TW201341002A - 判斷紫外光曝曬量之方法 - Google Patents

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Abstract

提供判斷傳遞至樣品(包含低光學傳輸複合流體)之UVC光劑量的方法。亦提供使樣品中之有機體(諸如孢子、細菌或病毒)不活化之方法，其包含向包含低光學傳輸複合流體之樣品傳遞一定劑量之UVC光。

Description

判斷紫外光曝曬量之方法 相關申請案之交叉引用
本申請案主張2012年3月15日申請之美國臨時申請案第61/611,362號的權益，其以引用的方式併入本文中。
本發明一般係關於判斷傳遞至樣品之UV光劑量之化合物及方法，其可應用於多種領域，包括使用UVC波長之光使諸如細菌、病毒及孢子之有機體不活化，及活化及/或抑制化學反應。
細胞培養基及上清液之病毒污染對全世界的生物醫藥製造商提出了挑戰。已採用若干方法使來自細胞上清液之或多或少之包膜或未包膜(或「裸」)DNA或RNA病毒粒子不活化及/或移除。此等方法之實例包括20 nm過濾技術、陰離子交換膜層析法、低pH值培育及深度過濾技術。
除上述技術之外，紫外(UV)光(尤其UVC譜帶中之光)亦已用於處理低傳輸溶液(包括細胞培養基)以使病毒不活化。然而，為了達到有效的病毒不活化，溶液必須曝曬於足夠且充分限定劑量之UV光(UVC譜帶中)以確保所要程度之病毒不活化。連續確保有效病毒不活化依靠對低光學傳輸溶液接收到的UVC輻射之劑量進行準確定量。
目前，存在兩種常用方法來定量由UVC反應器傳遞至流體之殺菌劑量。第一種方法使用生物劑量判斷法，藉此向反應器處理之流體 中加入攻擊微生物(例如病毒，諸如小DNA病毒)，且判斷不活化動力學。生物劑量學結果闡述由UVC反應器傳遞之平均流量(fluency)。對於高光學傳輸溶液(諸如水)，通常使用生物劑量判斷法按比例執行反應器驗證。然而，此方法不能量測反應器內之劑量範圍及劑量分佈，此為理解反應器設計、操作及按比例放大的關鍵參數。此外，按比例進行該等研究可能需要將生物污染物引入與不活化技術預期保護完全一樣之環境。因為衛生加工的控制要求，所以此困境對於在生物醫藥、醫藥及食物飲料情形中的低光學傳輸溶液處理尤其不可接受。最後，使用生物劑量判斷法之不活化量測在應用於高嚴格性不活化處理時傾向於產生「臨限值(threshold)」結果；因此，若非劑量超過已知臨限值，則不確定所接收之真實劑量。
通常與生物劑量判斷法結合使用之第二種方法為數學模式建立。數學模式建立與流體特性、系統幾何形狀及計算流體動力學一起採用比爾-朗伯定律(Beer-Lambert law)來估算所傳遞之殺菌劑量。存在市售電腦程式幫助建立該等模型，例如UVCalc®(Bolton Photosciences Inc.)及FLUENT(ANSYS,Inc.)。數學模型主要應用於具有高傳輸之流體(例如水)。然而，此方法亦具有缺點；對於涉及處理高度吸收(亦即低傳輸)流體(諸如細胞培養基)之應用，由於比爾-朗伯定律或其他光吸收數學描述中之非線性光吸收現象，所以數學模型具有較大程度之不準確度。儘管數學模型建立法具有根據分佈情況恰當描述所接收UVC劑量之優勢，但缺乏以實驗量測驗證，所以認為結果為理論結果且可能與量測到之現實不同。
因此，需要準確量測傳遞至低傳輸流體(諸如細胞培養基)之UVC劑量的方法，且因此確保向流體傳遞殺菌劑量之UVC光。
提供一種判斷傳遞至樣品(包含低光學傳輸複合流體)之UVC光劑 量的方法。在一個實施例中，該方法包含(a)量測UVC光源傳遞之通量率；(b)藉由以下產生標準曲線：(i)使可漂白螢光發射極與低光學傳輸複合流體接觸形成對照混合物；(ii)使對照混合物曝曬於UVC光持續初始滯留時間；(iii)自對照混合物獲得等分試樣；(iv)量測(iii)之等分試樣發射的螢光；(v)重複(ii)-(iv)一或多次，其中對照混合物曝曬於UVC光的滯留時間比初始滯留時間長；(vi)使發射之螢光與滯留時間關聯；(c)使可漂白螢光發射極與包含低光學傳輸複合流體之測試流體接觸形成測試混合物；(d)使測試混合物曝曬於UVC光持續所選滯留時間；(e)量測由測試混合物所發射之螢光；及(f)使用(b)之標準曲線判斷傳遞至測試混合物之劑量。在另一實施例中，UVC光之波長在約200 nm至約280 nm之範圍內。在另一實施例中，UVC光之波長為254 nm。在另一實施例中，低光學傳輸複合流體包含細胞培養基、血清、包含維生素之混合物、糖及顏料，以及含有胺基酸、肽或蛋白質之溶液。在另一實施例中，可漂白螢光發射極包含UV敏感之螢光微球體。在另一實施例中，UVC光源為NIST可追蹤VC光源。在另一實施例中，劑量以劑量分佈、平均劑量、P10劑量、P50劑量及P90劑量中之一者的形式提供。在另一實施例中，使用NIST可追蹤UVC偵測器量測UVC光源傳遞之通量率。
亦提供一種使樣品中之有機體不活化的方法，該樣品包含已知或懷疑包含有機體之低光學傳輸複合流體。在一個實施例中，該方法包含(a)識別已知或懷疑使病毒不活化之UVC劑量；及(b)使樣品曝曬於UVC光源提供的不活化劑量之UVC光；其中不活化劑量包含所選波長、所選UVC反應器功率及所選滯留時間；且其中功率及照射時間使用由以下產生之標準曲線判斷：(i)量測UVC光源傳遞之通量率；(ii)使可漂白螢光發射極與低光學傳輸複合流體接觸形成對照混合物；(iii)使對照混合物曝曬於UVC光持續初始滯留時間；(iv)自對照混合 物獲得等分試樣；(v)量測(iv)之等分試樣發射的螢光；(vi)重複(iii)-(v)一或多次，其中對照混合物曝曬於UVC光的滯留時間不同於初始滯留時間；及(vii)使發射之螢光與滯留時間關聯。在另一實施例中，UVC光之波長在約200 nm至約280 nm之範圍內。在另一實施例中，UVC光之波長為254 nm。在另一實施例中，低傳輸流體包含細胞培養基。在另一實施例中，螢光發射極包含UV敏感之螢光微球體。在另一實施例中，有機體為孢子。在另一實施例中，有機體為病毒。在另一實施例中，有機體為細菌。在另一實施例中，病毒包含dsDNA病毒、ssDNA病毒、dsRNA病毒及ssRNA病毒中之一或多者。在另一實施例中，病毒包含dsDNA病毒、ssDNA病毒、dsRNA病毒及ssRNA病毒中之一或多者；在特定實施例中，病毒可包含以下病毒科中一或多者之病毒：腺病毒科(adenoviridae)、非洲豬瘟病毒科(asfarviridae)、疱疹病毒科(herpesviridae)、虹彩病毒科(iridoviridae)、乳頭瘤病毒科(papillomaviridae)、多瘤病毒科(polyomaviridae)、痘病毒科(poxviridae)、圓環病毒科(circoviridae)、肝病毒科(hepadnaviridae)、小DNA病毒科(parvoviridae)、雙核糖核酸病毒科(birnaviridae)、呼腸孤病毒科(reoviridae)、沙粒病毒科(arenaviridae)、玻那病毒科(vornaviridae)、崩芽病毒科(bunyaviridae)、代爾塔病毒科(deltaviridae)、絲狀病毒科(filoviridae)、正黏液病毒科(orthomyxoviridae)、副黏液病毒科(paramyxoviridae)、桿狀病毒科(rhabdoviridae)、動脈炎病毒科(arterioviridae)、星狀病毒科(astroviridae)、杯狀病毒科(caliciviridae)、冠狀病毒科(cornonavirdae)、黃熱病毒科(flaviviridae)、HEV樣病毒、野田病毒科(nodaviridae)、小核糖核酸病毒科(picornaviridae)、披衣病毒科(togaviridae)及反轉錄病毒科(tertroviridae)。在特定實施例中，病毒為小DNA病毒MVM、反轉錄病毒MuLV或本揚病毒CVV。在一些實施 例中，該方法提供大於或等於約0.5、約1.0、約1.5、約2.0、約2.5、約3.0、約3.5、約4.0、約4.5、約5.0、約5.5、約6.0、約6.5或大於約6.5之病毒對數減少值(LRV)。在另一實施例中，該方法另外包含改進(a)初始功率及(b)初始週期中一者或兩者之步驟，使得UVC反應器傳遞之平均劑量等於不活化劑量。在其他實施例中，UVC光源為NIST可追蹤UVC光源。在另一實施例中，劑量為劑量分佈、平均劑量、P10劑量、P50劑量及P90劑量中之一者。在另一實施例中，使用NIST可追蹤UVC偵測器量測UVC光源傳遞之通量率。
圖1為顯示傳遞至培養基之UVC平均劑量之整體模型的曲線(plot)；在該圖中，顯示隨吸光度變化之通量。X=吸光度(254nm)。Y=通量(mJ/cm2÷分鐘)。A：6.329E-05。B：0.0006764。等式Y+1/(A+BX)。F-測試0.949474。
圖2為顯示UVC劑量與曝曬時間之關係及用於識別滯留時間之曲線的曲線。實心菱形表示培養基。實線表示直線。y=250.68x+2.0927 R2=0.9848
圖3為顯示如由FACS所量測由若干不同曝曬時間引起的微球體螢光分佈之曲線。
圖4為顯示模擬及最佳化之結果的曲線；圖4A顯示導致高UVC劑量條件之長曝曬時間的結果，而圖4B顯示導致低UVC劑量條件之短曝曬時間的結果。
圖5為顯示用於模擬分佈之實驗分佈的標準差與平均值之間之關係的曲線；圖5A顯示劑量群之誤差百分比與螢光分佈的關係，而圖5B顯示螢光分佈累積百分位群(percentile group)之誤差百分比與UVC劑量的關係。
圖6為顯示實驗及模型螢光分佈平均值與標準差之間之相關性的 曲線。實心圓表示實驗分佈。空心圓表示模型分佈。
圖7為顯示FACS之微球體螢光分佈與過程反應器處理的關係的曲線；R1=反應器1；R2=反應器2。
圖8為顯示模擬及最佳化之結果的曲線；圖8A描繪以過程反應條件處理之微球體的實驗及模擬螢光分佈之累積機率分佈，而圖8B顯示模擬劑量分佈。
圖9為顯示薄膜反應器之劑量分佈預測的一系列曲線。
圖10為顯示螺旋狀反應器之劑量分佈預測的一系列曲線。
圖11為顯示對使用蒙特卡羅(Monte Carlo)技術獲得之CV比值與使用群體統計模型建立技術獲得之CV比值進行比較的曲線。實心圓表示過程反應器蒙特卡羅。空心圓表示準直光束群體模型。
圖12為顯示實驗及預測劑量資料之逐對分析之圖形表示的曲線。
圖13為顯示反應器1之量測劑量分佈與預測劑量分佈關係之曲線。
圖14為顯示反應器2之量測劑量分佈與預測劑量分佈關係之曲線。
圖15為反應器1(左)及反應器2(右)之所選量測(頂部)及預測(底部)劑量分佈之機率分佈圖示的一系列曲線。
圖16為顯示具有針對製造(圖16A、圖16C、圖16E)及PC(圖16B、圖16D、圖16F)規定的流動速率之培養基A(圖16A、圖16B)、培養基B(圖16C、圖16D)及E(圖16D、圖16E)的預測劑量分佈之一系列曲線。
圖17為顯示如由FACS所量測到之若干由不同曝曬時間引起的微球體螢光分佈之曲線。
圖18為顯示對使用最佳漂白常數產生的量測之螢光分佈(深色線) 與模擬之分佈(淺色線)進行比較的曲線；圖18A顯示產生低UVC劑量實驗之短曝曬時間與模擬分佈的關係之結果，而圖18B顯示產生高劑量UVC實驗之長曝曬時間與模擬分佈的關係之結果。
圖19為顯示量測之螢光與劑量分佈之比較結果的曲線；圖19A顯示量測及模擬之螢光分佈的比較；而圖19B顯示由廣義γ分佈表示之相關劑量分佈。
圖20為顯示如由FACS所量測之重疊螢光分佈之曲線，其中樣品源自以準直光束裝置以多個滯留時間曝曬處理SDS溶液中之微球體。
圖21為顯示對使用對曝曬SDS溶液中之微球體最佳的漂白常數產生之量測之螢光分佈(深色線)與模擬之分佈(淺色線)進行比較之曲線。
圖22為顯示如由FACS所量測重疊螢光分佈之曲線，其中樣品源自以準直光束裝置以多個滯留時間曝曬處理培養基中之微球體。
圖23為顯示對使用曝曬培養基中之微球體為最佳的漂白常數所產生之量測之螢光分佈(深色線)與模擬之分佈(淺色線)進行比較之曲線。
圖24為顯示如由FACS所量測重疊螢光分佈之曲線，其中樣品源自以準直光束裝置以多個滯留時間曝曬處理胎牛血清(FBS)中之微球體。
圖25為顯示對使用對曝曬胎牛血清中之微球體最佳的漂白常數產生之量測之螢光分佈(深色線)與模擬之分佈(淺色線)進行比較之曲線。
