TW201504434A - 具有苯和／或萘降解能力的瓊氏不動桿菌ｄｓ４４分離株及其用途 - Google Patents

具有苯和／或萘降解能力的瓊氏不動桿菌ｄｓ４４分離株及其用途 Download PDF

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Abstract

本發明揭示一株具有苯和/或萘降解能力的瓊氏不動桿菌(Acinetobacter junii)DS44分離株，它以寄存編號BCRC 910561被寄存於食品工業發展研究所(FIRDI)的生物資源保存及研究中心(BCRC)。該瓊氏不動桿菌DS44分離株暨其繼代培養後代可被用於製備用以清除存在於一受污染的介質中之苯和/或萘的微生物試劑。

Description

具有苯和/或萘降解能力的瓊氏不動桿菌DS44 分離株及其用途
本發明是有關於一株具有苯和/或萘降解能力的瓊氏不動桿菌(Acinetobacter junii)DS44分離株，它以寄存編號BCRC 910561被寄存於食品工業發展研究所(FIRDI)的生物資源保存及研究中心(BCRC)。該瓊氏不動桿菌DS44分離株暨其繼代培養後代可被用於製備用以清除存在於一受污染的介質中之苯和/或萘的微生物試劑。
芳香烴(aromatic hydrocarbon)[亦被稱為芳烴(arene)]是指一種具有一或多個苯環(benzene ring)的烴化合物(hydrocarbon compound)，並且可依據苯環的數目而被區分為單環芳香烴(monocyclic aromatic hydrocarbons,MAHs)以及多環芳香烴(polycyclic aromatic hydrocarbons,PAHs)。芳香烴已被普遍地使用作為燃料(fuels)與工業溶劑(industrial solvents)，並且在製備醫藥品(pharmaceuticals)、農用化學品(agrochemicals)、聚合物、 炸藥(explosives)以及許多日常生活用品的過程中經常被用來作為起始物質。然而，這些芳香烴的分子結構非常穩定，並且具有高熔點、高沸點以及不易分解的特性，因此當它們被釋出到環境中時會持續地累積並且存在於自然界與生物體內，進而對整個生態環境或人體造成嚴重的危害。
苯(benzene)、甲苯(toluene)、乙苯(ethylbenzene)以及二甲苯(xylene)皆屬於MAHs並且被統稱為BTEX化合物，它們是最常見的地下水污染物(groundwater contaminants)以及土壤污染物(soil contaminants)，其中苯被發現具有致癌性(carcinogenicity)因而最為受到重視。苯(化學式為C6H6)是一種最簡單的MAHs，它在化學工業(chemical industry)上常被用來作為有機溶劑或者被用於製備苯衍生物(benzene derivatives)。當苯經由皮膚或眼睛的接觸、或者經由吸入(inhalation)以及攝入(intake)的方式而進入人體時，會抑制人體的中樞神經系統(central nervous system,CNS)並且產生困倦(sleepy)、頭暈(dizzy)、頭痛(headache)以及噁心(nausea)等症狀，若長期接觸甚至會影響紅血球、白血球以及血小板的形成，進而引發血癌(leukemia)。
萘(naphthalene)(化學式為C10H8)是一種由2個經融合的苯環(fused benzene ring)所構成的最簡單的PAHs，它已被廣泛地應用於生產染料(dyestuff)、樹脂(resin)、溶劑(solvent)、消毒劑(disinfectant)、殺蟲劑(insecticide)、防腐劑(preservative)以及防蛀劑 (mothproofing agent)等。當萘進入人體後可能會導致溶血性貧血(haemolytic anaemia)、噁心、嘔吐(vomiting)、腹瀉(diarrhea)、黃膽(jaundice)以及肝臟或腎臟損傷等症狀。
由於存在於環境中的苯和/或萘已嚴重地威脅到人類的健康並且造成生態環境的破壞，因此，如何有效地處理這些環境污染物即成為世界各國關注與研究的重點。目前已知的處理方法包括：固化法(solidification)、移除法(removing method)、焚化法(incineration)、活性碳吸附法(activated carbon adsorption)、觸媒還原法(catalytic reduction)、光分解法(photolysis)以及生物復育法(bioremediation)等等。
生物復育法主要是利用微生物的生物降解活性(biodegradative activities)來移除環境污染物與難分解的異生物毒素(recalcitrant xenobiotics)。生物復育法具有成本低廉、在降解環境污染物的過程中不會產生有毒的副產物而造成二次污染，以及可以在原地(in situ)進行操作等優點，因而已被廣泛地應用於受污染場址(contaminated site)的整治。在所有的生物復育技術(bioremediation techniques)當中，生物添加(bioaugmentation)特別受到重視，它主要是將微生物額外添加至一受污染的環境中以增進污染物的降解。在原生性微生物(indigenous microorganisms)無法有效降解難分解的異生物毒素的情況下，生物添加可能是唯一可達到生物復育的目的之方法。因此，分離與篩選出適合供用於生物復育法的微生物即成為本領域的相關研究人員 所致力的目標。
目前已有許多具有苯降解能力(benzene-degrading ability)的菌株從受污染的土壤中被分離出來，它們大多是屬於假單孢菌屬物種(Pseudomonas spp.)、假黃單孢菌屬物種(Pseudoxanthomonas spp.)、親脂環菌屬物種(Alicycliphilus spp.)、伯克氏菌屬物種(Burkholderia spp.)、羅爾斯頓氏菌屬物種(Ralstonia spp.)、無色桿菌屬物種(Achromobacter spp.)、噬氫菌屬物種(Hydrogenophaga spp.)、赤球菌屬物種(Rhodococcus spp.)以及關節桿菌屬物種(Arthrobacter spp.)等(Shuguang Xie et al.(2011),Biodegradation,22：71-81)。例如，分離自廢水處理的蘆葦根圈(rizosphere of wastewater treatment reed)的戀臭假單胞菌(Pseudomonas putida)AY-10(Eun Young Lee et al.(2011),International Proceedings of Chemical,Biological & Environmental Engineering,20：37-41)以及分離自受汽油污染的土壤的褐色假黃單胞菌(Pseudoxanthomonas spadix)BD-a59(Jeong Myeong Kim et al.(2008),Applied and Environmental Microbiology,74：7313-7320)皆被報導具有降解BTEX化合物的能力，因而可供應用於受BTEX污染之場址的生物復育上。
