TW201313247A - 以優化的海水白點蟲制動抗原互補去氧核糖核酸（ｃＤＮＡ）生產之疫苗及其製造方法與用途 - Google Patents

Abstract

本發明提供一種優化(optimize)海水白點蟲制動抗原互補去氧核糖核酸(cDNA)序列，其係透過置換密碼子使該序列能於原核生物及真核生物中表現，並且能產生免疫原性與海水白點蟲纖毛幼蟲純化出之制動抗原相近之蛋白質。本發明該進一步提供一以該cDNA製造之DNA疫苗預防魚類受海水白點蟲感染。

Description

以優化海水白點蟲制動抗原互補去氧核糖核酸(cDNA)生產之疫苗及其製造方法及用途

本發明提供一優化的海水白點蟲制動抗原互補去氧核糖核酸(cDNA)，及包含其之載體、以其生產之疫苗及其製造方法及用途。

周纖毛蟲類原生動物寄生蟲海水白點蟲(Cryptocaryon irritans)是造成多種海水魚類感染海水白點病之致病生物，野生魚類、觀賞魚類或養殖魚類都有可能遭受感染。目前海水白點蟲已是魚類養殖場常見的寄生蟲，其被認為是造成最嚴重漁業經濟損害的寄生蟲之一，不只亞洲養殖漁業(包括中國、台灣、日本、韓國、印度及其他亞洲國家)受到海水白點蟲之威脅，澳洲、波斯灣、以色列紅海、加勒比海等地亦有海水白點蟲之蹤跡，造成海水養殖漁業巨大的經濟損失。雖然可使用化學藥劑預防或治療受海水白點蟲感染之魚類，但其會造成嚴重的海洋汙染，且對人類健康有危害。

海水白點蟲的生命週期以四個階段組成：營養體(trophont)期、原分裂前體(protomont)期、分裂囊胞體(tomonts cyst)期及纖毛幼蟲(theront)期，早期有關與海水白點蟲分屬動物分類學上不同門(phylum)之淡水白點蟲(Ichthyophthirius multifiliis)之研究顯示體液免疫可藉由制動(immobilize)纖毛幼蟲達到預防感染之效果。有許多研究指出魚類血液免疫及皮膚黏膜免疫在對抗海水白點蟲上扮演重要角色，對海水白點蟲之細胞免疫可由自然受感染魚體的感染部位上的白血球滲入(Infiltration)及海水白點蟲營養體上CD8⁺白血球定位(localization)窺知，而對海水白點蟲之非專一細胞免疫反應如週邊血的嗜酸性白血球(eosinophil)數量降低及表皮層之黏膜細胞增生也在石斑魚中被發現。

許多研究指出對於海水白點蟲營養體、原分裂前體及纖毛幼蟲之免疫作用可在受感染魚體中誘發更強的保護免疫力(protective immunity)，其中纖毛幼蟲期可提供較強之保護免疫力。由於海水白點蟲係一絕對寄生蟲，作為疫苗之纖毛幼蟲僅能從受感染魚體中得到，因此要蒐集到足夠量的活體纖毛幼蟲用於生產疫苗相當費時費力且不切實際，且截至目前為止，並無技術可以利用離體方式使海水白點蟲完成完整的生命週期。

制動現象(immobilization phenomenon)係在離體實驗中，由經免疫過後之魚體的血漿及黏膜制動活體纖毛幼蟲，此現象可於魚體內發生並提供魚體保護，其係抗體結合寄生蟲細胞及纖毛表面抗原造成該寄生蟲無法移動。制動現象之目標抗原稱為致動抗原(immbolization antigens,iAg)，其特徵在於錨定大量糖基化磷脂醯肌醇(glycosyl phosphatidyl inositol,GPI)的表面膜蛋白。文獻中指出，從淡水白點蟲中分離出的制動抗原在誘發保護免疫力上扮演重要角色，該致動抗原之重組基因片段已被揭露可於金魚體內產生對抗淡水白點蟲之免疫反應，並有效提供保護免疫力。此外，有研究者曾利用受感染魚體及產生免疫反應的兔子的抗血清和海水白點蟲的營養體及纖毛幼蟲，萃取出箝入性膜蛋白(integral membrane protein)與大量的表面抗原，並從血清型(serotype)G37之海水白點蟲純化及選殖出此發生表面凝集/制動現象之抗原。然而因細菌及真核生物無法使用該寄生蟲之密碼子，使該制動抗原DNA序列在大腸桿菌及真核細胞中難以表現，再者，經優化的制動抗原(CISA-32)次選殖至pHSG299構築之密碼子僅能在細菌中表現，無法於哺乳類動物細胞、昆蟲細胞或酵母菌細胞中表現。於本發明中，該制動抗原之密碼子經修飾過後可順利於大腸桿菌及魚類細胞中表現該制動抗原重組蛋白，並且其具有免疫原性(immunogenic)。而本發明經由免疫測試證實該密碼子經修飾後之制動蛋白可做為預防點帶石斑魚(E. coioides)或其他海水魚類遭海水白點蟲感染之疫苗。

去氧核糖核酸(DNA)疫苗係指注射經基因工程改造之DNA進入生物體引發免疫反應以達到預防感染疾病之效果的技術，核酸疫苗可應用於預防細菌、病毒及寄生蟲感染，甚至可用來治療腫瘤，但目前大部分仍處於實驗階段。相較於傳統疫苗，DNA疫苗有許多優點，例如可同時誘發多種免疫反應。

以人類而言，疫苗對現代醫學有相當大的貢獻，例如使天花、小兒麻痺、傷寒(typhus)、輪狀病毒(rotavirus)、A型肝炎、B型肝炎等疾病都藉由疫苗達到良好的控制。然而，傳統疫苗僅能對抗有限數量的疾病，目前仍有許多疾病缺乏有效疫苗防治，例如人類後天免疫不全症候群(AIDS)、C型肝炎、瘧疾(malaria)等病症，仍待開發有效疫苗。

對動物而言，疫苗及其預防接種是控制動物病原疾病、保障養殖業持續發展的重要手段。魚類疫苗可分為滅活疫苗、減毒活疫苗、重組活疫苗、次單位疫苗以及DNA疫苗五大類；十年前已有一些細菌疫苗商品化，但病毒疫苗還很少，而寄生蟲疫苗完全沒有。因為魚類疫苗存在免疫原力、生產成本和安全性等問題，大部分疫苗停留在實驗室使用階段，還未商品化生產。

在開發疫苗過程中，所謂第一代疫苗係指全生物體疫苗(whole-organism vaccine)，其可能是活體、經弱化過的活體或死亡狀態的生物，滅活疫苗或減毒活疫苗，例如天花及小兒麻痺疫苗，其可誘發細胞毒殺T淋巴球(T_C或CTL)、輔助T細胞(T_H)活化及抗體產生，但其存在毒性回復(reversion to virulence)的風險，滅活疫苗(killed vaccine)雖不具有此風險，但其無法誘發細胞毒殺T淋巴球活化，且生產上有其對應疾病之限制。為最小化上述風險，第二代疫苗應運而生，例如次單元疫苗(subunit vaccine)，其係以已知蛋白質抗原(defined protein antigen)或重組蛋白組成，前者如破傷風(tetanus)疫苗及白喉(diphtheria toxoid)疫苗，後者如B型肝炎疫苗。第二代疫苗可誘發輔助T細胞及抗體產生，但仍然無法誘發細胞毒殺T淋巴球活化。

