TW201303097A - 用於鑑定及特徵化降脂藥劑之測試系統及方法 - Google Patents

Abstract

本發明是有關鑑定及特徵化用於治療與嚙齒動物之LDL-C濃度升高相關疾病或病況的治療候選物的方法、用於測試專一結合嚙齒動物第9型前蛋白轉化酶枯草溶菌素(proprotein convertase subtilisin/kexin type 9,PCSK9)之抗體效力的方法，以及嚙齒動物與其在鑑定或分析用於調節與LDL-C濃度升高相關之疾病或病況的化合物的用途。

Description

用於鑑定及特徵化降脂藥劑之測試系統及方法

本發明是有關鑑定及特徵化用於治療與嚙齒動物之LDL-C濃度升高相關的疾病或病況的治療候選物的方法、用於測試專一結合嚙齒動物第9型前蛋白轉化酶枯草溶菌素(proprotein convertase subtilisin/kexin type 9,PCSK9)之抗體效力的方法，以及嚙齒動物與其在鑑定或分析用於調節與LDL-C濃度升高相關之疾病或病況的化合物的用途。

本發明亦是有關含有包裝材料及嚙齒動物與視情況選用之PCSK-9專一性抗體或其抗原結合片段，以及關於進行上述方法之標籤或包裝插頁的套組或製造物品。

第9型前蛋白轉化酶枯草溶菌素(PCSK9)是一種屬於分泌型枯草桿菌酶家族(secretory subtilase family)之蛋白酶K次家族的前蛋白轉化酶。所編碼的蛋白質製造成可溶性酶原，其在內質網中經歷自催化分子內加工。有證據暗示PCSK9會藉由增進LDL受體分解而增加血漿LDL膽固醇，而LDL受體在肝臟中媒介LDL胞飲作用，是自循環清除LDL的主要途徑。PCSK9蛋白質的結構顯示其具有一個訊號序列，繼而為前結構域 (prodomain)、含有保守性三角殘基(D186、H226與S386)的催化結構域，以及C-端結構域。其在ER中經歷自催化切割而被合成為一個可溶性74-kDa前驅物，產生一個14-kDa的前結構域以及60-kDa催化片段。已顯示自催化活性對於分泌作用是必需的。在切割之後，前結構域仍與催化結構域緊密地締合。

PCSK9的抗體描述於，例如WO 2008/057457、WO 2008/057458、WO 2008/057459、WO 2008/063382、WO 2008/125623以及US 2008/0008697中。特別適於實施本發明的抗PCSK9抗體揭示於US 2010/0166768 A1中，其內容以全文引用的方式併入本文中。

本發明的技術問題

心血管疾病(CVD)在全世界是發病率與死亡率的主要病因，在美國所有死亡中約30%為心血管疾病而在歐洲所有死亡中差不多50%。許多研究已證實了低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)與CV發生率之間的直接相關性。例如，由20個隨機臨床試驗所組成的統合分析顯示，每降低1 mmol/L(40 mg/dL)的LDL-C與CVD發病率和死亡率明顯降低22%相關。基於這個研究以及類似研究的結果，國際治療指南(international treatment guidelines)建議已患有CVD的患者降低LDL-C至<2.0-2.6 mmol/L(<77-100 mg/dL)，而在高風險群(諸如患有CVD與糖尿病、吸煙、控制不良的高血壓、代謝症候群或先前心肌梗塞)降低至<1.8-2.0 mmol/L(<70-77 mg/dL)。但是，儘管降脂劑廣泛可取得，但在1999至2006期間於美國所有治療高膽固醇血症的成人患者約有30%無法達到他們所建議的LDL-C目標。理由包括無法堅持療法、藥劑抗性/耐受性以及不良事件發生率與劑量增加之間的正向相關性。另外，因為大部分有效的降脂劑僅能降低LDL-C濃度至多達55%，需要實質降低LDL-C之患者(諸如具有家族性高膽固醇血症者)中的目標達成率通常低於預期。因此，需要更有效的降脂劑以增進在這些患者中的目標達成率。

膽固醇恆定涉及3個重要的速率決定步驟：膽固醇合成、分泌以及從循環移除。大多數降脂劑主要針對膽固醇合成及/或分泌。但是，正發展出一種新型的降脂藥劑-第9型前蛋白轉化酶枯草溶菌素(proprotein convertase subtilisin/kexin type 9,PCSK9)抑制劑-其經LDL受體(LDLR)藉由增加自循環攝取膽固醇的速率來降低LDL-C濃度。

PCSK9是絲胺酸蛋白酶枯草桿菌蛋白酶(subtilisin)家族的第九個成員。其主要表現於肝臟與腸中，並且藉由一系列的轉錄因子調節，其中最為重要的是SREBP-2。在正常情況下，PCSK9結合至LDLR的細胞外表皮生長因子A結構域並且透過胞飲作用被內化。降低吞噬小體(endosomal)中的pH會增加PCSK9對LDLR的親和力，且整個複合物靶定至溶小體(lysosome)而分解。LDLR分解速率增加會降低LDL-C自循環移除的速 率，從而增加LDL-C的血清濃度。因此，接而降低PCSK9相對於LDLR之比率及/或破壞兩個蛋白質之間的交互作用可有效降低高膽固醇血症患者的LDL-C濃度。另外，PCSK9抑制劑具有增加史塔丁(statin)效力的潛力。消耗膽固醇會活化SREBP-2轉位，使其結合至PCSK9啟動子的SRE-1要素。因為SRE-1部位(motif)存在於LDLR與PCSK9啟動子中，使用史塔丁降脂會增加LDLR及其天然抑制劑PCSK9的轉錄。在高劑量的情況下，此回饋環被認為會限制了史塔丁降低LDL-C的效力。因此，提供額外LDL-C降低之有效PCSK9抑制劑(單獨或與史塔丁組合)對於未來管理CVD可能具有極為深遠的影響。

史塔丁在世界上是最為廣泛使用的藥劑。儘管史塔丁通常表現極佳的安全性型態，但需要進一步藉由降低非所欲副作用(諸如肌肉病變)已經很低的比率而使其安全性型態變得更佳。為了找出替代性治療方案，在使用於人類之前需要生物測試系統來篩選潛在藥劑候選物的活性與可能反效應。

以嚙齒動物和嚙齒動物細胞為基礎的測試系統廣泛用於小分子以及生物分子藥劑候選物的藥劑篩選。然而，考量到HMG-CoA還原酶抑制劑(如史塔丁)，先前已發現它們在嚙齒動物(諸如倉鼠)中無效。

相當出乎意料地，本發明的發明人發現，投與抗PCSK9抗體或其片段會降低敘利亞倉鼠體內的LDL-膽 固醇濃度。另外，儘管單獨HMG-CoA還原酶抑制劑治療對於LDL-C濃度沒有效用，但當HMG-CoA還原酶抑制劑與抗體治療一起施用時，HMG-CoA還原酶抑制劑治療具有協同效用。

這個令人驚訝的發現使該哺乳類動物使用於發展生物測試系統以供測試有效治療及/或預防心血管疾病的潛在新穎藥劑。

以上概述不盡然描述了本發明所解決的全部問題。

本發明的摘要不盡然描述了本發明的所有特徵。其他具體例將由查看之後的詳細說明而變得清楚。

在第一個態樣中，本發明是有關用於篩選化合物的方法，以鑑定用於調節與LDL-C濃度升高相關之疾病或病況的治療候選物，該方法包含：(a)提供嚙齒動物，(b)將測試化合物投與該嚙齒動物，及(c)偵測該化合物在該嚙齒動物體內相較於對照嚙齒動物是否增加或降低一或多個選自由以下組成之群組的參數：總膽固醇(TC)、低密度膽固醇(LDL-C)及高密度膽固醇(HDL-C)；其中調節該一或多個參數表示該化合物是用於在體內調節該疾病或病況的候選物。

在第二個態樣中，本發明是有關一種用於篩選化合物的方法，以鑑定用於調節與LDL-C濃度升高相關之疾病或病況的治療候選物，該方法包含(a)提供嚙齒動物，(b)將測試化合物投與該嚙齒動物，(c)在以該化合物治療該嚙齒動物之前，測定該嚙齒動物的一或多個選自由以下組成之群組的參數：總膽固醇(TC)、低密度膽固醇(LDL-C)及高密度膽固醇(HDL-C)，(d)在以該化合物治療該嚙齒動物之後，測定該一或多個參數，及(e)比較(a)中所得到的結果與(b)中所得到的結果，其中相較於(b)的結果，(a)參數的改變表示該化合物是用於在體內調節該疾病或病況的候選物。

在第三個態樣中，本發明涉及一種測試專一結合至hPCSK9之抗體或其抗原結合片段供治療與LDL-C濃度升高相關之疾病或病況之效力的方法，該方法包含：(a)將該抗體投與嚙齒動物；及(b)在將該抗體或其抗原結合片段投與給該嚙齒動物之前與之後測定該嚙齒動物的總膽固醇、LDL-C或HDL-C濃度，其中相對於在投與該抗體之前所測得之投藥前濃度，在投與該抗體之後測得總膽固醇及/或LDL-C濃度降低，及/或HDL-C濃度升高表示該抗體或其抗原結合 片段有效治療該疾病或病況，以及其中相對於在投與該抗體之前所測得之投藥前濃度，在投與該抗體之後測得總膽固醇濃度及/或LDL-C濃度增加表示該抗體在體內對於引起、促進或誘發該疾病或病況表現出反效應。

在第四個態樣中，本發明涉及一種測試專一結合hPCSK9之抗體或其抗原結合片段供調節與LDL-C濃度升高相關之疾病或病況之效力的方法，該方法包含：(a)在以該抗體治療嚙齒動物之前，測定得自嚙齒動物之體外樣品中的總膽固醇濃度、LDL-C濃度及/或HDL-濃度，(b)在以該抗體治療嚙齒動物之後，測定得自嚙齒動物之體外樣品中的總膽固醇濃度、LDL-C濃度及/或HDL-濃度，及(c)比較(a)中所得到的結果與(b)中所得到的結果，其中相對於在投與該抗體之前於(a)中所測得之投藥前濃度，在(b)中所測得之總膽固醇及/或LDL-C濃度降低，及/或HDL-C濃度增加表示該抗體或其抗原結合片段有效治療及/或預防該疾病或病況，以及其中相較於在(a)中所測得之投藥前濃度，在(b)中之總膽固醇濃度及/或LDL-C濃度增加表示該抗體在體內對於引起、促進或誘發該疾病或病況表現出反效應。

在第五個態樣中，本發明涉及一種測試專一結合hPCSK9之抗體或其抗原結合片段供治療與LDL-C濃 度升高相關之疾病或病況之效力的方法，該方法包含：(a)將該抗體投與嚙齒動物；及(b)在投與該抗體或抗原結合片段之後，藉由測定嚙齒動物的總膽固醇濃度及/或LDL-C濃度及/或HDL-C濃度來決定該抗體或其抗原結合片段的效力，(c)測定未以該抗體處理且較佳地獲得安慰劑之對照嚙齒動物的總膽固醇濃度及/或LDL-C濃度及/或HDL-C濃度，其中若(c)中所測得的總膽固醇濃度及/或LDL-C濃度比(b)中所測得者還低，且及/或(c)中所測得的HDL-C濃度比(b)中所測得者還高，則該抗體被認為是有效治療該疾病或病況，以及其中若(c)中所測得的總膽固醇濃度及/或LDL-C濃度比(b)中所測得者還高，則該抗體被認為是表現反效應。

在第六個態樣中，本發明涉及一種測試專一結合hPCSK9之抗體或其抗原結合片段供治療與LDL-C濃度升高相關之疾病或病況之效力的方法，該方法包含：(a)測定在將該抗體或其抗原結合片段投與至嚙齒動物之後所得樣品中的總膽固醇濃度及/或LDL-C濃度及/或HDL-C濃度，(b)測定得自未以該抗體或其抗原結合片段處理之嚙齒動物的對照樣品中的總膽固醇濃度及/或LDL-C濃度及/或HDL-C濃度， 其中若(b)中所測得的總膽固醇濃度及/或LDL-C濃度比(a)中所測得者還低，且及/或(b)中所測得的HDL-C濃度比(a)中所測得者還高，則該抗體被認為是有效治療該疾病或病況，以及其中若(b)中所測得的總膽固醇濃度及/或LDL-C濃度比(a)中所測得者還高，則該抗體被認為是表現反效應。

在第七個態樣中，本發明涉及一種測試化合物調節個體膽固醇濃度之效力的方法，該方法包含下列步驟：(a)提供嚙齒動物；(b)將專一結合PCSK9的抗體或其抗原結合片段投與給該嚙齒動物；(c)將測試化合物投與給該嚙齒動物；(d)在投與該測試化合物之後，測定該嚙齒動物的一或多個選自由以下組成之群組的參數：總膽固醇濃度、LDL-C濃度或HDL-C濃度，(e)測定未以該測試化合物刺激之對照嚙齒動物的一或多個相同參數，其中在(a)中所測得與(b)中所測得的膽固醇(總膽固醇或LDL-C或HDL-C)有差異表示該測試化合物有效調節個體的膽固醇濃度。

在第八個態樣中，本發明涉及一種在體外測試化合物調節個體膽固醇濃度之效力的方法，該方法包含下列步驟： (a)在已對嚙齒動物施用測試化合物之後，測定取自嚙齒動物之樣品中一或多個選自由以下組成之群組的參數：總膽固醇濃度、LDL-C濃度或HDL-C濃度，(b)測定未以該測試化合物刺激之對照嚙齒動物樣品的一或多個相同參數其中除了測試化合物之外，動物皆投與專一結合PCSK9之抗體或其抗原結合片段，以及其中在(a)中所測得與(b)中所測得的膽固醇(總膽固醇及/或LDL-C及/或HDL-C)有差異表示該測試化合物有效調節個體的膽固醇濃度。

在第九個態樣中，本發明涉及一種測試化合物調節個體膽固醇濃度之效力的方法，該方法包含下列步驟：(a)提供嚙齒動物；(b)將專一結合PCSK9的抗體或其抗原結合片段投與給該嚙齒動物；(c)將測試化合物投與給該嚙齒動物；(d)測定該嚙齒動物的一或多個選自由以下組成之群組的參數：總膽固醇濃度、LDL-C濃度或HDL-C濃度，(i)將測試化合物投與給該嚙齒動物之前，及(ii)將測試化合物投與給該嚙齒動物之後，(e)比較(d)(ii)與(d)(ii)中所得到的參數其中在(d)(ii)中所得參數與(d)(ii)中所得參數有差異表示該測試化合物有效調節個體的膽固醇濃度。

在第十個態樣中，本發明涉及一種在體外測試化合物調節個體膽固醇濃度之效力的方法，該方法包含下列步驟：(a)測定一或多個選自由以下組成之群組的參數：總膽固醇濃度、LDL-C濃度或HDL-C濃度，(i)將測試化合物投與給該嚙齒動物之前所得之嚙齒動物樣品中，以及(ii)將測試化合物投與所得之相同嚙齒動物樣品中，及(b)比較(d)(ii)與(d)(ii)中所得到的參數其中該嚙齒動物已投與專一結合PCSK9之抗體或其抗原結合片段以及測試投與化合物，及其中在(d)(ii)中所得參數與(d)(ii)中所得參數有差異表示該測試化合物有效調節個體的膽固醇濃度。

在第十一個態樣中，本發明是有關一種用於鑑定供治療與膽固醇濃度升高相關(且較佳地是與LDL-C濃度升高相關)之疾病的藥劑的嚙齒動物，其中嚙齒動物相較於對照嚙齒動物的PCSK9濃度降低。

在第十二個態樣中，本發明是有關相較於對照嚙齒動物PCSK9濃度降低之嚙齒動物的用途，其係作為模型系統供測定藥劑調節膽固醇的效用，且較佳地係降低膽固醇的效用。在第十一個或第十二個態樣的一個較佳具體例中，該藥劑為HMG-CoA還原酶抑制劑，諸如史塔丁。

在第十三個態樣中，本發明涉及一種製備適於用作為模型系統供測定藥劑調節膽固醇的效用(且較佳地係降低膽固醇的效用)之嚙齒動物的方法，該方法包含提供嚙齒動物或嚙齒動物之囊胚(blastocyst)，以及藉由遺傳剔除PCSK9、穩定或暫時抑制PCSK9或投與PCSK-9拮抗劑的方式來降低其PCSK9濃度。

在第十四個態樣中，本發明涉及一種嚙齒動物，較佳地是倉鼠，其是藉由如第十三個態樣的方法所獲得，且較佳地是藉由將PCSK-9專一性抗體投與給嚙齒動物所獲得。

在第十五個態樣中，本發明涉及一種進行如第一至十個態樣之一者的方法的套組，其包含嚙齒動物(較佳為倉鼠)以及PCSK9專一性拮抗劑，諸如PCSK9專一性抗體，且視情況包含一或多種如第六至七個態樣之一者的其他組分。

在第十六個態樣中，本發明涉及一種製造物品，其包含：(a)包裝材料或容器；(b)專一結合hPCSK9的抗體或其抗原結合片段；及(c)資料載體，諸如包裝材料包含的標籤或包裝插頁，其含有執行如第一至十個態樣之一者的方法的指示，該方法是用於分析或鑑定供治療或預防高膽固醇血症、高血脂症、血脂異常、動脈粥狀硬化及心血管疾病的化合物，以及視情況選用 (d)一或多種緩衝劑及/或試劑供測定樣品的總膽固醇濃度、LDL-C濃度或HDL-C濃度。

在第十七個態樣中，本發明涉及製造物品，其包含：(a)包裝材料或容器；(b)試劑及緩衝劑，供測定樣品的總膽固醇濃度、LDL-C濃度或HDL-C濃度；及(c)資料載體，諸如標籤，其含有執行如第一至十個態樣之一者的方法的指示，以及視情況選用的(d)專一結合hPCSK9的抗體或其抗原結合片段。

定義

在詳細說明本發明之前，應了解本發明並不囿限於本文所述的特定方法學、步驟及試劑，因為它們是可以改變的。亦應了解，本文所用的術語僅供說明特定具體例之用，且不欲限制本發明範疇，其僅受隨附申請專利範圍所限。除非另有指明，否則本文所用的全部技術與科技術語具有與本發明所屬技藝中一般技術者通常所理解相同的意思。

較佳地，本文所用術語係如"A multilingual glossary of biotechnological terms：(IUPAC Recommendations)",Leuenberger,H.G.W,Nagel,B.and Kölbl,H.eds.(1995),Helvetica Chimica Acta,CH-4010 Basel,Switzerland)中 所述般定義。

在以下通篇說明書以及申請專利範圍中，除非上下文另有需要，否則單字「包含(comprise)」及諸如「包含(comprises)」與「包含(comprising)」的變體被理解為意味包含所述整數或步驟或整數或步驟的群組，但不排除任何其他整數或步驟或整數或步驟的群組。

本說明書內文中通篇引用數篇文件(例如專利案、專利申請案、科學公開刊物、製造商的說明書、指示、GenBank存取號碼序列提交等)。在此不被理解為承認本發明因為先前發明早於此等揭示內容而不應被賦予專利權。一些本文引用文件的特徵在於「併入作為參考文獻」。在併入參考文獻之定義或教示與本說明書引用之定義或教示相衝突時，本說明書的內文優先。

序列：本文參照的所有序列揭示於隨附的序列表中，其全部內容與揭示內容為本說明書的一部分。

當與數值組合使用時，術語「約」表示涵括具有小於所指數值5%的下限且具有大於所指數值5%的上限間之範圍內的數值。

如本文所用，術語「第9型人類前蛋白轉化酶枯草溶菌素」或「hPCSK9」意指具有專利申請案US 2010/0166768 A1(該專利申請案以其整體併入本文作為參考文獻，見上)之SEQ ID NO：754中所示核酸序列，以及SEQ ID NO：2的胺基酸序列的hPCSK9，或其生物活性片段。

術語「專一地結合」、「專一結合」或類似語詞意指與抗原在生理條件下形成相對穩定複合物的抗體或其抗原結合片段。專一結合的特徵在於平衡解離常數為至少約1x10^-6 M或更低(例如較小的K_D表示更為緊密結合)。用於測定兩分子是否專一結合的方法為本技藝中已知，且包括例如平衡透析、表面電漿共振及類似方法。然而，專一結合hPCSK9的分離抗體可能對其他抗原(諸如其他物種的PCSK9分子)表現出交叉反應性。另外，如本文所用，結合至hPCSK9與一或多種其他抗原的多專一性抗體(例如雙專一性)仍視為「專一結合」hPCSK9的抗體。

如本文所用，術語「K_D」欲意指特定抗體-抗原交互作用的平衡解離常數。平衡解離常數通常是以「mol/L」(縮寫為「M」)來測量。

術語「緩慢解離速率(slow off rate)」、「Koff」或「kd」意指如藉由表面電漿共振(例如BIACORE^TM)量測時，與hPCSK9以1 x 10^-3 s^-1或更低(較佳為1 x 10^-4 s^-1或更低)的速率常數解離的抗體。

術語「高親和力」抗體意指如藉由表面電漿共振(例如BIACORE^TM)或溶液親和力ELISA量測時，彼等對hPCSK9具有結合親和力為至少10^-10 M、較佳10^-11 M、又更佳10^-12 M的mAb。

