量，該蛋白質是由一Oct-4的基因編碼而得。在一更佳具體實施例中，Oct-4基因之序列為SEQ ID NO：1。
在另一實施例中，該CAR+/mPSC包含一載體，其中該載體包含一種編碼Oct-4基因之核酸序列。在一較佳具體實施例中，該Oct-4基因序列為SEQ ID NO：1。
在一具體實施例中，該癌起始細胞為一肺癌起始細胞。在一較佳具體實施例中，該腫瘤為一肺部腫瘤。在另一具體實施例中，該抗癌藥物為一治療癌起始細胞之藥物。在一較佳具體實施例中，該抗癌藥物為一抗肺癌藥物。在一更佳具體實施例中，該抗癌藥物為一治療肺癌起始細胞之藥物。
本文之「抗癌(anti-cancer)」一詞包含治療及抑制癌症。此外，「抗癌」包含治療和/或抑制癌起始細胞。本文之「治療」一詞包含治癒、痊癒、減緩、減輕、改變、補救、改善、改進或影響疾病、疾病之症狀或患病傾向。治療及/或抑制癌起始細胞可以改善、預防、消除或減低個體的癌起始細胞的數量，或消除個體中的癌起始細胞等。
在一具體實施例中，該個體為一動物；較佳地，該個體為一哺乳動物；更佳地，該個體為人類。
本發明物進一步提供一種用於篩選抗癌藥物的方法，其包含：(a)植入癌起始細胞於動物中，其中該癌起始細胞包含過量表現Oct-4之分離的克沙奇病毒及腺病毒受體陽性之老鼠肺部幹細胞/先驅細胞(CAR+/mPSCOct-4_hi)，其中所述之癌起始細胞發展並形成腫瘤；(b)施用候選藥物於動物中；和(c)評估候選藥物對含有癌起始細胞(CICs)的腫瘤上之影響。
在一具體實施例中，該抗癌藥物是一治療癌起始細胞之藥物，在一較佳具體實施例中，該抗癌藥物是一抗肺癌藥物，在一更佳實施例中，該抗癌藥物是一治療肺癌起始細胞的藥物。
在另一具體實施例中，該動物為一嚙齒動物，較佳為一大鼠或一小鼠。
過量表現Oct-4之CAR+/mpSCs代表在每個CAR+/mPSCs中Oct-4表現量高於正常細胞10倍。在一較佳具體實施例中，每個
CAR+/mPSC的Oct-4表現量高於正常細胞16倍。在一更佳具體實施例中，每個CAR+/mPSC的Oct-4表現量高於正常細胞20倍。在一較佳實施例中，該表現量是指一DNA、RNA或蛋白質的表現量，該蛋白質是由Oct-4的基因編碼而得。在一更佳具體實施例中，Oct-4基因之序列為SEQ ID NO：1，在另一具體實施例中，Oct-4基因為Oct-4的cDNA。
在另一具體實施例中，每個CAR+/mPSC包含一個載體，其中該載體包含能編碼Oct-4基因的核酸序列。在一較佳具體實施例中，該Oct-4基因的序列為SEQ ID NO：1。
「腫瘤」一詞是指良性及惡性腫瘤之各自階段。腫瘤進展的第一階段是相對正常出現的細胞量增加，是為增生階段。有數個增生階段其細胞逐漸累積並開始發展異常外觀，是為發育異常階段的出現。
本文所述之「候選藥物」代表任何分子，例如蛋白質或藥物，其本質上具有抑制腫瘤細胞生長之能力。
在一具體實施例中，該癌起始細胞為肺癌起始細胞。在一較佳具體實施例中，該腫瘤為一肺部腫瘤。對於後面的案例，初步評估候選藥物效果的方法為，例如，視覺評估腫瘤大小及嚴重性。此具有附加的優點，即腫瘤的目視檢查允許藥物療效之立即性及持續性的評估。在非可見腫瘤的情況下，藥物效果評估通常需要藉由犧牲動物來檢查腫瘤。腫瘤可根據技術人員的標準技術偵測，其方法包括，除了肉眼檢查外(用於皮膚損傷)，組織化學及免疫組織化學技術等。通常，候選藥物係根據其抑制移植細胞株所發展之腫瘤形成和/或生長能力進行評估。此發明更進一步包含
確定該候選藥物是否為抗癌藥，其乃根據步驟(c)之候選藥物效能評估結果。
此外，本發明提供一種篩選抗癌藥物的方法，其包含：(1)提供一腫瘤組織，其腫瘤組織包含癌起始細胞(cancer initiating cells；CICs)，其中該癌起始細胞(CICs)包含過量表現Oct-4之分離的克沙奇病毒及腺病毒受體陽性之老鼠肺部幹細胞/先驅細胞(CAR+/mPSCOct-4_hi)；(2)使候選藥物與該腫瘤組織接觸；以及(3)偵測候選藥物於腫瘤組織上的影響。
在一具體實施例中，該癌起始細胞(CICs)為一肺癌起始細胞。在一較佳具體實施例中，該腫瘤組織為一肺部腫瘤組織。在另一具體實施例中，該抗癌藥物為一種治療癌起始細胞(CICs)之藥物。在一較佳具體實施例中，該抗癌藥物為一種抗肺癌之藥物。在一更佳具體實施例中，該抗癌藥物為一種抗肺部癌起始細胞(CICs)之藥物。
過量表現Oct-4之CAR+/mPSC代表於CAR+/mPSC中Oct-4之表現量高於正常細胞10倍。在一較佳具體實施例中，於CAR+/mPSC中Oct-4之表現量高於正常細胞16倍。在一更佳實施例中，Oct-4於CAR+/mPSC之表現量高於正常細胞20倍。該表現量是指一種DNA、RNA或蛋白質的表現量。在一較佳具體實施例中，該表現量係指蛋白質的表現量，該蛋白質由Oct-4的基因編碼而得。在一更佳具體實施例中，該Oct-4基因之序列為SEQ ID NO：1。
在另一實施例中，每一CAR+/mPSC包含一個載體，其中該
載體包含編碼Oct-4基因之核酸序列。在一較佳具體實施例中，該Oct-4基因之序列為SEQ ID NO：1。
在一具體實施例中，偵測候選藥物於腫瘤組織的效果包含觀察癌起始細胞(CICs)隨著時間的變化、癌症發展過程或是其於腫瘤組織內之生物特性。本發明進一步包含一種確認候選藥物是否為抗癌藥物的步驟，其乃依據步驟(3)中測試化合物抑制效果的結果。
本發明亦包含一種篩選用於抗癌之候選藥物的方法，其包含：(i)收集含有癌起始細胞(CICs)之培養液，其中該癌起始細胞包含過量表現Oct-4之分離的克沙奇病毒及腺病毒受體陽性之老鼠肺部幹細胞/先驅細胞(CAR+/mPSCOct-4_hi)；(ii)由癌起始細胞(CICs)中萃取一種外泌蛋白(exosomal protein)；(iii)分析此外泌蛋白(exosomal protein)；及(iv)利用步驟(iii)之分析結果與藥物數據庫進行比較，以獲得候選藥物。
在一具體實施例中，該癌起始細胞(CICs)為一肺癌起始細胞。在一較佳具體實施例中，該用於抗癌之候選藥物為一治療癌起始細胞(CICs)之候選藥物。在一更佳具體實施例中，該用於抗癌之候選藥物為一治療肺癌起始細胞之候選藥物。在另一具體實施例中，該用於抗癌之候選藥物為一抗肺癌之候選藥物。
在另一實施例中，該藥物數據庫為一DrugBank。
在一具體實施例中，本發明進一步包含一步驟(iv)後的步驟，是為步驟(v)，其為測試候選藥物對於癌起始細胞(CICs)之細胞毒
性。若該候選藥物對於癌起始細胞(CICs)具顯著毒性，則該候選藥物是一種抗癌藥物或是治療癌起始細胞(CICs)之藥物。
另外，本發明提供一種製備癌起始細胞(CICs)族群的方法，其包含以下步驟：(1)提供一載體，其包含能編碼Oct-4互cDNA之核酸序列；(2)將該載體轉染至克沙奇病毒及腺病毒受體陽性之老鼠肺部幹細胞/先驅細胞族群(CAR+/mPSCs)上，其中該載體藉由增加該核酸序列之拷貝數量以使Oct-4 cDNA過量表現相對於野生型CAR+/mPSCs中正常存在之拷貝數量；以及(3)分離步驟(2)中過量表現Oct-4之CAR+/mPSCs族群(CAR+/mPSCOct-4_hi)。
在一具體實施例中，該Oct-4 cDNA之基因序列為SEQ ID NO：1。
在另一具體實施例中，該Oct-4 cDNA具有編碼Oct-4蛋白質的功能。
本文中使用之「載體」一詞係指一核酸分子，其具有可在宿主細胞分裂之核酸序列。該載體亦包含載體內允許核酸序列接合之核酸序列，該核酸序列亦在宿主細胞中複製。載體之代表包含質體(plasmids)、黏質體(cosmid)或病毒載體；較佳時，該載體為反轉錄病毒載體(retroviral vector)。
圖1顯示克沙奇病毒及腺病毒受體陽性之老鼠肺部幹細胞/
先驅細胞(CAR+/mPSCs)的培養、分離與分化。(A)為初代培養之上皮細胞群落中克沙奇病毒及腺病毒受體(coxsackievirus and adenovirus receptor positive；CAR)免疫螢光染色，(i)為在相位(phase)對比圖像中，以白色虛線表示上皮細胞群落，(ii)為免疫螢光圖像呈現CAR表現於上皮細胞群落之細胞連結(cell-cell junctions)上，(iii)為圖A-ii框內區的放大圖像(比例尺：100μm)。(B)為利用螢光流式細胞分選儀(FACS)鑑別與分離初代培養(primary culture)中之CAR陽性族群，其稱作CAR+/mPSCs。(C)為以聚合酶連鎖反應(PCR)與即時聚合酶連鎖反應(real-time PCR)分析CAR+/mPSCs的基因表現圖譜(Gene expression profiles)。評估CAR、Oct-4、Sox-2及Nanog之基因表現。「L」為老鼠肺部組織；「CAR+」為CAR+/mPSCs；「ES」為老鼠胚胎幹細胞株(E14)。實驗數據以平均值±標準差表示。(D)為CAR+/mPSCs的分化，CAR+/mPSCs在分離後7天分化為第一型肺胞壁細胞(type-I pneumocytes)。在第1天，放大圖像顯示框內的分離細胞。白色虛線指出分化細胞於第4天及第7天之相位對比圖像。CAR與第一型肺胞壁細胞(type-I pneumocytes)標記T1α與AQP5之表現以免疫螢光染色評估。CAR表現在第1天可被偵測，而框中的放大圖像顯示CAR表現於分離細胞之細胞連結之間。而CAR在第4天與第7天表現消失。T1α與AQP5之表現在第4天及第7天可被偵測。(比例尺：100μm)
圖2顯示Oct-4於CAR+/mPSCs中之過量表現，此為在CAR+/mPSCs中過量表現Oct-4的步驟。(i)為以初代培養之相位對比圖為代表，放大圖像顯示mPSCs的上皮細胞群落。(ii)為依據初代培養細胞