在Sander A.B.Weelink et al.(2008),Applied and Environmental Microbiology,74：6672-6681中，Sander A.B.Weelink等人從得自於廢水處理工廠以及土壤樣品的可降解苯且還原氯酸鹽的增殖培養物(benzene-degrading chlorate-reducing enrichment culture)中分離出一株脫氮親脂環菌BC(Alicycliphilus denitrificans BC)，該菌株被發現在缺氧的條件下可利用氯酸鹽(chlorate)作為電子受體(electron acceptor)而生長於含有苯的培養基中，其中該菌株可將氯酸鹽還原為亞氯酸鹽(chlorite)，接著經由歧化作用(dismutation)來生成代謝性氧氣(metabolic oxygen)，所生成的代謝性氧氣可藉由該菌株所產生的加氧酶(oxygenase)而被用來降解苯。Sander A.B.Weelink等人據此而推論：在無外部氧氣(external oxygen)供應的情形下，該菌株仍可利用好氧性降解途徑(aerobic degradation pathway)來降解苯。
此外，曾被報導具有PAHs降解能力(PAHs-degrading ability)的菌株大多是屬於假單孢菌屬物種、關節桿菌屬物種(Arthrobacter spp.)、不動菌屬物種(Acinetobacter spp.)、黃桿菌屬物種(Flavobacterium spp.)、產鹼桿菌屬物種(Alcaligenes spp.)、微球菌屬物種(Micrococcus spp.)以及棒狀桿菌屬物種(Corynebacterium spp.)等，而其中又以假單孢菌屬物種是最為常見的具有萘降解能力(naphthalene-degrading ability)的菌株，諸如螢光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)以及戀臭假單胞菌(Pseudomonas putida)(Mark R.Smith(1990),Biodegradation,1：191-206；R.C. ohnet al.(2012),Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology,88：1014-1019)。
近年來，有許多文獻針對不同的細菌分離株在各種芳香烴上的降解能力來進行研究。例如，在Hohzoh Kiyohara et al.(1982),Applied and Environmental Microbiology,43：458-461中，Hohzoh Kiyohara等人從土壤中分離出一株糞產鹼桿菌AFK2(Alcaligenes faecalis AFK2)，繼而探討該糞產鹼桿菌AFK2對於150種有機化合物(例如醣類、醇類以及芳香烴化合物等)的利用能力。而實驗結果發現：就芳香烴化合物而言，糞產鹼桿菌AFK2僅可以利用菲(phenanthrene)(它是一種由3個經融合的苯環所構成的PAHs，化學式為C14H10)以及蔥(anthracene)(它是一種由3個經融合的苯環所構成的PAHs，化學式為C14H10)作為碳源與能量來源，但是無法分解萘、苯、甲苯、二甲苯以及苯并[α]蔥(benz[α]anthracene)。
在R.C.John et al.(2012)(同上述)中，R.C.John等人從受航空燃油(aviation fuel)污染的土壤中分離出24株具有PAH降解能力的細菌分離株，其中糞產鹼桿菌AFS-5(Alcaligenes faecalis AFS-5)被發現可以生長於含有萘、菲或(chrysene)(它是一種由4個經融合的苯環所構成的PAHs，化學式為C18H12)作為唯一碳源的培養基中。從上述有關糞產鹼桿菌分離株的研究結果可見，屬於同一菌種的不同細菌分離株對於不同的芳香烴的降解能力存在有顯著的差異性。
另外，在Qi Wenzhen et al.(2010),Ecology and Environmental Sciences,19：2177-2181中，Qi Wenzhen等人 藉由選擇性增富培養方法(selective enrichment culture method)而從受污染的土壤中分離出一株瓊氏不動桿菌(Acinetobacter junii)YZ-1，該菌株被發現可以利用菲作為唯一碳源並且具有優異的菲降解能力。因此，Qi Wenzhen等人認為該瓊氏不動桿菌YZ-1可供應用於受菲污染之土壤的生物復育。
在Yanjiao chen et al.(2010),Journal of Environmental Science and Health Part A,45：668-673中，Yanjiao chen等人從受PAHs污染的土壤中分離出一株瓊氏不動桿菌GY2，該菌株被發現能夠利用芘(pyrene)(它是一種由4個經融合的苯環所構成的PAHs)作為唯一碳源，並且在一為50μg/mL的芘濃度下具有較佳的生長率。因此，Yanjiao chen等人認為該瓊氏不動桿菌GY2具有降解芘的高潛力。
雖然已存在有上述文獻報導，申請人仍積極致力於篩選出可以降解苯和/或萘的微生物以供環境保護之用。經研究，申請人意外地從受苯或萘污染的實廠土壤中分離出一株新穎的細菌分離株(它後來經過特徵鑑定而被命名為瓊氏不動桿菌DS44)，它在種系上(phylogenetically)是不同於所屬物種中已公開的菌株，並且具有優越的苯以及萘降解能力。因此，該菌株被預期在整治受苯和/或萘污染的環境上具有極大的潛力。
發明概要
於是，在第一個方面，本發明提供一種具有苯和/或萘降解能力的瓊氏不動桿菌(Acinetobacter junii)DS44分離株，它以寄存編號BCRC 910561被寄存於食品工業發展研究所(FIRDI)的生物資源保存及研究中心(BCRC)。
在第二個方面，本發明提供一種用於清除存在於一受污染的介質中之苯和/或萘的微生物試劑，其包含有一如上所述的瓊氏不動桿菌DS44分離株或其繼代培養後代。