如本文所用，術語「表面電漿共振」意指容許藉由偵測生物感測器基質中的蛋白質濃度變化來分析即時 生物專一性交互作用的光學現象，例如使用BIACORE^TM系統(Pharmacia Biosensor AB,Uppsala,Sweden and Piscataway,N.J.)。

「抗原決定位(epitope)」，已知為「抗原決定基(antigenic determinant)」，是抗原被免疫系統(特別是抗體、B細胞或T細胞)所辨識的一個區域。如本文所用，「抗原決定位」是抗原能夠結合至本文所述抗體或其抗原結合片段的一部分。在上下文內，如本文所用術語「結合」較佳是有關「專一結合」。抗原決定位通常是由化學活性表面群集的分子(諸如胺基酸、糖側鏈、磷氧基或磺醯基)所組成，且可具有特異三維結構特性及/或特異電荷特性。構形與非構形抗原決定位因前者(非後者)在存有變性溶劑時不存在而被區分。

「抗原決定簇(paratope)」是抗體專一結合至抗原決定位的一個部分。

術語”抗體”，如本文所用，欲意指免疫球蛋白分子，其含有4個多肽鏈，藉由雙硫鍵交互連結的2個重(H)鏈以及2個輕(L)鏈。術語「抗體」亦包括抗體的所有重組形式，特別是本文所述抗體，例如下文所述於原核生物中表現的抗體、未糖基化抗體與任何抗原結合抗體片段和衍生物。各個重鏈含有1個重鏈可變區域(「HCVR」或「VH」)以及1個重鏈恆定區域(含有結構域CH1、CH2以及CH3)。各個輕鏈含有1個輕鏈可變區域(「LCVR」或「VL」)以及1個輕鏈恆定區域(CL)。 VH與VL區域可進一步分為具有超變異性的區域(命名為互補決定區域(complementarity determining regions,CDR))，散佈有較為保守的區域(命名為骨架區域(FR))。各個VH與VL由3個CDR以及4個FR所構成，以下列順序從胺基端往羧基端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鏈及輕鏈的可變區域含有與抗原交互作用的結合結構域。抗體的恆定區域可媒介免疫球蛋白結合至宿主組織或因子，包括免疫系統的各種細胞(例如效應細胞)及經典補體系統的第一組分(C1q)。

置換一或多個CDR殘基或刪除一或多個CDR也是可行的。在科學文獻中已描述就結合而言一或兩個CDR可以免除的抗體。Padlan等人(1995 FASEB J.9：133-139)根據已公開的晶體結構分析抗體及其抗原之間的接觸區域，並且推斷僅有約五分之一至三分之一的CDR殘基實際接觸到抗原。Padlan亦發現，許多抗體中一或兩個CDR沒有與抗原接觸的胺基酸(亦參見Vajdos et al.2002 J Mol Biol 320：415-428)。

不接觸抗原的CDR殘基可基於先前研究(例如CDRH2的殘基H60-H65通常是不需要的)，透過分子模型及/或按經驗由Chothia CDR以外的Kabat CDR區域鑑定出來。若刪除CDR或其殘基，其通常會被另一人類抗體序列佔有對應位置或此等序列之相等物的胺基酸所置換。CDR中的置換位置與待置換胺基酸亦可按 經驗選定。按經驗來說，置換可為保守性或非保守性置換。

如本文所用，術語抗體的「抗原結合片段」(或僅僅「結合部分」)意指保有能夠專一結合至其抗原(諸如hPCSK9)之抗體的一或多個片段。抗體的抗原結合功能已顯示可由全長抗體的片段來執行。涵括於術語抗體的「抗原結合片段」中的結合片段實例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL及CH結構域所組成的單價片段；(ii)F(ab’)₂片段，含有兩個位在樞紐區域的雙硫橋連接的Fab片段的雙價片段；(iii)由VH及CH結構域所組成的Fd片段；(iv)由抗體的一個單臂之VL及VH結構域所組成的Fv片段；(v)dAb片段(Ward et al.,(1989)Nature 341：544-546)，其由VH結構域所組成；(vi)分離的互補決定區域(CDR)，以及(vii)兩個或更多個分離CDR的組合，其可視情況藉由合成連接子接合。另外，儘管Fv片段的兩個結構域VL與VH是由分開的基因所編碼，但它們可以使用重組方法藉由合成連接子使其有如單一蛋白質鏈般被連接，其中VL及VH區域成對形成單價分子(已知為單鏈Fv(scFv)；參見例如Bird et al.(1988)Science 242：423-426；以及Huston et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883)。此等單鏈抗體亦欲涵括於術語抗體之「抗原結合片段」中。更多實例為結合結構域免疫球蛋白融合蛋白質，其含有(i)結合結構域多肽，其融合至免疫球蛋白樞紐區域多肽；(ii) 融合至樞紐區域的免疫球蛋白重鏈CH2恆定區域；以及(iii)融合至CH2恆定區域的免疫球蛋白重鏈CH3恆定區域。結合結構域多肽可以是重鏈可變區域或輕鏈可變區域。結合-結構域免疫球蛋白融合蛋白質更揭示於US 2003/0118592以及US 2003/0133939中。此等抗體片段可使用習於本技藝者所熟知的習知技術來獲得，且該等片段可採用與完整抗體相同的方式針對效用來進行篩選。「抗原結合片段」的更多實例係所謂微抗體，其是衍生自單CDR。例如，Heap等人描述一個衍生自抗HIV-1之gp120膜套糖蛋白之抗體的重鏈CDR3的17個胺基酸殘基微抗體(Heap CJ et al.(2005)J.Gen.Virol.86：1791-1800)。其他實例包括小抗體模擬物，其含有兩個或更多個較佳地藉由同源骨架區域彼此融合的CDR區域。這樣一種含有VH CDR1以及VL CDR3並藉由同源VH FR2連接的小抗體模擬物已為Qiu等人所描述(Qiu X-Q,et al.(2007)Nature biotechnology 25(8)：921-929)。

因此，如本文所用，術語「抗體或其抗原結合片段」意指免疫球蛋白分子以及免疫學上具有活性之免疫球蛋白分子的部分，亦即，含有免疫學專一地結合抗原的抗原結合部位的分子。

可用於本發明中的抗體及其抗原結合片段可來自於任何動物來源，包括鳥類及哺乳類動物。較佳地，抗體或片段是來自於人類、黑猩猩、嚙齒動物(例如小鼠、 大鼠、天竺鼠或兔子)、雞、火雞、豬、綿羊、山羊、駱駝、牛、馬、驢、貓或狗來源。尤其偏好的是人類或鼠來源的抗體。本發明抗體亦包括嵌合分子，其中衍生自一個物種(較佳為人類)的抗體恆定區域與衍生自另一個物種(例如小鼠)的抗原結合部位組合。另外，本發明抗體包含人類化分子，其中衍生自非人類物種(例如來自於小鼠)之抗體的抗原結合部位與人類來源之恆定與骨架區域組合。

如本文所例示，本發明抗體可直接得自於表現抗體的融合瘤，或可經選殖並在宿主細胞(例如CHO細胞或淋巴細胞)中重組表現。宿主細胞的更多實例包括微生物(諸如大腸桿菌)及真菌(例如酵母菌)。另外，它們可以在基因轉殖非人類動物或植物中重組地被製造。

術語「嵌合抗體」意指各重鏈及輕鏈的胺基酸序列的一部分與衍生自特定物種或屬於特定綱之抗體的對應序列為同源，而該鏈的其餘節段與另一物種或綱的對應序列為同源。一般而言，輕鏈及重鏈的可變區域模擬衍生自哺乳類動物的一種物種的抗體可變區域，而恆定部分與衍生自另一者的抗體序列為同源。這種嵌合形式的一個明顯優勢在於可變區域可便利地使用可取得的B細胞或融合瘤(來自非人類宿主生物與衍生自利如人類細胞製備物的恆定區域組合)從已知來源衍生而來。儘管可變區域具有易於製備且專一性不受來源影響的優勢，但是當抗體以來自非人類來源的恆定區域注射 時，人類恆定區域可能無法引起人類的免疫反應。但是，定義不受限於這個特定實例。

術語「人類化抗體」意指具有抗原結合部位的分子，其實質上是衍生自非人類物種的免疫球蛋白，其中該分子的其餘免疫球蛋白結構是以人類免疫球蛋白的結構及/或序列為基礎。此抗原結合部位可包含融合至恆定結構域上的完整可變結構域或僅有移植至可變結構域中的適當骨架區域之互補決定區域(CDR)。抗原結合部位可以是野生型或經一或多個胺基酸置換所修飾，例如修飾成更像人類免疫球蛋白。一些人類化抗體的形式保留所有CDR序列(利如人類化抗體，其含有來自小鼠抗體的全部六個CDR)。其他形式具有一或多個相對於原抗體有所變化的CDR。

用於使抗體人類化的各種方法對於習於技藝者來說是已知的，如同Almagro & Fransson所評論者，其上下文以全文併入本文作為參考文獻(Almagro JC and Fransson J(2008)Frontiers in Bioscience 13：1619-1633)。Almagro & Fransson區別合理方法及經驗方法。合理方法的特徵在於產生數個工程化抗體的變體並且評估它們的結合或任何其他感興趣的特性。若設計的變體無法得到預期結果，則開始一個設計與結合評估的全新循環。合理方法包含CDR移植、重整(resurfacing)、超人類化(superhumanization)以及人類字串符內容最佳化(Human String Content Optimization)。 相對地，經驗方法是根據產生大的人類化變體庫並且使用集富技術或高通量篩選來篩選最佳選殖株。因此，實驗方法端視能夠篩選大範圍抗體變體的可靠篩選及/或篩選系統而定。體外展示技術(諸如噬菌體展示及核糖體展示)滿足這些要件並為習於技藝者所熟知。經驗方法包括FR庫、導向篩選、骨架洗牌及Humaneering。

如本文所用，術語「人類抗體」意欲包括具有衍生自人類生殖細胞免疫球蛋白序列的可變與恆定區域。本發明的人類mAb可包括並非由人類生殖細胞免疫球蛋白序列所編碼的胺基酸殘基(例如體外藉由隨機或位址-專一性突變誘發或藉由體內體突變而引入突變)，例如在CDR中並且特別是在CDR3中。但是，如本文所用，術語「人類抗體」並非意欲要包括衍生自另一種哺乳類動物物種(諸如小鼠)的生殖細胞的CDR序列已被移植到人類FR序列上的mAb。本發明的人類抗體包括分離自人類免疫球蛋白庫，或來自經一或多個人類免疫球蛋白基因轉殖且不表現內源性免疫球蛋白的動物，例如由Kucherlapati & Jakobovits描述於U.S.Patent No.5,939,598。

如本文所用，術語「單株抗體」意指製備具有單分子組成的抗體分子。單株抗體對特定抗原決定位展現出單一結合專一性與親和力。在一個具體例中，單株抗體是藉由融合至永生細胞的融合瘤所生產，其包括由非人類動物(例如小鼠)所得之B細胞。

如本文所用，術語「重組抗體」包括所有藉由重組的方式製備、表現、製造或分離的抗體，諸如(a)分離自免疫球蛋白基因已基因轉殖或轉染色體之動物，或由其製備的融合瘤的抗體、(b)分離自經轉形以表現抗體之宿主(例如轉染瘤)的抗體、(c)分離自重組、組合抗體庫的抗體，以及(d)藉由任何其他涉及將免疫球蛋白基因序列剪接至其他DMA序列之方式製備、表現、製造或分離的抗體。

如本文所用，術語「轉染瘤」包括表現抗體的重組真核生物宿主細胞，諸如CHO細胞、NS/0細胞、HEK293細胞、HEK293T細胞、植物細胞或真菌，包括酵母菌細胞。

如本文所用，「異源性抗體」定義為關於製造諸如抗體的基因轉殖生物。此術語意指對應於彼等不同於基因轉殖生物的生物中所得到，與通常衍生自基因轉殖生物以外之物種的具有胺基酸序列或編碼核酸序列的抗體。

如本文所用，「異雜交(heterohybrid)抗體」意指具有不同生物來源的輕鏈及重鏈。例如，具有人類重鏈與鼠輕鏈締合之抗體為異雜交抗體。

因此，適用於本發明的「抗體及其抗原結合片段」包含(但不限於)多株、單株、單價、雙專一性、異結合、多專一性、重組、異源、異雜交、嵌合、人類化(特別是CDR-移植)、去免疫或人類抗體、Fab片段、Fab’片 段、F(ab’)₂片段、由Fab表現庫所製造的片段、Fd、Fv、雙硫連結的Fvs(dsFv)、單鏈抗體(例如scFv)、雙抗體或四抗體(Holliger P.et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90(14),6444-6448)、奈米抗體(亦已知為單結構域抗體)、抗特異性(抗-Id)抗體(包括，例如抗-Id抗體至本發明抗體)，以及上述任一者的抗原決定位結合片段。

本文所述抗體較佳地經分離。如本文所用，「分離抗體」欲意指實質上不含其他具有不同抗原專一性之mAb的抗體(例如專一結合hPCSK9的分離抗體實質上不含專一結合hPCSK9以外之抗原的mAb)。但是，專一結合hPCSK9的分離抗體可對其他抗原(例如來自於其他物種的PCSK9分子)具有交叉反應性。

如本文所用，「PCSK9拮抗劑」表示一種抑制PCSK9的至少一種生物活性(較佳係PCSK9的蛋白酶活性)的化合物。較佳PCSK9拮抗劑的特徵在於，當以化學計量來使用時，它們結合10%至100%存在於血液中的PCSK9，較佳係50%至100%。本發明的較佳PCSK9拮抗劑是中和抗體。

如本文所用，「中和抗體」(或「中和PCSK9活性的抗體」)欲意指抗體結合至hPCSK9會抑制PCSK9的至少一種生物活性，較佳係抑制PCSK9的蛋白酶活性。抑制PCSK9的生物活性可透過數種該技藝中已知標準體外或體內分析的一或多者藉由測量PCSK9生物活性的一或多種指標來評估。此等分析描述於例如US 2010/0166768 A1中，其內容以其全文併入本文作為參考文獻。

因為PCSK9會藉由增進LDL受體分解來增加血漿LDL膽固醇，故PCSK9活性對於與血漿LDL膽固醇濃度增加相關的數種疾病具有效用。因此，PCSK9拮抗劑，諸如中和抗-hPCSK9抗體或其抗原結合片段可用於降低升高的總膽固醇、非HDL膽固醇、LDL膽固醇，及/或脂蛋白元B100(ApoB100)。因此，PCSK9拮抗劑可用於改善、增進、抑制或預防數種此等疾病，包括(但不限於)高膽固醇血症、高血脂症、血脂異常、動脈粥狀硬化及心血管疾病。

在特定具體例中，本文所述之抗-PCSK9抗體或其抗原結合片段可結合至治療部分(therapeutic moiety)(「免疫結合物」)，諸如細胞毒素、化療藥劑、免疫抑制劑或放射同位素。

「保守性胺基酸置換」是一個胺基酸殘基置換成另一個具有類似化學特性(例如電荷或疏水性)之側鏈(R基團)胺基酸殘基。一般而言，保守性胺基酸置換基本上不會改變蛋白質的功能特性。若兩個或更多個胺基酸序列的不同處在於保守性置換，則相似性的百分比或程度可向上調整以校正置換的保守性特徵。用於調整的方式為習於本技藝者所熟知。參見，例如Pearson(1994)Methods MoI.Biol.24：307-331。具有類似化學特性側鏈之胺基酸群組的實例包括： 1)脂族側鏈：甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸及異白胺酸；2)脂族-羥基側鏈：絲胺酸及蘇胺酸；3)含醯胺側鏈：天冬醯胺酸及麩醯胺酸；4)芳族側鏈：苯丙胺酸、酪胺酸及色胺酸；5)鹼性側鏈：離胺酸、精胺酸及組胺酸；6)酸性側鏈：天冬胺酸及麩胺酸；以及7)含硫側鏈：半胱胺酸及甲硫胺酸。

較佳的保守性胺基酸置換群組為：纈胺酸-白胺酸-異白胺酸、苯丙胺酸-酪胺酸、離胺酸-精胺酸、丙胺酸-纈胺酸、麩胺酸-天冬胺酸與天冬醯胺酸-麩醯胺酸。另外，保守性取代是在Gonnet et al.(1992)Science 256：1443-45揭示的PAM250 log-可能度矩陣中具有正值的任何改變。根據已知的遺傳密碼，及重組與合成DNA技術，習於技藝的科學家可容易地建構出編碼保守性胺基酸變體的DNA。

如本文所用，「非保守性置換」或「非保守性胺基酸調換」定義為將一個胺基酸調換成另一個在上面所述7個標準胺基酸群組1)至7)之不同群組中所列的胺基酸。

術語「實質同一性」或「實質上相同」當意指核酸或其片段時，表示若加上適當核苷酸插入或刪除來與另一核酸(或其互補股)進行最佳比對時，核苷酸序列同一性為核苷酸鹼基的至少約90%，且更佳為至少約95%、 96%、97%、98%或99%，如藉由任何已知序列同一性演算法(諸如下面所述的FASTA、BLAST或GAP)所測量。

當應用於多肽時，術語「實質相似度」或「實質上相似」表示當兩個肽序列最佳化比對時(諸如藉由程式GAP或BESTFIT，使用預設空位權重)，具有至少90%序列同一性，更佳為至少95%、98%或99%序列同一性。較佳地，不相同的殘基位置差別在於保守性胺基酸置換。

關於多肽的序列相似度通常是使用序列分析軟體來測定。蛋白質分析軟體使用各種置換、缺失及其他修飾(包括保守性胺基酸置換)所指定的相似度計量法將類似序列相配對。例如，GCG軟體含有如GAP及BESTFIT的程式，其可在預設參數的情況下使用來決定緊密相關之多肽間的序列同源性或序列同一性，諸如來自不同生物物種或野生型蛋白質及其突變蛋白(mutein)之間的同源性多肽。參見，例如GCG第6.1版。多肽序列亦可使用FASTA在預設或建議參數下來進行比對；GCG第6.1版的程式。FASTA(例如FASTA2以及FASTA3)提供查詢序列與研究序列之間最佳重疊區域的比對與序列同一性百分比(Pearson(2000)上文)。當本發明序列與含有大量不同生物體之序列的資料庫相比對時，另一種較佳演算法是電腦程式BLAST，特別是BLASTP或TBLASTN，使用預設參數。參見例如Altschul et al. (1990)J.Mol.Biol.215：403 410以及(1997)Nucleic Acids Res.25：3389 402，其各自併入本文作為參考文獻。

當本申請案提及序列同一性百分比時，若未另外特別說明時，此等百分比計算為相對於較長序列的全長。此計算相對於較長序列的全長通用於核酸序列與多肽序列。

如本文所用，「治療」疾病或病症表示達到下列一或多者：(a)降低病症的嚴重性及/或持續時間；(b)限制或預防待治療病症之症狀性特徵形成；(c)抑制待治療病症之症狀性特徵惡化；(d)限制或預防先前已具有該病症之患者的病症復發；與(e)限制或預防先前已有病症症狀之患者的症狀復發。

如本文所用，「預防」疾病或病狀表示預防疾病在個體體內發生。

如本文所用，用詞「供投藥」及「要被投藥(is to be administered)」具有與「製備供投藥」相同的意思。換句話說，陳述活性化合物「供投藥」應理解為該活性化合物經調配並製成劑量，以使該活性化合物呈一種能夠展現其治療活性的狀態。

術語「治療有效量」或「治療量」欲表示會引起研究人員、獸醫師、醫師或其他臨床人員所研究之組織、系統、動物或人類的生物或醫學反應的藥劑或藥劑數量。術語「預防有效量」欲表示能預防或降低研究人員、獸醫師、醫師或其他臨床人員所研究之待預防組織、系 統、動物或人類之生物或醫學事件發生風險的藥劑數量。特別地，患者所接受的劑量是經選定，以達到所要降低LDL(低密度脂蛋白)膽固醇的數量；患者所接受的劑量亦可相對於時間滴定，以達到目標LDL濃度。使用本文所述抗體或抗原結合片段的劑量方案是依照包括下列的各種因素來選定：患者的種類、人種、年齡、體重、身體質量指數、性別及醫學狀況；待治療病況的嚴重度；所選供投藥化合物的效力；投藥途徑；投藥目的；以及患者的腎臟及肝臟功能。

如本文所用，「患者」表示任何人類或非人類動物，諸如任何可受益於使用本文所述抗體及其抗原結合片段治療的哺乳類動物、爬蟲類或鳥類。較佳地，「患者」是選自於由實驗動物(例如小鼠或大鼠)、馴養動物(包括，例如天竺鼠、兔子、雞、火雞、豬、綿羊、山羊、駱駝、牛、馬、驢、貓或狗)、嚙齒動物或靈長類動物(包括黑猩猩、大猩猩、倭黑猩猩與人類)所組成之群組。尤佳地，「患者」為人類。

