201120443 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係有關於一種細胞活性評估晶片，尤其a 用於檢測多生理參數之細胞活性評估晶片。 疋種 【先前技術】 細胞為生物體之最小生命單位，以細胞作為檢測單元 可代表生物體直接的生理反應。當細胞受到外來物理量或 • 化學性刺激時，細胞會自行調整並改變其營養物質之消耗 量及其代謝物的釋出量；藉由量測細胞攝取或釋出物質的 變化量訊息，可評估細胞當下的生理活性，並且量化外源 性刺激對細胞生理之影響。而目前於細胞活性狀態之評= 技術大約可分為兩大類，一是量測細胞能量的代謝情形； 其二是檢測細胞特異性變化或接受器（recept〇r)/配體 (ligand)系統的反應（如膜電位的變化等）。而於量測細胞 能量的代謝情形部份，又以下面三種策略來檢測指標性代 鲁 謝產物較為常見： 丨.一氧化碳生成量與p Η值的量測 請參照反應式一所示’使用pH值作為新陳代謝指 標的優點之一’是因為細胞在進行醣原酵解和呼吸氧化代 謝反應過程中’會產生許多有機酸並釋出二氧化碳氣體， 當這些有機酸解離或二氧化碳溶解時，皆會產生氫離子而 被排出細胞外’因此可藉由p Η值的量測，來得知細胞的 新陳代謝速率，而胞外二氧化碳濃度與pH值之間的關係 請參照反應式二所示之Hendersin-Hasse丨balch公式描述 201120443
。6%2。+ 6〇2— 6C02 + 6H20+38>A TP 反應式一 pH = 6.1 +log [卿;1 [co2] 反應式二 π氧氣消耗的量測技術 由於細胞需不斷的合成許多大分子（如蛋白質）來維持 # 生理的正常運作，在這些生化合成的過程中，須消耗大量 的ΑΤΡ，才能克服生化反應所需的活化能以促使生化合 成反應發生。而ΑΤΡ的合成則藉由生命體吞食、消化與 吸收外界進來的食物進行氧化’藉此供生理所需；請再參 照反應式一所示，如一莫耳的葡萄糖分子在經過酶原酵解 (glycolysis)與擰檬酸循環（citric acid cycle)後可生成 38莫耳的ATP，同時在此氧化過程中也消耗6莫耳的氧 分子。因此氧氣分子在ATP的合成過程中扮演著重要的 _ 角色’所以可利用氧氣的消耗量’來代表生命體_的生理活 性’當細胞生理活性愈高，需合成大量蛋白質時，將消耗 掉較多的氧氣來合成較多的ATP以協助蛋白質的合成。 目前於市面上商品化之細胞活性檢測晶片系統，其簡 介如下： (a)加拿大 Molecular Devices 公司之 Cytosensor® Microphysiometer :
Cytosensor® Microphysiometer基本結構是以石夕作 為底材，並於上方工作一層氮化矽，藉由光趨電位感測器 201120443 (light-addressable potentiometric sensor, LAPS)進行細 胞外酸化率之量測。其主要工作原理是透過光電效應，以 特定波長的光激發矽基材以產生電子電洞對，此時藉由恆 電位儀（potentiostat)於參考電極與工作電極間施與一固定 電位，以趨動電子電洞對產生電流。而電子電洞電流大小 與絕緣層表面電位有關，當細胞代謝產生較多質子而改變 PH值時，同時會改變絕緣層的表面電位，故會改變真正 落在矽基材上趨動電子電洞對移動的電場大小，所以可從 鲁 PH量測值的變化量來評估細胞的活性。此系統的特色為 ^頁y ®的樣本液或細胞即可進行量測，並且有良好之靈 敏度及少i的樣本消耗，而藉由雷射光點的照射可直接 定位量化待測點細胞之胞外pH值；然而，此系統僅能進 行單一生理指標胞外酸化率之檢測，於實際細胞生理活性 評估上資料不夠廣泛。 (b)德國 Bi〇nas® 公司之 Analyzing system 及 Metabolic chip ： •德國Bi〇nas®公司的多參數細胞生理分析系統可對胞 外酸化率（離子選擇性場效電晶體感測器（丨〇n沾阳⑴… field effect t「ansistor, |SFET))、氧氣消耗率（安培法感測 =)及細胞貼附性（交指狀電極導電度感測器）進行整合性 里測。其主要晶片設計是將細胞培養於封裝製作完成的晶 片中，由晶片上方兩端以微管道的方式輸送細胞培養液及 測試藥物，其内部緩衝液體積約為1〇//卜此感測晶片之 特點是能承受滅菌時的高溫高壓，並於培養時細胞不會受 到外界污染，容易與微電子電路整合並具有檢測快速與樣 201120443 本試劑量少等優點；但丨SFET晶片經反覆實驗測試後之 哥命目前仍待驗證。上述商品化量測晶片皆以封閉式微流 道進打液體更換，並以矽為基材，其不透光性阻礙光學法 檢測細胞型態的對照性。 由上述背景簡介得知，目前已商品化之細胞活性感測 系統，仍具有下列缺點： 1細胞活性變化為一綜合性之生理反應，每次單一 參數的量測無法完全得知細胞對外界刺激的生理響應但 _進订多參數細胞活性量測_，感測器的量測原理不同大幅 增加了为析儀器之價格’如Bj〇nas@公司之Metab0|jc chip以丨SFET量測胞外酸化率、安培法量測溶氧，阻抗 分析法量測細胞貼附。 2、目前於細胞活性晶片製作上，皆以矽作為底材以利 半導體製程技術之整合，然而卻限制了以顯微鏡同時觀測 細胞形態的功能。 ® 【發明内容】 本發明人有鑑於既有之細胞活性感測系統須要昂貴的 價格及複雜的製程才能進行多參數細胞活性量測，且皆以 矽作為底材而限制同時觀測細胞形態的功能，因此經過長 時間的研究以及不斷試驗後，終於發明出此用於檢測多生 理參數之細胞活性評估晶片。 β本發明之目的在於提供一種細胞活性評估晶片，尤其 疋種整合晶片式細胞培養、細胞耗氧率與胞外酸化率等 多生理參數檢測電極陣列之製程技術，以進行細胞生理活 201120443 性檢測時同步觀測細胞形態’並能簡化不同生理參數量測 電極於玻璃基材之電化學電極陣列之細胞活性評估晶片。 為達上述目的’本發明所運用的技術手段係在於提供 一種用於檢測多生理參數之細胞活性評估晶片，其係包括 一感測晶片，係包括一基材、一感測平面及一絕緣層 ，該感測平面設於該基材頂面，並包括互相間隔之一辅助 電極、一參考電極及位於該辅助電極該參考電極之間的二 • 溶氧電極與二PH電極，該絕緣層係設於該感測平面頂面， 於該絕緣層上相對於各電極的位置穿設一工作窗口，於相 對位於該參考電極與兩pH電極之工作窗口内係設有一氧化 銀層以覆蓋於該參考電極與兩pH電極對應該工作窗口的區 域； 一微流道墊高層，係結合於該感測晶片之頂面，包括 墊尚膜本體、一微流道層及一細胞培養槽，該墊高膜本 體位於該感測晶片之頂面，係包括一流通貫槽，該微流道 _層結合於該墊南膜本體之頂面，並包括一底面、一微流道 、一抽液孔及一透氣孔，該微流道係凹設於該底面，且該 微流道對應該流通貫槽的區域之形狀與位置係與流通貫槽 相4，該抽液孔及該透氣孔分別穿設於該微流道層的二側 ，且該透氣孔與該流通貫槽係位於同侧，該細胞培養槽貫 穿於該微流道層及該墊高膜本體且連通於該微流道、該抽 液孔及及該流通貫槽，以露出兩pH電極、兩溶氧電極之工 作窗口及該辅助電極。 較佳的是’該基材係為玻璃。 201120443 較佳的是’該感測平面係為金層。 其中’該感測平面與該基材間係包括一欽層。 較佳的是，該墊高膜本體之厚度為5〇"阳。 較佳的是，該感測平面厚度為25〇 nm，該工作窗口面 積為 20 。 