圖26為顯示如由FACS所量測重疊螢光分佈之曲線，其中樣品源自以準直光束裝置以多個滯留時間曝曬處理SDS溶液中之微球體。
圖27為顯示對使用對曝曬SDS溶液中之微球體最佳的漂白常數產生之量測之螢光分佈(深色線)與模擬之分佈(淺色線)進行比較之曲 線；圖27A顯示低UVC劑量實驗與模擬之分佈之關係的結果，而圖27B顯示高劑量UVC實驗與模擬之分佈之關係的結果。
圖28為顯示如由FACS所量測重疊螢光分佈之曲線，其中樣品源自以準直光束裝置以多個滯留時間曝曬處理Mab FVIP溶液中之微球體。
圖29為顯示對使用對曝曬Mab FVIP溶液中之微球體最佳的漂白常數產生之量測之螢光分佈(深色線)與模擬之分佈(淺色線)進行比較之曲線；圖29A顯示低UVC劑量實驗與模擬之分佈之關係的結果，而圖29B顯示高劑量UVC實驗與模擬之分佈之關係的結果。
圖30為顯示如由FACS所量測重疊螢光分佈之曲線，其中樣品源自以準直光束裝置以多個滯留時間曝曬處理含有酪胺酸之Mab FVIP溶液中之微球體。
圖31為顯示對使用對曝曬含有酪胺酸之Mab FVIP溶液中之微球體最佳的漂白常數產生之量測之螢光分佈(深色線)與模擬之分佈(淺色線)進行比較之曲線；圖31A顯示低UVC劑量實驗與模擬之分佈之關係的結果，而圖31B顯示高劑量UVC實驗與模擬之分佈之關係的結果。
圖32顯示反應器之示意圖。
本發明提供判斷傳遞至低傳輸流體(諸如細胞培養基，包括經稀釋之細胞培養基及經純化之蛋白質溶液)的紫外光範圍之C譜帶(「UVC」，約254 nm)中之輻射劑量的方法。亦提供以UVC光處理低傳輸流體以更有效地使流體中之病毒不活化的方法。在多個實施例中，低傳輸流體為細胞培養基，且在其他實施例中，病毒為小DNA病毒。
I.定義
如本文所用，除非另外明確指出，否則術語「一(「a」及 「an」)」意謂一或多個。
如本文所用，術語「UV光劑量」意謂以UV光形式傳遞至目標之能量的量。傳遞至目標之UV光劑量隨強度及曝曬時間變化。「紫外光劑量」之實例的非限制性清單包括約1 mJ、約10 mJ、約25 mJ、約50 mJ、約75 mJ、約100 mJ、約125 mJ、約200 mJ、約250 mJ、約300 mJ、約350 mJ、約400 mJ、約450 mJ、約500 mJ、約600 mJ、約700 mJ、約800 mJ、約900 mJ、約1000 mJ及大於約1000 mJ。
如本文所用，術語「UV光」意謂波長介於至少10 nm與至多400 nm之間的光譜區域。舉例而言，術語「UV光」涵蓋波長在約200 nm至約280 nm範圍內之光，包括波長約254 nm之光。在本文提供之方法中，UV光可以均勻聚焦及過濾方式傳遞；因此，均勻聚焦及非均勻聚焦之UV以及過濾之UV光及未過濾之UV光均涵蓋於術語「UV光」。
如本文所用，術語「低光學傳輸複合流體」意謂包含溶劑及一或多個分子溶質的自由流動之液體，其特性為當光通過一定厚度之流體時由於光能之物理吸收而強度減弱。舉例而言，術語「低光學傳輸複合流體」涵蓋含有水作為溶劑且含有碳水化合物及/或胺基酸(包括肽及/或蛋白質)作為溶質的溶液，當通過約1 cm流體厚度時，光強度減弱約10之因數。
如本文所用，術語「水因數」為藉由以下等式計算得到的值： ，其中a=溶液吸光度且l為以公尺為單位之路徑長度。
如本文所用，術語「滯留時間」意謂目標自開始曝曬於UVC光流至停止曝曬於UVC光所需之時間。因為集體內之個別目標可能由於不同軌跡而需要不同時間穿過反應器之曝曬區，所以其相應地經歷不同滯留時間；因此，集體經歷個別滯留時間之分佈，其平均值稱為平均滯留時間。在非流動目標之情形中，術語滯留時間與曝曬時間同義 且所有目標均曝曬相同時間量。
如本文所用，術語「可漂白螢光發射極」意謂一種化學實體，其可以(1)藉助於吸收光之光子獲得能量，將至少部分彼能量短暫保持於激發態，且隨後以較低能量光波長下的光之光子形式發射剩餘能量，及(2)吸收UVC波長光之光子且因此共價改變，從而隨後失去吸收光之光子的能力。作為特殊實例，與螢光分子共軛之聚苯乙烯粒子為可漂白螢光發射極，其可以吸收340 nm之光且隨後發射380 nm之光，且其在曝曬於較高能量254 nm UVC光後不可逆地丟失部分螢光產率。
如本文所用，術語「UVC光源」係指能夠傳遞一定劑量的光譜之UVC譜帶中之光的任何裝置。UVC光源可以(但無需)為NIST可追蹤的。UVC光源可為螺旋型或層流型或薄膜型。
II.判斷傳遞至包含低光學傳輸複合流體之樣品的UVC光劑量之方法
如本文所述，多個申請案依靠UVC作為全過程之組成。此等過程通常依賴於UVC之精確劑量。舉例而言，當不使有機體(諸如病毒、細菌或孢子)活化時，重要的是傳遞足夠UVC以使病毒不活化，同時使對有機體位於其中之環境的破壞最小。在另一實例中，當採用UVC起始或停止化學反應(諸如聚合)時，重要的是確保提供足夠起始或停止聚合之UVC劑量，但該劑量又不會破壞樣品中之其他化合物。在另一實例中，當使孢子不活化時，重要的是傳遞足夠UVC以使孢子不活化，同時使對孢子位於其中之環境的破壞最小。因此，儘管所揭示之方法可用於判斷傳遞至包含高光學傳輸流體(其可為或可不為複合流體)之樣品的UVC光劑量，但本文提供之方法在判斷傳遞至包含低光學傳輸複合流體之樣品的UVC光劑量時尤其有價值。
應注意，在所有本文提供之方法的情形中，所判斷之劑量為劑量分佈。然而，在本發明之其他態樣中，可以其他方式描述劑量，包 括平均劑量、P10劑量、P50劑量或P90劑量。
最初，使用UVC偵測器量測由UVC光源所傳遞之通量率。接著以滯留時間與通量率之數學乘積形式判斷對照劑量(參看實例1-4)。在一個實施例中，UVC偵測器為NIST可追蹤UVC偵測器。如本文所述產生之標準曲線使可漂白螢光發射極的螢光產率與其接收之對照劑量關聯。
在一個實施例中，該方法包含產生標準曲線。標準曲線可解釋UVC光源之細微變化及光源校準。為產生標準曲線，可以使用以下步驟。最初，可漂白螢光發射極與低光學傳輸複合流體接觸形成對照混合物。可漂白螢光發射極可為發射可量測螢光信號且可由UVC波長光漂白之任何結構或化合物。在一個實施例中，可漂白螢光發射極可包含螢光流體，而在另一實施例中，可漂白螢光發射極包含包埋螢光化合物或與螢光化合物關聯之基質。如實例中所述，較佳可漂白螢光發射極包含塗有螢光化合物之聚苯乙烯珠粒。此特定可漂白螢光發射極的優勢在於容易使用易獲得之技術(諸如FACS工具)進行監測。
儘管在選擇發射極之量時需要考慮低光學傳輸複合流體之量，但該方法中可採用任何量之可漂白螢光發射極。此外，用於量測螢光(且因此因曝曬於UVC所賦予之漂白)之工具的偵測極限可形成用於選擇發射極之量的標準。
所揭示方法之優勢為其應用於包含低光學傳輸複合流體之樣品的能力。儘管容易研究包含高光學傳輸之流體(例如水)(參看例如Bohrerova等人(2007))，但不存在分析包含低光學傳輸之樣品的方法。低光學傳輸流體之實例包括細胞培養基、血清及包含維生素、糖及顏料(例如類黃酮(flavinoid))之混合物，諸如果汁及維生素飲料以及含有胺基酸、肽或蛋白質之溶液。
該方法之另一優勢在於其可對複合流體進行，該等複合流體不 能使用Bohrerova等人之方法。複合流體之實例包括細胞培養基、血清及包含維生素、糖及顏料(例如類黃酮)之混合物，諸如果汁及維生素飲料以及含有胺基酸、肽或蛋白質之溶液。作為比較，在一個實施例中，標準流體(亦即非複合流體)包含具有水及清潔劑(諸如十二烷基硫酸鈉(SDS))之溶液。
已形成對照混合物，該對照混合物曝曬於UVC光持續滯留時間之初始時間以傳遞對照劑量。可在任何基礎上選擇包括功率位準、波長等之曝曬條件且其可包含任何值。對照UVC光源較佳經調適以與一定範圍之功率位準一致，但一貫傳遞已知通量的已知波長之UVC輻射，從而向全部體積之對照混合物傳遞已知一致劑量。較佳UVC光源功率位準在約1 mJ至約1000 mJ範圍內。在特定實例中，UV-C光源能夠傳遞約1 mJ、約10 mJ、約25 mJ、約50 mJ、約75 mJ、約100 mJ、約125 mJ、約200 mJ、約250 mJ、約300 mJ、約350 mJ、約400 mJ、約500 mJ、約600 mJ、約700 mJ、約800 mJ、約900 m或約1000 mJ。UV-C光源需要的另一特徵為能夠回應於監視器之反饋自動從第一功率位準切換至第二功率位準或由操作員手動切換。
對照UVC光源較佳亦適於一貫地傳遞一定波長範圍之UVC光。較佳波長在約200 nm至約280 nm範圍內，其對應於UV光譜的整個C譜帶。在特定較佳實施例中，波長為約254 nm。所揭示方法中可採用之光源的實例包括Newport Oriel® Flood UVC光源，例如型號97536或UVP®光源，例如EL系列UV燈。
在對照混合物已曝曬於對照UVC光源持續初始滯留時間以接收對照劑量後，取對照混合物之等分試樣隨後分析其剩餘螢光產率。等分試樣可為任何體積，然而該等分試樣應足夠大以允許使用任何所要儀器量測等分試樣之螢光。可在曝曬於UVC之前取對照混合物之等分試樣，用作對照樣品。
應注意，滯留時間對應於對照混合物自對照UVC光源接收UVC劑量的時間。因為所提供方法中可採用任何種類之UVC反應器或光源，所以此等光源之架構可變化。因此，應注意所揭示方法中之滯留時間並非僅僅對應於等分試樣在反應器本身中所耗費之時間，而是對應於曝曬於UVC光之時間，此在本文中稱為滯留時間。
在使等分試樣曝曬於UVC光持續滯留時間之初始時間之後，量測由等分試樣所發射之螢光。如本發明全文中所描述，可使用任何便利儀器(諸如FACS工具)量測螢光。
應注意，UVC對可漂白螢光發射極的作用將使發射極漂白至一定程度。因此，當量測螢光時，預期發射之螢光將減少至與曝曬時間逆相關的程度。換言之，預期隨著曝曬時間增加，發射之螢光減少。
繼續該方法，對照混合物曝曬於對照UVC光源持續所選滯留時間以確保對照劑量，自對照混合物獲得等分試樣及量測由等分試樣所發射之螢光的步驟可重複任意次數。應瞭解，產生標準曲線時，可能需要儘可能多的資料點合理可行。因此，可獲得1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15或15個以上等分試樣且量測螢光發射；此等資料點將形成標準曲線。
應瞭解，對照混合物之每次曝曬的滯留時間將與初始滯留時間不同。在許多情形中，滯留時間將逐漸變長。亦應瞭解，若需要較短滯留時間，則可能產生第二對照混合物，儘管此方法可能需要處理資料以解決採用兩種不同對照混合物產生資料的問題。
在產生標準曲線之最終步驟中，可漂白螢光發射極所發射之螢光與各別UVC劑量關聯。在一個實施例中，此關聯可以成對方式進行且以劑量為X軸且螢光讀取量為Y軸繪製於圖上。參看實例1-4。
產生標準曲線後，可漂白螢光發射極與包含低光學傳輸複合流體之測試流體接觸形成測試混合物。可漂白螢光發射極將與用於產生 標準曲線之發射極相同。測試流體可具有任何組成，限制條件為測試流體為複合流體。如本文所述，複合流體之實例包括細胞培養基、血清、包含維生素、糖及顏料(例如類黃酮)之果汁流體、含有胺基酸、肽或蛋白質之溶液，且此等流體不能使用對包含複合混合物之高光學傳輸流體適用之慣用UVC法研究。
測試混合物繼續曝曬於UVC光持續所選滯留時間。滯留時間較佳(但非必需)為比標準曲線之最長滯留時間短，但比標準曲線之最短滯留時間長的時間。
使測試混合物曝曬於UVC光持續所選滯留時間之後，量測測試混合物所發射的螢光。與產生標準曲線之情形中一樣，可採用量測螢光曝曬之任何便利方式，諸如FACS。
最終，使用針對對照混合物等分試樣及測試混合物量測的螢光產率判斷傳遞至測試混合物之劑量。在一個實施例中，藉由利用僅螢光產率資料之平均值來判斷僅劑量分佈之平均值。在第二實施例中，藉由利用螢光產率分佈資料判斷劑量分佈；可使用分佈之量測值(諸如平均值)及所選百分位另外抽象化廣義分佈。第二實施例利用可自較佳可漂白螢光發射極(與可漂白螢光分子結合的微球體)獲得的離散目標UVC劑量判斷法資訊。兩個實施例皆利用已知的由對照反應器傳遞至對照混合物等分試樣之劑量；因此允許唯一判斷由測試反應器傳遞至測試混合物的未知劑量。