術語「個體(subject)」或「個體(individual)」在本文中可交替地使用。如本文所用，「個體」意指人類或非人類動物(例如哺乳類動物、鳥類、爬蟲類、魚類、兩棲類或無脊椎動物類)；較佳地可受益於本發明之各種態樣(例如治療方法或本發明方法所鑑定出之藥劑)，或可用做實驗動物供鑑定或特徵化藥劑或治療方法的個體。該個體可以是，例如人類、野生動物、馴養動物 或實驗動物；例如包含：哺乳類動物，例如人類、非人類靈長類動物(黑猩猩、倭黑猩猩、大猩猩)、狗、貓、嚙齒動物(例如小鼠、天竺鼠、大鼠、倉鼠或兔子)、馬、驢、牛、綿羊、山羊、豬、駱駝；禽類，諸如鴨、鴿、火雞、鵝與小雞；爬蟲類動物，諸如：龜、陸龜、蜥蜴；兩棲類動物，諸如蛙(例如有爪蟾蜍)；魚類，諸如koy或斑馬魚；無脊椎動物，諸如蟲(例如線蟲)或昆蟲(諸如蒼蠅，例如黑腹果蠅)。術語個體亦包含禽類、魚類、爬蟲類或昆蟲的不同型態發育階段，包括卵、蛹、幼蟲或成蟲。若個體為患者更佳。

如本文所用，「單位劑量形式」意指且適於作為人類及/或動物個體之單一劑量的物理上分開的單位，各單位含有經計算會產生所要治療效用的預定量活性物質(例如約50至約500 mg的PCSK5抗體及/或約0.05 mg至100 mg HMG-CoA還原酶抑制劑)以及所需醫藥稀釋劑、載劑或媒劑。關於本發明新穎單位劑量形式的規格是由下列表示並直接相關：(a)活性物質及所達到特定治療效用的獨特性質，以及(b)如本說明書中所揭示，化合此等活性物質供治療動物或人類之用的技藝中固有的限制，其等為本發明的特徵。依據本發明，適當單位劑量形式的實例為小瓶、錠劑、囊劑、片劑、栓劑、粉劑小包、粉片、藥包、安瓿、前述任一者的分離多份，以及本文所述或該技藝中一般熟知的其他形式。抗體的一或多種此等單位劑量形式可包含本發明的製造物 品，視情況更包含一或多種HMG-CoA還原酶抑制劑的單位劑量形式(例如包含HMG-CoA還原酶抑制劑作為活性成分的氣泡錠劑)。

術語「活性物質」意指任何具有治療活性的物質，諸如一或多種活性成分。用作為治療劑的活性成分可採用醫藥物質(其本身在本技藝中可取得且可藉由已建立的步驟來製備)而易於製備在此等單位劑量形式中。

下列製備物例示說明製備本發明的活性成分以及單位劑量形式，且不為其限制。可製備數種劑量形式來實施本發明。例如，每小瓶的單位劑量可含有0.5 ml、1 ml、2 ml、3 ml、4 ml、5 ml、6 ml、7 ml、8 ml、9 ml、10 ml、15 ml或20 ml的約40至約500 mg PCSK5抗體之PCSK5抗體或其片段。若需要的話，此等製備物可藉由添加無菌稀釋劑至各小瓶中來調整至所欲濃度。在一個具體例中，本發明調配物的成分可呈分開或一起混合在單位劑量形式中的方式來提供，例如密封在容器(如指明活性劑數量的小瓶、安瓿或小袋(sachette))中的乾燥凍乾粉末或無水濃縮物。若藉由輸注投與組合物，可使用含有無菌醫藥級水或食鹽水的輸注瓶予以懸浮。若藉由注射投與組合物，可提供一安瓿的注射用無菌水或食鹽水以使得成分在投藥前混合。

本發明調配物包括用於製造醫藥組合物(例如適於投藥給個體或患者)的原料藥組合物，其可用於製備單位劑量形式。在較佳具體例中，本發明組合物係醫藥組 合物。此等組合物含有預防或治療有效量的一或多種預防或治療劑(例如本發明抗體或其他預防或治療劑)，以及醫藥上可接受的載劑。較佳地，醫藥組合物可調配成適於投藥給個體的途徑。

活性物質或成分(例如抗體或其片段及HMG-CoA還原酶抑制劑)可調配為各種劑量形式，包括固體劑量形式供經口投藥(諸如囊劑、錠劑、丸劑、粉劑與顆粒)、液體劑量形式供經口投藥(諸如醫藥上可接受的乳液、微乳液、溶液、懸浮液、糖漿與弛劑)、可注射製備物(例如無菌可注射水性或油性懸浮液)、用於直腸或陰道投藥的組合物(較佳為栓劑)，以及用於局部或穿皮投藥的劑量形式(諸如軟膏、糊劑、乳膏、乳劑、凝膠、粉劑、溶劑、噴霧劑、吸入劑或貼片)。

在特定具體例中，術語「醫藥上可接受」表示美國聯邦管理機構或州政府或EMA(歐洲醫藥局)所核准，或於美國藥典(United States Pharmacopeia-33/National Formulary-28 Reissue,published by the United States Pharmacopeial Convention,Inc.,Rockville Md.,publication date：April 2010)或其他一般所認可藥典列示用於動物，且特別是人類中。術語「載劑」意指一種與治療劑一起投與的稀釋劑、佐劑(例如佛氏佐劑(完全與不完全))、賦形劑或媒劑。此等醫藥載劑可以是無菌液體，諸如水及油，包括石油、動物、蔬菜或合成來源，諸如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油及類似物。當醫 藥組合物係靜脈內投與時，水是較佳的載劑。食鹽水溶液及水性右旋糖與甘油溶液亦可用作液體載劑，特別是用於可注射溶液。適當的醫藥賦形劑包括澱粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、米、麵粉、白堊、矽膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石、氯化鈉、脫脂奶粉、甘油、丙二醇、甘油、水、乙醇及類似物。關於(其他)賦形劑的使用及其用途亦參見“Handbook of _ Pharmaceutical Excipients”,fifth edition,R.C.Rowe,P.J.Seskey and S.C.Owen,Pharmaceutical Press,London,Chicago。若需要的話，組合物亦可含有微量濕潤或乳化劑，或pH緩衝劑。此等組合物可以採溶液、懸浮液、乳液、錠劑、丸劑、囊劑、粉劑、持續釋放調配物及類似物的形式。口服調配物可包括標準載劑，諸如醫藥級甘露醇、乳糖、澱粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鈉等。適當醫藥載劑的實例描述於E.W.Martin的"Remington's Pharmaceutical Sciences"中。此等組合物可含有預防或治療有效量的抗體，較佳地是呈純化形式的抗體，與適量的載劑以提供供適當投與給患者的形式。調配物應與投與模式相適配。

一般而言，本發明組合物的成分以分開或混合在一起的形式提供於單位劑量形式中，例如用於溶解的乾燥調配物，諸如密封容器(例如指明活性劑數量的安瓿或小袋)中的凍乾粉末、冷凍乾燥粉末或無水濃縮物。本發明組合物的成分亦可如密封容器(例如安瓿、小袋、 預填充注射器或自動注射器)，或用於可重複使用注射器或施用器(例如筆或自動注射器)之藥匣中的混合液體調配物(例如注射或輸注溶液)提供。若藉由輸注投與組合物，可使用含有無菌醫藥級水或食鹽水的輸注瓶予以懸浮。若藉由注射投與組合物，可提供一安瓿的注射用無菌水或食鹽水以使得成分在投藥前混合。

本發明亦提供包裝在密封容器(例如指明抗體數量的安瓿或小袋)中的調配物。在一個具體例中，含有抗體之本發明調配物以乾燥調配物的方式提供，諸如密封容器中且可復水(例如用水或食鹽水)至適當濃度供投與給個體的無菌凍乾粉末、冷凍乾燥粉末、噴霧乾燥粉末或無水濃縮物。在另一具體例中，抗體或其抗原結合片段以液體調配物的方式提供，諸如注射或輸注溶液。在一個具體例中，包含抗體之本發明調配物以至少40 mg、至少50 mg，更佳至少75 mg、至少100 mg、至少150 mg、至少200 mg、至少250 mg、至少300 mg、至少350 mg、至少400 mg、至少450 mg或至少500 mg抗體或其抗原結合片段呈乾燥調配物或密封於容器中的液體調配物的方式提供。包含抗體之本發明凍乾調配物應於其原容器中儲存在2至8℃下，且抗體應於復水後12小時內投與，較佳地6小時內、5小時內、3小時內或1小時內。包含抗體之本發明調配物可調配為中性或鹽形式。醫藥上可接受的鹽包括與陰離子(諸如衍生自氫氯酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等)形成的鹽以 及與陽離子(諸如衍生自鈉、鉀、銨、鈣、氫氧化鐵、異丙胺、三乙胺、2-乙胺乙醇、組胺酸、普魯卡因等)形成的鹽。

若成體個體具有收縮壓大於140 mmHg及/或舒張壓大於90 mmHg，則其被認為具有「高血壓」或「血壓高」。

可由本發明治療方法治療的特定族群包括具有下列病況中之一或多者的個體：具有LDL血漿離析術(LDL apheresis)徵象的個體、具有PCSK9活化突變(獲得功能突變「GOF」)的個體、具有總膽固醇濃度升高的個體、具有低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)濃度升高的個體、具有原發性高膽固醇血症的個體(諸如具有家族性或非家族性原發性高膽固醇血症的個體)、具有異型合子家族性高膽固醇血症(heFH)的個體；具有高膽固醇血症的個體，特別是原發性高膽固醇血症，其對史塔丁具有耐受性或不受史塔丁控制；以及處於高膽固醇血症發病風險下的個體，其可經預防性治療。其它徵象包括高血脂症及血脂異常，特別是若與諸如第2型糖尿病、膽汁鬱滯性肝病(原發性膽性肝硬化)、腎徵候群、甲狀腺機能低下症、肥胖症的次發性病因相關者；以及預防或治療動脈粥狀硬化與心血管疾病，諸如冠心病(CHD)。針對以上族群或個體所列的病況或病症是特別適於使用本發明抗體來治療的病況或病症。

但是，視前述疾病及病況的嚴重性而定，使用本發 明抗體及抗原結合片段來治療個體可能限於某些疾病或病況。

術語「反效應」(或副作用)意指因為給藥所引起的有害及非所要的效應。若就主要或治療效應來說被判斷為次發性時，反效應可稱為「副作用」。某些反效應僅發生在治療開始、增加或中斷之時。反效應可能造成疾病的某些併發症並負面地影響其預後。副作用的實例為過敏反應、嘔吐、頭痛或暈眩或本文所述任何其他效應。

如本文所用，「治療」疾病或病症表示達到下列之一或多者：(a)降低病症的嚴重性及/或持續時間；(b)限制或預防待治療病症之症狀性特徵形成；(c)抑制待治療病症之症狀性特徵惡化；(d)限制或預防先前已具有該病症之患者的病症復發；與(e)限制或預防先前已有病症症狀之患者的症狀復發。

如本文所用，「預防」疾病、病況或病症表示預防病狀、疾病或病況在個體體內發生。

人類的總膽固醇濃度升高在本發明上下文內理解為總膽固醇濃度為200 mg/dL或更高，特別是240 mg/dL或更高，LDL-C濃度升高在本發明上下文內理解為LDL-C濃度為100 mg/dL或更高，較佳地mg/dL或更高，較佳地160 mg/dL或更高，諸如190 mg/dL或更高。高密度脂蛋白濃度(HDL-濃度)在本發明上下文內理解為少於約40 mg/dL。

術語「樣品」或「取得樣品」在本文中係同義地使 用，且應理解為在本發明之不同態樣的上下文內，較佳地意指生物樣品。術語「樣品」或「感興趣的樣品」在本文中交替地使用，意指欲代表整個組織、器官或個體的一小部分。在分析時樣品提供關於組織狀態或器官或個體之健康或罹病狀態的資訊。樣品的實例包括(但不限於)液體樣品(諸如腦脊髓液、血液、血清、血漿、滑液、尿液、唾液及淋巴液)，或固體樣品(諸如生檢樣品)、組織與組織萃取物(例如取自於神經組織(例如來自脊髓)、皮膚、肌肉、軟骨、骨、滑膜、軟骨膜、囊與結締組織)。樣品的更多實例為細胞培養物或組織培養物，例如(但不限於)神經細胞的培養物。

分析樣品可依據視覺或化學基礎來達致。視覺分析包括(但不限於)容許評估樣品型態之組織、器官或個體的顯微鏡成像或射線照相掃描。化學分析包括(但不限於)偵測特定指標存在或不存在，或其數量或濃度改變。例如，組織樣品可藉由習知生檢技術自個體移除，或血液樣品可藉由習知集血技術自個體取得。樣品，例如組織或血液樣品，可在開始治療性療法(例如使用減輕疼痛的化合物)之前、在治療性療法期間，及/或在治療性療法之後自個體取得。

該樣品較佳為血液樣品、組織樣品、細胞群落樣品、單細胞樣品或細胞培養物樣品。組織樣品更佳為切片或外植體(explant)樣品，例如背根神經節或脊髓的外植體樣品。術語「體液樣品」意指衍生自個體身體的液 體樣品。該體液樣品可以是血液、尿液、腦脊髓液、耳垢(耵聹)、內淋巴液、外淋巴液、胃液、黏液、腹膜液、胸水、唾液或脂(皮膚油脂)樣品，包括其成分或部分。該體液樣品可混合或集中。因此，體液樣品可以是血液樣品與尿液樣品的混合物，或血液樣品與腦脊髓液樣品的混合物。「體液樣品」可藉由自個體移出體液而提供，但亦可藉由使用先前分離的體液樣品材料來提供。較佳地，個體之血液樣品為全血或血液部分，諸如血清或血漿。亦較佳的是使用血球(亦已知為造血細胞)。

較佳地，組織樣品的重量介於0.1至500 mg，更佳地介於0.5至250 mg，且最佳地介於1至50 mg，例如0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、2.5、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、或500 mg。

亦較佳地，細胞樣品(例如細胞群落樣品或細胞培養物樣品)由介於100至1000個細胞，較佳地介於200至800個細胞，且最佳地介於400至600個細胞所組成。

又更佳地，體液樣品具有介於0.1至20 ml的體積，更佳地介於0.5至10 ml，更佳地介於1至8 ml且最佳地介於2至5 ml，例如0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、2.5、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20 ml。更佳 地，血液樣品具有介於0.1至20 ml的體積，更佳地介於0.5至10 ml，且最佳地介於1至5 ml，例如0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、2.5、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20 ml。

在本發明的上下文內，術語「部件的套組(簡言之為「套組」)」應理解為製造物品，其含有兩種或更多種本申請案所發現之組分的組合，其組合成在空間上共同存在的功能單位且含有其他組分。

在本發明的上下文內，術語「顯著效應」表示任何不同於(任何)實驗背景噪音的效應。若測試化合物對於測試系統具有顯著效應，則該測試化合物被鑑定為例如調節膽固醇濃度的化合物。就此，比較測試化合物與對照(特別是陰性對照)的效用。在藥劑篩選時有(統計學上)顯著效應是例如高於或低於實驗平均值且同時亦高於或低於標準偏差(例如高於或低於實驗平均值(在實驗中具有2個或3個測定值的情況下)加上/減去3倍標準偏差(平均值±3SD))的效應。習於技藝者知道如何區別顯著效應與背景噪音或實驗偏差。

如本文所用，術語「拮抗劑」意指阻斷促效劑作用的物質。一般來說，拮抗劑藉由結合至受體分子的活性部位或異位部位，或與通常不涉入調節受體活性之獨有結合部位交互作用來作用。一般來說，拮抗劑與促效劑在結構限定結合部位相競爭。拮抗劑活性可逆轉或不可 逆轉，端視拮抗劑-受體複合物的交互作用時間長度而定。拮抗劑的實例包括(但不限於)核酸分子(諸如siRNA或miRNA)，或蛋白質(諸如激素、細胞激素、生長因子或神經傳導物質)、抗體或轉錄因子。

發明具體例

現將進一步說明本發明。在下面段落中，更詳盡地定義本發明的各種態樣。除非清楚表示為相反意思，否則如此處所定義的各態樣可與任何其他態樣組合。特別地，除非清楚表示為相反意思，否則表示為較佳或有利的任何特徵可與任何其他表示為較佳或有利的特徵組合。

在第一個態樣中，本發明是有關用於篩選化合物的方法，以鑑定用於調節與LDL-C濃度升高相關之疾病或病況的治療候選物，該方法包含：(a)提供嚙齒動物，(b)將測試化合物投與該嚙齒動物，及(c)偵測該化合物在該嚙齒動物體內相較於對照嚙齒動物是否增加或降低一或多個選自由以下組成之群組的參數：總膽固醇(TC)、低密度膽固醇(LDL-C)及高密度膽固醇(HDL-C)；其中調節該一或多個參數表示該化合物是用於在體內調節該疾病或病況的候選物。

在此態樣中，該對照嚙齒動物為與嚙齒動物不同的 動物，亦即不同的個體。亦可在兩個或更多個對照動物中測定膽固醇濃度並在此兩個或更多個對照動物中計算膽固醇濃度的平均值。

在第二個態樣中，本發明是有關一種用於篩選化合物的方法，以鑑定用於調節與LDL-C濃度升高相關之疾病或病況的治療候選物，該方法包含：(a)提供嚙齒動物，(b)將測試化合物投與該嚙齒動物，(c)在以該化合物處理該嚙齒動物之前，測定該嚙齒動物的一或多個選自由以下組成之群組的參數：總膽固醇(TC)、低密度膽固醇(LDL-C)及高密度膽固醇(HDL-C)，(d)在以該化合物處理該嚙齒動物之後，測定該一或多個參數，及(e)比較(a)中所得到的結果與(b)中所得到的結果，其中相較於(b)的結果，(a)參數的改變表示該化合物是用於在體內調節該疾病或病況的候選物。

在此態樣中，比較在投與該測試化合物之後嚙齒動物的膽固醇濃度與相同動物體內膽固醇在投藥前的膽固醇濃度。

依據第一及第二個態樣的較佳具體例，參數是體外於一或多個嚙齒動物的取得樣品中測得。

在已將化合物(抗體或史塔丁)投與給嚙齒動物之後測定參數或取得樣品，較佳是在化合物足夠展現其效應 的一段時間之後投與或取樣的方式來安排時間。

在採用對照嚙齒動物或自其所得之樣品作為比對的具體例態樣中，若對照嚙齒動物取得安慰劑(較佳除了活性成分本身以外，含有與含投與化合物調配物相同的成分)是適宜的。另外，若安慰劑投藥及取樣及/或參數測定同時發生或在測試嚙齒動物接受化合物之時發生是適宜的。投與的安慰劑較佳地具有相同的調配物(液體或固體，緩衝組合物)且經由相同途徑投與(例如口服、經口、局部或經注射)，並具有相同的單位劑量形式(例如特定體積的液體或錠劑等)。

本發明的另一較佳具體例涉及基於如第一個態樣之方法的步驟(c)與第二個態樣之步驟(c)、(d)與(e)的體外方法。

依據前兩個態樣的另一較佳具體例，調節一或多個參數表示在其他哺乳類動物(諸如人類)或爬蟲類動物或鳥類中具有相同的體內效應。

依據前兩個態樣的另一較佳具體例，總膽固醇及/或LDL-C降低及/或HDL-C增加表示該化合物在體內是治療或預防一或多種該疾病或病況的候選物，且其中總膽固醇及/或LDL-C增加表示該化合物表現出反效應且是在體內促進或誘發該疾病或病況之一或多者的候選物。

LDL-C濃度與總膽固醇濃度降低，以及HDL-C濃 度增加和發生與其聯結之疾病(例如高血脂症、心血管疾病等)的風險降低相關，在測試嚙齒動物體內該等參數降低表示該測試化合物可作為治療或預防此等疾病之一或多者的藥劑。

總C與LDL-C濃度增加與此等病症發病相關聯，本發明方法容許鑑定測試化合物的反效應。以此方法，本發明與動物模型亦適於測試欲用於治療與LDL-C濃度升高相聯結的其他疾病之候選化合物對於脂肪代謝是否具有可能的反效應。儘管HDL-C濃度降低可能是一個這樣的參數，但這個參數在本發明嚙齒動物測試模型中似乎不具有指標意義(參見實例段)。

在本發明不同態樣中所用的化合物可以是任何活性物質，諸如任何生物或化學物質或天然產物萃取物，不論是經純化、經部分純化、合成或由生化或分生方法所製造(例如生物分子，諸如蛋白質[例如抗體、非抗體蛋白質骨架，例如卓呯(darpin)、抗運載蛋白(anticalin)、雙抗體、親合體(affibody)等)]、核酸[例如反義、siRNA或適體]或小分子)。依據一個具體例，化合物為HMG-CoA還原酶抑制劑，例如史塔丁。

依據本發明不同態樣的一個較佳具體例，HMG-CoA還原酶抑制劑為史塔丁。更佳地，史塔丁是選自於由西立伐他汀(cerivastatin)、阿托伐他汀(atorvastain)、辛伐他汀(simvastatin)、匹伐他汀(pitavastatin)、羅蘇伐他汀(rosuvastatin)、氟伐他汀 (fluvastatin)、洛伐他汀(lovastatin)及普伐他汀(pravastatin)所組成之群組。

