TW201609117A - 促進傷口癒合之製劑及其製備方法及使用方法 - Google Patents
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Abstract
一種促進傷口癒合之製劑,包括細胞培養基,細胞培養基將經轉質的內皮前軀細胞予以培養而形成,且經轉質之內皮前驅細胞為將微小核醣核酸 let-7g 轉質至一內皮前驅細胞而形成,促進傷口癒合之製劑之製備方法包括分離步驟、轉質步驟、及培養步驟,分離步驟為自人類全血分離出單核球細胞,並將單核球細胞種在塗佈有人類纖維連接蛋白之孔盤(human-fibronectin-coated plate)以得到內皮前軀細胞,轉質步驟為將微小核醣核酸 let-7g 轉質至內皮前驅細胞,以得到經轉質的內皮前驅細胞,培養步驟為將經轉質的內皮前驅細胞予以培養一預定時間而得到促進傷口癒合之製劑。
Description
本發明相關於一種醫藥製劑,特別是相關於一種促進傷口癒合之製劑及其製備方法及使用方法。
糖尿病為全球常見的慢性疾病,是一種生物體將葡萄糖(糖類)轉換成能量的方式出現變化的疾病。原因爲身體無法製造足夠的胰島素,或是無法有效利用體內製造的胰島素以進行糖類之轉換。糖尿病易引發多種併發症,其中之一為血管病變。高血糖使紅血球之細胞膜變硬,導致血流不易通過微細血管而到達傷口組織。且,糖尿病患體內的血紅素亦不易釋放出氧氣,而造成傷口組織缺氧以及營養素不足。此外,高血糖亦會影響纖維母細胞以及上皮細胞的增生,因此,糖尿病患之傷口容易停滯在發炎期,而演變成慢性潰瘍。
目前相關於糖尿病患者傷口癒合的治療方式主要包括高壓氧治療、含銀活性碳纖維敷料、以及人類血小板衍生生長因子(platelet-derived growth factor, PDGF)凝膠。高壓氧治療係將病患置於高壓艙內,艙內加壓並維持在2.5絕對大氣壓下,使人經由其頭上所載的氧氣面罩吸取純氣,以提高血中含氧濃度,進而改善組織缺氧、促進傷口癒合、以及增強白血球之殺菌能力。然而此方式可能因高壓造成肺部、耳膜、以及鼻竇的壓力傷害、因高濃度氧氣而造成抽搐、以及治療後因水晶體變腫而導致視力改變。再者,此治療方式對於病患極為不便,因病患無法自行於家中操作。含銀活性碳纖維敷料係由PET不織布、含銀活性碳纖維布、以及聚乙烯(polyethylene, PE)膜三層結構所組成。當敷料接觸傷口滲液時,可藉由活性碳纖維本身良好的吸附性,以吸附血水滲液及細菌。同時,銀離子可破壞細菌的細胞膜及細胞核,而達到殺菌之效果。此外,活性碳纖維之遠紅外線之功能具有促進血液循環以及加速新陳代謝之功效,進而縮短傷口癒合之時間。然而,此產品對於糖尿病患傷口之癒合仍需花費較長的時間。且,將奈米銀粒均勻鍍設於活性碳纖維布上,是一件繁複且加工不易的製作工序,加上奈米銀粒的造價並不便宜,因而導致此產品之成本提高,從而降低商業競爭力。另外,人類血小板生長因子凝膠,含有基因重組的人類血小板源生長因子(Recombinate human platelet-derived growth factor, rh-PDGF),藉由其所含之生長因子以促進傷口癒合,惟其費用昂貴。
因此,本發明的目的即在提供一種促進傷口癒合之製劑及其製備方法及使用方法,能藉由簡易且成本相對較低之製備方法以製備出具有加速傷口癒合之製劑,且此製劑能隨時隨地應用於病患身上。
本發明為解決習知技術之問題所採用之技術手段提供一種促進傷口癒合之製劑,包括細胞培養基(cell culture medium),細胞培養基將經轉質的內皮前軀細胞(endothelial progenitor cell)予以培養而形成,且經轉質之內皮前驅細胞為將微小核醣核酸(microRNA)let-7g 轉質至一內皮前驅細胞而形成。
在本發明的一實施例中係提供一種製劑,細胞培養基於培養內皮前軀細胞之前係為內皮細胞基礎培養基(endothelial basal medium, EBM)。
在本發明的一實施例中係提供一種製劑,更包括至少一種醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。
在本發明的一實施例中係提供一種促進傷口癒合之製劑,賦形劑為一甘油。
