TW200524636A - Method for preparing homogenous liposomes and lipoplexes - Google Patents

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200524636 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於：用於製備脂質體及由脂質體與核酸分子· 組成之複合體（脂複合體）的方法，用於穩定儲存相應脂複合、 體之方法，及相應製得之脂質體及脂複合體。 σ 【先前技術】 隨著利用基因治療之處理方法的出現，脂f體被認為是 病毒基因轉移系統之非常有前途的替代物。然而，對於$ 因治療方法而言，核酸在脂質體中/與脂質體之複合及相= ^ 複合體（脂複合體）之應用對脂質體技術提出了新的要求。= 實現有效及可重現之基因轉移，必須界定脂質體/脂複合體 之各種化學及物理參數。此外，該方法必須能夠在無菌條 件下進行，且必須滿足醫藥組合物之嚴格的製造要求。 陽離子脂質體之形成係製備非病毒基因治療有效之轉移 系統中的主要步驟。陽離子脂質體係自個別陽離子脂質製 得，或更通常係自陽離子脂質與中性兩性分子（輔助脂質、

輔脂質）之組合製得。此種第一試劑D〇TMA([N-l-(2,3-二油 I 烯基氧基）丙基]_N，N，N，-三甲基氣化銨）能夠在與等莫耳量 之DOPE(二油醯基磷脂醯基乙醇胺）混合後活體外及活體内 轉染哺乳動物細胞（Feigner等人（1989年）Nature 337 387-388)。同時，已知許多直接或結合中性兩性分子而用於 · 基因轉移中之陽離子脂質。該等陽離子脂質包括（例 ， 如）DORI(l，2-«一油酿基乳基碳基丙基-3-二曱基經乙基漠化 叙）、DORIE(l，2->一油烤基氧基丙基-3-二甲基-經乙基漠化 95081.doc 200524636 銨）、DOTAP(二油醯基三曱基銨·丙烷-(N-[l-(2,3-二油醯基 氧基）丙基]-Ν，Ν，Ν-三甲基-甲基硫酸銨））、DMRIE(N-(1，2-二肉豆蔻醯基氧基丙基）-N，N-二甲基-N-羥乙基溴化銨）、 DOGS(二-十八烷基醯胺基甘胺醯基精胺）、DOSPA(2,3-二 油烯基氧基-N-[2(精胺-羧醯胺基）乙基]-N，N-二甲基-1-丙 基三氟乙酸銨）、PDMAEMA(聚（2-二曱基-胺基）甲基丙烯酸 乙酯）、DDAB(二甲基二-十八烷基銨）、DC-Chol 3β-[Ν-(Ν’，Ν’_二曱基胺基乙基）胺甲醯基]-膽固醇）及 DAC-Chol((3-p [Ν(Ν，Ν’_二曱基胺基-乙烷）胺甲醯基]•膽固 醇））。此外，還有各種如（例如）W096/18372中所描述之精 胺膽固醇基-胺基甲酸酯、或如（例如）WOO 1/62946中所描述 之1，4-二氫吡啶衍生物。相關陽離子脂質之非決定性總結亦 可在（例如）Miller(l 998)，Angew· Chem. 110，1862-1880之發 表文章中找到，其特定地以引用的方式倂入本文中。某些 陽離子脂質及混合物亦可購得，例如Effectene™及 SuperFect™ (Qiagen, Hilden, Germany)^ FuGene 6™ (Roche, Mannheim，Germany)、LipoFectinTM、LipoFectin2000TM、 LipoFECTAMINE Plus™ (Invitrogen, Karlsruhe, Germany) ° 自上世紀80年代末，脂感染，亦即在脂質體中複合或與 脂質體複合之核酸的轉染已獲得長足發展，且已在許多細 胞類型及細胞株上成功地進行了試驗。對於基因治療之人 類應用而言，已發現脂複合體之使用係一種非常有前途的 方法。（Galanis (2002) Current Opinion Molec. Therapeutics 4: 80_87 ; Stopeck等人（2001)Clinical Cancer Res. 7: 2285_2291 ; 95081.doc 200524636

Voges等人 2002)Human Gene Therapy· 13: 675_685 ; Jacobs等人 (2001)Lancet. 358: 727-729 ; Morgtan(編著）Gene Therapy Protocols (2002) Humana Press Inc. New Jersey) o 對於人類應用而言，需要一種簡單且實用之調配物。尤 其需要製造物理及化學穩定之脂複合體及制定一種用於可 重現地製造此等在其生物物理及生物學特性方面具有恆定 品質之複合體的方法。 帶陽離子之兩性分子（例如，脂質）與帶負電之核酸分子 的組合經由靜電相互作用導致形成複合體。視混合方法、 起始材料之濃度、調配物等而定，複合體可絮凝（Gershon等 人（1993)Biochemistry 32·· 7143-7151 ; Lasic 等人（1997)J· Am· Chem. Soc. 119: 832-833 ; Eastman 等人（1997)BBA 1325: 41-62)。由於所形成之聚集體非常大（在自幾微米至幾毫米 的範圍），因此該分散液不穩定，且該產品不適於臨床應 用。由於對於其聚集特徵而言極難使脂複合體穩定，因此 對於臨床應用而言，脂複合體係由醫生在醫院中Γ床邊"） 新鮮製備，或以冷凍形式進行儲存（上述Galanis(2002);上 述 Stopeck 等人（2001);上述 Voges 等人（2002);上述 Jacobs 等 人（2001);上述 Morgtan(2002) ; Gao & Huang(1995)Gene Therapy 2:710-722 ; J:遂 Feigner 等人（1995) ; Nabel 等人 (1994)Hum. Gene Therapy 5:57-77及 1089-1094)。由於此原 因，開發多種提供具有可重現品質之脂複合體的方法非常 重要。 脂複合體之生物物理特性尤其視用於複合核酸之脂質體 95081.doc 200524636

的特性及品質而定。文獻中描述了各種製備脂質體懸浮液 之方法及脂質體製劑。因此例如，脂質體可藉由超音浴或 振動棒來來超音處理含脂質之溶液而得以製備。所涉及之 方法為非常耗能之方法（Perrett等人（1991)J. Pharmacy & Pharmacology，43:154-161)，其無法為醫藥生產而容易地擴 大規模。亦存在這樣一種危險，即因使用了振動棒，脂質 體將受到小金屬微粒之污染。產物品質（脂質體之尺寸）難於 重現，且藉此所形成之脂質體通常非常小（S250 nm)。 Gregoriadis等人（1990)Int· J. Pharmaceutics 65: 235-242描述 了如何使用脫水_水合方法來形成脂質體。脂質體中亦可包 括活性物質。然而，所形成之脂質懸浮液會在其尺寸分布 及多分散性上展示出較高程度的非勻相性。更勻相之脂質 懸浮液只有在額外的製程步驟微流體化作用後獲得

(Washington & Davis, (1988) Int. J. Pharmaceutics 44:169-176; Vuillemard JC. (1991) J. Microencapsulation 8: 547-562)。然而， 此方法係在非常高之壓力下操作。 由磷脂分散液之製備知道可藉由擠壓方法來製備脂質體 (Elorza等人（1993)J. Microencapsulation 10:237-248; Berger等人 (2001 )Int. J· Pharmaceutics 223: 55-68)。該工作一般係在非常 高的壓力下進行，尤其是在擠壓係穿過孔徑尺寸小於1000 nm之膜來進行時（在Berger等人（上述）的情況下，操作壓力 超過50x105 Pa)。此一方面產生小脂質體，且另一方面在將 其轉換為大規模方法時涉及相當大的開支。此擠壓方法亦 經常與諸如冷凍-解凍步驟之另一製程步驟組合，以增加產 95081.doc 200524636 品品質。Mayer 等人（1986)BBA 858: 161-168; Hope 等人 (1985)BBA 812: 55-65; Nayar等人（1989)BBA 986: 200-206描述 了 一種擠壓凝膠相脂質之方法，但此方法亦需要介於17.5 與49 X 105 Pa之間的極高壓力。視所用之脂質及擠壓壓力 而定，該等作者主要描述了具有非常小（一般小於2〇(M 50 nm)直徑之脂質體的製備。

Sorgi & Huang (1996) Int. J. Pharmaceutics 144: 131-139 描述了使用微流化劑來製備陽離子脂質體，但其亦係在高 壓下操作。所用之操作壓力為約6.2x105 Pa。所製得之脂質 體的直徑小於200 nm(亦參照W096/27393)。專利申請案 W098/178 14亦描述了尺寸約為8〇〇 nm之陽離子脂質體。 總而吕之可表明：此項技術中已知之方法產生了非常小 的脂質體（<200 nm)，由於其較低的轉染效率，所以對於核 酸之轉移而言，其僅可用於非常有限的情況，或者該等方 法產生了非勻相之脂質體，其確實可充分轉化，但在長時 期内不穩疋’且可能不能滿足醫藥組合物之嚴格的品質要 求。 因此，本發明之一目標係提供一種用於製備在儲存上高 度穩定之勻相脂質體的方法及待製備之具有足夠的轉染效 率且同時具有良好穩定性之勻相脂複合體。另一目標係提 供相應的尺寸量度（measuring)為250-800 nm之脂質體及尺 寸量度為250-600 nm之脂複合體。 本發明之另一目標係揭示一種相應的用於製備脂質體戋 脂複合體之方法，其中脂質體或脂複合體可在GMP條件下 95081.doc -10- 200524636 製造。此係指在無菌條件下的可再製之勻相脂質體/脂複合 體批料之大規模製造。 本發明之另一目標係製備相應的勻相且可儲存之脂質體 及月曰複合體，其具有足夠的轉染效率且同時具有良好的穩 定性及GMP品質。 【發明内容】 本發明係關於一種用於製備勻相脂質體之方法，其中脂 質懸浮液在小於3x105 Pa之低壓條件下以一連續方法擠壓 穿過孔徑尺寸較佳介於600-900 nm之間的多孔膜。已發 現：使用陽離子脂質體或含有陽離子脂質及中性兩性分子 之脂質體（例如由DC-Chol/DOPE或DAC_Chol/DOPE組成） 的相應方法產生了穩定且勻相之脂質體混合物，其中脂質 體之量度為250-800 nm，較佳為250-600 nm，且多分散指 數為幺0.6 ’較佳S0.5，更佳<0.4。已證實使用聚碳酸酯膜作 為擠壓膜尤其有利。 根據一較佳實施例，脂質懸浮液中脂質體之濃度介於 〇·〇4與5 mg/ml之間，較佳介於〇1-2 mg/mi之間，尤其介於 0.1-1 mg/ml之間。在本文中，已證實流動速率介於1〇_25〇 1111/111111之間、較佳介於5〇_15〇1111/111丨11之間、最佳介於75-120 ml/mm之間尤其適宜。根據本發明之擠壓方法亦可在周圍 溫度下進行卻不會影響脂質體之品質。 根據另一實施例，根據本明之相應方法係在無菌條件下 於一密封系統中進行。脂質體或脂質體懸浮液可預先穿過 孔徑尺寸達1〇〇〇 nm之膜以進行預過濾。 95081.doc 200524636 根據另一實施例，本發明係關於一種用於連續低壓擠壓 脂質體之方法，其中該等脂質體較佳為含有陽離子脂質或 陽離子脂質與中性兩性分子之混合物的脂質體，較佳為 DC-Chol或DAC-Chol與DOPE之組合，其操作條件為：壓力 低於3xl05Pa，流動速率介於l〇 — 250 ml/min之間，且脂質濃 度介於0.04-5 mg/ml之間·，該方法之特徵在於脂質懸浮液連 續擠壓穿過多孔膜2-20次。令人驚奇地，此方法特別製得 里度尺寸為250-600 nm、較佳為280-500 nm、最佳為280-400 nm且多分散指數s 〇 · 5、較佳g 〇 · 4之勻相脂質體。 已證實使用如圖1所示之裝置來大規模製造根據本發明 之相應脂質體尤其適宜。該裝置由以下部分組成：機械或 電泵（1 )、通流量測調節器（2)、用於量測過濾壓力之壓力計 (3)、具有擠壓膜（孔徑尺寸為（例如％⑼nm/0為（例如）47 mm)之過濾盒（4)及通風閥（8)、溫度量測元件（5)、貯藏器孤 (6)及允許物質連續流動穿過擠壓膜且回流進入該貯藏器皿 的環形管道系統（7)。 本發明亦係關於藉由在此所描述之一根據本發明之方法 所製備的脂質體或含有多種脂質體之脂質體混合物。本發 月尤其係關於由多種界定尺寸介於250與8〇〇 nm之間、較佳 介於250與600 nm之間的脂質體組成之脂質體混合物，其中 該等脂質體含有陽離子脂質及中性兩性分子，其特徵在於 月曰質體混合物之多分散指數具有2〇·6〇、較佳2〇·5〇、最佳 < 〇·4的值。根據另一實施例，脂質體混合物之特徵在於： &離子月曰貝為膽固醇’例如DC-Chol((3- /5 [Ν(Ν，，Ν，-二甲基 95081.doc 200524636