化合物可以是單獨活性成分或包含於調配物或醫藥組合物或混合物中，其視情況含有一或多種其他活性成分或與一或多種其他活性成分組合。

化合物可以任何劑量與施用方案且以任何適於使用在嚙齒動物中的投藥途徑來投與。投藥途徑亦永遠視投與的化合物及其較佳調配物(例如液體或固體)而定。依據本發明的較佳投藥方案為每天1次、每天2次或每天3次、每天、每隔一天、1週1次、每隔1週1次或每月1次。適當的投藥途徑包括，例如口服投與、經口投與、局部投與、注射(例如靜脈內、肌肉內、腹膜內或皮下)或輸注。

用於嚙齒動物之適宜抗體劑量為例如數量為約0.5 mg/kg體重至約15 mg/kg體重，且較佳地在濃度約0.8 mg/kg體重至約13 mg/kg體重的範圍內，而較佳地在濃度約0.5 mg/kg、約1 mg/kg體重、約2 mg/kg、約3 mg/kg、約4 mg/kg、約5 mg/kg、約6 mg/kg、約7 mg/kg、約8 mg/kg、約9 mg/kg、約10 mg/kg、約11 mg/kg、約12 mg/kg或約13 mg/kg體重。依據又一較佳具體例，抗體以約1 mg/kg體重、約3 mg/kg體重或約10 mg/kg體重的數量投與給嚙齒動物，較佳為倉鼠。

較佳地，將此一劑量的抗體投與給嚙齒動物1次、1週1次、每隔1週或1個月1次。對抗體而言，較佳 的投藥途徑為，例如皮下注射。

依據本發明前兩個或其他態樣的一個具體例，相較於參考(例如相較於具有平均PCSK9濃度的嚙齒動物，其代表相同物種及/或相同健康狀態及/或相同品系及/或相同性別的嚙齒動物)，嚙齒動物具有PCSK9濃度降低或PCSK9活性降低。例如，若嚙齒動物為倉鼠(例如敘利亞倉鼠，諸如雄性敘利亞倉鼠)，PCSK9濃度或活性降低的嚙齒動物具有比一般倉鼠(較佳為一般敘利亞倉鼠)或一般雄性倉鼠或一般雄性敘利亞倉鼠或具有相同健康狀態之一般倉鼠(例如正常血脂或健康)或約相同年齡的一般倉鼠(例如一般雄性敘利亞倉鼠)明顯還低(例如，低至少5%、10%、15%、20%、25%或30%)的PCSK9濃度(較佳為蛋白質濃度)或活性(例如蛋白質活性)。

依據另一具體例，本發明是有關一種態樣1或2的方法，其中PCSK9的拮抗劑及較佳地專一結合至PCSK9的抗體在步驟(c)之前被投藥給如態樣1的嚙齒動物，或在步驟(a)之前被投藥給如態樣2的嚙齒動物。較佳地，相同濃度(以mg/kg體重測量)的抗體或其抗原結合片段在態樣1中被投與給嚙齒動物以及對照動物。相同地，可以使用PCSK9拮抗劑(諸如PCSK9抗體或其抗原結合片段)刺激兩種或更多種嚙齒動物，以測定此兩種或更多種嚙齒動物的膽固醇濃度並計算在此兩種或更多種嚙齒動物的膽固醇濃度平均值。

依據本發明不同態樣的一個較佳具體例，化合物為降脂化合物，諸如降低LDL-C濃度的化合物，例如HMC-CoA還原酶的抑制劑，且較佳為史塔丁，其中史塔丁較佳地選自由西立伐他汀、阿托伐他汀、辛伐他汀、匹伐他汀、羅蘇伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀或普伐他汀所組成之群組。

若化合物為HMG-CoA還原酶抑制劑(諸如史塔丁)，較佳的日劑量為約10 mg/kg至約60 mg/kg，較佳約15 mg/kg至約50 mg/kg日劑量，且更佳約20 mg/kg至約40 mg/kg日劑量，例如約10 mg/kg日劑量、約20 mg/kg日劑量、約30 mg/kg日劑量、約40 mg/kg、約50 mg/kg或約60 mg/kg日劑量。在其他較佳具體例中，投與日劑量的HMG-CoA還原酶抑制劑(例如史塔丁)每日2次(或每日2次)投藥方案，例如每天2次約5 mg/kg至約30 mg/kg每單次劑量(亦即約10 mg/kg至約60 mg/kg日劑量)，或每天2次約10 mg/kg至約20 mg/kg每單次劑量(亦即約20 mg/kg至約40 mg/kg日劑量)，且較佳地約每天2次10 mg/kg或每天2次15 mg/kg或每天2次20 mg/kg或每天2次25 mg/kg，而更佳地約每天2次10 mg/kg或約每天2次20 mg/kg。

在本發明不同態樣的又一較佳具體例中，史塔丁為：-西立伐他汀，以介於0.05 mg至2 mg的日劑量投與，較佳為0.2 mg、0.4 mg或0.8 mg的日劑量； -阿托伐他汀，以介於2 mg至100 mg的日劑量投與，較佳為10 mg、20 mg、40 mg或80 mg的日劑量；-辛伐他汀，以介於2 mg至100 mg的日劑量投與，較佳為5 mg、10 mg、20 mg、40 mg或80 mg的日劑量；-匹伐他汀，以介於0.2 mg至100 mg的日劑量投與，較佳為1 mg、2 mg、5 mg、10 mg或20 mg的日劑量；-羅蘇伐他汀，以介於2 mg至100 mg的日劑量投與，較佳為5 mg、10 mg、20 mg或40 mg的日劑量；-氟伐他汀，以介於2 mg至100 mg的日劑量投與，較佳為20 mg、40 mg或80 mg的日劑量；-洛伐他汀，以介於2 mg至100 mg的日劑量投與，較佳為10 mg、20 mg、40 mg或80 mg的日劑量；或-普伐他汀，以介於2 mg至100 mg的日劑量投與，較佳為10 mg、20 mg、40 mg或80 mg的日劑量。

依據另一較佳具體例，日劑量的史塔丁以1天2次投藥被投與給嚙齒動物(亦即每天2次投藥，其包含一部分(例如一半)日劑量且一起含有全日劑量)。

在第三個態樣中，本發明涉及一種測試專一結合至hPCSK9之抗體或其抗原結合片段供治療與LDL-C濃度升高相關之疾病或病況之效力的方法，該方法包含：(a)將該抗體投與給嚙齒動物；及(b)在將該抗體或其抗原結合片段投與給該嚙齒動物之前與之後測定該嚙齒動物的總膽固醇、LDL-C或 HDL-C濃度，其中相對於在投與該抗體之前所測得之投藥前濃度，在投與該抗體之後總膽固醇及/或LDL-C濃度降低，及/或HDL-C濃度升高表示該抗體或其抗原結合片段有效治療該疾病或病況，以及其中相對於在投與該抗體之前所測得之投藥前濃度，在投與該抗體之後總膽固醇濃度及/或LDL-C濃度增加表示該抗體在體內對於引起、促進或誘發該疾病或病況表現出反效應。

在第四個態樣中，本發明涉及一種測試專一結合至hPCSK9之抗體或其抗原結合片段供調節與LDL-C濃度升高相關之疾病或病況之效力的方法，該方法包含：(a)在以該抗體治療嚙齒動物之前，測定得自嚙齒動物之體外樣品中的總膽固醇濃度、LDL-C濃度及/或HDL-濃度，(b)在以該抗體治療嚙齒動物之後，測定得自嚙齒動物之體外樣品中的總膽固醇濃度、LDL-C濃度及/或HDL-濃度，及(c)比較(a)中所得到的結果與(b)中所得到的結果，其中相對於在投與該抗體之前於(a)中所測得之投藥前濃度，在(b)中所測得之總膽固醇及/或LDL-C濃度降低，及/或HDL-C濃度增加表示該抗體或其抗原結合片段有效治療及/或預防該疾病或病況，以及其中相較於在(a)中所測得之投藥前濃度，在(b)中 之總膽固醇濃度及/或LDL-C濃度增加表示該抗體在體內對於引起、促進或誘發該疾病或病況表現出反效應。

依據第三或第四個態樣的一個較佳具體例，嚙齒動物已被投與在人類體內降低總膽固醇及/或LDL-C濃度及/或增加HDL-C濃度的化合物，且其中該化合物在態樣3方法中在測定給藥前濃度之前並在態樣4步驟(a)中取得樣品之前投與化合物。依據一個具體例，該化合物為史塔丁，例如阿托伐他汀。

在第五個態樣中，本發明涉及一種測試專一結合hPCSK9之抗體或其抗原結合片段供治療與LDL-C濃度升高相關之疾病或病況之效力的方法，該方法包含：(a)將該抗體投與給嚙齒動物；及(b)在投與該抗體或其抗原結合片段之後，藉由測定嚙齒動物的總膽固醇濃度及/或LDL-C濃度及/或HDL-C濃度來決定該抗體或其抗原結合片段的效力，(c)測定未以該抗體處理且較佳地獲得安慰劑之對照嚙齒動物的總膽固醇濃度及/或LDL-C濃度及/或HDL-C濃度，其中若(c)中所測得的總膽固醇濃度及/或LDL-C濃度比(b)中所測得者還低，且及/或(c)中所測得的HDL-C濃度比(b)中所測得者還高，則該抗體被認為是有效治療該疾病或病況，以及其中若(c)中所測得的總膽固醇濃度及/或LDL-C濃 度比(b)中所測得者還高，則該抗體被認為是表現反效應。

在第六個態樣中，本發明涉及一種在體外測試專一結合hPCSK9之抗體或其抗原結合片段供治療與LDL-C濃度升高相關之疾病或病況之效力的方法，該方法包含：(a)測定在將該抗體或其抗原結合片段投與至嚙齒動物之後所得嚙齒動物樣品中的總膽固醇濃度及/或LDL-C濃度及/或HDL-C濃度，(b)測定得自未以該抗體或其抗原結合片段處理之嚙齒動物的對照樣品中的總膽固醇濃度及/或LDL-C濃度及/或HDL-C濃度，其中若(b)中所測得的總膽固醇濃度及/或LDL-C濃度比(a)中所測得者還低，且及/或(b)中所測得的HDL-C濃度比(a)中所測得者還高，則該抗體被認為是有效治療該疾病或病況，以及其中若(b)中所測得的總膽固醇濃度及/或LDL-C濃度比(a)中所測得者還高，則該抗體被認為是表現反效應。

依據第五或第六個態樣的一個較佳具體例，嚙齒動物及對照嚙齒動物已被投與在人類體內降低總膽固醇及/或LDL-C及/或增加HDL-C的化合物。

依據第五或第六個態樣的另一較佳具體例，該化合物為HMG-CoA還原酶抑制劑，且較佳為史塔丁。

在第七個態樣中，本發明涉及一種測試化合物調節個體膽固醇濃度之效力的方法，該方法包含下列步驟：(a)提供嚙齒動物；(b)將專一結合PCSK9的抗體或其抗原結合片段投與給該嚙齒動物；(c)將測試化合物投與給該嚙齒動物；(d)在投與該測試化合物之後，測定該嚙齒動物的一或多個選自由以下組成之群組的參數：總膽固醇濃度、LDL-C濃度或HDL-C濃度，(e)測定未以該測試化合物刺激之對照嚙齒動物的一或多個相同參數，其中在(a)中所測得與(b)中所測得的膽固醇(總膽固醇或LDL-C或HDL-C)有差異表示該測試化合物有效調節個體的膽固醇濃度。

在第八個態樣中，本發明涉及一種在體外測試化合物調節個體膽固醇濃度之效力的方法，該方法包含下列步驟：(a)測定在已對嚙齒動物施用測試化合物之後取得之嚙齒動物樣品的一或多個選自由以下組成之群組的參數：總膽固醇濃度、LDL-C濃度或HDL-C濃度，(b)測定未以該測試化合物刺激之對照嚙齒動物樣品的一或多個相同參數，其中除了測試化合物之外，動物皆投與專一結合PCSK9之抗體或其抗原結合片段，以及 其中在(a)中所測得與(b)中所測得的膽固醇(總膽固醇及/或LDL-C及/或HDL-C)有差異表示該測試化合物有效調節個體的膽固醇濃度。

依據本發明第七或第八個態樣的一個較佳具體例，相較於對照嚙齒動物的總、LDL或HDL膽固醇濃度，嚙齒動物或其樣品中所測得之膽固醇(總膽固醇及/或LDL-C)濃度降低及/或HDL-C濃度增加表示該測試化合物有效治療或預防在個體體內與LDL-C濃度升高相關之疾病或病症之一或多者；及相較於對照嚙齒動物的總或LDL膽固醇濃度，測試嚙齒動物或其樣品中所測得之膽固醇(總膽固醇及/或LDL-C)濃度增加表示該測試化合物具有反效應且可能引起、促進或誘發與LDL-C濃度升高相關之疾病或病況。

在第九個態樣中，本發明涉及一種測試化合物調節個體膽固醇濃度之效力的方法，該方法包含下列步驟：(a)提供嚙齒動物；(b)將專一結合PCSK9的抗體或其抗原結合片段投與給該嚙齒動物；(c)將測試化合物投與給該嚙齒動物；(d)測定該嚙齒動物的一或多個選自由以下組成之群組的參數：總膽固醇濃度、LDL-C濃度或HDL-C濃度，(i)將測試化合物投與給該嚙齒動物之前，及 (ii)將測試化合物投與給該嚙齒動物之後，(e)比較(d)(ii)與(d)(ii)中所得到的參數，其中在(d)(ii)中所得參數與(d)(ii)中所得參數有差異表示該測試化合物有效調節個體的膽固醇濃度。

在第十個態樣中，本發明涉及一種在體外測試化合物調節個體膽固醇濃度之效力的方法，該方法包含下列步驟：(a)測定一或多個選自由以下組成之群組的參數：總膽固醇濃度、LDL-C濃度或HDL-C濃度，(i)將測試化合物投與給該嚙齒動物之前所得之嚙齒動物樣品中，以及(ii)將測試化合物投與所得之相同嚙齒動物樣品中，及(b)比較(d)(ii)與(d)(ii)中所得到的參數，其中該嚙齒動物已投與專一結合PCSK9之抗體或其抗原結合片段以及測試投與化合物，及其中在(d)(ii)中所得參數與(d)(ii)中所得參數有差異表示該測試化合物有效調節個體的膽固醇濃度。

依據第九或第十個態樣的一個較佳具體例，相較於(i)，(ii)中的膽固醇(總膽固醇或LDL-C)濃度降低及/或HDL-C濃度增加表示該測試化合物有效治療或預防在個體體內與LDL-C濃度升高相關之疾病或病症之一或多者。

依據第九或第十個態樣的另一較佳具體例，相較於 (i)，(ii)中的膽固醇(總膽固醇或LDL-C)濃度增加表示該測試化合物具有反效應且可能引起、促進或誘發在個體體內與LDL-C濃度升高相關之疾病或病況之一或多者。

依據本發明第九及第十個態樣與其他態樣的另一較佳具體例使用測試嚙齒動物及對照嚙齒動物，對照嚙齒動物是來自於與測試嚙齒動物相同的物種，且較佳地亦來自與測試嚙齒動物相同的品系。另外，若對照嚙齒動物及測試嚙齒動物具有相同性別及/或約略同齡及/或健康狀態及/或體重較佳。在一實例中，測試嚙齒動物及對照嚙齒動物為雄性敘利亞倉鼠。

依據第九及第十個態樣的一個具體例，測試化合物為PCSK9抑制劑(諸如PCSK9抗體)或HMG-CoA還原酶抑制劑(例如史塔丁)。

依據本發明不同態樣的較佳具體例，其中抗體被投與給嚙齒動物(例如倉鼠)，該抗體以約0.5 mg/kg體重至約15 mg/kg體重的數量被投與給嚙齒動物，而較佳地呈約0.8 mg/kg體重至約13 mg/kg體重的濃度，及較佳呈約0.5 mg/kg、約1 mg/kg體重、約2 mg/kg、約3 mg/kg、約4 mg/kg、約5 mg/kg、約6 mg/kg、約7 mg/kg、約8 mg/kg、約9 mg/kg、約10 mg/kg、約11 mg/kg、約12 mg/kg或約13 mg/kg體重的濃度。依據又一較佳具體例，抗體以約1 mg/kg體重、約3 mg/kg體重或約10 mg/kg體重的數量被投與給嚙齒動物，較佳為倉鼠。

依據第一、第三、第五、第七或第九個態樣的較佳 具體例，膽固醇的參數或濃度是在取得樣品中測定。

測定膽固醇濃度(諸如總膽固醇濃度、HDL-膽固醇濃度或LDL-膽固醇濃度)在本技藝中為已知，且包含，例如比色、光度、螢光、重力或光譜法。

嚙齒動物的取得樣品可衍生自嚙齒動物的任何部分(器官，(固體或液體)組織等)，其通常含有膽固醇(諸如肝臟或體液，例如血液、血漿或血清)。習於技藝者知道如何自嚙齒動物(例如由倉鼠)獲得該等樣品(例如取得血液)、製備它們(若需要的話)以及測定其中的膽固醇濃度(例如使用商業套組，參見實例段落)。

儘管本發明方法是使用嚙齒動物來進行，各方法的結果可解釋為表示該方法中所用動物或物種以外的其他動物或物種，諸如所用物種的其他嚙齒動物、所用物種的其他哺乳類動物及較佳地表示人類。

依據本發明態樣，與LDL-C濃度升高相關的疾病或病況可以是任何典型與LDL-C濃度升高相關的疾病或病況，且較佳為在人類中與LDL-C濃度升高相關的病況，諸如高膽固醇血症、高血脂症、血脂異常、動脈粥狀硬化、心血管疾病，特別是原發性高膽固醇血症、家族性高膽固醇血症或不受史塔丁控制的高膽固醇血症。

在第十一個態樣中，本發明是有關一種用於鑑定供治療與膽固醇濃度升高相關(且較佳地是與LDL-C濃度升高相關)之疾病的藥劑的嚙齒動物，其中嚙齒動物相 較於對照嚙齒動物的PCSK9濃度降低。

在本發明的不同態樣及具體例中，相較於參考(例如相較於參考嚙齒動物或衍生自一般嚙齒動物的參考值，例如一或多種具有平均PCSK9濃度的嚙齒動物，其代表相同物種及/或相同健康狀態及/或相同品系及/或相同性別的嚙齒動物)，嚙齒動物的PCSK9濃度降低或PCSK9活性降低。例如，若嚙齒動物為倉鼠(例如敘利亞倉鼠，諸如雄性敘利亞倉鼠)，PCSK9濃度或活性降低的嚙齒動物具有比一般倉鼠(較佳為一般敘利亞倉鼠)或一般雄性倉鼠或一般雄性敘利亞倉鼠或具有相同健康狀態之一般倉鼠(例如正常血脂或健康)或約相同年齡的一般倉鼠明顯還低(例如，低至少5%、25%、30%、50%、70%或至少80%)的PCSK9濃度(較佳為蛋白質濃度)或活性(例如蛋白質活性)，且較佳具有比一般雄性敘利亞倉鼠明顯還低的PCSK9濃度或活性。

在第十二個態樣中，本發明是有關相較於對照嚙齒動物PCSK9濃度降低之嚙齒動物的用途，其係作為模型系統供測定藥劑調節膽固醇的效用，且較佳地係降低膽固醇的效用。在第十一或第十二個態樣的一個較佳具體例中，該藥劑為HMG-CoA還原酶抑制劑，諸如史塔丁。

依據第十一個態樣的一個較佳具體例，嚙齒動物用於如態樣1、2、7、8、9或10之一者的方法中。

依據另一較佳具體例，用於本發明不同態樣中之具 有PCSK9濃度或活性降低之嚙齒動物的PCSK9濃度或活性降低是由於遺傳剔除PCSK9、穩定或暫時抑制PCSK9或投與PCSK-9拮抗劑所致。

PCSK9拮抗劑包含小分子或生物分子，諸如抗體、非抗體蛋白質骨架(例如卓呯(darpin)、抗運載蛋白、奈米抗體、親合體等)或拮抗核酸(例如雙股或單股DNA或RNA，其例如抑制PCSK9基因表現或PCSK9活性，且包括，但不限於反義核酸、適體、siRNA(小干擾RNA)與核糖體)。

可在化學上合成核酸(例如反義核酸)，例如依據磷酸三酯法(參見，例如Uhlmann,E.& Peyman,A.(1990)Chemical Reviews,90,543-584)。適體係以高親和力結合多肽，在此為PAK的核酸。適體可藉由自不同單股RNA分子的大池中的篩選法來分離，例如SELEX(參見，例如Jayasena(1999)Clin.Chem.,45,1628-50；Klug and Famulok(1994)M.Mol.Biol.Rep.,20,97-107；US 5,582,981)。適體亦可合成並以其鏡像形式篩選，諸如L-核糖核苷酸(Nolte et al.(1996)Nat.Biotechnol.,14,1116-9；Klussmann et al.(1996)Nat.Biotechnol.,14,1112-5)。以此方法所分離的形式具有不會被天然核糖核酸酶分解的優勢，且因此具有較高的穩定性。

