TW201024792A - Wide-field super-resolution optical sectioning microscopy using a spatial light modulator - Google Patents

Description

201024792 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 ' 本發明為一種顯微鏡系統與使用方法，特別是一種超 . 解析率廣視野光切片的顯微系統與使用方法。 【先前技術】 在遠場光學顯微術的發展領域中，「空間解析率」的極 限一直是亟欲突破的重要課題。而目前具有空間解析率之 ® 超解析率能力的遠場光學顯微技術，例如激發放射耗散 (Stimulated Emission Depletion，STED)顯微術、光活化 定位顯微術（Photoactivated Localization Microscopy， PALM)以及推定光學重建顯微術（stochastic Optical Reconstruction Microscopy)等技術，皆都需以掃描式光 學系統進行成像。 由於前述技術所形成的系統複雜度與系統成本都相當 ❹高’且若需要三度空間影像時，則取像時間會變得相當長。 此外’亦可以遞迴演算法將光學影像的繞射效應降低而提 高空間解析率’此類技術可在高對比度的影像上成功提高 解析率；但由於進行計算時需要花費較長的時間；而若要 提高一部動態影片的觀測解析率，則於進行計算時，需要 花費更長的時間。 而結構式照明（Structured Illumination)，或稱圖樣 式激發（Pattern Excitation)則是另一類型的超解析率光 學技術。通常以二維網狀圖樣調變光學顯微鏡的入射光， 4 201024792 刀別在垂直光軸的χ方向和y方向移動該網狀圖樣到不同 位置，擷取至少五張影像後，再以方程式求解的方法以解 ' 出橫向解析率超過繞射極限的顯微影像。其好處是可以直 • 接二傳統廣視野光學系統取像，不需進行掃描機^ ;而立 計算影像的時間也比遞迴演算法要短得多。此種技術可採 用線性方式或是以非線性方式進行激發。此外，也有人提 出了以液晶空間光調變器調變的結構式照明超解析率全反 射螢光顯微術；但該二維結構式照明顯微技術尚未能提供 ® 光學切片（Optical Sectioning)的能力。 而結構式照明也可於廣視野光學系統中達到光學切片 的效果。在該技術中，僅需使用一維的週期性柵狀圖樣進 行調變。將栅狀圖樣分別在垂直光軸的方向，移動到撕狀 週期的0，2p/3，4p/3等空間相位’並在此三個位置取得 影p：—’1， /2， /3後，以一簡單代數運箕 重組該三個影像，就能得到廣视野 光學切片影像。 ❿ 另外’以液晶空間光調變器進行一維調變的廣視野光 予切片顯微術也已提出；採用差動量測的概念，可更進一 步改進廣視野光學切片顯微術的縱向解析率，可達到奈米 尺度；亦可利用遞迴演算法提高其橫向解析率。但是一維 調變的廣視野光學切片顯微技術並不能達到直接提高横向 '解析率的效果。 【發明内容】 本發明為一種光學影像處理的方法。該方法包括：在 5 201024792 複數個相位的每個相位上，以一個空間圖樣連續照明一個 樣本；在第一個縱向解析率和第一個橫向解析率上獲得代 - 表樣本之第一套影像的數據，而每一張影像與照明之複數 個相位的個別相位相關；以及，處理獲得的數據以產生強 化的切片影像樣本。進一步處理獲得的數據，包括處理獲 得的數據，以便在比第一個縱向解析率還大的第二個縱向 解析率上，產生代表第二套影像的數據；以及，在代表第 二套影像的數據上進行頻譜分析，以在比第一個橫向解析 ® 率還大的第二個橫向解析率上，形成強化的切片影像數據 樣本。 本發明根據第一套影像的每張影像，其所照明的個別 相位，以數學方式組合第一套影像以產生第二套影像。 對於第二套影像子集的每張影像，進行傅立葉分析， 以便在空間頻譜内形成該影像之頻譜。且組合每個影像之 頻譜，以形成強化的切片影像樣本之複合頻譜。使用複合 頻譜表示反傅立葉轉換，以產生強化切片影像樣本。 ® 在某些範例中，組合每個影像頻譜之個別部份，根據 空間圖樣的物理特性，將第二套影像之子集的頻譜，轉移 至以向量所決定之頻譜的原點。而空間圖樣的物理特性可 包括圖樣的週期性。 ' 在某些範例中，該空間圖樣在一維空間内顯示週期 • 性。在其它範例中，該空間圖樣在二維空間或多維空間内 顯示週期性。 在垂直光軸的平面内，根據空間圖樣的週期性，以線 201024792 性方式將空間圖樣轉移至一系列位置的每個位置。或者， 可進行照明樣本，而在垂直光軸的平面内，以一系列角度 、 的每個角度旋轉該空間圖樣。 , 在某些範例中，將光聚焦至樣本的第一個深度，以便 在第一個深度產生樣本的切片影像。並且，可連續將光聚 焦至樣本之一系列的深度，以便在每個個別的深度產生樣 本之一系列切片影像。 本發明為一種光學影像處理的方法。一個能產生具有 ® 空間圖樣的光源，以便在複數個相位的每個相位上，連續 照明一個樣本。一個能在第一個縱向的解析率和第一個橫 向解析率上，偵測樣本之第一套影像的偵測器。一個處理 器接收和處理第一套影像，以產生一張樣本之強化切片影 像。特別是，該處理器的組態可處理第一套影像，以便在 比第一個縱向解析率還大的第二個縱向解析率上，產生代 表第二套影像的數據；以及，在代表第二套影像的數據上， 進行頻譜分析，以便在比第一個橫向解析率還大的第二個 ® 橫向解析率上，形成代表樣本之強化切片影像的數據。 本發明包含一個光學組件，以便在樣本的第一個深度 將光束聚焦。 本發明亦可包含一個耦合至光學組件的控制器，且其 " 模組能控制該光學組件，以便在樣本的第二個深度將光束 • 聚焦。該控制器包含一個壓電定位器。 本發明包括：一個在一維空間内具有第一個週期性的 遮罩，該遮罩在二維空間内可進一步有第二個週期性。 7 201024792 本發明之光源，更包括一個耦合至遮罩的調變器，且 其能以改變該遮罩的模組來調節照明的相位。該遮罩的模 - 組包括一個遮罩的位置和一個遮罩的方向。 該處理器之進一步的組態，可根據與第一套影像的每 張影像所對應照明的個別相位進行計算，組合第一套影像 以產生第二套影像。對於第二套影像之子集的每張影像而 言，處理器進行傅立葉分析，以便在一個空間頻譜内形成 該影像之一個頻譜。處理器組合頻譜之每個個別的部份， ® 形成樣本的強化切片影像的複合頻譜。