TW201516155A - 高通量篩選高表現細胞之方法及由其篩選之細胞 - Google Patents
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Abstract
本發明提供一種方法高通量篩選高表現細胞之方法,其係利用自我處理裂解位置連接蛋白質與穿膜蛋白序列,藉由自我處理裂解位置之抑制劑的添加,可以調控蛋白質分泌或表現於細胞膜上。接著利用檢測技術即可快速且高通量篩選出高表現之細胞株。本發明另提供用於該方法之重組核苷酸序列及載體以及由該方法篩選出之細胞。
Description
本發明係關於一種重組核苷酸序列及利用該重組核苷酸序列高通量篩選高表現細胞之方法。特定言之,本發明係關於包含自我處理裂解酶(self-processing cleavage enzyme)位置之重組核苷酸序列及應用其高通量篩選高表現細胞。
高通量技術已成為醫藥及生物科技研究上重要的工具。
以哺乳動物細胞生產重組蛋白質藥物已是目前生物製藥的主流技術。雖然細胞株提供研究者生產大量特定蛋白質的機會,此等細胞株並非經常是有效的蛋白質生產者。一些細胞轉殖株僅生產低於最適量的蛋白質;其他細胞轉殖株可生產最適量的蛋白質表現,但由於結構錯誤形成或不適當的轉錄後修飾,而無法生產具完全功能性的蛋白質。
雖然已有多種可篩選高蛋白質產量細胞株的方法,但是仍然存在諸多缺失,例如:
(1)單一細胞株分離法:為傳統篩選高產能之重組蛋白分泌細胞的方法,必須先分離培養單株細胞,再逐一以ELISA分析細胞培養液中重組蛋白質之濃度,在人工方式操做下,可分析的細胞數目有限、過程耗時。
(2)表現報告基因:讓細胞共同表現重組蛋白質與報告基因(例如:綠色螢光蛋白、膜蛋白CD20),藉由FACS分析報告基因的表現量篩選重組蛋白分泌細胞。然而,目前仍缺乏適用於各種細胞之報告基因,綠色螢光蛋白會造成細胞毒性、CD20則進適用於CD20缺乏的細胞株,此外,細胞內報告基因與重組蛋白質為不等量表現,偵測報告基因之表現量無法代表細胞重組蛋白的相對產能。
(3)低溫捕捉:利用4℃低溫使分泌的重組蛋白暫時呈現於細胞表面,但此方法僅被使用於分泌抗體的細胞。
(4)GPI-固定的融合蛋白(GPI-anchored fusion protein;GPI:Glycosylphosphatidylinositol):再重組蛋白C端建構GPI-錨定的序列,使重組蛋白經過後轉譯修飾產生GPI-錨定鑲嵌於細胞膜上,幫助FACS偵測之。然而此方法必須以酵素磷脂醯肌醇-專一性磷脂酶C(phosphatidylinositol-specific phospholipase C;PI-PLC)切斷GPI-錨定才能夠得到游離的重組蛋白。
(5)膠體微滴技術(gel microdrop technology):利用生物素化的瓊脂糖(biotinylated argarose)將蛋白質分泌細胞包裹成液滴狀(gel microdrop),使分泌之重組蛋白滯留於膠體微滴中,再以多重免疫螢光標定重組蛋白,搭配FACS篩選高螢光強度膠體微滴得到高分泌型細胞。膠體微滴須以特殊儀器製作,而每個液滴內僅占有一個細胞的機率極低,更需要多重抗體標定才能進行偵測,儀器不普及、成本高且做法繁複。
(6)基質為主的分泌分析:不同於膠體微滴,此方法直接將細胞修飾上生物素,培養在高黏性的培養液中,使細胞分泌之重組蛋白累積於細胞周圍,再以再以多重免疫螢光標定重組蛋白,以
FACS篩選具高螢光強度之高分泌型細胞。此方法仍須以較為繁複的多重抗體標定重組蛋白才能進行偵測,成本較高。