中CAR呈陽性表現者利用流式細胞儀分離出mPSCs，並隨即和具Oct-4 cDNA編碼的反轉錄病毒載體(retroviral vectors)轉染。(iii)為經轉染的CAR+/mPSCs與餵養細胞(feeder cell)於第2天共同培養，在第21天觀察到似鵝卵石的細胞群落，放大圖像顯示單一群落的形態。(iv)為第28天時似鵝卵石之個別群落的分離與放大。(v)為群落建立成細胞株，其包含C1、E9及C7。C1細胞株之形態圖為代表。(比例尺：100μm)
圖3顯示第一型肺胞壁細胞(type-I pneumocytes)中Oct-4之過量表現。在CAR+/mPSCs衍生之第一型肺胞壁細胞(type-I pneumocytes)中，Oct-4過量表現之過程的時間週期如圖所示。(i)為顯示上皮細胞群落之初代培養基之相位對比代表圖。(ii)為CAR+/mPSCs於第7天時分化為第一型肺胞壁細胞(type-I pneumocytes)。(iii)為第8天時，第一型肺胞壁細胞(type-I pneumocytes)以能編碼Oct-4 cDNA之反轉錄病毒載體(retroviral vectors)轉染。(iv)為經轉染之細胞於第10、21、35、42天加入餵養細胞補充(feerder cell supplement)時增殖。(比例尺：100μm)
圖4顯示CAR+/mPSCsOct-4_hi中的Oct-4之超高量表現。(i)為以西方墨點法(Western blot)分析CAR+/mPSCs及CAR+/mPSCsOct-4_hi之C1、E9及C7細胞株中的Oct-4表現量，「ES」表示老鼠胚胎幹細胞株(E14)。(ii)為Oct-4表現之定量，數據以平均值±標準差表示。** P<0.01：與CAR+/mPSCs相比。
圖5顯示CAR+/mPSCsOct-4_hi中CAR的表現量。(A)為利用流式細胞儀分析C1、E9與C7細胞株中的CAR陽性之族群。(B)為以
免疫螢光染色呈現在C1、E9與C7細胞株之細胞膜中的CAR表現量，在Alex488nm螢光下標記CAR，DAPI為細胞核之標記，插入之圖像為正方形區域內之放大圖。比例尺：100μm。
圖6顯示CAR+/mPSCsOct-4_hi之表型改變。(A)為改變之細胞週期分佈，其顯示C1細胞株與CAR+/mPSCs之細胞週期之代表圖。(B)為CAR+/mPSCsOct-4_hi之C1、E9、C7細胞株展現增生能力，其顯示CAR+/mPSCs及CAR+/mPSCsOct-4_hi之C1、E9、C7細胞株之生長曲線。(C)為CAR+/mPSCs與CAR+/mPSCsOct-4_hi細胞株之端粒酶(Telomerase)活性，評估C1、E9與C7細胞株在第12、20及50代之表現，CAR+代表CAR+/mPSCs細胞，H代表熱去活性。
圖7顯示CAR+/mPSCsOct-4_hi C1細胞株之致瘤能力。(A)為C1細胞株之腫瘤生成於重症聯合免疫缺陷小鼠(Severe Combined Immunodeficiency mice；SCID mice)中執行。1x106個細胞之C1細胞株(數量=6)或CAR+/mPSCs(數量=4)與基質膠(matrigel)混合後經皮下轉植到重症聯合免疫缺陷小鼠背部。腫瘤生長以卡尺(calipers gauge)監測。(i)為28天後，觀察到C1細胞株衍生腫瘤，箭頭為C1細胞株注射的位置，及箭號為CAR+/mPSCs注射的位置。腫瘤切除後做進一步檢查。(ii)為基於注射後逐日所收集之數據所計算之腫瘤生長曲線，個別腫瘤測量之數據以平均值±標準差表示。(B)為蘇木精-伊紅染色(H&E stain)之C1細胞株衍生腫瘤之代表圖。(i)顯示高核質比之細胞。(ii)為圖A-i框內之放大圖像。(iii)為具有高有絲分裂率之腫瘤細胞(以箭頭表示)。(iv)為圖A-iii
框內之放大圖像。(比例尺：100μm)
圖8顯示C1細胞株衍生腫瘤之免疫組織化學檢查，其表示C1細胞株衍生腫瘤之免疫組織化學圖之代表圖。(A)為Oct-4及CAR表現。(B)為致癌基因活化，包括磷酸化-Src(phospho-Src；p-Src)、磷酸化-β-胡蘿蔔素(phospho-β-catenin；p-β-catenin)、c-myc及細胞週期蛋白D1(cyclin D1)。(C)為人類腺癌之診斷標記之表現，包括TTF1、NAPSA、CK7及CK-HMW。插入之圖像為框內的放大圖像。(比例尺：100μm)
圖9顯示CAR+/mPSCsOct-4_hi之體外致瘤表型。(A)為軟瓊脂菌落形成分析(soft agar colony formation assay)。CAR+/mPSCs、CAR+/mPSCsOct-4_hi C1、E9、C7及A549細胞株以軟瓊脂培養(soft agar culture)，細胞群落在兩週後拍照及定量。(B)為球體形成分析(sphere formation assay)。CAR+/mPSCs、CAR+/mPSCsOct-4_hi C1、E9、C7及A549細胞株進行球體形成試驗，二級球體(secondary spheres)(>70μm)於10天後拍照及定量。(比例尺：100μm)
圖10顯示CAR+/mPSCsOct-4_hi C1細胞株之體內致瘤及轉移能力(A)為體內異體轉植(xenograft)腫瘤形成。(i)為腫瘤之生長曲線，不同濃度之C1細胞株(105、104、103及102個細胞)經皮下注射到重症聯合免疫缺陷小鼠體內，腫瘤直徑在注射後於指定時間以卡尺測量，數據以平均值±標準差呈現。(ii)為腫瘤於注射後第28天切除、拍照及測量(比例尺：1cm)。(B)為轉移性腫瘤結節形成，C1細胞株(3×105個細胞)於重症聯合免疫缺陷小鼠之尾部靜脈注射，以CAR+/mPSCs注射者作為控
制組，於五週後記錄肺中的轉移性腫瘤結節形成(以箭號指示)。以C1細胞株注射之小鼠經蘇木精-伊紅染色(H&E staining)後顯示廣泛出血及結節形成，C1細胞株之放大圖像顯示肺組織中的結節(比例尺：100μm)(C)以CAR+/mPSCs及C1細胞株注射之小鼠的積極限法(Kaplan-Meier)存活曲線(數量=10)。
圖11顯示CAR+/mPSCsOct-4_hi中推定的癌起始細胞(CICs)的特性。(A)為以流式細胞儀分析CAR+/mPSCs與CAR+/mPSCsOct-4_hi之C1、E9及C7細胞株中的CD133表現，以百分比顯示個別細胞株之CD133陽性族群。(B)為以流式細胞儀分析乙醛脫氫酶(aldehyde dehydrogenase；ALDH)之活性，CAR+/mPSCs與CAR+/mPSCsOct-4_hi C1、E9及C7細胞株之ALDEFLUOR試驗結果如所示，經DEAB處理之樣本為陰性對照組，百分比顯示個別細胞株之乙醛脫氫酶(ALDH)陽性族群。(C)為CAR+/mPSCsOct-4_hi之細胞存活率。CAR+/mPSCsOct-4_hi之C1、E9及C7細胞株與A549細胞以(i)二氯二胺鉑(cisplatin)(2.5、5、10、25、50及100μM)及(ii)太平洋紫杉醇(paclitaxel)(2.5、5、10、50、100及200nM)處理48小時，數據以平均值±標準差顯示。* P<0.05，** P<0.01：與A549比較。(D)CAR+/mPSCsOct-4_hi之抗細胞凋亡潛能。(i)為以西方墨點法分析CAR+/mPSCs與CAR+/mPSCsOct-4_hi之C1、E9及C7細胞株中生存素(survivin)的表現。(ii)為經10μM二氯二胺鉑(cisplatin)或10nM太平洋紫杉醇(paclitaxel)處理後之CAR+/mPSCs與CAR+/mPSCsOct-4_hi C1、E9及C7細胞株中裂解凋亡蛋白酶-3(Cleaved caspase-3；c caspase-3)及裂
解凋亡蛋白酶-9(cleaved caspase-9；c caspase-9)之表現量。
圖12顯示CAR+/mPSCsOct-4_hi之促血管新生因子(pro-angiogenic factors)的表現。(A)為以即時聚合酶連鎖反應(real-time PCR)分析CAR+/mPSCs與CAR+/mPSCsOct-4_hi C1、E9及C7細胞株之促血管新生因子之基因表現量，數據以平均值±標準差呈現。* P<0.05、** P<0.01：與CAR+/mPSCs比較。
圖13顯示CAR+/mPSCsOct-4_hi之血管新生潛能。(A)為CAR+/mPSCs與CAR+/mPSCsOct-4_hi之C1、E9及C7細胞株之雞胚胎尿絨毛膜(chick chorioallantoic membrane；CAM)試驗。(i)為細胞轉殖72小時後之顯微照片的代表圖，箭號標示血管的分支點。(ii)為依據分支點的數目計算決定血管新生潛能，單獨基質膠(Matrigel)的樣本用來作為背景值；血管內皮生成因子(vascular endothelial growth factor；VEGF)(10ng)則作為陽性對照組。數據以平均值±標準差表示。*P<0.05：與單獨基質膠(Matrigel)之組別比較；** P<0.01：與CAR+/mPSCs組別比較。(B)為CAR+/mPSCsOct-4_hi C1、E9、C7細胞株及A549衍生腫瘤經免疫組織化學染色法測得之CD31表現。(i)為各種腫瘤之代表圖(比例尺：100μm)。(ii)為利用類流式固態組織細胞儀(TissueGnostics)掃描及影像分析軟體(HistoQuest)定量分析腫瘤中的CD31表現，數據以平均值±標準差表示，** P<0.01：與A549腫瘤比較。
圖14顯示CAR+/mPSCsOct-4_hi C1細胞株與SVEC4-10共同培養之管柱形成(tube formation)。共軛焦顯微鏡圖像顯示SVEC4-10與C1