然後，處理器以複 合頻譜的反傅立葉轉換，以產生強化切片影像。 光源本身的模組可產生該空間圖樣，如該光源可包括 一個LED陣列結構，以產生可移動之二維的光學圖樣。 使用單一光調變器來調變照明光的空間相位，可在三 維空間改進廣視野光學顯微鏡的解析率。當使用快速切換 的光電技術時進行光的調變時，則取像速率可能像一張超 解析率的影像一樣快（如每秒處理五張圖樣的影像框架）。 ® 本發明所述之系統和方法可以很容易地，以低成本安 裝到各種光學設備，包括傳統的螢光顯微鏡。此外，可以 很容易地在系統内安裝一個以上的激發光源，如此則在研 究細胞功能的應用上會很有用處。且因可以高速取得一張 ~ 樣本之超解析率的影像，可進行活細胞内結構物的動態分 ' 析。 本發明只需要快速傅立葉轉換（FFT)和代數計算，可 使用一個獨立處理器以處理影像。該獨立處理器可比其它 8 201024792 軟體更快地處理影像，且可像網路卡（PCI) —樣，進一步 整合入現有的個人電腦内。 - 故而’關於本發明之優點與精神可以藉由以下發明詳 述及所附圖式得到進一步的暸解。 【實施方式】 1.系統概述 參考第1圖，係為一個具有結構式照明之光切片顯微 ® 鏡100的一個具體實施例。光切片顯微鏡100具有傳統顯 微鏡的數個組件，包括一個光源110以產生一個光束112， 一個光束分離器140以反射光束112至欲進行影像處里的 :個樣本⑽。-套光學組件，包括一個物鏡 光束112對焦至樣本160所選擇的影像平 ，或發射)的光先被物鏡15。接收，且在由:過本： 綠14G之後，被—個偵測器m (如⑽照像機）横 ❹/則Λ測器17〇將所债測的光信號轉換成電氣信號並傳遞 至個處理器18〇 (如電腦）以形成樣本16〇的數值影像。 ，本16〇(或是物鏡150)安裝在一個定位臺162上， =在=向和縱向上進行線性移動。在此說明中，「橫向」一 岡通爷描述一個沿著光傳播之光軸的方向（如第1圖所示 的z軸）’而「縱向」一詞通常描述一個與光軸垂直的平面 (如X~y-平面）。對於「厚的」樣本(如一個高度大於 1以111的物體）’可在樣本160與物鏡150之間調整z的距 離以便在各種深度形成樣本的切片影像，亦稱為顯微鏡 9 201024792 之光切片的能力。 傳統廣視野顯微鏡之空間解析率會受到光之繞射極限 - 的限制。在這裏，「空間解析率」或「光學解析率」一詞通 _ 常描述：一個影像處理系統之光學組件解析欲進行影像處 理之樣本内細節的能力。換句話說，「空間解析率」相當於 樣本内兩個可分辨的（可解析的）點被分開之最小的空間 距離。因此，具有「較大」或「強化」之空間解析率的影 像處理系統能在樣本内顯示「較細」的結構，或能分辨以 參 較小空間距離分開之相臨的點。 一個改進廣視野顯微鏡之空間解析率的方法是，使用 一種空間調變圖樣以照明樣本，如下所述，基本上是執行 一個諧波之空間頻率進行混合的程序。 在具體實施例中，提供一個光調變器120和光源110 以便將一個空間圖樣（如實質上週期性的空間圖樣）透過 一個圖樣式光束112投影到樣本160上。光調變器120的 一個範例包括一個遮罩13 0 (如一個二維桃狀的形式）和 ® 一個控制單元（未顯示）以調整遮罩的空間結構，以便能 分段或連續改變圖樣式光束112的空間相位。遮罩130能 有局部之一維或多維的週期性（如第1圖所示在一個與光 束112垂直的平面上沿著px和py軸運動）。可以改變遮罩 . 130的空間結構，例如，以線性或旋轉的方式空間移動遮 罩 130。 在此沒有提出任何理論限制，至少可根據下述部份， 了解具有結構式照明顯微鏡100的解析率強化能力。 201024792 假設Λ是物鏡150之焦面上一個均勻照明 必是-個樣本經由均勻照明所產生的一般影像二且 ::::頻譜内（亦參考為倒立空間）以樣:二 =樣本。對每一個光學系統而言，根據光學= 能透過系统個切斷頻率門播之樣本的空間頻率 、糸統而進仃轉移。因此，以光學系統形 =資，移之空間頻帶(「通帶」)的樣本;:: #内Γί 換句話說’在此通帶外面之樣本資訊，會在 Μ失去’且無法恢復。 個調變之二維（2D)空間圖樣被投影到樣本上時， ，、、、上之結構式照明的強度1(义，7)會變成： 小’水/。[2 + COS(似—Δ《) + (χ)如一 △《)]⑴ 別β其中"為倒立空間内調變圖樣的空間頻率，△么和从分 相：2和1方向中，調變圖樣相對於樣本之移動的空間 相位常數。空間頻率^表示為： U = ^^n)sin(a)/^ ⑵ 的夾Ϊ中Γ為玻躺折射率，α為*束與光學系統之光軸 欠角且』為照明的真空波長。 描述Ϊ於結構式照明的結果，現在樣本的影像獻能被 岭，*二(, +Mr-(^y)e^+My+(x,y)e^ (3) 其中觚為樣本在均句照明下的一般影像，立仏加)和 201024792 &±(^)為四個影像成份，其頻譜中心分別在正和負的方向 上沿著心或心軸，由倒立空間内的空間頻率w來進行偏移。 . 且使用〜（波紋符號）來表示一個變數的二維傅立葉轉換， 以氣來表示影像怂的頻譜，且分別以和 (<，A，± M )以表示 Mx±(xj)和 My± (χ，>〇 的頻譜。 結構式照明的一個主要效應是，藉由將空間頻譜之額 外的高頻區域，移入光學系統的通帶内，故可在影像#U，7) 的重建内，恢復於傳統廣視野顯微鏡内所接觸不到的資 ⑩ 訊，因此可以改進光學系統的空間解析率。 根據方程式（3)，目前所觀察的影像#(z，7)，是一般 影像與四個頻譜，而其原點被偏移切或-ί/之額外成份的 組合。由於這些成份在方程式（3)内加總的係數與照明的相 位相關（即从和~〇,可在不同的照明相位下記錄樣本之 一系列的影像，以及在記錄的影像上進行算術運算以萃取 出這些成份。在分離這些成份之後，可在大於傳統廣視野 顯微鏡的縱向和橫向解析率上，使用這些成份内的資訊以 • 重建樣本的一張影像，詳細的描述如下。 2.操作 參考圖2，提供示範流程200供顯微鏡100使用，以 執行一個三維（3D)樣本的光切片。使用此流程，在橫向 ' 和縱向上，可獲得比傳統廣視野顯微鏡較大解析率之樣本 ' 的縱向切片影像。 步驟210 :先找出一個初步「有興趣的區域」（R0I) 以進行影像處理。通常是在樣本160之一個所選擇的ζ深 12 201024792 以-個二維（x-#y_)的區域來定義該「有興趣 藉由樣本⑽在縱向和橫向上，相對於物鏡15〇 的移動’可將入射光束聚焦到該「有興趣的區域」上，例 如’藉由移動定位臺162。

