TW201519916A - 複合水膠材料及其製備方法 - Google Patents

Abstract

本發明揭示一種具可吸收性，由明膠與聚麩胺酸鹽類形成之複合水膠材料及其製備方法，經處理與原花青素及其多酚類衍生物交聯。本發明可在前述製程中或材料完成後添加，並可將藥物或生長因子附加上去。本交聯明膠與聚麩胺酸鹽材料具備生物相容性與生物可降解性，可用於植入人體或用於體表作為敷料、植入體內或應用於組織工程。

Description

複合水膠材料及其製備方法

本發明係以天然交聯劑原花青素低聚物進行明膠混合聚麩胺酸鹽處理。

傷口癒合是一個複雜的生物學過程，包括血液凝固，炎症，纖維組織增生，膠原沉積，和傷口收縮。傷口癒合的過程可分為三個階段，分別是發炎期、增生期和成熟期，發炎期的傷口，白血球會穿透血管聚集，並且釋放自由基攻擊外來物質，分解產生抗體以進行更進一步的免疫反應，但過多不穩定的自由基會破壞細胞組織，進而使發炎反應過度發生，造成傷口癒合的速度減慢、以及皮膚紅腫等不適症狀。在1963年Hinman和Meibach的研究指出：傷口保持潮濕的環境癒合速度較快。而許多後來的研究亦表明，潮濕的環境的確有利於傷口癒合，而能夠含水占總重量達20%以上的水膠(hydrogel)，便吸引許多人投入其應用在傷口癒合敷材上的研究。水膠可以廣泛的的定義為：一種能吸取大量水分的三維網狀高分子，水膠因本身具有親水性的官能基，如：-OH、-CONH、-CONH₂及-COOH等，這些官能基能在水中能以氫鍵鍵結的方式抓取水分子，進而使這些高分子在水中能產生水合作用而形成水合的骨架，一方面會大量抓取水分子，另一方面維持網狀結構，所以水膠結構中能夠保持相當高比例的水含量，即 所謂的〝膨潤現象〞(swelling)。常見的水膠(Hydrogel)的交聯方式可以分為兩種：物理以及化學製法。物理方法中，最常用的是利用高能的EB射線(electron bean irradiation)及γ-射線(γ-irradiation)把一般的化學結構諸如R-OH,R-CH₃,R-NH₂等，斷鍵變成游離基(free radicals)如‧OH,H‧,R-CH₂,R-NH等，這些游離基因高能而不穩定，很容易再攻擊其他化學結構而重新構成安定的新鍵結(random cross-linking)。交聯後水膠的結構特性及之吸水速率、保水和緩釋等功能，會受到放射能劑量、高分子濃度、水溶液中含氧(dissolved O₂)、酸鹼度(pH)、溫度、成分純度以及金屬離子濃度之影響。化學方法分為使用化學架橋劑以及天然交聯劑，常用的化學架橋劑主要有：(1)醛類：如甲醛(formaldehyde)、戊二醛(glutaraldehyde)(2)碳化二亞胺類：如EDC(1-ethyl-3-(3-dimethyl amino-propyl)carbodiimide)(3)環氧化合物：如聚乙烯醚之環氧樹脂((polyethylene glycol)diglycidyl ether,PEGDE)，對於L929細胞相對毒性依序為：甲醛>戊二醛>EDC>PEGDE。其中PEGDE之細胞毒性最小。傳統化學架橋劑本身是化學合成，植入人體後會刺激局部組織產生長時間的炎症反應，而且在體內不易降解，其細胞毒性大。近年來以環烯醚萜類和多酚類化合物為代表的天然交聯劑克服了傳統化學交聯劑生物相容性差的缺點。而為了提高傷口復原速度，近年來水膠的設計上會以模擬細胞外基質(extracellular matrix,ECM)為目標，以交連劑交連後形成的水膠敷於傷口表面。由於水膠材質含有大量水分，可充當為細胞外基質，所以細胞會進入水膠網狀結構中，並使水膠產生降解，和新生皮膚層合而為一。若要成為一個理想的皮膚傷口敷料，則必須具有以下特點：1.良好吸水性；2.具 有透氣性；3.具有抗菌性；4.可促進傷口癒合的能力；5.易剝離性。因此本實驗在材料的選擇上選用了生物相容性及可利用性佳的明膠(Gelatin)為主體，但由於明膠通常是透過有毒的交聯劑來交聯，導致具有一定細胞毒性的問題。此外，明膠的凝膠具有一定的缺點，因沒有足夠的靈活性和水的吸收能力，不利於傷口癒合，而且很容易受到細菌汙染而導致傷口惡化，因此需要找尋其他方法來改善其缺點。