DNA疫苗即第三代疫苗，其係以質體透過基因工程技術處理，使其可產生一至兩個屬於病原體之特定抗原或蛋白質，當該DNA被送進體內細胞後，透過該質體宿主細胞本身機制即可讀取該DNA並轉譯出病原體之特定蛋白質，該蛋白質會被認定為外來蛋白質，便會被宿主細胞呈現至其表面，誘發免疫系統辨認並產生多種免疫反應。

1993年以來，DNA疫苗以其高免疫保護率受到了廣泛關注。DNA疫苗是指直接把帶有目標抗原基因的重組質體轉染或注射到動物體內，使之表達出天然抗原物質。與傳統疫苗相比，DNA疫苗的製作相對簡單，成本低廉，運輸保存容易，不存在毒力回復的現象。與滅活疫苗和次單位疫苗相比，DNA疫苗的效果更好。1996年，Anderson等首次將魚傳染性造血器官壞死症病毒(IPNV)的糖蛋白基因插入真核表現質體以製成DNA疫苗，並免疫虹鱒魚，發現能夠誘導其產生強烈的保護性免疫反應，抵抗IPNV病毒的攻擊。迄今為止，學者仍陸續進行魚類DNA疫苗相關研究，並有突破性的發展。

本發明即提供一種以海水白點蟲制動抗原互補去氧核糖核酸(cDNA)生產之疫苗及其製造方法及用途，該疫苗即為魚類抗寄生蟲之DNA疫苗，其可用於預防魚類感染海水白點蟲，係於該領域極具新穎性及進步性之發明。

本發明提供一種優化(optimize)海水白點蟲制動抗原互補去氧核糖核酸(cDNA)序列之方法，其包含：

a.取得海水白點蟲制動抗原之mRNA序列；

b.將該mRNA序列轉換為cDNA序列；

c.根據該cDNA序列中終止碼(stop codon)周圍之密碼子(codons)對應之胺基酸殘基之特定特徵推測出終止碼特定胺基酸，使該終止碼以能轉譯出該特定胺基酸之密碼子取代後，轉譯出之蛋白與從該海水白點蟲纖毛幼蟲純化出之制動抗原兩者之免疫原性(immunogenicity)相近；及

d.將該終止碼(stop codon)以能轉譯出該特定胺基酸之密碼子取代，產生優化的(optimized)cDNA序列；

其中該特定特徵係選自終止碼周圍密碼子所對應之胺基酸殘基的結構特性、疏水性、電荷分布所組成之群組。

本發明所提供之優化(optimize)海水白點蟲制動抗原互補去氧核糖核酸(cDNA)序列之方法，其中該特定胺基酸為精氨酸(Arginine)、甘胺酸(Glycine)或丙胺酸(Alanine)，以甘胺酸(glycine)置換疏水性端(hydrophobicity alteration)、丙胺酸(alanine)置換可最小化結構改變、精胺酸(arginine)可用以置換帶電部分(regional charge)。

本發明進一步提供一優化的海水白點蟲制動抗原互補去氧核糖核酸(cDNA)序列，其包含SEQ ID NO:10所示之核苷酸序列，及一載體，其包該優化的海水白點蟲制動抗原cDNA序列，該載體為pGex2T-iAg或pcDNA3.1-iAg。

本發明進一步提供一種核酸疫苗，其包括該優化的海水白點蟲制動抗原cDNA序列，其進一步可以利用幾丁聚醣奈米顆粒包裹。

本發明進一步提供一種優化的海水白點蟲制動抗原cDNA序列用於製備針對海水白點蟲之抗體的用途，其特徵在於將包含SEQ ID NO:1所示之核苷酸序列之cDNA序列之載體使用於一宿主(host)，促使該宿主產生抗體對該cDNA序列轉譯出之蛋白質發生免疫反應後，取得該針對海水白點蟲之抗體，其中該載體可為為pGex2T-iAg或pcDNA3.1-iAg，並可以幾丁聚醣包裹成奈米顆粒，而其中使用於該宿主之方式可為混入飼料或食餌中、混入水中浸泡該宿主或注射該宿主；而其中該宿主為水生生物，尤其係魚類，例如黑鯛(Acanthopagrus schlegelii)、異臂花鮨(Caprodon schlegelii)、紅點九刺鮨(Cephalopholis aurantia)、青星九刺鮨(Cephalopholis miniata)、細點牙鯛(Dentex dentex)、歐洲海鱸(Dicentrarchus labrax)、尖吻重牙鯛(Diplodus puntazzo)、單斑重牙鯛(Diplodus sargus)、青石斑(Epinephelus awoara)、點帶石斑(Epinephelus coioides)、鞍帶石斑(Epinephelus lanceolatus)、三斑石斑(Epinephelus trimaculatus)、黑毛瓜子臘(Girella leonina)、臀斑髭鯛(Hapalogenys mucronatus)、棘箱魨(Kentrocapros aculeatus)、大黃魚(Larimichthys crocea)、尖吻鱸(Lates calcarifer)、銀紋笛鯛(Lutianus argentimaculatus)、赤鰭笛鯛(Lutjanus erythopterus)、白星笛鯛(Lutjanus stellatus)、角鱗魨(Melichthys vidua)、真鯛(Pagrus major)、花軟唇(Plectorhynchus cinctus)、茉莉花鱂(Poecilia latipinna)、魔鬼簑鮋(Pterois volitans)、黃錫鯛(Rhabdosargus sarba)、金錢魚(Scatophagus argus)、紅甘鰺(Seriola dumerili)、銀籃子魚(Siganus oramin)、金頭鯛(Sparus aurata)、布氏鯧鰺(Trachinotus blochii)、海鱺(Rachycentron canadum)、青甘鰺(Seriola quinqueradiata)、克氏海葵魚(Amphiprion clarkii)、白條海葵魚(Amphiprion frenatus)、鞍斑海葵魚(Amphiprion polymnus)或眼斑海葵魚(Amphiprion ocellaris)。

寄生蟲體收集與培養

於台北地區的魚市場收集受海水白點蟲(Cryptocaryon irritans)感染的魚類後培養於水槽中，從該水槽底部收集囊胞體(tomont)後，培養於從台灣南部地區購買之點帶石斑魚(grouper Epinephelus coioides)幼魚(平均每尾重量2.6公克)上。