因此,仍須要一種方便、高效率的篩選技術以快速篩選高蛋白質產能之細胞株。
使用哺乳動物細胞表現重組蛋白質藥物,因其具有後轉譯修飾及醣基化修飾之能力,能穩定重組蛋白質結構與功能,確保產品之品質及適用性。然而,培養哺乳動物細胞的成本高昂,因此必須控制使用於蛋白質表現階段之哺乳類細胞為高表現之單一細胞株。因此,本發明開發容易操作、可搭配FACS高通量篩選高產能、高功能細胞株或提升或改變重組蛋白質功能細胞株的篩選平台。本發明所篩選出之細胞株無須後續處理,即可直接大量分泌重組蛋白質,加速且提升重組蛋白質藥物之產量,以供應市場需求。
在一方面,本發明提供一種帶有可檢測標籤之重組核苷酸序列,其包含,5’至3’的方向,編碼一蛋白質或多肽之第1序列;編碼自我處理裂解酶(self-processing cleavage enzyme)位置之第2序列及編碼細胞外-穿膜區域之第3序列,其中該第2序列位於第1序列與第3序列之間,及其中該可檢測標籤位於第1序列或第3序列。
本發明重組核苷酸序列之第1序列、第2序列及第3序列係以5’至3’的方向連接,其中該第2序列位於第1序列與第3序列之間。
該編碼蛋白質之第1序列係指編碼任何擬由本發明細胞生產之蛋白質或多肽。例如,但不限於,抗體cDNA基因庫、抗體、抗原、免疫調節蛋白、抗生素、蛋白疫苗、生長因子及細胞激素等。
自我處理裂解位置為轉錄後(post-translational)或共轉錄(co-translational)處理裂解位置該編碼蛋白質之第2序列為該編碼
自我處理裂解位置(self-processing cleavage site)序列,其為一DNA序列,其編碼自我處理裂解位置或序列,其一旦轉錄,可調控包含該自我處理裂解位置之蛋白質或多肽之快速細胞內裂解,以產生不連續的成熟蛋白質或多肽。;只要是真核細胞的內蛋白酶(endoprotease)均具有自我處理裂解位置,而可用於本發明。具體言之,任何存在於反式高爾基氏網(trans-Golgi network)內的任何蛋白酶及其相對應之切位片段即可作為本發明之自我處理裂解位置。較佳地,該自我處理裂解位置序列可為,但不限於,Furin共同序列RXK(R)R、Furin裂解序列RAKR、Xa因子裂解序列或位置IE(D)GR、序號肽I裂解序列或位置LAGFATVAQA、凝血酶裂解序列或位置LVPRGS或反式高爾基氏網(trans-Golgi network)內的原蛋白轉變酶族(proprotein convertase family)中的PC1/3、PC2、PACE4、PC5。較佳地,該自我處理裂解位置序列為Furin共同序列RXK(R)R、Furin裂解序列RAKR。該Furin裂解位置具有RXK(R)R之共同序列(consensus sequence)。該Furin裂解位置可被類類枯草菌素蛋白酶(subtilisin-like proteases)裂解,如furin及其他絲胺酸蛋白酶。
該編碼蛋白質之第3序列為細胞外-穿膜區域,其為穿膜蛋白肽鏈穿過膜脂雙層的區段。任何細胞外-穿膜區域皆可用於本發明。
本發明重組核苷酸序列帶有檢測標籤。該檢測標籤可為螢光標籤、放射線標籤(radiolabel)或抗原標籤。較佳地,該檢測標籤可為螢光標籤。
本發明重組核苷酸序列係使用已知之分子生物學技術構築,例如Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(2nd edition,Coldspring Harbor Laboratory Press,Plainview,N.Y.