在第三個方面，本發明提供一種用於清除存在於一受污染的介質中之苯和/或萘的方法，其包括：使用一如上所述的瓊氏不動桿菌DS44分離株或其繼代培養後代來處理該受污染的介質，而使得存在於該受污染的介質中之苯和/或萘被該瓊氏不動桿菌DS44分離株或其繼代培養後代所降解。
本發明的上述以及其它目的、特徵與優點，在參照以下的詳細說明與較佳實施例和隨文檢附的圖式後，將變得明顯。
發明的詳細說明
為了這本說明書之目的，將被清楚地瞭解的是：文字“包含有(comprising)”意指“包含但不限於”，以及文字“包括(comprises)”具有一對應的意義。
要被瞭解的是：若有任何一件前案刊物在此被引述，該前案刊物不構成一個下述承認：在台灣或任何其他國家之中，該前案刊物形成本技藝中的常見一般知識之 一部分。
除非另外有所定義，在本文中所使用的所有技術性與科學術語具有熟悉本發明所屬技藝的人士所共同瞭解的意義。一熟悉本技藝者會認知到許多與那些被描述於本文中者相似或等效的方法和材料，它們可被用於實施本發明。當然，本發明決不受到所描述的方法和材料之限制。
為了有效地處理環境污染物，避免環境以及生態繼續遭到嚴重的破壞，世界各國皆紛紛投入大量的人力與財力來尋求解決的方法。現今，在各種用於處理環境污染物的方法當中，生物復育法具有成本低廉、在降解環境污染物的過程中不會產生有毒的副產物而造成二次污染，以及可以在原地(in situ)進行操作等優點，因而已被廣泛地應用於受污染場址(contaminated site)的整治。
為了篩選出適合供應用於生物復育法的微生物，申請人從受苯或萘污染的實廠土壤中分離出20株細菌分離株，接著將所得到的分離株分別培養於含有苯或萘的培養基中並分析它們對於苯以及萘的降解效用，進而從中篩選出一株具有優異的苯以及萘降解能力的細菌分離株DS44。該細菌分離株DS44經特徵鑑定而被歸屬於瓊氏不動桿菌(Acinetobacter junii)，它被申請人命名為“瓊氏不動桿菌DS44”，並已於西元2012年8月29日以寄存編號BCRC 910561被寄存於台灣的食品工業發展研究所的生物資源保存及研究中心(BCRC of FIRDI)。
申請人進一步經由實驗而發現到，本發明的瓊 氏不動桿菌DS44可以利用苯或萘作為唯一碳源，並且對於苯以及萘的降解效用會隨著該瓊氏不動桿菌DS44的培養時間的增加而更趨於明顯。另外，申請人藉由模擬土壤整治環境的試驗而證實：該瓊氏不動桿菌DS44可以有效地清除存在於土壤中的萘。
基於上述的有利生物活性，本發明的瓊氏不動桿菌DS44或其繼代培養後代被預期具有供應用於生物復育的高潛力。於是，本發明提供一種用於清除存在於一受污染的介質中之苯和/或萘的微生物試劑，其包含有一如上所述的瓊氏不動桿菌DS44或其繼代培養後代。
依據本發明，該受污染的介質是一固態、液態或氣態的環境介質，這包括，但不限於：土壤(soil)、污泥(sludge)、沉積物(sediment)、蓄水層(aquifer)、水體(water body)、廢水(waste water)以及廢氣(exhaust)。較佳地，該受污染的介質是選自於下列所構成的群組：農業用地(例如田地以及果園用地等)、放牧草地、林地、加油站用地、工業用地、人工的水體(例如井水、漁業養殖池、池塘以及水庫等)、天然的水體[例如地下水(groundwater)、河水、湖水以及海水等]、工廠廢水、生活污水以及污水處理廠的淤泥。
依據本發明的微生物試劑可進一步包含有至少一種可清除單環和/或多環芳香烴的微生物。
適用於本發明的可清除單環芳香烴的微生物包括，但不限於：假單孢菌屬物種(Pseudomonas spp.)、假黃單孢菌屬物種(Pseudoxanthomonas spp.)、親脂環菌屬物種 (Alicycliphilus spp.)、伯克氏菌屬物種(Burkholderia spp.)、羅爾斯頓氏菌屬物種(Ralstonia spp.)、無色桿菌屬物種(Achromobacter spp.)、噬氫菌屬物種(Hydrogenophaga spp.)、赤球菌屬物種(Rhodococcus spp.)以及關節桿菌屬物種(Arthrobacter spp.)。較佳地，該可清除單環芳香烴的微生物是選自於由下列所構成的群組：戀臭假單胞菌(Pseudomonas putida)AY-10、褐色假黃單胞菌(Pseudoxanthomonas spadix)BD-a59、脫氮親脂環菌BC(Alicycliphilus denitrificans BC)，以及它們的組合。
適用於本發明的可清除多環芳香烴的微生物包括，但不限於：假單孢菌屬物種、關節桿菌屬物種(Arthrobacter spp.)、不動菌屬物種(Acinetobacter spp.)、黃桿菌屬物種(Flavobacterium spp.)、產鹼桿菌屬物種(Alcaligenes spp.)、微球菌屬物種(Micrococcus spp.)以及棒狀桿菌屬物種(Corynebacterium spp.)。較佳地，該可清除多環芳香烴的微生物是選自於由下列所構成的群組：螢光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)、戀臭假單胞菌(Pseudomonas putida)、糞產鹼桿菌AFS-5(Alcaligenes faecalis AFS-5)，以及它們的組合。
依據本發明的微生物試劑可選擇性地包含有對於微生物生長有益的營養物，這包括，但不限於：甘油(glycerol)、核黃素(riboflavin)、酪蛋白(casein)、聚蛋白腖(polypeptone)、肉萃取物(meat extract)、大豆餅(soybean cake)、酵母萃取物(yeast extract)、纖維素、葡萄糖、玉米 萃取物(corn extract)、乳清粉末(whey powder)、澱粉、維生素[諸如噻胺(thiamine)、生物素(biotin)、菸鹼醯胺(nicotinic acid amide)以及泛酸鈣(calcium panthotenate)]以及酵素[諸如澱粉酶(amylase)、蛋白酶(protease)以及脂肪酶(lipase)]。
依據本發明的微生物試劑可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合使用的形式，這包括，但不限於：培養液(culture solution)、懸浮液(suspension)、顆粒體(granules)、粉末(powder)、錠劑(tablet)、丸劑(pill)、膠囊(capsules)、濃漿(slurry)以及類似之物。此外，該微生物試劑也可以被固著(immobilized)在一不可溶的支撐物(insoluble support)上而被使用。
依據本發明的微生物試劑可進一步包含有一生物可相容的載體(biocompatible carrier)。