在第一實施例中，藉由涉及以下之兩部分方法判斷未知劑量：(1)使用接收之劑量形成與對照混合物等分試樣平均螢光相關的標準曲線或等式，及(2)應用所得標準曲線或等式自已知平均螢光判斷測試混合物的未知劑量。特定言之，針對對照混合物等分試樣量測之平均螢光產率相對於相應所傳遞對照UVc劑量逐對繪圖。所得圖形表示代表標準曲線，其可以通常理解之方式利用。另外，可藉由使用適當 連續數學函數與統計學最佳方法擬合資料來概括由逐對資料表示的對照劑量與對照平均螢光之間的關係。所得代數方程則代表標準方程，其可以通常理解之方式使用，包括用於其他數學運算中。接著使用以下簡單步驟判斷傳遞至測試混合物之平均劑量：(a)根據對照混合物量測之平均螢光產率換算測試混合物量測之平均螢光產率，(b)藉由自標準曲線讀取值或針對所要劑量解標準方程判斷相應對照混合物劑量，及(c)根據所判斷之對照混合物平均劑量換算測試混合物平均劑量。
在第二實施例中，藉由涉及以下之兩部分方法判斷未知劑量分佈：(1)判斷螢光漂白動力學參數，其為使對照混合物等分試樣螢光分佈與所接收劑量相關之等式的組成，及(2)以統計學最佳方式應用所得光致漂白等式來判斷未知劑量分佈，該分佈最佳預測已知測試混合物螢光分佈。特定言之，針對對照混合物等分試樣量測之螢光產率分佈以統計學最佳化方式用作目標函數，判斷適當描述光致漂白現象之螢光漂白動力學參數。因為所有等分試樣必需遵照同一光致漂白機制，所以其相應地服從同一數學等式及參數。因此，判斷螢光漂白動力學參數之最佳方式同時使用自所有對照混合物等分試樣獲得之所有螢光分佈資料判斷最佳代表螢光漂白現象之未知參數的數值。一旦已知，螢光漂白動力學參數完成螢光漂白等式。為了判斷測試混合物在通過測試反應器後所接收到的未知劑量分佈，以統計學最佳化程序應用螢光漂白等式以最佳預測測試混合物等分試樣之螢光分佈。此隨後最佳化中之未知因素為完成劑量分佈方程之參數。儘管任何分佈函數原則上均可應用於此最佳化程序，但較佳分佈函數為三個參數之廣義γ分佈函數，因為其在收斂最佳化計算方面之可靠性。
應注意，所揭示方法之任何或所有步驟可手動進行或藉由任何便利自動方式進行，諸如藉由採用自動化系統或電腦控制系統。在一 些實施例中，整個方法可為自動化的。在其他實施例中，一或多個步驟可為自動化的。舉例而言，對所傳遞劑量之評定及回應於目標劑量水準之變化進行的調節可形成單個自動化步驟。在一個實施例中，穩定樣品曝曬於UV光光源且同時監測相對於目標劑量之變化。若偵測到相對於目標之變化，則控制模組可調節曝曬時間、曝曬波長或UV光源之功率使得達到目標劑量。此可以反饋環類型配置即時進行。
所揭示方法可以任何規模且以離散單元操作或以連續連接過程形式進行。在離散單元操作的一個實施例中，在容器中形成任何體積之樣品。容器接著曝曬於UV光(例如UVC光)且隨後進行病毒或孢子不活化之評定。可重複操作直至樣品中存在的任何孢子或病毒不活化。或者，可藉由曝曬於UV光持續進行評定。在使病毒不活化後，樣品可轉移至各別容器以供進一步加工或包裝。
在另一態樣中，可以任何規模(實驗室規模至商業規模)進行所揭示方法。當以商業規模進行該方法時，宜將樣品分成等分試樣且平行處理各等分試樣。舉例而言，可平行運作多個UVC光源以適應大體積穩定樣品。
在另一態樣中，所揭示方法可用於藉由與實驗判斷之劑量進行比較來驗證用於劑量判斷之預測方法的準確度。該驗證程序為有益的，因為其提高對於便利地對不方便使用實驗方法評定之環境中的UVC處理應用數學預測之準確度的保證。醫藥製造廠中UVC處理存在該等情形，該等製造廠難以或可能禁止引入可能污染設備或環境之外來測試材料。
在另一態樣中，所揭示方法可用於定量比較一種UVC處理傳遞之劑量與第二UVC處理傳遞之劑量，即使該等處理的許多方面可能不同，包括：時間、場所、反應器設計、流體光學傳輸、流體複雜性及混合物組成。該比較程序是有價值的，因為其允許一個環境中UVC處 理之效能在另一可能非常不同的環境中得以如實複製。對於將醫藥製造廠中之UVC處理與生物實驗室中之處理(涉及傳染物，諸如病毒、細菌及黴漿菌(mycoplasma))進行比較通常存在該等情形。
III.使樣品中之有機體不活化的方法
在製備治療用途之蛋白質溶液時，諸如孢子及病毒之有機體的不活化為關鍵步驟。實際上，多個管理機構已建立病毒不活化之標準且許多供應商已解決此問題。病毒及孢子不活化技術已在許多方向上發展，包括過濾技術、HTST及UVC技術。儘管此等技術中每一者都具有實力，但每一者亦具有缺點。在UVC情形中，已觀察到儘管使孢子及病毒不活化為有效且高效之方法，但蛋白質長期曝曬於UVC光可能導致蛋白質降解及/或氧化。因此，儘管UVC技術為使孢子及病毒不活化之有效方法，但使包含蛋白質之樣品曝曬於高劑量UVC光可能對蛋白質本身具有不良影響。因此，在本發明的一個態樣中，提供一種方法，其中可採用使包含蛋白質組分之樣品中的孢子或病毒不活化所需之高劑量UVC，而同時藉由將傳遞至樣品的UVC劑量修整至不超過使孢子或病毒不活化所需的劑量來降低或消除破壞蛋白質本身的可能。因此，提供一種使包含蛋白質組分之樣品中的有機體(諸如孢子或病毒)不活化之方法。
在一個態樣中，所揭示方法係針對孢子及病毒之不活化，該等孢子及病毒可能並非故意引入至包含蛋白質組分之樣品中。蛋白質生產過程中非故意病毒引入之可能來源包括污染之原料或暴露於製造人員。
所揭示方法之一個優勢在於其可用於任何類型之病毒，且與病毒是否包膜無關。因此，該方法可應用於雙股DNA病毒、單股DNA病毒、雙股RNA病毒及單股RNA病毒。可使用所揭示方法使之去活化之病毒科(隱含包括該科之所有成員)的實例包括：腺病毒科、非洲豬 瘟病毒科、疱疹病毒科、虹彩病毒科、乳頭瘤病毒科、多瘤病毒科、痘病毒科、圓環病毒科、肝病毒科、小DNA病毒科、雙核糖核酸病毒科、呼腸孤病毒科、沙粒病毒科、玻那病毒科、本揚病毒科、代爾塔病毒科、絲狀病毒科、正黏液病毒科、副黏液病毒科、桿狀病毒科、動脈炎病毒科、星狀病毒科、杯狀病毒科、冠狀病毒科、黃熱病毒科、HEV樣病毒、野田病毒科、小核糖核酸病毒科、披衣病毒科及反轉錄病毒科。在可與治療性蛋白質生產過程特定相關之特定實施例中，可使用所揭示方法使之去活化之病毒包括小DNA病毒MVM、反轉錄病毒MuLV或本揚病毒CVV。
最初，識別已知或推測使有機體不活化之UVC光劑量。為了最有效且高效地使用UVC使諸如孢子或病毒之有機體不活化，需要識別將實現所要結果之UVC目標劑量。儘管不用針對待不活化孢子或病毒之類型及在任何便利UVC劑量下進行之方法使UVC曝曬條件(整體包含「UVC劑量」)最佳化即可進行所揭示方法，但可藉由識別對於待不活化孢子或病毒具有特異性之目標劑量來提高該方法之效率。應注意，一些有機體可共用UVC光去活化之條件，且藉由選擇適當曝曬條件，兩種或兩種以上類型之有機體(例如兩種或兩種以上病毒或兩種或兩種以上孢子)可在所揭示方法之單次操作中得以去活化。已進行多個研究來識別多種含有DNA之病毒及含有RNA之病毒的UV敏感性。參看例如Lytle及Sagripanti,(2005)J Virol.79：14244-252，及Rnipe等人，(2007)Field's Virology.Lippincott Williams & Wilkins，其以引用的方式併入本文中。
已知或懷疑包含有機體的包含低光學傳輸複合流體之樣品接著繼續曝曬於由在所選功率位準及所選波長下操作的光源提供之UV光持續所選滯留時間。可用於所揭示方法之光源的實例包括Newport Oriel® Flood UVC光源，例如型號97536或UVP®光源，例如EL系列UV 燈。
UVC光源較佳經調適以與一定範圍之功率位準一致。較佳功率位準在約1 mJ至約1000 mJ之範圍內。在特定實例中，UV-C光源能夠傳遞約1 mJ、約10 mJ、約25 mJ、約50 mJ、約75 mJ、約100 mJ、約125 mJ、約200 mJ、約250 mJ、約300 mJ、約350 mJ、約400 mJ、約500 mJ、約600 mJ、約700 mJ、約800 mJ、約900 mJ或約1000 mJ。UVC光源所需之另一特徵為能夠回應於監視器之反饋自動從第一功率位準切換至第二功率位準或由操作員手動切換。
UVC光源較佳亦適於傳遞一定波長範圍之UVC光。較佳波長在約200 nm至約280 nm範圍內，其對應於UV光譜的整個C譜帶。在特定較佳實施例中，波長為約254 nm。
如本文所述，UVC電源功率與UVC電源中樣品之滯留時間(亦即如本文所定義，樣品曝曬於UVC光之時間)的組合需要足以使有機體不活化；若傳遞至樣品之UVC累積劑量不足以完全使有機體不活化，則其可能導致樣品隨後複雜化。當樣品包含治療性產品(諸如抗體或治療性蛋白質)時，此等問題混合。此外，由製造商提供之對UVC光源的校準可能不準確。
因此，為了確保向樣品傳遞足夠劑量之UVC，所揭示方法提供識別UVC光源提供該劑量所需之條件的步驟。應注意，在所有本文提供之方法的情形中，所判斷之劑量為劑量分佈。然而，在本發明之其他態樣中，可以其他方式描述劑量，包括平均劑量、P10劑量、P50劑量或P90劑量。應承認，P10劑量、P50劑量或P90劑量為所接收UVC落在所述機率之所要劑量之內之百分比的反映，例如P90劑量包括落在90%目標劑量之內的所有劑量。
為了使用將可漂白螢光發射極之螢光產率與其接收之對照劑量關聯的標準曲線(如本文所述產生)，使用UVC偵測器量測UVC光源傳 遞之通量率。在一個實施例中，UVC偵測器為NIST可追蹤UVC偵測器。接著以滯留時間與通量率之數學乘積形式判斷對照劑量(參看實例1-4)。
繼續採用以下步驟：產生標準曲線。標準曲線可解釋UVC光源之細微變化及光源校準。可使用以下步驟產生標準曲線。最初，可漂白螢光發射極與低光學傳輸複合流體接觸形成對照混合物。螢光發射極可為發射可量測螢光信號的任何結構或化合物。在一個實施例中，螢光發射極可包含螢光流體，而在另一實施例中，螢光發射極包含包埋螢光化合物或與螢光化合物關聯之基質。如實例中所述，較佳螢光發射極包含塗有螢光化合物之聚苯乙烯珠粒。此特定螢光發射極的優勢在於容易使用易獲得之技術(諸如FACS工具)進行監測。
儘管在選擇發射極之量時需要考慮低光學傳輸複合流體之量，但該方法中可採用任何量之可漂白螢光發射極。此外，用於量測螢光(且因此由曝曬於UVC所賦予之漂白)之工具的偵測極限可形成用於選擇發射極之量的標準。
所揭示方法之優勢為其能夠應用於包含低光學傳輸複合流體之樣品。儘管容易研究包含高光學傳輸之流體(例如水)(參看例如Bohrerova等人(2007))，但不能使用同一方法研究包含低光學傳輸之樣品而結果具有任何有意義的可信度。低光學傳輸流體之實例包括細胞培養基、血清及包含維生素、糖及類黃酮之混合物，諸如果汁及維生素飲料以及含有胺基酸、肽及蛋白質之溶液。
該方法之另一優勢在於其可對複合流體進行，該等複合流體不能使用Bohrerova等人之方法。複合流體之實例包括細胞培養基、血清及包含維生素、糖及顏料(例如類黃酮)之混合物，諸如果汁及維生素飲料以及含有胺基酸、肽及蛋白質之溶液。作為比較，在一個實施例中，標準流體(亦即非複合流體)包含具有水及清潔劑(諸如十二烷基 硫酸鈉(SDS))之溶液。
已形成對照混合物，該對照混合物曝曬於UVC光持續滯留時間之初始時間。可在任何基礎上選擇包括功率位準、波長等之曝曬條件且其可包含任何值。UVC光源較佳經調適以與一定範圍之功率位準一致。較佳功率位準在約1 mJ至約1000 mJ之範圍內。在特定實例中，UVC光源能夠傳遞約1 mJ、約10 mJ、約25 mJ、約50 mJ、約75 mJ、約100 mJ、約125 mJ、約200 mJ、約250 mJ、約300 mJ、約350 mJ、約400 mJ、約500 mJ、約600 mJ、約700 mJ、約800 mJ、約900 mJ或約1000 mJ。UVC光源需要的另一特徵為能夠回應於監視器之反饋自動從第一功率位準切換至第二功率位準或由操作員手動切換。
UVC光源較佳亦經調適以傳遞一定波長範圍之UVC光。較佳波長在約200 nm至約280 nm範圍內，其對應於UV光譜的整個C譜帶。在特定較佳實施例中，波長為約254 nm。所揭示方法中可使用之光源的實例包括Newport Oriel® Flood UVC光源，例如型號97536。
對照混合物曝曬於UVC持續初始滯留時間後，取對照混合物之等分試樣。等分試樣可為任何體積，然而該等分試樣應足夠大以允許使用任何所要儀器量測等分試樣之螢光。可在曝曬於UVC之前取對照混合物之等分試樣，用作對照樣品。