(1989))。
在另一方面,本發明提供一種包含本發明重組核苷酸之載體。該載體可為任何DNA或RNA分子,如質體、病毒或其他載體,其含有本發明之重組核苷酸序列。該載體可藉由嵌入宿主細胞之基因組或存在於細胞中而轉形至宿主細胞。本發明載體可包含額外元件,例如,啟動子及轉錄調控序列等表現元件。可有效將核酸導入細胞而使蛋白質或多肽表現的任何適合載體均可用於本發明方法。
在另一方面,本發明提供一種高通量篩選具表現蛋白質的細胞之方法,其包括下列步驟:(a)構築包含帶有可檢測標籤之重組核苷酸序列之載體,該載體包含,5’至3’的方向,編碼蛋白質或多肽之第1序列;編碼自我處理裂解位置(self-processing cleavage site)之第2序列及編碼細胞外-穿膜區域之第3序列,其中該第2序列位於第1序列與第3序列之間,及其中該可檢測標籤位於第1序列或第3序列;(b)以(a)之載體轉染細胞;(c)添加自我處理裂解酶抑制劑使(a)載體中之重組核苷酸序列之表現產物暫時性錨定於細胞表面;及(d)測定可檢測標籤以篩選表現錨定於細胞表面之重組蛋白之細胞以得到具表現之蛋白生產細胞。
本發明方法係利用自我處理裂解位置(例如furin蛋白酶切位片段(RAKR))連接蛋白質與穿膜蛋白序列,藉由自我處理裂解位置之抑制劑的添加與否,可以調控重組蛋白質分泌或表現於細胞膜上。接著利用檢測技術(例如利用流式細胞儀),即可快速且高通量篩選出高蛋白質產能、表現抗原專一性/高親和性抗體、或表現高功能性重組蛋白質之細胞株。
本發明方法係將如前述之載體轉染至真核細胞以進行表現,基於擬生產之蛋白質或多肽而選用適當的細胞進行轉染。該細胞包括,但不限於,昆蟲細胞、動物細胞、植物細胞及酵母菌細胞。
接著,添加自我處理裂解酶抑制劑使載體中之重組核苷酸序列之表現產物暫時性錨定於細胞表面。例如,當加入Furin抑制劑(Dec-RVKR-CMK)抑制Furin蛋白酶活性時,本發明重組序列不會被Furin蛋白酶切割,而可以穩定地呈現於細胞膜表面。利用任何可測定檢測標籤之合適檢測方法即可篩選表現錨定於細胞表面之重組蛋白之細胞以得到具生產性之蛋白生產細胞。較佳地,該檢測方法為流式細胞儀。
在另一方面,本發明提供一種如本發明方法所篩選出之具生產蛋白質的細胞。
本發明載體及方法可應用於下列:
(一)篩選可高度分泌重組蛋白質之細胞株:轉殖重組蛋白質基因至哺乳動物細胞後,每顆細胞分泌重組蛋白的產量具高度異質性。將重組蛋白質基因與本系統結合後,利用自我處理裂解酶抑制劑使重組蛋白質暫時地表現於細胞膜上,較佳可搭配流式細胞儀(FACS)快速篩選出高蛋白質產能之細胞株;當移除抑制劑後,此細胞株即可持續且大量地分泌重組蛋白質,有效降低篩選高產能細胞株之成本,提升重組蛋白質產量,以供應臨床市場之需求。
(二)篩選溶酶體內高度表現重組蛋白質之細胞株:部分重組蛋白質(ex:perforin,granzymes...)是儲存於哺乳動物細胞之溶酶體內,不易篩選出高表現量之細胞株。將(表現於溶酶體內的)重組蛋白質基因與本系統結合後,再轉殖到哺乳動物細胞中表現,利用自我處理裂解酶抑制劑可使少量重組蛋白暫時地
表現於細胞膜上,較佳可搭配流式細胞儀(FACS)快速篩選出高蛋白質產能之細胞株;當移除抑制劑後,此細胞株之溶酶體內可累積大量重組蛋白質,加速篩選高產能細胞株之時程。
(三)快速篩選抗原專一性抗體:將抗體cDNA基因庫與本系統結合,再轉殖到哺乳動物細胞中表現,利用自我處理裂解酶抑制劑使抗體暫時地表現於細胞膜上,再以流式細胞儀搭配特定抗原探針,即可快速篩選出表現抗原專一性抗體的細胞株;當移除抑制劑後,此細胞株即可持續地分泌抗原專一性抗體,用於進行抗體功能與親和性分析,無須再透過額外的克隆工程才能獲得該抗體,可幫助藥廠或研究單位於短時間內得到更多具抗原專一性之高潛力抗體。
