TW201428255A - 分析鄰苯二甲酸酯類之試劑 - Google Patents

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Shin-Ruei Jiang
Chia-Ju Tsai
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Univ Kaohsiung Medical
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Abstract

本發明提供一種分析鄰苯二甲酸酯類之試劑，包括：一萃取溶劑，其中該萃取溶劑包括二氯甲烷(methylene chloride,CH2Cl2)、三氯甲烷(chloroform,CHCl3)或四氯甲烷(tetrachloromethane,CCl4)，且該萃取溶劑之體積為10-250μL；以及一分散溶劑，其中該分散溶劑包括乙腈(acetonitrile)、丙酮(acetone)、甲醇(methanol)或乙醇(ethanol)，且該分散溶劑之體積為30-600μL；其中該萃取溶劑與該分散溶劑使用於分散液液微萃取(dispersive liquid-liquid microextraction,DLLME)且使用於分析一液態樣品、一固態樣品或一乳化劑型化粧品樣品。

Description

分析鄰苯二甲酸酯類之試劑
本發明係有關於鄰苯二甲酸酯類之分析方法，且特別是有關於一種利用6種前處理方法搭配毛細管液相層析方法分析鄰苯二甲酸酯類。
鄰苯二甲酸酯類(phthalate esters,PAEs)是塑膠工業中常使用的塑化劑，其常應用於塑膠容器、食品包裝、玩具與化粧品中。
鄰苯二甲酸酯類為環境荷爾蒙(environmental hormones)或稱為內分泌干擾物質(endocrine-disrupting chemicals)，其可通過呼吸道(respiratory)、消化道(gastroinstestinal)與皮膚等途徑進入人體。
為了避免鄰苯二甲酸酯類危害人體健康，各國針對不同樣品中的鄰苯二甲酸酯類含量有不同的規定。目前台灣衛生署已公告禁止將鄰苯二甲酸二(乙基己基)酯(di-(2-ethyl hexyl)phthalate,DEHP)、鄰苯二甲酸二正丁酯(di-n-butyl phthalate,DBP)、鄰苯二甲酸丁基苯甲酯(butyl benzyl phthalate,BBP)、鄰苯二甲酸二辛酯(di-n-octyl phthalate,DOP)添加到化粧品中。
為了人體健康考量，分析各式樣品中的鄰苯二甲酸酯類是極為重要的，因此，本發明提供一種分析鄰苯二甲酸酯類之方法。
本發明提供一種鄰苯二甲酸酯類之分析方法，包括以下步驟：提供一液態樣品或固態樣品；對該液態樣品或固態樣品進行一前處理方法以得到一萃取液，其中該前處理方法包括液相液相萃取(liquid liquid extraction,LLE)、超音波輔助萃取(ultrasonic-assisted extraction,UAE)、微波輔助萃取(microwave-assisted extraction,MAE)、分散液液微萃取(dispersive liquid-liquid microextraction,DLLME)、冷凝分散液液微萃取(dispersive liquid-liquid microextraction-solidification of floating organic droplet,DLLME-SFO)或霧點萃取(cloud point extraction,CPE)；以及將該萃取液送入一毛細管液相層析儀搭配紫外光/可見光光譜儀中進行偵測，以分析該液態樣品或固態樣品中之鄰苯二甲酸酯類。
本發明另提供一種分析鄰苯二甲酸酯類之試劑，包括：一萃取溶劑，其中該萃取溶劑包括二氯甲烷(methylene chloride,CH2Cl2)、三氯甲烷(chloroform,CHCl3)或四氯甲烷(tetrachloromethane,CCl4)，且該萃取溶劑之體積為10-250μL；以及一分散溶劑，其中該分散溶劑包括包括乙腈(acetonitrile)、丙酮(acetone)、甲醇(methanol)或乙醇(ethanol)，且該分散溶劑之體積為30-600μL；其中該萃取溶劑 與該分散溶劑使用於分散液液微萃取(dispersive liquid-liquid microextraction,DLLME)。
