TW201323857A - 檢測鉛離子的方法及套組 - Google Patents
檢測鉛離子的方法及套組 Download PDFInfo
- Publication number
- TW201323857A TW201323857A TW100144700A TW100144700A TW201323857A TW 201323857 A TW201323857 A TW 201323857A TW 100144700 A TW100144700 A TW 100144700A TW 100144700 A TW100144700 A TW 100144700A TW 201323857 A TW201323857 A TW 201323857A
- Authority
- TW
- Taiwan
- Prior art keywords
- buffer solution
- intensity
- test
- gold nanoparticles
- test strip
- Prior art date
Links
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
本發明係關於一種檢測鉛離子的方法,其包括下列步驟:提供檢測試紙,其包括基材與附於該基材上的經蛋白修飾的金奈米粒子,該檢測試紙呈現一顏色之第一強度;提供反應試劑,其包括硫代硫酸鈉(Na2S2O3)、2-硫甘醇(2-mercaptoethanol)及緩衝溶液;將待測樣品與該檢測試紙及該反應試劑反應,使該檢測試紙呈現該顏色之第二強度;以及分析並比較該顏色的第一強度及第二強度,其中第二強度小於第一強度表示該待測樣品含有鉛離子。本發明亦提供檢測鉛離子的套組。
Description
本發明係關於一種鉛離子的檢測方法及檢測套組。
鉛係廣泛地應用於工業界,主要用以製造鉛蓄電池。隨著汽車工業的發達,鉛使用量更逐年提升,造成鉛廣散分布於地球環境中。然而,鉛的毒性會影響生殖、免疫、神經、心血管等人體系統,尤其孩童的身體發育及智力發展,一旦鉛進入人體,會形成一種神經毒素,減緩腦部和神經傳導的速度,進而導致行為無法控制等情形。
美國環境保護局係明訂一般飲用水中鉛含量的安全值為15 ppb。由於,人體尿液及血液的鉛濃度可作為職場或環境中鉛污染的取樣來源,因此美國疾病管理局公布尿鉛的含量標準為23 ppb,世界衛生組織亦訂定成年人血液中的鉛含量安全範圍需小於300 ppb,尤其當血中鉛含量達到600 ppb時,即需接受螯合治療(Chelation therapy)。
傳統中,檢測環境或生物樣品的鉛離子檢測方法可為原子吸收光譜儀(atomic absorption spectrometry)、石墨爐原子吸收光譜儀(graphite furnace atomic absorption spectrometry)、陽極剝除伏安法(anode stripping voltammetry)、感應耦合電漿原子發射光譜分析儀(ICP-AES)、感應偶合電漿質譜儀(ICP-MS)、X光螢光儀(x-ray fluorescence spectroscopy)、中子活化分析(neutron activation analysis)、微分脈波陽極脫除伏安法(differential pulse anode stripping voltammetry)或同位素稀釋質譜儀(isotope dilution mass spectrometry)。上述檢測方法或儀器雖然都可達到ppb等級,然而儀器的操作繁瑣、高度專業化,且價格昂貴、維修保養不易。
近年來,開發出多樣較為簡易的光學技術以取代儀器,例如:小分子(small molecules)、DNA酶(DNAzymes)、寡核苷酸(oligonucleotides)、高分子聚合物(polymers)、蛋白質(proteines)或奈米材料(nanomaterials)等,其皆可用以檢測水溶液中鉛離子濃度,但是限制條件多,具有水溶性差、易受其他金屬離子干擾、基質干擾、高成本、檢測過程複雜、穩定性差或線性範圍窄等缺點。
綜上所述,精密的儀器設備雖靈敏度高,但操作不易、價格昂貴,相對地簡易的光學技術檢測結果精準度不佳,又限制條件多。因此,亟需開創檢測方法以落實靈敏度佳,但同樣簡易低成本的鉛離子檢測。
本發明係首次提出以經蛋白修飾的金奈米粒子塗布於試紙上,當加入含有硫代硫酸鈉(Na2S2O3)、2-硫甘醇(2-mercaptoethanol)及緩衝溶液之反應試劑及待測樣品時,如該待測樣品含有鉛離子,則該試紙的顏色強度會減弱,因此,可用以檢測待測樣品之鉛離子。根據本發明之檢測對鉛離子有高度的專一性及靈敏度,可應用於高濃度鹽類、生物尿液或血液等各式樣品,且偵測極限達皮摩爾(picomolar)等級。
因此,在一方面,本發明提供一種檢測鉛離子的方法,其包括下列步驟:
(a)提供檢測試紙,其包括基材與附於該基材上的經蛋白修飾的金奈米粒子,該檢測試紙呈現一顏色之第一強度;
(b)提供反應試劑,其包括硫代硫酸鈉(Na2S2O3)、2-硫甘醇(2-mercaptoethanol)及緩衝溶液;
(c)將待測樣品與該檢測試紙及該反應試劑反應,使該檢測試紙呈現該顏色之第二強度;以及
(d)分析並比較該顏色的第一強度及第二強度,其中第二強度小於第一強度表示該待測樣品含有鉛離子。
較佳地,本發明之方法進一步包括在待測樣品與該檢測試紙及該反應試劑反應後,以微波處理該檢測試紙。該微波處理可用以加速反應時間。