細胞株共同培養之管柱結構。SVEC4-10為老鼠內皮細胞株，以PKH26染色；C1細胞株球體(C1 clone sphere)或C1細胞株細胞(C1 clone cells)以鈣黃綠素-AM(Calcein-AM)標記。經過8小時共同培養後拍攝管柱構造。DAPI為細胞核標記。(A)為C1細胞株球體與SVEC4-10共同培養。(B)C1細胞株細胞與SVEC4-10共同培養。
圖15顯示CAR+/mPSCsOct-4_hi之管柱形成試驗(tube formation assay)。(i)為CAR+/mPSCsOct-4_hi C1、E9、C7細胞株在內皮細胞生長培養基(Endothelial cells growth medium；EGM)中培育7天後，偵測其管柱形成，而於內皮細胞生長培養基(Endothelial cells growth medium；EGM)培育之CAR+/mPSCs則沒有觀察到管柱形成，管柱網路(tube network)以鈣黃綠素-AM(Calcein-AM)染色，再利用螢光顯微鏡紀錄8小時。(ii)為管柱形成能力，其以定量管柱長度來決定，數據以平均值±標準差表示，** P<0.01：與CAR+/mPSCs比較。(比例尺：100μm)
圖16顯示以內皮細胞生長培養基(EGM)培養之CAR+/mPSCsOct-4_hi表現內皮細胞的表面標記，CAR+/mPSCsOct-4_hi C1、E9、C7細胞株於內皮細胞生長培養基(EGM)中培育7天，接著分析其內皮細胞專一性表面標記之表現，其包括CD31、CD105、CD34及CD144，數字表示陽性表現族群。
圖17顯示CAR+/mPSCsOct-4_hi之血管新生潛能。(A)為利用免疫螢光染色C1-GFP細胞株衍生腫瘤所測得之內皮細胞抗原表現結果。(i)為CD31之鑑定。(ii)為vWF之鑑定。(iii)為CD105之鑑定。
放大圖像顯示某些GFP陽性細胞參與血管形成(以箭號標示)，且一部分的GFP陽性細胞亦表現CD31(以星號標示)(比例尺：100μm)。(B)為以流式細胞儀分析C1-GFP細胞株之分離腫瘤的CD31表現，代表內皮細胞之CD31陽性子群占所有腫瘤族群之3%，在18%的CD31陽性內皮細胞子群中發現GFP表現。
圖18顯示以內皮細胞生長培養基(EGM)培養之CAR+/mPSCsOct-4_hi的ANGs/Tie2信號分析。(A)為即時聚合酶連鎖反應(real-time PCR)分析在內皮細胞生長培養基(Endothelial cells growth medium；EGM)培養之CAR+/mPSCsOct-4_hi C1、E9、C7與CAR+/mPSCs細胞株之血管新生相關受體的基因表現，其包括血管內皮生長因子受體2(vascular endothelial growth factor receptor 2；VEGFR2)及Tie2。數據以平均值±標準差表示，** P<0.01：與CAR+/mPSCs比較。(B)為以西方墨點法分析內皮細胞生長培養基(EGM)培養之CAR+/mPSCsOct-4_hi C1、E9、C7與CAR+/mPSCs細胞株的ANGs/Tie2之信號活化，包括Tie2、磷酸化-Tie2(phospho-Tie)、血管生成素1(angiopoietin 1；ANG1)、血管生成素2(angiopoietin 2；ANG2)、生長因子受體結合蛋白2(growth factor receptor bound protein 2；GRB2)、ERK與磷酸化-ERK(phospho-ERK)表現。
圖19顯示Tie2激酶抑制劑(Tie2 kinase inhibitor)降低CAR+/mPSCsOct-4_hi之血管新生。(A)為CAR+/mPSCsOct-4_hi C1細胞株於內皮細胞生長培養基(Endothelial cells growth medium；EGM)培養7天，接著執行管柱形成試驗(tube formation assay)，以相對節點(node)數目用來
驗證管柱形成。經2μM Tie2激酶抑制劑(Tie2 kinase inhibitor)處理後，於內皮細胞生長培養基(Endothelial cells growth medium；EGM)培養的C1細胞株之管柱形成能力下降。數據以平均值±標準差呈現。** P<0.01：與無Tie2激酶抑制劑(Tie2 kinase inhibitor)之組別比較。(B)為C1細胞株之雞胚胎尿絨毛膜(chick chorioallantoic membrane；CAM)試驗，以血管分支點(branch point)的數目用來驗證C1細胞株之血管誘導。Tie2激酶抑制劑(Tie2 kinase inhibitor)(2μM)可降低C1細胞株誘導之血管形成。數據以平均值±標準差呈現。* P<0.05：與無Tie2激酶抑制劑(Tie2 kinase inhibitor)之組別比較。(C)為體內異體移植(xenograft)腫瘤生成試驗，C1細胞株之腫瘤生長經Tie2激酶抑制劑(Tie2 kinase inhibitor)處理後被抑制，50mg/公斤體重之Tie2由第7天至第25天內每兩天自腹腔注射一次，腫瘤體積於第10至25天紀錄。數據以平均值±標準差呈現，* P<0.05：與無Tie2激酶抑制劑(Tie2 kinase inhibitor)之組別比較。
以下範例不受限制，且僅為本發明諸多方面及特色之代表。
材料與方法
依據克沙奇病毒及腺病毒受體陽性(coxsackievirus and adenovirus receptor positive；CAR-positive)之表現，藉由螢光流式細胞分選儀(fluorescence-activated cell sorting；FACS)從初代培養細胞中分離出克
沙奇病毒(coxsackievirus)及腺病毒(adenovirus)受體陽性之老鼠肺部幹細胞/先驅細胞族群(coxsackievirus and adenovirus receptor positive mouse pulmonary stem/progenitor cells；CAR+/mPSCs)。以含有Oct-4(SEQ ID NO：1)編碼之反轉錄病毒載體轉染CAR+/mPSCs及CAR+/mPSCs衍生之第一型肺胞壁細胞(type-I pneumocytes)。高量表現Oct-4之細胞，即CAR+/mPSCsOct-4_hi細胞株，其利用西方墨點法分析(Western blot analysis)、端粒酶重複擴增試驗(telomerase repeat amplification assay)、流式細胞儀分析、軟瓊脂菌落形成能力試驗(soft agar colony formation assay)、球體形成試驗(sphere formation assay)、反轉錄聚合酶連鎖反應(reverse transcription PCR)與即時聚合酶連鎖反應(real-time PCR)分析基因表現、管柱形成試驗(tube formation assay)及雞胚胎尿絨毛膜(chicken chorioallantoic membrane；CAM)試驗。體內致瘤潛能係藉由重症聯合免疫缺陷小鼠(Severe Combined Immunodeficiency Mice；SCIDmice)之限制性稀釋移植實驗(limiting dilution transplantation experiment)及腫瘤轉移試驗(metastasis assay)進行評估，衍生腫瘤以免疫組織化學和免疫螢光染色法進行處理。
細胞培養
從台灣生物資源保存及研究中心(Bioresource Collection and Research Center of Taiwan)取得人類肺腺癌細胞株(Human lung adenocarcinoma cell line)A549、老鼠腋窩淋巴結/血管上皮細胞株(mouse axillary lymph node/vascular epithelial cell line)SVEC4-10和人類胚腎細胞株(human embryonic kidney cell line；HEK)293T，A549、SVEC4-10和
HEK293T細胞於DMEM培養基(Dulbecco’s modified Eagle medium，Sigma-Aldrich)及10%胎牛血清(FBS)於37℃下及含5%二氧化碳之潮濕培養箱中培養。
老鼠肺部幹細胞/先驅細胞之無血清初代篩選培養
新生ICR小鼠(產後1到3天)以頸椎脫臼法(cervical dislocation)犧牲，分離肺部組織並將其收集於預冷之和含有青黴素(penicillin，100units/mL)與鏈黴素(streptomycin，100g/mL)之Hank緩衝液(Hank's buffer)。將肺部組織切成直徑1到2mm之片段並放置於消化培養基(digested medium)中，其包含0.1%蛋白分解酶第14型(protease type-XIV，Sigma-Aldrich)和1ng/mL之DNA分解酶-I(DNase-I，Sigma-Aldrich)於MEM(Minimum Essential Medium Eagle)培養基，於4℃下放置過夜。接著，加入10%胎牛血清(FBS)/MEM培養基以中和蛋白分解酶/DNA分解酶-I，組織懸浮物以10mL吸管(pipette)輕輕混合數次。組織碎片以100μm之尼龍細胞濾網(nylon cell strainer)過濾，清洗細胞並再懸浮於有補充胰島素/運鐵蛋白(transferrin)/硒(ITS)(Invitrogen)之MCDB-201培養基(Sigma-Aldrich)中。這些細胞以3x105細胞/mL之密度於塗覆膠原蛋白-I(collagen-I，Becton Dickinson Biosciences)之細胞培養盤上進行培養，經過一天培養後，用添加硒(ITS)與1ng/mL之重組表皮生長因子(epidermal growth factors，Invitrogen)之MCDB-201培養基使細胞再生(refresh)。肺部表皮細胞株(Pulmonary epithelial colony)在細胞融合(confluent)第10至14天時於培養基上形成細胞群落。這些初代細胞以
