TW200533744A - Mutant of serratia marcescens, transformed cell thereof and use of the same - Google Patents

Description

200533744 玖、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係藉由改變黏質沙雷氏 風{berratia marcescens、 中之訊號傳遞系統，以提升二元 、 感應系統對生物抑制性物 質之敏感度，以利於檢測生物抑制性物質之濃度。 【先前技術】 & 當工廠的製程產生異常反應’常造成大量高濃度廢液或 廢水的排出，耗-般卫廠皆有調勾池進行緩衝，但因受 限於土地面積而無法完全達到預期的效果，因此常突增廢 水生物處理系統之負荷或毒害性物質的流人，此對於廢水 生物處理系統影響極大。故提前仙出環境中汙染物的變 化里，將有助於了解X廠廢水特性的變化，並即時調整工 廠廢水之處理與排放條件’進而維持整體處理系統效能的 穩定性並避免生物毒害之發生。 細菌的生物二元感應系統，在近年來的微生物學研究中 深受重視。二元系統的組成可分為兩部分，一為感受器 (sensor)，另一為對應調節子（resp〇nse regulat〇r)。當位於 細胞膜上之感受器感應到環境中的訊息分子，如溫度、声 透壓或是金屬離子的改變，會透過自我磷酸化作用 (autophosphorylation)磷酸化特定的胺基酸（如組胺酸），進 而將此磷酸化訊息傳遞至對應調節子，藉由對應調節子對 下游基因的調控，調節細菌生理以適應環境。 目前已發現黏質沙雷氏桿菌二元系統中會調控細菌溶血 素（Hemolysin)及脂肪酸代謝相關之基因，其分別為mm與

O:\9l\91726.DOC 200533744 ’且發現利用該等基因作為啟動子，並配合作為報導 子之發光基因所構築之基因重組載體，可轉形到細菌而對 外界毋性物質之刺激產生不同之光度，進而推測毒性物質 的濃度’使其成為廢水毒物之監測工具。惟其對毒性物質 之敏感度仍須作進一步之改良。 、 本舍明發現黏質沙雷氏桿菌中與訊號傳遞系統有關之 心基因會抑制加σ基因之表現。若抑制黏質沙雷氏桿菌 中：以基因之表現，即可大幅提升/α姆因之表現，進而 提南該細菌對毒性物質之敏感度。 【發明内容】 本發明係有關黏質沙雷氏桿菌突變株，其對生物抑制性 物質具有較高之敏感度。 本發明之目的為提供經轉形之黏質沙雷氏桿菌突變株。 本發明之另一目的為提供檢測生物抑制性物質之方法。 【實施方式】 本發明之主要方面為提供以以基因之表現被抑制之黏質 々田氏桿菌穴變株’其相較於黏質沙雷氏桿菌野生株，對 生物抑制性物質具有較佳之敏感度。 本發明之黏質沙雷氏桿菌突變株係以各種習知之方法， 如用伽瑪射線或紫外線照射，或用誘變劑處理，如羥胺和 乙基甲烷’定點誘變（site-directed mutagenesis)，或活體外 跳躍基因大變法（以Wiro transposon mutatenesis)，將以以 基因之核苷酸序列中插入、置換及/或刪除一或多個核芸 西文，進而抑制〜以基因表現產物之產生。

O:\91\91726.DOC 200533744 本發明令之d基因係指包含SEQ iD N〇: i之核芬酸序 列或其類似物’其中該類似物係、指與seq id n〇^之核菩 酸序列具有至少80%或90%同一性之核#酸序列，其較佳為 具有90%同一性之核苷酸序列。 本發明另提供經表現載體轉形之黏質沙雷氏桿菌突變 株。根據本發明之一具體實施例，本發明黏質沙雷氏桿菌 ^變株為黏質沙雷氏桿菌CH_1AA株，寄存於臺灣新竹的食 品工業發展研究所，寄存編號為BCRC 91〇247。 一本文所用的「表現載體」係指夠槁帶並轉移報導子進入 宿主細胞’並表現該報導子之核酸分子。具體而言，載體 係指各種習知之質體、枯接質體、嗟菌體或病毒。通常， 該報導子系經操作與報導基因連接，t其被引人宿主細胞 時，該報導子可在對應調節子之控制下被表現，則報導子 之表現可反應對應調節子之調控。 根據本發明’表現載體中之對應調節子係為/MG啟動 根據本毛明之具體實施例’該表現載體為响⑽，寄 存於臺灣新竹的食品卫業發展研究所，寄存編號為bcrc 940441 。 本發明中之啟動子係指包$SEQ ID N〇：2之核苷酸 序列、其片段或其類似物，其中該類似物係指與SEQ id n〇: 2之核苷酸序列具有至少8〇%或9〇%同一性之核苷酸序列， 其較佳為具有90%同一性之核甞酸序列。 根據本發明，表現載體中之報導子係為可編碼發光蛋白 貝之基因或hcz等報導基因（reporter gene)，其中較佳為可