應注意，滯留時間對應於對照混合物接收UVC劑量之時間。因為所提供方法中可採用任何種類之UVC反應器或光源，所以此等光源之架構可變化。因此，應注意所揭示方法中之滯留時間並非僅僅對應於等分試樣在反應器本身中所耗費之時間，而是對應於曝曬於UVC光之時間，此在本文中稱為滯留時間。
在使等分試樣曝曬於UVC光持續滯留時間之初始時間之後，量測等分試樣發射之螢光。如本發明全文中所描述，可使用任何便利儀器(諸如FACS工具)量測螢光。
應注意，UVC對可漂白螢光發射極的作用將使發射極漂白至一定程度。因此，當量測螢光時，預期發射之螢光將減少至與曝曬時間直接相關的程度。換言之，預期隨著曝曬時間增加，發射之螢光減少。
繼續該方法，對照混合物曝曬於UVC光持續所選滯留時間，自對照混合物獲得等分試樣及量測等分試樣發射之螢光的步驟可重複任意次數。應瞭解，產生標準曲線時，可能需要儘可能多的資料點合理可行。因此，可獲得1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15或15個以上等分試樣且量測螢光發射；此等資料點將形成標準曲線。
應瞭解，對照混合物之每次曝曬的滯留時間將與初始滯留時間不同。在許多情形中，滯留時間將逐漸變長，儘管在其他情形中，可能需要自滯留時間比先前獲得之等分試樣短的等分試樣獲得螢光量測。或者，可能產生第二對照混合物，儘管此方法可能需要處理資料以解決採用兩種不同對照混合物產生資料的問題。
在產生標準曲線之最終步驟中，由發射極所發射之螢光與各別UVC曝曬時間關聯。在一個實施例中，此關聯可以成對方式進行且以劑量為X軸且螢光讀取量為Y軸繪製於圖上。參看實例1-4。
應注意，所揭示方法之任何或所有步驟可手動進行或藉由任何便利自動化方式進行，諸如藉由採用自動化系統或電腦控制系統。在一些實施例中，整個方法可為自動化的。在其他實施例中，一或多個步驟可為自動化的。舉例而言，對所傳遞劑量之評定及回應於目標劑量水準之變化進行的調節可形成單個自動化步驟。在一個實施例中，穩定樣品曝曬於UV光且同時監測相對於目標劑量之變化。若偵測到相對於目標之變化，則控制模組可調節曝曬時間、曝曬波長或UV光源之功率使得達到目標劑量。此可以反饋環類型配置即時進行。
所揭示方法可在任何範疇且以離散單元操作或以連續連接過程 形式進行。在離散單元操作的一個實施例中，在容器中形成任何體積之樣品。容器接著曝曬於UV光(例如UVC光)且隨後對病毒或孢子之不活化進行評定。可重複操作直至樣品中存在的任何孢子或病毒得以不活化。或者，可藉由曝曬於UV光持續進行評定。在使病毒不活化後，樣品可轉移至各別容器以供進一步加工或包裝。
在另一態樣中，可以任何規模(實驗室規模至商業規模)進行所揭示方法。當以商業規模進行該方法時，宜將樣品分成等分試樣且平行處理各等分試樣。舉例而言，多個UVC光源可平行運作以適應大體積穩定樣品。
IV.所揭示方法之額外應用
本文提供之方法將在許多領域得到應用。舉例而言，UVC光可用於起始化學反應，諸如聚合反應。在此應用中，需要提供起始所要化學反應但不會降解或危害反應混合物之其他組分之UVC劑量。為了實現此目標，必須判斷既定UVC光源傳遞之UVC的精確劑量。此舉可使用本發明中所述之方法完成。
在另一應用中，UVC可用於抑制或停止化學反應。另一方面，需要提供抑制或停止化學反應但不會降解或危害反應混合物之其他組分之UVC劑量。為了實現此目標，必須判斷既定UVC光源傳遞之UVC的精確劑量。此舉亦可使用本發明中所述之方法完成。
本發明中已提供許多參考文獻。本文引用之所有參考文獻(包括實例)出於任何目的以全文引用的方式併入本文中。
實例
以下實例示範所揭示方法之實施例及態樣且不欲作為限制。
實例1 判斷平均UVC劑量 藉由流式UVC反應器處理傳遞
本實例描述用於判斷低傳輸複合流體流過流式過程反應器後傳遞之平均劑量的方法。其判斷涉及形成由逐對對照劑量與平均螢光資料點構成的標準曲線或曲線圖，其中使用對照反應器及對照混合物形成對照資料。為了確保準確度，藉由以NIST可追蹤UVC感測器進行量測與可接受之標準計算的組合來判斷彼曝曬之劑量。
用於實例1之材料及方法 螢光微球體
使用兩批來自Polymicrospheres(Indianapolis,IN)之螢光F114聚苯乙烯微球體(第1批：目錄號：PS1805-FL14；激發/發射：340/380 nm；0.2%固體，8.9×108個微球體/ml，1.6 μm平均直徑；第2批：目錄號：D4162R；激發/發射：340/380 nm，1.0%固體，4.44×109個微球體/ml，1.6 μm平均直徑)。藉由獲自Duke Scientific Corporation提供之公共資訊的計算由固體百分比確定微球體濃度。螢光微球體之UVC照射的量測結果為染料之抑止或光致漂白，導致螢光強度(FI)發射減少。
使用螢光活化細胞分選(FACS)進行螢光微球體之分析，此為允許定量記錄個別微球體之螢光信號的專門類型之流動式細胞測量術。所用FACS系統為Dako MoFlo XDP。為了自直方圖遮蔽雙線(doublet)、不規則顆粒及工具雜訊，設定包括最均勻螢光微球體群體之閘門。一旦形成閘門後，其對於隨後之全部樣品均保持恆定。為了一致，對各樣品所計數螢光微球體之數目設定為10,000。來自點陣圖之資料接著繪製於線性標度上，其中x軸反映相對螢光強度(0-256)且y軸為事件數(微球體)。使用具備FACS工具之軟體自此等線性圖計算各樣品之螢光強度平均值。
準直光束
使用準直光束形成用於分析經Bayer UVivatec UVC反應器加工之 螢光微球體的標準曲線。此系統之設計仿照環境保護局水處理指導性文件(Environmental Protection Agency's Water Treatment Guidance document)。該系統包含UVP之低壓水銀燈(6瓦特(watt))、2 UVP輻射計、攪拌盤及具有攪拌棒之燒杯。
螢光微球體外加至0.1% SDS中且曝曬於UV燈持續設定時間點。準直光束之結果闡述反應器傳遞之劑量與微球體螢光強度之改變之間的關係。
產生標準曲線
螢光微球體以1×106個粒子/ml之濃度外加至細胞培養基中。細胞培養基經UVC反應器加工且以滯留時間間隔取等分之樣品。為了達到較長滯留時間，材料經系統加工多次。
分析此等樣品且產生繪製劑量與曝曬時間關係的標準曲線。此標準曲線用於計算針對既定培養基之所要劑量的所需滯留時間。基於反應器體積將滯留時間轉化為流動速率。反應器體積亦稱為曝曬體積，定義為流體曝曬於UVC之空間。對於UVivatec UVC裝置，曝曬體積為24 mL。
計算流動速率
產生以UVC裝置處理之流體的流動速率。計算是基於所處理流體在254 nm下的吸光度以及燈強度輸出。燈輸出由UVC裝置量測且反映燈之操作完整性。對於此實例中所述之所有實驗，UVC燈的輸出皆為100%。
FACS分析
螢光活化細胞分選(FACS)為專門類型之流動式細胞測量術，其允許定量記錄個別微球體之螢光信號。本實例中所研究之所有樣品均在科羅拉多州奧羅拉市科羅拉多大學癌症中心流動式細胞測量術核心(University of Colorado Cancer Center Flow Cytometry Core,in Aurora, Colorado)進行分析。使用兩個系統：第一系統為使用相干190-C 488氪雷射器之Dako MoFlo高速FACS分選機。對於此系統，指引雷射器在350 nm下激發且其具有用於資料收集之409/20 nm帶通濾波器。第二系統為Dako MoFlo，稱為MoFlo XDP。XDP具有在UVC範圍內激發且在450 nm下發射之固態紫外光雷射器。此實例中呈現之資料使用XDP系統產生。
FACS資料解釋
每次FACS運作開始時，在系統上運作具有含螢光微球體之0.1% SOS的未經處理之對照組。為了自直方圖遮蔽雙線、不規則顆粒及工具雜訊，設定包括最均勻螢光微球體群體。一旦形成閘門後，其對於隨後之全部樣品均保持恆定。為了一致，針對各樣品所計數之螢光微球體之數目設定為10,000。藉由FACS軟體自線性直方圖計算螢光強度平均值。自所得直方圖記錄各螢光強度平均值。
實例1之結果及論述
為了建立螢光強度改變與傳遞至微球體之劑量之間的關係，建構準直光束裝置。此系統之設計基於環境保護局(EPA)指導手冊，例外為文件中提及之微生物換為螢光微球體。
系統可使用水作為測試流體操作，且對於此等實驗，螢光微球體外加至0.1% SDS中。
基於曝曬時間計算以mJ/cm2為單位之所傳遞劑量的等式(Bolton及Linden,(2003),ASCE,129(3)：209-215)如下：
其中 DCB=UV劑量(m J/cm2)
Es=平均UV強度(照射樣品之前及之後量測) (mW/cm2)
Pf=皮氏因數(Petri factor)(無量綱)
R=254 nm下空氣-水界面處的反射係數(無量綱)
L=燈中心線至懸浮液表面之距離(cm)
D=懸浮液深度(cm)
A254=254 nm下的UV吸光度(無量綱)
t=曝曬時間(s)
在使用準直光束之每次實驗之前，燈升溫至少2小時。量測每次實驗之平均UV強度及皮氏因數。此舉使用NIST可追蹤輻射計實現。此等量測之程序在EPA指導手冊中詳細描述。
為了產生標準曲線，製備30 mL每毫升含有1×106個外加至0.1% SDS中之螢光微球體粒子的樣品且量測及記錄A(254)。將溶液置於燒杯中且在標準曲線上的各時間點移除1 ml等分試樣。表A詳細說明針對各標準曲線進行的計算：
使用FACS工具分析樣品且記錄所得螢光強度平均值。計算未處理對照組向經處理對照組的螢光強度平均值位移，且此位移稱為ΔFI。ΔFI接著針對所計算劑量繪圖(表A)。所傳遞劑量與ΔFI之間的非線性響應需要使用擬合軟體。確定指數增長模型為最佳擬合。
經一系列實驗追蹤標準曲線之重現性，以發現分析之變化性。標準曲線樣品曝曬於具有及不具有可見光濾光片之UVC燈。此濾光片阻斷可見範圍內之UV光且具有該系統。因為Bayer UVivatec®系統上不具有濾光片，所以移除此濾光片以保持各裝置之間的一致性。所繪製之資料反映分析之重現性以及缺乏濾光片之作用。檢驗資料後，推斷當標準曲線顯示各操作之間顯示良好相關性時，標準曲線可針對每一組實驗而重複。
判斷傳遞至細胞培養基之劑量
螢光微球體外加至待處理之培養基中。使用FACS工具分析未處理對照組以及來自處理條件之樣品且記錄所得螢光強度平均值。針對各處理計算螢光強度相對於對照組之改變(ΔFI)，且使用來自準直光束之標準曲線判斷劑量。顯示細胞培養基對微球體之螢光強度(FI)有影響，藉此提高FI信號。進行實驗以確保使用ΔFI值的準確度。
細胞培養基中之經處理螢光微球體使用離心機短暫離心且再懸浮於0.1% SDS中。預期在樣品加工協定中，可能需要包括包含自細胞培養基移除螢光微球體的步驟；此可能導致分析之一致性及比較容易。然而，FACS工具容易被含有高含量碎片之樣品及含有濃蛋白質之樣品堵塞。
進行以下實驗來測試培養基對ΔFI之作用。螢光微球體外加至水及原料培養基中，濃度為1×106個珠粒/ml。接著經UVivatec®反應器加工含有螢光微球體之原料培養基溶液。處理後，將經處理培養基之樣品離心。移除多數培養基(剩下殘餘量)且將螢光微球體再懸浮於水 中。分析以下樣品：培養基中之未處理珠粒、水中之經處理珠粒、培養基中之經處理珠粒、水中經處理培養基之經離心樣品。流式細胞儀之結果顯示於表B中。
表B中呈現之結果顯示FI之類似值。由於平均FI之差，使用Δ值計算劑量。
判斷傳遞之平均劑量
確定計算方法之不準確度後，針對一定範圍之吸光度建立新模型以囊括所處理不同類型之細胞培養基。螢光微球體外加至多種組合物之細胞培養基中，用於判斷多種操作條件下傳遞之劑量。將所傳遞劑量與曝曬時間相關聯建立標準曲線。使用由本實例中所述之準直光束產生的標準曲線計算所傳遞之劑量。
用於劑量判斷之總體模型
觀測到傳遞至所研究細胞培養基之多個平均劑量之間存在顯著可變性。使用針對各培養基類型收集之全部資料，建立總體模型以更緊密檢驗相關性。此總體模型圖解254 nm下之吸光度與通量(劑量/時間)的關係以比較類似吸光度值之可比較性。圖解資料(80個資料點)；圖1顯示此彙編之結果。
基於上文提供之等式，針對UVivatec® UVC反應器建立模型。模型基於預選波長(例如254 nm)及所要UVC劑量(例如約125 mJ/cm2，足以使樣品中存在之任何病毒不活化的劑量)。調節通道數目以將流動 速率保持於系統之操作參數範圍內(5-20 LPH)。對於設定為向細胞培養基傳遞125 mJ/cm2之所要劑量的UVivatech®系統，確定此工具之參數如下：