(四)提升抗原專一性抗體之親和性:將隨機突變後的專一性抗體基因庫與本系統結合,再轉殖到哺乳動物細胞中表現,利用自我處理裂解酶抑制劑使抗體暫時地表現於細胞膜上,再以流式細胞儀搭配特定抗原探針及特定環境條件,可快速篩選出表現高親和力抗體的細胞株;無須透過額外的基因克隆工程,當移除抑制劑後,即可得到分泌型抗體以進行抗體功能與親和性分析,可短時間內研發出高親和性之抗體藥物。
(五)提升或改變重組蛋白質之功能:將隨機突變後的重組蛋白質基因庫與本系統結合,再轉殖到哺乳動物細胞中表現,利用自我處理裂解酶抑制劑使重組蛋白質暫時地表現於細胞膜上,較佳例如以流式細胞儀搭配特定受質(例如蛋白酶專一性受質)及特定環境條件(例如酸鹼環境),可快速篩選出表現高功能性重組蛋白質(例如高蛋白酶活性、抗酸性環境或抗鹼性環境)的細胞株;無須透過額外的基因克隆工程,當移除抑制劑後,即可得到分泌型重組蛋白質以進行功能性分析,可於
短時間內研發出高功能性之重組蛋白質。
圖1顯示以暫時性膜蛋白表現系統篩選可高度分泌重組蛋白質之細胞株。利用基因克隆技術在重組蛋白質之C端依序接合furin蛋白酶切位(RAKR)及老鼠B7胞外-穿膜蛋白基因序列(mB7);將此基因轉殖入哺乳動物細胞後,當加入furin抑制劑抑制furin活性時,可使重組蛋白-RAKR-mB7穩定地表現於細胞表面,進一步藉由流式細胞儀分選技術,高通量篩選高蛋白質產能之細胞;當移除furin抑制劑時(細胞恢復furin活性),此細胞株即可大量分泌重組蛋白質,可用於量產重組蛋白質。
圖2顯示以furin抑制劑調控細胞分泌抗-EGFR抗體或膜表現抗-EGFR Ab-RAKR-mB7。(A)利用酵素免疫分析法(ELISA)偵測293T/抗-EGFR細胞培養液中抗-EGFR抗體的濃度,Dec-RVKR-CMK為furin抑制劑,Y軸為細胞分泌之抗-EGFR抗體濃度,X軸為細胞組別,結果顯示293T/抗-EGFR可穩定分泌抗-EGFR抗體;當加入furin抑制劑,抗-EGFR抗體之分泌量會顯著下降。(B)利用FACS技術搭配FITC結合抗-人類IGG抗體(FITC conjugated anti-human IgG antibody)偵測293T/anti-EGFR細胞膜上抗-EGFR Ab-RAKR-mB7之表現量,填滿區域為293T控制組細胞,實線為未給予furin抑制劑之293T/anti-EGFR細胞,虛線為給予furin抑制劑之293T/抗-EGFR,結果顯示:抑制furin活性會使抗-EGFR抗體轉變為抗-EGFR Ab-RAKR-mB7,進而穩定表現於細胞膜上。
圖3比較細胞膜表現anti-EGFR Ab-RAKR-mB7與分泌anti-EGFR antibody之關聯性。(A)Y軸為細胞數,X軸為螢光強度,紅色區塊為293T控制組,以利用FACS技術搭配FITC conjugated anti-human IgG抗體分選出細胞膜上anti-EGFR Ab-RAKR-mB7低表現(藍線)、中
表現(橘線)以及高表現(綠線)之293T/anti-EGFR細胞。(B)Y軸為細胞分泌之anti-EGFR antibody濃度,X軸為細胞組別,由左至右依序為293T細胞、anti-EGFR Ab-RAKR-mB7低表現(Low)、中表現(Medium)以及高表現(High)之293T/anti-EGFR細胞。
圖4顯示膜表現型anti-EGFR Ab-RAKR-mB7表現量與分泌型anti-EGFR antibody產量之相關係數。X軸為細胞膜上anti-EGFR Ab-RAKR-mB7之表現量(螢光訊號平均值),Y軸為細胞分泌anti-EGFR antibody之產量,每個點代表個別的單株293T/anti-EGFR細胞,結果顯示anti-EGFR Ab-RAKR-mB7之表現量與anti-EGFR antibody之產量成顯著正相關(R2=0.9165)。