步驟220 :在-系列空間相位的每一個相位上，以一 個光學關樣本16G。在本财，料學圖樣係 ^束m穿過遮罩13Q所產生，且藉由沿著㈣卜轴線 性地移動遮罩13〇，以調整光學圖樣的㈣相位。 例如，參考第3A圖至第3E圖，在一套的五個空間相 位上顯示一個二維（2D)週期性光學圖樣。在第从圖中， 光學圖樣的中心是在原點上，且其線距分別沿著㈣卜轴 在-個7\和ΤΑ-個空間週期上重複。在本例中，Τχ和的 結構與Ty相同。而在某些其它範例中’亦可在兩個方向的 每個方向上，以一個特別的局部週期性來設定一個二維 光學圖樣的結構。 在第3B圖和帛3C财，光學圖樣分別在負和正的方 向上’沿著px軸以120。（或τ/3)偏移。與此類似地，在 第3D圖和第3E圖中，光學圖樣分別在負和正的方向上， 沿著py軸以120。（或T/3)偏移。 口第3Α圖至第3Ε圖中顯示，五個圖樣空間相位常數 可以表不為= (2 π /3) ·(历，w，其中（私λ)分別= (Μ)、（1，〇)、（2,0)、（〇，ι)、和（〇 2)。 ^步驟230 :在結構式照明下，可由偵測器no連續獲 知樣本160内，具有「有興趣的區域」的五張影像，而每 13 201024792 一張影像可以顯示，且形成在所照明的五個空間相位的每 一個相位上。根據方程式（3)，在相位θ聊上所獲得的一張 影像1則可表示為： {x,y) = 2M0 (x,y) +MX_ (x,y)ei2^ +MX+ (x,y)en^3 +MY_(x,y)ei2^+MY+(x,y)ei2-13 ( 在此步驟上，所獲得之影像的橫向和縱向解析率 可與傳統廣視野顯微鏡解析率進行比較。