胺基乙烧）胺甲醯基]-膽固醇））或DAC-Chol((3-万IT 二甲基胺基-乙烷）胺曱醯基]-膽固醇））。根據另一較佳實施 例’根據本發明之脂質體含有乙醇胺衍生物，例如二油酿 基磷脂醯基乙醇胺（DOPE)。 此外，本發明係關於一種用於混合根據本發明之脂質體 與核酸分子（核酸分子=核酸）之方法。已證實藉由能使脂質 體與核酸分子均勻且連續地組合的所謂γ形構件來進行混 合尤其有利。此外，已發現介於+/- 4-0.01之間、較佳介於 +/ - 1 · 2 5 - 0 · 7 5之間的脂質體核酸電荷比率製得尤其穩定且 勻相之脂複合體。已證實將等體積的含有脂質體之懸浮液 與含有核酸之溶液相組合在一起尤其有利。 根據另一實施例，當將脂質體與核酸混合時脂質體之濃 度介於0.02-1 mg/ml之間。已證實當將脂質體與核酸混合時 流動速率介於100-500 ml/min之間具有優勢。相應方法可在 一岔封裝置中進行，以使脂複合體可在無菌條件下製造。 根據本發明之相應方法使得製備由多種界定尺寸介於 250-600 nm之間、較佳介於275_5〇〇 nm之間、最佳介於 275-400 nm之間且多分散指數α·5〇、較佳<〇4〇的脂複合體 組成之脂複合體混合物成為可能。因此，根據另一實施例， 本發明係關於藉由藉由在此所描述之根據本發明之方法所 製得之脂複合體，尤其係彼等界定尺寸介於25〇_6〇〇 nm之 間、較佳介於275-500 nm之間、最佳介於275_4〇() nm之間 且多分散指數S 0 · 5 0、較佳< 〇 · 4 〇之脂複合體。 在另一實施例中，本發明係關於一種（例如）藉由在適宜 95081.doc 13 200524636 之fe疋劑存在下之凍乾法來長期儲存相應製得之脂複合體 的方法，該方法包含以下步驟··（勾將脂複合體混合物冷凍 至f50°C之溫度；（b)在約-2〇它之溫度下將脂複合體混合物 乾燥至少35小時；（c)在約2〇它之溫度下將脂複合體混合物 乾燥至少1 〇小時。 根據一較佳實施例，在適宜之穩定劑存在下凍乾根據本 發明之脂複合體混合物之方法包含以下步驟··（約以約 d C/min之降溫速率將脂複合體混合物冷凍至f 5〇。〇之溫 度；（b)在$·50°(：下將脂複合體混合物培育至少2小時；⑷ 以約SO.3°C/min之加熱速率將脂複合體混合物加熱至約 -20°C ; (d)在約-20°C下將脂複合體混合物乾燥至少35小 時；⑷以約<(K44°C/min之加熱速率將脂複合體混合物自約 -20 C加熱至約20°C ;及（f)在約20°C下將脂複合體混合物乾 燥至少10小時。已證實在介於〇.〇l-〇el*巴之間、較佳介於 0.025-0.05毫巴之間的壓力下進行（d)點之乾燥尤其適宜。 此外，本發明亦係關於可藉由在此所描述之一根據本發 明之方法來獲得之脂複合體凍乾物，以及在此所描述之句 相脂複合體或脂複合體凍乾物在製備醫藥組合物或作為醫 藥組合物中之用途，該等醫藥組合物在基因治療中用於轉 染哺乳動物細胞。 【實施方式】 本發明係關於一種用於製備勻相脂質體之方法，其中脂 質懸浮液以一連續方法擠壓穿過一孔徑尺寸較佳為 600-900 nm之多孔膜，該方法之特徵在於該擠壓係在壓力 95081.doc -14- 200524636 低於3x105 pa之低壓條件下進行。相應製得之脂質體具有 250-800 nm之平均尺寸。脂質體混合物之多分散指數 <0.6，較佳 <〇·5，或 <〇·4。 術語”脂質體，’意指脂質分子之多層（由至少一雙層脂質 組成）且一般為球形的積聚物之含脂質水懸浮液，其係藉由 在水中機械混合乾燥脂質形成。 π多分散指數”（=ΡΙ)係脂質體混合物中個別脂質體之勻相 或多相尺寸分布之量度，且表示混合物中微粒分布之寬 度。精確定義可在"Material and methods”章節中找到。pi 可藉由（例如）在此充當參考方法的”Material and meth〇ds" 章節中所述之方法來測定。 在本發明之意義上，術語，，低壓條件”係指低於3xl〇5pa、 較佳低於2x1 〇5 Pa且尤其較佳低於1x1 〇5 pa之過遽壓力。 擠壓穿過具有界定孔徑尺寸之膜使得製備具有界定尺寸 之脂質體成為可能。已發現，不僅孔徑尺寸而且諸如壓力、 々’L動速率、脂質濃度之其它參數亦影響所擠壓之脂質體的 化學物理特性。在高壓（高於3χ丨〇5 pa)下進行擠壓產生具有 大約小於200 nm之相對較小直徑的脂質體。相應之脂質體 在與核酸混合後展示出非常低的轉染效率，且此大大限制 了其在基因治療領域中之適宜性。此外，f要非常高的操 作壓力之方法僅可以相當大的技術代價來擴大至工業規 模。 藉由本發明，吾人已成功地提供了—種用於製備具有介 於250-800 nm之間、較佳介於28〇_7〇〇 nm之間、最佳介於 95081.doc -15- 200524636 280-600 nm之間的界定尺寸之勻相脂質體之方法。根據本 發明之方法之特徵在於高度可重現性，而其又允許製備句 相的用於基因治療之目的批量脂質體。批量意指在操作/生 產運仃過程中自界定量之起始材料製得之脂質體或脂質體 混合物。已發現，根據本發明之脂質體的高品質（=勻相性 及穩定性）必定會受到所選定之製程參數及方法指導的影 響。 吾人已驚奇地發現：若具有0.04-5 tng/ml、較佳為〇」-2 mg/m卜最佳為m mg/m卜再佳為〇 25]㈤咖丨之脂質濃 度的知貝懸浮液之擠壓係在低壓條件下穿過孔徑尺寸為 6.900㈣之膜來進行，則其產生尤其句相之脂質體/脂質 體混合物。因此，本發明亦係關於一種用於製備勻相脂質 體之方法，其中脂質懸浮液在低於3x105pa之低壓條件下以 一連續方法擠壓穿過孔徑尺寸為6〇〇_9〇〇 nm之多孔，該方 法之特被在於·月曰質濃度為0 04 — 5 ，較佳為〇· u mg/ml，最佳為〇·ι] mg/m卜再佳為〇 251叫㈤。 已很顯然，除了孔徑尺寸外，過濾壓力及脂質濃度與流 動速率亦影響脂質體/脂質體混合物之勻相性。令人驚奇 地，介於10-250 ml/min之間、較佳介於5(M5〇ml/min之間、 最佳介於75-120 ml/min之間的流動速率產生尤其勻相之脂 質體。因此’本發明亦係關於藉由低壓擠壓穿過6〇〇_9〇〇 nm 膜來製備勻相脂質體之方法，其特徵在於··脂質濃度介於 0.04-5 mg/ml之間，較佳介於〇1_2 mg/ml之間，最佳介於 0.1-1 mg/ml之間，再佳介於o.h-〗 mg/mI之間，且擠壓過程 95081.doc 200524636 中之流動速率介於10-250 ml/min之間，較佳介於50-150 ml/min之間’最佳介於75-120 ml/min之間。 擠壓膜較佳係孔徑尺寸為600-900 nm之聚碳酸酯膜，例 如孔徑尺寸為600、650、750、800、850或900 nm之聚碳酸 酯膜。然而，由諸如具有適宜特性之聚合物的其它材料所 製得之擠壓膜亦適於本發明之目的。 此外已發現，若擠壓係以連續方法進行且脂質懸浮液擠 壓穿過擠壓膜若干次，較佳在2-20次之間，則脂質體之品 質’尤其是脂質體混合物之勻相性可得到進一步的改良（例 如’參照實施例1，表4)。因此，本發明亦係關於藉由低壓 擠壓脂質懸浮液來製備勻相脂質體之方法，其中進行條件 車父佳為·脂質濃度介於〇.〇4_5 mg/ml之間，較佳介於〇·ι_2 mg/ml之間，最佳介於〇1_i mg/ml之間，再佳介於ου] mg/ml之間，且穿過6〇〇_9〇〇nm之膜，且流動速率較佳介於 10-250 ml/min之間，最佳介於5〇_15〇 ml/min之間，更佳介 於75-120 ml/min之間；該方法之特徵在於脂質懸浮液擠壓 穿過膜至少兩次，較佳在2次與2〇次之間。尤其較佳的是其 中擠壓係以連續方法進行之相應方法。甚至更佳的是（例如） 在無菌條件下於如圖1所示之密封系統中進行的相應擠壓 方法。 吾人已令人驚奇地發現，根據本發明之方法尤其適於製 備勻相陽離子脂質體/脂質體混合物或含有陽離子脂質及 中性兩性分子的脂質體/脂質體混合物。特定言之，已證 實右由中性兩性分子與陽離子脂質之混合物組成的脂質 95081.doc -17- 200524636 則其尤其勻 體係藉由在此描述之根據本發明之方法製得 相且穩定。 陽離子脂質”意指在規定條件下具有過剩正電荷之脂 質。中性（兩性離子）兩性分子意指在規定條件下無過剩電荷 且因此電荷中性之分子。