本發明又提供一種分析鄰苯二甲酸酯類之試劑，包括：一萃取溶劑，其中該萃取溶劑包括十一烷醇(undecanol)、1-十二烷醇(1-dodecanol)、2-十二烷醇(2-dodecanol)、正十六烷(n-hexadecane)、1-溴十六烷(1-bromohexadecane)、1,10-二氯癸烷(1,10-dichlorodecane)或1-氯十八烷(1-chlorooctadecane)，且該萃取溶劑之體積為5-150μL；以及一分散溶劑，其中該分散溶劑包括乙腈(acetonitrile)、丙酮(acetone)、甲醇(methanol)或乙醇(ethanol)，且該分散溶劑之體積為30-600μL；其中該萃取溶劑與該分散溶劑使用於冷凝分散液液微萃取(dispersive liquid-liquid microextraction-solidification of floating organic droplet,DLLME-SFO)。
本發明另一種分析鄰苯二甲酸酯類之試劑，包括：一界面活性劑，其中該界面活性劑包括Triton X-100、Triton X-114、Genapol X-080，其中該界面活性劑使用於霧點萃取(cloud point extraction,CPE)。
第1-3圖為一系列層析圖，用以說明用本發眀毛細管液相層析儀搭配紫外光/可見光光譜儀分析13種鄰苯二甲酸酯類之訊號。
本發明提供一種鄰苯二甲酸酯類之分析方法，包括以下步驟，首先，提供液態樣品或固態樣品，其中液體樣品包括流動性液體樣品或半流動性液體樣品，其中流動性液體樣品包括水樣品或化粧品樣品，而水樣品例如飲用水、自來水，而化粧品樣品例如水溶液型化粧品或乳化劑型化粧品。半流動性液體樣品例如乳液樣品。固體樣品包括型態固定之塑膠製品。
接著，對液態樣品或固態樣品進行前處理方法以得到萃取液(extraction liquid)，其中前處理方法包括液相液相萃取(liquid liquid extraction,LLE)、超音波輔助萃取(ultrasonic-assisted extraction,UAE)、微波輔助萃取(microwave-assisted extraction,micro-MAE)、分散液液微萃取(dispersive liquid-liquid microextraction,DLLME)、冷凝分散液液微萃取(dispersive liquid-liquid microextraction-solidification of floating organic droplet,DLLME-SFO)或霧點萃取(cloud point extraction)。
須注意的是，由於待測樣品(液態樣品或固態樣品)型態及基質(matrix)成分複雜，因此，固態樣品須先均質化，以水、乙腈或甲醇為溶劑溶解之後，離心取上清液，再依據待測樣品之特性選擇所需之前處理方法。
下文將分別討論六種前處理方法，為簡化說明，用英文縮寫代表各種不同的前處理方法。
1.液相液相萃取(liquid liquid extraction,LLE)
LLE之原理係藉由待測樣品與萃取溶劑之間的「相似相 溶」，亦即極性化合物溶於極性溶劑中，非極性化合物溶於非極性溶劑中，依據待測樣品之極性選擇合適的萃取溶劑。因此，當前處理方法為液相液相萃取(LLE)時，可藉由改變萃取溶劑之種類與萃取次數，找到最佳化之萃取條件。
當前處理方法選擇液相液相萃取(LLE)時，LLE之萃取溶劑包括甲苯(toluene)、乙酸乙酯(ethyl acetate)或己烷(hexane)、二氯甲烷(methylene chloride,CH2Cl2)或三氯甲烷(chloroform,CHCl3)。LLE之萃取次數(extraction times)為約1-4次，較佳為2-3次。
LLE之實驗步驟如下：
(A)將待測樣品溶液與萃取溶劑加入樣品瓶中。
(B)震盪混合(vortexing)待測樣品溶液與萃取溶劑。
(C)利用離心方式使溶液分層，收集有機層。
(D)可重複上述步驟多次，將所有的有機層濃縮乾燥，以得到萃取物。
(E)萃取物溶解於甲醇中，以得到萃取液。