步驟240 :處理所獲得的五張影像，以便在真實空 間内形成縱向的切片影像。特別是基於本範例内照明所用 之特殊的相位常數，可由所獲得的五張影像中，萃取出抓 如下： K{^y) = ^ [^φΐο y) + ΜΦ20(χ, y) + Μφ01 (x, y) + Μψ01 (x, y) - Μφ00 (x, 而可獲得縱向切片影像Mx±和My±如下： (6) (7)

Mx± = ^[^〇〇 (^^) + ^10 {χ^)^αφ + Μφ20 (χ,γ)β±ί2π/3'\ Μϊ± {χ^) = ^\_Μφ^ (χ^) + Μφ〇ι {x,y)eiil,!l1 +Μφ01 (x,y)e±ilnl%'\ 如上所述，該四張縱向切片影像Μχ±和ΜΥ±的每一張影 像，可提供比傳統廣視野顯微鏡更大的縱向解析率，亦如 Neil, et al.在1997年12月15日於光學通訊（Optics Letters)刊物所出版的「在傳統顯微鏡中，使用結構式光 以獲得光切片的方法」内所述之參考。 步驟250 :為了能更進一步改進樣本160影像的橫向 解析率，以二維傅立葉轉換，將該四張縱向切片影像Mx±* 14 201024792 轉入一個空間頻譜（倒立空間）内。因此，分別以 土》，夂）和l±(t，心±«)來表示所獲得之Mx±(x，少）和 的頻譜。 步驟260 :在空間頻譜内，沿著h和也，以一個"的 大小，將心±(<±1^)和从”0’^«)由其原先的位置偏 移，而產生該四張偏移的頻譜影像和##(紅也）。 步驟270 :處理該四張偏移的頻譜影像，以形成一個 複合頻譜#胃^，例如，「聯結」偏移頻譜影像之個別的部份， ⑩ 以建立一張超重疊的頻譜影像。較佳地，在建立超重疊頻 譜影像的程序中，亦補償顯微鏡之光學轉移函數所引起的 訊號衰減。 步驟280 :經由在該複合頻譜上，進行反傅立葉轉換， 重建一張「有興趣的區域」的超解析率影像。經由步 驟250至步驟280的頻譜分析，所重建的超解析率影像 Msuper ’ 會比縱方切片影像Jfo和提供一較大的橫向解析 率。因此，超解析率影像 Msuper 有時候亦被認為是一張強化 ® 的切片影像，其在橫向和縱向上，比傳統廣視野顯微鏡具 有更大的解析率。 步驟290 :在獲得目前之「有興趣的區域」的超解析 率影像之後，選擇不同z深度下的，下一個「有興趣 的區域」樣本，例如，以預定的增量/減量在縱向上移動樣 本160。因此，可在每一個z深度重複執行步驟220至步 驟280，以便在一套z深度上，連續形成樣本的超解析率 影像。 15 201024792 在本範例中，會以一系列方式來描述一個三維樣本的 光分片。特別是在下一個深度開始的照明步驟220之前， - 且在一選擇深度下，於影像重建步驟280時完成樣本。在 ^ 其它範例中，可用平行的方式獨立處理影像取得步驟220 至步驟230，和影像分析步驟240至步驟280。例如，可先 在不間斷下，經由一套樣本的深度，取得五張影像的群組， 而在一個稍後的步驟中執行，以取得影像的頻譜分析。 現在參考第4A圖至第4F圖，可於以下說明中，進一 ⑩ 步說明上述的步驟200。為了簡單起見，將第3A圖的二維 光學圖樣投影到一個平面上，進行影像處理。 第4A圖顯示第3A圖的二維光學圖樣，已被投影到平 面上的一張影像Am (如在步驟230中所獲得的）。 第4B圖顯示影像頻譜在空間頻譜内以二維傅立葉 轉換形成的一個頻譜。該頻譜包含在原點上的一個 Airy圖樣，以及分別沿著h或心軸偏移原點一段補償距離 後，成為四個另外的Airy圖樣。該補償距離與第3A圖之 ® 光學圖樣的線距會成反比。 第4C圖顯示，二維光學圖樣被投影到平面上的一張縱 向切片影像#/-(如在步驟240所獲得的）。 第4D圖顯示，空間頻譜内备-的頻譜影像 (如在步驟250所獲得的）。在該頻譜影像内，僅使用兩條 ' 虛線右邊的頻率成份，藉以建立複合頻譜Msuper。 第4E圖顯示，聯結四張偏移頻譜影像瓦±(紅々,）和 <±(紅也）的個別部份，至一個頻譜内，以獲得一個複合頻 16 201024792 譜Msuper (如在步驟270所獲得的）。由第4D圖之虛線所圍 住的頻率成份，形成該複合頻譜Msuper的四分之一。 • 第4F圖是一個以第4A圖之圖樣式影像，所重建的超 解析率影像汾super (未按相同的比例顯示）。 3.範例 以下章節提供上述系統與使用方法流程的範例。在某 些範例中，進行結構式照明的結果與均勻照明比較，以說 明結構式照明之強化效應。