其中’該塾高膜本體係為_層聚二甲基矽氧炫 (poly(dimethylsiloxane)，PDMS) 〇 其中，該微流道係為直線型。 本發明還關於一種用於檢測多生理參數之細胞活性評 估晶片之製法，係包括： 於-基材頂面形成-辅助電極、一參考電極及位於該 輔助電極該參考電極之間的二溶氧電極與：pH電極，於各 電極上方設置一絕緣層，並於該絕緣層上相對於各電極的 位置分別穿設有一工作窗口，以露出對應之電極，於位在 該參考電極與兩pH電極之工作窗口上沈積一氧化銥層，以 覆蓋於該參考電極與兩pH電極對應該工作窗口的區域； 提供一微流道層’由該微流道層的底面凹設有一微流 道’該微流道層係穿設該抽液孔及該透氣孔，該抽液孔及 該透氣孔分別形成於該微流道的兩側；提供一墊高膜本體 ，將該墊高膜本體結合於該微流道層的下方而形成一微流 道墊高層’並於該微流道層及該墊高膜本體穿設形成一細 胞培養槽，且該細胞培養槽係與該微流道、該抽液孔及該 透氣孔互相連通； 將該微流道墊高層组裝於該感測晶片頂面而形成一細 胞活性評估晶片，且該細胞培養槽的位置係相對於該輔 201120443 助電極、兩PH電極與兩溶氧電極之工作窗口的區域上 方。 較佳的疋’該基材係為玻璃。 其中，該墊高膜本體係將該PDMS溶液塗佈於一基板 頂面固化所形成。其中，該墊高膜本體係以氧氣電漿處理 方式結合於該微流道層的下方而形成該微流道墊高層。 其中，於一基材頂面形成該輔助電極、該參考電極、 兩溶氧電極與兩PH電極前’係以濺鍍法將鈦層形成於該基 鲁 材頂面，再沈積金層於該鈦層上形成一感測平面，並利用 舉離（丨ift-off)氣程使該感測平面形成該辅助電極、該參考電 極、兩溶氧電極與兩PH電極；再進一步於各電極上方形成 一絕緣層，並經過曝光、顯影及硬烤而於各電極上分別形 成一工作窗口 ’於該參考電極與兩pH電極之工作窗口經由 電鍍形成一氧化銥層。 較佳的是’該墊高膜本體之厚度為5〇 "m，該工作窗 口 面積為 20 //mx20 //m。 • 其中，將該墊高膜本體結合於該微流道層的下方而形 成一微流道墊高層後’係於該墊高膜本體形成一流通貫槽 ，且該微流道對應該流通貫槽的區域之形狀與位置係與流 通貫槽相符，該流通貫槽係與該透氣孔位於同側，再於該 微流道層及該塾高膜本體穿設形成該細胞培養槽。 本發明又關於一種用於檢測多生理參數之細胞活性評 估晶片’其係如前述之製法所製成者。 本發明所提供之用於檢測多生理參數之細胞活性評估 晶片，藉由上述技術手段，可以獲得的優點及增進之功效 201120443 至少包括： 1、 本發明將pH電極與溶氧電極共同整合於同一晶片 上’以免標定與非侵入式直接監測細胞活性的變化。 2、 本發明利用該墊高膜本體之設計，於抽出廢液的同 時能控制細胞培養槽内液體之液面高度，且避免抽液時的 流速對細胞的影響而能更精確的評估細胞之活性變化。 3、 本發明之晶片以便宜的透明玻璃材料取代昂貴的石夕 晶圓’作為感測電極微製程加工與細胞培養的基材，除易 於大量製作、降低製作成本與簡化製程程序外，也改良過 去珍基材不利以顯微鏡同時進行光學觀測細胞型態之問題 【實施方式】 為能詳細瞭解本發明的技術特徵及實用功效，並可依 照說明書的内容來實施，詳細說明如後： 請參閱第一、二圖所示，本發明係相關於一種用於檢 測多生理參數之細胞活性評估晶片，其係包括一感測晶片 (10)及一微流道墊高層（2〇); 該感測晶片（10)包括一基材（11)、一感測平面（12)及 一絕緣層（13) ’該感測平面（12)位於該基材（11)上，製作 時係可以蒸鍍法或濺鍍法將鉻層或鈦層形成於該基材（11) 頂面作為一黏著層，再沈積金或鉑作為該感測平面（1 2)， 並利用標準的蝕刻（etching)製程或舉離（丨ift-off)製程完成 