在另一方面,本發明提供亦一種檢測鉛離子的套組,其包括基材與附於該基材上的經蛋白修飾的金奈米粒子;以及反應試劑,其包括硫代硫酸鈉(Na2S2O3)、2-硫甘醇(2-mercaptoethanol)及緩衝溶液。
本發明之各個具體實例的細節說明如後。本發明之其他特徵將會經由以下各個具體實例中的詳細說明及申請專利範圍而清楚呈現。
無須進一步的闡述,咸相信本發明所屬技術領域中具有通常知識者基於前述說明即可利用本發明至最廣的程度。因此,可以理解以下的說明僅僅是作為例示說明之用,而非以任何方式限制其餘的揭露內容。
本發明說明中之用詞通常具有在本技術領域中、在本發明內容中、及各用語所在之特定內容中的原始意義。某些用來描述本發明之詞彙將在以下或在發明說明書中討論,以對專門人員提供有關於本發明之描述的附加指南。為了方便,某些詞彙可能會以醒目標示,例如使用協體及/或引號。醒目標示之使用並不影響一詞彙之範圍及意義;一詞彙之範圍及意義在同內容中係相同的,無論是否以醒目標示。可被理解的是,同樣的事情可用一種以上的方式說明。因此,可使用其他語言及同義字用於任何一或多個此處討論的詞彙,且一詞彙是否在此處被詳盡闡述或討論並不賦予任何特殊的意義。提供某些詞彙的同義字。一或多個同義字之敘述並不排除其他同義字之使用。在本發明說明書任一處,實例的使用包括此處所討論的任何詞彙的例子,係僅用於解說,並不限制本發明或舉例用辭彙之範圍及意義。同樣地,本發明並不受本發明說明書中所給的各種具體實施例。
除非另有定義,此處所有使用之技術及科學名詞具有與本發明所屬技術領域中熟習此藝者所一般性了解者相同的含意。如有矛盾的情形,以本文件(包括定義)為準。
本文所使用的「一」乙詞,如未特別指明,係指至少一個(一個或一個以上)之數量。
在一方面,本發明提供一種檢測鉛離子的方法,其包括下列步驟:
(a)提供檢測試紙,其包括基材與附於該基材上的經蛋白修飾的金奈米粒子,該檢測試紙呈現一顏色之第一強度;
(b)提供反應試劑,其包括硫代硫酸鈉(Na2S2O3)、2-硫甘醇(2-mercaptoethanol)及緩衝溶液;
(c)將待測樣品與該檢測試紙及該反應試劑反應,使該檢測試紙呈現該顏色之第二強度;以及
(d)分析並比較該顏色的第一強度及第二強度,其中第二強度小於第一強度表示該待測樣品含有鉛離子。
在另一方面,本發明提供一種鉛離子的檢測套組,其包括:檢測試紙,其包括基材與附於該基材上的經蛋白修飾的金奈米粒子;以及反應試劑,其包括硫代硫酸鈉(Na2S2O3)、2-硫甘醇(2-mercaptoethanol)及緩衝溶液。
本文所述的檢測試紙之「基材」可為任何可與蛋白吸附之材質者,包括但不限於硝化纖維膜、耐龍轉漬膜、聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)、醋酸纖維膜、混合纖維膜、氧化鋁濾膜和聚碳酸脂樹脂膜。其中,由於硝化纖維膜和蛋白之間具有高疏水作用力,可作為主要的吸附力,且硝化纖維膜已被廣泛地用於轉印蛋白質,因此在一特定實施例中,選用硝化纖維膜作為檢測試紙之基材。
本文所述的「金奈米粒子」可為任何奈米尺寸的金粒子。金奈米粒子形狀可為如點狀、球狀、棒狀或盤狀等;平均直徑範圍可為5-25 nm,特定而言為10-20 nm,又更特定而言為約13 nm;以及吸收波長範圍可為400 nm至600 nm,特定而言為約450 nm至550 nm,又更特定而言為約520 nm。具體而言,本發明使用的金奈米粒子為球狀,並具有13 nm之平均直徑以及於紫外光-可見光吸收光譜中的最大吸收波長520 nm(呈現紅色)。本發明使用的金奈米粒子可依習知方式將三價金離子錯合物還原成一價金離子後,再還原成零價金原子並聚集成奈米尺度而製得。例如,將檸檬酸鈉溶液置於圓底雙口瓶,加熱攪拌至沸騰狀態後,加入四氯金酸溶液,持續加熱攪拌,溶液從原本黃色的三價金離子錯合物變化成無色的一價金離子,再由無色變成黑色的金奈米晶種,最後轉變為酒紅色的金奈米粒子,接續以冰浴急速冷卻至室溫,保存於4℃冰箱。
根據本發明的金奈米粒子係經蛋白修飾,因而可吸附於檢測試紙之基材上。可用於修飾金奈米粒子的蛋白包括但不限於牛血清白蛋白、白蛋白、肌紅蛋白、血纖維蛋白和酪蛋白。
根據本發明的檢測試紙包括基材與附於該基材上的經蛋白修飾的金奈米粒子。本發明的檢測試紙可用以下方式製得:例如,先將金奈米粒子與具有該蛋白之蛋白溶液混合形成金奈米粒子蛋白混合液,然後將該金奈米粒子蛋白混合液塗布於該基材上,以及可視需要地進行乾燥及/或清洗等步驟。圖1顯示根據本發明之特定實例中的檢測試紙的製備方式。
本發明使用的反應試劑包括硫代硫酸鈉(Na2S2O3)、2-硫甘醇(2-mercaptoethanol)及緩衝溶液。其各自可視需要調配適當濃度。例如,硫代硫酸鈉可調配濃度範圍為50-150 mM,較佳為約100 mM;2-硫甘醇可調配濃度範圍為200-300 mM,較佳為約250 mM;以及緩衝溶液可為甘胺酸氫氧化鈉緩衝溶液,濃度為約1-10 mM,較佳為5 mM。本發明使用的緩衝溶液可具有酸鹼值範圍為9-11,較佳為約pH 10。本發明使用的緩衝溶液亦可為其他種類的緩衝溶液,包括但不限於,磷酸鹽緩衝溶液、三羥甲醇丙烷(Tris)緩衝溶液和檸檬酸鹽緩衝溶液。反應試劑中的硫代硫酸根離子會穿過檢測試紙表面的牛血清白蛋白,於金奈米粒子表面瞬間形成複合物(Au(S2O3)2 3-),此時若待測樣品中含有鉛離子,鉛離子會沈積於金奈米粒子表面,因而加速2-硫甘醇和金奈米粒子以Au+-2-ME的型態析出。在一特定實例中,金奈米粒子未析出前,其於表面電漿共振光譜(Surface Plasmon Resonance,SPR)的吸收峰落在520 nm,一旦金奈米粒子析出,波長520 nm的吸收強度就會減低,其可由一般分析顏色強度的儀器測得。
