201231664 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明侧於-種將咖⑽基_接嵌入大腸桿菌染色體上之獅 1咖’以生產驗基丁醋(PHB)菌株的方法，特別是指一種利用基因轉殖技 術，將咖⑽基因，轉殖到大腸桿菌内，並誘導大腸桿菌以產生聚經基丁 酯(PHB)產物。 j 【先前技術】 近年來，由於環保意識的抬頭，不可分解的石化瓣製品，對環 境的破壞«源的浪費，0成為各界關注並亟欲解決的議題；因此，尋求 低成本、可分解的替代材料是目前各方所努力的目標。 微生物為了適應自然界錄的環境，在不利於其生㈣惡劣條件下， 通常會在體内產生、累積特定的能源物質而得以存活下去，在這些物質當 中，聚羥基烷酯(Polyhydroxyalkanoates ’ PHAs)因為具有生物相容性 _C〇mpatible)、生物可分解性(biodegradable)及可塑性咖⑹吻），其物理 性質類似於娜產品(如:聚乙稀polyethy|ene)，因此可作為替代石化塑勝的 生物塑穆補，以職㈣聽瓣不馳分解所造細環境污染問題， 並可進步研發成為南價值的生醫材料，以供生物工程和生物醫學界應用。 5^基院SI(PHAs)這種聚醋類是某些細菌用以儲存能量的形式當這 些細菌處於碳源過剩且缺乏某一類營養素(例如：N、p、s、〇或Mg等） 的環境時，便會在細胞_積驗魏s旨(PHAs)，以供作獅並儲存能量。 聚祕烧S旨(PHAs)及其相關衍生物是由不同微生物代謝而來的，其分 類是依照碳原子數目而作區分。例如：含3〜5碳為聚經基丁醋 (polyhydroxybutyrate，phb);含為短碳鏈的聚羥基院師丨印典 scl-PHAs);而侧鏈碳數在6_1〇個碳時，則為中長碳鏈的聚羥基烷酯 (medium-chain-length，mcl-PHAs)。 201231664 在用以生產聚經基丁醋(polyhydroxybutyrate，PHB)的微生物中， Cupriavidus necator(先前稱為 Ralst〇nia eiltropha)最被廣泛使用。Ralst〇nia eutropha Alcaligenes latus r§j i ^.Ι^.^.ΊΓΘθ(ΡΗΒ) y 相較於其他野 生型生產聚經基丁醋(PHB)的微生物，含有PHA基因的重組大 腸桿菌被應用在聚經基丁酯(PHB)的生產上更具優勢，其優點包括能用利用 廣泛的碳源、聚羥基丁酯(PHB)蓄積量高、細胞較脆弱(有利於ρΗβ的取 知·），及在發酵過程中由於缺乏細胞内的聚經基丁醋分解酶(PHb depolymerases)而使聚羥基丁酯(PHB)不致被分解。 • 在異質菌體宿主(hetero丨0g〇us bacterial hosts)之血紅蛋白(hemoglobin， VHb)表現中包含一 基因，特別在限制氧氣條件下此叹办基因會增強細 胞的密度、氧化代謝、蛋白質及抗生素生產及細胞修復活動。其他有利的 影響包括&尚真菌的抗生素生產，在哺乳動物細胞中增加組織型纖溶酶的 合成，並加快植物的生長。一些研究指出，VHb對菌體成長的幫助是來自 於直接影響呼吸氧化酶’而此酵素提供氧氣，從而提高氧化填酸化反應(三 磷酸腺苷的生產）。此外，我們證實，”办與p在重組質體的表現中 能幫助聚羥基丁酯(PHB)的生產。 目前生產聚羥基丁酯&〇丨丫1^£11*(巧1)吻恤，？1^)所使用菌株之一為利 • 肖大腸桿菌來大量發酵生產。雖然大腸桿菌本身不帶有合成聚經基丁酷 (PHB)相關之基因，因此大多數的大腸桿菌菌株都以質體攜帶咖⑽的方 式來生產聚經基丁醋(PHB)，質體表現咖⑽蛋白的好處為〒數目多， 但是相對的要轉«的穩定’則需要耗f大量的抗生素成本，因此，本 發明將咖CAB基隨入大腸桿菌染色體之吻版us中，且成功地表現相 關蛋白酵素來產生聚經基丁醋(觸）。此重組菌株仍有其缺點因為嵌入染 色體中使得基因變成1個C〇py，比起質體的多個c〇py數目相差甚大因此 表現的PHB内含物的比例就相對的較質體的表現方式為低，此問題仍需進 一步的克服。 201231664 由此可見，上述習用以質體攜帶的方式來產生PHB的方法仍 有諸多缺失’實非一良善之設計者，而亟待加以改良。 