在本發明的一個較佳具體例中，該微生物試劑中的瓊氏不動桿菌DS44被該生物可相容的載體捕獲在內(entrapped therein)。該生物可相容的載體包括，但不限於：矽膠(silica gel)、澱粉(starch)、瓊脂(agar)、幾丁質(chitin)、幾丁聚糖(chitosan)、聚乙烯醇(polyvinyl alcohol)、聚乳酸(polylactic acid)、藻酸(alginic acid)、聚丙烯醯胺(polyacrylamide)、鹿角菜膠(carrageenan)、瓊脂糖(agarose)、明膠(gelatin)、纖維素(cellulose)、醋酸纖維素(cellulose acetate)、聚葡萄糖(dextran)以及膠原蛋白(collagen)。
在本發明的另一個較佳具體例中，該微生物試劑中的瓊氏不動桿菌DS44被擔負(supported on)在該生物可相容的載體上。該生物可相容的載體包括，但不限於：玻璃(glass)、陶瓷(ceramic)、金屬氧化物(metal oxide)、活性碳(activated carbon)、高嶺石(kaolinite)、皂土(bentonite)、沸石(zeolite)、鋁(alumina)、無煙煤(anthracite)、戊二醛(glutaraldehyde)、聚丙烯酸(polyacrylic acid)、聚胺甲酸酯(polyurethane)、聚氯乙烯(polyvinyl chloride)、離子交換樹脂(ion exchange resin)、環氧樹脂(epoxy resin)、光塑性樹脂(photosetting resin)、聚酯(polyester)以及聚苯乙烯(polystyrene)。
依據本發明的微生物試劑也可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一用於清除存在於一受污染的介質中之苯和/或萘的生物反應器或裝置。有關生物反應器的製造可以參考，例如，US 5279963、US 5258303、US 5552051、US 5494574、US 6030533、US 2003/0008381 A1、US 2006/0270024 A1、EP 0609399 B1、EP 0867238，以及K.Ishii and T.Furuichi(2007),Journal of Hazardous Materials,148(3)：693-700。
本發明亦提供一種用於清除存在於一受污染的介質中之苯和/或萘的方法，其包括：使用一如上所述的瓊氏不動桿菌DS44或其繼代培養後代來處理該受污染的介質，而使得存在於該受污染的介質中之苯和/或萘被該瓊氏不動桿菌DS44或其繼代培養後代所降解。
如本文中所用的，術語“降解”意指將一化合物代謝性地分解成一較不複雜(less complex)的分子。
在依據本發明的方法中，該瓊氏不動桿菌DS44或其繼代培養後代可與至少一種可清除單環和/或多環芳香烴的微生物來組合使用。
適用於本發明之方法的可清除單環芳香烴的微生物包括，但不限於：假單孢菌屬物種(Pseudomonas spp.)、假黃單孢菌屬物種(Pseudoxanthomonas spp.)、親脂環菌屬物種(Alicycliphilus spp.)、伯克氏菌屬物種(Burkholderia spp.)、羅爾斯頓氏菌屬物種(Ralstonia spp.)、無色桿菌屬物種(Achromobacter spp.)、噬氫菌屬物種(Hydrogenophaga spp.)、赤球菌屬物種(Rhodococcus spp.)以及關節桿菌屬物種(Arthrobacter spp.)。較佳地，該可清除單環芳香烴的微生物是選自於由下列所構成的群組：戀臭假單胞菌(Pseudomonas putida)AY-10、褐色假黃單胞菌(Pseudoxanthomonas spadix)BD-a59、脫氮親脂環菌BC(Alicycliphilus denitrificans BC)，以及它們的組合。
適用於本發明的方法之可清除多環芳香烴的微生物包括，但不限於：假單孢菌屬物種、關節桿菌屬物種(Arthrobacter spp.)、不動菌屬物種(Acinetobacter spp.)、黃桿菌屬物種(Flavobacterium spp.)、產鹼桿菌屬物種(Alcaligenes spp.)、微球菌屬物種(Micrococcus spp.)以及棒狀桿菌屬物種(Corynebacterium spp.)。較佳地，該可清除多環芳香烴的微生物是選自於由下列所構成的群組：螢光 假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)、戀臭假單胞菌(Pseudomonas putida)、糞產鹼桿菌AFS-5(Alcaligenes faecalis AFS-5)，以及它們的組合。
本發明之其他的特徵及功效，將於參照圖式的實施方式中清楚地呈現，其中：圖1顯示被接種以不同細菌分離株之含有苯的布氏哈斯肉湯培養基(Bushnell-Hass broth,BHB)在培養歷時3天後所測得的苯濃度，其中對照組表示未被接種以任何菌株之含有苯的BHB；圖2顯示被接種以不同細菌分離株的液態土壤樣品在培養歷時7天後所測得的萘濃度，其中對照組表示未被接種以任何菌株的液態土壤樣品；圖3顯示本發明的瓊氏不動桿菌(Acinetobacter junii)DS44之部分的16S rDNA的核苷酸序列；圖4顯示本發明的瓊氏不動桿菌DS44之16S-23S rDNA的內部轉錄間隔(internal transcribed spacer,ITS)的核苷酸序列；以及圖5顯示本發明的瓊氏不動桿菌DS44在模擬管柱裝置中對於含有萘的土壤樣品的萘降解率，其中對照組表示未被導入瓊氏不動桿菌DS44之含有萘的土壤樣品。
較佳實施例之詳細說明
本發明將就下面的實施例來做進一步說明，但應瞭解的是，該等實施例僅是供例示說明用，而不應被解釋為本發明的實施上的限制。
實施例 一般實驗材料： 1. 基礎瓊脂培養基(minimal agar medium)：
在下面實施例中所使用的基礎瓊脂培養基具有下面表1所示的配方。
2. 胰蛋白酶大豆肉湯培養基(Tryptic Soy broth,TSB)：
在下面實施例中所使用的胰蛋白酶大豆肉湯培養基具有下面表2所示的配方。
3. 布氏哈斯肉湯培養基(Bushnell-Hass broth,BHB)：
在下面實施例中所使用的布氏哈斯肉湯培養基具有下面表3所示的配方。
4. 含有苯的布氏哈斯肉湯培養基：
在下面實施例中所使用的含有苯的布氏哈斯肉湯培養基(苯的濃度：50μg/mL)是藉由將9.9mL布氏哈斯肉湯培養基(BHB)以及0.1mL苯標準品(benzene standard)(5000μg/mL，型號40004，購自於思必可有限公司)予以混合均勻而被製得。