本文所述的「顏色之強度」係指一特定顏色之強度(或稱深淺度),可由各種已知的測量方式量化。例如,可以掃描獲得待測物之影像,以軟體分析顏色強度,其主要分析紅、藍、綠(RGB)三值,強度以0至255之數值表示。在一特定實例中,本發明是測量檢測試紙之吸收綠光的G值(定義為G abs),以判斷紅色之強度,其中G abs數值較大時,表示紅色之強度較小。
本文所述的「第一強度」是指檢測試紙在與檢測試劑與待測樣品反應之前的顏色之強度;而「第二強度」是指檢測試紙在與檢測試劑與待測樣品反應之後的顏色之強度。根據本發明,分析並比較檢測試紙之顏色的第一強度及第二強度,如第二強度小於第一強度,表示待測樣品含有鉛離子。具體而言,此處所述的「第二強度小於第一強度」可為第二強度為第一強度的95%或以下,較佳為85%或以下,更佳為75%或以下。
適用於本發明的待測樣品較佳為液狀樣品,例如,來自環境中的液狀樣品,如,海水或雨水;或來自生物體的液狀樣品,如尿液或血液。
根據本發明,待測樣品與檢測試紙及反應試劑反應後,檢測試紙會因待測樣品存在鉛離子與否而產生顏色的強度變化,且可依強度變化計算出鉛離子濃度。具體而言,進行檢測時,先將反應試劑與待測樣品混合,再將混合物加於檢測試紙上。待測樣品與檢測試紙及反應試劑之反應時間較佳為30分鐘或以上,更佳為1小時或以上,還要更佳為2小時或以上。在一特定實施例中,為了加速反應進行,可進一步以微波處理該檢測試紙。本發明使用的「微波」是指波長介於紅外線與特高頻之間的電磁波輻射,波長範圍大約在1 m至0.1 mm之間,頻率範圍是300 MHz-300 GHz。在一具體實施例中,使用頻率為2-3 GHz之微波爐,以功率為約450 W,對檢測試紙進行微波處理。經微波處理,反應時間可縮短至2小時以下,更佳為1小時以下,還要更佳為30分鐘以下,最佳可達約10分鐘。
以下實例僅作為說明,而非作為本發明之限制。
四氯金酸(Hydrogen tetrachloroaurate(III) trihydrate,HAuCl4)、2-硫甘醇(2-Mercaptoethanol,C2H6OS)、硫代硫酸鈉(Na2S2O3)、甘胺酸(glycine)、半胱胺酸(cysteine)、氫氧化鈉(NaOH)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)、氯化鋰(LiCl)、氯化鈉(NaCl)、氯化鉀(KCl)、氯化鈣(CaCl2)、氯化鎂(MgCl2)、氯化亞鐵(FeCl2)、氯化鐵(FeCl3)、硝酸鎳(Ni(NO3)2‧6H2O)、硝酸銅(Cu(NO3)2)、硝酸鈷(Co(NO3)2‧6H2O)、氯化鋅(ZnCl2)、氯化錳(MnCl2)、氯化鎘(CdCl2)、氯化鉑(PtCl2)、氯化鉛(PbCl2)、硝酸鉛(Pb(NO3)2)、氯化鍶(SrCl2)、氯化鉻(CrCl3)、硝酸銀(AgNO3)和氯化汞(HgCl2)購於美國Sigma-Aldrich公司。磷酸二氫鈉(NaH2PO4‧H2O)、磷酸氫二鈉(Na2HPO4‧2H2O)、磷酸三鈉(Na3PO4‧12H2O)和三鈉檸檬酸鹽(Trisodium citrate dehydrate)購買自美國J. T. Baker公司。Urine sample(SRM 2672a)購買自National Institute of Standards and Technology(NIST,Maryland)。血液樣品(BCR 636、635、634)購買自Institute for Reference Materials and Measurement(IRMM,Geel,Belgium)。
盤式吸收儀SynergyTM 4 Multi-Mode Microplate Reader(Biotek Instruments,USA);穿透式電子顯微鏡H-7100(Hitachi,Tokyo);感應耦合電漿質譜儀E-6000(Perkin-Elmer,Germany);加熱攪拌器PC-420(Corning,USA);超音波洗淨器D9NX-DC200H(Delta,Taiwan);震盪混合器G-560(Scientific-Industries,USA);迴轉式混合器S-101(Firstek,Taiwan);純水機Milli-Q system QGARD00R1(MA,USA);電子分析天平HR-200(Adapter,Japan);高速離心機3K-30(Sigma,Germany);pH酸鹼度計SP-701(Switzerland,UK);桌上型掃描機Epson Perfection 1660 Photo Scanner(Epson,USA);飛行式質譜儀AutoflexIII MALDI-TOF/TOF mass spectrometer(Bruker Daltonics,Bremen,Germany)。
100 mL的4.0 mM檸檬酸鈉溶液置於圓底雙口瓶,在冷凝迴流裝置下加熱攪拌至沸騰狀態後,迅速加入1.0 mL的0.1 M四氯金酸溶液,並持續加熱攪拌約8分鐘,溶液從原本黃色的三價金離子錯合物變化成無色的一價金離子,再由無色變成黑色的金奈米晶種,最後轉變為酒紅色,接續以冰浴急速冷卻至室溫,保存於4℃冰箱。酒紅色的液體以穿透式電子顯微鏡(transmission electron microscopy,TEM)觀察,金奈米粒子直徑為13 nm,金奈米粒子於紫外光-可見光吸收光譜中最大吸收波長為520 nm。