螢光流式細胞分選儀(FACS)分離克沙奇病毒及腺病毒受體(coxsackievirus and adenovirus receptor positive；CAR)陽性(CAR-positive)之老鼠肺部幹細胞/先驅細胞(mouse pulmonary stem/progenitor cells；mPSCs)。
克沙奇病毒及腺病毒受體陽性之老鼠肺部幹細胞/先驅細胞(CAR+/mPSCs)之分離
取自初代培養細胞之細胞懸浮物以螢光流式細胞分選測量儀(FACS caliber instrument，Becton Dickinson Biosciences)分析CAR陽性之細胞。簡單而言，將1×106顆細胞與山羊抗CAR多株抗體(R&D systems)於4℃下培養一小時。清洗後，將細胞與Alexa488偶聯之驢抗山羊IgG抗體(Alexa488-coupled donkey anti-goat IgG，Jackson ImmunoResearch)於4℃下培養一小時。細胞螢光以流式細胞分選儀(FACSAriaTM，Becton Dickinson Biosciences)評估，以及數據以CellQuestTM軟體(Becton Dickinson Biosciences)分析。細胞根據CAR陽性表現達到>90%之純度，其稱為CAR+/mPSCs，CAR+/mPSCs以低轉速離心(1100rpm，5分鐘)並重新懸浮以供後續用途，其包含Oct-4轉染及細胞分化實驗。
Oct-4轉染
如前所述，依據CAR陽性(CAR-positive)表現量，藉由螢光流式細胞分選儀(FACS)將CAR+/mPSCs從初代培養細胞分離出來。詳細方法於補充方法內描述。以具有編碼Oct-4(SEQ ID NO：1)之反轉錄病毒載體轉染CAR+/mPSCs及CAR+/mPSCs衍生之第一型肺胞壁細胞(type-I pneumocytes)。簡單而言，反轉錄病毒載體之質體pMXs-mOct-4
(Addgene)與包裹質體(packaging plasmid)(pCMV-gag-pol-PA和pCMV-VSVg)係利用GeneJuice轉染試劑(Novagen)送入HEK293T細胞中，48小時後病毒上清液以0.45μm過濾器過濾，並加入10μg/mL之凝聚胺(polybrene)。接種1×104顆之CAR+/mPSCs及CAR+/mPSCs衍生之第一型肺胞壁細胞(type-I pneumocytes)於每個35μm之細胞培養盤上，並以病毒上清液培養16小時。轉染後之細胞以mES/MCDB201(1：1)培養基培養，並補充絲裂黴素(mitomycin C)去除MEF細胞(餵養細胞)活性。似鵝卵石之細胞群落於第18至25天形成，第28天時手動分離細胞群落，並進一步於補充mES/MCDB201(1：1)的Matrigel(Becton Dickinson Biosciences)培養基上擴大以建立C1、E9、C7細胞株。C1-GFP細胞株之建立係利用C1細胞株轉染具有編碼GFP之反轉錄載體。簡單而言，反轉錄病毒質體pMXs-puro GFP(Addgene)與包裹質體(pCMV-gag-pol-PA和pCMV-VSVg)藉GeneJuice轉染試劑(Novagen)送入HEK293T細胞中，48小時後，病毒上清液以0.45μm過濾器過濾，並添加10μg/mL之凝聚胺(polybrene)。將1×104顆C1細胞株接種於35mm之培養盤，並於病毒上清液中培養16小時。加入嘌呤黴素(purimycin，2.5μg/mL)至培養液中，五天後GFP陽性細胞株可被鑑定及放大，其稱為C1-GFP細胞株。
RNA萃取、反轉錄聚合酶連鎖反應與即時聚合酶連鎖反應
利用TRIzol試劑(Invitrogen)萃取總RNA，依照製造商的說明使用M-MLV RT(Promega)合成cDNA。反轉錄聚合酶連鎖反應(reverse transcription PCR)係利用Taq聚合酶(Invitrogen)依照製造商的說明操作。
即時聚合酶連鎖反應(real-time PCR)係利用7900HT即時聚合酶連鎖反應儀器(Applied Biosystems)操作，引子序列列於表1中，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase；GAPDH)表現用於標準化。
西方墨點法分析
細胞裂解物在RIPA緩衝液(Pierce)中萃取，並利用BCA蛋白質檢測試劑(Pierce)依照製造商之說明定量，等量(30μg)之總蛋白以十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)分離，並轉漬到活化的聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene difluoride membranes)(Millipore)上。以5%脫脂牛奶阻斷(blocking)後，該膜以初級抗體孵育(incubated)，如表2所示。墨點與共軛辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase)之二級抗體孵育，並以加強之化學冷光偵測器(chemiluminescence detection，Millipore)偵測免疫反應帶(immune-reacted bands)。
流式細胞儀分析
在CD133表現分析中，細胞被分離為單一細胞，清洗並懸浮於磷酸鹽緩衝液(PBS)中。細胞以別藻藍蛋白(allophycocyanin；APC)共軛抗老鼠CD133抗體(BioLegend)標記，接著以螢光流式細胞分選測量儀分析。在細胞週期分佈之分析中，細胞培養於6孔培養盤上，培養24小
時後收集細胞、以PBS清洗並於-20℃下以70%酒精固定放置過夜。接著，細胞以PBS清洗一次，並重新懸浮於含有200μg/mL之RNA分解酶A(RNaseA)與50μg/mL之碘化丙啶(propidium iodide)的PBS中，以螢光流式細胞分選測量儀分析細胞週期分佈。腫瘤中CD31與GFP之表現，係利用組織分離套組(Miltenyi Biotec)分離腫瘤至細胞懸浮液中，細胞懸浮液以別藻藍蛋白(allophycocyanin；APC)共軛抗老鼠CD133抗體(BioLegend)染色，接著利用螢光流式細胞分選測量儀分析。
乙醛脫氫酶活性試驗
細胞之乙醛脫氫酶(aldehyde dehydrogenase；ALDH)活性係利用ALDEFLUOR試驗套組(StemCell Technologies)偵測，其根據製造商之說明操作。將細胞懸浮於含有BODIPY-氨基乙醛(BODIPY-aminoacetaldehyde；BAAA)的ALDEFLUOR試驗緩衝劑於37℃下反應60分鐘。細胞以一種乙醛脫氫酶(aldehyde dehydrogenase；ALDH)抑制劑(二乙基氨基苯甲酮(diethylaminobenzaldehyde；DEAB))處理並作為陰性對照組。碘化丙啶(Propidium iodide)染色鑑定不能存活的細胞。螢光流式細胞分選測量儀藉由綠色螢光通道(520-540nm)用於分析細胞之乙醛脫氫脢(ALDH)活性。
端粒酶重複擴增試驗
端粒酶活性係利用端粒酶重複擴增(telomerase repeat amplification；TRAP)試驗測量，細胞於TRAP裂解緩衝液中均質化。於端粒酶反應中使用蛋白質(20μg)，並伴隨著50μL TRAP反應緩衝液，其
包含20mM三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl)(pH 8.3)、1.5mM氯化鎂、63mM氯化鉀、0.05%吐溫-20(Tween-20)、1mM EGTA、50μM脫氧核苷三磷酸(deoxynucleotide triphosphate，Pharmacia)、標記之TS、ACX及U2引子各0.1μg、5×10-3阿托莫耳(attomoles)之內部控制引子(TSU2)、2單位之Taq DNA聚合酶(Invitrogen)與2μL之CHAPS萃取物。於3℃下反應30分鐘後，端粒酶延長產物經PCR於以下條件中放大：30個循環，每個循環包含94℃下30秒、60℃下30秒與72℃下45秒。將反應混合物加熱至94℃ 5分鐘以將端粒酶去活性，放大之產物以12%聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)分析，再以溴乙錠(ethidium bromide)染色並在紫外光下觀察。
軟瓊脂細胞群落形成能力試驗
軟瓊脂細胞群落形成能力試驗(soft agar colony formation assay)係透過接種3×103顆細胞於35mm之組織培養盤，其包含一層0.35%低熔融瓊脂(agarose)/ES/MCDB-201覆蓋於一層0.5%低熔融瓊脂(agarose)/ES/MCDB-201之上。每隔兩天外加完整培養液，兩週後細胞群落以0.05%結晶紫(cystal violet)和甲醇固定，拍攝細胞群落生成並以光學顯微鏡定量。
球體形成試驗(Sphere formation assay)
細胞以每孔1000顆之密度接種於24孔超低附著培養盤(ultra low-attachmentplate)(Corning)中，並於無血清之DMEM培養基中培養，其外加2% B27(Invitrogen)、20ng/mL之表皮生長因子(Epidermal growth factor；EGF)及20ng/mL之鹼性纖維母細胞生長因子(basic fibroblast