⑩ 3. 1範例I 參考第5A圖至第5C圖，使用光切片顯微鏡100進行 影像處理，包括直徑為100-nm螢光球之樣本。該螢光球的 發射波長約為560 nm。在該發射波長下，均勻照明之理論 橫向解析率的限度約為263 nm。因此，一顆100-nm螢光 球之均勻照明的影像，將有約280 nm的觀察差寬度。在此 處，「寬度」一詞指的是假設影像内個別粒子是一種高斯 (Gaussian )強度分佈時，在最大值的一半的全寬度 ❿（FWHM)。 第5A圖顯示，在均勻照明下，兩顆100-nm螢光球的 影像。第5B圖顯示，於焦面上，在使用具有750-nm週期 性二維網狀圖樣的結構式照明下，兩顆螢光球的一張超解 ’析率影像。第5C圖顯示，一個所選擇之螢光球的兩個強度 • 分佈曲線，虛線的曲線是沿著第5A圖之虛線的樣本，而實 線的曲線是沿著第5B圖之虛線的樣本。 基於第5C圖内，兩個強度分佈曲線的「在最大值的一 17 201024792 半的全寬度」，第5A圖之均勻照明影像的橫向解析率，約 為325 nm。經由比較，第5β圖之結構式照明影像的橫向 - 解析率約為180 nm，故顯示解析率的改進約為2倍。

3. 2範例II 參考第6A圖至第6C圖，沿著z軸掃描三顆2〇〇_nm螢 光球，以估計具有結構式照明之顯微鏡1〇〇的縱向解析 率。在第一個範例内，選擇較大直徑比螢光球，以避免縱 向和橫向強度變化之間的耦合，當物體的成像比光學系統 © 的橫向解析率小得多時，通常會發生此情況。 測量和比較不同週期之兩個網狀圖樣的縱向強度曲 線。在第6C圖中，虛線的曲線是將一個75〇 nm週期的網 狀圖樣（在焦面上測量）投影到樣本上所獲得的，而實線 的曲線是將一個500 nm週期的網狀圖樣投影到樣本上所獲 得的。實線曲線的「在最大值的一半的全寬度」約為29〇 nm，相當於一個21〇11111的縱向解析率（；約〇 38；1)。 第6A圖和第6B圖是在使用一個75〇—nm網狀圖樣的， 參兩個不同橫向位置下所記錄之螢光球的影像。這兩張影像 顯示橫向解析率已被改進，因此三顆球能清楚地解析，且 當樣本被移離焦面時’螢光球的強度會降低。 值得注意的是，以500-rnn網狀圖樣所獲得之縱向強度 曲線的侧翼’仍有高峰強度的20%，可能是由物鏡的縱向 色差所造成的。對於所堆疊的樣本而言，此種侧翼可能~ 響影像的品質，因此，在某些範例中，75〇_nm網狀圖樣在 觀察生物樣本（如細胞）内部結構上，可能是較好的。在 18 201024792 某些應用中，可使用某些過濾、_ (如縱向 與調變圖樣來減低侧翼的大小。 μ 3. 3範例111 上述的光分片顯微鏡100和使用流程可被用於生 =以^察細胞内結構物’甚至當細胞被堆疊在—起時