製備檢測試紙前需先製備修飾有牛血清白蛋白的金奈米粒子,其係將20 mL的3 μM牛血清白蛋白溶液與20 mL的15 nM金奈米粒子溶液混合,室溫下達平衡時間為30分鐘。利用絮凝分析,估計每顆金奈米粒子表面約結合有約20個牛血清白蛋白。
根據動態光散射(dynamic light scattering,DLS)的量測結果,估算未修飾牛血清白蛋白的金奈米粒子與修飾後的金奈米粒子,其水合半徑分別為28.3±6.2和45.2±7.5 nm。修飾有牛血清白蛋白的金奈米粒子因存在著立體障礙跟靜電斥力,可分散在液體中,且穩定的存在於500 mM的氯化鈉水溶液中,亦可以固態的方式保存之。
接著,提供一約為0.5平方公分的硝化纖維膜,塗布1 μL的15 nM牛血清白蛋白-金奈米粒子溶液於其上,乾燥15分鐘,之後以約20 mL去離子水沖洗30秒,清除硝化纖維膜上任何鍵結較弱的牛血清白蛋白-金奈米粒子和灰塵,靜置於室溫約1小時後使用。檢測試紙置於4℃冰箱避光可存放6個月之久。
圖2(A)、圖2(B)及圖2(C)分別為金奈米粒子於掃描式電子顯微鏡(scanning electron microscope,SEM)的影像圖示,圖2(D)、圖2(E)及圖2(F)為高倍率SEM的影像圖示。
如圖2(A)及圖2(D)所示,由SEM上可觀察到修飾有牛血清白蛋白的金奈米粒子,於硝化纖維膜上沒有聚集的現象。又,如圖2(B)及圖2(E)所示,加入反應試劑後的金奈米粒子相同顯示無聚集的現象。再,如圖2(C)及圖2(F)所示,加入反應試劑及鉛離子後的金奈米粒子同樣未見金奈米粒子聚集的現象,但明顯可見的是,金奈米粒子直徑於鉛離子反應後變小很多。
如圖3所示,在紫外光-可見光之吸收光譜分別觀察(a)檸檬酸鹽包覆金奈米粒子水溶液;(b)修飾有牛血清白蛋白的金奈米粒子水溶液;(c)檢測試紙,三者吸收峰一致為520 nm,說明金奈米粒子於三種狀態下都沒有聚集的現象。
再者,如圖4所示,X光能譜散佈分析儀(Energy Dispersive Spectrometer,EDS)的量測結果說明檢測試紙上有金奈米粒子的訊號。如圖5(A)及圖5(B)所示,進一步以色彩分析儀及表面輔助雷射脫附質譜儀(Surface-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry,SALDI-MS)加以分析檢測試紙,可觀察到檢測試紙顏色為均勻的紅色(參閱圖5(A)所示),與修飾有牛血清白蛋白的金奈米粒子均勻地吸附於硝化纖維膜上(如圖5(B)所示)。其中,色彩分析儀和質譜儀分析所得之相對標準偏差值(RSD值)分別為1.8%和4.1%。此外,也可利用ICP-MS定出每張檢測試紙(0.5 cm×0.5 cm)含有的金奈米粒子為2.95×10-8 mg。
檢測試紙可用桌上型掃描機進行影像掃描,由Image J軟體做色彩分析,主要為紅、藍、綠(RGB)三色,其中是以吸收綠光的G值(G abs)為指標,利用此法以量化檢測試紙並作為判定是否含有鉛離子的數據參考。
反應試劑最佳化條件為100 mM硫代硫酸鈉(Na2S2O3)、250 mM 2-硫甘醇(2-ME)於5 mM,pH 10甘胺酸-氫氧化鈉緩衝溶液(glycine-NaOH)。緩衝溶液的製備為:精秤1.5014克的甘胺酸,加入二次離子水中並調至100 mL,以配製的甘胺酸溶液。接續地,取50 mL,200 mM甘胺酸溶液,及1.0 M氫氧化鈉水溶液,調配成pH值分別為6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0和12.0的甘胺酸-氫氧化鈉緩衝溶液,並保存於4℃冰箱中,其中緩衝溶液濃度為100 mM。
如圖1所示,將含鉛標準品與反應試劑混合(反應試劑之各成份的最終濃度如上),再將檢測試紙浸入混合溶液中,於室溫反應2小時,接著用水沖洗2次(各約5 mL),30秒後再用空壓機(60 lb/in2)將檢測試紙乾燥。鉛離子存在的情況下,金奈米粒子會被浸析(leaching),使得反應後的檢測試紙的紅色消失,因此待測樣品中含有鉛離子時,檢測試紙的紅色強度會減弱。
如圖6所示,G abs和鉛離子濃度的對數是呈現一線性關係(R 2=0.98),尤其當鉛離子濃度範圍在10 nM至1 μM之間。其中,鉛離子濃度的偵測極限(Limit of Detection,LOD)為5 nM當雜訊比(signal/noise(S/N) ratio)為3。
如圖7(A)所示,經蛋白修飾的金奈米粒子水溶液的吸收值(Abs 520),於反應時間2小時中,Abs 520隨時間的變化,其中(a)為1.5 nM修飾有牛血清白蛋白的金奈米粒子;(b)為1.5 nM修飾有牛血清白蛋白的金奈米粒子、1.0 mM硫代硫酸鈉、100 mM 2-硫甘醇;(c)為1.5 nM修飾有牛血清白蛋白的金奈米粒子、1.0 mM硫代硫酸鈉、100 mM 2-硫甘醇、1.0 μM氯化鉛;(d)為1.5 nM修飾有牛血清白蛋白的金奈米粒子及1.0 μM氯化鉛。當中,唯有反應試劑與鉛離子同時存在,其於520 nm的吸收度,會隨著時間下降。
又,如圖7(B)所示,較佳反應條件下(100 mM硫代硫酸鈉與250 mM 2-硫甘醇),反應時間2小時,檢測試紙的色度變化與G abs相對應,其中含1.0 μM鉛離子和反應試劑的(c),其檢測試紙G abs明顯增大,表示金奈米粒子已被浸析,且由肉眼即可判定紅色的色度減弱,證實具有牛血清白蛋白修飾的金奈米粒子浸析的結果。
另外,如圖8所示,亦可藉由SALDI-MS說明在浸析後的金奈米粒子的表面確實有Au-Pb合金存在。此外,如圖9所示,觀察檢測試紙G abs隨時間的變化,2小時後變化趨於緩和,因此檢測試紙於反應試劑中較佳的反應時間為2小時。