以使用全部濃度、以水或擴展培養基稀釋2倍之原料培養基進行之螢光微球體分析測試此總體模型。各培養基之吸光度錄入上述模型中，錄入所要劑量，且計算流動速率。檢驗許多處理條件，如表D、E及F中所示。
用於使細胞培養基中之病毒不活化的劑量判斷
進行研究以確定用於UVC介導之病毒不活化的處理方案。為了確定培養基之處理方案，使用所揭示螢光微球體分析進行若干實驗。目標劑量為125 mJ/cm2。表G用於確定實現此劑量之所要曝曬時間。此第一行表示用於該工具之計算劑量。
針對y錄入125 mJ/cm2之劑量且求解x，發現滯留時間為0.4916分鐘。參看圖2。為了實現此滯留時間，發現流動速率為5.9 LPH，兩個通路通過系統。
實例1之結論
可執行所形成及描述之螢光微球體分析以判斷傳遞至具有不同吸光度之細胞培養基(包括低傳輸流體，諸如細胞培養基)的平均劑 量。所揭示之分析提供評價UVC反應器之方法，而不管比例或設計。螢光微球體可外加至所有類型之細胞培養基中，且可準確判斷既定反應器傳遞之UVC劑量。此可提供病毒不活化領域中急需之確定性且形成多種病毒不活化方法之組成。
實例2 定量UVC劑量分佈
已提供用於判斷平均劑量UVC劑量之方法及採用UVC光使病毒及其他有機體不活化之方法，需要提供定量向樣品(例如包含低光學傳輸流體之樣品)提供之UVC劑量的方法。因此，提供確定性卷積模型，其模擬穿過連續流動UVC反應器之通路產生的劑量分佈。該模型含有描述漂白螢光微球體之函數及描述微球體穿過反應器期間遭遇之劑量分佈的廣義不對稱分佈函數。藉由擬合由以UVC準直光束裝置處理微球體產生之資料來確定漂白函數中所含之動力學參數。藉由以UVC感測器(例如NIST可追蹤感測器)進行量測與可接受之標準計算的組合來判斷彼曝曬之劑量。藉由擬合由通過流式UVC反應器所產生之螢光分佈來確定劑量分佈函數內之參數。使用蒙特-卡羅法進行分佈卷積。使用最佳化程式自動識別產生計算分佈與量測分佈之最佳擬合的參數值。使用源自累積分佈曲線之分佈抽象物描述可用於支持反應器設計/IQ/OQ/PQ之方面的分佈特徵及處理確認及驗證。
已從最先提議之方法(Anderson(2003))演變出定量使用螢光微球體之劑量分佈的程序。一些優勢源於杜克大學(Duke University，Bohrerova(2005))及普渡大學(Purdue University，Blatchley(2006))的研究，該研究利用不同螢光珠粒化學物質及不同數學反卷積法。兩種程序皆已成功用於支持對於工業規模UVc系統用於二級水處理之驗證(Linden(2009),Shen(2009))，但從未用於描述包含低光學傳輸流體(諸如細胞培養基或含有胺基酸、肽或蛋白質之溶液)之系統。
本實例描述用於基於光致漂白化學之確定性描述自螢光微球體分佈資料定量UVC劑量分佈之新穎數學方法。儘管使用隨機法進行卷積計算(蒙特-卡羅法)，但描述該現象之等式完全為確定性的。相比之下，主要替代方案(Bohrerova(2005))利用涉及貝葉斯統計(Bayesian statistics)之隨機等級法，及使微球體螢光強度分佈與UV通量分佈關聯之馬爾可夫鏈蒙特卡羅整合技術。當分析資料以產生供納入受管制行業之確認及/或驗證報導中的值時，確定性數學一般有利。
用於實例2之材料及方法
如實例1中所述進行螢光漂白之量測。以UVC準直光束及反應器處理之微球體的螢光強度以數位流式細胞儀(FACS)量測。如實例1中所述，基於通量(強度)、曝曬時間/滯留時間及254 nm下之吸光度計算由準直光束傳遞之UVC劑量。
模型開發 基礎物理學
光降解現象受常見物理定律(互易定律(Reciprocity law))支配，其可表示為：破壞=ʃλ 函數(劑量(λ))d λ
劑量(λ)=ʃt I(λ,t)dt
互易定律之評論性綜述已顯示生物材料一律服從此定律且對用於製造螢光微球體之合成材料幾乎總是成立(Martin(2003))。低壓水銀燈在254 nm波長下基本上產生單色光，因此波長整合並非必須(EPA(2006))。此定律之實際意義為破壞程度視輻射劑量而定，且不同強度及時間組合可產生相同劑量。因此，不同微球體可橫向穿過UVC反應器之不同路徑且經歷不同輻射強度及滯留時間但積聚相同劑量，且因 此破壞量相同。在數學術語中，正向計算(強度、時間至破壞)唯一，而反向計算(破壞至強度、時間)不唯一。
光致漂白動力學模型
光致漂白為光降解現象，其中螢光在曝曬於光後存在損失(或減少)。所涉及之光學及化學過程為複雜的且涉及多種物理及化學狀態之間的過渡。此外，此等過渡受螢光微環境條件影響且可受微球體固定化學及懸浮液體性質影響(Song(1995),Song(1996),and Song(1997))。儘管如此，光致漂白之速率一般視無抑止劑存在下兩種相互作用機制染料/染料(DD)及染料/氧氣(DO)之間的競爭而定(Song(1996))。微球體上具有高染料負載時，DD機制占主導(Song(1997))且動力學可由反映反應之一階特性的單指數函數描述。通常併入單指數函數以說明用於高精度量測液體流動速度之雷射誘發螢光法中之光致漂白(Crimaldi(1997),Larson(2006))。更一般而言，雙指數函數用於描述尤其當DD及DO相互作用競爭時的光致漂白動力學(Talhavini(1999))。微球體之光致漂白在本文中藉由下文提供之廣義雙指數函數描述：F(劑量)=F0*[w1*e-劑量*Kb1+(1-w1)*e-劑量*Kb2]
F(劑量)=UVC處理後之螢光強度
F0=UVC處理之前的螢光強度
w1=機制1之加權函數
Kb1=機制1之動力學常數
Kb2=機制2之動力學常數
劑量=整合UVc強度*時間(互易定律)
使用準直光束之微球體UVC曝曬的模型
用於此等及其他研究之螢光微球體不完全一致；亦即，各珠粒之粒度及密度、螢光團編號及微環境等與下一者略微不同。實際上， 不同合成法及甚至使用同一合成之不同製備可產生具有顯著不同光譜及光致漂白特徵之懸浮液(Imhof(1999))。儘管如此，微球體懸浮液為珠粒之全體且全體之屬性及行為藉由將其當作分佈來可靠描述。
在準直光束UVC處理之情形中，劑量為均勻的(藉由小心設計)且漂白之等式(全體)僅含有說明微球體不均勻性的分佈函數，如下所示：
此情形中之動力學常數(w1、Kb1及Kb2)代表全部值且描述微球體整體之漂白行為。對於劑量及動力學常數之固定值，處理後的螢光分佈為處理之前螢光分佈的線性變換。
應注意，漂白動力學等式之函數形式對高階矩之螢光分佈具有顯著作用。如所說明，使0為分佈之「自然指數族」(NEF)(其包括正分佈、帕松(Poisson)分佈、γ分佈、二項式分佈及負二項式分佈)之成員。則，0具有二次方差函數(平均值之方差至多為平均值的二次函數)且線性變換滿足以下(Morris(1982))：X(x)X{μ,V(μ)}
X'(x)=(X(x)-b)/c
X'(x)=X'{μ',V'(μ')}
μ'=(μ-b)/c
V'(μ')=V(μ)/c2
X(x)=具有平均值μ及方差V(μ)之初始NEF分佈
X'(x)=具有平均值μ'及方差V'(μ')之線性變換之分佈
使用流式過程反應器之微球體UVC曝曬之模型
在通過過程反應器期間，個別微球體曝曬於空間變化之通量率持續變化之時間量。然而，因為UVC輻射之破壞遵循互易定律，判斷個別珠粒積聚之劑量時無需考慮此等個別曝曬「路徑」。然而，足以將個別劑量當作整體之一部分，其中整體之特性可藉由分佈函數描述。因此，對於過程反應器，漂白等式如下表示：
為了利用過程反應器之漂白等式，必須以劑量分佈()卷積初始螢光分佈(0)，獲得經處理螢光分佈((劑量))。應注意，通過反應器樣品之大量微球體穿過反應器樣品的幾乎全部軌道且依照互易定律物理上卷積強度及時間。漂白等式中具體化之數學卷積必須對類似綜合空間取樣以足夠代表經處理螢光分佈。
過程反應器之漂白等式形式上確定(唯一F0及劑量值產生唯一F值)。因此，若最初微球體螢光分佈及劑量分佈已知且由良態分析函數描述，則可用分析法判斷經處理螢光分佈。實際上，僅已知螢光分佈且其藉由使用FACS經驗量測來判斷。為了保持分析完整性，最佳使用經驗螢光分佈進行計算(表示為含有螢光珠粒計數之「強度」區段)。此等計算使用蒙特-卡羅數值法進行，其以隨機取樣模擬經驗分 佈，且藉此在廣泛組合空間上卷積劑量及初始螢光分佈。
劑量分佈(未知)必須由一些形式的機率密度函數抽象化以進行卷積。對若干不同不對稱「可撓性」分佈進行研究以識別提供模擬與經驗判斷最終螢光分佈之最佳擬合者。尋找劑量分佈之單函數形式以允許在由不同過程反應器產生之不同劑量分佈之間容易進行比較。所判斷劑量分佈之分析性質有利，因為其允許使用嚴格統計數學進行統計推斷。
實例2之結果及論述 UVC準直光束處理後的微球體螢光分佈模擬
藉由如材料及方法中所述及表H中所概述處理微球體及分析樣品，獲得螢光分佈資料。所有資料均自單個FACS分析收集。在變化控制excel試算表(excel spreadsheet)內進行模擬且廣泛註釋。在表H中，BIN名稱對應於由FACS(FACS BIN名稱、實驗分佈名稱)收集或由模擬計算(模擬分佈名稱)產生之BIN資料。FACS BIN及實驗分佈之BINS的內容一致。
微球體之UVC處理導致螢光分佈的劑量依賴性變化，如圖3中所 示。定性方面，觀測到平均螢光隨著劑量增加而降低，且分佈隨著劑量增加急劇增加。定量方面，變化較複雜，因為處理影響螢光分佈平均值、方差及不對稱性。
圖3中所示之螢光漂白結果用於確定微球體光致漂白動力學參數w1、Kb1及Kb2之量值。此舉藉由進行蒙特卡羅模擬及最佳化實現。最佳化之目標為匹配以約125 mJ/cm2劑量處理之樣品的實驗及模擬分佈平均值。可接受解決方案之額外要求自螢光跨度中點(50% +/- 6%及50% +/- 15%)以大致等距間隔放置-規定此等4個分佈之實驗及模擬分佈平均值在可接受解決方案中彼此的2 FU內。為了滿足最佳化目標及要求，漂白動力學參數之值以決策變數形式分配且在極限內自動變化直至獲得各值的最佳組合。典型模擬(內環路)及最佳化(外環路)必然伴有以下：
1.假設w1、Kb1及Kb2之初始值；
2.自ExpF(0)之1e4值：常數w1、Kb1、Kb2計算SimF(x)之1e4值
a.確定SimF(x)分佈之平均值
b.比較目標與要求之SimF(x)及ExpF(x)的平均值
c.判斷平均值之差是否在允許公差內，若是，則解決方案 允許
3.使用專有目標尋找算法假設w1、Kb1及Kb2的新值
a.返回步驟2；重複順序直至w1、Kb1、Kb2之1e3組合 測試到
4.順序結束時，計算允許之解決方案的統計資料且識別最佳解決方案。
輸出說明顯示於表I中：
使用上述方法之模擬及最佳化的結果顯示於圖4A及圖4B中。圖4A顯示長曝曬時間導致高UVC劑量條件之結果，而圖4B顯示短曝曬時間導致低UVC劑量條件之結果。曲線圖描繪所有模擬及相應實驗分佈的累積機率分佈。因為對實驗bin更有限之解析，所以實驗分佈看似更「逐步」。使用類似顏色說明相應SimF(x)及ExpF(x)累積分佈以促進視覺比較。自圖4A及4B顯而易知，用於闡述目標及要求之分佈具有與預期一樣的最佳擬合。
在圖5A及圖5B中可見模擬之定量準確度最佳，圖5A及圖5B藉由分佈上的相對位置(累積百分比)或處理劑量描繪模擬之誤差百分比。有趣地是，誤差並非系統地視分佈上的位置而定。亦即，模擬準確地變換分佈之形狀(亦即方差及不對稱性)，此與劑量依賴性漂白一起發生。模擬之誤差百分比系統地依賴於處理劑量-不出意外的話，最大準確度存在於目標劑量(其為最佳化之目標)附近。儘管如此，針對約85至約320 mJ/cm2之範圍內的劑量獲得約4%內之螢光模擬準確度。此範圍遠超過與預期過程反應器處理相關的預期劑量分佈範圍。模擬準確變換螢光分佈之形狀的發現具有重要含意。應注意，涉及模擬之最佳化不以任何方式包括分佈形狀，而擬合僅涉及使用分佈平均值。因此，分佈形狀之變換為漂白等式形式之自然屬性，而非等式參數之值。更特定言之，漂白等式為未處理螢光分佈之線性變換。因為模擬變換匹配實驗變換，所以此暗示漂白化學過程本身為線性變換。支持此一般解釋之其他證據顯示於圖6中，其中可見標準差與實驗分佈平均值之間的關係與模擬分佈平行。本實例之模型開發部分預期及描述該關係。