本發明為解決習知技術之問題所採用之另一技術手段係提供一種促進傷口癒合之製劑之製備方法,包括以下步驟:分離步驟:自人類全血分離出單核球細胞,並將單核球細胞種在塗佈有人類纖維連接蛋白之孔盤(human-fibronectin-coated plate)以得到內皮前軀細胞;轉質步驟:將微小核醣核酸 let-7g 轉質至內皮前驅細胞,以得到經轉質的內皮前驅細胞;以及培養步驟:將經轉質的內皮前驅細胞予以培養一預定時間而得到促進傷口癒合之製劑。
在本發明的一實施例中係提供一種製備方法,於培養步驟中,將經轉質的內皮前驅細胞之培養係為培養於內皮細胞生長培養基(endothelial growth medium-2, EGM-2)7天,並於第7天將內皮細胞生長培養基更換為內皮細胞基礎培養基,接著持續培養2天以收集內皮細胞基礎培養基而得到促進傷口癒合之製劑。
在本發明的一實施例中係提供一種製備方法,預定時間為6至10天。
在本發明的一實施例中係提供一種製備方法,分離步驟中,藉由梯度劑 Histopaque-1077 以密度梯度離心法自人類全血中分離出單核球細胞。
本發明為解決習知技術之問題所採用之另一技術手段係提供一種促進傷口癒合之方法,包括:將治療有效量之製劑投予至一生物體之傷口。
在本發明的一實施例中係提供一種促進傷口癒合之方法,生物體為一患有糖尿病之患者。
經由本發明所採用之技術手段,在本發明中,特別選用內皮前驅細胞以及微小核糖核酸let-7g以共同製備出促進傷口癒合之製劑。其係因內皮前驅細胞具有分化成血管內皮細胞,以修復不完整的血管內皮層,以及促使血管新生之能力。而微小核醣核酸中 let-7g 則在過往研究發現其可保護血管內皮細胞,治療及預防血管硬化等疾病。
藉由將 let-7g 轉質入內皮前驅細胞,以調控內皮前驅細胞之表現,並培養此經轉質 let-7g 之內皮前驅細胞,使內皮前驅細胞釋放出具有加速傷口癒合之因子至培養基中。此培養基不僅具有良好的治癒傷口之效果,且,製備方法簡單,所費的時間及成本皆不高,因此可普遍地應用於傷口不易癒合之患者,例如糖尿病患,而不增加病患於經濟上之壓力。此外,本發明之製劑之使用方法為直接將製劑施用於病患之傷口處,操作方式簡便而可隨時隨地使用。
以下根據第1圖,而說明本發明的實施方式。該說明並非為限制本發明的實施方式,而為本發明之實施例的一種。
依據本發明的一實施例的一促進傷口癒合之製劑,包括細胞培養基(cell culture medium),細胞培養基將經轉質的內皮前軀細胞(endothelial progenitor cell)予以培養而形成,且經轉質之內皮前驅細胞為將微小核醣核酸(microRNA)let-7g 轉質至一內皮前驅細胞而形成。
詳細而言,細胞培養基於培養內皮前軀細胞之前為內皮細胞基礎培養基(endothelial basal medium, EBM),用以特別培養內皮前軀細胞。
為了使本發明之促進傷口癒合之製劑穩定性佳、應用範圍廣泛、或減少其刺激性等因素,本發明之製劑更包括至少一種醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。舉例而言,將一甘油添加至製劑中,藉由甘油之黏性使得原本為液態之製劑轉變為半流體,以便於本製劑應用在外敷之用途上。
在本實施例中,促進傷口癒合之製劑之製備方法,包括以下步驟: (1) 分離步驟:自人類全血分離出單核球細胞,並將單核球細胞種在塗佈有人類纖維連接蛋白之孔盤(human-fibronectin-coated plate)以得到內皮前軀細胞(步驟S1); (2) 轉質步驟:將微小核醣核酸let-7g轉質至內皮前驅細胞,以得到經轉質的內皮前驅細胞(步驟S2);以及 (3) 培養步驟:將經轉質的內皮前驅細胞予以培養一預定時間而得到促進傷口癒合之製劑(步驟S3)。
詳細而言,在本實施例中係藉由梯度劑Histopaque-1077以密度梯度離心法自人類全血中分離出單核球細胞以得到內皮前軀細胞。將10ml之梯度劑Histopaque-1077以及10ml之人類全血加入50c.c.之離心管中均勻混合後,以700g之離心速度將其離心30分鐘,離心後收集含有高濃度之單核球細胞之棕黃層(buffy-coat layer)。接著,將棕黃層懸浮於30ml的 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)中,以250g之離心速度將其離心10分鐘,捨棄上清液且保留細胞團塊,再將細胞團塊懸浮於 DMEM 中並予以離心,並重複此步驟2~3次以得到單核球細胞團塊。最後,將單核球細胞團塊回溶於內皮細胞生長培養基-2(Endothelial Cell Growth Medium-2, EGM-2),以3x106
