TW201741462A

TW201741462A - 篩選病毒相關變異群變化之分子標記的方法

Info

Publication number: TW201741462A
Application number: TW105116890A
Authority: TW
Inventors: Zhuo Yuan You
Original assignee: Genomics Bioscience & Technology Co Ltd
Priority date: 2016-05-30
Filing date: 2016-05-30
Publication date: 2017-12-01
Also published as: TWI604057B

Abstract

本發明提供一種篩選病毒相關變異群變化之分子標記的方法，包含以次世代定序技術(Next Generation Sequencing，NGS)進行深度病毒定序，解讀病毒株中各變異群基因序列，並以數位式聚合酶鏈鎖反應(Digital Polymerase Chain Reaction，Digital PCR)篩選病毒相關變異群變化之分子標記。本發明之方法在病毒的監控與防治上提供更快速、靈敏及精準的結果。

Description

篩選病毒相關變異群變化之分子標記的方法

本發明提供一種篩選病毒之分子標記的方法，特別係一種篩選病毒相關變異群變化之分子標記的方法。

近年來，受全球化與國際交流頻繁的影響，全球公共衛生系統皆面臨新興感染性疾病極易迅速擴散、傳播的重大挑戰。要建構周全的防疫醫療網絡，包含疫情的監控、快速診斷的方法與疫苗及藥物的導入及研發等，皆需透過基礎學術、臨床研究、政府政策與醫藥生技產業的緊密合作，才能因應傳染病全球大流行的危機。

以禽流感為例，自二十世紀以來，禽流感疫情陸續在全球各地爆發，甚至多次發生禽傳人的案例，造成人類的重症及死亡。2013年，中國大陸發生嚴重的禽流感疫情，至今已造成二百多人死亡，致死率高達35%，引起各國的高度重視。於2015年初，臺灣爆發新一波禽流感疫情，包含H5N8及H5N3亞型病毒株皆首次在臺灣發現，而新型H5N2病毒更是全球首見，雖然目前尚無禽傳人之案例發生，但至3月為止，已造成臺灣家禽養殖業近新台幣30億元的損失。

A型禽流感病毒的主要宿主為水鳥或水禽，此類病毒會感染主要宿主的呼吸道及腸胃道，並經腸胃道被排放到水中。這些流感病毒對水鳥或水禽不具致病力，但對其他禽鳥動物則具高度致病性。禽流感病毒屬RNA病毒，共具8段基因，而其中HA基因被認為是決定宿主專一性及致病性的基因之一；HA基因上，若插入一段具鹼性胺基酸的序列(RERRRKKR)可擴大病毒感染禽鳥宿主的範圍，前人研究也發現此段鹼性胺基酸數量增加，也會造成病毒致病力的增加。然而，當國內學者取2003及2004年爆發的禽流感病毒株探討病毒累代後的病原性變化情形時，發現病原性指數(靜脈內接種病原性指數IVPI及腦內接種病原性指數ICPI)會隨著繼代增加，但與血球凝集素(HA)切割位胺基酸序列的變化並不具關聯性，其顯示HA切割位的鹼性胺基酸並非影響禽流感病毒病原性變化的唯一原因。

目前用於鑑定禽流感病毒的實驗室診斷方法為：快速抗原檢測(Rapid antigen detection)病毒培養(Virus culture)、病毒核酸檢測(RT-PCR或Real-time RT-PCR分析法)及血清抗體檢測等，然而，傳統的檢測方式只能檢測病毒主要族群的表現，無法針對潛在可能具高病原性的病毒變異群進行分析，導致在防/檢疫的過程中會有錯失在早期防堵疫情爆發的可能性。

由於新型H5N2禽流感病毒型原先皆屬於低病原性禽流感病毒(Low-pathogenic Avian Influenza,LPAI)，轉變為高病原性禽流感病毒(High-pathogenic Avian Influenza,HPAI)，顯示病毒演化快速且難以預測，因此，建立一套快速、完整的分析方法對臺灣的禽流感病毒進行嚴密監控，期望未來能及早發現高病原性禽流感病毒或新型變異株的產生實有其必要性。