5. 含有萘的土壤樣品(naphthalene-containing soil sample)：
將取自於一高雄市整治場址之受萘污染的土壤(收集深度約1公尺)以一木槌進行破碎處理，接著予以風乾(air-dried)歷時7至10天，繼而以一孔徑為0.85mm的篩網來進行過篩，由此所得到之經過篩的土壤樣品是依據下面“一般實驗方法”的「1.苯以及萘濃度的測定」當中所述的方法而被測量到具有一為191.7mg/kg的萘濃度，繼而將之保存於4℃下備用。
一般實驗方法： 1. 苯以及萘濃度的測定：
在下面的實施例中，各個待測樣品中的揮發性有機化合物(volatile organic compounds,VOCs)(亦即苯以及萘)是使用一吹氣捕捉裝置(purge and trap device)(型號4560，OI Analytical)來進行收集，接著使用一氣相層析儀(gas chromatograph,GC)(型號6890，Agilent Technologies)來對所收集到的苯或萘進行濃度的測定。有關吹氣捕捉裝置以及氣相層析儀的操作條件分別被顯示於下面的表4以及表5中。
此外，為供比對，分別使用苯(5000μg/mL)以及萘(5000μg/mL)來作為對照標準品(control standard)並進行相同的分析，這些化學物質是購自於思必可有限公司。
實施例1. 具有苯與萘降解能力以及乳化能力的細菌分離株的分離與篩選(Isolation and screening of bacteria isolates having the benzene and naphthalene degrading ability and emulsifying ability)： A、 試驗菌株的來源與分離：
在本實驗中所使用之用於篩選試驗菌株的實廠土壤樣品是取自於苗栗縣整治場址之受苯污染的土壤(收集深度約5公尺)以及高雄市整治場址之受萘污染的土壤(收集深度約1公尺)。
首先，將10g之實廠土壤樣品加入至一含有500mL無菌水的培養瓶中，繼而藉由超音波處理(ultrasonication)來充分散浮該土壤樣品，接著將所得到的懸浮液置於一恆溫振盪培養箱(28℃、50rpm)中進行培養歷時7天。之後，將所形成的培養物進行10倍連續稀釋(10-fold serial dilution)，而得到具有不同稀釋倍數(106至 108倍)的液態培養物，繼而對各個含有不同稀釋倍數的液態培養物分別取0.1mL，並將之均勻塗佈於一基礎瓊脂培養基上，接著於30℃下靜置培養歷時48至72小時。然後，申請人分別以肉眼與顯微鏡來觀察各個基礎瓊脂培養基上的菌落型態以及菌株的生長情形，繼而從中挑選出20個菌落(colonies)並以四區劃線法(four-quadrant streak method)的方式分別塗佈於一基礎瓊脂培養基上，接著於30℃下靜置培養歷時48至72小時。上述菌株純化步驟被重複進行數次，而得到20株經純化的細菌分離株，其中包括：菌株編號DS01、DS03、DS06、DS08、DS11、DS14、DS17、DS19、DS21、DS23、DS26、DS27、DS28、DS31、DS33、DS35、DS36、DS40、DS42以及DS44。之後，將該等細菌分離株分別接種至適量之胰蛋白酶大豆肉湯培養基(TSB)中，並置於一恆溫振盪培養箱(30℃、50rpm)中進行培養歷時48至72小時，接著對所形成的細菌培養物加入適量的甘油(glycerol)至一最終濃度為10%(v/v)，繼而將之冷凍保存於-80℃下備用。
B、 製備細菌分離株的接種源(inoculum)：
將依據上面「A、試驗菌株的來源與分離」中所得到的20株細菌分離株以一為0.4%(v/v)的接種量分別接種至5mL YM培養基[含有0.4%酵母菌萃取物(yeast extract)、1%麥芽萃取物(malt extract)以及0.4%右旋糖(dextrose)](Difco 0711-01，啟新生物科技有限公司)中，並於30℃下進行培養歷時18小時。之後，將所得到的菌液依 序地以200mL YM培養基以及20L YM培養基來進行菌株的擴增培養，而由此所形成的培養物被使用作為下面實施例中的細菌分離株的接種源。
C、 篩選具有苯降解能力的細菌分離株：
將適量之依據上面「B、製備細菌分離株的接種源」所得到的20株細菌分離株的接種源分別接種至含有苯的布氏哈斯肉湯培養基中，由此所得到的20個試驗菌液分別具有一為1×105CFU/mL的細菌濃度，然後於室溫下對各個試驗菌液進行震盪培養歷時3天。接著，依據上面“一般實驗方法”的「1.苯以及萘濃度的測定」當中所述的方法來測量所得到的培養物中的苯濃度。此外，為供比較，未被接種以任何菌株之含有苯的布氏哈斯肉湯培養基被拿來作為對照組(control)，並進行相同的實驗。
圖1顯示被接種以不同細菌分離株之含有苯的布氏哈斯肉湯培養基在培養歷時3天後所測得的苯濃度。由圖1可見，各個培養物中所測得的苯的濃度皆明顯低於對照組所具者。特別地，被接種以細菌分離株DS03、DS11、DS14、DS19、DS36、DS42以及DS44的培養物所測得的苯濃度是低於40mg/L。這個實驗結果顯示：細菌分離株DS03、DS11、DS14、DS19、DS36、DS42以及DS44皆具有優越的苯降解能力。
D、 篩選具有萘降解能力的細菌分離株：
首先，對20支含有5mL無菌水的試管分別加入15g含有萘的土壤樣品並予以均勻混勻，繼而將適量之 依據上面「B、製備細菌分離株的接種源」所得到的20株細菌分離株的接種源分別接種至該等液態土壤樣品中，由此所得到的20個待測樣品分別具有一為1×105CFU/g的細菌濃度，之後於室溫下對各個待測樣品進行震盪培養歷時7天。接著，依據上面“一般實驗方法”的「1.苯以及萘濃度的測定」當中所述的方法來測量各個待測樣品中的萘濃度。此外，為供比較，未被接種以任何菌株的液態土壤樣品被拿來作為對照組，並進行相同的實驗。
圖2顯示被接種以不同細菌分離株的液態土壤樣品在培養歷時7天後所測得的萘濃度。由圖2可見，各個待測樣品中所測得的萘濃度皆明顯低於對照組所具者。特別地，被接種以細菌分離株DS19、DS21、DS26、DS31、DS36、DS40以及DS44的待測樣品所測得的萘濃度是低於0.15mg/kg，而其中被接種以細菌分離株DS44的待測樣品具有一為0.0699mg/kg的萘濃度。這個實驗結果顯示：細菌分離株DS19、DS21、DS26、DS31、DS36以及DS40皆具有優越的萘降解能力，而細菌分離株DS44則具有最佳的萘降解能力。
E、 篩選具有乳化能力的細菌分離株：
依據上面第C項以及第D項的實驗結果，申請人進一步挑選出11株具有較佳的苯和/或萘降解能力的細菌分離株(包括DS03、DS11、DS14、DS19、DS21、DS26、DS31、DS36、DS40、DS42以及DS44)來進行乳化能力的試驗，俾以篩選出具有開發潛力的菌株。