剔除動物是指藉由在基因體中靶定突變或將核酸(例如DNA載體、寡核苷酸或siRNA)暫時或穩定引入動物中的方式下調或關閉一或多個基因。製造剔除動 物，特別是剔除嚙齒動物在本技藝中為已知；因此，製造PCSK9剔除嚙齒動物落在熟習技術者的技藝中。剔除動物的實例可，例如自說明PCSK9剔除小鼠的Mbikay M.,et al.,FEBS Letters,2010,February 19,584(4)：701-6取得。

下調PCSK9可藉由任一類動物或細胞的修飾(穩定或暫時，較佳為穩定)而達致，所述修飾會降低PCSK9活性(亦即其對PCSK的能力)、PCSK9轉錄穩態濃度(亦即藉由活化PCSK轉錄或轉錄穩定化)或PCSK蛋白質穩態濃度(亦即藉由活化PCSK9轉譯或其轉譯後加工；藉由調節PCSK9轉譯後修飾或藉由活化其穩定化或藉由抑制其分解)。例如，此可藉由使用PCSK9的顯性負突變體、PCSK9的反義寡核苷酸、RNAi建構物、藉由製造功能性或基因體PCSK9剔除(其為例如可誘導的)或其他該技藝中已知的適當技術而達致。關於以上技術的概述，參見，例如Current protocols in Molecular biology(2000)J.G.Seidman,Chapter 23,Supplemtent 52,John Wiley and Sons,Inc.；Gene Targeting：a practical approach(1995),Editor：A.L.Joyner,IRL Press；Genetic Manipulation of Receptor Expression and Function,2000；Antisense Therapeutics,1996；Scherr et al,2003。

術語「剔除」如本文所用亦意指使用siRNA下調嚙齒動物的PCSK9蛋白質濃度或活性。

在第十三個態樣中，本發明涉及一種製備適於用作 為模型系統供測定藥劑調節膽固醇的效用(且較佳地係降低膽固醇的效用)之嚙齒動物的方法，該方法包含提供嚙齒動物或嚙齒動物之囊胚，以及藉由遺傳剔除PCSK9、穩定或暫時抑制PCSK9或投與PCSK-9拮抗劑的方式來降低其PCSK9濃度。

在第十二或第十三個態樣的一個較佳具體例中，嚙齒動物的PCSK9活性或表現濃度降低是藉由將PCSK9拮抗劑(較佳地專一性PCSK9抗體)投與給嚙齒動物所致。

在本發明不同態樣的其他較佳具體例及具體例中，嚙齒動物是選自於倉鼠、小鼠、大鼠、天竺鼠與兔子，且較佳為倉鼠，更佳為敘利亞倉鼠。依據尤佳具體例，倉鼠為雄性敘利亞倉鼠。

依據另一較佳具體例，嚙齒動物為正常血脂或高血脂，且較佳為正常血脂。

在第十四個態樣中，本發明涉及一種嚙齒動物，較佳地是倉鼠，其是藉由如第十三個態樣的方法所獲得，且較佳地是藉由將PCSK-9專一性抗體投與給嚙齒動物所獲得。

在第十五個態樣中，本發明涉及一種進行如態樣1至10之一者的方法的套組，其包含嚙齒動物(較佳為倉鼠)以及PCSK9專一性拮抗劑，諸如PCSK9專一性抗體，且視情況包含一或多種如第六至七個態樣之一者的其他組分。

在第十六個態樣中，本發明涉及一種製造物品，其包含：(a)包裝材料或容器；(b)專一結合hPCSK9的抗體或其抗原結合片段；及(c)資料載體，諸如包裝材料包含的標籤或包裝插頁，其含有執行如態樣1至10之一者的方法的指示，該方法是用於分析或鑑定供治療或預防高膽固醇血症、高血脂症、血脂異常、動脈粥狀硬化及心血管疾病的化合物，以及視情況選用(d)一或多種緩衝劑及/或試劑供測定樣品的總膽固醇濃度、LDL-C濃度或HDL-C濃度。

在第十七個態樣中，本發明涉及製造物品，其包含：(a)包裝材料或容器；(b)試劑及緩衝劑，供測定樣品的總膽固醇濃度、LDL-C濃度或HDL-C濃度；及(c)資料載體，諸如標籤，其含有執行如態樣1至10之一者的方法的指示，以及視情況選用的(d)專一結合hPCSK9的抗體或其抗原結合片段。

依據第十六或第十七個態樣的一個較佳具體例，依據製造物品包含一或多隻嚙齒動物，諸如倉鼠，較佳為敘利亞倉鼠。

依據第十六或第十七個態樣的另一較佳具體例，該製造物品包含資料載體，其中該資料載體包含諸如以下的資訊 (i)使用抗體或其片段的指示，(ii)品質資訊，諸如關於抗體或物品的批號及/批數、製造或組合地點或有效期限或有效期的品質資訊、關於正確儲存或操作物品的資訊，(iii)關於用以測定膽固醇濃度的緩衝劑、稀釋劑、試劑之組合物或使用抗體的資訊，(iv)關於釋明實行上述方法時所得資訊的資訊，(v)當實施不當方法時，關於可能的誤釋或錯誤結果的警示，及/或(vi)當使用不當試劑及/或緩衝劑時，關於可能的誤釋或錯誤結果的警示。

用於本發明不同態樣中的嚙齒動物較佳地選自倉鼠、小鼠、大鼠、天竺鼠及兔子，且更佳地為倉鼠。依據尤佳具體例，嚙齒動物為敘利亞倉鼠，又更佳為雄性敘利亞倉鼠。依據本發明不同態樣的另一較佳具體例，嚙齒動物為正常血脂或高血脂，且較佳為正常血脂嚙齒動物，諸如正常血脂倉鼠。

本發明的數種態樣以及具體例可彼此組合。習於技藝者應了解適當組合本發明不同態樣及具體例的其他較佳具體例。

用於實施本發明的較佳抗體

下段說明抗體及其抗原結合片段的功能與結構特徵，該抗體及其抗原結合片段可用於實施本發明的所有 態樣。因此，諸如「在較佳具體中」、「在一些具體例中」、「在另一較佳具體例中」的用語及類似用語應理解為意指本發明第一個態樣、本發明第二個態樣、本發明第三個態樣、本發明第四個態樣、本發明第五個態樣、本發明第六個態樣、本發明第七個態樣、本發明第八個態樣、本發明第九個態樣、本發明第十個態樣、本發明第十一個態樣、本發明第十二個態樣、本發明第十三個態樣、本發明第十四個態樣、本發明第十五個態樣、本發明第十六個態樣及本發明第十七個態樣的具體例。

適於實施本發明的所有抗體或其抗原結合片段專一結合hPCSK9。在本發明任一態樣的較佳具體例中，抗體或其抗原結合片段為重組人類抗體或其片段。在一個更特定具體例中，抗體或其抗原結合片段為全人類單株抗體或其抗原結合片段，其專一結合hPCSK9並中和PCSK9活性。

可用於本發明中的mAb可為全長(例如IgG1或IgG4抗體)或可僅含有抗原結合部分(例如Fab、F(ab’)₂或scFv片段)，且可修飾成影響功能性，例如消除殘餘效應功能(Reddy et al.(2000)J.Immunol.164：1925-1933)。

在一個具體例中，抗體或其抗原結合片段的特徵在於結合含有hPCSK9(SEQ ID NO：2)之胺基酸殘基238的抗原決定位。在一個更特定具體例中，抗體或抗原結合片段結合在hPCSK9(SEQ ID NO：2)之位置238、 153、159與343的一或多個胺基酸殘基的抗原決定位。在一個更特定具體例中，抗體或其片段的特徵在於結合不含有SEQ ID NO：2之位置192、194、197及/或237處之胺基酸殘基的抗原決定位。

在一個具體例中，抗體或其抗原結合片段的特徵在於結合包含hPCSK9(SEQ ID NO：2)之胺基酸殘基366的抗原決定位。在一個更特定具體例中，抗體或抗原結合片段結合包含hPCSK9(SEQ ID NO：2)之位置147、366及380處的一或多個胺基酸殘基的抗原決定位。在一個更特定具體例中，抗體或抗體之抗原結合片段的特徵在於結合不含有SEQ ID NO：2之位置215或238處之胺基酸殘基的抗原決定位。

在一個具體例中，抗體或其抗原結合片段包含本文所示抗體316P或300N之一或多個序列(參見第6圖與第7圖)。

在一個具體例中，抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：9之重鏈可變區域(HCVR)或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性之實質上相似的序列。

在一個具體例中，抗體或其抗原結合片段更包含SEQ ID NO：10之輕鏈可變區域(LCVR)或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性之實質上相似的序列。

在特定具體例中，抗體或其抗原結合片段包含如 SEQ ID NO：9中所示的HCVR胺基酸序列及如SEQ ID NO：10中所示的LCVR胺基酸序列。

在較佳具體例中，抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：5之重鏈CDR3(HCDR3)結構域或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性之實質上相似的序列；及/或SEQ ID NO：8之輕鏈CDR3(LCDR3)結構域或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性之實質上相似的序列。在一個具體例中，HCDR3/LCDR3序列對為SEQ ID NO：5/8。在一個更佳具體例中，抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：5中所示之HCDR3結構域以及SEQ ID NO：8中所示之LCDR3結構域。

在又一個具體例中，抗體或其抗原結合片段更包含SEQ ID NO：3之重鏈CDR1(HCDR1)結構域或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性之實質上相似的序列；及/或SEQ ID NO：4之重鏈CDR2(HCDR2)結構域或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性之實質上相似的序列；及/或SEQ ID NO：6之輕鏈CDR1(LCDR1)結構域或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性之實質上相似的序列；及/或SEQ ID NO：7之輕鏈CDR2(LCDR2)結構域或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性之實質上相似的序列。在一個具體例中，重鏈及輕鏈CDR序列包含選自 由以下組成之群組中的序列：SEQ ID NO：3、4、5、6、7、8。在較佳具體例中，抗體或其抗原結合片段包含如SEQ ID NO：3、4、5、6、7及8中所示之重鏈及輕鏈CDR胺基酸序列。

在一個相關的較佳具體例中，抗體或其抗原結合片段包含重鏈及輕鏈CDR結構域，其包含於SEQ ID NO：9/10之重鏈及輕鏈序列對中。

在一個具體例中，抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：18之重鏈可變區域(HCVR或VH)或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性之實質上相似的序列。

在一個具體例中，抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：19之輕鏈可變區域(LCVR或VL)或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性之實質上相似的序列。

在特定具體例中，抗體或其抗原結合片段包含如SEQ ID NO：18中所示之HCVR胺基酸序列及如SEQ ID NO：19中所示之LCVR胺基酸序列。

在較佳具體例中，抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：14之重鏈CDR3(HCDR3)結構域或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性之實質上相似的序列；及/或SEQ ID NO：17之輕鏈CDR3(LCDR3)結構域或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性之實質上相似的序列。在一個具 體例中，HCDR3/LCDR3序列對為SEQ ID NO：14/17。在一個更佳具體例中，抗體或其抗原結合片段包含如SEQ ID NO：14中所示之HCDR3結構域及如SEQ ID NO：17中所示之LCDR3結構域。

在又一具體例中，抗體或其抗原結合片段更包含SEQ ID NO：12之重鏈CDR1(HCDR1)結構域或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性之實質上相似的序列；及/或SEQ ID NO：13之重鏈CDR2(HCDR2)結構域或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性之實質上相似的序列；及/或SEQ ID NO：15之輕鏈CDR1(LCDR1)結構域或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性之實質上相似的序列；及/或SEQ ID NO：16之輕鏈CDR2(LCDR2)結構域或其具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性之實質上相似的序列。在一個具體例中，重鏈及輕鏈CDR序列包含選自由SEQ ID NO：12、13、14、15、16及17所組成之群組中的序列。在較佳具體例中，抗體或其抗原結合片段包含如SEQ ID NO：12、13、14、15、16及17中所示之重鏈及輕鏈CDR胺基酸序列。

在一個相關的較佳具體例中，抗體或其抗原結合片段包含重鏈及輕鏈CDR結構域，其包含於SEQ ID NO：18/19之重鏈及輕鏈序列對中。

在又一具體例中，抗體或其抗原結合片段為人類抗 PCSK9抗體或其抗原結合片段，其含有由衍生自V_H、D_H及J_H生殖系序列之核苷酸序列段所編碼的重鏈可變區域(HCVR)，以及由衍生自V_K及J_K生殖系序列之核苷酸序列段所編碼的輕鏈可變區域(LCVR)，其中生殖系序列為(a)V_H基因段3-23、D_H基因段7-27、J_H基因段2、V_K基因段4-1與J_K基因段2；或(b)V_H基因段3-7、D_H基因段2-8、J_H基因段6、V_K基因段2-28與J_K基因段4。

在較佳具體例中，抗體或其抗原結合片段結合至hPCSK9上的相同抗原決定位，因為抗體含有如SEQ ID NO：3、4、5、6、7及8中所示之重鏈與輕鏈CDR胺基酸序列。

在較佳具體例中，抗體或其抗原結合片段與含有如SEQ ID NO：3、4、5、6、7及8中所示之重鏈與輕鏈CDR胺基酸序列的抗體競爭結合至hPCSK9。

本發明涵蓋抗PCSK9抗體，其具有經修飾的糖基化型態。在一些應用中，移除非所欲糖基化部位的修飾可能是有用的，或例如移除岩藻糖部分以增加抗體依賴性細胞毒性(ADCC)功能(參見Shield et al.(2002)JBC 277：26733)。在其他應用中，可做半乳糖基化修飾以修飾補體依賴性細胞毒性(CDC)。

某些有關實施本發明之抗體的較佳序列：SEQ ID NO：3：Gly Phe Thr Phe Asn Asn Tyr Ala

SEQ ID NO：4：Ile Ser Gly Ser Gly Gly Thr Thr

SEQ ID NO：5：Ala Lys Asp Ser Asn Trp Gly Asn Phe Asp Leu

SEQ ID NO：6：Gln Ser Val Leu Tyr Arg Ser Asn Asn Arg Asn Phe

SEQ ID NO：7：Trp Ala Ser

SEQ ID NO：8：Gln Gln Tyr Tyr Thr Thr Pro Tyr Thr

SEQ ID NO：9：

SEQ ID NO：10：

製備人類抗體

用於在基因轉殖小鼠體內製造人類抗體的方法為已知的(參見例如US 6,596,541,Regeneron Pharmaceuticals,VELOCIMMUNE^TM)。 VELOCIMMUNE^TM技術涉及製造基因轉殖小鼠，其具有含人類重鏈及輕鏈可變區域可操縱地連接至內源性小鼠恆定區域基因座的基因體，藉此小鼠製造含有人類可變區域及小鼠恆定區域並對抗原刺激反應的抗體。編碼抗體之重鏈及輕鏈的可變區域的DNA經分離，並且可操縱地連接至編碼人類重鏈及輕鏈恆定區域的DNA。接著，在能夠表現全人類抗體的細胞中表現DNA。在特定具體例中，細胞為CHO細胞。

抗體可在治療上用於阻斷配體-受體交互作用或抑制受體組分交互作用，而非透過補體固定與補體依賴性細胞毒性(CDC)參與來殺滅細胞，或透過抗體依賴性細胞媒介細胞毒性(ADCC)來殺滅細胞。因此，抗體的恆定區域對於抗體固定補體和媒介細胞依賴性細胞毒性的能力來說是重要的。因此，同型抗體可根據其對於抗體媒介細胞毒性是否為所要的來選定。

人類抗體表現出兩種與樞紐異質性相關的形式。在一種形式中，抗體分子包含約150-160 kDa的穩定四鏈建構物，其中二聚體藉由鏈間重鏈雙硫鍵而被約束在一起。在第二種形式中，二聚體不是經由鏈間雙硫鍵連結，且形成一個由共價偶合輕鏈及重鏈組成的約75-80 kDa分子(半抗體)。此等形式即使是在親和力純化之後 也相當難以分離。

第二種形式在各種完整IgG同型中的出現頻率是因為(但不限於)與抗體之樞紐區域同型有關的結構差異。在人類IgG4樞紐的樞紐區域中，單一個胺基酸置換可能將第二種形式的出現明顯降低至一般使用人類IgG1樞紐所觀察到的程度(Angal et al.(1993)Molecular Immunology 30：105)。本發明涵括具有一或多個在樞紐CH2或CH3區域中的突變，其可能是所要的，例如在製造時，俾以增進所欲抗體形式的產率。

一般而言，使用感興趣的抗原刺激VELOCIMMUNE^TM小鼠，且自表現抗體的小鼠回收淋巴細胞(諸如B細胞)。淋巴細胞可以與骨髓瘤細胞株融合以製備永生融合瘤細胞株，且此融合瘤細胞株經篩選並選定以鑑定出製造對感興趣抗原具有專一性的融合瘤細胞株。編碼重鏈及輕鏈之可變區域的DNA經分離並連結至所要重鏈及輕鏈的同型恆定區域。此一抗體蛋白質可在細胞(諸如CHO細胞)中製造。另外，編碼抗原專一性嵌合抗體或輕鏈及重鏈之可變結構域的DNA可以從抗原專一性淋巴細胞中直接被分離。

一開始，分離具有人類可變區域及小鼠恆定區域的高親和力嵌合抗體。如下所述，抗體經特徵化並針對所要特徵(包括親和力、選擇性、抗原決定位等)進行選定。小鼠恆定區域置換為所要人類恆定區域以製造本發明的全人類抗體，例如野生型或修飾型IgG1或IgG4。儘 管所選恆定區域可依據特定用途而改變，但高親和力抗原結合及標靶專一性特性必須存在於可變區域中。

抗原決定位定位與相關技術

為了篩選結合至特定抗原決定位的抗體(例如，阻斷IgE結合至其高親和力受體的抗體)，可進行如Harlow與Lane說明抗體之慣用交叉阻斷分析(Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harb.,NY)。其他方法包括丙胺酸掃描突變體、肽墨點(Reineke(2004)Methods Mol Biol 248：443-63)(在此特別以其整體併入作為參考文獻)，或肽裂解分析。另外，可採用諸如抗原決定位切除、抗原決定位提取及抗原化學修飾(Tomer(2000)Protein Science 9：487-496)(在此特別以其整體併入作為參考文獻)。

術語「抗原決定位」意指抗原上B細胞及/或T細胞所反應的位置。B細胞抗原決定位可由連續胺基酸或透過蛋白質的三級折疊而相鄰之不連續胺基酸形成。由連續胺基酸所形成的抗原決定位通常在與變性溶劑接觸時仍可維持，而由三級折疊所形成的抗原決定位在以變性溶劑處理時會喪失。抗原決定位通常包括至少3個，更通常為至少5或8至10個胺基酸呈特殊空間構型。

修飾輔助分析(Modification-Assisted Profiling,MAP)，亦已知為基於抗原結構的抗體分析(Antigen Structure-based Antibody Profiling,ASAP)，是一種將針對相同抗原的大量單株抗體(mAb)依據各抗體對經化學或酵素修飾之抗原表現的結合型態類似性來予以分類的方法(US 2004/0101920，在此特別以其整體併入作為參考文獻)。各類可反映一種獨特的抗原決定位，其明顯不同於另一類所表示的抗原決定位或與另一類所表示的抗原決定位部分重疊。此技術提供快速過濾遺傳上相同的mAb，使得特徵化得以著重於遺傳上有差異的mAb。當應用於融合瘤篩選時，MAP有助於鑑定製造具有所需特徵之mAb的罕見融合瘤株。MAP可用於將本發明的抗PCSK9 mAb分選成結合不同抗原決定位的mAb群組。

在不同具體例中，抗-hPCSK9抗體或抗體之抗原結合片段結合催化結構域中的抗原決定位，其為約SEQ ID NO：2的153至425；更具體地，約153至約250或約250至約425的抗原決定位；更具體地，本發明抗體或抗體片段結合片段約153至約208、約200至約260、約250至約300、約275至約325、約300至約360、約350至約400，及/或約375至約425之片段中的抗原決定位。

在不同具體例中，抗-hPCSK9抗體或抗體之抗原結合片段結合原肽結構域中的抗原決定位(SEQ ID NO：2的殘基31至152)；更具體地，約殘基31至約殘基90或約殘基90至約殘基152的抗原決定位；更具體地， 本發明抗體或抗體片段結合約殘基31至約殘基60、約殘基60至約殘基90、約殘基85至約殘基110、約殘基100至約殘基130、約殘基125至約殘基150、約殘基135至約殘基152，及/或約殘基140至約殘基152之片段中的抗原決定位。

在一些具體例中，抗-hPCSK9抗體或抗體之抗原結合片段結合C-端結構域的抗原決定位(SEQ ID NO：2的殘基426至692)；更具體地，約殘基426至約殘基570、或約殘基570至約殘基692的抗原決定位；更具體地，本發明抗體或抗體片段結合約殘基450至約殘基500、約殘基500至約殘基550、約殘基550至約殘基600，及/或約殘基600至約殘基692之片段中的抗原決定位。

在一些具體例中，抗體或抗體片段結合包括超過一個所舉催化、原肽或C-端結構域，及/或兩個或三個不同結構域中之抗原決定位(例如，催化與C-端結構域中，或原肽與催化結構域中，或原肽、催化與C-端結構域中的抗原決定位)。