本案發明人鑑於上述習用以質體攜帶pkCAB的方式來產生PHB的方 法所衍生的各碰點，乃$思加赠良鑛，並㈣年苦^^旨潛心研究 後，終於成功研發完成本件一種將di_expressing CAB v沙基因嵌入大 腸桿菌染色體中之吻β l〇cus區域(丨〇cus)來產生PHB之方法。 【發明内容】 本發明之目的即在於提供一種藉由重組大腸桿菌以生產聚羥基丁酸 S曰(PHB)的方法，利用基因轉殖方法，將生產聚羥基丁酯(pHB)的尸 基因轉殖入大腸桿菌中。 本發明的目的為一種藉由重組大腸桿菌以生產聚羥基丁酯(pHB)的方 法，其方法包括： ⑴提供一大腸桿菌(£sc/ien_dna co/i)微生物； (2) 提供一具有基因的DNA構築物； (3) 將(2)所得之DNA構築物轉殖到(1)之大腸桿菌c〇/l·)微 生物體内； (4) 將(3)所得之重組大腸桿菌進行筛選； (5) 將(4)所得之重組大腸桿菌進行培養； ⑹收取(5)所獲得之大腸桿菌菌體，純化獲得聚羥基丁酯(pHB)。 將冲妙基因片匣(cassette)插入到大腸桿菌K12的rt/pfl區域 (locus)中，為了篩選和分析重組大腸桿菌，將一段抗慶大霉素(gentamidn， GM)的基因片匣(cassette)連接於下游的吻β·.冲flC4fi v奸基因片段的載 體’進而轉殖入大腸桿菌。藉由接合生殖(c〇njUgati〇n)的方式將 «/pB::p/wC4B-v沙基因片段從大腸桿菌317_1(^的轉移至大腸桿菌κΐ2,再 201231664 經由同源重組方法將基因插入染色體中，由此完成含有之重組 菌株’稱為大腸桿g YH100(£. co/iYHIOO)。 【實施方式】 一、實驗材料： 菌株及質體 此實驗中所使用的菌株及質體種類歸納列表於表一，培養基於滅菌前 將酸驗值調整至6·8。大腸桿菌培養於Luria_Bertani培養基(組成為丨〇克/ 公升姨化蛋白胴(tryptone) ’ 5克/公升酵母萃出物(yeast extract) 10克/公升 氣化鈉(NaCl)及1%葡萄糖)中，L5%Bact0™瓊脂(agar)加入形成固態培 養基中。 兔一、本實驗中所使用之菌株、質體及引子列表
種類 相關特性 參考來源 菌株 ATCC E. coli KI2 E. coli MG 1655 Invitrogen E. coli DH5a F*O80 /αοΖΔΜ 15 recA endAl A(lacZYA-argF)U\69 deoR gyrA96 thiA hsdR\7 supEAA relAl E. co/i SI7-1 X'pir lysogen of SI7-1 [thi pro hsdR hsdM+ Mtvl RP4 2-Tc::Mu，ICm::Tn7(TprSmr);宿主細 胞能夠藉由Pir蛋白質將自殺質體轉殖入受體 細胞 YH100 £, co/ί K12 加入p/iaC4B-v冲基因；Gmr 本實驗 質體 pYH-1 pUT::nlpB::phaCAB-vgb::GmR ； Gmr ； Ampr 本實驗 引子 phaC-F 5，-CCATATCGCTTCGCTGCC phaC-R 5’-CCACGACACCAGAAACACC nlpB-FF 5，-GTCGACAAAACTACACCATCACCCAAC nlpB-FP 5’-CCCGGGACTTTCATGCCCACTTTTTCC
酵素及藥品 DNA 限制酶(restriction enzyme)及修御酶(modification enzyme)購買自 201231664 羅氏藥廠(Roche)。7bg聚合酶p〇|ymerase)及聚合酵素鏈索反應 (polymefase chain reaction，PCR)相關產物賭自於 Perkin-Elmer 或 Takara Biomedicals。其他實驗等級化學藥品購自sigma❽⑽以丨c〇mpany。 二、實驗方法： 聚羥基丁酯(PHB)定量法