O:\91\9I726.DOC 200533744 編碼發光蛋白質之基因。該可編碼發光蛋白質之基因包含 如冷光.蛋白（luC1ferase)基因、綠色螢光蛋白⑽⑽ fluorescent protem)基因及藍色螢光蛋白（Mue fiu〇rescent protem)基因，其中較佳為冷光蛋白基因，而更佳為冷光蛋 白基因組五。 刖所提到的基因工程方法如DNA突變、載體構築及轉形 可以由本領域技術人員完成，其可參見，例如，M〇lecular Clomng: A Laboratory Manua卜第二版，c〇ld Spnng Harb〇r

Laboratory Press，Sambrook，J.，E· F· Fritsch和 T Maniatis 編著（1989)。 本發明還提供檢測生物抑制性物質之方法，所述方法包 括將本發明經轉形之黏質沙雷氏桿菌突變株與待測樣本接 觸；及測定報導子之表現量，並藉由報導子表現量之降低 程度，判斷樣本中生物抑制性物質之量之多募。 本發明中之生物抑制性物質係指重金屬物質、有機物質 或金屬離子等會抑制生物正常生理機能之毒性物質，其中 較佳為酚、苯、甲苯、乙基苯、二甲苯、長碳鏈脂肪酸及 其混合物。 本發明内谷可參考以下實施例作進一步之了解。下述實 施例僅用以說明本發明，而非對本發明作任何限制。 實施例1 以體外跳躍基因破壞法製備突變株 於3 0°C下，將黏質沙雷氏桿菌野生株CH-1震盪培養隔夜 後，取1.5毫升菌液加到微量離心管中，以13,〇〇〇 rpm離心2 O:\9I\91726.DOC -9- 200533744 分鐘後，倒去上清液，以微量吸管頭儘可能吸去殘留液體。 於沉澱物中加入0.6毫升溶解溶液，以微量吸管打散沉澱物 使菌體懸浮，置於80°C打破細菌。接著加入0.2毫升沉澱溶 液，蓋上管蓋並將管子反覆上下搖動後將離心管置冰浴 中。再以1 2,000 rpm離心1 5分鐘，小心吸出上清液至另一離 心管，加入1倍體積之異丙醇混合均勻，以12,000 rpm離心 1 0分鐘後倒去上清液，沉澱物以70%酒精洗二次，每次各 離心1分鐘。沉澱物以真空乾燥濃縮機（SpeedVac)乾燥後， 以30微升TE-8.0溶解，如此便可得到染色體DNA。 將上述方法所得到之染色體DNA以正向引子： ACCGTACGCGGCATTGGCTATTTG (SEQ ID NO: 3)ArssA 反向引子：GGGGCAATCATGGTCGTGGTTC (SE1 ID NO: 4) 進行聚合酶鏈鎖反應（Polymerase Chain Reaction)，並依表1 所示，於0.5毫升之微量離心管中逐一加入各項試劑。 表1 反應物質 體積（微升） 最終濃度. 去離子水 28.5 - lOxPCR緩衝液 5 lx lOxdNTP混合液 5 200微莫耳濃度 (μΜ) dNTP 正向引子 5 0.2微莫耳濃度 反向引子 5 0.2微莫耳濃度 模板DNA 1 〜50 pg Γ叫DNA聚合⑽ 0.5 0·5單位（U) 總體積 50 以手指頭輕彈管壁使各項試劑混合均勻。在PCR反應器 上設定反應時間為94°C、1分鐘，60°C、40秒及72°C、30 O:\91\91726.DOC -10- 200533744 秒。將聚合酶鏈鎖反應得到所需基因片段進行電泳分 析，並j屯化出所要的產物。再將此基因接合至 PUT-miniTn5-Kml(Kenneth T.(de Lorenzoet et al.? 1 99〇? 1 994)) 載體形成pUT-miniTn5-Kml-rssA重組質體。

於轉形前16至20小時製備黏質沙雷氏桿菌CH」野生株之 勝任細胞（competent cell)，其係將黏質沙雷氏桿菌 生株接種並在LB液體培養基中隔夜培養（3(rc)，再以 的比例接入另一20宅升之LB培養基中，於3(rc下震盪培養 約2至3小時。收集離心管中之菌液並置於冰浴⑺至^分 鐘，再以8,〇〇〇 g於4。〇離心5分鐘。倒去上清液，以冰冷二 次水沖洗菌塊後，再以8,000笔於4。〇離心5分鐘並重覆上述 浸泡、清洗之步驟二至三次。加入1〇〇微升之冰冷二次水， 稍加震盪使混合均勻即可獲得勝任細胞。