cells/ml之密度種在塗佈有人類纖維連接蛋白之孔盤以得到內皮前軀細胞。
於轉質步驟中,將75ng的let-7g稀釋在100μl之培養基中,並將之震盪以均勻地混合。接著,加入3μl之轉質液至經稀釋之 let-7g,均勻混合後置於15~25℃之環境下5~10分鐘以形成轉質複合物。將轉質複合物加到內皮前軀細胞,靜置3小時後,再加入培養基以完成轉質。
於培養步驟中,將經轉質 let-7g 的內皮前驅細胞培養於內皮細胞生長培養基7天,並於第7天將內皮細胞生長培養基更換為內皮細胞基礎培養基,接著持續培養2天以收集內皮細胞基礎培養基而得到促進傷口癒合之製劑。當然,本發明不以此為限。根據細胞狀況、轉質效率或實驗上等需求,經轉質的內皮前驅細胞之培養時間可為6至10天。
本發明之促進傷口癒合之製劑用於促進傷口癒合的方法為將治療有效量之製劑或經添加載劑、稀釋劑或賦形劑之製劑投予至一生物體之傷口,其中,生物體可為一患有糖尿病之患者。
以下為將本發明之促進傷口癒合之製劑用於治療糖尿病小鼠之實驗。此實驗之主要流程係包括糖尿病動物模型之建構、糖尿病動物傷口模型之建構、糖尿病動物傷口之治癒、以及統計分析。
首先,利用鏈脲佐菌素(streptozotocin, STZ)具有對胰島β細胞之破壞作用,誘發C57BL/6Jk的小鼠其糖尿病之產生。在本實施例中,將鏈脲佐菌素以50mg/kg之劑量注射於8至12週的小鼠腹膜內連續7天,並控制小鼠之血糖濃度在150~200mg/dL。20隻小鼠經誘發糖尿病後,其中6隻小鼠歸為EBM組、7隻小鼠歸為let-7g(-)-EPC組、以及7隻小鼠歸為let-7g(+)-EPC組總共3個組別以進行接下來的實驗。詳細而言,EBM組為以內皮細胞基礎培養基處理糖尿小鼠之傷口;let-7g(-)-EPC組為利用經培養內皮前軀細胞之培養基處理糖尿病小鼠之傷口;let-7g(+)-EPC組則為利用經培養經轉質 let-7g 之內皮前軀細胞之培養基處理糖尿病小鼠之傷口。
請同時參照第2圖,糖尿病小鼠之模型建構完後,糖尿病小鼠其背部欲形成傷口之部位的毛係為被剃掉,並予以消毒。利用6-mm之穿刺活體細胞工具於小鼠背部製造出兩個左右對稱且深度達肉層(Panniculus carnosus)之傷口。將環狀矽片夾板放置並固定於傷口外圍,並以封閉敷料(occlusive dressing)覆蓋於傷口表面。
糖尿病小鼠之傷口建立完成後,分別將50μl的內皮細胞基礎培養基、經培養內皮前軀細胞之培養基、以及經培養經轉質let-7g之內皮前軀細胞之培養基與甘油以1:1之比例混合,並將上述三種培養基分別用以處理EBM組、let-7g(-)-EPC-CM組、以及let-7g(+)-EPC-CM組之小鼠之右邊傷口而作為實驗組,左邊的傷口則未經任何處理,使之自然癒合而作為控制組,控制組係用以與實驗組相比較其傷口癒合之速率。處理頻率為每天,實驗之進行直至傷口完全癒合或其它因素而結束。
本發明之促進傷口癒合之製劑用於糖尿病小鼠傷口之實驗進行至9天各組之傷口癒合程度已有顯著性差異,故在所預期停止實驗之時間前即停止本實驗。
本實驗係藉由數位影像器材每天拍攝小鼠傷口區域之影像,並利用image-J分析系統計算傷口區域之像素以得到傷口殘餘率、傷口癒合速率、及傷口癒合速率差。傷口殘餘率為將每日的傷口面積除以原始傷口面積。傷口癒合速率為以100%減掉傷口殘餘率。傷口癒合速率差為控制組與實驗組其傷口癒合速率相減的絕對值。
如第3圖所示為實際拍攝各組小鼠傷口癒合狀況之圖片,可觀察到let-7g(+)-EPC-CM組中的實驗組其小鼠傷口癒合程度最為良好。
如下表1所示,其為利用 McNemar 檢定以個別分析三個不同組別其控制組及實驗組之傷口癒合速率,可得知無論是EBM組、let-7g(-)-EPC-CM組、或是let-7g(+)-EPC-CM組的實驗組,相較於控制組皆有較高的傷口癒合速率。 【表1】