本發明所使用之寄生蟲體培養之流程如下：利用小型油漆刷從該水槽底部輕輕地掃取並收集海水白點蟲的囊胞體，並利用海水洗去多餘的殘渣或黏膜後，將該囊胞體利用過濾過的海水培養於培養皿(petri plates)上，並於室溫培養三至七天。海水白點蟲的纖毛幼蟲(theront)會從囊胞體中產生，此時於攝氏4度以1500g離心含有該纖毛幼蟲的溶液10分鐘後即可收集活體之纖毛幼蟲，將該活體纖毛幼蟲感染未被海水白點蟲感染過之成魚(每尾平均重量300公克，從魚市場中採買而得)，隨後可得約六百萬隻活體纖毛幼蟲提供後續以水為媒介之人工感染試驗。

DNA萃取與基因型鑑定(genotype differentiation)

利用Bio-Rad 36897 CHELEX 100樹脂抽取囊胞體之DNA，一次約使用20至30顆囊胞體，完成後，以聚合酶連鎖反應(polymerase chain reaction,PCR)及核醣體DNA(rDNA)之18S、ITS-1與5.8S區域之特定引子(Primers 1 and 2;Table 1)放大特定序列片段，以初步變性溫度攝氏95度進行3分鐘後，再以溫度循環：變性溫度攝氏94度60秒、結合溫度攝氏55度30秒，及延長溫度攝氏72度60秒進行30個循環，放大完成之序列交由明欣生物科技有限公司(Mission Biotech Co.,Ltd.)定序，再將定序成果，即海水白點蟲之部分18S、全部的ITS-1以及部分5.8S序列以多重序列比對軟體CLUSTAL W(版本1.83)鑑別其基因型。

從兩種品系(isolates)之海水白點蟲中得到部分18S、整段ITS-1之DNA序列，及部分5.8S rDNA，其核苷酸序列已公開於GenBank，即Chiayi(AF490381)與Aus C(AY029271)。

制動抗原(immobilization Antigen,iAg) cDNA選殖(cloning)

利用Trizol(Invitrogen)及所提供之程序抽取全RNA後，利用Primer 3軟體在GeneBank資料庫中記錄之制動抗原序列AB262047設計目標制動抗原之特定引子；而部分抗原之基因序列係分離自Chiayi(即嘉義，此品系海水白點蟲採集自嘉義)海水白點蟲，並以含有25微升(μl)之2X反應混合液(2X Reaction Mix)、10微微莫耳濃度(pM)之引子(primers 3 and 4,Table 1)、2微升反轉錄酶SuperScript^TM III RT/Platinum Taq Mix、0.5微克(μg) RNA模板之套組，50微升之總反應體積於SuperScript^TM III One-Step RT-PCR系統放大之，上述進行方式為以攝氏50度30分鐘進行cDNA合成後，以溫度循環為初期變性溫度攝氏94度進行2分鐘，再以溫度循環：變性溫度攝氏94度15秒、結合溫度攝氏55度30秒，及延長溫度攝氏68度60秒進行40個循環，最後以溫度攝氏68度5分鐘進行最終延長，放大後的產物次選殖(subclone)至pGEM-T Easy Vector(Promega)並對其定序。

5′ and 3′末端選殖技術

利用末端選殖套組(5' and 3' rapid amplification of cDNA ends,RACE)(Invitrogen & Clontech)產出Chiayi海水白點蟲之制動抗原的完整cDNA序列。3'末端選殖係以包含2微升之10倍PCR緩衝液、2.5毫莫耳濃度(mM)之氯化鎂、0.5毫莫耳濃度之dNTP、5毫莫耳濃度之DTT、200U之反轉錄酶(Superscrip II Reverse transcriptase)及oligo(dT)-containing Adaptor Primer(AP;Invitrogen)共20微升之反應溶液(Invitrogen)，於攝氏42度下反應50分鐘後加溫至攝氏70度反應10分鐘，進行反轉錄以合成第一股cDNA(First Strand cDNA)。

再將此含有3'端結尾之cDNA作為模板加入2微升至包含5微升之10倍PCR緩衝液、5毫莫耳濃度之氯化鎂、0.5毫莫耳濃度之dNTP、5毫莫耳濃度之DTT、5U Taq(Genemark)及10微微莫耳濃度之AUAP引子(Abridged Universal Amplification Primer)(Invitrogen)，總量50微升之反應液，於初期變性溫度攝氏94度進行2分鐘，再以溫度循環：變性溫度攝氏94度30秒、結合溫度攝氏58度30秒，及延長溫度攝氏72度60秒進行35個循環，最後以溫度攝氏72度10分鐘進行最終延長，放大後的產物次選殖至pGEM-T Easy Vector並對其定序。

至於5'端末端選殖，其第一股cDNA係利用 RACE cDNA Amplification Kit(Clotnech)，以5'端RACE CDS引子A與SMART II A寡核苷酸(oligonucleotide)於攝氏42度反應1.5小時後稀釋10倍，再將2毫升含有5'端結尾之cDNA作為模板，加入至包含通用引子A Mix(universal Primer A Mix,UPM)(Clontech)及反轉高基因專一性引子(reverse gene specific primer)(primer 6,Table 1)的PCR反應溶液，此反應以初期變性溫度攝氏94度進行2分鐘，再以溫度循環：變性溫度攝氏94度30秒、結合溫度攝氏55度30秒，及延長溫度攝氏72度60秒進行35個循環，最後以及溫度攝氏72度10分鐘進行最終延長。隨後利用巢式聚合酶連鎖反應(Nested PCR)以稀釋50至100倍之第一次PCR產物為模板，與巢式通用引子(nested universal Primer A,NUP)Clontech)及巢式反轉高基因專一性引子(nested reverse gene specific primer)(primer 7,Table 1)於上述相同情況下進行，放大後的產物次選殖至pGemTeasy plasmid(Promega)並對其定序。

最後以SignalP 3.0測試Chiayi海水白點蟲之全長制動抗原之訊息胜肽(signal peptide)、SMART program預測跨膜(transmembrane)片段，及big-PI Predictor program預測胜肽裂解(propeptide cleavage)之可能omega(ω) site及糖基化磷脂醯肌醇(glycosylphosphatidylinositol,GPI)之固定位置(anchor site)。

密碼子置換(Codon replacement)

該制動抗原之原始序列(GenBank: FJ167511)係以軟體DNASTAR Lasergene 6進行分析，並依據胺基酸之結構特性、疏水性及電荷分布等特性以適當的胺基酸置換終止密碼子，例如以甘胺酸(glycine)置換疏水性端(hydrophobicity alteration)、丙胺酸(alanine)置換可最小化結構改變、精胺酸(arginine)可用以置換帶電部分(regional charge)。本實施例選定之置換殘基為核苷酸序列第309至311、393至395、468至470、519至521、540至542、657至659、及897至899個核苷酸。置換過終止密碼子之該制動抗原核酸序列以軟體GENEART Gene optimizer Sequence Analysis(Prisma Biotech Co.)分析，評斷標準包含GC含量及密碼子品質評估(codon quality assessment)，為使該序列在大腸桿菌(E. coli)、哺乳動物細胞、昆蟲細胞或酵母菌系統中有穩定之高表現量，序列中之GC含量由原始序列之37%提升至47%。