有鑑於此，本發明以次世代定序技術(Next Generation Sequencing，NGS)進行深度病毒定序，解讀病毒株中各變異群基因序列，並以數位式聚合酶鏈鎖反應(Digital Polymerase Chain Reaction，Digital PCR)篩選病毒相關變異群變化之分子標記。

本發明之目的係提供一種篩選病毒相關變異群變化之分子標記的方法，包含：(a)將一病毒樣本進行一深度定序，其中該病毒樣本係包含一連續繼代感染的病毒樣本，以作為病毒演化及變異影響之推估模式；(b)將該深度定序結果進行一生物資訊分析，其中該生物資訊分析包含一病毒株的序列解碼以及分析該病毒株變異群隨著繼代的組成變化；以及(c)尋找該病毒株變異群中合適的分子標記，其中若該病毒株變異群中具有與病原性指數變化具正相關之一變異；並以數位式聚合酶鏈鎖反應(Digital Polymerase Chain Reaction，Digital PCR)確認產生該變異的族群占一病毒樣本中病毒株變異群的多數，則該變異為合適的分子標記。

在本發明之一實施例中，其中該深度定序係為次世代定序技術(Next Generation Sequencing，NGS)。

在本發明之一實施例中，其中該連續繼代感染的病毒樣本係為至少連續繼代約1至50代的病毒樣本。

在本發明之一實施例中，其中該1至50代的病毒樣本中，每10個世代取一個病毒樣本作為代表。

在本發明之一實施例中，其中該病毒係為禽流感、登革熱或狂犬病。

在本發明之一實施例中，其中以一數位式聚合酶鏈鎖反應(Digital Polymerase Chain Reaction，Digital PCR)建立該合適的分子標記的檢測方法。

在本發明之一實施例中，其中該步驟(b)的該病毒株序列解碼包含組裝(assemble)序列及利用已知病毒序列做參考。

在本發明之一實施例中，其中該步驟(b)分析一病毒株變異群隨著繼代的組成變化，包含偵測該病毒株變異群及分析該病毒株變異群組成。

在本發明之一實施例中，其中該步驟(b)分析一病毒株變異群隨著繼代的組成變化，進一步包含進行該些病毒樣本關聯性分析。

在本發明之一實施例中，其中該步驟(d)進一步包含進行優化該數位式聚合酶鏈鎖反應的定量條件。

本發明針對台灣於2004年首次禽流感爆發後家畜衛生試驗所收集之代表性樣本進行深度定序，除完整解讀禽流感病毒株中各變異群基因序列尋找合適分子標誌外，本發明更嘗試以數位式PCR技術建立H5N2禽流感病毒變異群比例快速檢測技術產品化開發。截至目前為止，數位式PCR屬新型技術，其技術門檻較目前現行的快速檢測等高，在國內因其設備價格較為昂貴，較少科研單位使用，目前的應用大多限於臨床癌症之研究，尚未普遍被應用微生物防疫、檢疫上，本發明利用數位式PCR高靈敏度、絕對定量之優勢針對病毒的變異群進行檢測；相較於傳統方法，本發明之方法可發展出檢測速度快、同時進行定性與定量的分子標記，更是一種可分析出高、低病原性病毒族群在整體病毒群的表現之分子標記。本發明提供一種篩選病毒相關變異群變化之分子標記的方法，可提供給防/檢疫單位及一般養殖業者在病毒的監控與防治上更快速、靈敏及精準的檢測結果。

以下將配合圖式進一步說明本發明的實施方式，下述所列舉的實施例係用以闡明本發明，並非用以限定本發明之範圍，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可做些許更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

101、102、103、104‧‧‧本發明之步驟

第一圖係為本發明之篩選病毒相關變異群變化之分子標記的方法的流程圖。

第二圖係為031209樣本之八段禽流感病毒的基因擴增結果。

第三圖係為本發明以次世代定序技術(Next Generation Sequencing，NGS)進行深度病毒定序分析HA基因繼代變異的趨勢。E0、E5、E20、E30、E40及E50分別表示原始毒株、第5代、第20代、第30代、第40代及第50代；藍色條帶顯示模板病毒鹼基；紅色條帶為不同病毒株的變異位點。