圖5顯示以暫時性膜蛋白表現系統篩選溶酶體內高度表現重組蛋白質之細胞株。利用基因克隆技術在重組蛋白質之C端依序接合furin蛋白酶切位(RAKR)及老鼠B7胞外-穿膜蛋白基因序列(mB7);將此基因轉殖入哺乳動物細胞後,加入furin抑制劑抑制furin活性,可使重組蛋白-RAKR-mB7固定於溶酶體胞膜表面,若溶酶體內儲存過多的重組蛋白質時,細胞會以分泌或胞吐等形式排出部分重組蛋白質,此時,重組蛋白-RAKR-mB7即會呈現於細胞膜表現,可進一步藉由流式細胞儀分選技術,高通量篩選高蛋白質產能之細胞;當移除furin抑制劑時(細胞恢復furin活性),此細胞株即為溶酶體內大量儲存重組蛋白質之細胞株,可用於量產表現於溶酶體內的重組蛋白質。
圖6顯示以furin抑制劑調控細胞於溶酶體內儲存PCD-GB或膜表現PCD-GB-RAKR-mB7。(A)以西方點墨法搭配鼠抗-myc抗體及山羊抗-鼠IgG-HRP偵測LEC1與LEC1/PCD-GB細胞內PCD-GB重組蛋白質的表現情形;(B)利用furin抑制劑(Dec-RVKR-CMK)抑制LEC1與LEC1/PCD-GB細胞之furin活性,再以FACS技術搭配
mouse anti-myc antibody及goat anti-mouse IgG-FITC偵測細胞膜上PCD-GB-RAKR-mB7的表現量。填滿區域為LEC1控制組細胞,實線為未給予furin抑制劑之LEC1/PCD-GB細胞,虛線為給予furin抑制劑之LEC1/PCD-GB細胞。(C)X軸為細胞膜上PCD-GB-RAKR-mB7之表現量(螢光訊號平均值),Y軸為細胞溶酶體內PCD-GB儲存量,每個點代表個別的單株LEC1/PCD-GB細胞,結果顯示細胞膜上PCD-GB-RAKR-mB7之表現量與溶酶體內PCD-GB的儲存量成顯著正相關(R2=0.9441)。
實例一 篩選可高度分泌重組蛋白質之細胞株
利用基因克隆技術將furin蛋白酶切位片段(RAKR)連接抗-EGFR抗體(一種分泌型的人類化抗體)與老鼠B7胞外與穿膜蛋白序列(mouse B7,mB7),建構成抗-EGFR Ab-RAKR-mB7(Figure 1)。將此基因轉殖入哺乳動物細胞後(本次實驗所使用之細胞株為human embryonic kidney cells,HEK-293),在正常環境下,高基氏體內豐富的furin蛋白酶可有效的切斷抗-EGFR抗體與mB7之間的切位片段(RAKR),使抗-EGFR抗體分泌至細胞外;當加入furin抑制劑(Dec-RVKR-CMK)抑制furin蛋白酶活性時,抗-EGFR Ab-RAKR-mB7不會被furin蛋白酶切割,可以穩定地呈現於細胞膜表面;再利用免疫螢光標定(使用FITC-結合抗-人類抗體;FITC-conjugated anti-human antibody標定細胞膜上的抗-EGFR Ab-RAKR-mB7),搭配流式細胞儀篩選技術(FACS),即可快速且高通量篩選出細胞膜上高表現anti-EGFR Ab-RAKR-mB7之細胞;當移除furin抑制劑(Dec-RVKR-CMK)後,該細胞株即為可高度分泌抗-EGFR抗體之高產能細胞株(圖1)。
以人類化抗表皮生長因子抗體(人類化抗-EGFR抗體)為例,我們利用慢病毒載體將抗-EGFR Ab-RAKR-mB7基因轉殖入人類胚胎腎細胞,建構成293T/抗-EGFR細胞株。在缺乏furin抑制劑(Dec-RVKR-CMK)的環境下,293T/抗-EGFR可持續地分泌抗-EGFR抗體至細胞外(圖2A)。反之,當加入furin抑制劑抑制furin蛋白酶活性時,293T/抗-EGFR細胞分泌anti-EGFR抗體會大幅下降(圖2A),轉變為抗-EGFR Ab-RAKR-mB7表現於細胞膜上(圖2B)。
以慢病毒系統所建立的293T/抗-EGFR細胞群,個別細胞分泌抗-EGFR抗體之產能具有高度異質性。為了證實暫時性膜抗體表現系統可搭配FACS技術以篩選高產能之細胞株,在加入furin抑制劑後,我們利用FACS技術篩選出不同膜表現量(高、中、低表現量)之細胞株進行培養放大(圖3A);在移除furin抑制劑後,偵測各組細胞的抗-EGFR抗體分泌量,結果顯示:(在加入furin抑制劑時)以FACS所篩選出細胞膜上高度表現抗-EGFR Ab-RAKR-mB7之細胞株即為(當移除furin抑制劑時)可高度分泌抗-EGFR抗體之細胞株(圖3B)。