本發明主要係促進材料與活體組織之間的作用的材料，使材料在體內被吸收的過程中，新生組織亦可逐步取代，進而使缺陷部位癒合。此研究中，將具有凝膠特性的明膠，結合有著高吸水及保濕性的聚麩胺酸鹽，並利用具有強抗氧化性的原花青素進行交聯反應，製成天然高分子共聚物水膠，使之具有高吸水、保濕、抗氧化性，並應用於創傷敷料。

一般常見明膠通常是透過有毒的交聯劑來交聯，導致具有一定細胞毒性的問題。然而，此發明所製得之可吸收性的明膠水膠並非使用常用之化學交聯劑，而是使用多酚類化合物為代表的天然交聯劑，因此所製出的可吸收性的明膠水膠為半透明狀，表面平整且厚度均一且不具有氣泡，同時具有很好之抗拉張強度、良好的生物相容性及極佳的膨潤性等特性，因此可達到大量吸收傷口滲出液之目的，進而加速組織癒合，故可應用傷口癒合敷材、可降解體內臟器止血水膠、皮下軟組織填充材等。此發明所製出之可吸收性的γ-聚麩胺酸鹽與明膠經原花青素交聯之水膠，不會像化學交聯劑所製出明膠水膠容易造成生物毒性或體內不易降解甚至引起發炎情況的發生。

我們選擇使用天然來源的生醫材料，具有生物相容性(biocompatibility)而可被植入或結合入活體系統中，以用來取代或修補活體系統的一部分，或者直接與活體接觸而執行其生命功能。而此實驗著重於可降解性傷口敷材，一方面期望可以吸收傷口初期產生的大量滲出液，另一方面希望可以保有傷口回復時所需的良好的濕潤環境，以及控制自由基含量避免發炎情況過度發生。因此本研究天然交聯劑(naturally occurring cross-linking agent)-葡萄子萃取物低聚合原花青素(oligomeric proanthocyanidins,OPCs)來作為交聯明膠的交聯劑，使用的明膠為type A型來源為豬皮。材料成分皆因天然物較不易對人體產生排斥且毒性更較戊二醛低。

明膠具有良好的物化性質可廣泛的應用於醫藥工業和臨床治療中，在物理方面，抗張強度高，具有相似於真皮的構形，而且透水、透氣性佳，但因延展性低，易乾裂；而化學方面，可以藉由適度交聯，來控制其溶解性，且可與藥物相互作用；另外在生物學方面：生物相容性好，更具有凝血作用，增加它在創傷敷料領域的可用性，而且明膠無抗原性、易於吸收，理應是敷料材的首選。但因其存在不耐水解、環境潮濕的話容易受細菌侵蝕而變質，成膜後質地易碎、機械性質差等缺點而限制了其在敷料應用的範圍。也因此，有越來越多關於明膠用於敷料的研究聚焦在明膠和其它聚合物的添加，其中包括人工合成聚合物與天然聚合物，其中天然聚合物具有低毒性、生物相容性好以及環保等優點，這些是合成聚合物所無法比擬的。