2.超音波輔助萃取(ultrasonic-assisted extraction,UAE)
UAE之原理係利用超音波頻率高時，具有強穿透力，使萃取溶劑能與待測樣品充分混合，而增強萃取效果。因此，當前處理方法為超音波輔助萃取(UAE)時，可藉由改變萃取溶劑之種類(extraction solvent)、超音波之溫度(extraction temperature)、超音波平衡時間(extraction duration)與萃取次數(extraction times)，找到最佳化之萃取條件。
當前處理方法選擇UAE時，UAE之萃取溶劑包括甲苯(toluene)、乙酸乙酯(ethyl acetate)或己烷(hexane)、二氯甲烷(methylene chloride,CH2Cl2)或三氯甲烷(chloroform,CHCl3)。UAE之萃取溫度為約30℃-50℃，較佳為約30℃-50℃。UAE之平衡時間為約5-20分鐘，較佳為約10-15分鐘。UAE之萃取次數(extraction times)為約1-4次，較佳為2-3次。
UAE之實驗步驟如下：
(A)將待測樣品溶液與萃取溶劑加入樣品瓶中。
(B)震盪混合(vortexing)待測樣品溶液與萃取溶劑，再經由超音波震盪數分鐘。
(C)利用離心方式使溶液分層，收集有機層。
(D)可重複上述步驟多次，將所有的有機層濃縮乾燥，以得到萃取物。
(E)萃取物溶解於甲醇中，以得到萃取液。
3.微波輔助萃取(microwave-assisted extraction,MAE)
MAE之原理係利用微波對萃取系統中的待測樣品直接作用，藉由微波能量加熱溶劑，而溶劑直接與待測樣品基質接觸，使待測物從待測樣品基質中脫附出來而溶於溶劑中。因此，當前處理方法為微波輔助萃取(MAE)時，可藉由改變萃取溶劑之種類(extraction solvent)、微波之能量(microwave power)、平衡時間(equilibration time)與萃取次數(extraction times)，找到最佳化之萃取條件。
當前處理方法選擇MAE時，MAE之萃取溶劑包括 甲苯(toluene)、乙酸乙酯(ethyl acetate)或己烷(hexane)、二氯甲烷(methylene chloride,CH2Cl2)或三氯甲烷(chloroform,CHCl3)。
適當的微波能量能幫助待測樣品溶解，理論上較高的微波能量可減少微波時間，但對於不耐熱的待測樣品，使用易揮發的溶劑時，反而高微波能量會降低萃取效率，因此，MAE之微波之能量(microwave power)為約200-1100瓦(W)，較佳為約500-900瓦(W)，更佳為約600-800瓦(W)。
MAE之平衡時間為約3-9分鐘，較佳為約4-8分鐘，更佳為約5-7分鐘。MAE之萃取次數(extraction times)為約1-4次，較佳為2-3次。
MAE之實驗步驟如下：
(A)將待測樣品溶液與萃取溶劑加入樣品瓶中。
(B)震盪混合(vortexing)待測樣品溶液與萃取溶劑，再經由微波(microwave)處理數分鐘。
(C)利用離心方式使溶液分層，收集有機層。
(D)可重複上述步驟多次，將所有的有機層濃縮乾燥，以得到萃取物。
(E)萃取物溶解於甲醇中，以得到萃取液。
4.分散液液微萃取(dispersive liquid-liquid microextraction,DLLME)
DLLME之原理係為液相液相萃取的微型化，藉由待測樣品在樣品基質(matrix)、萃取溶劑、分散溶劑之間平衡分配的過程，而達到萃取的目的。因此，當前處理方法為DLLME時，可 藉由改變萃取溶劑之種類(extraction solvent)、萃取溶劑的體積(volume of extraction solvent)、分散溶劑的種類(dispersive solvent)、分散溶劑的體積(volume of dispersive solvent)，找到最佳化之萃取條件。
DLLME之實驗步驟如下：
(A)將萃取溶劑、分散溶劑與待測樣品溶液加入樣品瓶中。
(B)震盪混合(vortexing)萃取溶劑、分散溶劑與待測樣品溶液後，萃取溶劑會形成微小液滴分散於待測樣品溶液中。當達到平衡狀態後，樣品溶液呈現霧狀溶液(cloudy solution)。
(C)利用離心方式使霧狀溶液分成兩層(水相與有機相)，含有待測物的待測樣品會沉積在底層的有機相中。