電極的圖案化，而形成互相間隔之一辅助電極（122)、一 201120443 參考電極（121)及位於該輔助電極（彳22)和該參考電極 (121)之間的二溶氧電極（123)與二pH電極（124);該絕緣 層（13)係由SU8負型光阻所組成，而塗佈於該感測平面 (12)上’經過曝光、顯影及硬烤（hard bake)以增加該絕緣 層（13)之強度’再於該絕緣層（13)上相對於各電極的尖端 位置分別形成一工作窗口（125)，並於該工作窗口（125)電 沉積一氧化銀層（126); 該微流道塾高層（20)係結合於該感測晶片（1 〇)頂面，包 鲁 括一墊高膜本體（21)、一微流道層（22)及一細胞培養槽（23) ，該墊高膜本體（21)位於該感測晶片（10)之頂面，係包括一 流通貫槽（211)’該微流道層（22)結合於該塾高膜本體（21) 之頂面，並包括一底面、一微流道（221)、一抽液孔（222)及 一透氣孔（223)，該微流道（221)係凹設於該底面，且該微流 道（221)對應該流通貫槽（211)的區域之形狀與位置係與該流 通貫槽（211)相符，該抽液孔（222)及該透氣孔（223)分別穿 鲁 設於該微流道層（22)，並分別形成於該微流道（221)的二侧 ’且該透氣孔（2 2 3)與該流通貫槽（211)係位於同侧，該細胞 培養槽（23)貫穿於該微流道層（22)及該墊高膜本體（21)且連 通於該微流道（221)、該抽液孔（222)、該透氣孔（223)及該 流通貫槽（21 1)’以露出兩pH電極（124)與兩溶氧電極 (123)之工作窗口（125)與該輔助電極（122)。 因此’本發明係可藉由感測晶片（10)之兩pH電極（124) 及兩溶氧電極（12 3)同時檢測細胞酸化率與呼吸活性量測， 以評估細胞活性的變化，並且以玻璃為基材（11 )，實現細 12 201120443 胞生理活性檢測時同步觀測細胞形態之目的，再者，利用 該塾高膜本體（21)之設計，於抽出廢液的同時能控制細胞 培養槽（23)内液體之液面高度，且避免抽液時的流速對細 胞的影響而能更精確的評估細胞之活性變化。 以下實施例係為了具體說明本發明用於檢測多生理參 數之細胞活性評估晶片之製法的技術手段。 實施例 一、製備感測晶片 鲁 （a)基材清潔 «月參閱第二（A)圖所示’本實施例所選用之基材（I” 係為玻璃，而為了清除玻璃表面之油污與灰塵，增加金屬 濺鍍於玻璃上的附著性，係先將玻璃玫入載玻片架内，浸 入異丙醇（isopropanol，丨PA)溶液中，以超音波震盪3〇 min ’再以二次蒸餾水超音波震盪5 mjn後更換二次水， 重複3〜5次清洗乾淨。接著將玻璃吹乾後，浸入食人魚 溶液（piranha solution)中，該食人魚溶液為體積比3 : 1 •之96% H2S〇4與3〇% H202配製而成，以8〇。〇進行隔水 加熱與超音波震盪3〇 mjn，取出玻璃後，再以二次蒸餾 水超音波震盈重複3〜5次清洗乾淨而完成玻璃清潔。 (b)電極製作 明參閱第三（B)圖所示，係於清潔後之玻璃上塗佈az 4620正光阻’經曝光顯影定義出電極的形狀後’進一步 以賤鑛法或蒸錄法工作一 5〇nm之欽層作為黏著層，再於 該鈦層上形成厚度250 nm之金層作為該感測平面（12)， 以丨PA或丙酮移除光阻即可於玻璃上形成一辅助電極 13 201120443 (122)、一參考電極（121)及位於該辅助電極（彳22)該參考 電極（121)之間的二溶氧電極（123)與二PH電極（124)。 (c)絕緣層製作 將SU8-3025負光阻作為絕緣層（13)並塗佈於各電極 上作第一層塗佈。第一階段係以500rpm旋轉塗佈15秒 ’第一階段以3000「pm塗佈40秒’再經於65。