因此，根據另一實施例，本發明亦係關於用於製備含有 至少一陽離子脂質或陽離子脂質及中性兩性分子的勻相脂 質體/脂質體混合物之方法。用於本發明之目的之適宜陽離 子脂質為（例如）·· DOTMA([N-l-(2,3-二油烯基氧基）丙 基]_N，N，N，·三甲基氯化銨）、D0RI(1，2-二油醯基氧基羰基 丙基-3·二甲基羥乙基溴化銨）、D〇RIE(1，2_:油烯基氧基丙 基-3-二甲基羥乙基溴化銨）、d〇TAP(二油醯基三甲基銨丙 烧（N-[l-(2,3-二油醯基氧基）丙基]_N，N，N•三甲基-甲基硫酸 錢））、DMRIE(N-(1，2-二肉豆蔻醯基氧基丙基）_Ν，Ν·二甲基 -Ν-經乙基溴化銨）、DOGS(二-十八烷基醯胺基甘胺醯基精 胺）、DOSPA(2,3-二油浠基氧基-N-[2(精胺-羧醯胺基）乙 基]-N，N-二甲基-1-丙基三氟乙酸銨）、ρ〇ΜΑΕΜΑ(聚（2-二甲 基-胺基）甲基丙烯酸乙酯）、DDAB(二甲基二-十八烧基 銨）、DC-Chol 3β-[Ν-(Ν，，Ν，_:甲基胺基乙基）胺曱醯基]-膽 固醇）及DAC_Chol((3-P[N(N，N，-二甲基胺基-乙烷）胺曱醯 基]·膽固醇））。此外，還有各種如（例如）W096/18372中所描 述之精胺膽固醇基-胺基曱酸酯、或如（例如）WO〇 1/62946中 所描述之1，4-二氫吡啶衍生物。相關陽離子脂質之非窮盡性 概述亦可在（例如）Miller (1998)，Angew.Chem. 11〇，1862-1880 95081.doc •18- 200524636 之發表文章中找到，其特定地以引用的方式倂入本文中。 較佳地，根據本發明之方法適於製備勻相的含膽固醇之脂 質體/脂質體混合物，較佳為含有DAC-Chol或DC-Chol作為 陽離子脂質之脂質體/脂質體混合物。 對DAC_Chol之描述亦可在（尤其）Reszka等人之 W096/20208中找到，而對DC_Chol之描述可在Epand等人之 US 5,283,185中找到。某些陽離子脂質及混合物亦可購買獲 得，例如 Effectene™及 SuperFect™ (Qiagen，Hilden，Germany)、FuGene 6TM (Roche，Mannheim，Germany)、LipoFectin™、LipoFectin2000TM、 LipoFECTAMINE Plus™ (Invitrogen, Karlsruhe, Germany) ° 用於本發明之目的之適宜中性兩性分子為（例如）··膽驗 衍生物，諸如二肉豆蔻醯基磷脂醯基膽鹼（DMPC)、二棕櫊 醯基-磷脂醯基膽鹼（DPPC)、二油醯基磷脂醯基膽鹼 (DOPC);或乙醇胺衍生物，諸如二肉豆蔻醯基磷月旨醯基乙 醇胺（DMPE)、二棕櫚醯基磷脂醯基乙醇胺（DPPE)、二油醯 基磷脂醯基乙醇胺（DOPE)，其中DOPE尤其較佳。 吾人已令人驚奇地發現，若待擠壓之脂質懸浮液含有作 為中性兩性分子之DOPE及作為陽離子脂質之DC-Chol(較 佳為DAC-Chol)，則在此所述之根據本發明之方法產生尤其 勻相且具有低多分散性之脂質體/脂質體混合物。 陽離子脂質與中性兩性分子可以1:99至99:1之重量比存 在，此意欲包括該等值之間的所有重量比。若將陽離子脂 質與中性兩性分子以10:90至40:60之重量比混合，例如以 10:90、15:85、20:80、25:75、30:70、35:65、40:60之重量 95081.doc -19- 200524636 比混合，則獲得尤其穩定且勻相之脂質體。在 DC-ChohDOPE或DAC-Chol:DOPE之月旨質混合物情況下，混 合比亦較佳為 21:79、22:78、23:77、24:76、25:75、26:74、 27:73 ' 28:72、29:7卜 30:70、31:69、32:68、33:67、34:66、 3 5:65、36:64、37:63、38:62、39:61、40:60，混合比尤其 為30:70。在所有情況下，下文將DC-Chol^DOPE情況下之 70:30重量比的DC-Chol:DOPE稱為DC30 ， 且將 DAC-Chol:DOPE 情況下之 70:30 重量比的 DAC-Chol:DOPE 稱為DAC30。因此，在一尤其較佳之實施例中，本發明係 關於勻相脂質體之製備，該等脂質體具有較佳<0.6、更佳 S 0.5且再佳<0.4之多分散指數，且其係由30:70重量比的 DC-Chol:DOPE、較佳為 DAC-Chol:DOPE(DC30 或 DAC30) 組成。 根據根據本發明之方法的另一實施例，待擠壓之脂質懸 浮液為陽離子脂質與中性兩性分子在水溶液中之懸浮液。 該脂質懸浮液可額外含有其它物質，例如鹽、聚合物、糖 或糖醇。添加相應物質（=佐劑）可進一步改良欲製備之脂質 體以及由其製得之脂質體-核酸複合體之穩定性。 聚合物之實例包括：聚乙烯吡咯啶酮；衍生纖維素，諸 如羥曱基纖維素、羥乙基纖維素或羥丙乙基纖維素；聚糖， 諸如水溶性聚蔗糖（ficoll)或葡聚糖；澱粉，諸如羥乙基澱 粉或羥丙基澱粉；糊精，諸如環糊精（2-羥丙基-β-環糊精， 磺基丁基醚-β-環糊精）；聚乙烯、二醇類、殼聚糖、膠原質、 透明質酸、聚丙烯酸酯、聚乙烯醇及/或果膠。糖可為（例如） 95081.doc -20- 200524636 早糖、—糖、寡聚糖-或多聚播―、甘z人 飞夕汆搪或其組合。單糖之實例為果 糖、麥牙糖、半乳糖、g _ 匍萄糖、D-甘露糖、山梨糖及其類 以物。二糖為（例如）乳糖、蔗糖、海藻糖、纖維二糖及盆類 似物。適宜的多聚糖之實例尤其包括棉子糖、松三糖、糊 精、澱粉及其類似物。糖醇之實例又包括甘露醇、木糖醇、 麥芽_、半乳_、阿㈣糖醇、侧金盞花醇、乳糖醇、 山梨糖醇（葡輯）、派喃糖基山梨醇、纖維醇、肌醇及其類 似物。 /之實例尤其包括醫藥上可接受之鹽，諸如無機鹽，如 氣化物、硫酸鹽、鱗酸鹽、二磷酸鹽、氫漠化物及/或硝酸 鹽。脂質懸浮液亦可含有有機鹽，諸如顏果酸鹽H 二酸鹽、反丁烯二酸鹽、酒石酸鹽、玻拍酸鹽、乙基號轴 酸鹽、檸檬酸鹽、乙酸鹽、乳酸鹽、甲磺酸鹽、苯甲酸鹽、 抗壞血酸鹽、對甲苯磺酸鹽、棕櫚酸鹽、水楊酸鹽、硬脂 酸鹽、依託酸鹽、葡庚糖酸鹽或萊比酸鹽（labionate)。 根據本發明之製備方法可用於製備由多種具有介於 250-800 nm之間、較佳介於28〇_6〇〇 nm之間、最佳介於 280-500 nm、更佳介於280·400 nmi間的界定尺寸之脂質 體組成之勻相脂質體混合物，此時該等脂質體較佳含有陽 離子脂質及中性兩性分子，其特徵在於脂質體混合物之多 分散指數具有<0.60、較佳<〇.5〇、更佳s〇.4〇的值。因此， 本發明亦係關於由多種具有介於250與800 nm之間、較佳介 於280-600 nm之間、最佳介於280-500 nm之間、更佳介於 280-400 nm之間的界定尺寸之脂質體組成之相應的脂質體 95081.doc 21 200524636 混合物，該等脂質體含有陽離子脂質及中性兩性分子’其 特徵在於脂質體混合物之多分散指數具有< 0.60、較佳 S0.50、更佳S0.40的值。較佳地，根據本發明之脂質體含 有諸如DC_Chol或DAC-Chol之膽固醇衍生物與選自 DMPC、DPPC、DOPC、DMPE、DPPE之中性兩性分子之組 合，或較佳與DOPE之組合。已證實使用含有如下物質或由 如下物質組成之相應的脂質體/脂質體混合物尤其有利：作 為中性兩性分子之DOPE及作為陽離子脂質之D(>Cho1及/ 或DAC-Chol，同時DOPE與陽離子脂質之質量比為 70:30(0€30或0人030)。此外，根據本發明之方法可用於製 備含有如下物質或由如下物質組成之脂質體/脂質體混合 物：上述陽離子脂質、中性兩性分子、鹽、聚合物、糖、 糖醇或其組合。 在此所述之根據本發明之脂質體適於製備勻相脂質體-核酸複合體，以形成所謂的脂複合體，其係藉由將相應脂 質體與核酸分子簡單地混合來達成。核酸分子（=核酸）通常 為基因組DNA、cDNA、合成DNA、RNA、mRNA、核糖酶、 反義RNA、合成肽核苷酸及單股募核苷酸，較佳為cDNA。 核酸可含於（例如）DNA表現載體中或含於表現盒中，且以 此方式允許在目標細胞中轉染後重組表現吾人所關心之基 因。以此方式，各種基因（較佳為治療基因）可鎖定於目標細 胞中，且在其中得以表現。治療基因之實例包括（例如）：胰 島素、類胰島素生長因子、人體生長激素（hGH)及其它生長 因子、組織胞漿素原活化劑（tPA)、促紅細胞生成素（EPO)、 95081.doc -22- 200524636 諸如介白素（IL)(例如，IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、 IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、 IL-15、IL-16、IL-17、IL-18)之細胞活素、干擾素（ifN)- a、 -/3、-Τ、-ω或-τ、腫瘤壞死因子（TNF)(例如，TNF- a、 -冷或-7 )、TRAIL、G_CSF、GM-CSF、M-CSF、MCP-1 至 MCP-5、eNOS、iNOS、HO_l、HO_2、HO-3及 VEGF、HGF。 月曰複合體通常係精由將核酸分子添加至脂質體、或相反 地藉由將脂質體添加至核酸分子來製備。在本發明之範疇 内’已證實藉由（例如）使用所謂的γ形構件來均勻組合脂質 體與核酸尤其有利。γ形構件意指（例如）如圖9所示之三腿 管。其係由兩個以銳角會聚於出口管中之入口管組成。連 績混合方法產生具有恆定含量之核酸的脂複合體。此外， 吾人已令人驚奇地發現，連續組合核酸與脂質體導致核酸 在月曰貝體中幾乎全部内在化，而當將核酸與脂質體簡單地 混合在一起時，核酸一般自脂質體中突出，且因此疏於良 好的保護，從而具有相互作用且誘導脂複合體絮凝之趨 勢。因此，藉由經由所謂的γ形構件之連續混合所製得之穩 疋月曰複合體的轉染使得改良受轉染之目標細胞中的表現卜 I改良之生物活性）成為可㉟。相應製得之脂序复合體之特徵 在於尚勻相性、溶液中之物理穩定性、極佳之長期穩定性 東乾f生且同時具有高生物活性。此外，連續組合核酸 與脂質體使得製備達㈣規模之大量的具株定高品質之 脂複合體成為可能。