參^^至^圖’在各種影像處理條 獲付之：定纖維母細胞内’肌動蛋白微絲（使用Α1= Fluo[ 488 phalloidin染色技術）的螢光影像。 後《 ί H岐在均㈣明下’肌動蛋白微絲的影像。該影 々有一個0·4之數值孔（ΝΑ)的一個低放大（2〇χ) 勿兄下所獲得的。在此影像内’可以看到數個堆疊細胞内 的肌動蛋白微絲。 第7Β圖是在均勻照明下，由第7Α圖之一個所選擇區 域（正方形虛線所圍的區域）的放大影像。該影像是在具 有一個1.3之數值孔的一個高放大（1〇〇χ)物鏡下，所獲 得的。 第7C圖與第7Β圖具有相同區域，但卻是在結構式照 明下所獲得的影像。第7D圖是與第7C圖具有相同區域， 且在物鏡縱向移動500 nm之後，所獲得的離焦影像。在第 7C圖内’所改進的橫向解析率，使得第7B圖内模糊的數 個微絲’能被清楚地分辨出來。因此，可使用該技術準確 的定量細胞骨架和/或其它細胞内結構物。此外，第7D圖 的強度會出現比第7C圖還低的現象’故與本發明的切片能 19 201024792 力是正相關的。 篦7二Π“為’沿著第7B圖（虛線的強度曲線)和 坊*桐八a強度曲線）之虛線的強度分佈曲線。基於 '奶刀训曲線’觀察到肌動*白微絲的寬度分別為約330 η:、’、、G nm ’表不結構式照明與均勻照明相比較下，結 構式照明_揭示生物樣本中更細微的結構。 4其它的具體實施例

乂下描述可提供上述系統和方法的各種的其它具體實 施例。 參考圖8，顯示光切片顯微鏡800的另外一個具體實 施例的圖。在該具體實施例内，一個空間光調變器: 包含一個搞合至極化器822的反射矽液晶（LC〇s)板824， 以做為照明光的二維調變。而反射矽液晶板824由1〇24 X 768像素所組成’且像素大小為u. 3 X u· 3 "m2。可在 一維反射矽液晶824上，以高達60赫茲（Hz)的更新速 率’迅速改變一個驅動信號，以移動投影到一個樣本860 上的正弦調變圖樣。 一個光源810 (如一個50 mW，475 nm二極體泵送的 固態的雷射）產生一個光束，在通過一個空間過濾器812 後’接著，藉由透鏡814擴大至約8 mm直徑的「最大值的 一半的全寬度」，藉以照明空間光調變器820。然後，空間 光調變器820上的網狀圖樣，透過透鏡880和物鏡850, 投影到樣本860上（如一個具有1.3數值孔的浸油物鏡）。 樣本860係以CCD照像機870所捕獲的影像。一個壓電 20 201024792 (PZT)的轉換器852被耦合至物鏡650上，以控制焦面與 樣本860的相對高度。 再次參考圖1 ’適用於光源的其它範例包括了： 各種燈（如LED燈和氙電弧燈）和雷射（如單一和多重波 長雷射）。光源110亦可包括一套光學組件如透鏡、鏡子、 和過濾器（未顯示）以控制所輸出之光束112的特性（如 強度、波長、和方向）。偵測器170的範例包括CCD照像機 和其它的CMOS偵測器。

除了使用遮罩之外，亦可使用光源本身產生的圖樣進 行光的調變。例如，可建構一個LED陣列使其有能力，產 生可移動的二維網狀圖樣。 空間圖樣的各種形式皆可使用。例如，可使用對稱或 非對稱週期的一維正弦圖樣或二維正弦圖樣。同時，藉由 光學圖樣，可以很方便地改變空間相位的模式化。9 參考第9A圖至第9F圖，顯示使用一維（1D)格栅調 變照明之空間相位的模式化範例。在該範例中，旋轉一維 格柵到-系列的角位置，每個角位置皆可相對於系列空間 相位中的一個。 產生空間圖樣亦可能有另外的方法。在某些範例中， 可使用雷射斑點技術產生空間圖樣。例如，若^某片毛 璃或光擴㈣絲沿著絲明路縣裝，村產生 點的圖樣’藉以用於照明樣本。在某些情況中，由於 =片：行處理許多框架，以取得一張具有強化解析 21 201024792 本發明可在電腦程式產品内，執行操作和信號處理的 方法；本發明可使用可程式處理器和方法以執行機器可讀 . 的儲存設備；本發明可輸入數據並透過可程式處理器來產 生輸出。本發明可將一個或多個空間光調變器、偵測器、 光源、處理器，和系統的其它組件耦合到電腦程式内的控 制器來執行；本發明的可程式系統，至少包括一個可接收 和傳送數據與指示的可程式處理器、一個數據存儲系統、 至少一個輸入裝置、和至少一個輸出設備。 Ο 以上所述僅為本發明之較佳實施例而已，並非用以限 定本發明之申請專利範圍；凡其它未脫離本發明所揭示之 精神下所完成之等效改變或修飾，均應包含在下述之申請 專利範圍内。 【圖式簡單說明】 第1圖係一個具有結構式照明之光切片顯微鏡的具體 實施例圖。 ❹ 第2圖係第1圖所示之光切片顯微所使用的影像處理 流程圖。 第3A至第3E圖，係根據第2圖的流程圖，在一序列 相位下，調變一個二維週期性圖樣範例的圖。 • 第4A圖係一個投影到一個平面上，第3A圖的二維週 - 期性圖樣之光學影像圖。 第4B圖係將第4A圖轉換到一個空間頻譜的二維週期 性圖樣的頻譜影像。 22 201024792 的影 第4C圖係將第3A圖 像必-。 之二維週期性圖樣進行切片 第4D圖係一個邮j.., 认〇 ,、 1U二間頻谱内必的頻譜影像