將2微升先前所構築之重組載體與1〇〇微升之勝任細胞於 微量離心管中混合均勻’置入電孔法專用高壓儀器中，以 _伏特電壓將重組載體導入黏質沙雷氏桿菌ch]野生株 菌體中進行同序列置換（h⑽。lGg_ re_binat_)，再利 用抗藥的特性篩選出之黏質沙雷氏桿菌突變株並命名為 CH-ΙΔΑ，且該黏質沙雷氏桿菌突變株已於民國93年3月幻 曰寄存於食品工章發展讲办Μ ^ _ 系孓展研究所，其寄存編號為 BCRC910247。 實施例2 基因重組發光菌之構築 以介6(?基因的正向引 利用前述聚合酶鏈鎖反應之方法

O:\91\91726.DOC -11 - 200533744 子：CCGGAATTCGCCGGTTACCAATGCCACTTT (SEQ ID NO: 5)及反 向引子.：TAATACGTAGGGGGAGCGAAACATGCAG (SEQ ID NO: 6) 獲得所需之啟動子片段（SEQ ID NO: 2)，進行電泳分析 並純化出所要的產物。將此啟動子片段選殖入 pBCSK(-)(Inveitrogen，US A)質體中，並以DNA序列分析確 認啟動子之方向。 將 pSB1075 (Wilson 等人，Construction and analysis of luxCDABE-based plasmid sensors for investigating N-acyl Homoserine lactone-mediated quorum sensing. FEMS Microbiol. Lett· 1998，163(2): 485-92)中之五基因 組以心mHI限制酶切出後，連接至上述含有啟動子之 質體中，並將其命名為pfabG，且該表現載體已於民國93 年3月23日寄存於食品工業發展研究所，其寄存編號為 BCRC940441 〇 將黏質沙雷氏桿菌CH-1野生株及CH-1AA突變株依前述 之方法製作成勝任細胞，再以電孔法將pfabG載體送入黏質 沙雷氏桿菌CH-1野生株及CH-ΙΔΑ突變株中以獲得重組發 光細菌。 實施例3 廢水中生物抑制性物質(盼(Phenol))之檢測 廢水生物抑制性物質快速檢測技術係利用生物抑制性物 質會使重組發光菌產生生理影響，進而使發光強度有所改 變的原理而設計。 重組發光菌檢測廢水中生物抑制性物質之檢測流程、檢 O:\91\91726 DOC -12- 200533744 測之囷液ϊ與樣品量係說明如下·· 1·將構築的發光細菌培養18-24小時（〇.D.600>2); 2. 以1: 1〇〇之稀釋模式將菌液加至新鮮的lb培養基後，於 3 0°C及225 rpm震動下培養至〇 D._>〇 ;1 ; 3. 將900微升待測樣本加入} 〇〇微升之菌液反應丨5分鐘； 4·利用冷光儀（Luminometer)Berthold Lumat LB9507谓測 螢光強度20秒，結果以發光值（Reiative Light Unit，RLU)表 示。 每批測定樣品中皆以純水作為正對照組（其發光值視為 100%)作為標準參考，以避免外在環境所引起的誤差。由於 負對照組（LB培養液）的發光值為〇,所以省略不測。樣本的 測定結果係以相對於正對照組的百分比表示。 圖1顯示黏質沙雷氏桿菌CH-MA突變株之重組發光菌之 务光值，其在酚濃度越高情況下之發光值越低。顯示黏質 d雷氏桿菌CH-ΙΔΑ突變株之重組發光菌確可運用於廢水 中生物抑制性物質的檢測。 圖2係將黏質沙雷氏桿菌CH_uf生株及CH-1aa突變株之 重組發光菌，分別在〇、〇·5、丨、丨.5、2、25及3小時後， 7量其啟動子的發光強度。其結果顯示黏質沙雷氏桿 囷CH-ΙΔΑ突變株之介^^啟動子的活性約為野生株之7 倍。 【圖式簡單說明】 圖1顯示於不同酚濃度下，黏質沙雷氏桿菌ch_iaa突變 株重組發光菌之發光值。

O:\91\91726.DOC -13 - 200533744 圖2顯示黏質沙雷氏桿菌CH-1野生株及CH-ΙΔΑ突變株之 重組發米菌的/ahG啟動子活性之比較結果。