因此，在另一奮始irU 貫轭例中，本發明係關於一種用於製備脂 95081.doc -23- 200524636 複合體之方法，其特徵在於脂質體與核酸分子之混合係藉 由能使脂質體與核酸分子非常均句且連續地組合γ形構件 來完成。藉由該相應方法，較佳藉由使用一γ形構件，可獲 得量度為250-600 nm且多分散性《〇5、較佳後4之句相脂複 合體，其中在該Y形構件中，用於組合脂質體懸浮液與核酸 之兩個入口管彼此成<80度、較佳<7〇度、更佳<6〇度、再佳 <50度或<40度之銳角（參照圖9，角α)。在所有情況下，管 之内徑均視一起穿過Υ形構件之脂質體及核酸的體積而 定。在本發明之範疇内，已證實具有3至5mm管内徑 構件具有優勢。在20-800 ml/min '較佳在100-500 ml/min 之流動速率下，相應的Y形構件允許連續複合脂質體與核酸 以產生相應尺寸之勻相脂複合體。例如，實例中所示之脂 複合體係以約150-170 ml/min或約400 ml/min之流動速率進 行混合。 在本發明之範疇内，使用陽離子脂質體或由中性兩性分 子與陽離子脂質組成的脂質體混合物（例如，特定為DC30 或DAC30)來製備脂複合體。因此，相應的脂質體在其表面 上帶有正電荷，而核酸則由於其磷酸鹽構架而帶有負電 荷。自 W098/01030獲知：1:20(+/-)、較佳為 2:10(+/-)的帶 有正電荷之脂質體與帶有負電荷之核酸的電荷對所形成之 脂複合體具有穩定化影響。在本情況下，已發現諸如以下 值的4-0.01内之脂質體-核酸之電荷比（+/-)尤其有利且改良 了所得脂複合體之穩定性：4、3.9、3.8、3.7、3.6、3.5等， 3.0、2.9、2.8、2.7、2.6、2·5等，1.0、1.9、1.8、1.7、1.6、 95081.doc -24- 200524636 1.5 等 ’ 0.9、08、Π7 λ, • ·、Ο·6、Ο·5 等，0·09、〇·〇8、〇 〇7、〇 〇6 等。脂質體-核酸之電荷比（仏)表示所用陽離子脂質之正電 n核I之負電何的比率。假^所有單價陽離子脂質皆具 有個⑴正電何。此意謂所投入之陽離子脂質之莫耳數相 當於正電荷之莫耳數（此適用於僅具有—個⑴正電荷之脂 質；對於多價陽離子脂質而言，此在計算中必須予以考 慮）。核酸上負電荷之電荷載體為磷酸鹽基團（每個磷酸鹽基 團帶有一個負電荷）。已證實h25_0 75之脂質體_核酸電= (+/)尤其有利，特別是就Dc_f體之使用或較佳為 DAC30脂質體之使用而言。因此，本發明亦係關於一種使 用-Y形構件自陽離子脂質體或自含有陽離子脂質及中性 兩性分子的脂質體（例如，DC3〇或〇八(：3〇)來製備勻相脂複 合體之方法，其特徵在於脂質體_核酸電荷比（+/_)為 4-0·(Η，較佳為2-0」，最佳為，且再佳為丨25_〇.75。 除了混合方法本身外，流動速率及脂質體-核酸電荷比 (+/-)、混合過程中脂複合體之穩定性必定受到所用之脂質 體》辰度的衫響。已發現，以下列條件藉由γ形構件連續混合 諸如DC30或較佳為DAC30之陽離子脂質體與核酸：連續流 動速率為20-800 ml/min，較佳為100-500 ml/min，且脂質體 -核酸之電荷比（+/-)為4-0.01，較佳為2-0.1，更佳為15_〇 5 且再佳為1.25-0.75，此時使用具有介於〇·〇2與1 mg/ml之間 的脂質體濃度之勻相脂質體懸浮液尤其有利。因此，在另 一態樣中，本發明係關於一種用於製備脂複合體混合物之 方法，其係藉由經由Y形構件連續混合諸如DC30或較佳為 95081.doc -25- 200524636 DAC30之陽離子脂質體與核酸來達成，其中連續流動速率 為20_800 ml/min ’較佳為1〇〇_5〇〇 ml/min，且脂質體_核酸 電荷比（+Λ)為4-0.01，較佳為2_〇.ι，更佳為ι5_〇.5且再佳 為1.25-0.75 ’該方法之特徵在於使用了脂質體濃度為約 0.02-1 mg/ml、較佳為約〇1·〇·5 mg/ml之勻相脂質體懸浮 液。 根據另一較佳實施例，用於製備脂質體之方法與混合脂 質體與核酸之方法可直接相互結合。因此，根據一尤其較 佳之實施例，本發明係關於一種用於製備具有多種脂複合 體之勻相脂複合體混合物的方法，其中該等脂複合體之量 度為 25 0-600 nm，較佳為 275-500 nm，最佳為 275-400 nm， 且多分散指數較佳S0.5，最佳<〇·4，該方法包含以下步驟： (a) 將含有陽離子脂質或陽離子脂質與中性兩性分子之混 合物（例如，DC30或較佳為DAC30)的脂質懸浮液以一連續 方法擠壓穿過600-900 nm之膜，其中流動速率較佳介於 10-250 ml/min之間，最佳介於50-150 ml/min之間，更佳介 於75-120 ml/min之間，同時脂質懸浮液中之脂質濃度較佳 介於0.04-5 mg/ml之間’較佳介於〇· 1 _2 mg/ml之間，最佳介 於0.1-1 mg/m卜更佳介於0.25-1 mg/ml之間，且將該脂質懸 浮液擠壓穿過該膜至少一次，但較佳連續穿過2至20次；及 (b) 使用Y形構件來混合藉此製得之脂質體混合物與預先 經消毒過濾（較佳藉由〇·2 μιη之過濾器）之核酸分子，其中連 續流動速率為20-800 ml/min，較佳為100-500 ml/min，且脂 質體-核酸電荷比（+/-)為4-0.01，較佳為2-0.1，最佳為 95081.doc -26- 200524636 1.5-0.5，且更佳。 根據本發明之另一較佳實施例，此”組合"方法係在無菌， 條件下於一密封系統中進行。用於進行相應組合方法之裝· 置作為實例展示於圖3中。自含有脂質懸浮液之貯藏器皿⑴ 開始，藉由泵（2)連續抽汲脂質懸浮液使其穿過具有6〇〇_9〇() nm之多孔膜的擠壓裝置（3)。在該擠壓裝置後為支路〇，其 一方面允許脂質懸浮液回流至貯藏器皿（1)，且因此一方面 能使脂質懸浮液擠壓數次，或允許將經擠壓之脂質懸浮液 輸送至Y形構件⑹，與核酸之混合係藉由該¥形構件⑹發鲁 生。在支路（5)與貯藏器盟（1)之間以及在支路（5)與丫形構件 ⑹之間存在閥⑷，藉由該等閥⑷可調節回流量或流向㈣ 構件之々丨L里。在第二貯藏器孤（7)中係經消毒過濾之核酸， 可藉由第二果⑻將其直接抽沒至Y形構件（6)。可將藉由混 合經擠壓之脂質懸浮液與核酸所形成之脂複合體收集於收 集谷器（9)中。車乂佳地，該裝置為一密封系統，以使得製造 過程可在無菌條件下進行。相應裝置亦係本發明之目標。 使用在此描述之根據本發明之方法，令人驚奇地可能獲 得高度勻相性，脂質體之所以具有該性質亦係由於在與核 酸複合後之特定擠壓方法。在本發明之範疇内所製得之脂 複合體混合物之特徵在於：脂複合體之量度為25〇_6〇〇 nm，較佳為 275-500 nm，更佳為 275-400 nm，且在於€〇·5、 · 較佳值4且在某些情況下甚至後3之低多分散指數。由於 · 同度自動化，可能製造超過多於一批的勻相脂複合體混合 物’该夢混合物尤其適合作為一（多種）用於基因治療之醫藥 95081.doe · -27- 200524636 組合物或用於製備該等組合物。因此，根據另一實施例， 本發明亦係關於由多種具有介於250與600 nm之間的界定 尺寸之脂複合體組成的脂複合體混合物，該等脂複合體係 由如上所述的根據本發明之勻相脂質體與核酸分子之混合 物組成’其特徵在於脂複合體混合物之多分散指數具有 S0.5、較佳$〇·4的值。在一較佳實施例中，脂複合體係由 DC30-或較佳為DAC30-核酸複合體組成並具有相應物理參 數之相應的脂質體·核酸複合體。 在另一態樣中，本發明係關於一種用於凍乾在此描述之 根據本發明之脂複合體的方法，該等脂複合體較佳含有以 70:30之較佳比率混合的dope與DC_Chol或DOPE與 DAC-Chol之混合物（Dc3〇或DAC30)。使用下述方法，有可 能將脂複合體儲存較長時期，較佳至少8個月（參照表2〇)。 如貫例中所示’脂複合體一旦重新構成，則其物理參數或 其生物活性與未經凍乾（亦即”新鮮”製備）之脂複合體無 異。用於凍乾脂複合體之根據本發明之方法係在適宜之穩 定劑存在下進行，主要係在250 mM蔗糖及25㈤撾氯化鈉存 在下進行，且其包含以下步驟：（勾將脂複合體混合物冷凍 至f 50 C之溫度；（b)在大約-20°C下將脂複合體混合物乾燥 至少35小時，較佳在真空中乾燥35_6〇小時；（勹在大約加。◦ 下將脂複合體混合物乾燥至少10小時，較佳乾燥1〇_24小 時。此等時間僅視為是指導。 所用之穩定劑可為（例如）各種糖、糖醇或聚合物。其可 作為單獨組份、作為混合物及/與鹽結合使用。適宜的糖、 95081,doc -28- 200524636 糖醇、聚合物及鹽之相應實例如上文所給定。有利地，較 佳在脂質體之製備中使用等滲溶液（約290-330 mOsm)形式 之穩定劑。脂質可在（例如）擠壓前懸浮於含有相應穩定劑之 相應溶液中。然而，亦可設想藉由在脂複合體製備過程中 添加穩疋试劑來穩定脂複合體，例如藉由將核酸溶解於含 有相應穩定劑之溶液中。對於此等目的而言，使用含有作 為一糖之嚴糖與作為無機鹽之氯化納的組合物尤其有利。 此種等滲組合物（例如，300 mOsm)之一實例為在自約5 mM 至約100 mM之濃度範圍内、尤其為5、1〇、15、20、25、 30、35、40、45或50 mM的氯化鈉與相應比例之蔗糖的組 合。對於上述目的而言，亦較佳使用獨自含有甘露醇之組 合物或含有甘露醇與至少一種其它單糖及/或二糖（例如，蔗 糖或海藻糖）的組合之組合物。例如，此種等滲組合物（例 如’ 300 mOsm)可含有濃度在自約10J90 mM、尤其在約 150-290 mM之範圍内的甘露醇與相應地濃度在自約1〇_29〇 mM、尤其在約10_150 mM之範圍内的蔗糖或海藻糖的組 合。在本文中，已證實使用蔗糖連同氣化鈉、較佳為25〇111]^ 蔗糖及25 mM氣化鈉有優。 已證實，使用包含以下步驟之方法來凍乾上述脂複合體 尤其有利··（a)以大約src/min之降溫速率將脂複合體混合 物冷凍至f5〇C之溫度；（b)在f5(TC下將脂複合體混合物 。月至乂 2小時，（c)以大約$〇·3 c/min之加熱速率將脂複合 體混合物加熱至大約-2(TC ; (d)在大約_2〇t下將脂複合體 混合物乾燥至少35小時，較佳乾燥35_6〇小時；（e)以大約 95081.doc -29- 200524636 S0.44°C/min之加熱速率將脂複合體混合物自約·2〇亡加熱 至約20°C ; (f)在約2〇t下將脂複合體混合物乾燥至少1〇小 時，較佳乾燥10-24小時。因此，本發明亦係關於一種相應 之方法。已證實，在乾燥（步驟（d))過程中，介於〇〇1_〇1毫 巴之間、較佳介於0.025-0.05毫巴之間的壓力（例如，參照 表11及表13)尤其有利。 此外，本發明亦係關於藉由在此所述之方法中的一種方 法所製得之脂複合體凍乾物。 本發明進一步包含直接或凍乾形式的根據本發明之脂複 合體混合物在包括與醫藥活性物質之組合治療在内的基因 治療中之用途。其可用於將基因治療與其它治療方法相組 合，例如與投予包括蛋白質及/或肽的醫藥活性物質相組 合0 通常，以核酸之總量計，投予總劑量在自約0.1至約40 之範圍内（包括其間之所有值）的脂複合體或含有其之醫藥 組合物。在本文中，熟練人員清楚短語，，其間之值，，表示在 指定之上限與下限之間的所有值，例如0.2、0.3、 〇·6、〇·7 等，h〇、U、U、1·3、1·4、1.5 等，2·〇、2 1、 2.2、2.3、2.4、2.5等，3.〇、31、3.2、33、3.4、3.5等， 4.0、4·1、4·2、4_3、4.4、4·5 等，5 〇 等，6 〇 等，7 〇 等，8 〇 等，9.0等，⑽等，u.轉，12叫，nG等，14轉，ΐ5··〇 等 ’ 16·0 等，17·0 等，ι8·〇 等，19.〇 等，2〇 ()等，25 〇 等， 30·0等，35.0等，40.0。顯然，實際所用之劑量、確切組合 物、投予時間及方法以及其它處理細節玎改變。可用之適 95081.doc -30- 200524636 宜動物模型為普通家豬（Schwartz，R· S.等人（1990)， Circulation 82，2190; Karas，S· Ρ·等人（1992)J. Am_ Coll. Cardiol. 20, 467)或所謂的迷你豬（Tumbleson，Μ· E·及 Schook， L. B. (1996) Advances in swine in biomedical research, Plenum Press, New York，Bd· 2，684 ;亦參照Unterberg，C·等人（1995)J. Am. Coll. Cardiol. 26, 1747)。在該等模型中所獲得之結果可 接著相應地轉移至人體。在所有情況下以核酸之總量計， 較佳投予總劑量在自約0.5 /xg至約10 Mg、最佳在約1 gg至 約5 /xg之範圍的醫藥組合物。 實施例之實例 以下實例用以進一步說明根據本發明之目標及方法。 材料及方法· 化學藥品及細胞： 所用之佐劑滿足醫藥上允許之佐劑的要求：蔗糖 (Stidzucker AG，Miinchen，DE)、氣化鈉（Merck KG，Darmstadt， DE)、WFI(用於注射之水）（Boehringer Ingelheim，Biberach， DE)。所用之所有脂質皆可購得：DC-膽固醇及DOPE可自 Avanti Polar Lipid，Inc·獲得，DAC30 自 G.O.T. Therapeutics Berlin，DE獲得。戶斤用之質體係藉由Boehringer Ingelheim選殖 及製備，在某些情況下，下文亦將其簡稱為核酸，例如： pMCP-Ι，其係一種MCP-1(單核細胞趨化蛋白1)編碼質體； pEGFP，其係一種EGFP(J· (之增強型綠色營光蛋白） 表現質體。為此，在異種啓動子（CMV啓動子）後選殖MCP-1 或EGFP之編碼區域。質體亦包含可選擇之標誌基因（新黴素 95081.doc -31 - 200524636 磷酸轉移酶基因），以使得可在選擇劑（例如，G-418)存在下 選擇必定轉染之細胞。質體之尺寸為約5千鹼基對。用於轉 染實驗之 BHK21、COS-7、HASMC、A-10 SMC 細胞係自 ATCC(American Type Culture Collection)獲得，且根據隨其所 提供之說明進行生長。 二元脂質薄膜之製備： 根據Avanti Polar Lipid Inc.所提供之’’技術資訊π說明來製 造二元脂質薄膜。將兩種脂質（陽離子脂質及輔助脂質 DOPE)單獨地溶於氯仿中或氯仿：甲醇混合物（2:1 ν/ν)中。 接著，將這兩種脂質以所要質量比一同滴定。下文將由30 w% DC-膽固醇及70 w% DOPE組成的脂質混合物稱為 DC30(陽離子脂質縮寫後之數字表示其在混合物中所占之 質量比例）。對於通用方法，亦可參照Pleyer等人Exp· Eye Res.(2001)73:l-7。下文將由 30 w% DAC-膽固醇及 70 w% DOPE組成的脂質混合物稱為DAC30。接著，消毒過濾脂質 混合物。將溶於有機溶劑中之二元脂質混合物轉移至已預 冷至-20°C之冷凍-乾燥裝置中，且平衡樣品直至溶液溫度保 持平衡。在-20°C、0.94毫巴之壓力下經隔夜除去溶劑。接 著，在高度真空（1(Γ3毫巴）下除去殘餘痕量之有機溶劑。或 者，可藉由鼓入氮流或氬流穿過樣品（輕輕搖動）且將樣品加 熱至約30-40°C來除去有機溶劑。殘餘痕量之有機溶劑亦係 在高度真空下除去。此等操作係在無菌條件下進行。接著， 可自藉此獲得之脂質薄膜來製備脂質懸浮液。 DC30懸浮液之製備： 95081.doc -32- 200524636 為製備 1 mg/ml 的 DOPE/DC-Chol 70/30(w/w)之脂質懸浮 液，在周圍溫度下混合1 ml轉染溶液（250 mM蔗糖、25 mM NaCl)與1 mg DC30且使其膨脹30分鐘。由此，藉由以轉染 溶液進行相應地稀釋來製備0.25 mg/ml之DC30脂質懸浮 液。 DAC30懸浮液之製備： 為製備 1 mg/ml 的 DOPE/DAC_Chol 70/30(w/w)之脂質懸 浮液，在周圍溫度下混合1 ml轉染溶液（250 mM蔗糠、25 mM NaCl)與1 mg DAC30且使其膨脹30分鐘。由此，藉由以轉 染溶液進行相應地稀釋來製備0.25 mg/ml之DAC30脂質懸 浮液。 核酸之解凍、溶解及消毒過濾： 在2-8°C下的冰箱中解凍儲存於-20°C下的核酸（1 mg/ml)，且以轉染溶液（250 mM蔗糖、25 mM NaCl)將其稀 釋至所要濃度。同時，將質體（例如，PMCP-1或pEGFP)拌 入轉染溶液（0.05 mg/ml)中。接著，藉由0.2 μηι消毒過濾器 對其進行消毒過濾（視待過濾的量而定，使用不同尺寸的消 毒過濾器··例如，Millipak ΤΜ 20: 100 cm2過濾表面， Millipak TM 40: 200 cm2過濾表面，Messrs· Millipore)。使 用蠕動泵來進行過濾。在消毒過濾前及其後，在過濾器上 進行整合試驗（泡點方法，標稱泡點：3.45毫巴，根據Pharm. Eu且根據"GMP-Beratei*，，，醫藥工業及供應商之參考工作， 2001 年 10月，GMP Verlag)。 測定微粒尺寸及多分散指數： 95081.doc -33- 200524636 藉由PCS(光子關聯能譜法）（裝置：Malvern Zetasizer 3000 HS， Malvern Autosizer 4700， Malvern Instrument Ltd·， Worcestershire，UK，Nicom 380，Nicom Technologies INC，USA) 來測定脂質體及脂複合體之微粒尺寸（表示為平均直徑0) 及多分散指數（PI)。使用相同的膠乳標準來校準所有儀器。 同時，在樣品上以90°的角度來量測He-Ne雷射之散射（根據 ISO 13321:1996(E))，且藉由以累積量分析進行評估自散射 數據確定這兩個參數（0及PI)。微粒分布之寬度藉由無量綱 之多分散指數（PI)來描述，且根據ISO 13321·· 1996(E)界 定，如下所述： ΡΙ = μ2 /(Γ)2=σ2/2(Γ)2