在一些具體例中，抗體或抗原結合片段結合hPCSK9上的抗原決定位，其含有hPCSK9(SEQ ID NO：2)的胺基酸殘基238。實驗結果(參見US 2010/0166768)顯示，當D238突變時，mAb 316P的K_D顯示在結合親和力降低>400倍(~1 x10^-9 M至~410 x10^-9 M)而T_1/2降低>30倍(自~37至1分鐘)。在一個特定具 體例中，突變為D238R。在特定具體例中，本發明抗體或抗原結合片段結合hPCSK9的抗原決定位，其含有兩個或更多個位置在153、159、238與343的胺基酸殘基。

如先前所示(參見US 2010/0166768)，在胺基酸殘基153、159或343的突變會致使親和力降低約5至10倍或T_1/2同樣降低。在特定具體例中，突變為S153R、E159R及/或D343R。

在一些具體例中，抗體或抗原結合片段結合hPCSK9上的抗原決定位，其含有hPCSK9(SEQ ID NO：2)的胺基酸殘基366。實驗結果(參見US 2010/0166768)顯示，當E366突變時，mAb 300N的親和力顯示降低約50倍(~0.7 x10^-9 M至~36 x10^-9 M)而T_1/2同樣降低(自~120至~2分鐘)。在特定具體例中，突變為E366K。

本發明包括抗-PCSK9抗體，其結合至與本文所述任一特定例示性抗體相同的抗原決定位。同樣地，本發明亦包括抗PCSK9抗體，其與本文所述任一特定例示性抗體競爭結合至PCSK9或PCSK9片段。

吾人可輕易使用技藝中熟知的慣常方法來判斷抗體是否與參考抗PCSK9抗體結合至相同抗原決定位，或與參考抗PCSK9抗體競爭結合。例如，為決定一個測試抗體是否結合至與本發明參考抗PCSK9抗體相同的抗原決定位，容許參考抗體在飽和條件下結合至PCSK9蛋白質或肽。接著，評估測試抗體結合至PCSK9 分子的能力。若測試抗體能夠在使用參考抗PCSK9抗體飽和結合之後結合至PCSK9，則可推斷測試抗體結合至與參考抗PCSK9抗體不同的抗原決定位。另一方面，若測試抗體在使用參考抗PCSK9抗體飽和結合之後無法結合至PCSK9，則測試抗體可能結合至與本發明參考抗PCSK9抗體所結合之抗原決定位相同的抗原決定位。

為決定一個抗體是否與參考抗PCSK9抗體競爭結合，以兩個方面進行上述結合方法學。在第一個方面，容許參考抗體在飽和條件下結合至PCSK9分子，繼而評估測試抗體對PCSK9分子的結合。在第二個方面，容許測試抗體在飽和條件下結合至PCSK9分子，繼而評估參考抗體對PCSK9分子的結合。若在兩個方面中，僅有第一(飽和)抗體能夠結合至PCSK9分子，則推斷測試抗體與參考抗體競爭結合至PCSK9。如技藝中具有通常技術者所了解，與參考抗體競爭結合之抗體不必然會結合至與參考抗體相同的抗原決定位，但可能會在空間上藉由結合重疊或相鄰抗原決定位來阻斷參考抗體的結合。

若兩種抗體各自競爭性抑制(阻斷)另一者結合至抗原，則它們結合至相同或重疊的抗原決定位。亦即，過量1倍、5倍、10倍、20倍或100倍的一種抗體會抑制另一者結合達至少50%，但較佳為75%、90%或甚至99%，如競爭性結合分析中所測得(參見，例如Junghans et al.,Cancer Res.1990 50：1495-1502)。另外，若基本上 在抗原中降低或消除一種抗體結合的所有胺基酸突變也會降低或消除另一者結合，則兩種抗體具有相同的抗原決定位。若一些降低或消除一種抗體結合之胺基酸突變也會降低或消除另一者結合，則兩種抗體具有重疊的抗原決定位。

接著，可進行其他慣常實驗(例如肽突變與結合分析)以確認發現測試抗體未結合事實上是否是因為結合至與參考抗體相同的抗原決定位，或若發現沒有結合是因為空間阻斷(或另一現象)。此類實驗可使用技藝中可用的ELISA、RIA、表面電漿共振、流式細胞儀或任何其他定量或定性抗體結合分析來進行。

在特定具體例中，本發明包含結合SEQ ID NO：2之PCSK9蛋白質的抗PCSK9抗體或抗體之抗原結合片段，其中抗體或其片段與PCSK9及變體PCSK9蛋白質的結合要比抗體或片段與SEQ ID NO：2之PCSK9蛋白質的結合少50%。在一個特定具體例中，變體PCSK9蛋白質含有至少一個在選自由以下組成之群組之位置的殘基突變：153、159、238及343。在更特定具體例中，至少一個突變為S153R、E159R、D238R及/或D343R。在另一特定具體例中，變體PCSK9蛋白質含有至少一個在選自由366組成之群組之位置的殘基突變。在一個特定具體例中，變體PCSK9蛋白質含有至少一個在選自由147、366及380組成之群組之位置的殘基突變。在更特定具體例中，突變為S147F、E366K 及V380M。

免疫結合物

本發明涵括結合至治療部分(諸如細胞毒素、化療藥劑、免疫抑制劑或放射同位素)的人類抗PCSK9單株抗體(免疫結合物)。細胞毒性劑包括任何有害於細胞的試劑。用於形成免疫結合物的適當細胞毒性劑與化療劑的實例為技藝中已知的，參見例如WO 05/103081。

雙專一性

本發明抗體可為單專一性、雙專一性或多專一性。多專一性mAb可能對一個目標多肽的不同抗原決定位具有專一性或含有對超過一個目標多肽具有專一性的抗原結合結構域。參見，例如Tutt et al.(1991)J.Immunol.147：60-69。人類抗PCSK9 mAb可連結至另一功能分子(例如另一肽或蛋白質)或與該另一功能分子一起表現。舉例而言，抗體或其片段可在功能上連結(例如，藉由化學偶合、基因融合、非共價締合或其他方式)至一或多個其他分子實體，諸如另一個抗體或抗體片段，以製造出具有第二種結合專一性的雙專一性或多專一性抗體。

可用於本發明上下文內的雙專一性抗體形式實例涉及使用第一免疫球蛋白(Ig)CH3結構域以及第二Ig CH3結構域，其中第一與第二Ig CH3結構域因為至少 一個胺基酸而彼此不同，且其中相較於沒有胺基酸差異的雙專一性抗體，至少一個胺基酸差異會降低雙專一性抗體結合至蛋白質A。在一個具體例中，第一Ig CH3結構域結合蛋白質A，而第二Ig CH3結構域含有會降低或破壞蛋白質A結合的突變，諸如H95R修飾(依據IMGT外顯子編號；依據EU編號為H435R)。第二CH3可進一步包含Y96F修飾(依據IMGT；依據EU為Y436F)。可在第二CH3中發現的更多修飾包括：在IgG1抗體中，D16E、L18M、N44S、K52N、V57M及V82I(依據IMGT；依據EU為D356E、L358M、N384S、K392N、V397M及V422I)；在IgG2抗體中，N44S、K52N及V82I(IMGT；依據EU為N384S、K392N及V422I)；與在IgG4抗體中，Q15R、N44S、K52N、V57M、R69K、E79Q及V82I(依據IMGT；依據EU為Q355R、N384S、K392N、V397M、R409K、E419Q及V422I)。上述關於雙專一性抗體形式的變化預期落在本發明範疇內。

生物等效性

本發明抗PCSK9抗體及抗體片段涵括具有從所述mAb變化之胺基酸序列，但仍保有結合人類PCSK9能力的蛋白質。相較於母本序列，此等變體mAb及抗體片段含有一或多個胺基酸添加、缺失或置換，但表現出大體上與所述mAb等效的生物活性。同樣地，相較於所揭示的序列，本發明抗PCSK9抗體的編碼DNA序列 涵括具有一或多個核苷酸添加、缺失或置換的序列，但其編碼與本發明抗PCSK9抗體或抗體片段大體上生物等效的抗PCSK9抗體或抗體片段。在上文討論此等變體胺基酸與DNA序列的實例。

例如，若兩個抗原結合蛋白質或抗體在藥學上等效或藥學上可替換，當在類似實驗條件下以相等莫耳劑量投藥時(單劑量或多劑量)，其吸收速率及程度未顯示顯著差異，則它們被認為是等效的。若一些抗體就其吸收程度為等效但在其吸收速率不相等則還是被認為是生物等效，因為此等吸收速率的差異與目的無關且反應在標籤，而非維持有效體內藥劑濃度的關鍵(例如慢性使用)，則它們被認為是等效或藥學上可替換，且被認為是醫藥上對於研究的特定藥劑產品沒有醫學上差異。在一個具體例中，若兩個抗原結合蛋白質就其安全性、純度及效力在臨床上沒有具意義的差異，則它們具生物等效性。

在一個具體例中，若患者可以在參考產品與生物產品間轉換一次或更多次而預期不會增加反效應風險(包括相較於無此等轉換的持續療法有免疫原性臨床上顯著改變或效力減小)，則兩個抗原結合蛋白質具生物等效性。

在一個具體例中，若兩個抗原結合蛋白質就應用條件而言藉由相同機制或作用機制作用達到此等機制已知的程度，則它們被認為具生物等效性。

生物等效性可以藉由體內與體外方法來證實。生物等效性測量法包括，例如(a)在人類或其他哺乳類動物體內的體內測試，其中於血液、血漿、血清或其他生物液中以時間為函數測量抗體或其代謝物的濃度；(b)體外測試，經校正且合理預測人類體內生物可利用性數據；(c)在人類或其他哺乳類動物體內的體內測試，其中以時間為函數測量抗體(或其目標)的適當急性藥理效應；以及(d)在充分控制的臨床試驗中，其已建立抗體之安全性、效力或生物可利用性或生物等效性。

本發明抗PCSK9抗體的生物等效變體可藉由，例如製造各種對於生物活性來說不必要的殘基或序列的置換，或刪除末端或內部殘基或序列。例如，對於生物活性來說不必要的半胱胺酸殘基可以刪除或以其他胺基酸取代以防止不必要或不正確的分子內雙硫橋在復性之後形成。

治療投藥及調配

本發明提供含有本發明抗PCSK9抗體或其抗原結合片段的治療組合物。投與如本發明之治療組合物將會同時投與適當載劑、賦形劑及其他併入調配物中以提供增進運輸、投遞、耐受性及類似特性的試劑。多種適當調配物可在所有藥學化學家所熟知的配方中找到：Remington's Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Company,Easton,PA。此等調配物包括，例如粉劑、糊 劑、軟膏、凝膠、蠟、油、脂質、含有囊泡的脂質(陽離子性或陰離子性)(諸如LIPOFECTIN^TM)、DNA結合物、無水吸收糊劑、水包油與油包水乳液、乳液卡波蠟(各種分子量的聚乙二醇)、半固體凝膠與含有卡波蠟的半固體混合物。亦參見Powell et al."Compendium of excipients for parenteral formulations"PDA(1998)J Pharm Sci Technol 52：238-311。

劑量可視待投藥個體的年齡與身材、目標疾病、病況、投藥途徑與類似因素而改變。當本發明抗體欲於本發明之不同態樣中使用時，在嚙齒動物中，靜脈內或皮下投與給嚙齒動物係有利的，且皮下較佳。

適於以約0.5 mg/kg體重至約15 mg/kg體重，且較佳濃度約0.8 mg/kg體重至約13 mg/kg體重，及較佳濃度約0.5 mg/kg、約1 mg/kg體重、約2 mg/kg、約3 mg/kg、約4 mg/kg、約5 mg/kg、約6 mg/kg、約7 mg/kg、約8 mg/kg、約9 mg/kg、約10 mg/kg、約11 mg/kg、約12 mg/kg或約13 mg/kg體重的數量將抗體投與給嚙齒動物。依據一個更佳具體例，以約1 mg/kg體重、約3 mg/kg體重或約10 mg/kg體重的數量將抗體投與給嚙齒動物，較佳為倉鼠。

已知各種投遞系統且可用於投與本發明之醫藥組合物，例如囊封於脂質體、微粒、微膠囊、能夠表現突變病毒之重組細胞、受體媒介的胞飲作用(參見，例如Wu et al.(1987)J.Biol.Chem.262：4429-4432)。引入方 法包括，但不限於皮內、肌肉內、腹膜內、靜脈內、皮下、鼻內、硬膜上與經口途徑。組合物可經由任何習知途徑投與，例如藉由輸注或大量注射(bolus injection)、藉由經表皮或黏膜皮膚襯(例如口腔黏膜、直腸與腸黏膜等)吸收，且可與其他生物活性劑一起投與。投與可以是全身性或局部的。

醫藥組合物亦可在囊泡中投遞，較佳為脂質體(參見Langer(1990)Science 249：1527-1533；Treat et al.(1989)in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer,Lopez Berestein and Fidler(eds.),Liss,New York,pp.353-365；Lopez-Berestein,ibid.,pp.317-327；通常參見出處同上)。

在某些情況下，醫藥組合物以控制釋放系統被投遞。在一個具體例中，可使用泵(參見Langer，上文；Sefton(1987)CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14：201)。在另一具體例中，可使用聚合材料；參見Medical Applications of Controlled Release,Langer and Wise(eds.),CRC Pres.,Boca Raton,Florida(1974)。在又另一個具體例中，控制釋放系統被置放在組合物標的鄰近處，因此僅需要全身性劑量的一部分(參見，例如Goodson,in Medical Applications of Controlled Release,上文，vol.2,pp.115-138,1984)。

可注射製品可包括用於靜脈內、皮下、皮內及肌肉內注射、點滴輸注等的劑型。此等可注射製品可依照公 知方法製備。例如，可注射製品可例如，藉由將上述抗體或其鹽溶解、懸浮或乳化於習知用於注射的無菌水性介質或油性介質中來製備。有關用於注射的水性介質，例如有生理食鹽水、含有葡萄糖與其他助劑的等張溶液等，其可與適當助溶劑(諸如醇(乙醇)、多元醇(例如丙二醇、乙二醇)、非離子性介面活性劑[例如聚山梨醇酯80、HCO-50(氫化菎麻油的聚氧乙烯(50 mol)加合物)]等組合使用。有關油性介質，採用例如芝麻油、大豆油等，其可與助溶劑(諸如安息酸苯甲酯、苯甲醇等)組合使用。由此製備的注射劑較佳地被填充於適當安瓿中。本發明之醫藥組合物可使用標準針頭與注射器皮下或靜脈內投遞。此外，有關皮下投遞，筆型投遞裝置毫無困難地適用於投遞本發明醫藥組合物。這樣的筆型投遞裝置可重複使用或為拋棄式。可重複使用的筆型投遞裝置通常採用含有醫藥組合物的可替換藥匣。一旦藥匣內全部醫藥組合物已被投與且藥匣空了，可易於丟棄空藥匣並替換成含有醫藥組合物的新藥匣。接著，筆型投遞裝置可再使用。在拋棄式筆型投遞裝置中，沒有可替換藥匣。可替換筆型投遞裝置在裝置內填充有容納在貯器中的醫藥組合物。一旦貯器沒有醫藥組合物了，將整個裝置丟棄。

許多可重複使用的筆型與自動注射器投遞裝置可應用於皮下投遞本發明之醫藥組合物。實例包括，但當然不限於AUTOPEN^TM(Owen Mumford,Inc.,Woodstock, UK)、DISETRONIC^TM pen(Disetronic Medical Systems,Burghdorf,Switzerland)、HUMALOG MIX 75/25^TM pen、HUMALOG^TM pen、HUMALIN 70/30^TM pen(Eli Lilly and Co.,Indianapolis,IN)、NOVOPEN^TM I、II與III(Novo Nordisk,Copenhagen,Denmark)、NOVOPEN JUNIOR^TM(Novo Nordisk,Copenhagen,Denmark)、BD^TM pen(Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ)、OPTIPEN^TM、OPTIPEN PRO^TM、OPTIPEN STARLET^TM和OPTICLIK^TM(sanofi-aventis,Frankfurt,Germany)，僅列舉數者。可應用於皮下投遞本發明醫藥組合物的拋棄式筆型投遞裝置包括，但當然不限於SOLOSTAR^TM pen(sanofi-aventis)、FLEXPEN^TM(Novo Nordisk)與KWIKPEN^TM(Eli Lilly)。

有利地，上述供經口或非經口使用的醫藥組合物被製備為呈適於活性成分投藥之單位劑量的劑型。此等呈單位劑量之劑型包括，例如錠劑、丸劑、囊劑、注射劑(安瓿)、栓劑等。所含上述抗體數量一般為每單位劑量中每劑型約4至約500 mg或約5至約500 mg；特別是注射形式，含有上述抗體約5至約100 mg或約5至400 mg(諸如每1 ml注射溶液約50至約200 mg)，而對其他劑型約10至約250 mg或約500 mg。

本發明提供治療方法，其中本發明抗體或抗體片段可用於治療與涉及hPCSK9之各種病況相關的高膽固醇血症。本發明抗PCSK9抗體或抗體片段尤其可用於治 療高膽固醇血症及類似疾病。組合療法可包括本發明抗PCSK9抗體與，例如(a)藉由抑制3-羥基-3甲基戊二醯基(HMG)-輔酶A(CoA)還原酶誘發膽固醇合成的細胞耗盡，諸如西立伐他汀、阿托伐他汀、辛伐他汀、匹伐他汀、羅蘇伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀及普伐他汀；(2)抑制膽固醇攝取及或膽酸再吸收；(3)增加脂蛋白分解(諸如菸鹼酸)；及在消除膽固醇中具有作用之LXR轉錄因子的活化劑，諸如22-羥基膽固醇之藥劑的一或多者，或固定組合，諸如依折麥布(ezetimibe)加上辛伐他汀；史塔丁加上膽酸樹脂(諸如考來烯胺(cholestyramine)、考來替泊(colestipol)、考來維侖(colesevelam))、菸鹼酸加上史塔丁的固定組合(例如菸鹼酸加上洛伐他汀)；或與其它降脂劑，諸如ω-3-脂肪酸乙酯(例如歐妙(omacor))。

實例

提出下列實例俾以將如何製造與使用本發明方法和組合物之完整揭示內容以及說明提供給技藝中具有通常技術者，且不欲限制發明人就其發明所視為的範疇。已盡力確保所用數字的正確性，但可能產生某些實驗誤差與偏差。除非另有指明，否則分子量為平均分子量，溫度為攝氏度，而壓力為大氣壓或近乎大氣壓。

活性化合物 抗體316P

抗體316P是全人類抗體，其含有如序列表SEQ ID NO：9中所示的HCVR以及如序列表SEQ ID NO：10中所示的LCVR。CDR序列顯示於SEQ ID NO：3、4及5(重鏈的CDR1、CDR2、CDR3)與SEQ ID NO：6、7和8(輕鏈的CDR1、CDR2、CDR3)中。

抗體316P是衍生自VelocImmune^®技術的人類單株抗PCSK9抗體，其阻斷PCSK9與LDLR之間的交互作用。抗體316P經由HepG2細胞中的LDLR拮抗PCSK9媒介的下調LDL攝取，且在人類與倉鼠體內對PCSK9皆具有高度結合親和力。本調查分成兩個研究：第一個研究設計成評估對正常血脂雄性敘利亞倉鼠(金倉鼠(Mesocricetus auratus))單次皮下(s.c.)注射316P的劑量反應、安全性及藥物動力學；第二個研究設計成探討單次s.c.注射316P與每天兩次阿托伐他汀給藥(單獨與彼此組合)對於LDL-C及其他脂質循環濃度的效應。亦評估各個治療對於安全性的效應。

方法及統計學 動物及治療

重量介於90至100 g的雄性敘利亞倉鼠(品系，在研究1中為RjHan：AURA，在研究2中為Bio^TM F₁B)是得自於Janvier(德國)，且容許在進入研究之前適應7天期間。所有動物住在控制溫度(19-21℃)、溼度(55%) 與12小時顛倒夜/日週期(於15：00至3：00為日)處，且自由取用水與標準倉鼠飼料(ssniff® Ha,Spezialitäten GmbH,Soest,Germany)。在Regeneron Pharmaceuticals Inc.(Tarrytown,NY,USA)表現並純化抗hPCSK9抗體319(Lot.02-090211，原液25.5 mg/mL)，且藉由s.c.注射在第0天使用磷酸鹽緩衝食鹽水(PBS)作為媒劑投與。阿托伐他汀(Sortis 40 mg/錠劑)得自於Pfizer Inc並每天使用0.5%羥乙基纖維素、乙醇和聚乙二醇硬脂酸酯(solutol)的混合物作為溶劑經口(p.o.)投與2次(早上與下午)。動物研究經Sanofi-Aventis Deutschland GmbH動物管理委員會核可。該機構經AAALAC認定³⁸。