growth factor；bFGF)(Invitrogen)。培養14日後離心收集初級球體，以胰蛋白酶(trypsin)分離再重新懸浮於此培養液中，二級球體(>70μm)在10天後拍攝與定量。
移植瘤試驗(xenograft tumor assay)
所有動物實驗皆經過台大醫學院動物照護及使用委員會(Institutional Animal Care and Use Committee of National Taiwan University College of Medicine)審查及批准。畸胎瘤形成試驗(teratoma formation assay)係以1×106顆之CAR+/mPSCsOct-4_hi C1、E9與C7細胞株經皮下注射至8週大之雄性重症聯合免疫缺陷小鼠(Severe Combined Immunodeficiency Mice；SCID mice)中；限制性稀釋移植實驗(limiting dilution transplantation experiment)係以C1細胞株(105、104、103和102顆細胞)或CAR+/mPSCs(106顆細胞)經皮下注射至重症聯合免疫缺陷小鼠體內；在C1-GFP細胞株和A549衍生腫瘤之實驗中，C1-GFP(1×105顆細胞)或A549(1×106顆細胞)以皮下注射至重症聯合免疫缺陷小鼠中。腫瘤尺寸每3天以卡尺測量一次，且體積(cm3)根據下列標準算式計算：長度×寬度2/2。腫瘤於實驗最後以手術切除並拍照。在腫瘤轉移試驗中，3×105顆C1細胞株和CAR+/mPSCs經側面尾部靜脈注射至重症聯合免疫缺陷小鼠體內，肺部轉移結節於第五週以屍體解剖及組織學檢查進行評估，利用Kaplan-Meier分析法比較注射C1細胞株與CAR+/mPSCs之小鼠之存活率的差別。
在二級腫瘤(secondary tumor)實驗中，1×106顆C1細胞株經皮下轉植4週後發展為腫瘤組織，將腫瘤組織切成小片後以胰蛋白酶
(trypsin)-EDTA消化。細胞懸浮物以100μm之細胞過濾器收集。利用FACSAriaII細胞分選儀分離高表現及低表現CAR之分化細胞，1x105、104、103和1×102個CAR高(CARhigh)及CAR低(CARlow)細胞(數量=4/組)分別經皮下轉植到重症聯合免疫缺陷小鼠背部。紀錄5週的二級腫瘤之形成，然後二級腫瘤之CAR表現則將進一步確認。
免疫組織化學與免疫螢光染色
腫瘤於福馬林中固定，接著脫水後以石蠟包埋並切片。腫瘤切片於檸檬酸鹽緩衝液(citrate buffer)(10mM，pH 6.0)中經微波輻射修復抗原(antigen retrieval)，將此腫瘤切片與初級抗體於4℃下反應過夜。免疫組織化學染色係將此腫瘤切片與相對應之HRP-偶聯之二級抗體在室溫下反應一小時後，利用0.05%之3,3'-二氨基聯苯胺(3,3’-diaminobenzidine；DAB)以肉眼觀察，細胞核以蘇木精(hematoxylin)複染。免疫螢光染色係利用相對應之螢光偶聯二級抗體於室溫下反應一小時，細胞核以DAPI螢光染劑複染。陰性對照組以相同條件製備，並以對照之免疫球蛋白G(IgG)取代初級抗體。抗體列於表2中。切片以顯微鏡(Nikon Eclipse 800)檢查，免疫組織化學染色切片以TissueFax細胞定量分析儀(TissueGnostics GmbH)掃描定量，免疫陽性族群之比例以HistoQuest軟體(TissueGnostics GmbH)分析。
細胞存活試驗
接種3×103顆細胞至96孔盤中並培養18小時。細胞以不同濃度之二氯二胺鉑(cisplatin，Sigma-Aldrich)或太平洋紫杉醇(paclitaxel)處理。48小時後根據廠商說明書指示操作WST-1試驗(Roche)測定細胞存活率，細胞存活率以未處理組別之百分比表示，並得到IC50值。
雞胚胎尿絨毛膜(chicken chorioallantoic membrane；CAM)試驗
受精雞卵在37℃及80%之濕度環境下培養，發育第8天時將1×106顆細胞放置於膜上並移植到生長中之雞胚胎尿絨毛膜(CAM)上方，第11天時雞胚胎尿絨毛膜(CAM)以4%三聚甲醛(paraformaldehyde)固定，並以立體顯微鏡(stereomicroscope)及數位相機拍照，分支點以NIH Image J軟體及血管新生外掛程式定量。
體外CAR+/mPSCsOct-4_hi管柱形成試驗(tube formation assay)
細胞於內皮細胞生長培養基(endothelial cell growth medium；EGM)(Lonza)中培養7天，收集細胞並於外加2%胎牛血清(fetal bovine serum；FBS)的DMEM培養基中懸浮，接種於基底膜基質(Matrigel)，8小時後細胞以鈣黃綠素-AM(calcein-AM)(Invitrogen)染色，並利用螢光顯微鏡(Zeiss)取得影像。
CAR+/mPSCsOct-4_hi C1細胞株與SVEC4-10共同培養形成管柱
將基底膜基質(Matrigel)鋪於35mm之培養皿(Ibidi μ dish)
上，C1細胞株衍生球體以綠色螢光追蹤劑鈣黃綠素-AM(calcein-AM)標記，並將其與染上紅色螢光追蹤染劑PHK26(Sigmla-Aldrich)之SVEC4-10細胞混合，細胞核以Hoechst33342染劑複染。細胞混合物接種於鋪上基底膜基質(Matrigel)之細胞培養盤，其含有外加2% FBS與5% Matrigel之DMEM。管柱形成以縮時攝影之螢光共軛焦顯微鏡(time-lapse immunofluorescence confocal microscopy)記錄。
Tie2激酶抑制劑之抑制
Tie2激酶抑制劑能有效、可逆且選擇性標靶Tie2激酶之ATP結合位點，其化學結構式為4-(6-甲氧基-2-萘基)-2-(4-甲基亞磺酰苯基-5-(4-吡啶基)-1H-咪唑(4-(6-methoxy-2-naphthyl)-2-(4-methylsulfinyl phenyl-5-(4-pyridyl)-1H-imidazole4-(6-methoxy-2-naphthyl)-2-(4-methylsulfinyl phenyl-5-(4-pyridyl)-1H-imidazole)(CAS編號：948557-43-5)(ab141270，Abcam，劍橋，馬薩諸塞州)，Tie2激酶抑制劑(2μM)對於經24小時處理後之CAR+/mPSCsOct-4_hi細胞株的細胞毒性為93.2±2.51%存活率。
在管柱形成(tube formation)試驗中，以內皮細胞生長培養基(Endothelial cells growth medium；EGM)培養之CAR+/mPSCsOct-4_hi C1細胞株的管柱形成以2μM Tie2激酶抑制劑處理，8小時後以鈣黃綠素-AM(calcein-AM)(Invitrogen)染色，再以螢光顯微鏡(Zeiss)取得影像。
血管形成試驗中，CAR+/mPSCsOct-4_hi C1細胞株的1×106顆細胞以2μM Tie2激酶抑制劑處理，並接續雞胚胎尿絨毛膜(chicken chorioallantoic membrane；CAM)試驗。第11天時，雞胚胎尿絨毛膜(CAM)
以4%三聚甲醛(paraformaldehyde)固定，並以立體顯微鏡及數位相機拍照，分支點以NIH Image J軟體及血管新生外掛程式定量。
CAR+/mPSCsOct-4_hi C1細胞株的1×105顆細胞經皮下注射至8週大之雄性重症聯合免疫缺陷小鼠(Severe Combined Immunodeficiency Mice；SCID mice)中。50mg/公斤體重之Tie2激酶抑制劑於第10至25天中每兩天經腹腔施打一次。腫瘤大小每2或3日經卡尺測量一次，且體積(cm3；立方公分)根據下列標準算式計算：長度×寬度2/2。實驗結束後，腫瘤以手術切除並拍照。
統計分析
取自至少3個獨立實驗之定量數據以平均值±標準差(SD)表示，學生t檢驗(student's t test)用來比較組別間之差異，利用Kaplan-Meier分析法獲得生存曲線，P<0.05為統計上顯著。
結果
轉染Oct-4至CAR+/mPSCs使其高度表現
組織專一性幹細胞數量雖少，卻是維持組織穩定性的主因。在之前的研究中已成功辨識並分離出CAR+/mPSCs(圖1(A)與1(B))。與老鼠胚胎幹細胞株(mouse embryonic stem cell line)(E14)相比，CAR+/mPSCs於聚合酶連鎖反應(PCR)及即時聚合酶連鎖反應(real-time PCR)分析中其Oct-4、Sox-2與Nanog表現量較低(圖1(C))。CAR+/mPSCs於第7天表現其分化為第一型肺胞壁細胞(type-I pneumocytes)之潛能，
其證據為其扁平細胞之型態以及第一型肺胞壁細胞(type-I pneumocytes)標記T1α與AQP5(圖1(D))的出現。因此，CAR+/mPSCs具有肺部專一性幹細胞/先驅細胞(stem/progenitor cell)之特性，這些細胞可利用CAR表現來辨識及利用螢光流式細胞分選儀(FACS)有效分離出來。
對CAR+/mPSCs及CAR+/mPSCs衍生之第一型肺胞壁細胞(type-I pneumocytes)藉由反轉錄病毒(retrovirus)轉染使Oct-4過量表現。在此實驗中，CAR+/mPSCs以Oct-4轉染(圖2(i)與(ii))，餵養細胞(feeder cell)於第2天供給(圖2(iii))，似鵝卵石之細胞群落形成於第18至25天時初次觀察到，第28天時，發展佳的細胞群落呈現明亮的邊界，群落中之細胞具高核質比(nuclear/cytoplasmic ratio)，且有顯著的核仁(圖2(iv))，接著將這些細胞挑起並放大建立細胞株(圖2(v))。表3顯示似鵝卵石之細胞群落形成的頻率，CAR+/mPSCs之轉染假控制組(sham control)或CAR+/mPSCs衍生之第一型肺胞壁細胞(type-I pneumocytes)以Oct-4轉染皆無法觀察到群落形成。