其中，<Γ>為平均衰變速率，//2 = J(r-〈r〉)2G(r>T σ=標準偏差（更精確之資訊參見ISO 13321:1996(E))。 根據ISO 1 3321:1 996(E)來界定平均微粒直徑XPCS(下文 中僅稱為0)，如下所述： 咏⑺]d(l/X)。 藉由HPLC(高效液相層析法）來分析脂質： 藉由HPLC(高效液相層析法）來測定脂質濃度及陽離子 (例如，DC-Chol)與輔助脂質（例如，DOPE)之比率。此主題 參照 Chang C.D & Harris D.J. (1998) J. Liqu. Chrom. & Rel· Technol. V21:1119_ 1136或 Meyer 0·等人（2000)Eur· J. Pharm. Biopharm. 50: 353-356。 核酸分析： 根據通用方法，使用瓊脂糖凝膠（溴化乙錠染色法）來測 95081.doc -34- 200524636 定基於CCC、OC及線性比例之評估所用的核酸之品質（參照 Ausubel，F.M.等人 Current protocols in molecular biology. New York: Green Publishing Associates and Wiley-lnterscience. 1994(更新版）；Sambrook等人Molecular Cloning : ALaboratory Manual(第二版）Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor, N.Y·，1989)。藉由 PicoGreen檢定法或 UV光譜法 來測定含量。

Karl-Fischer滴定 > 藉由 Karl Fischer方法（European Pharmacopoeia，2002)來測 定凍乾物樣品中之殘留水分含量。 測定轉染效率： 使用可購得之套組，根據由套組製造商所提供之說明， 測定受轉染細胞之蛋白質表現，該套組可為MCP-1:由BD Biosciences Pharmingen，BD Biosciences，San Diego, USA製造之 人體 MCP-1 ELIS A套組。使用由Messrs Becton Dickinson BD Biosciences，San Jose，USA製造之FACS裝置（螢光活化細胞分 類器），根據製造商之說明來測定EGFP之表現（過濾器488 nm) ° 實例1 :製備勻相脂質體DOPE/DC-Chol 70/30(DC30) 擠壓時間/週期對脂質體之尺寸及勻相性之影響： 為製造勻相DOPE/DC-Chol 70/30脂質體，製備具有1 mg/ml 脂質濃度的轉染媒體中之DC30脂質懸浮液（見上）。藉由貯 藏器孤，經由密封低壓擠壓裝置（見圖1)將脂質懸浮液以80 ml/min之流動速率連續地抽汲穿過孔徑尺寸為600 nm之聚 95081.doc -35- 200524636 碳酸脂膜（Messrs· Millipore，Billerica, MA USA)。膜上所量測 之壓力小於lxlO5 Pa(105 Pa=l巴）。在一相應的實驗設置 中，約10分鐘之擠壓時間對應於大約2個擠壓週期。 裝置·· Filtron螺動泵； 矽管（内徑4 mm); 擠壓單元： 貯藏器皿： 自表1可見 微孔過濾器外殼； 600 nm聚碳酸酯膜/0 47 mm ; 1000 ml分液漏斗。 ’脂質體之尺寸由所進行之擠壓的數目（擠壓 週期）控制。未經擠壓之脂質體具有大於15〇〇 nm之平均尺 =，而表示為相對於平均脂質體尺寸之±標準偏差的散射約 為::：。當擠塵週期之數目增加時，形成平均尺寸大約為 相之脂諸數目增加時，脂質體之句 相[生亦增加（參照表1)。 表1 ··

95081.doc -36- 200524636 不同流動速率對脂質體之尺寸及勻相性的影響： 類似於上述實例，進行該方法。選擇流動速率以使得膜 上之壓力不超過3 X 1〇5 Pa之值。流動速率為210、110、54 ml/min。在所有情況下，擠壓體積均為每分鐘100 m卜如 上所述調整所有其它製程參數。自表2可見，流動速率對脂 質體之所得尺寸分布及勻相性具有相當大的影響。在相同 擠壓時期内將流動速率減小至小於100 ml/min製得更大之 脂質體。 表2 : 流動速率 210 ml/min 110 ml/min 54 ml/min 時間(分鐘） 尺寸士 SD 尺寸土 SD 尺寸土 SD 0 1626 nm (1270) 1804 nm (1360) 1573nm(1134) 2 423 nm (186) 557 nm (316) 689 nm (380) 5 371 nm (163) 429 nm (212) 522 nm (278) 10 358 nm (163) 374 nm (177) 436 nm (198)

孔徑尺寸、脂質濃度及擠壓週期之數目對脂質體之尺寸 及勻相性的影響：

在前述實例中，藉由600 nm及800 nm聚碳酸S旨膜來進行 擠壓。為此，如上所述製備脂質濃度為1 mg/ml或0.25 mg/ml 之DC30脂質懸浮液，且藉由貯藏器皿來將其以80 ml/min 之流動速率連續地抽汲穿過孔徑尺寸為600 nm或800 nm之 聚碳酸酯擠壓膜（Millipore，上述）。在所有情況下，在膜上 所測得之壓力均小於1 X 105 Pa。可在表3中找到對樣品之 描述。樣品7係藉由用轉染溶液將預先已擠壓了 3次之樣品6 稀釋至0·25 mg/ml來製備。 95081.doc -37- 200524636 表3 ·· 樣品/濃度 脂質漕唐0.25¾香./¾升 備註