下表2所示為藉由Kruskal-Wallis檢定以比較EBM組、let-7g(-)-EPC-CM組、以及let-7g(+)-EPC-CM組的三個控制組之傷口癒合速率以及比較其三個實驗組之傷口癒合速率,可得知其皆有顯著性差異。其係因雖然控制組之傷口未經任何處理而採自然癒合方式,然而於實驗組所施用之培養基,其一部分仍可經由周邊循環吸收到體內,進而影響遠處(控制組)的傷口癒合。 【表2】
為了進一步比較EBM組、let-7g(-)-EPC-CM組、與let-7g(+)-EPC-CM組之治癒效果,下表3~6為藉由 Kruskal-Wallis 檢定及 Mann-Whitney(M-W U)檢定以分析三個組別以及三個組別中兩兩為一組之傷口癒合速率差。同時搭配第4圖所示之EBM組、let-7g(-)-EPC-CM組、以及let-7g(+)-EPC-CM組之傷口癒合速率差之趨勢,可得知let-7g(+)-EPC-CM組之糖尿病小鼠其傷口治癒效果最為良好,而EBM組則為最差。亦即,經培養經轉質let-7g之內皮前驅細胞之培養液具有最佳促進傷口癒合之效果。 【表3】【表4】【表5】【表6】
以上之敘述以及說明僅為本發明之較佳實施例之說明,對於此項技術具有通常知識者當可依據以下所界定申請專利範圍以及上述之說明而作其他之修改,惟此些修改仍應是為本發明之發明精神而在本發明之權利範圍中。
S1‧‧‧分離步驟
S2‧‧‧轉質步驟
S3‧‧‧培養步驟
S2‧‧‧轉質步驟
S3‧‧‧培養步驟
第1圖為顯示根據本發明的一實施例的一促進傷口癒合之製劑的流程圖。 第2圖為顯示根據本發明的實施例的一促進傷口癒合之製劑用於一測試糖尿病小鼠傷口癒合表現之實驗中,糖尿病小鼠之傷口建構的示意圖。 第3圖為顯示根據本發明的實施例的促進傷口癒合之製劑用於測試糖尿病小鼠傷口癒合表現之實驗中,各組糖尿病小鼠傷口癒合程度之實際影像圖。 第4圖為顯示根據本發明的實施例的促進傷口癒合之製劑用於測試糖尿病小鼠傷口癒合表現之實驗中,各組糖尿病小鼠傷口癒合速率之趨勢的折線圖。
S1‧‧‧分離步驟
S2‧‧‧轉質步驟
S3‧‧‧培養步驟
Claims (10)
- 一種促進傷口癒合之製劑,包含細胞培養基(cell culture medium),該細胞培養基係將經轉質的內皮前軀細胞(endothelial progenitor cell)予以培養而形成,且該轉質之內皮前驅細胞係為將微小核醣核酸(microRNA)let-7g轉質至一內皮前驅細胞而形成。
- 如請求項1所述之製劑,其中該細胞培養基於培養該內皮前軀細胞之前係為內皮細胞基礎培養基(endothelial basal medium, EBM)。
- 如請求項1所述之製劑,更包括至少一種醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。
- 如請求項3所述之製劑,其中該賦形劑係為一甘油。
- 一種促進傷口癒合之製劑之製備方法,包含以下步驟: 分離步驟:自人類全血分離出單核球細胞,並將該單核球細胞種在塗佈有人類纖維連接蛋白之孔盤(human-fibronectin-coated plate)以得到內皮前軀細胞; 轉質步驟:將微小核醣核酸 let-7g 轉質至該內皮前驅細胞,以得到經轉質的內皮前驅細胞;以及 培養步驟:將經轉質的該內皮前驅細胞予以培養一預定時間而得到該促進傷口癒合之製劑。
- 如請求項5所述之製備方法,其中於培養步驟中,將經轉質的該內皮前驅細胞之培養係為培養於內皮細胞生長培養基(endothelial growth medium-2, EGM-2)7天,並於第7天將該內皮細胞生長培養基更換為內皮細胞基礎培養基,接著持續培養2天以收集該內皮細胞基礎培養基而得到該促進傷口癒合之製劑。
- 如請求項5所述之製備方法,其中該預定時間係為6至10天。
- 如請求項5所述之製備方法,其中於該分離步驟中,係藉由梯度劑Histopaque-1077 以密度梯度離心法自該人類全血中分離出該單核球細胞。
- 一種促進傷口癒合的方法,包含:將治療有效量之如請求項1所述之製劑或如請求項3所述之製劑投予至一生物體之傷口。
- 如請求項9所述之方法,其中該生物體係為一患有糖尿病之患者。
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