Mx- {k-u, ky) ° 第5 ®係-個組合四張偏移頻譜影像从(υ,)和 对(紅也)所產生的複合頻譜影像汾sup π。 邊从ΐ::圖係一個投影到平面上之二維週期性圖樣之重 建的影像Λ/super。

第5A圖係在均勾照明下，兩顆1〇〇奈 的影像。 第5B圖係在使用具有75Q nm週期性二維網狀圖樣的 結構式照明下，由兩騎親所重_超解析率影像。 第5C圖係沿著第5A圖之虛線的第一個強度分佈曲線 (虛線的曲線）的圖，和沿著第5β圖之虛線的第二個強 度分佈曲線（實線的曲線）的圖。 第6A圖和帛6B圖，係在使用750 nm週期性網狀圖樣 的不同橫向位置下，所記錄之三顆球的影像。 第6C圖，係沿著光軸，使用75〇⑽週期性網狀圖樣 下’所獲得的第-個強度分佈曲線（虛線的曲線）的圖， 和使用一個500 nm週期性網狀圖樣所獲得的第二個強度分 佈曲線（實線的曲線）的圖。 第7A圖係在一個具有20X物鏡的均勻照明下，一組纖 維母細胞内肌動蛋白微絲的影像（NA=〇.4)。

第7B圖係在一個具有ιοοχ物鏡的均勻照明下，第7A 23 201024792 圖之正方形虛線所園區域的詳細影像（na=i.3)。 第7C圖係在一個具有1〇〇χ物 第7_同區域的詳細影像m=1.3)。 打，與 贫7r^7D圖係在—個具有1GGX物鏡的結構式照明下，與 ^圖相㈣域的詳細影像（帆3)，係由第 ^ 置縱向移動500 nm。

第圖係/σ著第7B圖之虛線的第一個強度分佈曲線 (虛線的曲線）的圖’和沿著第7C圖之虛線的第二個強度 分佈曲線（實線的曲線）的圖。 第8圖係第1圖所示’光切片顯微鏡的其他具體實施 例圖。 第9A圖至第9F圖係根據第2圖的流程圖，在一序列 相位下，調變另外一維週期性圖樣的圖。 【主要元件符號說明】 100光切片顯微鏡 ® 110光源 112光束 140光束分離器 150物鏡 160樣本 162定位臺 170偵測器 180處理器 24 201024792 650物鏡 810光源 812空間過濾器 814透鏡 820空間光調變器 880透鏡 850物鏡 860樣本 φ 870CCD照像機 852壓電轉換器

Claims (1)