本發明為縮短檢測鉛離子所需的反應時間,進一步以微波方式加熱反應,以加速金奈米粒子浸析的效率。如圖10(A)所示,較佳反應條件下,分別實驗微波(功率:400 W、450 W及500 W)與無微波(功率:0 W)照射的情形下檢測鉛離子,監測G abs以對應金奈米粒子浸析的程度,由鉛離子濃度與G abs之對應關係可說明微波確實可增加金奈米粒子浸析的效率。
微波的較佳微波功率為450 W,如圖10(B)所示,450W的微波照射,鉛離子濃度於100 pM至1.5 nM區間時,[(G abs-G 0 abs)/G 0 abs]與待測樣品中鉛離子濃度呈一線性關係,其中R 2=0.96。
如圖11所示,450 W微波照射條件下,約10分鐘G abs隨時間的變化已趨緩,說明微波照射下,反應時間由2小時縮減至10分鐘。
進一步探討,微波產生的溫度變化也提昇了檢測的靈敏度。如圖12所示,當微波功率為400 W、450 W和500 W時,其對應反應溫度分別為50℃、75℃和90℃,相較於室溫下反應有較高的G abs。微波條件下,鉛離子濃度之偵測極限可提昇至50 pM,雜訊比(signal/noise(S/N) ratio)為3。
如圖13所示,較佳微波反應條件下(450 W),分別檢測鉛離子與單一金屬離子(如:Li+、Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Sr2+、Ba2+、Mn2+、Fe2+、Co2+、Ni2+、Cu2+、Zn2+、Pt2+、Cd2+、Pd2+、Cr3+、Fe3+、Ag+、Au3+和Hg2+),並用G abs的變化作為判斷選擇性的標準。再者,單一金屬離子的濃度為100 nM,而鉛離子濃度僅10 nM依舊有高度的選擇性,選擇性至少高於其他金屬離子100倍之多,其中紅色色度的變化更是肉眼即可輕易觀察到。
為證實檢測試紙具有高耐受性(如:耐鹽、耐硫醇和耐蛋白質等)的特性,於檢測真實待測樣品時不會有聚集的現象,於是分別於模擬鹽類環境及模擬蛋白質環境下檢測鉛離子。如圖14(A)所示,鹽類環境(150 mM氯化鈉、5 mM氯化鉀、1 mM氯化鎂及1 mM氯化鈣)下,或如圖14(B)所示,蛋白質環境(25 μM牛血清白蛋白溶液)中,其偵測極限依舊可達100 pM。
此外,亦針對海水、尿液與血液樣品進行檢測。
海水待測樣品是取自於東海(East China Sea),先以0.2 μm的濾膜過濾以去除雜質,再以ICP-MS分析其離子含量。首先,海水樣品稀釋10倍後,接續另外添加鉛離子與反應試劑,調製後之混合溶液的鉛離子濃度為0-10 nM,取用1毫升混合溶液加入檢測試紙,在微波照射(450 W)下反應10分鐘,即可加以判定。
製備尿液待測樣品是採用美國環境健康中心(National Center for Environment Health)提供的標準方法(1180B/05-OD)。尿液待測樣品(SRM 2672a)中的鉛離子含量為1.20 μM,將尿液待側樣品稀釋200倍後,再添加鉛離子與反應試劑於其中,調製後之混合溶液鉛離子濃度為0-1.0 nM,取用1毫升混合溶液加入檢測試紙,在微波照射(450 W)下反應10分鐘,即可加以判定。
血液待測樣品BCR 636、635及634皆為粉末狀,分別取0.6 g加入3 mL去離子水溶解,以製成鉛離子濃度分別為2.51±0.24 μM、1.2±0.12 μM及0.22±0.02 μM的血液待測樣品。接續以硝化法分別將血液待測樣品消化,其取用1 mL的血液待測樣品、1 mL的硝酸原液及8 mL的去離水反應兩小時後,樣品置入離心機,轉速為4000 rpm,旋轉2分鐘後取出液體,分別將BCR 636、635及634稀釋至鉛離子濃度為0.5 nM,爾後添加鉛離子與反應試劑於其中,調製後之混合溶液鉛離子最後濃度為0-0.5 nM,取用1毫升混合溶液加入檢測試紙,在微波照射(450 W)下反應10分鐘,即可加以判定。
如圖15所示,海水樣品溶液中再外添加鉛離子,其中外添加的鉛離子濃度範圍在100 pM到10 nM之間時,鉛離子濃度對[(G abs-G 0 abs)/G 0 abs]仍呈一線性關係,其中R 2=0.96。
接續地,檢測尿液與血液樣品中的鉛離子濃度,數據資料請同時參閱表1。
如圖16(A)所示,首先利用標準添加法檢測標準尿液樣品SRM 2672a(鉛離子濃度理論值1.20 μM),檢測結果尿液樣品中含有的鉛離子濃度為1.17±0.071 μM(n=5),當信心水準為95%時,且t-test值小於2.776,SRM 2672a的可信範圍為1.08 μM到1.26 μM。如圖16(B)所示,血液樣品以相似的方法檢測,如表1所示,證實檢測試紙是可用於真實樣品的檢測。此外,參閱圖17所示,檢驗試紙的紅色色度變化,肉眼即可判定之。
綜上所述,本發明之檢測方法對鉛離子有高度的專一性及靈敏度,也可利用微波照射以縮短分析時間,再者本方法是確實可應用於真實樣品的,且檢測套組是檢測試紙及反應試劑,因此操作簡單、方便攜待且成本低廉。
雖然本發明已以較佳實施例揭露如上,然其並非用以限定本發明,任何熟習本發明技術者,當可在不脫離本發明之精神和範圍內,作些許之更動與潤飾,則應屬本發明申請專利範圍所界定之保護範圍。
圖1係為鉛離子的檢測套組及其檢測方法示意圖。
圖2(A)及圖2(D)為修飾有牛血清白蛋白的金奈米粒子的SEM影像及高倍率SEM影像,其粒徑大小為13.3±0.6 nm;圖2(B)及圖2(E)為加入反應試劑後的金奈米粒子的SEM影像及高倍率SEM影像,其粒徑大小為12.1±0.8 nm;圖2(C)及圖2(F)為加入反應試劑及鉛離子後的金奈米粒子的SEM影像及高倍率SEM影像,其粒徑大小為3.2±1.2 nm。