制動抗原質體(iAg plasmid)構築及包覆(encapsulation)

本實施例構築兩個質體：能表現於大腸桿菌之pGex-2t-iAg及能表現於石斑魚魚鰭細胞(grouper fin-1；GF-1)與經接種過後之石斑魚活體上之pcDNA3.1-optiAg，pGEX-2T係採用GE Healthcare(前Amersham Biosciences)生產之產品，目錄編號：27-4801-01；pcDNA3.1(+)係採用Invitrogen Life technologies生產之產品，目錄編號：V790-20。

pGex-2T-iAg之構築方式為：利用已置換的制動抗原DNA作為模板，設計一對引子(引子8(SEQ ID NO：8)及引子9(SEQ ID NO：9)，如表1及序列表所示)進行PCR以確認成熟蛋白質(mature protein)是否含有該制動蛋白DNA片段，其PCR之溫度循環為初期變性溫度攝氏94度進行2分鐘，再以溫度循環：變性溫度攝氏94度30秒、結合溫度攝氏58度30秒，及延長溫度攝氏72度60秒進行35個循環，其後以膠體萃取套組(gel extraction kit)(BIOMAN)將該放大後的DNA從瓊脂糖(agarose)分離(elute)出，並以限制酶BamHI及EcoRI(Invitrogen)切割後選殖至pGex-2T之BamHI及EcoRI限制酶切割位置。

pcDNA3.1-iAg之構築方式為：利用已置換的制動抗原DNA作為模板，設計一對引子(引子8(SEQ ID NO：8)及引子9(SEQ ID NO：9)，如表1及序列表所示)進行PCR以確認成熟蛋白質(mature protein)是否含有該制動蛋白DNA片段，其PCR之溫度循環為初期變性溫度攝氏94度進行2分鐘，再以溫度循環：變性溫度攝氏94度30秒、結合溫度攝氏58度30秒，及延長溫度攝氏72度60秒進行35個循環，其後以膠體萃取套組(gel extraction kit)(BIOMAN)將該放大後的DNA從瓊脂糖(agarose)分離(elute)出，並以限制酶BamHI及EcoRI(Invitrogen)切割後選殖至pGex-2T之BamHI及EcoRI限制酶切割位置。

為達到DNA疫苗之功效，在本實施例中，該優化的制動抗原質體pcDNA3.1-iAg係參考中華民國專利公開號第200926967號專利「水產用多重相乳化包埋口服製劑製作方法」，以水/油/水之三層乳狀結構(emulsion)以直徑19±6.47微米(μm)之大小包裹。在另一實施例中，其包裹方法系參考考國立海洋大學吳彰哲教授等發明之中華民國專利申請號第098133509號之「幾丁聚醣作為傳輸工具的應用和方法」，以離子凝膠法(ionic gelation)製備幾丁聚醣奈米微粒(chitosan nanoparticles)，其製備方法為將幾丁聚醣溶液(20毫升，1%幾丁聚醣溶解於醋酸之溶液)緩慢加至8毫升三聚磷酸溶液中(tripolyphosphate solution，0.84毫克/毫升)，將上述溶液於室溫中迅速進行超聲波震碎(ultrasonication，29W，4分鐘)處理，在以離心12000g，45分鐘除去沉積塊狀物質(pelleted particle)後，上清液即含有幾丁聚醣奈米微粒。將適量質體DNA加入該上清液後即可產生含有幾丁聚醣/質體DNA混合物之混合液，將該混合液於室溫以最大速度之震動(vortex)20秒，即可產生含有直徑介於130~160奈米之幾丁聚醣/質體DNA混合物之混合液。

利用細菌表現制動抗原並收集重組蛋白

將制動抗原質體pGex2T-iAg轉殖至大腸桿菌(pLysS BL21)隔夜培養後，將該菌液以含有50微克/毫升(μg/ml)安比西林(ampicillin)之新鮮LB培養液稀釋20倍，並於攝氏37度下快速搖晃(vigorous shaking)，在OD₆₀₀達到0.7時加入最終濃度0.1mM之IPTG(Isopropyl 1-thio-P-o-galactoside)後培養3小時，隨後收取並於攝氏4度以2000g離心15分鐘，以300pl之磷酸緩衝液(phosphate-buffered saline,PBS)使菌液再懸浮(resuspend)、於SDS-sample buffer中沸騰5分鐘後，以SDS－聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis)分析之，並利用麩胱甘肽樹脂(Glutathione resin)(Bioman Scientific Co. Ltd,Taiwan)純化GST-iAg融合蛋白。100毫升之菌液經過IPTG誘導後以離心收取並利用10毫升細胞裂解緩衝液(lysis buffer,50mM Tris,pH 8.0,O.1M NaCl,1mM EDTA)再懸浮，並加入最終濃度5毫克/毫升之溶菌酶(lysozyme)於室溫下培養5分鐘，再以1% Triton-100裂解細胞，再分別加入最終濃度5mM及10微克/毫升氯化鎂及去氧核糖核酸水解脢I(DNase I)消化黏滯DNA(viscous DNA)，溶解產物(lysate)以離心清理後，將上清液(supematant)於室溫下培養於1毫升之漿體(slurry)50%麩胱甘肽樹脂並緩慢搖動1小時，以10倍樹脂沉澱後體積(10 bed volumes)磷酸緩衝液(PBS)清洗該樹脂3次，再以15mM還原態麩胱甘肽(reduced glutathione)(Bioman,Taiwan)從該樹脂中沖提出GST-iAg融合蛋白，最後以Bradford Assay及西方墨點法測量GST融合制動抗原蛋白之濃度，其中第一抗體為抗海水白點蟲纖毛幼蟲(irritans theront)之兔子免疫球蛋白(rabbit immunoglobulin)(稀釋1000倍)，第二抗體為鹼性磷酸脢(alkaline phosphatase)接合山羊抗兔子免疫球蛋白(稀釋1000倍)。

表現制動抗原於GF-1細胞 轉染

GF-1細胞係從點帶石斑魚(Epinephelus coioides)魚鰭中取出，並培養於攝氏28度加入抗生素的L15培養液(Invitrogen,Carlsbad,CA)中，並加入5%(v/v)經熱處理不活化(heat-inactivated)之胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)，GF-1主要為類纖維母細胞(fibroblast-like)及表皮細胞。將pcDNA3.1-優化的制動抗原質體(pcDNA3.1-optiAg)及對照組pcDNA3.1利用lipofectamine 2000(Life Technologies,Inc.,Rockville,MD)及其操作指示轉染至GF-1細胞，其步驟為：轉染前20小時於6孔培養盤中每格培養1 x 10⁵個細胞，轉染時將3微升之lipofectamine以及1微克之該質體(pcDNA3.1-optiAg)分別以L15培養液稀釋至100微升，隨後將上述二溶液1:1混合並於室溫下放置20分鐘後，與800微升之無血清培養液混合，再緩慢滴至細胞上，靜置於攝氏28度培養5小時後更換新鮮培養液，最後於轉染後24小時，48小時及72小時收取細胞以觀察該制動抗原轉錄情形。