圖5A顯示螢光分佈模擬之誤差百分比與分佈之累積百分位的關係，而圖5B顯示螢光分佈模擬之誤差百分比與由準直光束處理傳遞之UVC劑量的關係。圖6顯示實驗及模型螢光分佈平均值與標準差之 間的相關性。
UVC過程反應器處理後微球體螢光分佈之模擬
以如表J中所示的若干不同反應器類型及培養基特性進行實驗。
預期反應器設計的差異會藉由影響個別微球體經歷之「曝曬時間」顯著影響劑量分佈。預期培養基吸光度之差異會藉由沿輻射之路徑長度使通量場強度衰減來影響劑量分佈。預期多次通過反應器會藉由混合(各別通路之間)及曝曬時間影響劑量分佈。
具有完全混合之反應器將確保所有微球體在反應器中存在的所有通量率環境中經歷相同時間-實際上，將傳遞與準直光束類似之劑量。該反應器不存在，但與螺旋狀反應器近似，該反應器在圓柱周圍使用螺旋形流徑誘導Dean渦流，其沿徑向尺寸不斷混合(在表J中標記為R2)。不具有混合之反應器將確保所有微球體都經歷沿反應器內之流線的層流-各流線將對應於比劑量(通量率與時間之積分)，但彼等劑量將不唯一(由於互易定律)。該反應器與薄膜設計(表J中標記為「R1」)近似，其提供穿過兩個類似尺寸圓柱之間的環形空間之流動。
以過程反應器處理產生性質上與圖7中所示之準直光束不同的分佈。在圖7中，及在表J中，R1係指薄膜UVC反應器1且R2係指螺旋狀UVC反應器。更特定言之，分佈不隨將螢光減少至準直光束所見之程度而「銳化」。預期到該行為係因為傳遞之劑量為漂白現象不再為螢 光分佈之線性變換的分佈。實際意義上，由過程反應器傳遞之劑量基本上未知，因為其為可由眾多分佈抽象物描述之分佈。類似地，不可能在反應器內進行單次量測就能判斷劑量分佈。必須在許多位置進行許多量測來推斷劑量分佈-此精確地為螢光微球體在通過過程反應器期間之行為。
為了完成對穿過過程反應器之通路的螢光分佈變換之模擬，必須卷積未處理之微球體螢光分佈與劑量分佈。出現物理對應物，此係因為微球體隨機對穿過反應器之軌道進行取樣；軌道與未處理之微球體螢光無關。為了簡化計算及提供比較以不同反應器及培養基組態產生之分佈的系統方式，使用若干熟知不對稱的機率分佈函數抽象化劑量分佈。此等包括廣義γ分佈、對數常態分佈及韋布分佈(Weibull Distribution)。
過程反應器之螢光漂白結果與自準直光束處理確定之漂白參數一起用於確定各別不對稱機率分佈函數之劑量分佈參數的值。此舉藉由進行蒙特卡羅模擬及最佳化實現。最佳化之目標為匹配實驗與模擬螢光分佈平均值。可接受解決方案之額外要求置於螢光機率分佈函數的相對末端(10百分位及90百分位)-規定此等兩個參數的實驗及模擬分佈抽象物值在可接受解決方案中彼此的2 FU中。為了滿足最佳化目標及要求，劑量分佈參數之值以決策變數形式分配且在極限內自動變化直至獲得各值的最佳組合。典型模擬(內環路)及最佳化(外環路)必然伴有以下：
1.假設劑量分佈位置、規模及形狀(或等效物)之初始值
2.自ExpF(0)之1e4值：恆定位置、規模及形狀(意謂條件=z之恆定劑量分佈)計算SimF(z)之1e4值
a.確定SimF(z)之平均值、10百分位及90百分位
b.比較目標與要求之SimF(z)及ExpF(z)的平均值、10百分位及90百分位。
c.判斷差是否在允許公差內；若是，則解決方案 得到允許
3.假設劑量分佈位置、規模及形狀(或等效物)的新值
a.返回步驟2；重複順序直至位置、規模及形狀之1e3組合測試到
4.順序結束時，計算允許解決方案之統計資料且識別最佳解決方案。
模擬之輸出說明顯示於表K中：
使用上述方法之模擬及最佳化的結果顯示於圖8A及圖8B中。曲線圖描繪一個模擬及相應實驗分佈的螢光累積機率分佈及劑量分佈。因為實驗bin更有限之解析，所以實驗分佈看似更「逐步」。不同過程反應器處理可產生相當不同之螢光分佈；相應地，除用於目標及要求規格外之各點處的擬合性質與劑量分佈不對稱性之程度一樣可變化。
圖8A描繪以過程反應條件處理之微球體的實驗及模擬螢光分佈的累積機率分佈；圖8B顯示模擬之劑量分佈。
劑量機率密度函數對螢光分佈模擬準確度之作用
為了簡化模擬且提供比較之系統平均值，藉由使用若干熟知不對稱機率分佈函數抽象化劑量分佈，包括廣義γ、對數常態及韋布分佈。所有過程反應器處理均以全部機率密度函數進行模擬，以便比較及選擇最適當分佈函數用於將來模型建立。螺旋狀(0.3AU)及螺旋狀(0.7AU)處理條件總是獲得最高性質擬合，而不管用於表示劑量的機率密度函數類型。性質上，分佈類型看似會略微影響與螢光分佈之不同百分位相關的誤差。使用廣義γ分佈之模擬的誤差基本上隨機，而對數常態及韋布分佈則為更線性或二次的。與分佈函數類型無關，所有處理類型之誤差在3%之內且百分位為10%至90%。與複雜過程反應器之模擬有關的誤差與準直光束處理獲得者相當。因為過程反應器模擬之漂白常數值獲自準直光束模擬，所以所有模擬的最大誤差來源可能源自漂白動力學的數學處理。
機率密度函數對劑量分佈形狀之作用
用於表示劑量之不同機率密度函數具有不同特性及特徵。因此，其在模擬期間的表現可不同且產生不同劑量分佈形狀。圖9中顯示由源自不同薄膜過程反應器處理之螢光分佈模擬所獲得之與不同機率密度函數有關的劑量分佈。圖10中顯示由不同螺旋狀反應器處理之模擬所獲得的分佈。
薄膜反應器處理產生比螺旋狀反應器寬的劑量分佈。對於較寬分佈，不同機率密度函數表現極類似。在低吸光度下，不對稱性及歪斜程度看似難區分。在較高吸光度下，不同機率密度函數產生看似較不同的劑量分佈。廣義γ產生具有顯著指數特徵之劑量分佈。韋布在低劑量下展示類似激增但在較高劑量下比廣義γ衰減慢得多。或者，對數常態保持較低吸光度下觀測到的逐漸上升及逐漸下降-除了隨吸光度增加變寬外，對數常態推導之劑量的外觀不會顯著變化。
針對所有機率密度函數同等進行對薄膜反應器產生之螢光分佈的模擬。所有最佳化均以相當數目之迭代收斂於規定公差內。約束決策變數值的極限的選擇對所有模擬之效能均具有顯著作用-一旦識別出適當極限，則使用不同分佈函數獲得的可接受解決方案之比例類似。廣義化γ及韋布之「位置」、「規模」及「形狀」參數的極限選擇更直觀；因此，在此等情形中，需要較少初步檢索來發現決策變數參數的適當初始值。
由螺旋狀反應器產生的狹窄劑量分佈對模擬更具挑戰且更顯著辨別不同機率密度函數。當使用廣義γ表示劑量時，以螺旋狀反應器處理針對所有吸光度均產生極狹窄且急劇下降的分佈。所得分佈顯著為指數的且特徵上看似接近狄拉克δ函數(Dirac-delta function)。使用韋布不允許分佈如此極端縮窄。然而，該行為與以薄膜反應器所觀測到的不可思議地類似，好像分佈函數接近於數學極限。使用對數常態分佈生產不可預知且可疑的行為。
對於不同機率密度函數，源自螺旋狀反應器之螢光分佈的模擬執行起來極不同。使用廣義γ之模擬在所有情形中均表現良好，且展示在類似迭代數目內平滑收斂至規定公差內。
使用韋布模擬需要顯著更多的檢索來發現初始判定值極限，但最終按照規定收斂。使用對數常態模擬表現不佳；2/9未能收斂且其餘傾向於產生單一行為。總之，廣義γ分佈展示最可靠且靈活的效能。
機率密度函數對劑量分佈抽象物值的作用
出於實際原因，需要使用抽象物或具有理解含義之單值描述劑量分佈。對於正態分佈，通常使用之抽象物為平均值及標準差。在廣義γ、對數常態及韋布分佈之情形中，邏輯延伸看似將為位置、形狀及規模參數。不幸地，此等參數缺乏用於描述分佈位置及擴充的直觀 意義。更一般可適用之量度包括平均值、模式及百分位-此等量度將用於定量用於其他計算及極限估算之劑量分佈
因為用於定量表示劑量之機率密度分佈看似影響劑量分佈之形狀，所以必須判斷該函數是否會影響用於定量分佈之抽象物值。為了測試此可能性，使用所有機率密度函數將所有反應器模擬的平均值、10百分位、50百分位及90百分位的值製表。藉由ANOVA分析所得值以判斷是否存在與分佈類型的顯著相關性。此分析之資料及結果顯示於表L(反應器1為薄膜反應器且反應器2為螺旋狀反應器)中。統計分析有力地顯示用於表示劑量之分佈函數對劑量分佈抽象物值不具有顯著作用。此作用之p值>0.5，而反應器類型及培養基吸光度的p值<0.0001。
劑量分佈抽象物值的不確定性估算
量測及計算之純量值可僅以有限確定度表示。較高尺寸量測(如分佈)同樣如此。在UVC劑量分佈之特定情形中，可預想「置信區域(confidence envelope)」之存在，其中該置信區域完全包圍分佈形狀且表示切割分佈區域之「線」必須及可能佔據的「空間」。不確定度的較簡單定量表達式涉及表示全部分佈抽象物之平均值及方差(平均值、10百分位、50百分位及90百分位)。
用於判斷劑量分佈之計算方法可使不確定度增加超過由實驗量測方差所產生之不確定度。不確定度之可能來源的解釋為估算適當值時的謹慎起始步驟。表M中提供整個UVC劑量判斷過程中顯著誤差來源。
對誤差來源及可觀測到其作用之點的檢查顯示方差實際上可集中歸為三類： 1.源自準直光束、微球體漂白及FACS量測，且可藉由準直光束FACS資料的群體統計學量測之誤差；2.源自漂白等式之擬合，且可藉由蒙特-卡羅試驗之隨機統計學量測的不確定度；3.源自劑量機率密度函數之擬合，且可藉由蒙特-卡羅試驗之隨機統計學量測的不確定度。
第2類及第3類方差可另外遭遇方差作用之蔓延。亦即，由漂白參數擬合誘導之方差通過劑量分佈擬合後可放大(或減弱)。該行為對非線性系統為可能的(與漂白等式中存在的一樣)。單獨處理此等不同類別之方差，接著組合形成估算劑量分佈抽象物值之不確定度的方法。
藉由以系統地改變要求公差範圍進行蒙特卡羅模擬，從而估算第2類及第3類方差來源之貢獻；相應地調整決策變數極限使得自每次模擬獲得類似比例的可接受解決方案。此等模擬之目的為確定源自蒙特卡羅模擬之不確定度的近似量值，從而確定漂白參數值及劑量分佈量測值。選擇螢光之公差極限作為調節不確定度的「槓桿」，此係因為必須對其作出規定以進行模擬且可以想像，其可與螢光方差之獨立確定量測值比對。不出所料，螢光公差範圍不影響螢光或劑量分佈抽象物的平均值，但其確實影響方差(標準差或變異係數)。然而，此等來源之方差量值不是特別大，因為螢光CV僅在0.002至0.0083之範圍內(表M，+/- 2FU公差情境)。
藉由使用群體統計法分析來自眾多準直光束處理及FACS分析的螢光資料，從而估算第1類方差來源之貢獻。分析顯示第1類來源之方差顯著大於來自其他貢獻者，此係因為螢光CV在0.02至0.04範圍內。因為第1類方差貢獻為第2類與第3類之組合貢獻的5至10倍，所以在估算劑量分佈抽象物值的全部方差時僅需考慮第1類方差貢獻。
原則上，可使用蒙特卡羅模擬(Brattin 1996，Frey 1998)確定與劑量分佈抽象物有關的方差(或不確定度)。不幸地是，並未良好控制公差範圍對方差之作用，如在恆定螢光公差及類似劑量下源自不同反應器類型之大範圍CV所證明。因為由蒙特-卡羅法確定之不確定度的估算看似視其他不受控制因素(諸如目標值的約束範圍)而定，所以需要其他方法來估算此等值。
為了開發估算劑量分佈抽象物中之方差及/或不確定度的程度的手段，假設劑量之變異係數可能與螢光之變異係數有關。最簡單關係、線性比例之檢驗顯示參數對不同模擬情境均良好表現且在極有限跨度上變化。藉由比較使用蒙特卡羅技術獲得之CV比值與使用群體統計模式建立技術獲得者，提供使用此參數估算方差之其他調整。此等結果之比較提供於圖11中，且表明此參數之值幾乎不取決於用於其計算之方法且同樣適於不同機率分佈區域(平均值及10百分位、50百分位、90百分位)。
因為實驗處理之方差貢獻(第1類)明顯最大，所以使用由使用群體模型所推導之CVRatio參數的表達式自準直光束群體方差計算劑量分佈之方差(由圖11中的實心符號及擬合線所示)。表N中提供劑量分佈抽象物方差的數學表達式：
表N提供用於自準直光束螢光分佈群體標準差計算劑量分佈抽象物之標準差的表達式。
表N中提供此公式用於估算此報導中所述之資料及模擬的劑量分佈方差之應用。此等結果之表現與由不確定分佈特性之基本分析所預期者相當一致(Brattin 1996，Frey 1998)。
表O提供使用表N中所述方法計算之劑量分佈抽象物的平均值及標準差(R1=反應器1，薄膜UVC反應器)：
實例2之結論
開發確定性卷積模型來模擬UVC螢光漂白之作用。模型含有與 光顯微術及雷射誘導之螢光速度量測中用於定量分析者類似的漂白函數。漂白函數用於變換未經處理之微球體螢光分佈。藉由使擬合最佳化來選擇經處理微球體螢光分佈平均值發現動力學常數。使用此數學方法在寬劑量範圍上準確地重現整體分佈特徵。