(D)之後，收集沉澱相(sedimented phase)，之後再乾燥，以得到萃取物。
(E)將萃取物溶解於甲醇中，以得到萃取液。
當前處理方法選擇DLLME時，DLLME之萃取溶劑包括二氯甲烷(methylene chloride,CH2Cl2)、三氯甲烷(chloroform,CHCl3)或四氯甲烷(tetrachloromethane,CCl4)；當樣品量介於0.2-10mL時，萃取溶劑之體積為約10-250μL，較佳為約20-30μL。
DLLME之分散溶劑包括乙腈(acetonitrile)、丙酮(acetone)、甲醇(methanol)或乙醇(ethanol)。當樣品量介於0.2-10mL時，分散溶劑之體積為約30-600μL，較佳為約70-100 μL。
須注意的是，當萃取溶劑的體積高於50μL時，離心後的有機相體積也會增加，反而會導致待測物(含有鄰苯二甲酸酯類)於有機相的濃度下降，進而造成濃縮係數(enrichment factor)下降。當分散溶劑的體積高於180μL時，待測物(含有鄰苯二甲酸酯類)在待測樣品溶液中的溶解度會提高，造成分配係數(distribution coefficient)降低，使萃取效率下降。
然而，分散溶劑並不限於上述提及之種類，只要是能與待測樣品溶液與萃取溶劑達到互溶之溶劑，亦在本發明所保護之範圍內。
於一較佳實施例中，萃取溶劑為三氯甲烷(chloroform,CHCl3)，分散溶劑為乙腈(acetonitrile)，且萃取溶劑、分散溶劑與待測樣品溶液之體積比為約2：9：30。
5.冷凝分散液液微萃取(dispersive liquid-liquid microextraction-solidification of floating organic droplet,DLLME-SFO)
DLLME-SFO之原理係結合DLLME與冷凝高熔點有機溶劑兩種方法，主要係採用低密度、低毒性的有機溶劑取代DLLME中所使用之含氯有機溶劑。因此，當前處理方法為DLLME-SFO時，可藉由改變萃取溶劑之種類(extraction solvent)、萃取溶劑的體積(volume of extraction solvent)、分散溶劑的種類(dispersive solvent)、分散溶劑的體積(volume of dispersive solvent)，找到最佳化之萃取條件。
DLLME-SFO之實驗步驟如下：
(A)將萃取溶劑、分散溶劑與待測樣品溶液加入樣品瓶中。
(B)震盪混合(vortexing)萃取溶劑、分散溶劑與待測樣品溶液後，萃取溶劑會形成微小液滴分散於待測樣品溶液中。之後，達到平衡狀態後，樣品溶液呈現霧狀溶液(cloudy solution)。利用離心方式使霧狀溶液分成兩層(水相與有機相)，含分析物的待測樣品會被萃取於上層有機相中。
(C)將樣品瓶放入冰浴中數分鐘，含分析物之上層有機相會冷卻凝固而與水相分離。
(D)最後，將含分析物之上層凝固有機相(含有鄰苯二甲酸酯類)取出或抽掉下層水溶液丟棄，回到室溫即得到萃取液。
當前處理方法選擇DLLME-SFO時，DLLME-SFO之萃取溶劑需要具備水中溶解度低、密度比水低、低揮發、對鄰苯二甲酸酯類有萃取能力與熔點接近室溫(約10-30℃)等優點。
萃取溶劑可選擇不含鹵素的溶劑，其中不含鹵素的溶劑包括十一烷醇(undecanol，熔點為13-15℃)、1-十二烷醇(1-dodecanol，熔點為22-24℃)、2-十二烷醇(2-dodecanol，熔點為17-18℃)或正十六烷(n-hexadecane，熔點為18℃)。當樣品量介於0.2-10mL時，萃取溶劑之體積為約5-150μL，較佳為約15-25μL。
DLLME-SFO之分散溶劑包括乙腈(acetonitrile)、丙酮(acetone)、甲醇(methanol)或乙醇(ethanol)。當樣品量介於 0.2-10mL時，分散溶劑之體積為約30-600μL，須注意的是，當分散溶劑之體積越小可得萃取液中待測物濃度越高。
於一較佳實施例中，萃取溶劑為1-十二烷醇(1-dodecanol)，分散溶劑為丙酮(acetone)，且萃取溶劑、分散溶劑與待測樣品溶液之體積比為約2：3：30。
6.霧點萃取(cloud point extraction,CPE)