將4mL之依據上面「B、製備細菌分離株的接種源」所得到的該11株細菌分離株的接種源分別接種至11支含有6mL超級柴油(super diesel)(購自於台灣中油股份有限公司)的試管中並且予以充分震盪混合歷時2分鐘，由此所得到的11個混合溶液分別具有一為1×105CFU/mL的細菌濃度，接著於室溫下對各個混合溶液進行靜置培養歷時24小時。之後，分別測量各個試管中的乳化層(emulsified layer)的高度以及整體溶液(total solution)的高度。
乳化指數E24(emulsification index E24)是藉由將所測得的乳化層以及整體溶液的高度代入下面的公式(1)而被計算出：公式(1)：A=(B/C)×100
其中：A=乳化指數E24(%)
B=乳化層的高度(cm)
C=整體溶液的高度(cm)若所測得的乳化指數E24越高，代表該細菌分離株的乳化能力越強。
下面表6顯示分別被接種以11株細菌分離株的超級柴油在培養歷時24小時後所測得的乳化指數E24。由表6可見，這11株細菌分離株皆具有乳化超級柴油的能力，其中細菌分離株DS14、DS19、DS36以及DS44具有較佳的乳化能力。
綜合上述第C項至第E項的實驗結果，申請人認為：在所純化出的20株細菌分離株中，細菌分離株DS44是最具有開發潛力的菌株，因此將它拿來進行下面的特徵鑑定。
實施例2. 具有苯與萘降解能力的細菌分離株DS44的特徵鑑定：
為了確認在上面的實施例中所篩選出的細菌分離株DS44之所屬菌種，細菌分離株DS44被拿來進行下面的初步試驗、16S rDNA序列分析、Biolog微生物鑑定系統(Biolog microbial identification system)分析以及16S-23S rDNA的內部轉錄間隔(internal transcribed spacer,ITS)序列分析。
A、 初步試驗：
有關細菌分離株DS44的初步試驗是委託食品工業發展研究所(Food Industry Research and Development Institute,FIRDI)來代為進行，試驗項目包括：革蘭氏染色(gram staining)、型態觀察(morphological observation)、觸酶(catalase)反應、氧化酶(oxidase)反應、運動性(mobility)以及在好氧(aerobic)與厭氧(anaerobic)條件下之生長情形。
依據初步試驗結果，該細菌分離株DS44為革蘭氏陰性桿菌、具觸酶、不具氧化酶、不具運動性、於好氧環境下會生長、於厭氧環境下不會生長，以及不會產生孢子。
B、 16s rDNA序列分析：
有關細菌分離株DS44的16s rDNA序列分析是委託食品工業發展研究所(FIRDI)來代為進行。
該細菌分離株DS44之部分的16S rDNA序列分析結果被顯示於圖3中，而經與NCBI網站上的基因資料庫進行比對後發現：該細菌分離株DS44之部分的16S rDNA序列(序列辨識編號：1)與瓊氏不動桿菌(Acinetobacter junii)的16S rDNA序列之間具有最高的序列相似性(sequence similarity)。
C、 Biolog微生物鑑定系統分析：
有關細菌分離株DS44的Biolog微生物鑑定系統分析是使用一GEN III MicroPlateTM(Biolog Inc.)並且委託食品工業發展研究所(FIRDI)來代為進行，分析項目包 括：71種碳源利用分析(carbon source ultilization assays)以及23種化學靈敏度分析(chemical sensitivity assays)。
下面表7顯示該細菌分離株DS44的Biolog微生物鑑定系統的分析結果，而將該分析結果與購自於Biolog公司的GEN III資料庫(型號22730D)比對後發現：該細菌分離株DS44的碳源利用以及化學靈敏度特性與瓊氏不動桿菌所具者最為接近。
依據上面第A至C項的實驗結果，本發明的細菌分離株DS44被初步鑑定是瓊氏不動桿菌，而為了確認該細菌分離株DS44是否為一種新穎的瓊氏不動桿菌分離株，該細菌分離株DS44被進一步拿來進行下面第D項的分析。
D、 16S-23S rDNA的內部轉錄間隔(internal transcribed spacer,ITS)序列分析：
於無菌條件下，將細菌分離株DS44接種於5mL的LB培養基(含有10mg/mL胰化腖、5mg/mL酵母菌萃取物以及10mg/mL NaCl)中，並於37℃下培養隔夜。之後，將菌液以10,000rpm來進行離心，繼而移除上澄液。接著，對所得到的沉澱物(pellets)予以加入800μL的GUTC緩衝溶液(GUTC buffer)[含有2.5M胍硫氰酸鹽(guanidine thiocyanate)、0.1M氯化鋰(Lithium chloride,LiCl)、10mM EDTA以及0.1M MOPS](pH 4.6)以及60μL的矽藻土懸浮液以充分散浮菌體，繼而於室溫下靜置歷時15分鐘後，以20,000g來進行離心歷時5分鐘。在移除上澄液之後，對所得到的沉澱物加入500μL GUTC緩衝溶液並予以混合均勻，接著於室溫下靜置歷時15分鐘後，以20,000g來進行離心歷時5分鐘。然後，將上澄液移除並以600μL清洗緩衝液(wash buffer)來洗滌沉澱物2次，繼而以600μL的75%乙醇(ethanol)予以洗滌1次，接著於真空下進行乾燥直至矽藻土變為白色。最後，加入30μL TE緩衝液(TE bufffer)(T2069，Sigma)，並於一範圍落在55℃至60℃內的 溫度下進行水浴歷時10分鐘，接著以12,000rpm來進行離心並收集上澄液，藉此而得到該細菌分離株DS44的基因組DNA(genomic DNA)。
以所得到的基因組DNA作為模版(template)，並使用一組分別被發表於Stephane Desaint et al.(2000),FEMS Microbiology Ecology,34：173-180以及Kuske C.R.et al.(1999),Syst Appl Microbiol.,22：300-311中的針對細菌菌株之16S-23S rDNA的ITS序列而被設計之具有下面所示核苷酸序列的引子對(primer pair)ITSF引子與ITSR引子來進行聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction,PCR)，而PCR的反應條件被顯示於下面表8中。
ITSF引子5’-tgcggctggatcacctcctt-3’(序列辨識編號：2)
ITSR引子5’-gccaaggcatccacc-3’(序列辨識編號：3)