圖3係為紫外光-可見光之吸收光譜圖(a)為檸檬酸鹽包覆金奈米粒子水溶液;(b)修飾有牛血清白蛋白的金奈米粒子水溶液;(c)為檢測試紙。Abs.為任意單位。
圖4說明檢測試紙的金奈米粒子的相對EDS強度訊號。
圖5說明檢測試紙於(A)Image J影像軟體和(B)表面輔助雷射脫附質譜儀分析試紙顏色均勻度。Abs.的值為任意單位。
圖6說明2-硫甘醇濃度變化,G abs對鉛離子濃度的對應關係圖。其中,較佳反應條件下,鉛離子濃度為10 nM至1 μM,G abs對鉛離子濃度呈一線性關係(R 2=0.98)。G abs為任意單位。
圖7(A)說明修飾有牛血清白蛋白的金奈米粒子水溶液的吸收值(Abs 520)隨時間的變化,其中(a)為修飾有牛血清白蛋白的金奈米粒子(1.5 nM);(b)為修飾有牛血清白蛋白的金奈米粒子(1.5 nM)、硫代硫酸鈉(1.0 mM)、2-硫甘醇(100 mM);(c)為修飾有牛血清白蛋白的金奈米粒子(1.5 nM)、硫代硫酸鈉(1.0 mM)、2-硫甘醇(100 mM)、氯化鉛(1.0 μM);(d)為修飾有牛血清白蛋白的金奈米粒子(1.5 mM)、氯化鉛(1.0 μM)。Abs 520的值為任意單位,誤差值是取四次分析後的結果。圖7(B)係為檢測試紙反應2小時後的G abs。其中,(a)未添加反應試劑;(b)添加硫代硫酸鈉(100 mM)、2-硫甘醇(250 mM);(c)添加硫代硫酸鈉(100 mM)、2-硫甘醇(250 mM)、氯化鉛(1.0 μM);(d)氯化鉛(1.0 μM)。G abs為任意單位,誤差值是取四次分析後的結果。
圖8係為SALDI-MS質譜以檢測試紙為基底進行分析。放大圖示中左邊係為資料庫圖譜,右邊係為檢測圖譜,其中鉛離子和AuPb合金的圖譜訊號位置為m/z 205.974、206.976、207.973、402.941、403.942及404.943,其分別是[206Pb]+、[207Pb]+、[208Pb]+、[Au206Pb]+、[Au207Pb]+及[Au208Pb]+的離子訊號。
圖9說明較佳反應條件下,G abs對時間的對應關係圖。
圖10(A)說明分別於微波功率0 W、400 W、450 W及500 W,鉛離子濃度與G abs之對應關係圖。圖11(B)說明微波功率為450 W,[(G abs-G 0 abs)/G 0 abs]與鉛離子濃度之對應關係圖。
圖11說明於較佳反應條件下混合450W的微波功率,G abs對時間的對應關係圖。
圖12說明反應溫度分別為25℃、50℃、75℃和90℃,於較佳反應條下,G abs對鉛離子濃度的對應關係圖。
圖13說明於較佳微波反應條件,相較於其他單一金屬離子,檢測試紙對於鉛離子的選擇性。
圖14說明於鹽類環境及蛋白質環境下檢測鉛離子,[(G abs-G 0 abs)/G 0 abs]與鉛離子濃度之對應關係圖,其反應條件係為較佳微波反應條件。其中,(A)包含150 mM氯化鈉、5 mM氯化鉀、1 mM氯化鎂及1 mM氯化鈣;(B)包含250 μM半胱胺酸;(C)包含25 μM牛血清白蛋白溶液。
圖15說明檢測海水樣品,[(G abs-G 0 abs)/G 0 abs]與鉛離子濃度之對應關係圖,其反應條件係為較佳微波反應條件。
圖16說明檢測尿液及血液樣品,[(G abs-G 0 abs)/G 0 abs]與鉛離子濃度之對應關係圖,其反應條件係為較佳微波反應條件。其中,(A)標準尿液樣品SRM 2672a,外添加鉛離子濃度由0到1.0 nM;(B)血液樣品BCR 636,外添加鉛離子濃度由0到0.5 nM。
圖17係為檢測稀釋50倍的血液樣品,其反應條件係為較佳微波反應條件。其中,(A)BCR 634,鉛離子濃度0.22±0.02 μM;(B)BCR 635,鉛離子濃度1.01±0.12 μM;(C)BCR 636,鉛離子濃度2.51±0.24 μM。
Claims (14)
- 一種鉛離子的檢測方法,其包括下列步驟:(a)提供檢測試紙,其包括基材與附於該基材上的經蛋白修飾的金奈米粒子,該檢測試紙呈現一顏色之第一強度;(b)提供反應試劑,其包括硫代硫酸鈉(Na2S2O3)、2-硫甘醇(2-mercaptoethanol)及緩衝溶液;(c)將待測樣品與該檢測試紙及該反應試劑反應,使該檢測試紙呈現該顏色之第二強度;以及(d)分析並比較該顏色的第一強度及第二強度,其中第二強度小於第一強度表示該待測樣品含有鉛離子。
- 如申請專利範圍第1項所述之檢測方法,其中該檢測試紙係由以下方法製得:將該金奈米粒子與具有該蛋白之蛋白溶液混合形成金奈米粒子蛋白混合液,以及將該金奈米粒子蛋白混合液塗布於該基材上。
- 如申請專利範圍第1項所述之檢測方法,其進一步包括在待測樣品與該檢測試紙及該反應試劑反應後,以微波處理該檢測試紙。
- 如申請專利範圍第1項所述之檢測方法,其中該金奈米粒子具有平均直徑5至25奈米。
- 如申請專利範圍第1項所述之檢測方法,其中該基材係選自由硝化纖維膜、耐龍轉漬膜、聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)、醋酸纖維膜、混合纖維膜、氧化鋁濾膜和聚碳酸脂樹脂膜所組成之群者。
- 如申請專利範圍第1項所述之檢測方法,其中該蛋白係選自由牛血清白蛋白、白蛋白、肌紅蛋白、血纖維蛋白和酪蛋白所組成之群者。
- 如申請專利範圍第1項所述之檢測方法,其中該緩衝溶液具有酸鹼值範圍為9-11。