CPE之原理係利用非離子型界面活性劑作為萃取溶劑，當非離子型界面活性劑溶於水中的濃度超過臨界微胞濃度(critical micellar concentration,CMC)時，非離子型界面活性劑會形成微胞，經過加熱後，待測樣品溶液會產生不互溶的兩相，一相含有濃度較高的界面活性劑的微胞相，另一相為含有較少量界面活性劑的水溶液相，而待測物(含有鄰苯二甲酸酯類)會被包覆在微胞相中。
此外，添加鹽類到待測樣品中可增加水相密度與離子強度，因此可促進兩相分離而提高萃取效率，此外，添加鹽類也可以改變界面活性劑之霧化溫度。因此，當前處理方法為CPE時，可藉由改變界面活性劑之種類(surfactant)、界面活性劑的濃度(concentration of surfacant)、鹽類之濃度(concentration of electrolyte)、平衡溫度(extraction temperature)與平衡時間(equilibration time)，找到最佳化之萃取條件。
當前處理方法選擇CPE時，CPE之界面活性劑包括Triton X-100、Triton X-114或Genapol X-080。界面活性劑的濃度必須要超過界面活性劑溶於水中之臨界微胞濃度(CMC)。於一實施例中，當界面活性劑為Genapol X-080時，其CMC為0.028 %(w/v)。
CPE之平衡溫度必須超過界面活性劑之霧點溫度。於一實施例中，當界面活性劑為Genapol X-080時，其霧點溫度為約42℃。CPE之平衡時間為約30-120分鐘，較佳為約45-90分鐘。CPE中，可添加的鹽類包括氯化鈉(NaCl)或氯化鉀(KCl)。
CPE之實驗步驟如下：
(A)將界面活性劑與待測樣品溶液加入樣品瓶中。
(B)震盪混合(vortexing)界面活性劑與待測樣品溶液後，將樣品瓶放置到恆溫水浴槽(thermostatic bath)中。
(C)之後，收集150μL含有濃度較高的界面活性劑的微胞相，以得到萃取液。
於一較佳實施例中，界面活性劑為Genapol X-080，且界面活性劑之濃度為4%(W/V)，平衡溫度為60℃，且4%(W/V)Genapol X-080與待測樣品溶液之體積比為約1：1。
最後，由上述6種不同前處理方法而得的萃取液，接著將萃取液送入毛細管液相層析儀(capillary liquid chromatography)搭配紫外光/可見光光譜儀中進行偵測，以分析水樣品或化粧品樣品中之鄰苯二甲酸酯類。毛細管液相層析儀中的毛細管管柱之內徑為約0.05-1.0mm，此外，內徑越小分離效率越好。
上述之鄰苯二甲酸酯類包括鄰苯二甲酸二甲酯(dimethyl phthalate,DMP)、鄰苯二甲酸二乙酯(diethyl phthalate,DEP)、鄰苯二甲酸二烯丙酯(Diallyl phthalate, DAP)、鄰苯二甲酸二丙酯(di-n-propyl phthalate,DprP)、鄰苯二甲酸丁基苯甲酯(butyl benzyl phthalate,BBP)、鄰苯二甲酸二正丁酯(di-n-butyl phthalate,DBP)、鄰苯二甲酸正戊酯(di-n-pentyl phthalate,DPP)、鄰苯二甲酸二環己酯(dicyclohexyl phthalate,DCHP)、鄰苯二甲酸二(4-甲基-2-戊基)酯(Bis(4-methyl-2-pentyl)phthalate,BMPP)、鄰苯二甲酸二正己酯(di-n-hexyl phthalate,DnHP)、鄰苯二甲酸二(乙基己基)酯(di-(2-ethyl hexyl)phthalate,DEHP)或鄰苯二甲酸二辛酯(di-n-octyl phthalate,DOP)、鄰苯二甲酸雙十一酯(Diundecyl phthalate,DUP)。
毛細管液相層析中所使用的移動相(mobile phase)之沖提液包括水、乙腈(acetonitrile)或上述之組合，且使用梯度沖提(gradient elution)方式，沖提時間、沖提液與流速如表1：
毛細管液相層析的流速為約10-20μL/ml，注入體積為約0.2-0.7μL。紫外光/可見光光譜儀之偵測波長包括202nm、225nm或275nm。
此外，鄰苯二甲酸酯類於偵測波長225nm與275nm 之偵測訊號的面積比例為約(6-9)：1(於標準偏差RSD=5-6%的條件下)。