實驗設計

調查分成兩個研究。8週大動物在隨機分組前依據體重分組，而研究1動物(每組6隻)在第0天接受s.c.PBS對照、1、3或10 mg/kg單次s.c.劑量的316P/PBS或無處理。研究2動物(每組10隻)在第0天接受s.c.或p.o.PBS對照、10 mg/kg單次s.c.注射316P/PBS、10或20 mg/kg每天2次p.o.阿托伐他汀給藥加上或不加上10 mg/kg單次s.c.注射316P/PBS，或無處理。就各研究而言，每週測量體重與食物攝取(飼料重量變化)1次，在給藥前1週開始。在Isofrluran CP®(CP Pharama,Burgdorf,Germany)氧氣/一氧化氮麻醉(3.5%,2：1)下於09：00至11：00之間自眼窩後靜脈叢內採血。在研究1 中，於第-6、1、7、14、21與28天取樣，而在研究2中，於第-7、0、3與7天取樣。使用Serum-Gel^®管(Sarstedt,Nümbrecht,Germany)在離心後獲得血清。使用人類診斷用的個別Roche臨床化學套組於Hitachi 912分析儀測定總膽固醇(TC)、LDL-C、HDL-膽固醇(HDL-C)與TG的血清濃度。

在各研究結束時，於非禁食狀態下犧牲動物並立即將肝臟秤重且在乾冰上急速冷凍。為測量肝臟膽固醇、TG與磷脂質，使用二氯甲烷/甲醇(v/v 2：1)萃取肝臟脂質並使用本文他處所述方法之修改方法來分析³⁹。藉由三明治ELISA使用山羊抗人類Fc抗體供捕捉以及辣根過氧化酶結合山羊抗hFc抗體(在Regeneron生產)供偵測來測定血清316P濃度。在研究2中，藉由西方墨點分析評估肝臟LDLR濃度的變化。使用人類診斷用的個別Roche臨床化學套組於Hitachi 912分析儀測定丙胺酸胺基轉移酶(ALT)、天門冬胺酸胺基轉移酶(AST)、鹼性磷酸酶(AP)與肌酸激酶(CK)的濃度。

統計分析

所有數據以平均值±平均值的標準偏差(SEM)表示並在分析前檢驗正規性與變異數同質性。使用單因子變異數分析(ANOVA)以及克-瓦二氏檢定(Kruskal-Wallis test)，或雙因子ANOVA以及丹內特檢定(Dunnett test)比較活性治療相對於對照的效應。在研究1中，分別使 用雙因子ANOVA以及丹內特檢定分析經媒劑治療的對照相對未治療對照組。P值≦0.05被認為有統計顯著性。敘述性地評估食物消耗與安全性參數(AST、ALT、AP及CK)。

結果

各處理組的脂質濃度在基線(研究1為第-6天，而研究2為第-7天)時相當(第1圖與第2圖)。在所有處理組中，平均體重逐漸增加，在各研究中體重、食物消耗或增重方面沒有明顯組間差異。相較於PBS對照組，未處理對照中的血清TC、LDL-C、TG、HDL-C與磷脂質濃度變化在整個研究中並沒有明顯差異。

研究1 在正常血脂倉鼠中單次s.c.注射1、3或10 mg/kg的316P的劑量反應

單次s.c.注射1、3或10 mg/kg的316P與LDL-C劑量依賴性降低相關超過2週(第1A圖)。在第1天之後對於LDL-C的最大效應為1 mg/kg劑量(17%降低)，而在第7天後觀察到最大效應為3與10 mg/kg劑量(分別為27%與59%降低)。在最高劑量(10 mg/kg)下，LDL-C降低僅在第7天與第14天有統計顯著性，之後LDL-C濃度緩慢地增加。但是，注意到LDL-C濃度並未達到PBS對照處理的濃度(0%降低)直到第28天。在所有劑量中於第7天TC降低是顯著的(分別為9%、17%與 28%，P≦0.0325)，而2個較高劑量在第14天(P≦0.0011)，且最高劑量在第21天(P≦0.0024)維持顯著性(第1B圖)。HDL-C降低有統計顯著性，但比對於LDL-C的效應(數據未示出)較不明顯。每一劑量的血清TG濃度在研究期間維持相對恆定(第1C圖)。

血清316P濃度分析表示在個別組別中達到適量與持續藥劑劑量(第3圖)。在24小時時間點的血清316P濃度與1、3和10 mg/kg的理論給藥濃度成比例。所有劑量中，在1天後偵測到最高濃度的316P，但在接下來的6天內開始下降。單次s.c.注射1、3或10 mg/kg的316P對於安全性參數或相對肝臟重量、肝臟膽固醇、TG或磷脂質濃度不具生物相關效應(數據未示出)。

研究2 於有或沒有單次s.c.注射10 mg/kg的316P的情況下，在正常血脂倉鼠中每日2次10或20 mg/kg阿托伐他汀對於脂質濃度的效應

如研究1中，單次s.c.注射10 mg/kg的316P對於血清LDL-C與TC濃度具有強力效應，其維持到第7天研究結束(第2A、2B圖)。在7天後，本身每天2次p.o.給藥10 mg/kg或20 mg/kg阿托伐他汀對於血清LDL-C、TC(第2A、2B圖)或HDL-C沒有明顯效應，但降低血清TG濃度達23%(第2C圖)。但是，在經阿托伐他汀處理的動物中，於第0天單次s.c.注射10 mg/kg的316P與血清LDL-C明顯降低有關(阿托伐他汀2×10 mg/kg為46%，而阿托伐他汀2×20 mg/kg為58%)，與 第3天TC(30%及32%)，在第7天維持很高效應(第2A、2B圖)。不論阿托伐他汀劑量為何，效應都類似(第2A、B圖)。如研究1中，添加316P 10 mg/kg對於TG濃度以外者都沒有顯著效應，其使用單獨阿托伐他汀2 x 10或20 mg/kg可達到(第2C圖)。此外，HDL-C降低有統計顯著性但比對LDL-C的效應較不明顯(數據未示出)。

相較於PBS對照組，經316P 10 mg/kg處理的動物具有最高濃度的肝臟LDLR表現(149%)，繼而是接受316P 10 mg/kg加上阿托伐他汀2×20 mg/kg(140%)而接著是單獨接受阿托伐他汀2×20 mg/kg(89%)(第4圖)。而阿托伐他汀2×10或20 mg/kg與ALT濃度臨床上不顯著的略微增加相關，單次s.c.注射316P是耐受良好的，對於安全性參數沒有與處理相關的效應，且對於相對肝臟重量、肝臟膽固醇、TG或磷脂質濃度沒有臨床相關效應。

討論

先前研究已顯示，316P在人類與一些其他物種體內對於PCSK9具有高度結合親和力，並且能夠經由LDLR拮抗PCSK9媒介的下調LDL攝取，從而降低LDL-C。本研究顯示，在正常血脂雄性敘利亞倉鼠中，單次s.c.注射1、3或10 mg/kg的316P會使得TC與LDL-C有顯著劑量依賴性降低，持續超過2週，其中較 高劑量(3與10 mg/kg)在第7天有最高效應(第1A、1B圖)。在本研究中觀察到LDL-C經316P媒介的最大下降(第7天59%)，與人體第1期研究的期中數據分析相符，其中在單一i.v.投藥之後，LDL-C降低超過60%並持續30天。在各研究的任何劑量下，就循環TG(第1C、2C圖)、食物攝取或體重沒有觀察到顯著效應，但在接受最高劑量316P(10 mg/kg)的動物中觀察到HDL-C濃度顯著降低(數據未示出)。此動物模型中，在以史塔丁處理之後觀察到HDL-C有類似降低的情形。因為人類在史塔丁處理的情況下不會顯示這個效應，咸信此差異是因為與人類相較之下，低等物種的HDL中脂蛋白元E相對豐富且它是透過上調LDLR而清除。

研究1的藥物動力學數據顯示，316P的血清濃度與對TC和LDL-C的劑量依賴性效應相關聯(第1、3圖)，暗示這個對於脂質濃度的效應是因為PCSK9抑制。此外，研究2顯示，與PBS對照相較之下，單次s.c.注射10 mg/kg的316P對肝臟LDLR濃度有1.5倍效應(第4圖)，暗示PCSK9抑制又使得LDLR增加。

已充分證明，嚙齒動物(包括倉鼠)對史塔丁的降LDL-C效應具有抗性，但史塔丁在此等動物中藉由抑制肝臟TG分泌而有效降低血清TG濃度。嚙齒動物與人類所發現的史塔丁效應不一致很有可能是因為PCSK9表現的差異。例如，在以羅蘇伐他汀處理血脂異常倉鼠的研究中顯示，肝臟PCSK9 mRNA表現被誘發至一個 比LDLR mRNA還高的程度。更多調查顯示，羅蘇伐他汀處理與SREBP-2及肝細胞核因子1α(HNF1α)的濃度增加有關。因為SREBP-2與HNF1α皆會活化PCSK9基因表現，而LDLR基因表現僅受SREBP-2活化，淨結果為肝臟LDLR濃度下降，而血清LDL-C濃度略為增加。然而，人類HepG2或Huh7細胞的研究顯示，羅蘇伐他汀會誘發LDLR mRNA與蛋白質(約2倍)和PCSK9 mRNA與蛋白質(約3倍)適度增加，但對於HNF1α濃度沒有可看見的效應。這些結果暗示，藉由史塔丁經HNF1α表現會以物種專一性的方式調節PCSK9。與這些發現相符的是，本研究顯示，不論劑量多少，每天2次投藥阿托伐他汀10或20 mg/kg對正常血脂敘利亞倉鼠的TC或LDL-C濃度沒有顯著效應，但阿托伐他汀2×20 mg/kg在處理7天之後使得TG濃度降低23%(第2圖)，而肝臟LDLR濃度降低0.89倍(第4圖)。若史塔丁在嚙齒動物中的抗性機制被認為與PCSK9：LDLR比例增加有關，則抑制PCSK9活性至少應該會部分回復史塔丁在敘利亞倉鼠體內的降脂效應。為了測試這個理論，敘利亞倉鼠接受單次s.c.注射316P組合無效劑量的阿托伐他汀。一如預期，與經阿托伐他汀處理的動物相較之下，血清LDL-C、TC與HDL-C濃度顯著降低(第2圖)，相對PBS處理對照，是與肝臟LDLR蛋白質濃度增加1.4倍有關的效應(第4圖)。此外，在任何劑量下，組合治療對於降低血清 LDL-C與TC濃度比單療法更為有效(第2圖)。

除了與ALT生物相關增加有關的阿托伐他汀以外，所有處理是耐受良好的，在安全性參數或肝臟脂質方面沒有臨床相關變化。總言之，這些數據暗示，單次s.c.注射316P劑量依賴性地中和PCSK9活性，且就克服在倉鼠模型中所觀察到的史塔丁抗性來說是安全又有效的。本研究亦確認正常血脂雄性敘利亞倉鼠是研究標靶PCSK9之藥劑的適當模型。

本發明的更多較佳態樣

1.一種測試化合物調節個體膽固醇濃度之效力的方法，其包含：(a)測定在將該化合物投與給該測試嚙齒動物之後所得測試嚙齒動物測試樣品中的總膽固醇濃度及/或LDL-C濃度及/或HDL-C濃度，(b)測定得自未投與該化合物之對照嚙齒動物對照樣品中的總膽固醇濃度及/或LDL-C濃度及/或HDL-C濃度，其中測試嚙齒動物與對照嚙齒動物的PCSK9活性或表現降低，且(c)測定測試樣品與對照樣品的總膽固醇濃度及/或LDL-C濃度及/或HDL-C濃度是否有差異，其中存在任何差異表示該化合物有效調節個體之膽固醇濃度。

2.如態樣1之方法，其中嚙齒動物的PCSK9活性或表現降低是因為遺傳剔除PCSK9、穩定或暫時抑制PCSK9或投與PCSK-9拮抗劑所致。

3.如態樣2之方法，其中PCSK9拮抗劑為抗體或抗體之抗原結合片段。

4.如態樣3之方法，其中該抗體或其抗體結合片段包含選自由以下所組成之列表的一或多個序列：SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18及SEQ ID NO：19。

5.如態樣3之方法，其中該抗體或抗體之抗原結合片段以1 mg/kg體重、3 mg/kg體重或10 mg/kg體重的濃度投與給嚙齒動物。

6.如態樣1之方法，其中測試嚙齒動物與對照嚙齒動物相同，且對照樣品是在投與該化合物之前取得。

7.如態樣1之方法，其中測試嚙齒動物與對照嚙齒動物不同。

8.如態樣1之方法，其中該嚙齒動物係選自於由倉鼠、小鼠、大鼠、天竺鼠及兔子所組成之群組。

9.如態樣8之方法，其中該嚙齒動物為倉鼠。

10.如態樣9之方法，其中該嚙齒動物為敘利亞倉鼠。

11.如態樣1之方法，其中該嚙齒動物為雄性嚙齒動物。

12.如態樣1之方法，其中該嚙齒動物為正常血脂或高血脂。

13.如態樣1之方法，其中該化合物為生物分子或小分子。

14.如態樣13之方法，其中該化合物是選自於由抗體、反義分子、siRNA與適體(aptamer)所組成之群組的生物分子。

15.如態樣13之方法，其中該化合物為HMG-CoA還原酶抑制劑。

16.如態樣15之方法，其中該HMG-CoA還原酶抑制劑為史塔丁。

17.如態樣1之方法，其中測試樣品與對照樣品中總膽固醇濃度及/或LDL-C濃度及/或HDL-C濃度的任何差異表示在其他諸如人類的哺乳類動物或爬蟲類動物或鳥類中有相同的體內效應。

18.如態樣1之方法，其中相較於對照樣品，測試樣品的總膽固醇濃度降低及/或LDL-C濃度降低及/或HDL-C濃度增加表示該化合物有效治療或預防一或多種與個體LDL-C濃度升高相關的疾病或病症。

19.如態樣1之方法，其中相較於對照樣品，測試樣品的總膽固醇濃度增加及/或LDL-C濃度增加及/或HDL-C濃度降低表示該化合物具有反效應且可能引起、促進或誘發一或多種與個體LDL-C濃度升高相 關之疾病或病症。

20.如態樣17或18之方法，其中該與LDL-C濃度升高相關的疾病或病況是選自於由高膽固醇血症、高血脂症、血脂異常、動脈粥狀硬化及心血管疾病所組成之群組。

21.如態樣1之方法，其中該對照嚙齒動物是與測試嚙齒動物相同的物種。

22.如態樣20之方法，其中該對照嚙齒動物是與測試嚙齒動物相同的品系。

23.如態樣1之方法，其中總膽固醇濃度及/或LDL-C濃度及/或HDL-C濃度是藉由比色、光度、螢光、重力或光譜法的方式測定。

24.如態樣1之方法，其中該測試樣品與該對照樣品為血液、血漿或血清。

25.一種用於鑑定供治療與膽固醇濃度升高相關，且較佳地與LDL-C濃度升高相關疾病之藥劑的嚙齒動物，其中相較於對照嚙齒動物，該嚙齒動物的PCSK9濃度降低。

26.如態樣25之嚙齒動物，其中該嚙齒動物的PCSK9活性或表現降低是因為遺傳剔除PCSK9、穩定或暫時抑制PCSK9或投與PCSK9拮抗劑所致。

27.如態樣26之嚙齒動物，其中PCSK9拮抗劑為抗體或抗體之抗原結合片段。

28.如態樣27之嚙齒動物，其中該抗體或其抗體結合片 段包含選自由以下所組成之列表的一或多個序列：SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18及SEQ ID NO：19。

29.如態樣28之嚙齒動物，其中該抗體或抗體之抗原結合片段以1 mg/kg體重、3 mg/kg體重或10 mg/kg體重的濃度投與給嚙齒動物。

30.如態樣26之嚙齒動物，其中該嚙齒動物選自於由倉鼠、小鼠、大鼠、天竺鼠及兔子所組成之群組。

31.如態樣30之嚙齒動物，其中該嚙齒動物為倉鼠。

32.如態樣31之嚙齒動物，其中該嚙齒動物為敘利亞倉鼠。

33.如態樣26之嚙齒動物，其中該嚙齒動物為雄性嚙齒動物。

34.如態樣26之嚙齒動物，其中該嚙齒動物為正常血脂或高血脂。

35.一種製備適於用作為模型系統供測定藥劑調節膽固醇之效用之嚙齒動物的方法，其包含提供嚙齒動物或嚙齒動物之囊胚，以及藉由選自於由遺傳剔除PCSK9、穩定抑制PCSK9、暫時抑制PCSK9及投與PCSK9拮抗劑所組成之群組的方法來降低其PCSK9 濃度。

36.一種測試專一結合PCSK9之抗體或抗原結合片段供治療與LDL-C濃度升高相關之疾病或病況之效力的方法，該方法包含：(a)測定在將該抗體或其抗原結合片段投與給測試嚙齒動物之後所得測試嚙齒動物測試樣品中的總膽固醇濃度及/或LDL-C濃度及/或HDL-C濃度，(b)測定得自未使用該抗體或其抗原結合片段處理之對照嚙齒動物對照樣品中的總膽固醇濃度及/或LDL-C濃度及/或HDL-C濃度，及(c)測定測試樣品與對照樣品的總膽固醇濃度及/或LDL-C濃度及/或HDL-C濃度是否有任何差異，其中若為以下則該抗體有效治療(i)測試樣品的總膽固醇濃度及/或LDL-C濃度比對照樣品低；及/或(ii)測試樣品的HDL-C濃度比對照樣品高；且其中若測試樣品的總膽固醇濃度及/或LDL-C濃度高於對照樣品，則該抗體對於疾病或病況具有反效應。

37.如態樣36之方法，其中該抗體或抗體之抗原結合片段以1 mg/kg體重、3 mg/kg體重或10 mg/kg體重的濃度投與給嚙齒動物。

38.如態樣36之方法，其中測試嚙齒動物與對照嚙齒動物相同，且對照樣品是在投與該抗體或抗原結合片 段之前取得。

39.如態樣34之方法，其中測試嚙齒動物與對照嚙齒動物不同。

40.如態樣36之方法，其中該嚙齒動物選自於由倉鼠、小鼠、大鼠、天竺鼠及兔子所組成之群組。

41.如態樣40之方法，其中該嚙齒動物為倉鼠。

42.如態樣41之方法，其中該嚙齒動物為敘利亞倉鼠。

43.如態樣43之方法，其中該嚙齒動物為雄性嚙齒動物。

44.如態樣36之方法，其中該嚙齒動物為正常血脂或高血脂。

45.如態樣36之方法，其中測試樣品與對照樣品總膽固醇濃度及/或LDL-C濃度及/或HDL-C濃度的任何差異表示在其他諸如人類的哺乳類動物或爬蟲類動物或鳥類中有相同的體內效應。

46.如態樣36之方法，其中與LDL-C濃度升高相關的疾病或病況是選自於由高膽固醇血症、高血脂症、血脂異常、動脈粥狀硬化及心血管疾病所組成之群組。

47.如態樣36之方法，其中對照嚙齒動物是與測試嚙齒動物相同的物種。

48.如態樣36之方法，其中對照嚙齒動物是與測試嚙齒動物相同的品系。

49.如態樣36之方法，其中總膽固醇濃度及/或LDL-C濃度及/或HDL-C濃度是藉由比色、光度、螢光、重 力或光譜法的方式測定。

50.如態樣36之方法，其中該測試樣品與該對照樣品為血液、血漿或血清。

51.一種測試化合物調節個體膽固醇濃度之效力的套組，其包含：嚙齒動物及PCSK9專一性拮抗劑。

52.如態樣51之套組，其中PCSK9專一性拮抗劑是抗體或抗體之抗原結合片段。

53.如態樣52之套組，其中抗體或其抗體結合片段包含選自於由以下所組成之列表的一或多個序列：SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18及SEQ ID NO：19。

54.如態樣51之套組，其中嚙齒動物係選自於由倉鼠、小鼠、大鼠、天竺鼠及兔子所組成之群組。

55.如態樣54之套組，其中該嚙齒動物為倉鼠。

56.如態樣55之套組，其中該嚙齒動物為敘利亞倉鼠。

57.如態樣51之套組，其中該嚙齒動物為雄性嚙齒動物。

58.如態樣51之套組，其中該嚙齒動物為正常血脂或高血脂。

第1圖是在研究1中吃正常飼料的雄性敘利亞倉鼠於單次s.c.注射1、3或10 mg/kg的316P或PBS(對照)之後的平均血清變化，A：低密度脂蛋白-膽固醇；B：總膽固醇與C：三酸甘油酯。各資料點表示各時間點的平均值±SEM(n=6)。

^# P 0.05，雙因子ANOVA繼而天然對照相對PBS對照進行丹內特檢定(Dunnett test)。

^＊ P 0.05，雙因子ANOVA繼而處理組相對PBS對照進行丹內特檢定。

第2圖是在研究2中吃正常飼料的雄性敘利亞倉鼠於接受每天2次p.o.給藥10 mg/kg或20 mg/kg的阿托伐他汀(atorvastatin)持續7天，繼而單次s.c.注射10 mg/kg的316P或PBS(對照)的平均血清變化，A：低密度脂蛋白-膽固醇；B：總膽固醇與C：三酸甘油酯。各資料點表示各時間點的平均值±SEM(n=10)。

第3圖是在研究1中吃正常飼料的雄性敘利亞倉鼠於單次s.c.注射1、3或10 mg/kg的316P或PBS(對照)之後的平均316P(hFc)濃度。各資料點表示各時間點的平均值±SEM(n=6)。