γ-聚麩胺酸在pH 2.0時為α-helix的結構，具有4種同分子 內氫鍵(inter-carboxyl hydrogen bonding)，此氫鍵極強，使得γ-聚麩胺酸之α-helix結構變得緊密堅固，同時不溶於水。但當pH升高或者α-COOH上的H被金屬離子置換成鹽類時，氫鍵即消失，α-helix之結構即展開呈線性，而成為帶陰電性(polyanionic)的親水性表面，水溶性大幅增加，而本次實驗所選擇的兩種γ-聚麩胺酸鹽類(鈉鹽及鈣鹽)，即是想利用此特點提升水膠敷料協助傷口復原的能力。

添加原花青素(OPCs)做為交聯劑使其薄膜表面具有的官能基減少，因此相較於Col film略呈疏水性，隨著添加的濃度越高，而使薄膜越為疏水性，但是當濃度超過10.0%以上時，會促使薄膜略為親水，是因為過多的OPCs接枝於膠原分子表面，而過多的交聯劑會影響水珠的完整性，或許因為OPCs的分子式中含有氫氧官能基(-OH)，所以過量的OPCs反而會使氫氧官能基(-OH)容易影響薄膜的疏水性，使得再生膜略為親水性，而讓水分子較為容易貼附於薄膜表面，進而提高生物的相容性。

材料設計上，我們發現設計添加OPCs，以期加強水膠強度和降低自由基達到傷口發炎程度的效用，從膨潤度測試依然可達到600%以上，而抗降解能力更提升到21天還能有60%的材質存在，預期能夠有效吸收創口初期大量滲出液並保留血液中有助於傷口回復的生長因子之目的。

從Ninhydrin交聯指數分析和DPPH的自由基清除測試皆顯示OPCs的添加具有提升交聯性和抗自由基的能力(自由基清除率達到90.36%以上)，而從抗拉測試亦顯示隨著OPCs的量增加，機械性質皆逐漸提升(楊式模數達到43.58KPa)。

生物性質探討方面，則使用老鼠纖維母細胞(L929)來進 行體外細胞實驗。細胞活性測試方面，都顯示添加10% OPCs的PGO水膠擁有並不具生物毒性，且進行血液相容性測試也顯示不具溶血反應。在綜合這些機械和體外測試比較可以得到，10% OPCs為最適當的添加量。

活體實驗方面，將PGO10%材質以侵入情況最輕微的皮膚刺激、過敏極大化、到最嚴重的傷口癒合等逐一測試。結果顯示經過14天的皮膚接觸觀察皆無紅腫現象。而過敏極大化測試的考驗期過後48小時觀察，亦皆無任何過敏反應。從直徑3cm傷口癒合測試中顯示，PGO 10%水膠具有加速創傷癒合的能力，並且在最後傷口縮減(傷口縮口率達90.03%以上)及回復狀況皆比僅用市售產品3M Tegaderm^TM明顯。而進一步的病理切片染色觀察到，在第14天的發炎細胞數量明顯較市售產品來的更低。

綜合以上結果可以發現，PGO水膠，在膨潤度、降解度、消除自由基、in vitro以及in vivo測試中，均表現出十分優異的性質，符合本實驗最初的構想，故此PGO水膠在不論是在外在皮膚或體內創口的應用中，具有很大的潛力。

γ-聚麩胺酸鹽與明膠水膠之製備(PG)‧‧‧本實驗利用PG做為對照組，取二次水，分別配置5wt%聚麩胺酸鹽及5wt%明膠，加熱至45℃攪拌溶解。再將聚麩胺酸鹽溶液與明膠溶液混合攪拌均勻。將上述溶液倒入直徑約3cm的模具固定形狀、於37℃烘乾一天，即可得到γ-聚麩胺酸鹽與明膠水膠