將細菌株於37。(：下，置於菌株培養液中，震盪培養(轉速為2〇〇rpm)48 小時後’測量菌株細胞乾重及聚羥基丁酯(PHB)重量。於50〇c中，將〇5 克乾燥菌體加入40%鈉十二烷基的硫酸鹽(s〇dium d〇decysuifate, SDS) 5mL 申反應5分鐘，離心以水沖洗並乾燥後獲得聚羥基丁酯(ρΗβ卜將聚羥基丁 S旨(PHB)於60。(：溶於氣仿24小時後以氣象層析儀(gas ch_at〇graphy，GC) 定量，含量以聚羥基丁酯(PHB)重量除以乾燥細胞重來表示(wt%)，濃度以 細菌懸浮液體積及聚羥基丁酯(PHB)含量計算而得。 聚羥基丁酯(PHB)定性分析 將樣品(大約5-10毫克)密封於鋁瓶中，熱譜測量溫度由_4〇〇c至2〇〇〇c 以每分鐘請咖S度下鄕分⑽—段_)，移_減氣(流速為4〇 毫升/分鐘）；該樣品保存在2,5分鐘，以消除熱歷史(thermal w卿），隨 後以冷卻料um分齡卻至机，織再加_2⑽。^麵财率1〇。〇 分鐘（第二段掃則並且在相·氣條件τ進行；熱譜測量以空白織來 做基線校正。樣本也進-步分析了重量損失，方法為料祕了醋(ρΗΒ) 在動態掃描模式下，使用PerkinElmer❼出巧的熱重分析儀 (th咖ogravimetric analyzer，TGA)來偵測。1〇至ls毫克樣品於沁至權弋 以每分鐘上升就速度下且魏流速為40毫升/分鐘下進行掃描分析。 201231664 尼羅紅染色法(Nile red stain) 聚羥基丁酯(PHB)顆粒在重組菌株培養在LB瓊脂平板含1%螢光染料 及尼羅河紅染料。PHB的顆粒下觀察細菌的紫外線光照條件。 西方印染法(Western blotting) 細菌細胞以phosphate-buffered saline(PBS, pH7.5)進行沖洗，並溶於細 胞裂解液(cell lysis buffer，pH7.2)(20mM piperazine-N，N，-bis(2-ethanesu丨f〇nic acid, PIPES) ’ lOOmMNaCl，ImMphenylmethylsulfonyl fluoride)中。將樣品 冰浴30分鐘後’於4<)C、14,000轉速下離心3〇分鐘。離心後上清液以i2.5〇/0 十一院基硫酸納聚丙稀醜胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)分析。將分離後之蛋白質移轉至聚偏氟乙烯 膜(polyvinylidene difluoride membrane)上，並將此聚偏氟乙烯膜浸泡於封閉 液(blocking buffer)(包含5%牛奶，0.1% Tween20)中一小時。進一步將此聚 偏氟乙烯膜浸泡於具有抗VHb表現多克隆抗體(anti_VHb polyclonal antibodies)，隨後又將此聚偏氟乙烯膜於室溫下浸泡於封閉液1小時，其次 以辣根過乳化物扭的抗兔二抗體（horseradish peroxidase-conjugated anti-rabbit second antibody)標記處理卜|、時後再以χ光膠片（X_ray f丨丨叫曝
穿透式電子顯微鏡(Transmission electron microscopy，TEM) 包裹在菌體中的聚羥基丁酯(PHB)經由穿透式電子顯微鏡(TEM)檢查負 染準備。將一滴菌液(包含1〇12 PFU/ml)塗抹在一個formvai·表面塗層網格 (200目銅網格）上’以2%的uranyl-acetateteandrup進行負染色，然後在 曰立H-7500透式電子顯微鏡在8〇千伏(kv)下操作。 9 201231664 三、實驗結果： 將rt//?Rv/?；wC4fl-v冲基因嵌入大腸桿菌(£. co/〇中 為了將外來DNA導入大腸桿菌染色體中，首先選擇一個非必要之基因 或位點作為同源重組(h〇m〇i〇gOUS recombinati〇n)的目標基因。先前的實驗發 現’基因的存在與否並不影響大腸桿菌生存能力。因此，將ρΛα(：/1队 基因片匣(cassette)插入到大腸桿菌Κ12的φβ區域(l〇cus)。為了篩選和分 析重組大腸；f干菌，將一段850-bp抗慶大霉素(gentamicin，GM)的基因片g (cassette)連接於下游的沙基因片段的載體，進而轉殖入大 腸桿菌。 簡單地說，n/ρβ基因的3’區域藉由聚合酶鏈鎖反應(p〇iymerase chain reaction，PCR)並且使用引子對吻B_FF/n/沖_FR來擴增該段區域。擴增產物 被轉殖到pCR2_l ’再用Sall/Smal切出η/ρβ片段。