第4圖為西方墨點分析，顯示肝臟低密度脂蛋白受體(LDLR)蛋白在以PBS s.c.(對照)、316P 10 mg/kg、阿托伐他汀2×20 mg/kg、316P+阿托伐他汀或PBS p.o.對照處理的正常血脂倉鼠中的相對濃度。

第5圖是關於PCSK9的序列，其中第5a)圖顯示如GenBank存取編號XP_00349578.1之中國倉鼠的PCSK9胺基酸序列(SEQ ID NO：1)、第5b)圖顯示人類PCSK9的胺基酸序列(SEQ ID NO：2)。人類PCSK9的蛋白質序列是進一步由NCBI資料庫以參考編號NP_777596(例如NP_777596.2)擷取而來。第5c)圖顯示如GenBank存取編號XM_003495737之中國倉鼠的PCSK9 mRNA的核酸序列(SEQ ID NO：11)。序列是由NCBI資料庫藉由存取編號以連結http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/擷取而來。

第6圖是關於用於本發明中之抗體316P的序列，其顯示SEQ ID NO：3、4、5、6、7、8、9及10。更多關於此等序列的詳情描述於「用於實施本發明的較佳抗體」段落中。

第7圖是關於抗體300N的序列，抗體300N是用於本發明的更佳抗體，其顯示SEQ ID NO：12、13、14、15、16、17、18及19。更多關於此等序列的詳情描述於「用於實施本發明的較佳抗體」段落中。

<110> Sanofi

<120> 用於鑑定及特徵化降脂藥劑之測試系統及方法

<130> DE 2012/

<160> 19

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 693

<212> PRT

<213> 倉鼠

<400> 1

<210> 2

<211> 692

<212> PRT

<213> 智人

<400> 2

<210> 3

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗體序列

<400> 3

<210> 4

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗體序列

<400> 4

<210> 5

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗體序列

<400> 5

<210> 6

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗體序列

<400> 6

<210> 7

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗體序列

<400> 7

<210> 8

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗體序列

<400> 8

<210> 9

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗體序列

<400> 9

115

<210> 10

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<222> 1..113

<223> 抗體序列

<400> 10

<210> 11

<211> 2082

<212> DNA

<213> 倉鼠

<400> 11

<210> 12

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗體序列

<400> 12

<210> 13

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗體序列

<400> 13

<210> 14

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗體序列

<400> 14

<210> 15

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗體序列

<400> 15

<210> 16

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗體序列

<400> 16

<210> 17

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗體序列

<400> 17

<210> 18

<211> 127

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗體序列

<400> 18

<210> 19

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗體序列

<400> 19

Claims (54)

1. 一種用於篩選化合物的方法，以鑑定用於調節與LDL-C濃度升高相關之疾病或病
2. 況的治療候選物，該方法包含：(a)提供嚙齒動物，(b)將測試化合物投與該嚙齒動物，及(c)偵測該化合物在該嚙齒動物體內相較於對照嚙齒動物是否增加或降低一或多個選自於由以下所組成之群組的參數：總膽固醇(TC)、低密度膽固醇(LDL-C)及高密度膽固醇(HDL-C)；其中該一或多個參數之調節表示該化合物是用於在體內調節該疾病或病況的候選物。
3. 一種用於篩選化合物的方法，以鑑定用於調節與LDL-C濃度升高相關之疾病或病況的治療候選物，該方法包含：(a)提供嚙齒動物，(b)將測試化合物投與該嚙齒動物，(c)在以該化合物處理該嚙齒動物之前，測定該嚙齒動物的一或多個選自於由以下所組成之群組的參數：總膽固醇(TC)、低密度膽固醇(LDL-C)及高密度膽固醇(HDL-C)，(d)在以該化合物處理該嚙齒動物之後，測定該一或多個參數，及(e)比較(a)中所得到的結果與(b)中所得到的結果， 其中相較於(b)的結果，(a)參數的改變表示該化合物是用於在體內調節該疾病或病況的候選物。
4. 如申請專利範圍第1或2項之方法，其中該等參數是在體外於一或多個取自嚙齒動物的樣品中測定。
5. 如申請專利範圍第3項之體外方法，其包含申請專利範圍第1項之步驟(c)，或包含申請專利範圍第2項之步驟(c)、(d)及(e)。
6. 如申請專利範圍第1至4項之一者的方法，其中一或多個參數之調節表示在其他諸如人類的哺乳類動物或爬蟲類動物或鳥類中有相同的體內效應。
7. 如申請專利範圍第1至5項之一者的方法，其中總膽固醇及/或LDL-C降低及/或HDL-C增加表示該化合物在體內是用於治療或預防一或多種該疾病或病況的候選物，且其中總膽固醇及/或LDL-C增加表示該化合物表現出反效應且在體內是促進或誘發一或多種該疾病或病況的候選物。
8. 如申請專利範圍第1至6項之一者的方法，其中該化合物為生物分子，諸如抗體、反義、siRNA或適體(aptamer)；或小分子，諸如HMG-CoA還原酶抑制劑，例如史塔丁。
9. 如申請專利範圍第1或2項之方法，其中相較於參考，申請專利範圍第1項之嚙齒動物或申請專利範圍第2項之嚙齒動物的PCSK9濃度或活性降低。
10. 如申請專利範圍第1、2或8項之一者的方法，其中PCSK9拮抗劑及較佳專一結合至PCSK9之抗體已在步驟(c)之前投與申請專利範圍第1項之嚙齒動物，或在步驟(a)之前投與申請專利範圍第3項之嚙齒動物。
11. 如申請專利範圍第9項之方法，其中該化合物為HMG-CoA還原酶的抑制劑，且較佳為史塔丁。
12. 一種測試專一結合hPCSK9之抗體或其抗原結合片段供治療與LDL-C濃度升高相關之疾病或病況之效力的方法，該方法包含：(a)將該抗體投與嚙齒動物；及(b)在將該抗體或其抗原結合片段投與該嚙齒動物之前與之後，測定該嚙齒動物的總膽固醇、LDL-C或HDL-C濃度，其中相對於在投與該抗體之前所測得之投藥前濃度，在投與該抗體之後測得總膽固醇及/或LDL-C濃度降低，及/或HDL-C濃度升高表示該抗體或其抗原結合片段有效治療該疾病或病況，以及其中相對於在投與該抗體之前所測得之投藥前濃度，在投與該抗體之後測得總膽固醇濃度及/或LDL-C濃度增加表示該抗體在體內對於促進、引起或誘發該疾病或病況表現出反效應。
13. 一種測試專一結合hPCSK9之抗體或其抗原結合片段供調節與LDL-C濃度升高相關之疾病或病況之效力的方法，該方法包含： (a)在以該抗體處理嚙齒動物之前，測定得自嚙齒動物之體外樣品中的總膽固醇濃度、LDL-C濃度及/或HDL-濃度，(b)在以該抗體處理嚙齒動物之後，測定得自嚙齒動物之體外樣品中的總膽固醇濃度、LDL-C濃度及/或HDL-濃度，及(c)比較(a)中所得到的結果與(b)中所得到的結果，其中相對於在投與該抗體之前於(a)中所測得之投藥前濃度，在(b)中所測得之總膽固醇及/或LDL-C濃度降低，及/或HDL-C濃度增加表示該抗體或其抗原結合片段有效治療及/或預防該疾病或病況，以及其中相較於在(a)中所測得之投藥前濃度，在(b)中之總膽固醇濃度及/或LDL-C濃度增加表示該抗體在體內對於促進、引起或誘發該疾病或病況表現出反效應。
14. 如申請專利範圍第11或12項之方法，其中該嚙齒動物已被投與在人類體內降低總膽固醇及/或LDL-C濃度及/或增加HDL-C濃度之化合物，且其中該化合物已在申請專利範圍第11項之方法中測定投藥前濃度之前投與，及在申請專利範圍第12項之步驟(a)取得樣品之前投與。
15. 一種測試專一結合hPCSK9之抗體或其抗原結合片段供治療與LDL-C濃度升高相關之疾病或病況之效力的方法，該方法包含： (a)將該抗體投與嚙齒動物；及(b)在投與該抗體或其抗原結合片段之後，藉由測定嚙齒動物的總膽固醇濃度及/或LDL-C濃度及/或HDL-C濃度來決定該抗體或其抗原結合片段的效力，(c)測定未以該抗體處理且較佳地獲得安慰劑之對照嚙齒動物的總膽固醇濃度及/或LDL-C濃度及/或HDL-C濃度，其中若(c)中所測得的總膽固醇濃度及/或LDL-C濃度比(b)中所測得者還低，且及/或(c)中所測得的HDL-C濃度比(b)中所測得者還高，則該抗體被認為是有效治療該疾病或病況，以及其中若(c)中所測得的總膽固醇濃度及/或LDL-C濃度比(b)中所測得者還高，則該抗體被認為是表現反效應。
16. 一種在體外測試專一結合hPCSK9之抗體或其抗原結合片段供治療與LDL-C濃度升高相關之疾病或病況之效力的方法，該方法包含：(a)測定在將該抗體或其抗原結合片段投與嚙齒動物之後所得嚙齒動物樣品中的總膽固醇濃度及/或LDL-C濃度及/或HDL-C濃度，(b)測定得自未以該抗體或其抗原結合片段處理之嚙齒動物的對照樣品中的總膽固醇濃度及/或LDL-C濃度及/或HDL-C濃度， 其中若(b)中所測得的總膽固醇濃度及/或LDL-C濃度比(a)中所測得者還低，且及/或(b)中所測得的HDL-C濃度比(a)中所測得者還高，則該抗體被認為是有效治療該疾病或病況，以及其中若(b)中所測得的總膽固醇濃度及/或LDL-C濃度比(a)中所測得者還高，則該抗體被認為是表現反效應。
17. 如申請專利範圍第14或15項之方法，其中該嚙齒動物與對照嚙齒動物已被投與在人類體內會降低總膽固醇及/或LDL-C及/或增加HDL-C的化合物。
18. 如申請專利範圍第11或16項中任一項的方法，其中該化合物為HMG-CoA還原酶抑制劑，且較佳為史塔丁。
19. 一種測試化合物調節個體膽固醇濃度之效力的方法，該方法包含下列步驟：(a)提供嚙齒動物；(b)將專一結合PCSK9的抗體或其抗原結合片段投與該嚙齒動物；(c)將測試化合物投與該嚙齒動物；(d)在投與該測試化合物之後，測定該嚙齒動物的一或多個選自於由以下所組成之群組的參數：總膽固醇濃度、LDL-C濃度或HDL-C濃度，(e)測定未以該測試化合物刺激之對照嚙齒動物的一或多個相同參數，其中在(a)中所測得與(b)中所測得的膽固醇(總膽固醇或 LDL-C或HDL-C)有差異表示該測試化合物有效調節個體的膽固醇濃度。
20. 一種在體外測試化合物調節個體膽固醇濃度之效力的方法，該方法包含下列步驟：(a)在已對嚙齒動物施用測試化合物之後，測定取自嚙齒動物之樣品中一或多個選自於由以下所組成之群組的參數：總膽固醇濃度、LDL-C濃度或HDL-C濃度，(b)測定未以該測試化合物刺激之對照嚙齒動物樣品的一或多個相同參數，其中除了測試化合物之外，動物皆投與專一結合PCSK9之抗體或其抗原結合片段，以及其中在(a)中所測得與(b)中所測得的膽固醇(總膽固醇及/或LDL-C及/或HDL-C)有差異表示該測試化合物有效調節個體的膽固醇濃度。
21. 如申請專利範圍第18或19項中任一項的方法，其中：相較於對照嚙齒動物的總、LDL或HDL膽固醇濃度，嚙齒動物或其樣品中測得的膽固醇(總膽固醇及/或LDL-C)濃度降低及/或HDL-C濃度增加表示該測試化合物有效治療或預防一或多種與個體LDL-C濃度升高相關的疾病或病症，且其中相較於對照嚙齒動物的總或LDL膽固醇濃度，測試嚙齒動物或其樣品中測得的膽固醇(總膽固醇及/或LDL-C)濃度增加表示該測試化合物具有反效應且 可能促進、引起或誘發與LDL-C濃度升高相關之疾病或病況。
22. 一種測試化合物調節個體膽固醇濃度之效力的方法，該方法包含下列步驟：(a)提供嚙齒動物；(b)將專一結合PCSK9的抗體或其抗原結合片段投與該嚙齒動物；(c)將測試化合物投與該嚙齒動物；(d)於(i)測試化合物投與該嚙齒動物之前，及(ii)測試化合物投與該嚙齒動物之後，測定該嚙齒動物的一或多個選自於由以下所組成之群組的參數：總膽固醇濃度、LDL-C濃度或HDL-C濃度，(e)比較(d)(i)與(d)(ii)中所得到的參數，其中在(d)(i)中所得參數與(d)(ii)中所得參數有差異表示該測試化合物有效調節個體的膽固醇濃度。
23. 一種在體外測試化合物調節個體膽固醇濃度之效力的方法，該方法包含下列步驟：(a)於(i)將測試化合物投與該嚙齒動物之前所得之嚙齒動物樣品中，以及(ii)在將測試化合物投與所得之相同嚙齒動物的樣品中， 測定一或多個選自於由以下所組成之群組的參數：總膽固醇濃度、LDL-C濃度或HDL-C濃度，及(b)比較(a)(i)與(a)(ii)中所得到的參數，其中該嚙齒動物已投與專一結合PCSK9之抗體或其抗原結合片段以及測試投與化合物，及其中在(a)(i)中所得參數與(a)(ii)中所得參數有差異表示該測試化合物有效調節個體的膽固醇濃度。
24. 如申請專利範圍第21或22項之方法，其中相較於(i)，(ii)的膽固醇(總或LDL-C)濃度降低及/或HDL-C濃度增加表示測試化合物有效治療或預防一或多種與個體LDL-C濃度升高相關之疾病或病症。
25. 如申請專利範圍第21或22項之方法，其中相較於(i)，(ii)的膽固醇(總或LDL-C)濃度增加表示測試化合物具有反效應且對於促進、引起或誘發一或多種與個體LDL-C濃度升高相關之疾病或病症。
26. 如申請專利範圍第20至24項中任一項的方法，其中對照嚙齒動物與測試嚙齒動物是相同物種，且較佳亦是相同品系。
27. 如申請專利範圍第1、w、18、19、21或22項中任一項的方法，其中該測試化合物為PCSK9抑制劑，諸如PCSK9抗體或HMG-CoA還原酶抑制劑，例如史塔丁。
28. 如申請專利範圍第9、11、12、14、15、18、19、21、22或26項中任一項的方法，其中該抗體以1 mg/kg體重、3 mg/kg體重或10 mg/kg體重的濃度投與嚙齒動物。
29. 如申請專利範圍第11、14、18或21項中任一項的方法，其中參數或膽固醇濃度是在取得樣品中測定。
30. 如申請專利範圍第3、4、12、15、19、22或28項中任一項的方法，其中膽固醇濃度是藉由比色、光度、螢光、重力或光譜法的方式測定。
31. 如申請專利範圍第3、4、12、15、19、22、28或29項中任一項的方法，其中該樣品是血液、血漿或血清。
32. 如申請專利範圍第1至30項中任一項的方法，其中該方法的結果被解釋為表示適於該方法所用物種以外的其他物種，諸如所用物種以外的其他嚙齒動物、所用物種以外的其他哺乳類動物，且較佳為人類。
33. 如申請專利範圍第1至31項中任一項的方法，其中與LDL-C濃度升高相關的疾病或病況是選自於由高膽固醇血症、高血脂症、血脂異常、動脈粥狀硬化及心血管疾病所組成之群組。
34. 一種用於鑑定供治療與膽固醇濃度升高相關疾病的藥劑之嚙齒動物，且該疾病較佳地是與LDL-C濃度升高相關，其中該嚙齒動物相較於對照嚙齒動物的PCSK9濃度降低。
35. 一種嚙齒動物的用途，其具有相較於對照嚙齒動物之降低的PCSK9濃度，其係作為模型系統供測定藥劑調節膽固醇的效用，且較佳地係降低膽固醇的效用。
36. 如申請專利範圍第33項之嚙齒動物或如申請專利範圍第34項之用途，其中該藥劑為HMG-CoA還原酶抑制 劑。
37. 如申請專利範圍第33項之嚙齒動物，其係用於如申請專利範圍第1、2、18、19、21或22項中任一項的方法中。
38. 如申請專利範圍第35或36項之嚙齒動物或如申請專利範圍第34項之用途，其中PCSK9活性或表現濃度降低是因為遺傳剔除PCSK9、穩定或暫時抑制PCSK9或投與PCSK-9拮抗劑所致。
39. 一種製備適於用作為模型系統供測定藥劑調節膽固醇效用之嚙齒動物的方法，而較佳係降低膽固醇的效用，該方法包含提供嚙齒動物或嚙齒動物之囊胚，以及藉由遺傳剔除PCSK9、穩定或暫時抑制PCSK9或投與PCSK-9拮抗劑的方式來降低其PCSK9濃度。
40. 如申請專利範圍第37項之嚙齒動物或用途或如申請專利範圍第39項之方法，其中PCSK9活性或表現濃度降低是因為將PCSK-9拮抗劑(較佳為專一性PCSK9抗體)投與嚙齒動物所致。
41. 如申請專利範圍第1至32項中任一項的方法、如申請專利範圍第34項之用途或如申請專利範圍第33或39項中任一項的嚙齒動物，其中該嚙齒動物是選自於倉鼠、小鼠、大鼠、天竺鼠及兔子，且較佳為倉鼠。
42. 如申請專利範圍第40項之方法、用途或嚙齒動物，其中該嚙齒動物為倉鼠，且較佳為敘利亞倉鼠。
43. 如申請專利範圍第1至41項中任一項之方法、用途或 嚙齒動物，其中該嚙齒動物為雄性嚙齒動物。
44. 如申請專利範圍第1至42項之方法、用途或嚙齒動物，其中該嚙齒動物為正常血脂或高血脂，且較佳為正常血脂。
45. 一種藉由如申請專利範圍第39至43項中任一項的方法獲得，且較佳藉由投與PCSK9專一性抗體獲得之嚙齒動物，較佳為倉鼠。
46. 一種用於如申請專利範圍第1至32項中任一項的方法的套組，其包含嚙齒動物，較佳為倉鼠；以及PCSK9專一性拮抗劑，諸如PCSK9專一性抗體，並視情況含有一或多種如申請專利範圍第44至47項中任一項的其他組分。
47. 一種製造物品，其包含：(a)包裝材料或容器；(b)專一結合hPCSK9的抗體或其抗原結合片段；及(c)資料載體，諸如包裝材料包含的標籤或包裝插頁，其含有執行如申請專利範圍第1至38項中任一項的方法的指示，該方法是用於分析或鑑定供治療或預防高膽固醇血症、高血脂症、血脂異常、動脈粥狀硬化及心血管疾病的化合物，以及視情況選用(d)一或多種緩衝劑及/或試劑供測定樣品的總膽固醇濃度、LDL-C濃度或HDL-C濃度。
48. 一種製造物品，其包含：(a)包裝材料或容器； (b)試劑及緩衝劑，供測定樣品的總膽固醇濃度、LDL-C濃度或HDL-C濃度；及(c)資料載體，諸如標籤，其含有執行如申請專利範圍第1至38項之一者的方法的指示，以及視情況選用的(d)專一結合hPCSK9的抗體或其抗原結合片段。
49. 如申請專利範圍第44或45項的製造物品，其進一步包含一或多隻嚙齒動物。
50. 如申請專利範圍第44至46項中任一項的製造物品，其包含一資料載體，其中該資料載體包含諸如以下的資訊(i)使用抗體或其片段的指示，(ii)品質資訊，諸如關於抗體或物品的批號及/批數、製造或組合地點或有效期限或有效期的資訊、關於正確儲存或操作物品的資訊，(iii)關於用以測定膽固醇濃度的緩衝劑、稀釋劑、試劑之組合物或使用抗體的資訊，(iv)關於釋明實行上述方法時所得資訊的資訊，(v)當實施不當方法時，關於可能的誤釋或錯誤結果的警示，及/或(vi)當使用不當試劑及/或緩衝劑時，關於可能的誤釋或錯誤結果的警示。
51. 如申請專利範圍第1至32項中任一項的方法、如申請專利範圍第34至39項中任一項的用途、如申請專利範圍第35至39項中任一項的嚙齒動物、如申請專利範圍 第43項之套組或如申請專利範圍第44至47項中任一項的製造物品，其中該嚙齒動物係選自於倉鼠、小鼠、大鼠、天竺鼠及兔子，且較佳為倉鼠。
52. 如申請專利範圍第48項之方法、用途、嚙齒動物、套組或製造物品，其中該嚙齒動物為倉鼠，且較佳為敘利亞倉鼠。
53. 如申請專利範圍第1至49項中任一項的方法、用途、嚙齒動物、套組或製造物品，其中該嚙齒動物為正常血脂或高血脂，較佳為正常血脂。
54. 如申請專利範圍第50項之方法、用途、嚙齒動物、套組或製造物品，其中該嚙齒動物為正常血脂敘利亞倉鼠，且較佳為正常血脂雄性敘利亞倉鼠。