- 如申請專利範圍第1項所述之檢測方法,其中該緩衝溶液係選自由甘胺酸氫氧化鈉緩衝溶液、磷酸鹽緩衝溶液、三羥甲醇丙烷(Tris)緩衝溶液和檸檬酸鹽緩衝溶液所組成之群者。
- 一種鉛離子的檢測套組,其包括:檢測試紙,其包括基材與附於該基材上的經蛋白修飾的金奈米粒子;以及反應試劑,其包括硫代硫酸鈉(Na2S2O3)、2-硫甘醇(2-mercaptoethanol)及緩衝溶液。
- 如申請專利範圍第9項所述之檢測套組,其中該金奈米粒子具有平均直徑5至25奈米。
- 如申請專利範圍第9項所述之檢測套組,其中該基材係選自由硝化纖維膜、耐龍轉漬膜、聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)、醋酸纖維膜、混合纖維膜、氧化鋁濾膜和聚碳酸脂樹脂膜所組成之群者。
- 如申請專利範圍第9項所述之檢測套組,其中該蛋白係選自由牛血清白蛋白、白蛋白、肌紅蛋白、血纖維蛋白和酪蛋白所組成之群者。
- 如申請專利範圍第9項所述之檢測套組,其中該緩衝溶液具有酸鹼值範圍為9-11。
- 如申請專利範圍第9項所述之檢測套組法,其中該緩衝溶液係選自由甘胺酸-氫氧化鈉緩衝溶液、磷酸鹽緩衝溶液、三羥甲醇丙烷(Tris)緩衝溶液和檸檬酸鹽緩衝溶液所組成之群者。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
TW100144700A TWI445946B (zh) | 2011-12-05 | 2011-12-05 | 檢測鉛離子的方法及套組 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
TW100144700A TWI445946B (zh) | 2011-12-05 | 2011-12-05 | 檢測鉛離子的方法及套組 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
TW201323857A true TW201323857A (zh) | 2013-06-16 |
TWI445946B TWI445946B (zh) | 2014-07-21 |
Family
ID=49032892
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
TW100144700A TWI445946B (zh) | 2011-12-05 | 2011-12-05 | 檢測鉛離子的方法及套組 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
TW (1) | TWI445946B (zh) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105067601A (zh) * | 2015-07-16 | 2015-11-18 | 重庆大学 | 一种基于纳米金的功能化试纸膜及用于检测铁离子的方法 |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
TWI678533B (zh) * | 2018-11-12 | 2019-12-01 | 弘光科技大學 | 含氯離子的濃度檢測方法 |
-
2011
- 2011-12-05 TW TW100144700A patent/TWI445946B/zh not_active IP Right Cessation
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105067601A (zh) * | 2015-07-16 | 2015-11-18 | 重庆大学 | 一种基于纳米金的功能化试纸膜及用于检测铁离子的方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
TWI445946B (zh) | 2014-07-21 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Yan et al. | A green synthesis of highly fluorescent nitrogen-doped graphene quantum dots for the highly sensitive and selective detection of mercury (II) ions and biothiols | |
Cheng et al. | Dithizone modified magnetic nanoparticles for fast and selective solid phase extraction of trace elements in environmental and biological samples prior to their determination by ICP-OES | |
Xiaoqing et al. | Fast synthesis of copper nanoclusters through the use of hydrogen peroxide additive and their application for the fluorescence detection of Hg 2+ in water samples | |