第四圖A至C係為禽流感病毒株繼代變異的曲線圖。第四圖A係為統計全部八段基因；第四圖B係為HA基因；第四圖C係為NA基因；淺灰線代表產生的變異的位點在病毒表現群中占的比例；深灰線代表變異點的數量。

第五圖A至C係為禽流感病毒株的HA基因序列變化分析。淺灰色長條為原始鹼基；深灰色長條為變異後的鹼基。

第六圖係為禽流感病毒株的HA基因之關聯性分析。

第七圖係以A539G及G1187A兩個位點之探針進行禽流感病毒株變異群檢測。Group A為變異族群；Group B為原始族群；GroupC為NC(Negative Count)；左方為RainDance數位式PCR測試結果；右方為BioRad數位式PCR測試結果。

本發明之篩選病毒相關變異群變化之分子標記的方法，以禽流感為例，如第一圖所示，首先步驟101：將一病毒樣本進行深度定序，其中該病毒樣本係包含連續繼代感染的病毒樣本，以作為病毒演化及變異影響之推估模式；其中本發明係利用次世代定序技術(Next Generation Sequencing，NGS)技術進行深度定序完成家畜衛生試驗所提供6個禽流感樣本各6個繼代共36個樣本；接著步驟102：將深度定序結果進行一生物資訊分析，其中該生物資訊分析包含該病毒株序列解碼以及分析一病毒株變異群隨著繼代的組成變化，以模擬在實際流行時的變化；進行步驟103：尋找該病毒株變異群中合適的分子標記，其中若該病毒株變異群與病原性指數變化具正相關，則為合適的分子標記；最後，進行步驟104：針對該合適的分子標記建立數位式聚合酶鏈鎖反應(Digital Polymerase Chain Reaction，Digital PCR)的檢測流程。

定義

本文中所述之次世代定序技術(Next Generation Sequencing，NGS)技術係包括：Illumina的Illumina HiSeq系統以及Illumina MiSeq系統；Roche公司開發的454系統；Life Technologies公司的Ion Torrent系統以及SOLiD系統；PacBio(Pacific Biosciences)公司的Pacific Biosciences系統；Helicos Biosciences的Helicos系統；Oxford Technologies的Nanopore系統等。

本文中所述之數位式聚合酶鏈鎖反應(Digital Polymerase Chain Reaction，Digital PCR)技術係包括：RainDance開發的RainDrop® digital PCR system；BioRad開發的QX200^TM Droplet Digital^TM PCR System等。

本文說所述之生物資訊分析軟體，包含：利用Bwa 0.7.10-r789軟體進行比對的序列(Query sequence)與參考序列互相比對；利用Samtools 0.1.19軟體進行序列排序、合併及索引；利用picard-1.119 MarkDuplicates軟體進行序列比對及標記重複序列；利用GenomeAnalysisTK-3.2-2 RealignerTargetCreator軟體重新調整讀取序列以使配對錯的鹼基數量最小化；利用GenomeAnalysisTK-3.2-2 UnifiedGenotyper進行變異判定，包含單核甘酸變異及插入或缺失變異；利用Integrative Genomics Viewer(IGV)將分析數據轉換為基因圖譜。但不限於此。

實施例1樣本前處理及基因庫製備

本發明之樣本來源為H5N5及H6N1禽流感病毒，其包含由家畜衛生試驗所提供之雞源病毒(表一)。

表一所列之病毒株為2004年台灣發生首例H5N2低病原性禽流感之病毒分離株，當年分析發現雖為首次爆發，仔細分析發現所有發生例的病毒基因依演化樹可概略分成6組基因分群，為了解這些病毒株在台灣養雞場累代循環之後可能發生的病毒變異情形，以14日齡雞胚胎蛋群為累代模式進行累代變異分析試驗。各群組選取代表性病毒株如表一所列，各代表株均經每代50枚14日齡雞胚胎蛋的連續繼代約1至50代，本發明以NGS技術對各代表株進行深度定序試圖了解在雞胚累代感染過程中，各組群代表株之演化趨勢，以作為台灣雞場H5N2流行時其病毒演化及變異影響之推估模式。