O:\91\91726.DOC -14- 200533744 序列表 <110〉國立成功大學 <120>黏質沙雷氏桿菌突變株，其轉形細胞及其用途 <140> <141> <160>6 <170> Word 7.0

<210> 1 <211> 2074 <212> DNA <213〉黏質沙雷氏桿菌（公而如mar⑽(:㈣） <220> <221〉rssA基因 <400> 1 gtgaacatat gagctggccg tcatccggcg catgcgctga cgcgaccgca aaaccctgtg ggcttcgcgt gtcatgctgg ctcatgcgtt cacggcgata atcggtaaag cggaatgatc tttattattg gaaatatttc aacaggcact tgttggtgga gctttaattt gattcgatct tcgcctggcg ttgaaaacct cgctgccaaa cacaaacctg ataacgaatt gcaccggcac gcgtggaaag acagagtgat ggtttcaaat tgggggctcc gataaccagc gacaatatcg agacgacctg gtgctgggtg gatgctgctg cgccaccggg ggtgaacagc actcatctcg gagcctcggc gctgatgctg cgtggtgcgc caactcgctg taccgtacgc ccttctttat tcgtcgcctg aacgcatcgt attaccgcgg caattaggca cgcctgatcg gatctcacgc caaaatatcc ctggaataca cgcgtcaagg gcgctgtatc tcgaaaaaag aaagcggtgt gaagtgcaca ggcattggct gcgcaccatt ggtgaaatat cgctgcaggc catcatcaag aggcgctgtg ccgacgcgga tgccggacgg cgatcatcat gcccgaacga ctgtcaaccg tcgatccggt agtatcacct tggaacagcg tgcataattt atttgctgaa attttccagg tggtattacc atcgccaata accattgaag ccgcgcattg aaataaactt cgacggtttg cctgaccgcc ctttctggcc gcgcatggcg caaccatcag gctgcacgaa gctgttcggc acgacgcaag gaaagagtag tgctggccat ccgacatgga ttctcgacga gcatgtacat 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900

O:\91\91726DOC 200533744 tgattccatc aataacggca tgcaggatga aatcgactat cacccgctgt ttgtggttta 960 cgatcgagac aaccgggtgc tttacagttc gcaaacgcag ggagagccgc tgcgcctgcc 1020 gccttcggtg ctgtccggtt ccgtcaatta cgccggcgcc aactggcatc tcgccggcag 1080 ctggaaagaa aagcgccagt accgggtgat cgtcggcgaa tcgttcaacg atcgcaccac 1140 gctgttcggc aatccggcgg acgtaccgct gctgggcatt ctggcggcca tcatcgtcac 1200 cttgctgttt accgcctatt tcagcctgcg gccgctgcgc cagatcgccc gcaccatctc 1260 cgatcgccag cctggcaacc tgtcgccgat caacgtcagc gagcagtatc aggaaatccg 1320 gccggtggtg atggaggtca acaaactgat ggcgcgcatc gacgccgcca atcagcgcga 1380 gaaacggttt atggccgacg ccgcgcacga actgcgcacg ccgatcgccg ccgtgctggc 1440 gcagctgcat ttgctgaccc aggtcaccga gcagcaggag cgccgggaga tcatcggcga 1500 catgcaacaa gggctggatc gcgcggcgtc gctgtcacgc cagctgatca acctggccaa 1560 gctggaggcg gaagattttc cgctgaagat tgaggcggtg gacatctacg ccgaaattgg 1620 caaatgcatc gcgcagcacg ttccctatgc attggaaaag gatgtggaac tgtcgctcga 1680 cggcagcgag gatgtggtgg tgagcaccga tcgccgtgcg ctgatcgcca tcttcaccaa 1740 tctgctggac aatgcgctca aatacgcgcc gcccggcagc cgcatcgaag ccaatatccg 1800 ctcgctggcg ccgctcggct gctatattac gttgcgcgac aacggcccag gagtaagcga 1860 agaacaccgt tcccgcctgt ttgagcgctt ttaccgcgtg cccggcacgc agcaaaccgg 1920 cagcgggctc ggattggcca tcgcccgcaa cctggccgac cctggccgac cgcagctgcg 1980 cgtcaccgaa ggcctcgacg atcgcggcat cggcttcatc atcgatttgc atcgatttgc 2040 ccggccacag actgagagtg aaccacgacc atga 2074 <210>2 <211〉300 <212> DNA <213> 黏質沙雷氏桿菌marcesre/u) <220> <221〉fabG 基因 <400> 2 acgctgctcg ttttgttgct gttgtctttt cgcggcgatg cgcagagcca tagccacggc 60 ggccatcatg cttccgcttt gcagcgggta catcaggcgg cggcgacgga tgcttacggc 120 tgcgccaagt cgcgcattaa aaagcagctg cgccgcctgg ctcagctttg aagcggtttt 180 tagggagccg ctctatactc tgacgggcat acggggcgcc tgcgcgcagg ccgctgtgtt 240 gatatcgcta accagagaaa aaacagtatg acgaaagtgg cattggtaac cggcgcaagc 300