於完成PCR之後，藉由1%瓊脂糖凝膠電泳來確認有否得到一大小約為700bp的PCR擴增產物，並從凝膠回收純化該經確認的PCR產物。該經純化的PCR產物是委託波仕特生物科技股份有限公司來進行定序，而所得到的定序結果是利用NCBI網站所提供的Gene Blast軟體來進行比對分析。
該細菌分離株DS44之16S-23S rDNA的ITS序列分析結果被顯示於圖4中，而經與NCBI網站上的基因資料庫進行比對後發現：細菌分離株DS44之16S-23S rDNA的ITS序列(序列辨識編號：4)與瓊氏不動桿菌BCRC 14854的16S-23S rDNA的ITS序列[GenBank登錄編號(accession number)：AY601832.1]之間僅具有77%的序列覆蓋率(coverage)，其中該細菌分離株DS44之16S-23S rDNA的ITS序列與該瓊氏不動桿菌BCRC 14854所具者的核苷酸殘基位置1至182處以及413至706處的核苷酸序列具有高度相似性，但是與該核苷酸殘基位置183至412處的核苷酸序列則具有高度的變異性。
綜合以上各項的特徵鑑定結果，申請人認為：本發明的細菌分離株DS44是一株新穎的瓊氏不動桿菌分離株。
本發明的瓊氏不動桿菌DS44已於西元2012年8月29日以寄存編號BCRC 910561被寄存於財團法人食品工業發展研究所的生物資源保存及研究中心(BCRC of FIRDI)(300新竹市食品路331號，台灣)。
實施例3. 瓊氏不動桿菌DS44對於苯以及萘的降解效用的評估： A、 苯的降解效用的評估：
將適量之瓊氏不動桿菌DS44的接種源分別接種至9支含有10mL含有苯的布氏哈斯肉湯培養基之試管中，由此所得到的菌液分別具有一為1×105CFU/mL的細菌濃度。接著，將這9支試管置於一恆溫震盪培養箱(28℃、50rpm)內進行培養，然後在第0、3、6、12、24、48、72、96以及120小時之時分別取出1支試管並依據上面“一般實驗方法”的「1.苯以及萘濃度的測定」當中所述的方法來測量培養物的苯濃度。
苯降解百分比是藉由將上面所測得的苯濃度代入下面的公式(2)而被計算出：公式(2)：D=(E-F)/E×100
其中：D=苯降解百分比(%)
E=第0小時所測得的苯濃度(mg/L)
F=各個時間點所測得的苯濃度(mg/L)
下面表9顯示被接種以瓊氏不動桿菌DS44的培養物的苯濃度隨著時間的變化。由表9可見，培養物的苯濃度會隨著培養時間的增加而逐漸地降低。特別地，當培養到第48小時之時，所測得的苯降解百分比可達至53.19%，而當培養到第120小時之時，所測得的苯降解百分比可達至81.30%。這個實驗結果顯示：瓊氏不動桿菌DS44對於苯具有良好的降解效用，並且降解效用會隨著時間的增加而更趨於明顯。
B、 萘的降解效用的評估：
對9支含有9mL布氏哈斯肉湯培養基的試管分別加入15g含有萘的土壤樣品並予以混合均勻，繼而將1mL之瓊氏不動桿菌DS44的接種源分別接種至該等液態土壤樣品中，由此所得到的9個待測樣品分別具有一為1×105CFU/g的細菌濃度。接著，將這9支試管置於一恆溫震盪培養箱(28℃、50rpm)內進行培養，然後在第0、3、6、12、24、48、72、96以及120小時之時分別取出1支試管並依據上面“一般實驗方法”的「1.苯以及萘濃度的測定」當中所述的方法來測量萘濃度。
萘降解百分比是藉由將上面所測得的萘濃度代入下面的公式(3)而被計算出：公式(3)：G=(H-I)/H×100
其中：G=萘降解百分比(%)
H=第0小時所測得的萘濃度(mg/kg)
I=各個時間點所測得的萘濃度(mg/kg)
下面表10顯示被接種以瓊氏不動桿菌DS44的待測樣品的萘濃度隨著時間的變化。由表10可見，待測樣品的萘濃度會隨著培養時間的增加而逐漸地降低。特別地，當培養到第6小時之時，所測得的萘降解百分比可達至48.98%，當培養到第48小時之時，所測得的萘降解百分比可達至85.55%，而當培養到第120小時之時，所測得的萘降解百分比甚至可達至92.27%。這個實驗結果顯示：瓊氏不動桿菌DS44對於萘具有優越的降解效用，並且降解效 用會隨著時間的增加而更趨於明顯。
實施例4. 瓊氏不動桿菌DS44在模擬土壤整治的環境中對於萘的降解效用：
為了確認瓊氏不動桿菌DS44在模擬土壤整治的環境中是否具有清除存在於受污染的土壤中之萘的能力，下面的實驗被進行。
實驗材料： 1. 去氧水(de-oxygen water)：
將9mg亞硫酸鈉(Na2SO3)以及1mg氯化亞鈷(CoCl2)加入1L無菌水中並予以混合均勻，繼而置於室溫下反應歷時2分鐘，所得到的去氧水被拿來作為一模擬流經土壤中的地下水。
2. 模擬管柱裝置：
在本實驗中所使用的模擬管柱裝置包含有一個 可充填土壤的直立圓柱形管柱(長30cm，內徑5cm)、二個可分別用於密封該管柱的頂端以及底端的鐵氟龍塞、一連接至位於該管柱的底端的鐵氟龍塞並且可供用於將去氧水導入至該管柱中的蠕動泵浦(型號323U，WATSON-MARLOW)，以及一連接至位於該管柱的頂端的鐵氟龍塞並且可供用於收集流出物(effluent)的導管。
實驗方法：
首先，在該管柱的底端的內側鋪設一紗布以防止土壤漏出，繼而以一鐵氟龍塞予以密封，然後依序地將下列物質充填至該管柱中：最下層由下至上依序是直徑為0.1cm、0.2cm以及0.5cm的玻璃圓珠(填充高度約為2cm)，中間層是653.85g含有萘的土壤樣品(具有一為184.6mg/kg的萘濃度，而填充高度約為20cm)，以及最上層由下至上依序是直徑為0.5cm、0.2cm以及0.1cm的玻璃圓珠(填充高度約為2cm)。接著，以一鐵氟龍塞來密封該管柱的頂端。
之後，利用該蠕動泵浦並以一為0.2mL/分鐘的速率連續地將去氧水從該管柱的底端導入該管柱中。當流出物自該管柱的頂端的導管中穩定地流出時，利用該蠕動泵浦而將適量的過氧化鈣(calcium peroxide,CaO2)(1000mg/L)導入至該管柱中，以使該管柱中的土壤樣品的溶氧量是落在6至7mg/L的範圍內。接著，使用該蠕動泵浦而將適量之瓊氏不動桿菌DS44的接種源導入至該管柱中，而使得該管柱中的土壤樣品具有一為1×105CFU/g的細菌濃 度。此外，為供比較，未導入瓊氏不動桿菌DS44之含有萘的土壤樣品被拿來作為對照組，並進行相同的實驗。
之後，收集流出物並且藉由使用一溶氧(DO)測定儀[dissolved oxygen(DO)meter](型號DO200，CLEAN)來測量溶氧量以及使用pH測定儀(pH meter)來測量pH值。另外，依據上面“一般實驗方法”的「1.苯以及萘濃度的測定」當中所述的方法來量測該流出物的萘濃度，然後將所得到的萘濃度乘以該流出物的體積，而得到該流出物的萘含量(g)。