反轉錄核酸聚合酵素連鎖反應(RT-PCR)

利用Trizol(Invitrogen)萃取上述經轉染之GF-1細胞之RNA，以Superscript One-Step RT-PCR套組(Invitrogen)及引子8(SEQ ID NO: 8)與引子9(SEQ ID NO: 9)(詳見表一及序列表)進行RT-PCR，該RT-PCR以初期變性溫度攝氏94度2分鐘，再以溫度循環：變性溫度攝氏94度30秒、結合溫度攝氏55度30秒，及延長溫度攝氏72度30秒進行30個循環，最後以延長溫度攝氏72度10分鐘，其產物以1.5%洋菜凝膠電泳及溴化乙錠(ethidium bromide)染色分析其產物。

細胞免疫化學染色法(Immunocytochemistry,ICC)法

將上述GF-1細胞培養於厚蓋玻片並根據上述轉染過程，利用5微克之pcDNA3.1-optiAg進行轉染，在培養48小時後以L-15培養液清洗並固定於含4%三聚甲醛(paraformaldehide)(v/v)的磷酸緩衝液(PBS)中，該受固定的細胞以NET-明膠阻斷液(NET-gelatin blocking solution)於室溫下培養1小時後，再於室溫下浸泡PBST(PBS with 0.1% triton X-100)15分鐘，隨後將該細胞加入含有稀釋1000倍之抗纖毛幼蟲兔子免疫球蛋白之NET-gelatin溶液，於攝氏4度下靜置過夜(以兔子免疫前(preimmune)免疫球蛋白為第一抗體之對照組)，利用PBST潤洗細胞後，再於室溫下與稀釋2000倍之螢光素異氰硫酸鹽(fluorescein isothiocyanate；FITC)接合山羊抗兔子免疫球蛋白培養2小時後，再次以PBST潤洗細胞，並以4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole；DAPI)於室溫下染色10分鐘後，移除該染色液，將該蓋玻片移至滴有免疫螢光抗退色液(mounting medium,malinol NX)之載玻片上，蓋玻片蓋上的方式使載有細胞之一面朝向該載玻片，經染色後，利用共軛焦雷射掃描顯微鏡(confocal laser scanning microscope)(台灣大學科技共同空間)顯影觀察。

誘發石斑魚苗免疫反應 初始免疫(Primary immunization)

從國立海洋大學水生動物實驗中心獲得之未出現白點病(Cryptocaryonasis)臨床症狀的石斑魚苗，於實驗前先飼養兩周，該魚苗皆被飼養於攝氏27度之32 ppt海水，並持續供應氧氣。在進行免疫反應測試前，從該實驗魚群中隨機選出20%並以抗海水白點蟲纖毛幼蟲之特定血清抗體力價(specific serum antibody titer)及酵素結合免疫吸附分析(Enzyme-linked immunosorbent assay；ELISA)。每組篩選21隻體重介於13至28公克之石斑魚苗，並將其分至三缸分別飼養於38公分x 25公分x 26公分之水族箱中。該三組石斑魚苗分別給予以下免疫刺激：(1)對第一組石斑魚苗於背鰭基部肌肉注射受包裹的水做為對照組；(2)對第二組石斑魚苗於背鰭基部肌肉注射受包裹的pcDNA3.1質體(1公克魚體注射1微克質體)做為對照組；(3)對第三組石斑魚苗於背鰭基部肌肉注射受包裹的pcDNA3.1-optiAg質體(1公克魚體注射1微克質體)，其中1微克質體(濕重，wet weight)約包含有1.4 x 10¹¹個質體。

第二次追加注射係於第一次注射兩天後再給予相同劑量之注射，以確保魚體有足夠之DNA量。

初始接種後對魚體進行轉錄確認

經過初始接種後，對魚體(n=3)進行體內基因表現測試，利用引子8(SEQ ID NO：8)及引子9(SEQ ID NO：9)(如表一所示)對注射點附近之肌肉組織測試該制動抗原基因之表現量，該肌肉組織樣本係於注射後24小時收取，並利用RT-PCR測試之。

追加免疫重組制動抗原蛋白

第二次免疫反應測試採核酸初免-蛋白加強(DNA prime-protein boost)之方法進行，用於實驗之石斑魚苗體重介於30公克至45公克之間，此次實驗一樣分為三組進行，每組約含12至15尾魚苗，該三組石斑魚苗分別給予以下免疫刺激：(1)對第一組石斑魚苗於背鰭左側肌肉注射受包裹的水做為空白對照組(2)對第一組石斑魚苗於背鰭左側肌肉注射受包裹的pcDNA3.1質體(1公克魚體注射1微克質體)做為對照組；(3)對第三組石斑魚苗於背鰭基左側肉注射受包裹的iAg質體(1公克魚體注射1微克質體)，並於初始免疫10日後於背鰭右側肌肉注射麩胺基硫轉移酵素(glutathione S-transferase,GST)接合之制動抗原重組蛋白(1公克魚體注射1微克)作為免疫增強劑(booster)。

進行人工浸染

利用每公升海水1.8 x 10⁴隻之活體Aus C分離品系(isolate)(從基隆之受感染施氏花鱸(Caprodon schlegelii)身上取得)海水白點蟲纖毛幼蟲人工浸染免疫後或免疫增強後7日之魚體，人工浸染的方式為：於38公分x 25公分x 26公分之水箱內5公升之海水中感染10至20分鐘後，再加入海水至15公升放置24小時，如2至3天後魚體體表出現白點，則確認受到海水白點蟲感染。本測試每日記錄實驗魚體之死亡數目持續一周。

實驗魚體死亡率記錄

利用下列公式計算專一性累積死亡率(cumulative mortality of the specific death,CMSD)：

CMSD(%)=(死亡魚體總數-非特定因素死亡數目/實驗魚體總數-非特定因素死亡數目)×100

統計

利用變異數分析(Analysis of Variance，ANOVA)及鄧肯氏多變域測驗(Duncan's New Multiple Range Test,DMRT)分析CMSD，p值小於0.01及p值小於0.05可顯示該結果具有統計顯著性。利用統計軟體SPSS 11.5繪製Kaplan-Meier存活曲線以表現經制動抗原刺激免疫反應之實驗魚體之累積死亡率。