7 思唐克=容液雜 j次穿過 稀釋 樣品5虎 上述實驗顯示：視膜之孔徑尺寸、_週期及脂質濃度 之選擇而定，可精確地調整脂質體之尺寸。視擠壓膜之孔 徑尺寸*定’三次擠壓0.25 mg/ml之脂f分散液給定不同結 果。當使用600 nm膜時，脂質體尺寸為28111111。當使用8〇〇 nm膜時，脂質體尺寸為352 nm。另一方面，若使用更高的 脂質濃度，則在3次穿過後，在稀釋脂質體後獲得相似之直 徑值。此等測試顯示必須彼此精確調整三個製程參數：脂 質濃度、擠壓週期（時間）及擠壓膜之孔徑尺寸。當擠壓之數 目增加時，可製得具有勻相尺寸分布之脂質體（參照表句。 經擠壓之脂質體的多分散指數隨著擠壓數目而減少。相較 於具有1 mg/ml脂質濃度的經擠壓之DC30脂質懸浮液，擠壓 0.25 mg/ml之DC30脂質懸浮液產生更勻相之脂質體 表4 ·· 脂質1 豐樣品 600 尺寸(nm) nm膜 多分散指f _ 8〇〇 t 尺寸(nm) im膜 多分散指數 樣品1 擠壓1次 348 0.53 420 0.55 樣品2 擠壓2次 290 0.40 366 0.54 樣品3 擠壓3次 281 0.30 __352 0.45 樣品4 擠壓1次 465 0.51 430 0.65 95081.doc -38 - 200524636 樣品5 擠壓2次 390 0.56 372 0.67 樣品6 擠壓3次 380 0.59 355 0.57 樣品7 稀釋 369 0.42 368 0.46 經擠壓脂質體之穩定性： 將藉由連續低壓擠壓（濃度為1 mg/ml，流動速率為80 ml/min，壓力小於lxlO5 Pa，600 nm膜）所製得之脂質體儲 存於周圍溫度及4°C下。在不同時間量測儲存對脂質體之穩 定性（=尺寸）的影響。 表5 : 擠壓 時間/分鐘 微粒尺寸(nm) 立刻 61 RT 1 4°C 12 RT h 4°C RT [h 4°C 5 478 489 482 463 471 487 482 10 397 389 392 386 395 379 385 15 368 372 379 375 368 381 375 30 352 348 346 356 351 360 354 將看見，脂質體之尺寸在4°C及周圍溫度下在24小時内保 持穩定。因此，無導致炫融之ff阻力（frustration)"(表面張力） 堆積於脂質體中。所進行之實驗及前述實例顯示：低壓（小 於3· 105 Pa=3巴）下之連續流動擠壓係一種可重現地製備在 介於約25 0 nm與800 nm之間的尺寸範圍内之脂質體的適宜 方法。脂質體之尺寸可藉由擠壓時間、流動速率及擠壓膜 之孔徑尺寸來調整。脂質體之尺寸在周圍溫度及4°C下在至 少24小時之時期内保持穩定，且因此允許可靠且簡單地’’進 一步處理”脂質體以形成脂複合體。可以平穩地”可縮放”且 95081.doc -39- 200524636 可在無菌條件下生效之方法的方式將該方法容易地調適用 於工業規模。 在擠壓過程中（600 nm擠壓膜），DC3 0脂質體之品質保持 不變。濃度及DC-Chol與DOPE之比率皆不變。脂質體之脂 質含量（表6)藉由HPLC(高效液相層析法）來測定。 表6 : 樣品 組成(所需） 批次1 擠壓1次 〇g/mL) 批次2 擠壓2次 (Mg/mL) 批次3 擠壓3次 (Mg/mL) 擠壓後之脂質體 DC-Chol 30 gg/mL 33.4 30.8 31.4 DOPE 70 "g/mL 72.1 68.3 69.7 實例2 :勻相脂質體DOPE/DAC-Chol 70/30(DAC30)之製備 以實例1中之發現為基礎，製備尺寸介於250與800 nm之 間且多分散指數S0.6之勻相脂質體。為製備勻相脂質體 DOPE/DAC-Chol 70/30 w/w(DAC30)，用轉染媒體（250 mM 蔗糖、25 mMNaCl)培育DAC30脂質薄膜30分鐘，且使其膨 脹30分鐘。將脂質濃度調整至1 mg/mL。將脂質懸浮液轉移 至低壓擠壓裝置中。接著，藉由密封低壓擠壓裝置（見圖1) 將脂質懸浮液以80 ml/min之流動速率連續且均勻地（類似 於實例1)抽汲穿過孔徑尺寸為800 nm之聚碳酸酯膜 (Messrs. Millipore，Billerica，MA USA)。在膜上所所測得之 壓力小於lxl05 Pa。在一相應實驗設置中，5分鐘之擠壓時 間對應於一個（1)擠壓週期。該實驗係在無菌條件下用經消 毒的材料及裝置進行。 裝置： Filtron蠕動泵； 95081.doc -40- 200524636 矽管（内徑4 mm); 擠壓單元：擠壓夕卜殼Gelman Sciences 2220 ; 800 nm聚碳酸酯膜/0 47 mm ; 貯藏器皿：10 00 ml分液漏斗。 接著，用經消毒過濾之轉染媒體（250 mM蔗糠、25 mM NaCl)將經擠壓之DAC30脂質體稀釋至〇·25 mg/ml之脂質濃 度。在脂質薄膜膨脹後，獲得量度為自500至1500 nm之脂 質體，其尺寸一般不能在批與批之間重現（參照表7)。在1 mg/mL脂質懸浮液單次擠壓穿過800 nm聚碳酸S旨膜後’獲 得量度為自430至450 nm且具有在自〇.4至0.5範圍内的窄多 分散指數（=PI)的DAC30脂質體。在將1 mg/ml經擠壓之脂質 體稀釋至0.25 mg/ml之最終》農度後’脂質體之尺寸在自 420-400 nm(PI=0.4至 0.5)之範圍内。 表7 : 實驗 擠壓前 擠壓後1 mg/ml 稀釋後 0.25 mg/ml 尺寸(pi) 尺寸(pi) 尺寸(PI) 1 1100 nm (0.99) 447 nm (0.47) 439 nm (0.40) 2 502 nm (0.96) 434 nm (0.45) 423 nm (0.49) 藉此所製得之脂質體可在2-8°C下儲存數天（7天）而無品 質損耗。在2-8°C下儲存7天後，脂質體之尺寸（表7之實驗2， 0.25 mg/mL)為 425 nm(PI = 〇·48) 〇 實例3:製備由DOPE/DC-Chol 70/3 0(DC30)及核酸組成之 勻相脂複合體 以實例1之發現為基礎，製備勻相脂質體。流程圖（圖4) 95081.doc -41 _ 200524636 展示了製備DC30脂複合體中之各個步驟。在前述實例中， 脂質與DNA之質量比為4:1，其對應於約0.75之電荷比（+/-)。 將400 mg經消毒之月旨質DC30與400 ml經消毒之轉染溶液 (250 mM蔗糖及25 mM NaCl)組合，以使得脂質濃度為1 mg/ml。在周圍溫度下膨脹30分鐘後，兩次穿過600 nm聚碳 酸酯膜來進行擠壓。將375 ml此脂質懸浮液與1500 ml轉染 溶液組合。獲得1875 ml 0.2 mg/mL之DC3 0脂質懸浮液。脂 質體量度為310nm(PI = 0.3 5)。將於2-8°C下解凍的濃度為1 mg/ml之DNA( 100 mg)拌入1900 ml轉染溶液中。稀釋步驟後 DNA濃度為0.05 mg/mL。接著，消毒過濾DNA溶液。 在下一步驟中，混合1875 ml此經消毒過濾之DNA溶液與 DC30脂質體。在所有情況下，脂質體懸浮液與DNA溶液之 起始體積均為1875 ml，且調整脂質體懸浮液（0.2 mg/mL) 及DNA溶液（0.05 mg/mL)之濃度以使得脂質與DNA之質量 比為4:1。 藉由進行圖3及圖4中所示之方法來獲得穩定之脂複合 體。必須進行前述混合過程以確保均一且連續地組合脂質 體與核酸。為此目的，藉由Y形構件（例如，Hibiki Y-1 0 3 mm，用於更大體積之Hibiki Y-2 0 5 mm，或Norma Y形構 件0 3 mm及0 5 mm)均勻且連續地混合脂質體懸浮液與 DNA溶液，並將其轉移至經消毒之燒瓶中。其它幾何配置 亦可以。所用之Y形構件具有3 mm之直徑（圖3)。Y形構件 可由聚丙烯（PP)、聚乙烯（PE)或聚氯乙烯（PVC)製成，或由 不銹鋼或玻璃製成。用於核酸溶液及用於脂質體懸浮液的 95081.doc -42- 200524636 兩個泵必須’’相同切換’’=(同樣的流動速率），以使得可均勻 且連續地抽汲溶液。若使用能夠單獨地傳送兩種液體之單 級泵，則必須注意確保將這兩種液體同時吸入γ形構件中且 藉由該γ形構件進行組合及混合。在前述實例中之通流速率 為150-170 ml/min。兩種起始溶液之體積相同。 裝置：Ismatec螺動泵； Y形構件：0 am, Hibiki Y-1 (Carl Roth GmbH & Co_ KG·， Karlsruhe, DE)； 2個石夕管 Messrs· ITE (0 4 mm) (Intertechnik Elze，Elze， DE)。 在混合後，於進一步處理前使脂複合體容積（3750 ml)在 周圍溫度下靜置至少30分鐘：DNA濃度為0·025 mg/mL ;脂 質濃度為〇. 1 mg/ml。 在製得脂複合體後30分鐘，脂複合體尺寸一般為270-310 nm，且在周圍溫度下經3小時的儲存後幾乎不變（表8)。 表8 : 實驗 1 2 尺寸(nm) 多分散指數 尺寸(nm) 多分散指數 0.5小時後 297 0.15 289 0.17 3小時後 275 0.15 278 0.15 下表（表9)展示了藉由上述混合方法所製備之脂質體 (DC30)及脂複合體（DC30/DNA 4:1 w/w)的PCS結果（在30分 鐘後量測）。脂質體懸浮液係藉由各種擠壓週期（6〇〇 nm擠 壓膜）來獲得將看見，起始條件會影響脂複合體之品質。表 8及表9中之數據顯示，兩次穿過相同擠壓膜來擠壓脂質體 95081.doc -43- 200524636 得到這樣的脂質體，藉由該等脂質體可製造在280-3 10 nm 之尺寸範圍内且PI < 0.3之脂複合體。 表9 ·· 樣品 批次1擠壓1次 批次2擠壓2次 批次3擠壓1次 尺寸(nm) 多分散 指數 尺寸(nm) 多分散 指數 尺寸(nm) 多分散 指數 擠壓後之 脂質體 414 0.43 338 0.35 323 0.31 凍乾前之 脂複合體 338 0.30 281 0.20 269 0.16 凍乾後之 脂複合體 338 0.31 284 0.22 259 0.18 實例4 :製備由DOPE/DAC-Chol 70/30(DAC30)及核酸組 成之勻相脂複合體 以實例2之發現為基礎，製備勻相脂質體。流程圖（圖5) 展示製備DAC30脂複合體中之各個步驟。在前述實例中， 脂質與DNA之質量比為5:1，其對應於約1之正負電荷比 (+/-)。為此，組合100 mg經消毒之脂質DAC30與1〇〇 ml經 消毒之轉染溶液（250 mM蔗糖及25 mM NaCl)，以使得脂 質濃度為1 mg/ml。在周圍溫度下膨脹30分鐘後，一次穿過 800 nm之聚碳酸酯膜來進行擠壓。組合87.5 ml之此脂質懸 浮液與262.5 ml之轉染溶液以獲得350 ml 0.25 mg/mL之 DC30脂質懸浮液。脂質體量度為約430 nm(PI = 〇·4)。將在 2-8°C下解凍的濃度為1 mg/ml之DNA(20 mg)拌入380…之 轉染溶液中。稀釋步驟後DNA濃度為0.05 mg/mL。接著， 消毒過濾DNA溶液。在下一步驟中，混合此經消毒過遽之 DNA溶液與DAC30脂質體。在所有情況下，脂質體懸浮液 95081.doc -44- 200524636 與DNA溶液之起始體積均為350 m卜調整脂質體懸浮液 (0.25 mg/mL)及DNA溶液（0.05 mg/mL)之濃度以使得脂質 與DNA之質量比為5:1。 藉由進行圖3及圖5中所示之方法來獲得穩定脂複合體。 必須進行該混合過程以確保均一且連續地組合脂質體與核 酸（見實例3)。藉由Y形構件（圖9)均勻且連續地混合脂質體 懸浮液與DNA溶液，且將其轉移至經消毒之燒瓶中。所用 之Y形構件具有3 mm之直徑。用於核酸溶液及用於脂質體 懸浮液的兩個泵’’相同切換π，以使得可均勻且連續地抽汲 該等溶液。若使用能夠單獨傳送兩種液體之單級泵，則必 須注意確保將這兩種液體同時吸入Υ形構件中，且藉由該Υ 形構件進行組合及混合。在前述實例中之通流速率為400 ml/min。兩種起始溶液之體積相同。 裝置：Ismatec螺動泵； Y形構件：0 3 mm，Hibiki Y-1(見上）； 2個石夕管 Messrs· ITE(0 4 mm)。 在混合後，於進一步處理前使脂複合體容積（700 ml)於周 圍溫度下靜置至少30分鐘：DNA濃度為0.025 mg/mL ;脂質 濃度為 0.125 mg/ml。 根據實例4所製得之脂複合體的品質概括於表10中。其展 示了來自藉由上述方法所製得之4個不同批次的PCS結果。 表10 : 批次 尺寸(nm) 多分散指數 1 309 0.27 2 300 0.28 95081.doc -45 - 200524636 3 312 0.24 4 320 0.23 此等實例清楚地顯示可使用上述方法來製備可重現之批 次。月旨複合體在280-3 30 nm之範圍内，且PI < 0.4。 實例5 :包裝由DOPE/DC-Chol 70/30(DC30)及核酸組成之 勻相脂複合體 使用標準充填機（Messrs· Bausch & Str0eble，GmbH & Co· KG·，Ilshofen，DE)，根據活塞泵充填方法，將實例3中所製 得之DC30脂複合體裝入2 ml管瓶中（容量為1.5 m卜參照圖 4)。此步驟亦可在無菌條件下使用經消毒之材料來進行。 所用之主要包裝為： 管瓶：2R無色注射管瓶 GA1 BB(Messrs· Schott，Mainz，DE); 瓶塞：Gusto 13 mm V2 F210 3WRS D713 ; 滾花螺帽·· Kombika/Alu 13 mm(在所有情況下均係由The West Company，Germany GmbH，Eschweiler，DE製造）。 實例6 :包裝由DOPE/DAC-Chol 70/30(DAC30)及核酸組 成之勻相脂複合體 使用標準充填機（Messrs. Bausch & Stroble，上述），根據 活塞泵充填方法，包裝實例4中所製得之DAC30脂複合體。 或者，對於少量體積而言，可使用Eppendorf吸量管手工充 填容器。此步驟亦可在無菌條件下使用經消毒之材料來進 行（如實例5中之包裝）。 實例7 :凍乾由DOPE/DC-Chol 70/30(DC30)及核酸組成之 勻相脂複合體 對凍乾之預備性測試： 95081.doc -46- 200524636 控制凍乾之方法對凍乾物之品質具有相當大的影響。對 凍乾脂複合體之測試係在Lyo Com 4018冷凍乾燥裝置（凍 乾器）（Mess:rs. Hof)中進行。冷凍乾燥裝置之技術細節概括 於表11中。控制凍乾之起始數據（起始值）展示於表12中。起 始過程總共持續53.5個小時。 表11 : 設備名稱 GFT裝置 型號及製造商 Lyo Com 4018 (Tiny Lyo) Hof GmbH 35102 Lohra 總的架子空間 0,36 m2 架數 3 冷凝器之位置 外部，乾燥腔室下放 冷凝器之最大冰容量 10-15 kg 最低架子溫度 -55〇C 最低冷凝器溫度 -80°C 真空調節器 Pirani真空閥 溫度感應器 PT100

表12 : 持續時間 (hh:mm) 標稱溫度(°C) 真空度(毫巴） 裝載 00:05 5 1000 冷凍 00:55 -50 1000 00:30 -50 1000 01:00 -50 1000 00:30 -50 1000 主要乾燥 01:30 -20 0.05 33:30 -20 0.05 3:30 -20 0.05 95081.doc -47- 200524636