本發明將家畜衛生試驗所提供的六個樣本各6個繼代合計36個禽流感病毒樣本進行純化病毒的以遺傳物質RNA、反轉錄為cDNA。由於禽流感病毒具八段遺傳物質，以通用引子擴增八段病毒的基因，其中八段基因包含：PB1、PB2、PA、HA、NP、NA、M及NS；其基因片段大小依序為：2341bp、2341bp、2233bp、1778bp、1565bp、1413bp、1027bp及890bp，第二圖為031209樣本之擴增結果。

實施例2利用次世代定序技術進行深度定序

本發明將36個樣本進行深度定序，建立生物資訊分析流程將各樣本內含病毒株基因序列解碼，確認樣本所含病毒株變異群組成。本發明採用世界上最廣為使用的Illumina次世代定序技術。其定序原理，首先，將待測DNA打斷成200至700bp的小片段，將轉接序列接於兩端接上。將已接上轉接序列的待定序DNA片段，置入表面帶有互補轉接序列的晶片，透過聚合酶鏈鎖反應進行DNA放大，接著置入依不同鹼基而標記特定且可移除螢光分子的去氧核苷酸材料與反應試劑，反覆進行螢光標記移除、試劑置換與偵測序訊號，以快速讀取大量之定序結果，最後以資訊軟體，分析配對該DNA序列。此外，在2012年，Illumina推出了新型的儀器(MiSeq)與對讀定序方法(paired-end)，使得此技術的定序讀取長度可達2×250bp，每次反應能產生8Gb的定序結果，耗時約2天，錯誤率僅小於1%。

將DNA樣本隨機斷裂成約450bp，利用Illumina MiSeq技術作對樣本作對讀定序(paired-end read)，讀長為2×250bp。將36個樣本分別接上不同密碼(barcode)序列混合定序，每一個樣本的平均定序深度高達5,000倍，增加實驗結果的準確度。

實施例2進行次世代定序結果之生物資訊分析

本發明進行36株病毒株之各八段遺傳物質的序列組裝及基因註釋；並進行36株病毒株之變異點偵測及變異群組分析，在家畜衛生試驗所提供樣本中發現第30繼代至第40繼代的遺傳變異明顯增加，進行病毒株關聯性分析，並篩選可能的病毒分子標記。

2.1病毒株基因序列組裝(assemble)及註釋(annotation)

進行次世代定序結果之生物資訊分析，首先，去除定序品質不佳與Illumina的接頭序列，將每一對reads先組合成一條約450bp長的序列。將樣本序列與雞的基因體序列比對，去除宿主的定序汙染後，分別做de novo組裝及利用已知的流感序列做參考，並進行序列功能註釋。並將序列回貼組裝好的流感基因體來偵測變異點。最後，利用變異點的資訊來計算樣本所含病毒株變異群隨著繼代的組成變化。

2.2病毒株變異點偵測及變異群組成分析

本發明以H5N2禽流感的14日齡雞胚胎繼代培養病毒株(第0代至第50代)，利用次世代定序技術進行全基因組的深度定序，累積病毒的全基因組序列資料分析隨繼代產生變異位點的資料及變異趨勢，對病毒整體族群的變異情形進行檢測與統計。其結果如第三圖定序結果所示，禽流感病毒八段基因的整體變異位點會隨著繼代而增加，其中部分位點突變後會被保留下來，一直存在於病毒族群中，且變異後的族群會隨著病毒累代而增加。以HA基因上的539號鹼基(nt539)與1187號鹼基(nt1187)為例：以031209樣本原始病毒株序列作為模板，與之比對後各病毒株具變異的位點。藍色條帶顯示模板病毒鹼基，紅色條帶為不同病毒株的變異位點。其顯示在原始毒株(E0)時，其原始核苷酸分別為A/G，當病毒繼代至40代(E40)時，病毒毒力明顯增強且此兩位點的變異族群(G/A)也大量增加。