藉由進行劑量分佈與未經處理之微球體螢光分佈的隨機數學卷積將漂白分析延伸至過程反應器。對表示劑量之不同不對稱分佈函數的比較揭示函數形式影響劑量分佈之視覺外觀，但不影響定量分佈抽象物。選擇廣義γ分佈一般表示劑量，因為其相對於其他分佈函數展現出眾耐久性及收斂性。
開發數學框架來估算與不同劑量分佈抽象物有關的不確定性(及方差)。方法利用使用群體統計學由對眾多準直光束處理之分析所確定的變異係數。不同分佈抽象物之方差相對於劑量及螢光之抽象物值按比例放大。所得方差近似法之一般行為與藉由替代數學手段確定者相當一致。
實例2中所引用之參考文獻
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實例3 薄膜反應器之理想機械劑量模型
在實例3中，描述模擬由穿過連續流動薄膜UVC反應器之通路產生的劑量分佈之確定性卷積模型。模型含有解釋UVC通量率之半徑依賴性及在兩個圓柱之間所形成的環形區域中之軸流速度的函數。藉由根據互易定律卷積半徑位置之速度加權分佈的通量率及滯留時間來計算UVC劑量分佈。使用蒙特-卡羅法進行卷積。推斷出分佈抽象物且與使用螢光微球體漂白方法實驗獲得者比較。模型亦用於以數學方法表徵若干反應器設計及/或操作參數的作用。
先前已使用用於UVC劑量分佈判斷(使用UVC敏感之螢光珠粒光漂白)之實驗方法(參看實例1)及用於定量通過流式反應器期間傳遞至螢光珠粒之劑量分佈的確定性卷積模型(參看實例2)來支持過程及反應器設計。仍需要判斷操作參數值對所接收劑量之作用的預測模型， 以允許對一個參數(諸如流動速率)進行知情調整，從而抵消其他參數(諸如培養基吸光度或燈功率)之改變。由過程反應器所傳遞之劑量固有分佈之事實迫使使用預測模型支持過程及反應器設計；在政府部門管制的使用情況下尤其如此(參看例如EPA(2006))。最常用模型採用隨機軌跡預測之計算流體力學來估算傳遞至假設粒子之群體的劑量分佈(Liu_2004)。儘管實驗驗證極有限，但認為此等模型準確且可靠，預測劑量分佈概況時尤其如此。此等模型之另一缺點為其要求高度專業化電腦軟體系統及操作員，且計算幾乎不具有透明度或直觀性。
實例3描述一種用於預測通過由兩個同心圓柱形成之薄膜反應器之環形區域時增加的UVC劑量分佈之新穎確定性模型。該模型藉由根據發光之互易定律卷積UVC通量分佈(半徑之函數)與滯留時間(半徑之函數)來計算劑量。卷積使用蒙特-卡羅法，其中半徑分佈由速度加權分佈函數說明。通量率及軸向速度之等式源自基本等式之分析解決方案，該等基本等式適用於簡單同心圓柱幾何形狀。
實例3之材料及方法 UVC劑量之實驗判斷
藉由定量螢光微球體之漂白實驗判斷UVC分佈。如實例1中所述，螢光微球體以準直光束(對照)及連續流動反應器(未知)處理且以數位流式細胞儀(FACS)量測以判斷螢光分佈。使用確定性卷積模型自螢光分佈推斷出UVC劑量分佈，該模型如實例2所述採用動力學漂白等式及根據互易定律的廣義γ分佈。
準確度之統計評定
藉由ANOVA及建立之其他統計法比較預測及量測之劑量分佈抽象物。
基礎物理學
光降解現象受常見物理定律(互易定律)支配，其可表示為： 破壞=ʃλ 函數(劑量(λ))d λ
劑量(λ)=ʃt I(λ,t)dt
互易定律之評論性綜述已顯示生物材料一律服從此定律且對用於製造螢光微球體之合成材料幾乎總是成立(Martin(2003))。低壓水銀燈在254 nm波長下基本上產生單色光，因此波長整合並非必須(EPA(2006))。此定律之實際意義為破壞程度視輻射劑量而定，且不同強度及時間組合可產生相同劑量。因此，不同微球體可橫向穿過UVC反應器之不同路徑且經歷不同輻射強度及滯留時間但積聚相同劑量，且因此破壞量相同。在數學術語中，正向計算(強度、時間至破壞)唯一，而反向計算(破壞至強度、時間)不唯一。在時間不變性的特定情形中，劑量等於通量率(I)與曝曬時間(t)之乘積。
UVC通量
已設計出用於計算通量率之多種方法且併入模型中以預測UVC過程反應器中之劑量。最常用方法之準確度與使用距離燈表面不同位置及距離(5至15 cm)懸浮於空氣或水中的固定光量計圓罩的實驗量測值進行比較。結果顯示簡單半徑模型最準確，非常接近燈表面(Liu(2004))。使用半徑模型成功預測具有適量吸收液(Abs=3至6 cm-1)的薄膜反應器(約5 mm環)中之不活化程度(Ye(2007))。反射貢獻對小環薄膜反應器及低吸光度流體可能重要(Bolton(2000))。吸收及外壁反射衰減的半徑通量率模型表示為(Liu(2004))：I(r)=I 1(r)+I 2(r)
RF 1=(1-R 1)＊T q ＊(1-R 2)
RF 1=石英反射因數
R 1=空氣至石英反射率
R 2=石英至水反射率
T q=石英傳輸
RF 1=不鏽鋼反射因數
滯留時間
薄膜反應器之簡單幾何形狀允許分析解決低雷諾數(Reynolds number)運動(通常稱為環形普塞流動(Poiseuille flow))之納維爾-史托克斯等式(Navier-Stokes equation)。此流動方案之特徵為存在與燈中心等距之均勻場線，產生軸向流動軌跡與燈表面平行的實際結果。與特定軌跡相關之滯留時間與軸向速度的倒數成比例。薄膜反應器之環形空間中的軸向速度及相關滯留時間表示為(Munson(1990))：
τ(r)=L/υ
R=ln(r 0/r i )
R 2=r i 2-r 0 2
R 4=r 0 4-r i 4
τ(r)=滯留時間(s)
v 2(r)=軸向速度(m/s)
r i =環之內徑(m)
r 0=環之外徑(m)
徑向機率函數
為了根據互易定律完成通量率與滯留時間的蒙特-卡羅整合，必須建立徑向機率函數。此機率函數確保在蒙特-卡羅計算中對半徑值進行取樣的頻率與實際工作中相當。在實際工作中，例如由螢光微球體漂白實驗所描繪，在既定半徑處橫穿反應器之收集體積內之粒子數目與彼半徑處之流體軸向速度成比例。此結果之所以發生係因為粒子均勻分散且軸向流動不隨時間變化且旋轉對稱(Ye(2007))。
對於流經同心圓柱之情形，徑向機率函數表示為： v 2(r)/Q=(-2/π)＊[(r 2-r 0 2)+(r 2/r)]＊(R 4-R 2 2/R)-1
實例3之結果及論述 反應器設計及操作參數
藉由對實驗資料及理論資料進行逐對分析來評定源自機械模型之預測準確度。使用在不同操作參數下施加於不同薄膜反應器之螢光珠粒漂白法獲得實驗資料。表P中提供不同反應器類型特有的操作及設計參數。圖32中提供反應器之示意圖。表Q中提供以反應器進行之特定測試實驗之操作參數。
量測及預測之逐對資料
表R中提供如FACS及隨後確定性反卷積法所判斷在表Q中詳述之實驗中傳遞至螢光微球體之劑量。應注意，劑量可由分佈函數描述，此係因為過程反應器不會傳遞均勻劑量。分佈函數使用分佈抽象物平均值P10、P50及P90描述。
表S中提供如使用模型開發部分中所述之模型判斷的在表R中詳述之實驗中傳遞的預測劑量。藉由相同分佈抽象物描述劑量分佈函數以使能夠直接比較模型準確度判斷。
預測劑量之準確度
在圖12種圖示比較實驗及理論預測。根據反應器及允許線性擬合之流體吸光度(交叉流動速率)將資料組分組。若預測完全準確，則所有資料點均將在各圖45度對角線上。圖表評論明確揭示所量測值內存在方差(預測值實際上為確定性的；因此不具有方差)。預先針對螢光微球體分析與用於判斷劑量之確定性卷積法之組合估算與不同量測劑量分佈抽象物相關之方差(參看實例2)。
進行正規統計分析以解決兩個問題：(1)兩個薄膜反應器是否產生統計學上不同的劑量分佈？及(2)量測及預測劑量統計學上不同之劑量範圍是什麼？反應器之比較需要使用機械模型，此係因為比較實驗 利用不同操作參數(及具有不同設計參數之不同反應器)且因此需要針對適合比較進行「正規化」。進行後一分析作為表徵機械模型之一部分，以使能夠隨後用於預測產生目標劑量值所需之操作參數值。
關於第一個問題，過程反應器不產生統計學上不同之劑量分佈且認為相等及可互換。關於第二個問題，機械模型不產生統計學上與下表T中規定範圍內劑量抽象物值之實驗不同的結果。正常操作平均值及P50劑量抽象物值含於規定範圍內且認為預期用途之預測為準確的。正常操作P10及P90劑量抽象物值或者可能位於規定範圍之外且需要進一步分析。
為了理解P10及P90劑量分佈抽象物之預測值與量測值之間的可能差異，比較多個獨立量測值之累積機率曲線圖。反應器之重疊比較分別顯示於圖13(反應器1)及圖14(反應器2)中(在圖13及圖14兩者中，預測結果以實線顯示且實驗結果以符號顯示)。
反應器1(圖13)之累積機率重疊之比較揭示預測分佈比量測分佈更不對稱。特定言之，預測分佈之低劑量側比量測對應物更急劇上升。同樣，預測分佈之高劑量側比持續高劑量尾部更急劇下降。一般而言，預測及量測曲線在低平均劑量下比高平均劑量下更緊密一致。儘管劑量分佈曲線在各情形中可能看似顯著不同，但劑量分佈抽象物無需如此；此結果藉由沿0.5累積百分位線及表示平均值之各填充符 號之間值的比較得以證明。一般而言，預測分佈對吸光度之靈敏度與量測分佈不同。
反應器2之累積機率覆蓋的比較(圖14)揭示類似於反應器1之趨勢。然而，重要差異為整個分佈上反應器2的量測與預測之間的一致性比反應器1更明顯。因為兩個反應器之機械模型相同(參數值除外)，所以差異必然由實驗資料的差異引起。因為機械模型代表理想反應器(軸向均勻流動等)，所以反應器2由於其略為不同之設計執行起來更類似於理想環形流UVC反應器的推斷是合理的。
圖15中最佳說明平均值及P50劑量分佈抽象物之準確度相對於P10及P90抽象物的區別。儘管所有分佈均與廣義γ分佈一致，但預測之分佈比量測之分佈尖銳。P10及P90劑量分佈抽象物的準確定量預測需要包括如表U中所示的此等值之偏置偏移。
預測之應用
直接影響所傳遞UVC劑量之若干變數具有可能影響最終傳遞劑量之控制帶。此等操作參數包括以下：1)培養基吸光度-混合個別組分時的變化可能改變254 nm下之溶液；2)體積流動速率-液體轉移在具有已知準確度之反饋控制下進行；3)燈功率-個別水銀燈產生略微不同量之UVC輻射且燈輸出隨使 用緩慢衰減；4)環形間隙寬度-個別石英套筒及不鏽鋼殼可具有略微不同的直徑尺寸。
為了支持過程表徵，使用機械模型估算與此等操作參數變化之作用混合相關的劑量。表V含有所研究操作變化範圍。
若所得劑量方差超過先前針對實例2中所述之螢光微球體分析所識別的誤差帶，則認為其統計學上顯著。為了確保適當評定與大劑量處理相關之培養基降解風險，判斷由所有操作參數之巧合變化引起的高劑量(最壞情形高劑量)。此劑量與統計學上顯著之高劑量進行比較且用於識別適於過程表徵中研究之劑量。
用於識別製造中之最壞情形高劑量之計算表徵過程及在過程表徵中傳遞最壞情形劑量之操作參數產生顯示於圖16A-16F中的劑量分佈。
圖16之檢查顯示傳遞至不同培養基類型(其A254值不同)之劑量分佈高度相當。類似地，結果顯示增加過程表徵之平均劑量(超過製造中預期之最壞情形高劑量)導致所有劑量抽象物的值增加。三種不同培養基類型之製造及過程表徵處理的最終偏置調整劑量抽象物值(以mJ/cm2表示)顯示於表W中：
單個參數變化之影響總是小於由所有變化產生的影響-所有變化產生的影響為所有單個參數變化之影響之相加。另外，多數潛在重要操作變數具有特定控制機制，包括以下：
1)培養基吸光度-原料規格及混合程序
2)體積流動速率-經流量計及流量控制器實現之反饋控制
3)燈功率-新燈規格及電功率監測
4)環形間隙寬度-製造商規格、尺寸不隨使用變化
對於完整性，以計算方式考慮培養基吸光度變化的意義。表X中提供產生100或150 mJ/cm2之劑量所需的吸光度(所有其他操作參數如針對125 mJ/cm2之劑量所規定)。檢查顯示此量值之培養基吸光度變 化實際上不可能。
實例3之結論
所述機械模型允許預測由針對平均值及P50分佈抽象物之實驗微球體判斷所判斷之置信區間內的UVC劑量。P10及P90抽象物之準確預測要求校正偏置偏移。使可能有助於形成高劑量之操作參數漂移混合產生約144 mJ/cm2之最壞情形劑量估算值。在過程表徵中使用150 mJ/cm2之劑量確保該劑量統計學上不同於製造目標劑量且超過正常操作最壞情形劑量。模擬顯示實際上不可能僅因低培養基吸光度而超過最壞情形劑量。
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實例4 判斷過程反應器UVC劑量 產生標準曲線