於CAR+/mPSCs中似鵝卵石之細胞群落形成頻率介於0.05-0.13%(表3)，同時在CAR+/mPSCs之轉染假控制組(sham control)中無法觀察到似鵝卵石之細胞群落(數據無顯示)。CAR+/mPSCs衍生之第一型肺胞壁細胞(type-I pneumocytes)的反轉錄病毒轉染於第8天操作，此時第一型肺胞壁細胞(type-I pneumocytes)皆分化良好(圖3(i)、(ii)及(iii))，餵養細胞於第10天供給(圖3(iv))，Oct-4轉染之第一型肺胞壁細胞(type-I pneumocytes)直到誘導後第42天皆無觀察到群落形成。這些結果顯示Oct-4之過量表現可誘導CAR+/mPSCs形成似鵝卵石之細胞群落，且於細胞狀態，即幹細胞/先驅細胞(stem/progenitor cells)階段，而非分化階段，似乎對於透過Oct-4過量表現所誘導之群落形成是關鍵的。
似鵝卵石之細胞群落被分離並建立為個別的細胞株。為了評估表型的改變，取3個獨立實驗之細胞株，名為C1、E9和C7，做進一步檢查。西方墨點(Western blot)分析顯示Oct-4於C1、E9和C7細胞株中高度表現；因此，它們被稱為CAR+/mPSCsOct-4_hi細胞株(圖4(i))，Oct-4於C1、E9和C7細胞株中之表現量高於CAR+/mPSC16到20倍，Oct-4於C1、E9和C7細胞株中之表現量與老鼠胚胎幹細胞(E14)相似，然而CAR+/mPSCs之Oct-4表現量低(圖4(ii))。在初代培養中，CAR專一表現於肺部幹細胞/先驅細胞(pulmonary stem/progenitor cells)，並作為分離CAR+/mPSCs之標記。在CAR+/mPSCsOct-4_hi細胞株中，CAR在>95%之細胞中表現，且這些細胞失去分化為第一型肺胞壁細胞(type-I pneumocytes)
之能力(圖5(A)與(B))，細胞週期分析顯示CAR+/mPSCs與CAR+/mPSCsOct-4_hi細胞株中其G1-，S-和G2/M-時期變動顯著(圖6(A))。表4顯示CAR+/mPSCs與CAR+/mPSCsOct-4_hi C1、E9與C7細胞株其細胞週期為G1-，S-和G2/M-時期之族群分析。CAR+/mPSCsOct-4_hi細胞株於S-和G2/M-時期的族群明顯增加。
另外，C1、E9與C7細胞株能繁殖超過50代，其倍增時間(Doubling time)為23±1小時(圖6(B))，在表5中顯示倍增時間。
端粒酶活性在C1、E9及C7細胞株之第12、20、50代能偵測到，在CAR+/mPSCs則無(圖6(C))。這些結果證實CAR+/mPSCs之Oct-4高量表現足以產生不朽效果，例如G1細胞週期進程、增生潛能與端粒酶活性。
CAR+/mPSCsOct-4_hi展現致癌潛能
為了評估CAR+/mPSCsOct-4_hi細胞株之多能潛能，畸胎瘤(teratoma)形成試驗在C1、E9與C7細胞株中操作，取C1、E9與C7細胞株的1×106顆細胞經皮下注射到重症聯合免疫缺陷小鼠(SCID mice)體內。經過20至24天後，畸胎瘤(teratoma)大約形成一公分(圖7(A))，圖7(B)顯示C1細胞株之組織病理分析的代表圖。蘇e木精-伊紅染色法(H&E staining)顯示腫瘤中無外胚層(ectodrmal)、中胚層(mesodermal)及內胚層(endodermal)之分化；此外，腫瘤展現典型惡性表型之特徵，例如高細胞密度、小且圓之不成熟細胞增生、高核質比之多型細胞(pleomorphic cell)、高有絲分裂比(圖7(B))。利用免疫組織化學染色可偵測腫瘤中之Oct-4與CAR(圖8(A))，腫瘤中亦可測得其他活化態之致癌基因，包含磷酸化-Src、磷酸化-β胡蘿波素(phospho-β-catenin)、c-myc及週期蛋白D1(cyclin D1)(圖8(B))。肺腺癌(Lung adenocarcinoma)
之診斷標記，如甲狀腺轉錄因子-1(thyroid transcription factor-1；TTF1)、Napsin A(NAPSA)、細胞角蛋白7(cytokeratin 7；CK7)及細胞角蛋白重分子量(cytokeratin heavy molecular weight；CK-HMW)亦可於腫瘤中偵測出來(圖8(C))。這些數據顯示CAR+/mPSCs經Oct-4高量表現後具有致癌能力。
接著量化CAR+/mPSCsOct-4_hi細胞株之致癌潛能，利用軟瓊脂細胞群落形成能力試驗(soft agar colony formation)評估非錨定依賴性生長(Anchorage-independent growth)。兩週後，C1、E9及C7細胞株與人類肺腺癌細胞株(human lung adenocarcinoma cell line)A549；相比形成顯著較多之軟瓊脂細胞群落；然而，CAR+/mPSCs中無法觀察到此類細胞群落(圖9(A)與表6)。為了評估二級球體形成的效率，C1、E9與C7細胞株於無附著的狀態下培養。CAR+/mPSCsOct-4_hi細胞株之二級球體形成效率顯著高於A549細胞，且於CAR+/mPSCs中亦無球體形成(圖9(B)與表6)，表6顯示細胞群落與球體之定量。
在諸多試驗中，C1細胞株展現最顯著之致瘤行為，包含最高之增生速率、最高之非錨定依賴性群落形成(anchorage-independent colony formation)效率及最高之二級球體形成效率。故選擇C1細胞株操作後續之活體致瘤實驗(in vivo tumorigenic experiment)。為了確認C1細胞株之致瘤性，進行限制性稀釋移植實驗(limiting dilution transplantation experiment)。腫瘤形成能力為6/6、5/6、5/6，其分別對應105、104與103顆C1細胞株注射；此外，低濃度之C1細胞株(102)即足以在平均注射後28天產生腫瘤(4/6)(圖10(A)-i)，腫瘤大小與形態於圖10(A)-ii中呈現。相反地，利用CAR+/mPSCs細胞移植(106顆細胞)孵育56天仍無法觀察到腫瘤產生(數據未呈現)。為了檢查轉移潛能，3×105顆C1細胞株經由老鼠之尾端靜脈移植，並讓其發展35天。所有注射C1細胞株的老鼠的肺部組織中有腫瘤結節(tumor nodule)產生(圖10(B))。肺部組織經蘇木精-伊紅染色法(H&E staining)染色後顯示C1細胞株移植老鼠出現廣泛出血與結節形成，而以CAR+/mPSCs移植之老鼠後並無偵測到異常病變。利用Kaplan-Meier存活分析得到經C1或CAR+/mPSCs細胞株移植後老鼠的存活率，注射C1細胞株之老鼠平均存活率顯著低於移植CAR+/mPSCs者(圖10(C))。這些結果顯示CAR+/mPSCs經Oct-4高量表現後出現惡性轉變，其透過體內與體外之CAR+/mPSCsOct-4_hi細胞株致瘤潛能及腫瘤起始能力實驗皆可得到證實。
CAR+/mPSCsOct-4_hi展現肺癌癌起始細胞之特性
對於肺部癌起始細胞的偵測，已有不同的生物標記被提出，
包含CD133表現、乙醛脫氫酶(aldehyde dehydrogenase；ALDH)活性與化療抗性。利用這些生物標記進一步研究CAR+/mPSCsOct-4_hi細胞株之癌起始細胞(CICs)特性。流式細胞儀分析顯示C1、E9和C7細胞株中，CD133+細胞約占17.4-31.7%；然而在CAR+/mPSCs中幾乎無法偵測到CD133+細胞(圖11(A))。乙醛脫氫酶(ALDH)活性在C1、E9和C7細胞株中占18.4-33.2%，然而只有0.8%之CAR+/mPSCs表現乙醛脫氫酶(ALDH)活性(圖11(B))。化療抗性也是癌起始細胞之關鍵生物特性，因此評估C1、E9和C7細胞株對於二氯二胺鉑(cisplatin)與太平洋紫杉醇(paclitaxel)之化療抗性。細胞存活率(cell viability)於圖11(C)中顯示。表7顯示二氯二胺鉑(cisplatin)與太平洋紫杉醇(paclitaxel)對於CAR+/mPSCsOct-4_hi C1、E9、C7與A549細胞株之IC50。二氯二胺鉑(cisplatin)對於C1、E9、C7細胞株之IC50介於26.4-34.7μM，顯示CAR+/mPSCsOct-4_hi細胞株對於二氯二胺鉑(cisplatin)之抗性較A549高2至3倍；而太平洋紫杉醇(paclitaxel)對於C1、E9、C7細胞株之IC50介於43.2-47.2nM，其約為A549之6倍高(圖11(C))。
蛋白質生存素(Survivin)已被充分證實能夠抑制細胞凋亡並在賦予癌起始細胞化療抗性中扮演重要的角色。本發明發現生存素表現量在C1、E9與C7細胞株中明顯較CAR+/mPSCs高(圖11(D))。C1、E9與C7細胞株在二氯二胺鉑(cisplatin)與太平洋紫杉醇(paclitaxel)處理後亦較CAR+/mPSC展現較低表現量之裂解凋亡蛋白酶-3(cleaved caspase-3)與裂解凋亡蛋白酶-9(cleaved caspase-9)(圖11(D)-ii)。總括而言，這些結果顯示Oct-4之高量表現可以驅使CAR+/mPSCs轉型並賦予其似癌起始細胞的特性。