第四圖A至C係為繼代後禽流感病毒株的變異情形統計，淺灰線代表產生的變異的位點在病毒表現群中占的比例，深灰線代表變異點的數量，整體的情況來看，隨著繼代的增長(X軸)，突變的位置越來越多，但是突變在整個族群病毒上的程度卻隨繼代次數而下降；病毒的族群變異與突變量的交會點皆在第40代，顯示病毒繁衍至一定程度時，會產生大幅度的變異。同樣的情況也發生在HA基因(第四圖B)與NA基因(第四圖C)。

第五圖A顯示031209樣本在HA基因在第20與第30繼代在有3個鹼基TAA/GAA(離胺酸(Lysine))的插入；根據過去文獻指出，此區域為HA剪切位(HA cleavage pattern)，此段區域的鹼性胺基酸多寡可能與病毒致病力有相關性。第五圖B顯示在HA基因上的兩個位點，A539G(N171S)、G1187A(V387I)的變化情形。第五圖C所顯示，經次世代定序技術定序後，根據其reads數可估算不同變異族群在整個病毒族群中所占的比例；HA基因上在031209原始病毒株至第50繼代變異點鹼基平均變化比例統計；淺灰色長條為原始鹼基；深灰色長條為變異後的鹼基。

2.3病毒樣本關聯性分析及病毒株分子標記的搜尋

利用次世代定序技術對所有病毒繼代的八段病毒基因序列進行深度定序後，排列出36個病毒株的演化關係。根據HA基因的關聯性分析，如第六圖所示，可將36個病毒株區分為5個族群，其中，031209樣本繼代至第40代後，變異程度增加，使其在演化關係上與040204樣本及040206樣本的原始繼代較為相似。另外，A127樣本的原始繼代與其他病毒株差異較大，而隨著病毒繁衍的代數增加，被歸屬於040111樣本病毒株同個族群，進而可得到與病毒病原性具關連性的分子標記。

本發明在HA基因上選擇兩個位點(A539G及G1187A)作為數位式PCR快速篩檢技術的標的位點，以031209第50代樣本(E50)為例，如第七圖及表二所示，Group A為變異族群；Group B為原始族群；GroupC為NC(Negative Count)；左方為RainDance數位式PCR測試結果；右方為BioRad數位式PCR測試結果。數位式PCR快速篩檢技術在031209第50代定量結果顯示：A539於族群中占34.3%；G539於病毒族群中占65.7%。G1187於族群中占10.0%；A1187於病毒族群中占90.0%。顯示當031209病毒株繼代至第50代時，產生變異的族群占病毒總族群的多數，結果顯示兩組探針都可準確分析族群比例，兩組探針皆通過禽流感病毒株的專一性測試。

實施例3建立數位式PCR檢測方式

本發明先以次世代定序技術對不同病毒株的禽流感病毒進行8段基因的完整深度定序，找出禽流感病毒8段基因上分別可能與病原性指數變化具正相關的變異位點，再根據其核酸變異情形進行分析，進而得到可能與病毒病原性具關聯性的分子標誌。再根據這些位點挑選與病原性指數變化最具相關性的2至8個位點進行探針的設計與合成，並與目前市售兩款數位式PCR(Digital PCR)主要廠商(RainDance與BioRad)合作，分別使用其設備進行優化單組探針以數位式PCR偵測禽流感病毒的檢測條件。

3.1數位式PCR引子設計

本發明挑選數個族群變異數量與病原性指數變化呈顯著正相關性的位點作為開發數位式PCR檢測的分子標誌。數位式PCR是目前最新的核酸偵測技術，可對微量核酸進行定性及定量分析，主要是透過微奈米化技術，將50μL(microliter)的PCR反應體積縮小至5pL(picoliter)液滴中，同時以單分子的形式在不會互相干擾的情形下進行1千萬個PCR反應，透過此特殊的方式可將檢測的靈敏性提高至1/250,000，並藉由引子對的設計可同時偵測多個目標核酸片段。