為了說明可利用FACS技術精確地評估個別細胞分泌重組蛋白質之產能,以單一細胞株分離法得到23顆293T/anti-EGFR單株細胞,進行培養放大;在加入furin抑制劑後,以FACS分析細胞膜上抗-EGFR Ab-RAKR-mB7之表現量,並量化為螢光強度平均值;移除furin抑制劑後,以ELISA偵測單株細胞分泌抗-EGFR抗體之濃度。統計結果顯示:細胞膜上抗-EGFR Ab-RAKR-mB7之表現量與該細胞分泌抗-EGFR抗體之產量具有顯著正相關性(R2=0.9165)(圖
4)。本發明可搭配FACS技術快速且精確地篩選出可高度分泌重組蛋白之細胞株。
實例二 篩選溶酶體內高度表現重組蛋白質之細胞株
本實例為一種表現於溶酶體內的重組蛋白質(perforin-granzyme fusion protein,PCD-GB),利用基因克隆技術將furin蛋白酶切位片段(RAKR)連接PCD-GB與mB7,建構成PCD-GB-RAKR-mB7(圖5)。將此基因轉殖入哺乳動物細胞後(本次實驗所使用之細胞株為Chinese Hamster Ovary cells,LEC1),在正常環境下,高基氏體內豐富的furin蛋白酶可有效的切斷PCD-GB與mB7之間的切位片段(RAKR),PCD-GB會儲存於溶酶體內;當加入furin抑制劑(Dec-RVKR-CMK)抑制furin蛋白酶活性時,PCD-GB-RAKR-mB7不會被furin蛋白酶切割,可以穩定地固定於溶酶體之胞膜表面,若溶酶體內儲存過量的蛋白質時,部分PCD-GB-RAKR-mB7會因分泌或胞吐作用而呈現於細胞膜上;再利用免疫螢光標定(使用FITC-結合抗體(conjugated antibody)標定細胞膜上的PCD-GB-RAKR-mB7),搭配流式細胞儀篩選技術(FACS),即可快速且高通量篩選出細胞膜上高表現PCD-GB-RAKR-mB7之細胞;當移除furin抑制劑(Dec-RVKR-CMK)後,該細胞株即為溶酶體內高度表現PCD-GB之高產能細胞株(圖5)。
利用慢病毒載體將PCD-GB-RAKR-mB7基因轉殖入LEC1細胞,建構成LEC1/PCD-GB細胞株。在缺乏furin抑制劑(Dec-RVKR-CMK)的環境下,furin蛋白酶可將PCD-GB-RAKR-mB7分解為PCD-GB,並且儲存於溶酶體內(圖6A);圖6A存在部分未分解之PCD-GB-RAKR-mB7,應為尚未進入反-Golgi-網絡(trans-Golgi network;TGN)的未成熟PCD-GB-RAKR-mB7蛋白質。反之,當加入furin抑制劑抑制furin蛋白酶活性時,可利用FACS技術
搭配anti-myc抗體(位於PCD-GB之C端上的一個標籤(tag)),偵測LEC1/PCD-GB細胞膜上會表現出少量PCD-GB-RAKR-mB7(圖6B)。為說明本發明可利用FACS技術精確地評估個別細胞之溶酶體內重組蛋白質的儲存量,以單一細胞株分離法得到18顆LEC1/PCD-GB單株細胞,進行培養放大;在加入furin抑制劑後,以FACS分析細胞膜上PCD-GB-RAKR-mB7之表現量,並量化為螢光強度平均值;移除furin抑制劑後,以ELISA偵測單株細胞溶酶體內PCD-GB之濃度。統計結果顯示:細胞膜上PCD-GB-RAKR-mB7之表現量與該細胞溶酶體內的PCD-GB儲存量具有顯著正相關性(R2=0.9441)(圖6C)。本發明可搭配FACS技術快速且精確地篩選出溶酶體內高度表現重組蛋白質之細胞株。
Claims (22)