須注意的是，相較於傳統的高效能液相層析(high performance liquid chromatography,HPLC)管柱，本發明使用微米級毛細管管柱之內徑小，因此，所需要的溶劑使用量較少，樣品的載入量較少，產生之廢液較少，較符合環保之需求。因此，本發明所提供之鄰苯二甲酸酯類之分析方法，適合應用於分析真實水樣品或化粧品樣品中。
本發明以毛細管液相層析法分析10種鄰苯二甲酸酯類之標準品，實驗結果顯示異日內分析(inter-day assay)，相對標準偏差小於5.43%，表示具有良好精密度，相對誤差小於5.35%，表示具有良好準確度。此外，於同日內分析，相對標準偏差小於4.62%，表示具有良好精密度，相對誤差小於3.3%，表示具有良好準確度。
再者，分析13種鄰苯二甲酸酯類之標準品，其偵測極限為0.17μg/mL，線性範圍為0.5-50μg/mL。
【實施例】
實施例1
先製備標準品如下，分別將DMP、DEP、DprP、BBP、DBP、DPP、DCHP、DnHP、DEHP、DOP十種鄰苯二甲酸酯類的標準品配置成3種不同濃度5.00μg/mL、20.00μg/mL、30.00μg/mL。
每次取0.5μL的上述樣品送入毛細管液相層析儀搭配紫外光/可見光光譜儀中進行偵測，藉由異日間分析(inter-day assay)與同日內分析(intra-day assay)評估本發明之 分析方法的精密度(precision)與準確度(accuracy)。
表2顯示10種鄰苯二甲酸酯類之異日間分析(inter-day assay)之精密度與準確度。由表2可得知，於異日間分析，相對標準偏差小於5.43%，表示具有良好精密度，相對誤差小於5.35%，表示具有良好準確度。
表3顯示10種鄰苯二甲酸酯類之同日內分析(intra-day assay)之精密度與準確度。由表3可得知，於同日內分析，相對標準偏差小於4.62%，表示具有良好精密度，相對誤差小於3.3%，表示具有良好準確度。
第1圖顯示35.00μg/mL之13種鄰苯二甲酸酯類之訊號，於偵測波長202nm的條件下進行偵測。第2圖顯示35.00μg/mL之13種鄰苯二甲酸酯類之訊號，於偵測波長225nm的條件下進行偵測。第3圖顯示35.00μg/mL之13種鄰苯二甲酸酯類之訊號，於偵測波長275nm的條件下進行偵測。
於第1-3圖中，圖中訊號(1)DMP；(2)DEP；(3)DAP；(4)DprP；(5)BBP；(6)DBP；(7)DPP；(8)DCHP；(9)BMPP；(10)DnHP；(11)DEHP；(12)DOP；(13)內部標準品：棕櫚酸萘酯(Naphthyl palmitate)(14)DUP。由第1-3圖中可知，利用本發眀之毛細管液相層析法，可分離出13種鄰苯二甲酸酯類。
實施例2
實施例2顯示3種不同的水樣品經過6種不同的前處理方法以得到萃取液，再將萃取液送入毛細管液相層析儀搭配紫外光/可見光光譜儀中進行偵測。
以下分別描述6種不同前處理方法之實驗步驟。
(1)LLE
將300μL的水樣品加入玻璃樣品瓶(glass sample vials)中，再加入100μL乙酸乙酯(ethyl acetate)。經過震盪混合(vortexing)1分鐘之後，再離心(轉速3000g)5分鐘。離心之後，收集75μL懸浮液(supernatant)。重複上述步驟多次，將所有的懸浮液濃縮乾燥，以得到萃取物。
(2)UAE
將300μL的水樣品加入玻璃樣品瓶(glass sample vials)中，再加入150μL乙酸乙酯(ethyl acetate)。經過震盪混合(vortexing)1分鐘之後，再經由超音波於30℃下震盪15分鐘(Branson 3510，工作頻率42kHz,100W)，再離心(轉速3000g)5分鐘。離心之後，收集110μL懸浮液(supernatant)。重複上述步驟多次，將所有的懸浮液濃縮乾燥，以得到萃取物。
(3)MAE
將300μL的水樣品加入玻璃樣品瓶(glass sample vials)中，再加入150μL乙酸乙酯(ethyl acetate)。經過震盪混合(vortexing)1分鐘之後，再經由微波於700W 6分鐘，再離心(轉速3000g)5分鐘。離心之後，收集110μL懸浮液(supernatant)。重複上述步驟多次，將所有的懸浮液濃縮乾燥，以得到萃取物。
(4)DLLME