巴 在凍乾方法結束時，用氮來使 一 -ΤΓ ^ ^ -T； A 果乾态通風，且在600耄 下推封&瓶。自表丨2中所示 1 ννηι νπςΛ I轾參數開始，對用於測試 1-5(V01-V05)之方法進行如 衣3中所不之變化以優化該方 法0 表13 : 測試Ϋ0Ϊ V02 冷)東 在30分鐘 内自5至 -50°C 維持4小時 在30分鐘 内自5至 -50°C 維持4小時 在55分鐘 内自5至 -50°C 維持4小時 在55分鐘 内自5至 -50°C 維持4小時 ^StS(MD) °·10^ΈΓΓ~- 在30分鐘内至_3〇°c 維持23.5小時， 在1小時内至〇°C維持 jj.5小時 在1小時内至-i〇°c維 持23小時，1小時内至 jC維持13·5小時 〇·〇25毫巴（實際為 0.05-0.025 毫巴）， 在2小時内至-10°C 維持36.5小時 在1.5小時内至_2〇°c 維持37小時 V05 在55分鐘 内自5至 -50°C 維持2小時 〇·〇5毫巴， 在1.5小時内至_20°C 維持37小時 毫巴^ 在1.5小時内 至201：維持4 小時 ϋι毫巴 在1.5小時内 至 20°C 維持4小時 0.01毫巴 在1.5小時内 至 20°C 維持4小時 0.05毫巴 在1.5小時内 至 20°C 維持4小時

程式變化 冷卻梯度至 -50°C MD之真空度降 低， 溫度升高 冷凍梯度為 l〇C/min， MD擴展 〇·〇25毫巴真空 星 _ MD在-20°C下進 行，MD與AD之 真空度相同 0.05毫巴， 在1.5小時内 至 20°C 維持8+2小時 冷練2小時 (貯藏相縮短)AD 時間之變化 表14 t給定了各凍乾物之凍乾餅的視覺評定結果。凍乾 95081.doc -48- 200524636 餅之視覺檢測顯示：由於大體數目之凍乾餅崩解’所以測 試V01之凍乾餅不適宜。此等凍乾餅具有#常長的重新構成 時間。由Karl-Fischer滴定法所測定之殘留水分含量全部展 示於表16中。測試v〇l之凍乾餅的殘留水分含量大於5%。 表 15 : _ 測試 餅之特徵 評估 V01 在部分負載之中心之凍乾餅已完全崩 解’在邊緣上之凍乾餅顯著收縮 —^--- 不適宜 V02 所有凍乾餅均已顯著收縮，一些餅具有 空穴=崩解，罐(tin)外與罐内無明顯差別。 適宜(除了已崩解之餅 外)視覺邊界 V03 與V02類似，〜10%餅(分布於負載上)崩解 適宜(除了已崩解之餅 外)視覺邊界 V04 餅收縮，内外間無差別 週宜視覺邊界 V05 餅收縮，内外間無差別 適宜視覺邊界 未崩解之凍乾物（來自V〇l)展示出較低的殘留水分含量。 以不同調配物來進行測試V〇3及V04。一種調配物含有氣 化納（250 mM蔗糖、25 mM NaCl) ’另一種調配物不含有 氣化鈉（250 mM蔗糖）。表丨6中之數據顯示缺少氣化納產生 更乾的凍乾物。然而，調配物中缺少氣化鈉會導致脂複合 體液體調配物之不穩定性，此表示必需氣化鈉。藉由使用 更長的後期乾燥時間，可能製得殘留水分含量顯著低於3 % 之凍乾物（表16中之v〇5)。 表16 : 測試 NT 樣品 η 平均％ 最小％ 最大％ 小時 VC% V01 20°C，4小時 劣 3 559 529 5.85 0.28 5 V02 20°C，4小時 佳(内部） 3 320 2.61 3.57 0.52 16 V03 20°C，4小時 佳 3 274 222^ _3.37 0.58 21 20°C，4小時 佳/無NaCl 3 158 L26~· 1.90 0.32 20 V04 20°C，4小時 Ϊ 5 290 2.39^ 3.27 0.35 12 20°C，4小時 佳/無NaCl 5 132 1.13 』47 0.13 10 95081.doc -49- 200524636 V05 20°C，8小時 佳 5 223 2.02 2.74 0.29 13 20°C，l〇 小時 佳 5 196 1.50 2.70 0.45 23 各個測試之製造溫度的數據展示於表17中。 表17 : 測試 MD 初始MD rci 突然乾燥 (°〇 平均溫度 ΓΟ V01 30°C/0.10 毫巴 -42 -30 •36 V02 -10°C/0.05 毫巴 -40 -18 -29 V03 -10°C/0.025 毫巴 -40 -27 -34 V04 -20°C/0.05 毫巴 -40 -26 33 V05 -20°C/0.05 毫巴 -42 -30 -36 兩種調配物之玻璃轉移溫度（Tg，）係藉由量熱法（DSC 821 Messrs· Mettler Toledo (Giessen，DE))來測定。

Tg·轉折點10°C/ min對照劑_34°C

無氣化鈉之對照劑-32°C 真性劑（verum)-33至-35°C 主要乾無應在低於玻璃轉移溫度之溫度下進行。 概括言之，可以說視覺上崩解之餅比未崩解之餅具有更 高的殘留水分含量。無NaCl之凍乾物總是比具有NaC1之束 乾物乾燦。隨者後期乾餘時間增加，殘留水分含量減少， 且在2(TC下10小時後，殘留水分含量為約2%。真性劑與對 照劑之殘留水分含量相當。在主要乾燥開始時，產物溫度 (-40 C)低於Tg’（-34°C)。在-20°C及〇.〇5毫巴之主要乾燥條件 下，獲得光學上適宜之凍乾物。最佳之凍乾程式概括於表 18中。 凍乾DC30脂複合體： 根據實例3製備DC30脂複合體，且根據實例5進行包裝， 95081.doc -50- 200524636 接著凍乾。所用之凍乾器為由Messrs Hof(Lohra，DE)製造之 Lyo Com 5018。凍乾過程之總持續時間為64小時。使用真 空閥來調節真空度。真空度量測探針係由Messrs Pirani(Thyracont Elektronic GmbH，Passau，DE)製造之探 針。無需冷凍-乾燥薄片來進行乾燥。在800毫巴之壓力下 密封容器。精確的凍乾程式詳述於表1 8中。 表18 : 持續時間 (hh:mm) 所需時間 CC) 真空度 (毫巴） 裝載 00:00 5 1000 冷凍 00:55 -50 1000 02:00 -50 1000 主要乾燥 00:05 -50 0.05 01:30 -20 0.05 47:00 -20 0.05 後期乾燥 02:00 30 0.05 10:00 30 0.05 取出 00:30 5 0.05 總時間 64:00 將最終產物（管瓶）自凍乾器中取出，且將管瓶反壓。將 其儲存2-8°C。所形成之凍乾餅不會崩解。圖6A及6B展示凍 乾餅之SEM(掃描電子顯微鏡）照片。圖6B展示了凍乾餅本 身之細節。此類型之珠乾餅具有幾秒鐘之非常短的重新構 成時間。 來自表9之批次中之DC30脂複合體的殘留水分含量（藉由 Karl Fischer滴定法測定）展示於表19中。在每一情況下，每 95081.doc -51 - 200524636 批選定5只管瓶，並測定其殘留水分含量。 表19 : 樣品 批次1(%) 1次擠壓 批次2(%) 2次擠壓 批次3 (%) 3次擠壓 ’ 1 0.77 0.76 0.74 2 0.95 0.70 0.66 3 0.74 0.75 0.83 4 0.73 1.05 0.52 5 0.76 0.96 0.73 1 平均 0.79 0.84 0.70 SD 009 0.15 0.12 VC 11.5 18.15 16.58 SD :標準偏差，VC :變化係數 束乾物之殘留水分含量^ 3 %。可見到，各批次之間的殘 留水分含量無顯著差別。吾人已知殘留水分含量對產物之 穩定性具有相當大的影響。

實例8 :凍乾由DOPE/DAC-Chol 70/30(DAC30)與核酸組 成之勻相脂複合體 在上述實例中的 Messrs. Christ(Osterode，DE)之 Lyo Epsilon 2-12D凍乾器中進行凍乾。使用Pirani探針來調節真 空度。無需薄片進行凍乾。凍乾程式之精確細節包含於表 20中。 表20 : 製程步驟 時間 溫度 壓力 (hh:mm) (°〇) (毫巴） 裝載 00:00 +5 1000 95081.doc -52- 200524636 冷凍 00:55 •50 1000 冷凍 02:00 -50 1000 主要乾燥 00:05 -50 0.05 主要乾燥 01:30 -20 0.05 主要乾燥 47:00 -20 0.05 後期乾燥 2:00 +30 0.05 後期乾燥 10:00 +30 0.05 取出 00:30 +5 0.05 總時間 64:00 — 初步包裝如同實例5。DAC30脂複合體之殘留水分含量數 據（根據Karl Fischer測定）詳述於表21中（n=10只管瓶）。脂複 合體之含水量對於產物之長期穩定性而言係一重要因素。 表21 : 樣·品 含水量(％) 1 0.65 2 0.54 3 0.71 4 0.65 5 0.78 6 0.65 7 0.71 8 1.29 9 0.85 10 0.90 平均 0.77 DAC30月旨複合體之殘留水分含量的結果再次小於1%。在 以1.5 ml WFI重新構成凍乾物後，測定DAC30脂複合體之直 徑。表22展示了使用上述製備方法之4個獨立批次的結果。 展示了製備後30分鐘（凍乾前）及凍乾後（凍乾後）之脂複合 體尺寸的兩組數據（亦參照表10)。 95081.doc -53- 200524636 表22 : 凍乾前 凍乾後 批次 尺寸(nm) 多分散指數 尺寸(nm) 多分散指數 1 309 0.27 313 0.29 2 300 0.28 303 0.32 3 312 0.24 310 0.25 4 320 0.23 320 0.26 所用之凍乾程式不會對脂複合體尺寸產生不穩定化影 當（可）在無菌條件下進行整個過程時，在DAC30脂複合 體之最終產物上進行病原體計數。病原體計數係使用歐洲 及美國藥典中之方法來測定。表23展示了不同批次的 DAC30脂複合體之結果。 表23 : 凍乾後之脂複合體批次 每mL/g病原體計數 (cfu) 每mL/g病原體計數 (cfu) 細菌 真菌 批次1 <1/2.5管瓶 <1/2.5管瓶 批次2 <1/2.5管瓶 <1/2.5管瓶 批次3 <1/2.5管瓶 <1/2.5管瓶 批次4 <1/2.5管瓶 <1/2.5管瓶

Cfu :菌落形成單位 實例9 :脂複合體之生物活性及活體外轉染 核酸溶液與脂質體分散液之混合順序對產物品質之影 響： 核酸溶液與脂質體分散液之混合次序（將脂質加至核酸 =LtoD，將核酸加至脂質=DtoL)(L:脂質，D: DNA)會影響 95081.doc -54- 200524636 脂複合體之穩定性及其轉染特性。此部分地視所用之脂 質、脂質與核酸之比率、總脂質濃度及調配物緩衝液而定。

圖7展示了藉由可購得之脂質Lipofectin(Invitrogen life technologies，Carlsbad，USA)的實例之結果。如圖7所示，脂複 合體之尺寸及轉染效率皆改變（藉由EGFP之表現來測定）。 後者強烈地受到兩種溶液之組合及混合方式與方法的影 響。藉由LtoD製備之脂複合體之轉染效率為DtoL脂複合體 之轉染效率的兩倍。微粒尺寸亦改變（圖7)，且其視混合方 法而定。