上述實施方式之實施結果 制動抗原之cDNA選殖

Chiayi品系制動抗原之cDNA全長有987個鹼基對，開放讀碼區(open reading frame)含有329個胺基酸，其包含一19個胺基酸的推定的胺端訊息胜肽(N-terminal signal peptide)(如圖一所示)，五端及三端之非轉譯區(untranslated region,UTR)分別為19個核苷酸及140個核苷酸。再者，Chiayi品系制動抗原含有7個TAA密碼子(核苷酸第23-25,392-394,467-469,518-520,539-541,656-658與896-898)及1個TAG密碼子(核苷酸第308-310)，其轉譯出之初始蛋白質估計為34.65 kDa、不含訊息胜肽之成熟蛋白質估計為32.69，估計之isoelectric point(pI)為7.5。Chiayi品系制動抗原被預測出有兩段穿膜片段(transmembrane segment)分別位於第225-227及306-328個胺基酸，另外Chiayi-制動蛋白的羧基末端蛋白質被預測於第302個胺基酸絲氨酸(serine)處具有一可能omega(ω) site提供原胜肽(propeptide)切割及糖基化磷脂醯肌醇(GPI)之固定位置(如圖一所示)。

受轉染GF-1細胞中與以制動蛋白DNA注射過之魚體肌肉中之制動蛋白轉錄產物

以RT-PCR檢測經pcDNA3.1-optiAg轉染後24小時、48小時及72小時之GF-1細胞中制動蛋白轉錄產物表現量顯示於圖二A，以相同劑量之pcDNA3.1轉染之負對照組未顯示電泳條帶(band)，未經轉染之細胞也未顯示電泳條帶。另外，於轉染後24小時測出利用制動蛋白刺激免疫之魚體肌肉樣本中含有制動蛋白轉錄產物(如圖二B所示)，且對照組(mock control)，即以pcDNA3.1注射之魚體肌肉樣本並未顯示電泳條帶。

利用大腸桿菌表現之制動抗原重組蛋白

利用西方墨點法測試之結果證明了加入IPTG可誘使GST-iAg融合蛋白表現(如圖三A，Lane 3所示)，該融合蛋白係以麩胱甘肽凝膠樹脂(glutathione sepharose resin)(BIOMAN,Taiwan)純化。老鼠抗GST抗體辨認約55 kDa的intact融合蛋白及25 kDa的GST蛋白(如圖三A所示)，另外，兔子抗海水白點蟲纖毛幼蟲之免疫球蛋白亦可辨認GST-iAg融合蛋白(如圖三B所示)，而利用兔子免疫前血清則無法辨認之。利用線性迴歸方程式分析電泳並推算制動抗原重組蛋白之分子量(R²=0.9668)為32.067，與預估的分子量32.69相當接近。

制動抗原蛋白(iAg protein)於GF-1細胞中之表現量分析

利用免疫細胞化學染色法(ICC)分析制動抗原質體(iAg plasmid)於經pcDNA3.1-optiAg轉染之GF-1細胞中表現制動抗原蛋白之能力，經轉染48小時後以共軛焦雷射掃描顯微鏡觀察，僅以pcDNA3.1-optiAg轉染之細胞表現制動抗原蛋白(如圖四C所示)，對照組(mock control)及未經轉染的細胞都無產生螢光(如圖四g及四k所示)。同時利用兔子免疫前免疫球蛋白為第一抗體做ICC測試之結果中，經pcDNA3.1-optiAg轉染之細胞亦無產生螢光。

以制動抗原免疫石斑魚對海水白點蟲之免疫保護力效果

如表二所示，以pcDNA3.1-optiAg免疫之魚體之專一性累積死亡率(CMSD)為50%，其在統計上與注射水之對照組(93% CMSD)及僅注射pcDNA3.1之對照組(93% CMSD)相比顯著下降。最高的相對存活率(relative percent survival,RPS)在第一次試驗中得到為46%，其劑量為每1公克魚體注射1微克之制動抗原質體兩次(中間間隔兩天，共2微克)，對照組中存活的魚體上亦發現感染海水白點蟲病徵之白色小點。

以重組蛋白追加免疫(boost)的效果

如表三所示，以制動抗原質體免疫並以重組制動抗原蛋白追加免疫之魚苗其相對存活率為40%，與對照組相較(84% CMSD)，其以海水白點蟲感染後之CMSD顯著較低(50%)(p<0.05)。

奈米微粒包裹

為達到較高的免疫效果，在本發明其中一個實施例係以幾丁聚醣(chitosan)奈米微粒包裹該制動抗原質體，其中幾丁聚醣奈米微粒及幾丁聚醣/DNA混合物之製備方法係依據中華民國公開號第201021806號專利「幾丁聚醣作為傳輸工具的應用和方法」及其相關論文：Han-Ning Huang,Tsung-Lin Li,Yi-Lin Chan,Chien-Lung Chen,Chang-Jer Wu著作之「Transdermal immunization with low-pressure-gene-gun mediated chitosan-based DNA vaccines against Japanese encephalitis virus」(發表於Biomaterials 30(2009) 6017-6025)。該幾丁聚醣奈米微粒係以離子凝膠(ionic gelation)製備，將幾丁聚醣溶液(1%之幾丁聚醣溶解於20毫升之醋酸溶液)緩慢加至8毫升之三聚磷酸鹽(tripolyphosphate,TPP)(0.84毫克/毫升)後，立刻於室溫中以超音波處理(ultrasonication)(29W,4分鐘)，再離心12,000轉45分鐘以去除沉積顆粒，該上清液即含有幾丁聚醣奈米微粒。而幾丁聚醣/DNA混合物之取得則係將10毫升質體DNA溶液(1毫克/毫升)加入不同量之幾丁聚醣溶液，隨後於室溫中震盪(vortex)該混合液20秒，其製備完成之幾丁聚醣/DNA混合物之直徑約介於130~160奈米。

本發明中用於製作DNA疫苗之制動抗原係從Chiayi品系海水白點蟲(GenBank: FJ167511)選殖而得，其完整序列中有8個密碼子在原核生物或部份真核生物中之功能為終止密碼子(7個TAA及1個TAG)，因此無法以該密碼子直接於細菌或其他真核生物中表現出重組蛋白。在這八個終止密碼子中，其中1個位於訊息胜肽區域，其餘7個位於原本海水白點蟲制動抗原基因片段中，並被置換成通用麩醯胺(Glutamine)密碼子CAG及CAA，然而該通用麩醯胺密碼子亦無法於細菌中表現，故密碼子優化(Codon optimization)，即根據特定生物之需求置換特定密碼子，係增加可表現該序列之細胞品係及生物之手段之一，如將密碼子置換成目標生物可讀且可轉換出與原本位置相同之胺基酸，則該用以刺激免疫之制動蛋白胺基酸序列及可與原本相同。因此，本發明其中一個實施例中，考慮胺基酸之結構及電荷分部等特性，該7個終止密碼子(除了位於訊息胜肽區域之密碼子)被置換成精氨酸(Arginine)、甘胺酸(Glycine)或丙胺酸(Alanine)，同時丙胺酸及甘胺酸之密碼子可增加GC含量，該制動蛋白序列經修飾後將平均CG含量由36%提升至47%。此經密碼子置換之制動蛋白基因於石斑魚鰭細胞中成功表現，同時也可在細菌中表現出GST融合蛋白。