將300μL的水樣品加入玻璃樣品瓶(glass sample vials)中，再加入90μL乙腈(acetonitrile)與20μL三氯甲烷(chloroform,CHCl3)。經過震盪混合(vortexing)1分鐘之後，再離心(轉速3000g)5分鐘。離心之後，收集30μL的沉澱相(sedimented phase)，之後再乾燥，以得到萃取物。
(5)DLLME-SFO
將300μL的水樣品加入玻璃樣品瓶(glass sample vials)中，再加入30μL丙酮(acetone)(作為分散溶劑)與20μL 1-十二烷醇(1-dodecanol)(作為萃取溶劑)。經過震盪混合(vortexing)1分鐘之後，再離心(轉速3000g)5分鐘，之後放入冰浴5分鐘。去除液相之後，將殘餘物送到毛細管液相層析儀。
(6)CPE
將300μL的水樣品加入玻璃樣品瓶(glass sample vials)中，再加入300μL的4% Genapol X-080(w/v)(作為界面活性劑)。經過震盪混合(vortexing)1分鐘之後，樣品瓶放置到60℃恆溫水浴槽(thermostatic bath)中45分鐘。之後，收集150μL含有濃度較高的界面活性劑的微胞相(surfactant-rich phase)，接著送到毛 細管液相層析儀。
經由上述6種不同前處理方法收集到的萃取物，再加入300μL的甲醇，形成萃取液。於注入分析儀器之前，150μL的待測溶液混合20μL的內部標準品棕櫚酸萘酯(Naphthyl palmitate)。
毛細管液相層析儀(Agilent 1200 series LC system)搭配紫外光/可見光光譜儀之實驗條件如下：管柱為Agilent ZORBAX SB-C18管柱(150×0.5mm；5μm)；移動相(mobile phase)由水與乙腈(acetonitrile)所組成，且使用梯度沖提(gradient elution)方式，沖提時間與濃度如上述表1；流速為約15μL/min；注入量為約0.5μL；紫外光/可見光之偵測波長為約225nm。
表4顯示利用6種前處理方法偵測到3種不同水樣品的鄰苯二甲酸酯類含量(μg/mL)。由表4可知，在水樣品中較常存在DEP與DBP。另外，使用DLLME-SFO的前處理方法，因層析結果會干擾DPP與DCHP，因此，此方法不適用分析這兩種分析物。
實施例3 偵測化粧品樣品
實施例3係將實施例2所使用之水樣品置換成化粧品樣品，實驗操作方法皆相同。
表5顯示利用6種前處理方法偵測3種市售水溶液劑型化粧品樣品的鄰苯二甲酸酯類含量(μg/mL)。表6顯示利用6種前處理方法偵測3種市售乳化劑型化粧品樣品的鄰苯二甲酸酯類含量(μg/mL)。
由表5、表6中可知，若前處理步驟無法分成有機層與水層，則添加20%氯化鈉(NaCl)幫助分層，即可完成萃取。另外，使用DLLME-SFO的前處理方法，因層析結果會干擾DPP與DCHP，因此，此方法不適用分析這兩種分析物。於表6中，因為樣品為乳化劑型，適用LLE、UAE與DLLME-SFO之前處理方法。
上述數據為測量3次的平均值
ND：並未偵測到鄰苯二甲酸酯類
X：方法不適用於分析此分析物
上述數據為測量3次的平均值
ND：並未偵測到鄰苯二甲酸酯類
X：方法不適用於分析此分析物
c：添加20%氯化鈉(NaCl)
上述數據為測量3次的平均值
ND：並未偵測到鄰苯二甲酸酯類
X：方法不適用於分析此分析物
c：添加20%氯化鈉(NaCl)
實施例4 偵測固態樣品
取4種不同的固態樣品，分別為PVC手套(代號Q)、食物塑膠袋之內袋(代號R)、食物塑膠袋之外袋(代號S)、醬料袋(代號T)。
4種固態樣品分別進行下述實驗步驟：
(1)將樣品剪成小碎片，面積大小約為0.5×0.5cm2。
(2)秤取100mg的小碎片四份，分別加入3mL的冷水(約25℃)、熱水(100℃)、乙腈或丙酮。
(3)將其混合物於30℃的水中超音波震盪30分鐘，之後離心取上清液。
(4-1)分別取出300μL由冷水萃取的上清液，進行DLLME或DLLME-SFO的萃取。
(4-2)分別取出300μL由熱水萃取的上清液，進行DLLME或DLLME-SFO的萃取。
(4-3)取出90μL由乙腈萃取得上清液，加入到300μL的水中，再加入20μL的三氯甲烷(chloroform)進行DLLME萃取。