- 一種高通量篩選具表現蛋白質的細胞之方法,其包括下列步驟:(a)構築包含帶有可檢測標籤之重組核苷酸序列之載體,該載體包含,5’至3’的方向,編碼蛋白質或多肽之第1序列;編碼自我處理裂解位置(self-processing cleavage site)之第2序列及編碼細胞外-穿膜區域之第3序列,其中該第2序列位於第1序列與第3序列之間,及其中該可檢測標籤位於第1序列或第3序列;(b)以(a)之載體轉染細胞;(c)添加自我處理裂解酶抑制劑使(a)載體中之重組核苷酸序列之表現產物暫時性錨定於細胞表面;及(d)測定可檢測標籤以篩選表現錨定於細胞表面之重組蛋白之細胞以得到具表現蛋白直之細胞。
- 如請求項1之方法,其中該編碼自我處理裂解酶位置之第2序列為真核細胞的內蛋白酶之自我處理裂解位置。
- 如請求項1之方法,其中該編碼自我處理裂解酶位置之第2序列為Furin共同序列RXK(R)R、Furin裂解序列RAKR、Xa因子裂解序列或位置IE(D)GR、序號肽I裂解序列或位置LAGFATVAQA、凝血酶裂解序列或位置LVPRGS或反式高爾基氏網(trans-Golgi network)內的原蛋白轉變酶族(proprotein convertase family)中的PC1/3、PC2、PACE4、PC5。
- 如請求項1之方法,其中該編碼自我處理裂解酶位置之第2序列為Furin共同序列RXK(R)R或Furin裂解序列RAKR。
- 如請求項1之方法,其中該蛋白質或多肽為抗體、抗原、免疫 調節蛋白、抗生素、蛋白疫苗、生長因子或細胞激素。
- 如請求項1之方法,該檢測標籤可為螢光標籤、放射線標籤或抗原標籤。
- 如請求項1之方法,該檢測標籤可為螢光標籤。
- 如請求項1之方法,其可高通量篩選具蛋白質產能之細胞。
- 如請求項1之方法,其可篩選可高度分泌重組蛋白質之細胞。
- 如請求項1之方法,其可篩選溶酶體內高度表現重組蛋白質之細胞。
- 如請求項1之方法,其可篩選表現抗原專一性抗體之細胞。
- 如請求項1之方法,其可篩選表現提升抗原專一性抗體之親和性之細胞。
- 如請求項1之方法,其可篩選表現提升或改變重組蛋白質之功能之細胞。
- 如請求項1之方法,其中該第1序列編碼抗體cDNA基因庫、抗體、抗原、免疫調節蛋白、抗生素、蛋白疫苗、生長因子及細胞激素。
- 一種如請求項1之方法所篩選出之具生產蛋白質的細胞。
- 一種帶有可檢測標籤之重組核苷酸序列,其包含,5’至3’的方向,編碼一蛋白質或多肽之第1序列;編碼自我處理裂解酶(self-processing cleavage enzyme)位置之第2序列及編碼細胞外-穿膜區域之第3序列,其中該第2序列位於第1序列與第3序列之間,及其中該可檢測標籤位於第1序列或第3序列。
- 如請求項16之重組核苷酸序列,其中該編碼自我處理裂解酶位置之第2序列為真核細胞的內蛋白酶之自我處理裂解位置。
- 如請求項16之重組核苷酸序列,其中該編碼自我處理裂解酶位置之第2序列為Furin共同序列RXK(R)R、Furin裂解序列 RAKR、Xa因子裂解序列或位置IE(D)GR、序號肽I裂解序列或位置LAGFATVAQA、凝血酶裂解序列或位置LVPRGS或反式高爾基氏網(trans-Golgi network)內的原蛋白轉變酶族(proprotein convertase family)中的PC1/3、PC2、PACE4、PC5。
- 如請求項16之重組核苷酸序列,其中該編碼自我處理裂解酶位置之第2序列為Furin共同序列RXK(R)R或Furin裂解序列RAKR。
- 如請求項16之重組核苷酸序列,其中該檢測標籤可為螢光標籤、放射線標籤或抗原標籤。
- 如請求項16之重組核苷酸序列,其中該第1序列編碼抗體cDNA基因庫、抗體、抗原、免疫調節蛋白、抗生素、蛋白疫苗、生長因子及細胞激素。
- 一種包含如請求項16之重組核苷酸序列之載體。
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