是以，本發明進一步比較CAR+/mPSCs、CAR+/mPSCsOct-4_hi與A549細胞株(人類肺腺癌細胞株)之差別(表3)。相較於CAR+/mPSCs，CAR+/mPSCsOct-4_hi有許多癌起始細胞之特性。A549是癌細胞，但不是癌起始細胞；與A549細胞相比，CAR+/mPSCsOct-4_hi之軟瓊脂細胞群落形成(soft agar colony)、球體形成(sphere formation)、CD133及乙醛脫氫酶(ALDH)活性皆有較高之表現量。此外，少量之CAR+/mPSCsOct-4_hi(103顆細胞)即可形成腫瘤並具有腫瘤再生能力。這些結果顯示CAR+/mPSCsOct-4_hi是癌起始細胞。
表8、CAR+/mPSCs、CAR+/mPSCsOct-4_hi與A549細胞株之
CAR+/mPSCsOct-4_hi參與腫瘤血管新生
在先前的研究中，顯示CAR+/mPSCs能表現促血管新生因子(proangiogenic factors)，包括血管內皮生長因子A(vascular endothelial growth factor A；VEGFa)、周邊血液幹細胞(granulocyte colony stimulating factor；GCSF)、血管細胞黏聯分子1(vascular cell adhesion molecule 1；VCAM-1)與鹼性纖維母細胞生長因子(basic fibroblast growth factor；bFGF)，其可引發內皮細胞管形成。因此，本發明欲評估CAR+/mPSCsOct-4_hi細胞株之血管新生潛能。經即時聚合酶連鎖反應(Real-time PCR)分析發現本發明之C1、E9與C7細胞株的促血管新生因子表現量，包含血管生成素1(angiopoietin 1；ANG1)、血管生成素2(angiopoietin 2；ANG2)、血管內皮生長因子A(vascular endothelial growth factor A；VEGFa)、胎盤生長因子(placental growth factor；PLGF)、血小板衍生生長因子A(platelet-derived growth factor A；PDGFa)、周邊血液幹細胞(granulocyte colony stimulating factor；GCSF)、血管細胞黏聯分子1(vascular cell adhesion molecule 1；VCAM-1)與鹼性纖維母細胞生長因子(basic fibroblast growth factor；bFGF)皆顯著高於CAR+/mPSCs(圖12)，為了進一步確認血管新生潛能，我們在雞胚胎尿絨毛膜(chick chorioallantoic membrane；CAM)試驗中使用C1、E9與C7細胞株與CAR+/mPSCs。相較於CAR+/mPSCs的移植，當C1、E9與C7細胞株移植到雞胚胎尿絨毛膜(chick chorioallantoic
membrane；CAM)上時引發廣泛的血管新生(圖13(A)-i))，分支點定量顯示C1、E9與C7細胞株移植之血管分支點較CAR+/mPSCs顯著增加(圖13(A)-ii))，Cl、E9與C7細胞株衍生腫瘤之免疫組織化學分析與定量顯示其CD31陽性族群顯著高於A549衍生腫瘤的CD31陽性族群(圖13(B)-i與-ii)。這些數據顯示Oct-4高量表現可增強CAR+/mPSCsOct-4_hi細胞株之血管新生潛能。
為了進一步闡明CAR+/mPSCsOct-4_hi在血管新生(angiogenesis)中的功能貢獻，故監控與C1細胞株孵育後內皮細胞之管柱形成(tube formation)。用綠色螢光追蹤劑鈣黃綠素-AM(calcein-AM)標記C1細胞株衍生球體，並與用紅色螢光追蹤劑PKH26標記之SVEC4-10細胞混合後，共同培養以使管柱形成。C1細胞株衍生球體吸收SVEC4-10細胞並建立管柱網絡(圖14(A))。有些C1細胞株之細胞被發現整合入SVEC4-10細胞的管柱網絡(圖14(B))。C1、E9與C7細胞株在內皮細胞生長培養基(EGM)(Lonza)培養7天以檢查管柱形成能力，亦培養CAR+/mPSCs作為控制組。以內皮細胞生長培養基(EGM)培養之C1、E9與C7細胞株展現管柱形成能力，然而以內皮細胞生長培養基(EGM)培養之CAR+/mPSCs並無法觀察到此能力(圖15(i)與(ii))。在內皮細胞生長培養基(EGM)中，C1、E9與C7細胞株表現內皮細胞標記，包括CD31、CD105、CD34與CD144(圖16)。這些結果指出CAR+/mPSCsOct-4_hi不僅擁有血管新生潛能，亦參與體外之管柱形成(tube formation)。為了評估體內之腫瘤血管形成(tumor blood vessel formation)潛能，轉染GFP至C1細胞
株(C1-GFP細胞株)，並將其經皮下移植至重症聯合免疫缺陷小鼠(SCID mice)體內以形成腫瘤。利用免疫螢光染色，偵測到C1-GFP細胞株衍生腫瘤中的內皮細胞抗原，包含CD31、vWF與CD105。有些血管不完全表現內皮細胞抗原，且GFP陽性細胞(GFP+cell)直接融合至血管中，展現似馬賽克的結構。此外，有些內皮細胞同時表現內皮細胞抗原且為GFP陽性(圖17(A)-i,ii與iii)。為了確定GFP陽性之內皮細胞的出現，分離腫瘤並以流式細胞儀檢測，其結果與免疫螢光染色相似，12-18%之CD31+族群亦為GFP陽性(圖17(B))。為了檢查CAR+/mPSCsOct-4_hi細胞株與內皮細胞之間的關聯，利用即時聚合酶連鎖反應(real-time PCR)分析血管新生相關受體(angiogenesis associated receptors)血管內皮生長因子受體2(vascular endothelial growth factor receptor 2；VEGF2)與Tie2之基因表現。專一性表現在內皮細胞之受體Tie2在內皮細胞生長培養基(EGM)培養之C1、E9與C7細胞株中其表現皆顯著高於CAR+/mPSCs；而血管內皮生長因子受體2(VEGF2)並無顯著差別(圖18(A))。西方墨點(Western blot)分析確認ANGs/Tie2/GRB2/ERK訊息傳遞的參與，顯示於內皮細胞生長培養基(EGM)培養之C1、E9與C7細胞株的血管生成素1(angiopoietin 1；ANG1)、血管生成素2(angiopoietin 2；ANG2)、磷酸化-Tie2、生長因子受體結合蛋白2(growth factor receptor bound protein 2；GRB2)與磷酸化-ERK的表現量相對於CAR+/mPSCs顯著增加(圖18(B))。這些數據顯示CAR+/mPSCsOct-4_hi主動參與腫瘤血管新生，而非如CAR+/mPSCs扮演被動的角色。另外，Tie2激酶抑制劑降低內皮細胞生長培養基(EGM)培養之C1細胞株的管柱形成潛能，並於雞胚胎尿絨毛膜(chick chorioallantoic
membrane；CAM)試驗中抑制C1細胞株促進的血管形成(圖19(A))。另外，內皮細胞生長培養基(EGM)培養之C1細胞株的管柱形成(tube formation)在抗體中和血管內皮生長因子A(vascular endothelial growth factor A；VEGFA)組與IgG控制組中並無顯著差異(圖19(B))。在異體移植腫瘤試驗(xenograft tumor assay)中，50mg/公斤體重之Tie2抑制劑在C1細胞株移植7天後每2天經腹腔注射一次。Tie2抑制劑顯著降低C1於腫瘤早期發展時期之腫瘤體積(圖19(C))。因此，本發明提出之腫瘤血管形成機制可能不同於常規腫瘤血管形成機制，在CAR+/mPSCsOct-4_hi細胞株主動參與腫瘤血管新生的過程中Tie2/ANGs訊息傳遞扮演重要的角色。
一個熟知此領域技藝者能很快體會到本發明可很容易達成目標，並獲得所提到之結果及優點，以及那些存在於其中的東西。本發明中之方法乃較佳實施例的代表，其為示範性且不僅侷限於本發明領域。熟知此技藝者將會想到其中可修改之處及其他用途。這些修改都蘊含在本發明的精神中，並在申請專利範圍中界定。
說明書中提及之所有專利及出版品，都以和發明有關領域之一般技藝為準。所有專利和出版品都在此被納入相同的參考程度，就如同每一個個別出版品都被具體且個別地指出納入參考。
在此所適當地舉例說明之發明，可能得以在缺乏任何要件，或許多要件、限制條件或並非特定為本文中所揭示的限制情況下實施。所使用的名詞及表達是作為說明書之描述而非限制，同時並無意圖使用這類排除任何等同於所示及說明之特點或其部份之名詞及表達，但需認清的
是，在本發明的專利申請範圍內有可能出現各種不同的改變。因此，應了解到雖然已根據較佳實施例及任意的特點來具體揭示本發明，但是熟知此技藝者仍會修改和改變其中所揭示的內容，諸如此類的修改和變化仍在本發明之申請專利範圍內。
<110> 林泰元
<120> 癌起始細胞及其用途
<130> 2726-LTY-TW
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 5958
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 1
Claims (11)
- 一種癌起始細胞，其包含過量表現Oct-4之分離的克沙奇病毒及腺病毒受體陽性之老鼠肺部幹細胞/先驅細胞(coxsackievirus and adenovirus receptor positive mouse pulmonary stem/progenitor cell；CAR+/mPSC)。
- 如申請專利範圍第1項所述之癌起始細胞，其中該CAR+/mPSC包含一編碼Oct-4基因的載體。
- 如申請專利範圍第2項所述之癌起始細胞，其中該Oct-4基因之序列為SEQ ID NO：1。