低聚合原花青素(oligomeric proanthocyanidins,OPCs)‧‧‧低聚合原花青素(oligomeric proanthocyanidins,(OPCs))是屬於類黃酮族群之天然色素，廣泛存在於蔬果花卉中，在酸性環境下相當穩定，並且在許多研究中皆顯示花青素已被證實是一種能夠對抗體內過多自由基的天然成份強效的抗氧化劑(抗氧化能力約是維他命E的50倍)，能維持正常的細胞連結、血管的穩定、增進微細血管循環、提高微血管和靜脈的流動，並且能跟膠原蛋白結合，強化結締組織，避免人體受到某些酵素的破壞，特別是專門破壞膠原蛋白的膠原酶(collagenase)

γ-聚麩胺酸鹽與明膠經原花青素交聯之水膠(PGO)‧‧‧ 將配置好的γ-聚麩胺酸鹽與明膠溶液，加入已預熱至45℃原花青素溶液(5wt%,in 5% Citric acid solution)依照不同添加比例(5wt%、10wt%、15wt%)，緩緩加入PG溶液後，於45℃下攪拌30分鐘。將上述溶液倒入直徑約3cm的模具固定形狀、於37℃烘乾一天

圖示為一實施例之參考流程。

本發明將用以下之實例做進一步之說明，但本實例只是此發明中的一部分，並不應該將這些實例作為本發明之限制。

取二次水，分別配置5wt%聚麩胺酸鹽及5wt%明膠，加熱至 45℃攪拌溶解。再將聚麩胺酸鹽溶液與明膠溶液混合攪拌均勻。

將配置好的γ-聚麩胺酸鹽與明膠溶液，加入已預熱至45℃原花青素溶液(5wt%,in 5% Citric acid solution)依照不同添加比例(5wt%、10wt%、15wt%)，緩緩加入PG溶液後，於45℃下攪拌30分鐘。將上述溶液倒入直徑約3cm的模具固定形狀、於37℃烘乾一天，即可得γ-聚麩胺酸鹽與明膠經原花青素交聯之水膠。

Claims (9)

1. 一種以原花青素及其多酚類衍生物交聯之明膠混合聚麩胺酸鹽與其複合物，以及其製備方法。此材料具備生物相容性與生物可降解性，可用於植入人體或用於體表作為敷料、植入體內或應用於組織工程。
2. 如申請專利範圍第一項之原花青素，包括花青素、兒茶素及其多酚類衍生物。
3. 如申請專利範圍第一項之製備方法，包括原花青素與明膠混合聚麩胺酸鹽的前處理，其處理包括原花青素在酸性溶液中的分散，以及明膠混合聚麩胺酸鹽溶液的製備。
4. 如申請專利範圍第三項之原花青素分散，其溶液可為pH值介於1~7間之無特定濃度酸性至中性溶液，可為有機酸與無機酸與其緩衝溶液，其中以檸檬酸為最佳。
5. 如申請專利範圍第三項之明膠混合聚麩胺酸鹽溶液的製備，其溶液可為pH值介於1~7間之無特定濃度酸性至中性溶液，可為有機酸與無機酸與其緩衝溶液，並可添加醇類，其中以異丙醇為最佳。
6. 如申請專利範圍第四項與第五項之原花青素溶液以及明膠混合聚麩胺酸鹽溶液，將其均勻混合，於非特定溫度進行交聯反應。於非特定時間反應後即可製成以原花青素及其多酚類衍生物交聯之明膠混合聚麩胺酸鹽材料。
7. 如申請專利範圍第六項之反應後，可以自然蒸發、抽真空、冷凍乾燥等不特定手段去除液體以製成乾燥之材料。
8. 如申請專利範圍第一項之原花青素交聯之明膠混合聚麩胺酸鹽與其複合物，可在前述製程中或材料完成後添加鹽類而形成之複合材料，並可將藥物或生長因子附加上去。
9. 如申請專利範圍第一項之原花青素交聯之明膠混合聚麩胺酸鹽與其複合物，具有生物相容性、生物可降解性，可用於植入人體或用於體表作為敷料、植入體內或應用於組織工程。