Yang et al. | An enzyme-induced Au@ Ag core–shell nanoStructure used for an ultrasensitive surface-enhanced Raman scattering immunoassay of cancer biomarkers | |
Dai et al. | One-pot synthesis of bovine serum albumin protected gold/silver bimetallic nanoclusters for ratiometric and visual detection of mercury | |
TWI511971B (zh) | 探針、偵測金屬離子的方法、與偵測化學/生化分子的方法 | |
WO2014181814A1 (ja) | 生体試料のラマン定量分析用バイオチップ | |
CN109696430B (zh) | 一种测定微囊藻毒素浓度的方法 | |
Liu et al. | Using a functional nanogold membrane coupled with laser desorption/ionization mass spectrometry to detect lead ions in biofluids | |
Abbaszadeh et al. | Speciation analysis of inorganic arsenic in food and water samples by electrothermal atomic absorption spectrometry after magnetic solid phase extraction by a novel MOF-199/modified magnetite nanoparticle composite | |
Kandhro et al. | Zinc and iron determination in serum and urine samples of thyroid patients using cloud point extraction | |
CN108948373B (zh) | 一种铈基金属有机骨架材料的制备方法及其在Co(Ⅱ)识别中的应用、荧光检测方法 | |
CN107300544A (zh) | 一种亚铁离子的检测方法 | |
CN103983638B (zh) | 一种利用金纳米颗粒同时检测三价六价铬离子的方法 | |
CN105891189A (zh) | 一种铜离子检测试剂盒及其应用 | |
El-Feky et al. | Utilization of a plasticized PVC optical sensor for the selective and efficient detection of cobalt (II) in environmental samples | |
TWI445946B (zh) | 檢測鉛離子的方法及套組 | |
Cai et al. | Mercaptosuccinic acid modified CdTe quantum dots as a selective fluorescence sensor for Ag+ determination in aqueous solutions | |
Liu et al. | Protein-mediated wool-ball-like copper sulfide as a multifunctional nanozyme for dual fluorescence “turn-on” sensors of cysteine and silver ions | |
Cvak et al. | Synthesis and characterization of colloidal gold particles as labels for antibodies as used in lateral flow devices | |
EP1896857A1 (en) | A method for separating target component using magnetic nanoparticles | |
Li et al. | Green and facile synthesis of silicon-doped carbon dots and their use in detection of Hg 2+ and visualization of latent fingerprints | |
Gan et al. | Arginine–malate-based dual-emission carbon dots for uric acid determination in human serum with a miniaturized device | |
Sun et al. | From the perspective of high-throughput recognition: Sulfur quantum dots-based multi-channel sensing platform for metal ions detection | |
CN105181953B (zh) | 葡萄串样纳米粒子、免疫探针、其制备方法及应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | Annulment or lapse of patent due to non-payment of fees |