〇下烘烤 30秒，並分別於75°C與85。(：下烘烤2分鐘，再逐步升溫 至95°C供烤10分鐘》再利用旋轉塗佈法將SU8-3025進 • 行第二層塗佈’其旋佈與軟烤參數同第一層SU8-3025負 光阻之製作過程。再利用設計之光罩透過曝光機於光能 200mJ/cm3下曝光1〇秒，進行曝後烤加強光交連程度與 結構後，再於65°C下烘烤10分鐘，並分別於75。(：與 85C下烘烤2分鐘’再逐步升溫至150硬烤1〇分鐘， 請參閱第三（C)圖所示，最後對晶片顯影即可於各電極上 分別定義出一工作窗口（125)，並形成一具有工作窗口之 基材。 Φ (d)氧化銀pΗ感測電極製作 請參閱第三（D)圖所示，配製一氧化銥（丨「〇χ)電鍍液， 將該氧化銥電鍍液靜置兩天後，將該具有工作窗口之基材 置入於該氧化銥電鍍液中，使用多功能電位儀，連接晶片 之工作電極，並配合外接Ag/AgCI參考電極及白金絲輔 助電極’利用循環伏安法（CyCHC voltammetry，CV)電锻 丨「〇x’將電位定於0V至+0.6V之間，電位改變速率為 20 mV s·1，循環300次，於該參考電極（121)與兩ρΗ電 極（124)之工作窗口（125)工作面積2〇"mx2〇//m之一氧化銀 201120443 層（126)而形成一氧化銥pH感測電極，請參照附件一（A) 及附件一（B)所示。 請參照第七（A)、（B)圖所示將兩氧化銥pH感測電極以 pH6_00、7_00、8.00的PBS緩衝溶液測試以及評估其靈敏 度，經過線性計算，可得到其靈敏度約為-76mV/pH。 二、製備微流道墊高層 (a) 製備微流道層 請參閱第四（A)〜（D)圖所示，係先準備一玻璃基板（30) φ ，將該玻璃基板（30)經過清潔後塗佈SU8負型光阻（31)， 經曝光顯影，並移除光阻後即形成母膜（32)。請參閱第五 (E)〜（G)圖所示，將聚二曱基矽氧烷 (poly(dimethylsiloxane), PDMS)主劑與固化劑以 10:1 (w/w%)攪拌混合均勻並除去氣泡後，澆鑄於該母模上，並 於加熱板上加熱1.5 h後即固化，待其冷卻後自該母膜（32) 取下而形成一微流道層（22)，由該微流道層（22)的底面凹設 有一微流道（221)，其高度約為200 //m，再以玻璃毛細管 φ 於該微流道層（22)穿設該抽液孔（222)及該透氣孔（223)，該 抽液孔（222)及該透氣孔（223)係分別形成於該微流道（221) 的兩侧。 (b) 製備墊高膜本體 將PDMS主劑與固化劑以1 0 : 1 (w/w%)的比例調配後 旋轉塗佈於乾淨之一壓克力基板表面，置於加熱板上待其 固化形成一墊高膜本體（21)於壓克力基板上，其厚度約為 50 _。 (c) 製備微流道墊高層 t 15 201120443 請參閱第五（Η)圖所示’將該墊高膜本體（21)與該微流 道層（22)以功率100W的氧氣電漿處理1〇秒，並使該塾高 膜本體（21)結合於該微流道層（22)的下方，於兩者結合同時 ’該壓克力基板係與該塾南膜本體（21)分離，將該墊高膜 本體（21)的一部分撕除而形成一流通貫槽（211)，且該微流 道（222)對應該流通貫槽（211)的區域之形狀與位置係與流通 貫槽（211)相符，該流通貫槽（211)係與該透氣孔（223)位於 同側，使液體能流至該參考電極（121)以進行量測，並於該 φ 微流道墊高層（20)穿設形成細胞培養槽（23)，且該細胞培養 槽（23)係相對位於該微流道（221)的中段位置，且藉由該微 流道（221)連通該抽液孔（222)及該透氣孔（223)，而該細胞 培養槽（23)的底緣與該微流道（221)之間距為50//m。 