DNA疫苗在水產養殖業中因其經濟性、環境保護性及安全性極具產業利用性，曾有許多前案指出DNA疫苗抗魚類之病原體的成效。於本發明其中一實施例中，密碼子經置換後之制動抗原構築pcDNA3.1-optiAg成功於受轉染之GF-1細胞中表現制動抗蛋白，並經共軛焦雷射掃描顯微鏡確認。同時經RT-PCR亦確認pcDNA3.1-optiAg於接受肌肉注射並免疫後之石斑魚之注射處表現，該RT-PCR結果中之電泳條帶與該制動抗原之分子量相同。此外，制動抗原蛋白於受pGex2T-iAg質體轉染之大腸桿菌之表現亦經由西方墨點法證實，其結果顯示該重組制動抗原蛋白在生體外及升體內都可成功表現，故本實施例之DNA疫苗可成功於生物體內誘發免疫反應。

再者，本發明其中一實施例中，以海水白點蟲感染之實驗中成功證明該制動抗原可提供適當的保護(46% RPS)，於第一次試驗(如表二所示)，以每1公克魚體1微克之劑量注射兩次實驗魚體(中間間隔兩天，共2毫微克)，其RPS為46%，然而第二次試驗(如表三所示)，以每1公克魚體1微克之劑量僅注射1次實驗魚體，第二次係以重組制動抗原蛋白注射(每1公克魚體1微克)，其RPS為40%，並未比第一次試驗高，不過如給予更高劑量之制動抗原質體或重組制動抗原蛋白可能可以達到更好的保護效果。如欲更增強本發明所提供之DNA疫苗的效果，應可從DNA之劑量、奈米粒子包裹技術、加入訊息胜肽、選擇適當血清型(serotype)及適當的投藥方式，此外，於本發明其他實施例中，並不限於此實施例所使用的制動抗原，亦可從海水白點蟲身上取得其他抗原實施。

表二中顯示以制動抗原質體誘發免疫之組別III與對照組I、II之經海水白蟲感染後CMSD有顯著差異(經變異數分析及鄧肯氏多變域測驗分析p<0.01)。

表三中顯示以制動抗原質體誘發免疫之組別III與對照組I、II之經海水白蟲感染後CMSD有顯著差異(經變異數分析及鄧肯氏多變域測驗分析p<0.01)。

將DNA以奈米微粒(nanoparticle)或微粒(microparticle)包裹可避免DNA被消化以增加被攝取量，受奈米微粒包裹之DNA疫苗可透過口服或注射實施，而奈米微粒被認為較微粒佳之原因在於其體積之一致性。而此包裹物以生物可分解材質製成為佳，一種由大展生命科技股份有限公司(Alarvita Biolife)生產之抗魚類結病毒(betanodavirus)之疫苗即係以此種方式包裹。另外奈米微粒之平均直徑約為80奈米，較水/油/水三層乳狀結構之19微米小許多。

於本發明其中一實施例，發明人利用Aus C品系海水白點蟲進行人工浸染，而制動抗原DNA疫苗係由Chiayi品系海水白點蟲所構築，兩品系ITS-1區域有3.55%之差異，制動抗原序列有84%相似。而本發明之相關實施例中，此2種品系中皆未發現血清抗體反應，因此制動抗原是否可誘發跨血清型(cross-serotype protection)之保護須經更多實驗證明之。

DNA疫苗可提供體液免疫及細胞媒介免疫之反應，以肌肉注射為例，肌細胞會是主要的受轉染細胞類型，雖此免疫方法未產生細胞媒介免疫，但受轉染肌細胞產生之抗原足以產生細胞毒殺T淋巴球(CTL)反應。

能夠誘發CTL反應之DNA疫苗編碼(encode)之抗原有全蛋白質、截斷(truncated)蛋白質、融合蛋白質、一叢細胞毒殺T淋巴球胜肽(CTL peptide)、一段嵌於異源蛋白(heterologous protein)之細胞毒殺T淋巴球胜肽、極小細胞毒殺T淋巴球胜肽(minimal CTL peptide)等。以NetCTL預測，選殖入pcDNA3.1-optiAg的制動抗原序列，其主要有9個組織相容性複合物(Major histocompatibility complex,MHC)配位子/細胞毒殺T淋巴球抗原決定基(MHC ligands/CTL epitope)。

許多先前技術曾揭露DNA疫苗應用於動物中可誘發抗體反應，又有部分先前技術推測若一DNA疫苗不含引導訊息序列(leading signal sequence)，則相較於全長之序列，其免疫原性較低。相對地，亦有先前技術肯定缺乏分泌訊號序列(secretion signal sequence)之蛋白質亦可誘發抗體反應。DNA疫苗誘發抗體反應之能力可以其所產生之成熟蛋白質結構為膜錨定(membrane-anchored)蛋白或可溶性蛋白、或是否為分泌蛋白。

本發明所提供之制動抗原DNA疫苗具有免疫原性，即使該制動抗原質體並未包含訊息序列以表現抗原為細胞外蛋白質。在本發明其中一實施例中，雖然該DNA疫苗已能誘發免疫反應，但如以對其加入適當訊息胜肽之實施方式，亦可對目標寄生蟲產生體液免疫反應，其可增加該DNA疫苗之效果。

以本發明所提供之抗海水白點蟲DNA疫苗而言，能在不同品系間產生免疫保護效果是相當重要的，因為魚類通常會遭受不只一種品系之海水白點蟲感染，先前技術顯示兩個不同的海水白點蟲制動血清型(immobilization serotype)對不同品系產生之抗血清(antiserum)產生制動現象，故根據免疫力價(immobilization titer)及營養體總數(trophont count)，可認為這兩種血清型能誘發交叉保護反應(cross-protection)。

將質體傳送至欲轉染目標物亦係進行DNA疫苗產生免疫反應之基本步驟之一，目前有許多種方式用以增加DNA於生體內之傳送率，其包含各種配方如鹽類、局部麻醉(local anesthetic)、油脂、醣類及基因槍與Biojet等等，但若能將DNA疫苗以混入魚飼料之方式投藥則具有降低魚體壓力、可一次對大量的魚施藥、低成本等優點，然若以注射方式投藥，則可精準控制劑量。

綜上所述，本發明之實施例完成一個藉由密碼子置換使制動抗原蛋白質能於原核細胞及真核細胞系統中表現之方法，同時亦驗證了該制動蛋白具有免疫原性，故本發明所提供之DNA疫苗確實可預防魚類受到海水白點蟲感染。

<110>　國立台灣大學

<120>　以海水白點蟲制動抗原互補去氧核糖核酸(cDNA)生產之疫苗及其製造方法及用途

<130>　1550-NTU-TW

<160>　10

<170>　PatentIn version 3.5

<210>　1

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<212>　DNA

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圖一係Chiayi品系海水白點蟲之制動抗原核苷酸序列(GenBank FJ167511)及其對應之胺基酸序列。預測之訊息胜肽以方框白底表示，終止密碼子以無框線深灰底表示，預測穿膜片段以無框線灰底表示，以方框深灰底表示者為糖基化磷脂醯肌醇固定位置(第302個胺基酸絲氨酸)，左側數字為核苷酸序列、右側數字為胺基酸序列。