另一個DNA片段， ’從質體pSY〇2中用Smal/历mflll酵素切出。這兩個片段，„/ρΒ 和p/wCMfi-v沙，連同GmR基因片匣(cassette)被//imflllASmal所切出，一起 連接到被Smal所切出的pUTmini_Tn5_kmi自殺載體(slUdde vect〇r)，以形 成 ρυΤ-η/ρβ.νρΛαΟΙβ-ν政:.ΌηΊΚ ’ 稱為 pYH-1(如圖 1A 所示）。 為了達到經由同源重組將基因成功插入染色體中，pYH-1經由接合生 殖(conjugation)的方式從大腸桿菌817_1(λρίΓ)轉移至大腸桿菌Κ12，接合子 (transconjugants)分布於含慶大霉素(gentamicin)(丨5微克/毫升)之lb培養皿 中’經由聚合酶鏈鎖反應(p〇lymeraSe chain reacti〇n，pCR)及 pha F/phaC_R 引子對的使用篩選出轉殖的目標物（如圖IB所示），由此產生之含 沙重組菌株被稱為大腸桿菌YH100(£. co/i YH100)。 重組大腸桿菌(£· coZ〇YHl〇〇表現型(phenotype) 比較分析了 ；^aC4B-vgb重組大腸桿菌yjboo和野生型大腸桿菌κΐ2 的細胞生長速率(如圖2所示），細胞生長曲線藉由測量光密度值在 600nm 201231664 所得’在沒有抗生素的存在下’ YHU)0菌株(生長超過48小時)的生長速度 顯者兩於K12菌株的生長速度(如圖2A所示）。 為了證實咖C4B-V冰基因的表達，尼羅紅染色法⑽卜_和西方印染 法(Western blotting)分別用來評估功能性PhaCAB和VHb表現’重組菌株 YH100暴露在紫外線燈下的顏色為紅色(陽性結果）；在尼羅紅染色法中，不 同於K12菌株(control)的表現(如圖2B所示）。 VHb的表現’經由v沙編碼，透過西方印染法(Westem bi〇tting)及抗VHb 表現多克隆抗體(anti-VHb polyclonal antibodies)來證實；VHb表現，分子量 為14kDa，表現在重組菌株YH100上，但不表現在野生型的K12菌株上(如 圖2C所不）。這些結果表示經由此方式成功的將基因表現在在 大腸桿菌上。 重組大腸桿菌(£· co/i)YH100生產聚經基丁醋(phb) 將重組大腸桿菌YH100培養在LB培養基中且以葡萄糖為唯一碳源 (carbon source)培養48小時，檢測出聚羥基丁酯(PHB)積累在重組大腸桿菌 YH100中。聚羥基丁酸醋(PHB)在6(rc以過剩氣仿萃取24小時，並用氣相 色層分析儀(Gas Chromatography ’ GC)分析。最後測得細胞乾重(CDW)、聚 羥基丁酯(PHB)的濃度及聚羥基丁酯(phb)的含量分別為1.2克/升、0.25克/ 升’重量和20.83%。野生型大腸桿菌K12並不生產聚羥基丁醋(PHB)。 經重組大腸桿菌(£：· co/〇YH100生產之聚羥基丁酯(phb)特性 經重組大腸桿菌(£· co/〇YH100生產之聚羥基丁酯(PHB)經由穿透式電 子顯微鏡(Transmission electron microscopy, TEM)來確認。聚羥基丁酯(PHB) 累積在重組大腸桿菌YH100株(如圖3A所示），但野生型的大腸桿菌K12 並不產生聚羥基丁酯(PHB)(如圖3B所示）。所生產之聚羥基丁酯(PHB)之特 性檢測，經重組大腸桿菌YH100生產而純化過的聚羥基丁酯(PHB)和商業 201231664 化的聚沒基丁醋(PHB)(Sigma-Aldrich公司），進行了分子量的評估(如表二所 示）。經重組大腸桿菌YH100生產的聚羥基丁酯(PHB)平均分子量(Mw)和數 目平均分子量比市售的聚羥基丁酯(PHB)高出兩倍。 表二、經重組大腸桿菌(£· CW)YH100生產之聚羥基丁醋(PHB)及市售聚羥基丁醋(PHB) 分子量比較 聚羥基丁酯(PHB)來源 分子量 Mw Μη PDI 重組大腸桿菌(£. co/i)YH 100 1,005,000 733,000 1.37 市售聚羥基丁酯(PHB) 506,000 343,000 1.47