3.2數位式PCR條件最佳化

本發明進一步行優化確切的定量條件，將進一步開發多價引子試劑套組，提供檢疫單位檢測禽流感病毒變異群比例的技術服務。首先針對各變異點進行單組探針的測試，可準確檢測病毒中各變異族群所占比例。未來，一次實驗即可同時檢測2至8組變異位點的變化，得到快速並準確的病毒族群的組成分析。

本發明之篩選病毒相關變異群變化之分子標記的方法，其係利用最先進的次世代定序技術及生物資訊分析策略，重新對農委會家畜衛生試驗所歷年收集的禽流感病毒樣本進行深度測序及分析，而了解低致病性禽流感病毒如何提升為高致病性的機轉，並且建立一套以數位式PCR技術為基礎的快速精準分析策略，開發更靈敏且準確的檢測方法。

相較於過去的檢測技術，在偵測不同種類之病毒核酸是否存在樣品中，會使用PCR或real-time PCR的技術，而當需偵測微量病毒的核酸序列時，往往會遭遇病毒核酸含量太低、宿主核酸汙染及採樣檢體核酸種類太過複雜等問題，導致使用現在傳統的檢測方式無法有效的偵測病毒。此外，過去的檢測技術僅能檢測出病毒群的基因型態，無法檢測整體病毒族群內微量變異群的族群比例序列資訊。而本發明利用數位式PCR針對禽流感病毒所開發的分子標記，則可有效解決上述的問題。

因此，本發明之方法能早期察覺病毒重要位點的變異及其可能增加致病力與傳播力的潛在危機，同時這些量化數據的彙整將為未來禽流感防疫工作建立一個快速篩選病毒相關變異群變化之分子標記的方法，且其他傳染性病原，如：登革熱病毒及狂犬病病毒等，也可透過此模式進行數位式PCR檢測技術的發展，提升國內對於傳染性疾病的應變能力。

101、102、103、104‧‧‧本發明之步驟

Claims

一種篩選病毒相關變異群變化之分子標記的方法，包含：(a)將一病毒樣本進行一深度定序，其中該病毒樣本係包含一連續繼代感染的病毒樣本，以作為病毒演化及變異影響之推估模式；(b)將該深度定序結果進行一生物資訊分析，其中該生物資訊分析包含一病毒株的序列解碼以及分析該病毒株變異群隨著繼代的組成變化；以及(c)尋找該病毒株變異群中合適的分子標記，其中若該病毒株變異群中具有與病原性指數變化具正相關之一變異；並以數位式聚合酶鏈鎖反應(Digital Polymerase Chain Reaction，Digital PCR)確認產生該變異的族群占一病毒樣本中病毒株變異群的多數，則該變異為合適的分子標記。
如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該深度定序係為次世代定序技術(Next Generation Sequencing，NGS)。
如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該連續繼代感染的病毒樣本係為至少連續繼代約1至50代的病毒樣本。
如申請專利範圍第3項所述之方法，其中該1至50代的病毒樣本中，每10個世代取一個病毒樣本作為代表。
如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該病毒係為禽流感、登革熱或狂犬病。
如申請專利範圍第1項所述之方法，其中以一數位式聚合酶鏈鎖反應(Digital Polymerase Chain Reaction，Digital PCR)建立該合適的分子標記的檢測方法。
如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該步驟(b)的該病毒株序列解碼，包含組裝(assemble)序列及利用已知病毒序列做參考。
如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該步驟(b)分析一病毒株變異群隨著繼代的組成變化，包含偵測該病毒株變異群及分析該病毒株變異群組成。
如申請專利範圍第8項所述之方法，其中該步驟(b)分析一病毒株變異群隨著繼代的組成變化，進一步包含進行該些病毒樣本關聯性分析。
如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該步驟(d)進一步包含進行優化該數位式聚合酶鏈鎖反應的定量條件。