1. 201024792 七、申請專利範圍： 1. 一種光學影像形成的方法，至少包含： 在複數個相位的每個相位上以一空間圖樣連續地照明 一樣品； 一獲得數據代表該樣品之一第一套影像，係在一第一 縱向解析率和一第一橫向解析率上，每個影像與該照明之 複數個相位的一個別相位相關；以及 處理該獲得數據以產生該樣品之一強化切片影像，包 ⑩ 括： 處理該獲得數據，以在比該第一縱向解析率還大的該 第二個縱向解析率上，產生代表第二套影像的數據；以及 在代表該第二套影像的數據上，進行頻譜分析以便在 比該第一個橫向解析率還大的一第二橫向解析率上，形成 代表該樣品之該強化切片影像數據。 2. 如申請專利範圍第1項所述之光學影像形成的方法，其 中處理獲得數據以產生代表第二套影像的數據，包括： ® 根據與第一套影像的每一個影像有關之該照明的個別 的相位，計算組合該第一套影像以產生該第二套影像。 3. 如申請專利範圍第1項所述之光學影像形成的方法，其 中對於代表第二套影像數據所進行的頻譜分析，包括： 對於第二套影像之子集的每個影像而言，進行傅立葉 • 分析以便在一個空間頻譜内，形成該影像之一頻譜。 4. 如申請專利範圍第3項所述之光學影像形成的方法，其 中對於代表該第二套影像數據所進行的頻譜分析，更進 26 201024792 一步包括： 組合該頻譜之每個個別部份，以形成該樣品之強化切 片影像之複合頻譜。 . 5.如申請專利範圍第4項所述之光學影像形成的方法，其 中該組合頻譜表示之每個個別部份，包括： 根據該空間圖樣的一物理特性，轉移該第二套影像子 集的頻譜，係以一向量所決定之頻譜的一原點。 6. 如申請專利範圍第5項所述之光學影像形成的方法，其 % 中該空間圖樣的物理特性包括該空間圖樣的一週期性。 7. 如申請專利範圍第4項所述之光學影像形成的方法，其 中對於代表第二套影像數據所進行的頻譜分析，進一步 更包括： 使用反傅立葉轉換以產生該強化切片影像以處理該複 合的頻譜。 8. 如申請專利範圍第1項所述之光學影像形成的方法，其 中該空間圖樣在一維空間内顯示週期性。 ® 9.如申請專利範圍第1項所述之光學影像形成的方法，其 中該空間圖樣在二維空間内顯示週期性。 10.如申請專利範圍第1項所述之光學影像形成的方法，其 中在複數個相位的每個相位上以一空間圖樣連續地照 明一樣品，包括： • 在一垂直光軸的平面内，使用線性方式轉移該空間圖 樣，至根據該空間圖樣的週期性所決定之一系列位置的每 一個位置。 27 201024792 11. 如申請專利範圍第1項所述之光學影像形成的方法，其 中在複數個相位的每個相位上以一空間圖樣連續地照 明一樣品，包括： 在一垂直光軸的平面内，以一系列角度的每一個角度 旋轉該空間圖樣。 12. 如申請專利範圍第1項所述之光學影像形成的方法，其 中在複數個相位的每個相位上以一空間圖樣連續地照 明一樣品，包括： ⑩ 聚焦該照明至該樣品的一第一個深度，以在第一個深 度產生該樣品的一切片影像。 13. 如申請專利範圍第12項所述之光學影像形成的方法， 更進一步包含： 連續聚焦該照明至該樣品之一系列的深度，以在每個 個別深度產生該樣品之一系列切片影像。 14. 一種光學影像形成的系統，至少包含： 一光源，係產生一光束與一空間圖樣，在複數個相位 ⑩ 的每一個相位上，連續照明一樣品； 一偵測器，係偵測該樣品在第一縱向解析率和第一橫 向解析率之第一套影像，每個影像與該照明之複數個相位 的個別相位有關；以及 * 一處理器，係處理該第一套影像以產生該樣品之一強 • 化切片影像，該處理器的模組為： 處理該第一套影像，以在比該第一個縱向解析率還大 的一第二個縱向解析率上，產生一第二套影像數據；以及 28 201024792 在該第二套影像數據上進行頻譜分析，以在比該第一 個橫向解析率還大的一第二個橫向解析率上，形成該樣品 _ 之該強化切片影像數據。 15. 如申請專利範圍第14項所述之光學影像形成的系統， 更進一步包含： 一個光學組件以聚焦該光束於該樣品的第一深度。 16. 如申請專利範圍第15項所述之光學影像形成的系統， 更進一步包含： 〇 一控制器，係耦合至該光學組件，且其模組控制該光束 聚焦至該樣品的第二深度。 17. 如申請專利範圍第16項所述之光學影像形成的系統， 其中該控制器包括壓電定位器。 18. 如申請專利範圍第14項所述之光學影像形成的系統， 其中該光源包括在一維空間内具有第一週期性的遮罩。 19. 如申請專利範圍第18項所述之光學影像形成的系統， 其中該遮罩在二維空間内，更進一步有第二週期性。 ❹ 20.如申請專利範圍第18項所述之光學影像形成的系統， 其中該光源更進一步包括： 一調變器，係耦合至該遮罩，且改變該遮罩的一模組以 調節該照明的該相位。 _ 21.如申請專利範圍第20項所述之光學影像形成的系統， * 其中該遮罩的模組包括該遮罩的一位置。 22.如申請專利範圍第20項所述之光學影像形成的系統， 其中該遮罩的模組包括該遮罩的一方向。 29 201024792 23. 如申請專利範圍第14項所述之光學影像形成的系統， 其中該處理器之更進一步的組態為： 計算組合該第一套影像以產生該第二套影像，係根據 該第一套影像的每個影像有關之該照明的該個別相位； 對於該第二套影像之一子集的每個影像，進行傅立葉 分析以形成該影像之一頻譜在一空間頻譜内； 組合該頻譜之每個個別部份以形成該樣品之該強化切 片影像之一複合頻譜；以及 φ 使用反傅立葉轉換以產生該強化切片影像以處理該複 合頻譜。 24. 如申請專利範圍第14項所述之光學影像形成的系統， 其中該光源包括一個LED陣列結構，以產生可移動之光 圖樣。 30