三、 製備細胞活性評估晶片 請參閱第一、六圖所示，將該微流道墊高層（20)以壓 克力夾具组裝於該感測晶片（1 〇)上方即形成該細胞活性評 估晶片’該細胞培養槽（23)的位置係相對於兩pH電極 φ (124)與兩溶氧電極（123)之工作窗口（125.)的上方，並與 該微流道（221)、該抽液孔（222)、該透氣孔（223)及該流 通貫槽（211)相連通，且於該絕緣層（13)及該感測平面（12) 上，對應於該細胞培養槽（23)的區域形成一細胞培養平面 (14卜 四、 晶片表面修飾與細胞培養 請參閱第一、六圖所示，本實施例係以細胞活性評估 晶片對He La細胞（50)進行生物活性檢測，該HeLa細胞 (50)為人類子宮頸癌上皮細胞株。而由於SU8製成之絕緣 16 201120443 層（13)為疏水性，但HeLa細胞（5〇)之細胞膜表面帶負電 ，不容易貼附於細胞培養平面（14)上，因此利用細胞外基 質修飾技術’將10#丨聚左旋離胺酸（poly-L-lysine， 〇_〇01% (w/w))滴於細胞培養平面（14)，待其自然揮發後， 再滴入1 〇 #丨的纖黏連蛋白（fibronectin, 10 //g mL_1)進行修 飾门樣待其自然揮發後，則可加入細胞培養液於細胞培 養槽（23)内’再加入1〇 "丨且密度為4 71x1〇5 ce丨丨s/mL之 HeLa細胞懸浮液，而後靜置π分鐘讓HeLa細胞（5〇)貼 • 附於表面上，再利用微注射泵（40)插入該抽液孔（222)，並 將培養液抽乾，同時觀察抽液時對HeLa細胞貼附之影響 〇 由於本發明係採用非密閉式培養的方式，且該細胞培 養槽（23)係以50 //m的高度以該微流道（221)連通該抽液孔 (222) ’如此再抽出廢液的同時能控制細胞培養槽内液體之 液面高度，且細胞培養平面（14)與該微流道（221)相距有50 // m，因此抽液時的流速快慢產生的剪切力對細胞的影響不 • 大，可改善HeLa細胞因受到流體之剪切力而被沖走之問 題，使HeLa細胞可以穩定的貼附於細胞培養平面（彳4)上， 而此更精確的S平估細胞之活性變化。五、以細胞活性評估 晶片對H e L a細胞進行量測
請參閱第八圖所示，其係以細胞活性評估晶片之溶氧 電極對HeLa細胞進行呼吸活性量測❶先將密度為2〇〇〇 cells mm·2之HeLa細胞培養於細胞培養平面上，並加入 30 //L之細胞培養液，該細胞培養液係以1 〇 mM ( N-2-经 乙基派嗓- N- 2-乙橫酸（HEPES)為緩衝分子，且含有25 mM 17 201120443 之甘露醇（mannito丨）’再進行耗氧率量測ι〇分鐘；同前述 步驟再分別量測10 mM HEPES+25 mM葡萄糖（glucose) 及 10 mM HEPES+25 mM glucose + 1 % insulin，最後以 1 % Triton X-100將細胞移除。比較培養液中含有g^c〇se 或膜島素（insulin)分子時對胞外呼吸活性的影響，其結果發 現在含有 25 mM glucose 與 25 mM glucose +1% insulin 的細胞培養液中’耗氧率較含有25 mM mannito丨時的耗氧 率分別增加了 1.23及1·54倍。
• 請再參閱第九圖所示’其係以細胞活性評估晶片之氧 化銥pH感測電極對HeLa細胞進行胞外酸化率的量測。先 將密度為1016 cells mm·2之He La細胞培養於晶片中，並 加入10 //L以1 mM HEPES為緩衝分子之細胞培養液，並 進行酸化率量測10分鐘；同前述步驟分別量測]mM