<210>3 <211>24 <212> DNA

O:\91\91726.DOC 200533744 <213>人工序列 <220> <221>引子 <400〉3 accgtacgcg gcattggcta tttg 24 <210〉4 <211〉 22 <212> DNA <213〉人工序列 <220〉 <221〉引子

<400> 4 ggggcaatca tggtcgtggt tc 22 <210〉5 <211>30 <212> DNA <213>人工序列 <220〉 <221〉引子

<400〉5 ccggaattcg ccggttacca atgccacttt 30

<210 6 <211〉 28 <212> DNA

O:\91\9I726.DOC 200533744 <213〉人工序列 <220〉 - <221>引子 <400> 6 28 taatacgtag ggggagcgaa acatgcag

O:\91\91726 DOC -4 -

Claims (1)

1. 200533744 拾、申請專利範圍： 1. 種聲占貝沙雷氏桿菌（☆厂突變株，其中 以以基因之表現係被抑制。 ” 2·根據申明專利範圍第1項之黏質沙雷氏桿菌突變株，其中 之rssA基因之核苷酸序列係經插入、置換及/或刪除一或 多個核苷酸以抑制其表現。 3 ’根據申明專利範圍第1項之黏質沙雷氏桿菌突變株，其中 之rssA基因包含SEQIDN〇：i之核苷酸序列或其類似物。 4·根據申凊專利範圍第1項之黏質沙雷氏桿菌突變株，其中 。亥類似物包含與SEQ ID N〇: }之核苷酸序列具有至少 80%同一性之核苷酸序列。 5.根據申請專利範圍第4項之黏質沙雷氏桿菌突變株，其中 該類似物包含與SEQ ID NO: 1之核苷酸序列具有至少 90%同一性之核苷酸序列。 6·根據申請專利範圍第丨項之黏質沙雷氏桿菌突變株，其係 為黏質沙雷氏桿菌CH-ΙΔΑ株，其係寄存於臺灣新竹的食 品工業發展研究所，寄存編號為BCRC910247。 7. —種轉形細胞，其係為經表現載體轉形之根據申請專利 範圍第1至6項中任一項之黏質沙雷氏桿菌突變株，其中 該載體包含/a6G啟動子及報導子。 8·根據申請專利範圍第7項之轉形細胞，其中該介啟動子 包含SEQ ID NO·· 2之核苷酸序列、其片段或其類似物。 9 ·根據申請專利範圍第8項之轉形細胞，其中該類似物包含 與SEQ ID NO: 2之核苷酸序列具有至少80。/。同一性之核 答酸序列。 O:\91\91726.DOC 200533744 1 〇·根據申請專利範圍第9項之轉形細胞，其中該類似物包含 與SEQ ID NO·· 2之核：y：酸序列具有至少90%同一性之核 菩酸序歹|J。 根據申明專利範圍第7項之轉形細胞，其中該報導子係為 可編碼發光蛋白質之基因。 ' 12 ·根據申明專利範圍第丨丨項之轉形細胞，其中該可編碼發 光蛋白貝之基因係選自冷光蛋白（luciferase)基因、綠色螢 光蛋白（green fluorescent protein)基因或藍色螢光蛋白 (blue fluorescent pr〇tein)基因所組成之群。 13.根射請專利範圍第_之轉形細胞，其中該可編碼發 光蛋白質之基因係為冷光蛋白基因。 14·根據申請專利範圍第13項之轉形細胞，其中該冷光蛋白 & 西係為 luxCDABJE。 根據申請專利範圍第7項之轉形細胞， 為pfabG，其係寄存於臺灣新竹的食品

   其中該表現載體係 工業發展研究所， 16. —種檢測生物抑制性物質之方法，其包含： 之轉形細胞接觸； (1)將待測樣本與根據申請專利範圍第7至項中任一項 中生物抑制性物 (2)測定報導子之表現量以判斷待測樣本 質之量。 其中該生物抑制性物 一甲笨、長碳鏈脂肪 乙基笨、 17.根據申請專利範圍第丨6項之方法，其中 質係選自酚、笨、曱苯、乙基笨、二曱 酸及其混合物。 O:\91\91726.DOC