(4-4)取出30μL由丙酮萃取得上清液，加入到300μL的水中，再加入20μL的1-dodecanol進行DLLME-SFO萃取。
表7顯示利用DLLME前處理方法偵測4種固態樣品的鄰苯二甲酸酯類含量(μg/mL)。
表8顯示利用DLLME-SFO前處理方法偵測4種固態樣品的鄰苯二甲酸酯類含量(μg/mL)。
上述數據為測量3次的平均值
ND：並未偵測到鄰苯二甲酸酯類
上述數據為測量3次的平均值
ND：並未偵測到鄰苯二甲酸酯類
X：方法不適用於分析此分析物
雖然本發明已以數個較佳實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何所屬技術領域中具有通常知識者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作任意之更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

Claims (6)

  1. 一種分析鄰苯二甲酸酯類之試劑，包括：一萃取溶劑，其中該萃取溶劑包括二氯甲烷(methylene chloride,CH2Cl2)、三氯甲烷(chloroform,CHCl3)或四氯甲烷(tetrachloromethane,CCl4)，且該萃取溶劑之體積為10-250μL；以及一分散溶劑，其中該分散溶劑包括包括乙腈(acetonitrile)、丙酮(acetone)、甲醇(methanol)或乙醇(ethanol)，且該分散溶劑之體積為30-600μL；其中該萃取溶劑與該分散溶劑使用於分散液液微萃取(dispersive liquid-liquid microextraction,DLLME)且使用於分析一液態樣品、一固態樣品或一乳化劑型化粧品樣品。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之分析鄰苯二甲酸酯類之試劑，其中該萃取溶劑為三氯甲烷(chloroform,CHCl3)，該分散溶劑為乙腈(acetonitrile)，且該萃取溶劑與該分散溶劑之體積比為2：9。
  3. 一種分析鄰苯二甲酸酯類之試劑，包括：一萃取溶劑，其中該萃取溶劑包括十一烷醇(undecanol)、1-十二烷醇(1-dodecanol)、2-十二烷醇(2-dodecanol)、正十六烷(n-hexadecane)、1-溴十六烷(1-bromohexadecane)、1,10-二氯癸烷(1,10-dichlorodecane)或1-氯十八烷(1-chlorooctadecane)，且該萃取溶劑之體積為5-150μL；以及 一分散溶劑，其中該分散溶劑包括包括乙腈(acetonitrile)、丙酮(acetone)、甲醇(methanol)或乙醇(ethanol)，且該分散溶劑之體積為30-600μL；其中該萃取溶劑與該分散溶劑使用於冷凝分散液液微萃取(dispersive liquid-liquid microextraction-solidification of floating organic droplet,DLLME-SFO)且使用於分析一液態樣品、一固態樣品或一乳化劑型化粧品樣品。
  4. 如申請專利範圍第3項所述之分析鄰苯二甲酸酯類之試劑，其中該萃取溶劑為1-十二烷醇(1-dodecanol)，該分散溶劑為丙酮(acetone)，且該萃取溶劑與該分散溶劑之體積比為2：3。
  5. 一種分析鄰苯二甲酸酯類之試劑，包括：一界面活性劑，其中該界面活性劑包括Triton X-100、Triton X-114、Genapol X-080，其中該界面活性劑使用於霧點萃取(cloud point extraction,CPE)且使用於分析一液態樣品、一固態樣品或一乳化劑型化粧品樣品。
  6. 如申請專利範圍第5項所述之分析鄰苯二甲酸酯類之試劑，其中該界面活性劑為Genapol X-080，且界面活性劑之濃度為4%(W/V)。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN111208263A (zh) * 2020-01-16 2020-05-29 贵州省烟草科学研究院 一种应用种子评价全生物降解地膜中有机添加剂生态毒性的方法

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