- 如申請專利範圍第1項所述之癌起始細胞，其中該CAR+/mPSC之Oct-4表現量為正常CAR+/mPSC的16倍。
- 如申請專利範圍第1項所述之癌起始細胞，其為一肺癌起始細胞。
- 如申請專利範圍第1項所述之癌起始細胞，其具有致瘤能力，其中該致瘤能力包含腫瘤形成、腫瘤再生、轉移能力或其組合。
- 如申請專利範圍第1項所述之癌起始細胞，其具有CD133表現、乙醛脫氫酶(aldehyde dehydrogenase；ALDH)活性、化療抗性或其組合。
- 如申請專利範圍第1項所述之癌起始細胞，其具有血管新生的功能。
- 如申請專利範圍第1項所述之癌起始細胞，其具有參與腫瘤血管形成的功能。
- 如申請專利範圍第1項所述之癌起始細胞，其表現內皮細胞之表面標 記，其中該內皮細胞之表面標記包含CD31、CD105、CD34、CD144或其組合。
- 如申請專利範圍第8項所述之癌起始細胞，其具有藉由活化ANG/Tie2訊息傳遞路徑以加強血管生成的功能。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| TW105125166A TWI633187B (zh) | 2016-08-08 | 2016-08-08 | 癌起始細胞及其用途 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| TW105125166A TWI633187B (zh) | 2016-08-08 | 2016-08-08 | 癌起始細胞及其用途 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| TW201805419A true TW201805419A (zh) | 2018-02-16 |
| TWI633187B TWI633187B (zh) | 2018-08-21 |
Family
ID=62013977
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| TW105125166A TWI633187B (zh) | 2016-08-08 | 2016-08-08 | 癌起始細胞及其用途 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| TW (1) | TWI633187B (zh) |
-
2016
- 2016-08-08 TW TW105125166A patent/TWI633187B/zh not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| TWI633187B (zh) | 2018-08-21 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11130943B2 (en) | Culture medium | |
| Ishii et al. | FGF2 mediates mouse spermatogonial stem cell self-renewal via upregulation of Etv5 and Bcl6b through MAP2K1 activation | |
| Wang et al. | Evaluation of CD44 and CD133 as cancer stem cell markers for colorectal cancer | |
| Di et al. | The stem cell markers Oct4A, Nanog and c-Myc are expressed in ascites cells and tumor tissue of ovarian cancer patients | |
| Christensen et al. | Immunohistochemical expression of stem cell, endothelial cell, and chemosensitivity markers in primary glioma spheroids cultured in serum-containing and serum-free medium | |
| US20220154143A1 (en) | Culture Method for Head and Neck Organoids | |
| US11834682B2 (en) | Method for identifying anti-cancer agents using an in vitro cell culture system that maintains cancer cell stemness | |
| EP3645704A1 (en) | Single lung cell-derived organoids | |
| US20160146815A1 (en) | Method for screeing cancer metastasis inhibitor using culture of cells or spheroidically aggregated cells in which lysyl-trna synthetase is regulated to be expressed or unexpressed | |
| TWI633187B (zh) | 癌起始細胞及其用途 | |
| US20180037871A1 (en) | Cancer initiating cell and use thereof | |
| Gu et al. | Acquisition of tumorigenic potential and enhancement of angiogenesis in pulmonary stem/progenitor cells through Oct-4 hyperexpression | |
| Filipović et al. | Possible impact of NCAM and FGFR1 molecule expression patterns on the biological behavior of renal cell carcinoma | |
| Rodrigues | Defining the role of tumor-derived exosomes in brain metastasis | |
| Tang et al. | Downregulation of chemokine (C‑C motif) ligand 5 induced by a novel 8‑hydroxyquinoline derivative (91b1) suppresses tumor invasiveness in esophageal carcinoma | |
| Klochkova | ROLE OF AUTOPHAGY AND AGING IN HOMEOSTASIS OF ESOPHAGEAL EPITHELIUM | |
| Karmakar | Molecular Insights Into PAF-1 Mediated Pancreatic Homeostasis, Stemness, and Cancer Progression | |
| Li | Unraveling the role of non-cancerous cells in the organization, progression, and metastasis of breast cancer | |
| Virtakoivu et al. | Vimentin plays a functional role in mammary gland regeneration | |
| Yeung | Prostate cancer cells require a Rab35-dependent exosome sub-population for stromal activation and tumour growth | |
| AU2020327593A1 (en) | Method for differentiating epithelial stem cells | |
| Mukhopadhyay | Biochemical pathways regulating mammary epithelial cell homeostasis and differentiation | |
| Wamsley | The Roles of NF-κB, Activin, and Sphingosine-1-Phosphate in Promoting Non-Small Cell Lung Cancer-Initiating Cell Phenotypes | |
| Setti | SHEDDING LIGHT ON GLIOBLASTOMA AND DERIVED EXTRACELLULAR VESICLES IN ONE CLIC | |
| Nemirovsky | The regulation of mitotic spindle orientation by BRCA1 controls the proliferation, polarization and growth arrest of human mammary epithelia |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Annulment or lapse of patent due to non-payment of fees |