HEPES+25 mM glucose、1 mM HEPES+25 mM glucose + 1 % insulin 進行比較，最後以 1 〇/〇 Trjt〇n x_1〇〇 將細胞移除。比較培養液中含有g|ucose或jnsu|jn分子時 • 對胞外酸化率的影響，其結果發現在含有25 mM g|UC0se 與25 mM glucose +1〇/〇 insuNn的細胞培養液中，酸化率較 含有25 m M mannito丨時的酸化率分別增加了 2〇及3〇倍 〇 請再參閱第十圖所示，利用本發明之細胞活性評估晶 片以OCP法（氧化銥pH感測電極）與安培法（溶氧電極）同時檢 測溶氧與pH的變化^在大約240秒處注入30//L的1 Μ亞硫酸 鈉（Na2S03，pH 10.20，[〇2] = 〇_〇9 mg/l)於培養槽内，進行
18 201120443 氧氣的去除與pH的鹼化，其與pH相關的氧化銥表面電位與 溶氧電流的變化分別-146 mV與-3.747 nA，之後在42〇 s處 重新換液回原本的1 mM HEPES溶液，其氧化銥表面電位 與溶氧電流又可回復。 因此’本發明能同時檢測細胞酸化率與呼吸活性之細 胞活性評估晶片，以評估細胞活性的變化，並且以玻璃為 基材’能實現細胞生理活性檢測時同步觀測細胞形態之目 _ 的’再者’本發明係由含有離底部一定高度之微流道與細 胞培養槽進行大體積的細胞培養，其液體的更換可藉由微 流道與幫浦系統共同完成，且由於流道開口離底部約5〇 //m，可降低流體剪切力對細胞與代謝產物濃度梯度的影 響’大幅簡化了長時間培養與固定換液的程序。 惟以上所述者，僅為本發明之較佳實施例而已，备不 能以此限定本發明實施之範圍，凡依本發明申請專利^圍 及說明書内容所作之簡單的等效變化與修飾，皆應仍屬本 發明專利涵蓋之範圍内。 【圖式簡單說明】 第一圖係本發明較佳實施例之細胞活性評估晶 示意圖。 胃 第二圖係本發明較佳實施例之細胞活性評估晶 示意圖。 11 第三㈧’圖係本發明較佳實施例之感測晶片製作流 19 201120443 程示意圖。 第四（A)~(D)圖係本發明較佳實施例之微流道層製作流 程不意圖。 第五（E)~(H)圖係本發明較佳實施例之微流道墊高層製 作流程示意圖。 第六圖係本發明較佳實施例之細胞活性評估晶片剖面 示意圖。 第七（A)圖係本發明較佳實施例之氧化銥pH感測電極 φ 在ΡΗ6·〇〇〜8_〇〇之PBS緩衝溶液的電位變化。 第七（Β)圖係本發明較佳實施例之氧化銥pH感測電極 在pH6.00〜8.00之PBS缓衝溶液的靈敏度計算。 第八圖係本發明較佳實施例以細胞活性評估晶片之溶 氧電極對HeLa細胞進行呼吸活性量測，藉以說明HeLa 細胞對葡萄糖或胰島素之結果。 第九圖係本發明較佳實施例以細胞活性評估晶片之氧 化錶pH感測電極對HeLa細胞進行胞外酸化率的量測，藉 φ 以說明外源刺激對胞外酸化率之影響。 第十圖係本發明較佳實施例以細胞活性評估晶片同時 檢測溶氧與pH的變化，藉以說明注入Na2S03後於〇cp 電位值及溶氧電流上之變化 【附件簡單說明】 附件一（A)係為本發明較佳實施例之金層作為感測平面 未鍍氧化銥的狀態。 附件（B)係為本發明較佳實施例之金層作為感測平面 20 201120443 ，鍍有氧化銥的狀態。 【主要元件符號說明】 (10)該感測晶片 (11)基材 (1 2)感測平面 (121)參考電極 (122)輔助電極 (123)溶氧電極 (124)pH 電極 (125)工作窗口 (126)氧化銥層 (13)絕緣層 (14)細胞培養平面 (20)微流道墊高層 (21)墊高膜本體 (211)流通貫槽 (22)微流道層 (221)微流道 (222)抽液孔 (223)透氣孔 (23)細胞培養槽 (30)玻璃基板 (31)SU8負槊光阻 (32)母膜 (40)微注射泵 (50)HeLa 細胞 21