整個實驗期間總共歷時15天，每天依據上述方式來收集流出物並且測量它的溶氧量、pH值以及萘含量，同時持續地監測所測得的溶氧量並依據上述方式來調整該管柱中的土壤樣品的溶氧量，而流出物的pH值則是被維持在一為6.0至7.5的範圍內，俾以確保該菌株是在一好氧且具有較佳pH值的環境下生長。在整個實驗結束之後，將每天所測得的流出物的萘含量(g)相加，而得到流出物的總萘含量(g)。
另外，在導入瓊氏不動桿菌DS44之後的第5天，從該管柱中取出適量的土壤樣品，並依據上面“一般實驗方法”的「1.苯以及萘濃度的測定」當中所述的方法來測量萘濃度，然後將所測得的萘濃度乘以該土壤樣品的重量，而得到該土壤樣品的殘餘萘含量(g)。另外，在實驗開始之前，該土壤樣品的初始萘含量(g)亦參照上述方式而被計算出來。以上實驗被重複進行2次。
有關萘降解率(naphthalene degradation rate)(%)是藉由將上面所得到的各個萘含量(g)代入下面的公式(4)而被計算出：公式(4)：J=(K-L-M)/K×100
其中：J=萘降解率(%)
K=含有萘的土壤樣品的初始萘含量(g)
L=含有萘的土壤樣品的殘餘萘含量(g)
M=流出物的總萘含量(g)
結果：
圖5顯示瓊氏不動桿菌DS44在模擬管柱裝置中對於含有萘的土壤樣品的萘降解率。由圖5可見，在與對照組相較之下，被導入有瓊氏不動桿菌DS44的土壤樣品所測得的萘降解率顯著地被增加。這個實驗結果顯示：瓊氏不動桿菌DS44可以有效地清除存在於土壤中的萘。
綜合上面的實驗結果，申請人認為：本發明的瓊氏不動桿菌DS44具有發展成為一供用於清除存在於一受污染的介質(特別是土壤)中之萘和/或苯的微生物試劑的高潛力。
於本說明書中被引述之所有專利和文獻以其整體被併入本案作為參考資料。若有所衝突時，本案詳細說明(包含界定在內)將佔上風。
雖然本發明已參考上述特定的具體例被描述，明顯地在不背離本發明之範圍和精神之下可作出很多的修改和變化。因此意欲的是，本發明僅受如隨文檢附之申請 專利範圍所示者之限制。
【生物材料寄存】
國內寄存資訊【請依：寄存機構、日期、號碼順序註記】
1. 瓊氏不動桿菌(Acinetobacter junii)DS44：食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心(BCRC of FIRDI)；2012年8月29日；BCRC 910561。
<110> 龐仁傑 何一正 周錦東 柴浣蘭
<120> 具有苯和/或萘降解能力的瓊氏不動桿菌(Acinetobacter junii)DS44分離株及其用途
<130> 瓊氏不動桿菌DS44
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 583
<212> DNA
<213> 瓊氏不動桿菌DS44
<400> 1
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工的序列
<220>
<223> 用於PCR擴增細菌菌株之16S-23S rDNA的ITS序列的前向引子ITSF
<400> 2
<210> 3
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工的序列
<220>
<223> 用於PCR擴增細菌菌株之16S-23S rDNA的ITS序列的反向引子ITSR
<400> 3
<210> 4
<211> 740
<212> DNA
<213> 瓊氏不動桿菌DS44
<400> 4

Claims (15)

  1. 一種瓊氏不動桿菌(Acinetobacter junii)DS44，其以寄存編號BCRC 910561被寄存於食品工業發展研究所的生物資源保存及研究中心。
  2. 一種用於清除存在於一受污染的介質中之苯和/或萘的微生物試劑，其包含有一如請求項1的瓊氏不動桿菌DS44或其繼代培養後代。
  3. 如請求項2的微生物試劑，其中該受污染的介質是選自於由下列所構成的群組：土壤、污泥、沉積物、蓄水層、水體、廢水以及廢氣。
  4. 如請求項3的微生物試劑，其中該受污染的介質是選自於由下列所構成的群組：田地、果園用地、放牧草地、林地、加油站用地、工業用地、井水、漁業養殖池、地下水、河水、湖水、海水、工廠廢水、生活污水以及污水處理廠的淤泥。
  5. 如請求項2的微生物試劑，其進一步包含有至少一種可清除單環和/或多環芳香烴的微生物。
  6. 如請求項2的微生物試劑，其被製造成一選自於由下列所構成之群組的劑型：培養液、懸浮液、顆粒體、粉末、錠劑、丸劑、膠囊以及濃漿。
  7. 如請求項2的微生物試劑，其進一步包含有一生物可相容的載體。
  8. 如請求項7的微生物試劑，其中該瓊氏不動桿菌DS44被該生物可相容的載體捕獲在內。
  9. 如請求項8的微生物試劑，其中該生物可相容的載體是選自於由下列所構成的群組：矽膠、澱粉、瓊脂、幾丁質、幾丁聚糖、聚乙烯醇、聚乳酸、藻酸、聚丙烯醯胺、鹿角菜膠、瓊脂糖、明膠、纖維素、醋酸纖維素、聚葡萄糖以及膠原蛋白。
  10. 如請求項7的微生物試劑，其中該瓊氏不動桿菌DS44被擔負在該生物可相容的載體上。
  11. 如請求項10的微生物試劑，其中該生物可相容的載體是選自於由下列所構成的群組：玻璃、陶瓷、金屬氧化物、活性碳、高嶺石、皂土、沸石、鋁、無煙煤、戊二醛、聚丙烯酸、聚胺甲酸酯、聚氯乙烯、離子交換樹脂、環氧樹脂、光塑性樹脂、聚酯以及聚苯乙烯。
  12. 一種用於清除存在於一受污染的介質中之苯和/或萘的方法，其包括：使用一如請求項1的瓊氏不動桿菌DS44或其繼代培養後代來處理該受污染的介質，而使得存在於該受污染的介質中之苯和/或萘被該瓊氏不動桿菌DS44或其繼代培養後代所降解。
  13. 如請求項12的方法，其中該受污染的介質是選自於由下列所構成的群組：土壤、污泥、沉積物、蓄水層、水體、廢水以及廢氣。
  14. 如請求項13的方法，其中該受污染的介質是選自於由下列所構成的群組：田地、果園用地、放牧草地、林地、加油站用地、工業用地、井水、漁業養殖池、地下水、河水、湖水、海水、工廠廢水、生活污水以及污水處理 廠的淤泥。
  15. 如請求項12的方法，其中該瓊氏不動桿菌DS44可與至少一種可清除單環和/或多環芳香烴的微生物來組合使用。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN110846257A (zh) * 2019-12-11 2020-02-28 中冶华天工程技术有限公司 降解长链烷烃的微生物菌及其应用
CN114134066A (zh) * 2021-10-13 2022-03-04 西南科技大学 一株高产脂肪酶菌株及其在油脂降解中的应用

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