藉由將11.26 μl螢光珠粒儲備液(Polymicrospheres,Indianapolis IN，螢光F114聚苯乙烯微球體，粒子濃度為4.44×109)外加至50 ml 0.1% SDS溶液中達到每毫升1×106個粒子之粒子濃度製備對照混合物。
藉由準直光束反應器將對照劑量之UVC傳遞至含有螢光微球體之對照混合物。對照混合物曝曬於UVC持續不同累積時間，在各累積時間移除樣品。累積時間在1至20分鐘範圍內，因此提供各樣品自恆定強度UVC光源接收相應較高UVC劑量之樣品。UVC光源傳遞0.3836 mW/cm2之通量率。未曝曬樣品用作對照樣品。表Y概述用於產生標準曲線之資料。
使用裝備有用於在UVC範圍內激發且在450 nm下發射之固態紫外光雷射器之Dako MoFloTM XDP高速FACS分選機量測曝曬及對照(未曝曬)微球體之螢光分佈。各自展示含有約10,000個計數之分佈直方圖。對應於未曝曬微球體之樣品T0具有由曲線ExpF(T0)所示之螢光分佈。接收較高劑量之微球體樣品(在曝曬20分鐘之樣品T20中到達頂點)具有較低平均螢光(對應於分佈平均值之BIN數)。圖17顯示曝曬及對照微球體之螢光分佈。
量測螢光分佈後，進行數學反卷積來確定顯示於表Z中的光致漂白動力學常數：
使用最佳漂白常數產生量測螢光分佈(深色線)與模擬分佈(淺色線)之比較。此等結果顯示於圖18A及圖18B中。
判斷過程反應器劑量分佈
接著，進行數學反卷積以判斷由過程反應器處理所傳遞之劑量分佈。彼操作之結果顯示於表AA中：
接著進行量測螢光分佈之比較且顯示於圖19A至圖19B中。在圖19A中，量測螢光分佈(深灰色線)與模擬分佈(淺灰色線)比較；包括未處理微球體螢光分佈用於參考(黑線)。在圖19B中，顯示由通過過程反應器所產生且藉由所述模擬程序判斷之劑量分佈。
實例5 判斷複合培養基溶液中之微球體漂白動力學常數 產生標準曲線
藉由將微球體外加至(A)0.1% SDS溶液、(B)細胞培養基及(C)胎牛血清中製備對照混合物。根據實例1及實例4中所述之方法使分離對照混合物曝曬於一系列對照劑量之UVC。表BB、表CC及表DD分別概述用於產生針對SDS溶液、細胞培養基及FBS之標準曲線的資料。如表BB、CC、DD中所觀測到，增加程度之吸光度導致衰減程度之所接收劑量。
藉由如實例1及實例4中所述之FACS分析獲得SDS溶液、細胞培養基及FBS中所含之曝曬及對照(未曝曬)微球體之螢光分佈，且分別顯示於圖20、圖22及圖24中。如圖20、圖22及圖24中所觀測，增加光吸收導致衰減程度之所接收劑量，此導致微球體漂白程度降低。
量測螢光分佈後，進行數學反卷積來確定光致漂白動力學常數。反卷積中所用之方法描述於實例2中。使用針對SDS溶液、細胞 培養基及FBS中所含之微球體之最佳漂白動力學常數對量測螢光分佈與模擬分佈的比較分別顯示於圖21、圖23及圖25中。由培養基及胎牛血清所代表之複合高光學吸收溶液之量測及模擬分佈與由SDS溶液所代表之低光學吸收溶液的同等準確。
使用實例2中所述之反卷積程序確定微球體漂白動力學參數之數值且顯示於表EE中。重要地是，複合高光學吸收溶液(由培養基及胎牛血清代表)之漂白的漂白動力學參數之數值與低光學吸收簡單溶液(由SDS溶液代表)中者基本上相同。
實例6 判斷複合蛋白質溶液中之微球體漂白動力學常數 產生標準曲線
藉由將微球體外加至(A)0.1% SDS溶液、(B)含蛋白質-A純化之單株抗體(Mab)的過濾病毒不活化池(FVIP)及(C)含蛋白質-A純化之Mab的補充有UVC保護劑酪胺酸之FVIP中製備對照混合物。根據實例1及實例4中所述之方法使分離對照混合物曝曬於一系列對照劑量之UVC。表FF、GG及HH分別概述用於產生針對SDS溶液、含蛋白質A純化之Mab的FVIP及含蛋白質A純化之Mab的補充有酪胺酸之FVIP之標準曲線的資料。在此實驗中，基於流體之光吸收調整曝曬之滯留時 間從而在不同流體之間傳遞一組一致劑量。此調整時間在表GG及HH中稱為「材料之理論曝曬時間」。
藉由如實例1及實例4中所述之FACS分析獲得SDS溶液、蛋白質A純化之Mab FVIP及補充有酪胺酸之蛋白質A純化之Mab FVIP中所含之曝曬及對照(未曝曬)微球體之螢光分佈，且分別顯示於圖26、圖28及圖30中。
量測螢光分佈後，進行數學反卷積來確定光致漂白動力學常數。反卷積中所用之方法描述於實例2中。使用針對SDS溶液、蛋白質A純化之Mab FVIP及補充有酪胺酸之蛋白質A純化之Mab FVIP中所含之微球體的最佳漂白動力學常數對量測螢光分佈與模擬分佈之比較顯示於圖27A及圖27B、圖29A及圖29B以及圖31A及圖31B中。複合高光學吸收溶液(由蛋白質A純化之Mab FVIP及補充有酪胺酸之蛋白質A純化之Mab FVIP代表)之量測及模擬分佈與低光學吸收溶液(由SDS溶液代表)同等準確。
使用實例2中所述之反卷積程序確定微球體漂白動力學參數之數值且顯示於表II中。重要地是，複合高光學吸收溶液(由蛋白質A純化之Mab FVIP及補充有酪胺酸之蛋白質A純化之Mab FVIP代表)中之漂白的漂白動力學參數之數值與低光學吸收簡單溶液(由SDS溶液代表)中者基本上相同。
如尺寸排阻層析法所量測，以UVc輻射處理Mab蛋白質可能產生 有限破壞。納入酪胺酸作為保護劑可降低破壞程度。如表JJ中所見，在Mab FVIP中納入酪胺酸降低各處理劑量下產生之HMW雜質的量。儘管提供針對UVC誘導之蛋白質破壞的保護，但如FVIP與具有酪胺酸之FVIP之間基本上相同的漂白動力學參數值所證明，酪胺酸不干擾微球體之漂白。
實例7 藉由UVc處理使培養基中之病毒及黴漿菌不活化 產生標準曲線
藉由將外來試劑外加入兩種不同培養基製劑中來製備對照混合物；關於所用試劑及培養基製劑之資訊概述於表KK中。各自具有基礎培養基B或E之30 mL等分試樣外加有(A)5%(v/v)MMV儲備液、(B)5%(v/v)CVV儲備液或(C)100CFU/ml精胺酸黴漿菌(M.arginini)儲備液。將外加溶液轉移至100 mm具有磁力攪拌棒之皮氏培養皿中。在T=0分鐘(未曝曬之測試物品)處移除1 mL等分試樣。將皮氏培養皿置於UVC光下且開啟計時器；如表LL及表MM中所示在所要時間點移除曝曬樣品之1 mL等分試樣。藉由適合手段分析所收集之樣品中活試劑之存在。
如表LL及表MM中所示，病毒及黴漿菌曝曬於UVc輻射導致高於臨限劑量之完全不活化，各輪之間的臨限劑量由於正常實驗變化性可略微不同。然而，如先前實例中所觀測，光學吸收溶液中微球體之螢光漂白程度與所接收劑量進行性相關；藉此獲得對所接收UVc劑量之 更準確判斷。

Claims (24)

  1. 一種判斷傳遞至包含低光學傳輸複合流體之樣品的UVC光劑量之方法，其包含：(a)量測UVC光源傳遞之通量率；(b)藉由以下步驟產生標準曲線：(i)使可漂白螢光發射極與低光學傳輸複合流體接觸形成對照混合物；(ii)使該對照混合物曝曬於UVC光持續初始滯留時間；(iii)自該對照混合物獲得等分試樣；(iv)量測該(iii)之等分試樣發射之螢光；(v)重複(ii)-(iv)一或多次，其中該對照混合物曝曬於UVC光的滯留時間比該初始滯留時間長；(vi)使發射之螢光與該滯留時間關聯；(c)使可漂白螢光發射極與包含低光學傳輸複合流體之測試流體接觸形成測試混合物；(d)使該測試混合物曝曬於UVC光持續所選滯留時間；(e)量測由該測試混合物所發射之螢光；及(f)使用(b)之標準曲線判斷傳遞至該測試混合物之劑量。
  2. 如請求項1之方法，其中該UVC光之波長在約200 nm至約280 nm之範圍內。
  3. 如請求項2之方法，其中該UVC光之波長為254 nm。
  4. 如請求項1之方法，其中該低光學傳輸複合流體包括細胞培養基、血清、包含維生素、糖及顏料之混合物，及含有胺基酸、肽或蛋白質之溶液。
  5. 如請求項1之方法，其中該可漂白螢光發射極包含UV敏感之螢光 微球體。
  6. 如請求項1之方法，其中該UVC光源為NIST可追蹤UVC光源。
  7. 如請求項1之方法，其中該劑量以劑量分佈、平均劑量、P10劑量、P50劑量及P90劑量中之一者的形式提供。
  8. 如請求項1之方法，其中該UVC光源傳遞之通量率使用NIST可追蹤UVC偵測器量測。
  9. 一種使樣品中之有機體不活化之方法，該樣品包含已知或懷疑包含有機體之低光學傳輸複合流體，該方法包含：(a)識別已知或懷疑使病毒不活化之UVC劑量；及(b)使該樣品曝曬於UVC光源提供的不活化劑量之UVC光；其中該不活化劑量包含所選波長、所選UVC反應器功率及所選滯留時間；及其中功率及照射時間使用藉由以下產生之標準曲線判斷：(i)量測該UVC光源傳遞之通量率；(ii)使可漂白螢光發射極與低光學傳輸複合流體接觸形成對照混合物；(iii)使該對照混合物曝曬於UVC光持續初始滯留時間；(iv)自該對照混合物獲得等分試樣；(v)量測由該(iv)之等分試樣所發射之螢光；(vi)重複(iii)-(v)一或多次，其中該對照混合物曝曬於UVC光的滯留時間不同於該初始滯留時間；及(vii)使該發射之螢光與該曝曬時間關聯。
  10. 如請求項9之方法，其中該UVC光之波長在約200 nm至約280 nm之範圍內。
  11. 如請求項10之方法，其中該UVC光之波長為254 nm。
  12. 如請求項9之方法，其中該低傳輸流體包含細胞培養基。
  13. 如請求項9之方法，其中該螢光發射極包含UV敏感之螢光微球體。
  14. 如請求項9之方法，其中該有機體為孢子。
  15. 如請求項9之方法，其中該有機體為病毒。
  16. 如請求項9之方法，其中該有機體為細菌。
  17. 如請求項9之方法，其中該病毒包含dsDNA病毒、ssDNA病毒、dsRNA病毒及ssRNA病毒中之一或多者。
  18. 如請求項17之方法，其中該病毒包含一或多種以下病毒科之病毒：腺病毒科(adenoviridae)、非洲豬瘟病毒科(asfarviridae)、疱疹病毒科(herpesviridae)、虹彩病毒科(iridoviridae)、乳頭瘤病毒科(papillomaviridae)、多瘤病毒科(polyomaviridae)、痘病毒科(poxviridae)、圓環病毒科(circoviridae)、肝病毒科(hepadnaviridae)、小DNA病毒科(parvoviridae)、雙核糖核酸病毒科(birnaviridae)、呼腸孤病毒科(reoviridae)、沙粒病毒科(arenaviridae)、玻那病毒科(vornaviridae)、本揚病毒科(bunyaviridae)、代爾塔病毒科(deltaviridae)、絲狀病毒科(filoviridae)、正黏液病毒科(orthomyxoviridae)、副黏液病毒科(paramyxoviridae)、桿狀病毒科(rhabdoviridae)、動脈炎病毒科(arterioviridae)、星狀病毒科(astroviridae)、杯狀病毒科(caliciviridae)、冠狀病毒科(cornonavirdae)、黃熱病毒科(flaviviridae)、HEV樣病毒、野田病毒科(nodaviridae)、小核糖核酸病毒科(picornaviridae)、披衣病毒科(togaviridae)及反轉錄病毒科(tertroviridae)。
  19. 如請求項18之方法，其中該病毒為小DNA病毒MVM、反轉錄病毒MuLV或本揚病毒CVV。
  20. 如請求項9之方法，其中該方法提供大於或等於約0.5、約1.0、 約1.5、約2.0、約2.5、約3.0、約3.5、約4.0、約4.5、約5.0、約5.5、約6.0、約6.5或大於約6.5之病毒對數減少值(LRV)。
  21. 如請求項9之方法，其另外包含改進(a)初始功率及(b)初始週期中一者或兩者之步驟，使得UVC反應器傳遞之平均劑量等於不活化劑量。
  22. 如請求項9之方法，其中該UVC光源為NIST可追蹤UVC光源。
  23. 如請求項9之方法，其中該劑量為劑量分佈、平均劑量、P10劑量、P50劑量及P90劑量中之一者。
  24. 如請求項9之方法，其中該UVC光源傳遞之通量率使用NIST可追蹤UVC偵測器量測。
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