Mw :為平均分子量；:為數目平均分子量；PD丨：為廣分布指數 經重組大腸桿菌YH100生產的聚羥基丁酯(PHB)的廣分布指數 (po丨ydispersity，PDI)比市售的聚羥基丁酯(PHB)更接近單一性，這表 示說經重組大腸桿菌YH100生產的聚羥基丁酯(PHB)之產物符合一般市售 聚合物的特性。經重組大腸桿菌YH100生產的聚羥基丁酯(PHB)的物理特 性’以使用熱插掃描儀(differential scanning calorimetry，DSC)和熱重分析儀 (thermogravimetric ana丨yzer，TGA)分析後，結果呈現於表三和表四。經重組 大腸桿菌YH100生產的聚羥基丁酯(PHB)的熱穩定性，和市售的聚羥基丁 酯(PHB)相近似。 表三、本試驗中聚羥基丁醋(PHB)經熱差掃描儀(DSC)之特性分析 熱差掃描儀(DSC) 第一段加熱掃描 冷卻掃描 第二段加熱掃描 聚羥基丁酯(PHB)來源 Tm(°C) Xn(%) T,(°C) AHc(J/e) Tm(°C) AHm(j/a) XJ%) 重組大腸桿菌YHtOO 178 73 50 75 -47 169 75 51 市售聚羥基丁酯(PHB) 176 84 58 68 -55 175 83 57
Tm :熔點；AHm :熔點熱函；AHC :結晶熱函；ΔΗ(：:結晶熱函；Xc : PHB結晶比例 12 201231664 表四 基丁醋(PHB)經熱重分析儀(DSC)之降㈣磨__ _聚經基丁酯(PHB)央通_ T，(。C) V°C) 大腸桿菌(£. co/AYH 丨 Of) 70S ^ ~^!ΜΪτί(ΡΗΒ) 乃：重量損失之起點溫度；Trf :重量損失之最高溫度 本發明所提供之一種將p/iaCAB基因直接嵌入大腸桿菌染色體上之 n/pfil0CUS ’以生產聚縣丁醋(pHB)菌株的方法，與其他習用技術相互比較 時’更具有下列之優點： L開發能夠穩定生產聚羥基丁酯(PHB)之菌株穩定生產之菌株。 2·解決目前利用質體表現聚羥基丁醋(pHB)不穩定之問題。 3. 解決使用昂貴抗生素之問題。 4. 提高聚羥基丁酯(PHB)生產量及品質。 上列詳細說明係針對本發明之一可行實施例之具體說明，惟該實施例 並非用以限制本發明之補細，凡未麟本發明技藝精神所為之等效實 施或變更，均應包含於本案之專利範圍中。 乡/5上所述，本案不但在方法上確屬創新，且所製得之微生物能較習用 微生物增進上述多項功效，應已充分符合新賴性及進步性之法定發明專利 要件，爰依法提出申請，懇請貴局核准本件發明專利申請案，以勵發明’ 至感德便。 【圖式簡單說明】 圖1、（A)構築基因嵌入大腸桿菌染色體區域之重組菌株 (ΥΗ)。利用基因同源互換技術’將生產ρηβ相關基因放置於吻 基因之後面’使可以於η/ρβ區域表現/相關之蛋白 酵素《^B)利用聚合酶鍵鎖反應(p〇iymerase chain reacti〇n, pcr)來證實 五.co/ι YH100的p/iaC基因。PCR的模板分別為£· co" κΐ2及£. co" 13 201231664 YH100，圖中顯示分子量標記(M)及正對照組。 圖2、野生型大腸桿菌c〇fi K12)及重組大腸桿菌YH100(£. co/i YH100) 之特性比較。(A)培養在LB培養基中之微生物生長曲線在吸光值為6⑻ nm下測量。(B)當基因表現出酵素蛋白後，將可以生合成PHB 生物聚脂，所產生的(ΡΗΒ)可以利用尼羅紅染色法(Nile Red)的方式觀 察到紅色螢光產生(i)為可見光⑼紫外光(3〇〇 nm)。⑹使用西方印染法 (Western blotting)驗證VHb的產生；⑴為經12% SDS-PAGE分離並以 Coomassie Brilliant Blue染色過之細胞粗萃取物；（π)以抗VHb表現多克隆 抗體(anti-VHb polyclonal antibodies)來證實VHb表現，其中對照組為 野生型大腸桿菌(£：· co/i K12)，實驗組為重組大腸桿菌ΥΗ100(£.⑺“ YH100) 〇 圖 3、穿透式電子顯微鏡(Transmjssi〇n士你〇11 mjcr〇sc〇py,TEM) 的觀察方法，可以直接觀察到菌株是否有PHB顆力的產生，由圖三 TEM結果顯示，YH100菌株有產生白色的pHB生物聚脂(A)，相較於 野生株K12則沒有產生任何的phb顆粒(B)。 【主要元件符號說明】 無 14