圖二係以RT-PCR偵測制動蛋白轉錄產物。圖二A為受轉染24小時、48小時及72小時後之GF-1轉錄產物，泳道(Lane)M為DNA marker；泳道24、48、72分別為受轉染24小時、48小時及72小時後之結果。圖二B為受注射之魚體肌肉細胞之轉錄產物，泳道M為DNA marker；泳道1、2、3分別為注射質體模板(plasmid template)、對照組質體(mock plasmid)及制動抗原質體(iAg plasmid)之結果。

圖三係以西方墨點法偵測大腸桿菌表現重組制動抗原蛋白。圖三A泳道1為Marker；泳道2為未經IPTG誘導之大腸桿菌；泳道3為經IPTG誘導之大腸桿菌以小鼠抗GST抗體辨認，其中55kDa箭頭指示處為GST融合制動抗原蛋白、25kDa箭頭指示處為GST蛋白。圖三B泳道1為Marker；泳道2箭頭指示處為GST融合制動抗原蛋白以兔子抗海水白點蟲纖毛幼蟲抗體辨認。

圖四為透過共軛焦雷射掃描顯微鏡觀察以兔子抗海水白點蟲纖毛幼蟲免疫球蛋白之(A)白光(bright)；(B) DAPI染色部份；(C) FITC染色部份；(D)前兩者重疊之石斑魚GF-1細胞(a至d為以pcDNA3.1-optiAg轉染之GF-1細胞；e至h為以pcDNA3.1轉染之GF-1細胞；i至1為未經轉染之GF-1細胞；Bar=50微米)。

圖五以Kaplan-Meier存活曲線表現經制動抗原刺激免疫反應之實驗魚體隻存活率，其中經制動抗原刺激免疫反應及經重組制動抗原蛋白加強(boost)兩組之對數等級(log rank)之顯著性為0.008。

【附件簡單說明】

附件一為圖一之彩圖，預測之訊息胜肽以紅色方框表示，終止密碼子以綠底表示，預測穿膜片段以灰底表示，以紅底方框表示者為糖基化磷脂醯肌醇固定位置(第302個胺基酸絲氨酸)。

附件二為圖二之彩圖。

附件三為圖三之彩圖。

附件四為圖四之彩圖。

附件五為圖五之彩圖。

Claims (14)

1. 一種優化(optimize)海水白點蟲制動抗原互補去氧核糖核酸(cDNA)序列之方法，其包含：a.取得海水白點蟲制動抗原之mRNA序列；b.將該mRNA序列轉換為cDNA序列；c.根據該cDNA序列中終止碼(stop codon)周圍之密碼子(codons)對應之胺基酸殘基之特定特徵推測出終止碼特定胺基酸，使該終止碼以能轉譯出該特定胺基酸之密碼子取代後，轉譯出之蛋白與從該海水白點蟲纖毛幼蟲純化出之制動抗原彼此之免疫原性(immunogenicity)相近；及d.將該終止碼(stop codon)以能轉譯出該特定胺基酸之密碼子取代，產生優化的(optimized)cDNA序列；其中該特定特徵係選自終止碼周圍密碼子所對應之肽基酸殘基的結構特性、疏水性、電荷分布所組成之群組。
2. 如申請專利範圍第1項之方法，該特定胺基酸為精氨酸(Arginine)、甘胺酸(Glycine)或丙胺酸(Alanine)。
3. 一優化的海水白點蟲制動抗原互補去氧核糖核酸(cDNA)序列，其包含SEQ ID NO:10所示之核苷酸序列。
4. 一載體，其包含申請專利範圍第3項之優化的海水白點蟲制動抗原cDNA序列。
5. 如申請專利範圍第4項之載體，其為pGex2T-iAg或pcDNA3.1-iAg。
6. 一種核酸疫苗，其包含申請專利範圍第3項之優化的海水白點蟲制動抗原cDNA序列。
7. 如申請專利範圍第6項之核酸疫苗，其係以幾丁聚醣奈米顆粒包裹。
8. 一種優化的海水白點蟲制動抗原cDNA序列用於製備針對海水白點蟲之抗體的用途，其特徵在於將包含SEQ ID NO:1所示之核苷酸序列之cDNA序列之載體使用於一宿主(host)，促使該宿主產生抗體對該cDNA序列轉譯出之蛋白質發生凝集反應後，取得該針對海水白點蟲之抗體。
9. 如申請專利範圍第8項之用途，其中該載體係以幾丁聚醣包裹成奈米顆粒。
10. 如申請專利範圍第8項之用途，其中該載體為pGex2T-iAg或pcDNA3.1-iAg。
11. 如申請專利範圍第8項之用途，其中該宿主為水生生物。
12. 如申請專利範圍第11項之用途，其中該水生生物為魚類。
13. 如申請專利範圍第12項之用途，其中該魚類為黑鯛(Acanthopagrus schlegelii)、異臂花鮨(Caprodon schlegelii)、紅點九刺鮨(Cephalopholis aurantia)、青星九刺鮨(Cephalopholis miniata)、細點牙鯛(Dentex dentex)、歐洲海鱸(Dicentrarchus labrax)、尖吻重牙鯛(Diplodus puntazzo)、單斑重牙鯛(Diplodus sargus)、青石斑(Epinephelus awoara)、點帶石斑(Epinephelus coioides)、鞍帶石斑(Epinephelus lanceolatus)、三斑石斑(Epinephelus trimaculatus)、黑毛瓜子臘(Girella leonina)、臀斑髭鯛(Hapalogenys mucronatus)、棘箱魨(Kentrocapros aculeatus)、大黃魚(Larimichthys crocea)、尖吻鱸(Lates calcarifer)、銀紋笛鯛(Lutianus argentimaculatus)、赤鰭笛鯛(Lutjanus erythopterus)、白星笛鯛(Lutjanus stellatus)、角鱗魨(Melichthys vidua)、真鯛(Pagrus major)、花軟唇(Plectorhynchus cinctus)、茉莉花鱂(Poecilia latipinna)、魔鬼簑鮋(Pterois volitans)、黃錫鯛(Rhabdosargus sarba)、金錢魚(Scatophagus argus)、紅甘鰺(Seriola dumerili)、銀籃子魚(Siganus oramin)、金頭鯛(Sparus aurata)、布氏鯧鰺(Trachinotus blochii)、海鱺(Rachycentron canadum)、青甘鰺(Seriola quinqueradiata)、克氏海葵魚(Amphiprion clarkii)、白條海葵魚(Amphiprion frenatus)、鞍斑海葵魚(Amphiprion polymnus)或眼斑海葵魚(Amphiprion ocellaris)。
14. 如申請專利範圍第8項之用途，其中將該載體使用於該宿主之方式可為混入飼料或食餌中、混入水中浸泡該宿主或注射該宿主。