亦對脂質DAC30進行類似測試，且概而言之可以說DtoL 脂複合體之轉染似乎稍優於LtoD脂複合體。在Lipofectin之 情況下，相反的混合順序給定更佳結果。這兩種製備方法 (DtoL及LtoD)皆具有引起脂複合體溶液聚集及混濁之趨 勢。藉此製得之脂複合體在脂質調配物中不穩定，且因此 不適於進一步處理（傾析且隨後凍乾）。此外，此等兩種方法 (DtoL及LtoD)得到微粒尺寸不可重現之脂複合體。批次間 之微粒尺寸的變化大於300%。 針對脂複合體之轉染品質來預處理脂質體： 相較於未經擠壓之脂質體，經擠壓之脂質體之預處理對 所製得之脂複合體之轉染效率及微粒尺寸具有影響。表24 展示了 DAC30/pAH7_EGFP 4:1 (w/w)之脂複合體的轉染效 率（表示為轉染細胞％)，其係藉由將質體與脂質體複合來進 行，該等脂質體未經擠壓或一次擠壓穿過800 nm擠壓膜且 使用Y形構件來進行混合。由經擠壓之脂質體製得之脂複合 95081.doc •55- 200524636 體的轉染效率為自未經擠壓之脂質體所製得之脂複合體的 轉染效率的兩倍。 表24 : 轉染效率/% 未經擠壓 經擠壓 HASMC 3.7 7.9 A-10SMC 12.0 26.4 HA SMC =人體主動脈平滑肌細胞，A-10 SMC=大鼠平滑 肌細胞 根據實例4製備之脂複合體批次的生物活性： 藉由轉染BHK21細胞來測試由質量比為5:1之DAC30及 pMCP-Ι質體組成之脂複合體的生物活性（轉染特性）。使用 BD OptEIA™ Human MCDA ELISA Kit, BD Biosciences Pharmingen來量測轉染細胞之經表現的MCP-1蛋白質。使用 可購得之測試劑（BCA，二金雞納酸）來測定總蛋白質。 效力=pMCP-l 濃度（pg/mL) 蛋白質濃度（Mg/mL) 表2 5顯示·新鮮製備之脂複合體（;東乾前）之生物活性與 經凍乾之脂複合體（凍乾後）之生物活性相當。凍乾前/後之 效力的比率為〜1 · 10，且因此表明生物活性未受影響。 表25 : 6孔盤 脂複合體之生物活性 凍乾前 凍乾後 批次 效力 MW(pg MCP-1 /呢蛋白質） 效力 未稀釋 1182 ----- 1072 95081.doc -56 - 200524636 以1:2進行稀釋 819 746 1:5進行稀釋 312 314 4個獨立批次在凍乾前及凍乾後所表現之蛋白質的比率 詳述於表26中。再次清楚地知道脂複合體之生物活性維持 不變。 表26 : 批次 凍乾前/後蛋白質表現的商 1 1.11 2 1.02 3 1.02 4 U2 實例10 : DAC30脂複合體之長期穩定性

在各種溫度下測定脂複合體DAC30/pMCP-l 5:1 (w/w)(作為凍乾物）之儲存穩定性（見圖8)。測定下列參數： 脂複合體之尺寸、勻相性（多分散指數PI)、DNA含量、ccc 形式之DNA完整性、殘留水分含量（表示為商：量測值/零值）

及生物活性（表示為測試批次之轉染效率，基於内標準品）。 將此等腊複合體在2-8°C下儲存8個月（表27)顯示：脂複合體 之尺寸在自300-3 3 0 nm之範圍内，且ΡΙ<〇·3。DNA含量及 DNA完整性（表示為％ccc形式）在量測精確度範圍内幾乎未 改變。殘留水分含量亦未變化。 表27 取樣時間

尺寸 (nm) 310 ΤΓο" "328* 多分散 指數 0.25 0.26 0.26 0.25 DNA含量 (Mg/ml) 26 ^29 27~ "25" ccc形式之DNA 完整性(％) 74Ύϊ ~77" "τΓ 殘留水分 比率 0.9 Τ〇^ΤΓ 95081.doc -57- 200524636 Τ=儲存溫度’標稱DNA含量=25(μ/ιπ1)’殘留水分比率= 量測值/零值 圖8展示了脂複合體（儲存於4。(：下）在8個月的時期内之生 物活性的結果。可見，待基於内標準品測試之批次之生物 活性的商包括大約為2的值。 在37°C下儲存液態脂複合體僅在約2個月後即導致生物 活性的急劇降低。商僅為〇. 1。 在3 7 C下儲存/東乾形式之脂複合體顯示在1個月後商為 0.82且在2·5個月後商為〇·5。在25 °C下儲存脂複合體（涞乾 物）仍展示4個月後生物活性商大於2。 【圖式簡單說明】 圖1 ·· 一連續擠壓裝置之圖解結構，該裝置由以下部分組 成·軟管泵（1)、流量調節器（2)、用於量測過濾壓力之壓力 計（3)、包含具有規定孔徑尺寸（例如，6〇〇 nm/047 mm)之擠 壓膜的過濾盒（4)及通風閥（8)、溫度量測元件（5)、貯藏器亚 (6)及環形管道系統（7)。 圖2 :用於製備具有界定微粒尺寸的脂複合體之流程圖。 圖3 ··用於製備可儲存之脂複合體之方法的圖。脂質懸浮 液之貝丁藏為皿（1)、弟一栗（2)、具有600-900 nm之多孔膜的 擠壓裝置（3)、閥（4)、支路（5)、γ形構件（6)、核酸之貯藏器 皿（7)、第二泵（8)及脂複合體之收集容器（9)。 圖4 :用於製備大小比率為4:1之DC3〇/核酸脂複合體的流 程圖。批量大小：375〇1111容積，劑量：〇〇251^/1111核酸。 圖5 :用於製備大小比率為5:1iDAC3〇/^^酸脂複合體的 95081.doc -58- 200524636 流程圖。批量大小：700 ml容積，劑量：0.025 mg/ml核酸。 圖6: (A)凍乾餅之表面的SEM(掃描電子顯微鏡）照片。（B) 凍乾餅内之SEM(掃描電子顯微鏡）照片。 圖7 :在脂複合體製備過程中，質量比為6: l(w/w)之 Hpofectin與pAH7-EGFP質體的不同混合順序對月旨複合體 (聚集體）之轉染效率及尺寸的影響。LtoD=將脂質加至 DNA，DtoL=將DNA加至脂質。脂複合體尺寸係藉由PCS來 測定。轉染效率係在A-10 SMC(平滑肌細胞）上進行測試。 圖8:在4°C下儲存幾個月之DAC30/pMCP-l 5:l(w/w)之脂 複合體的生物活性（轉染效率）。轉染效率係基於内標準品。 圖9 :用於混合核酸與脂質體之Y形構件。 【主要元件符號說明】 1 機械或電泵/軟管泵 1 脂質懸浮液之貯藏器皿 2 通流量測調節器/流量調節器 2 第一泵 3 壓力計 3 擠壓裝置 4 過濾、盒 4 閥 5 溫度量測元件 5 支路 6 貯藏器皿 6 Y形構件 95081.doc -59- 200524636 7 環形管道系統 7 核酸之貯藏器皿 8 通風閥 8 第二泵 9 收集容器 95081.doc 60-

Claims (1)

1. 200524636 十、申請專利範圍： 1· 一種由多種具有一介於250與800 nm之間的界定尺寸之 脂質體組成的脂質體混合物，該等脂質體含有一陽離子 脂質及一中性兩性分子，其特徵在於該脂質體混合物之 多分散指數具有<0.60的值。 2·如請求項1之脂質體混合物，其特徵在於該陽離子脂質為 DC_Ch〇l((3 + [N-(N*，N·-二甲基胺基乙烷）胺甲醯基]膽 固醇））或DAC-Chol((3J[N(N，N，·二甲基胺基-乙烧）胺甲 酿基]-膽固醇））。 3.如請求項1或2之脂質體混合物，其特徵在於該中性兩性 分子為一膽鹼衍生物（二肉豆蔻醯基磷脂醯基膽鹼 (DMPC)、二棕搁醯基磷脂醯基膽鹼（Dppc)、二油醯基磷 脂醯基膽鹼（DOPC))或一乙醇胺衍生物（二肉豆蔬醯2磷 脂醯基乙醇胺（DMPE)、二棕橺醯基磷脂醯基乙醇胺 (DPPE)或二油醢基磷脂醯基乙醇胺⑴⑽丑)）。 4·請求項3之脂質體混合物，其特徵在於該等脂質體含有作 為中性兩性分子的D0PE及作為陽離子脂質的Dc_Ch^ /或DAC-Ch0卜或由以上該等物質組成，_轉該陽離 子脂質之質量比為70:30。 ’其中一脂質懸浮液以 該方法之特徵在於該擠 下進行。 一種用於製備勻相脂質體之方法 一連續方法擠壓穿過一多孔膜， 壓係在小於3 X 105 Pa之低壓條件 6. 含有 95081.doc 200524636 7·如请求項6之方法，其特徵在於該陽離子脂質為一膽固醇 衍生物。 + 8·如請求項7之方法，其特徵在於該膽固醇衍生物為 二曱基胺基乙烷）胺甲醯基]•膽 固醇））或DAC-Chol((3 J[N(N，N，·二甲基胺基-乙烷）胺甲 醯基l·膽固醇））。 士明求項8之方法，其特徵在於該中性兩性分子為一膽驗 4亍生物（―肉豆蔻醯基磷脂醯基膽驗（DMpc)、二掠橺醯基 磷脂醯基膽鹼（DPPC)、二油醯基磷脂醯基膽鹼（D〇pc)) 或一乙醇胺衍生物（二肉豆蔻醯基磷脂醯基乙醇胺 (DMPE)、一棕櫊醯基碟脂醯基乙醇胺（DppE)或二油醯基 填脂醯基乙醇胺（DOPE))。 10·如研求項9之方法，其特徵在於該等脂質體含有作為中性 兩性分子的DOPE及作為陽離子脂質的DC_Ch〇1及/或 DAC-Chol，或由以上該等物質組成，D〇pE與陽離子脂質 之質量比為70:30。 11. 如請求項5至1〇中4壬一項之方法，其特徵在於該脂質懸浮 液中之I質體濃度為0·04_5 mg/ml，較佳為〇1_2叫㈤， 尤其為 0,1 -1 mg/ml。 12. 如請求項6至10中任一項之方法，其特徵在於該脂質懸浮 液係-陽離子脂質與-中性兩性分子於一水溶液中的一 懸浮液。 13·如明求項12之方法’其中該懸浮液額外含有鹽、聚合物 及/或糖化合物。 95081.doc 200524636 14·如請求項6至10中任一項 1A t 、万法，其特徵在於該擠壓係在 一介於10與250 ml/min之門从★ 曰’的流動速率下進行。 1 5·如請求項6至1 〇中任一項. '方法，其特徵在於該擠壓係在 周圍溫度下進行。 1 6 ·如請求項6至1 〇中任一項夕 — 、 法’其特徵在於該擠壓係在 一岔封糸統中於無菌條件下進行。 1 7.如請求項6至1 〇中任一項夕士^ 貝之方法，其特徵在於該多孔膜係 一聚碳酸酯膜。 1 8 ·如請求項6至1 〇中任一項之古、上 貝之方法，其特徵在於該多孔膜具 有多個在自600 nm至_ nm尺寸範圍的孔。 1 9·如請求項6至1 〇中任一項之古、土 甘a士" 貝之方法，其特徵在於該脂質懸浮 液連續擠壓穿過該多孔膜介於2與2〇次。 20· —種可藉由如請求項18之方法獲得之脂質體。 21. -種用於製備脂複合體之方法，其特徵在於將如請求項 20之脂質體與核酸分子混合。 、 22_如凊求項21之方法，其特徵在於脂質體與核酸分子之該 混合係藉由一 Y形構件來進行，該γ形構件允許均勻且連 續地組合（相等體積之）該等脂質體與核酸分子。 23·如請求項21或22之方法，其特徵在於在混合過程中脂質 體之濃度介於0.02與1 mg/ml之間。 24·如請求項21或22之方法，其特徵在於該等脂質體-核酸之 電荷比（+/_)介於4與-0.01之間。 25·如請求項24之方法，其特徵在於該等脂質體-核酸之電荷 比（+/-)介於0.75與1·25之間。 95081.doc 200524636 26. 如請求項21或22之方法，其特徵在於脂質體與核酸係以 一自20至800 ml/min之流動速率混合。 27. 如請求項26之方法，其特徵在於脂質體與核酸係以一自 1 00至5 00 ml/min之流動速率混合。 28. —種用於製備勻相脂複合體混合物之方法，其中該等脂 複合體混合物所具有的脂複合體量度為250-600 nm，較佳 為275-5 00 nm，最佳為275-400 nm，且多分散指數<0.5， 該方法包含以下步驟·· (a) 以一連續方法，以一較佳介於10·25 0 ml/min之間、最 佳介於50-150 ml/min之間、更佳介於75-120 ml/min之 間的流動速率將一含有DC30或較佳為DAC30的脂質 懸浮液擠壓穿過一 600-900 nm之膜，此時該脂質懸浮 液中之脂質濃度較佳介於0.04-5 mg/ml之間，較佳介於 0.1-2 mg/ml之間，最佳介於0.1-1 mg/ml之間，更佳介 於0.25-1 mg/m之間，且將該脂質懸浮液擠壓穿過該膜 至少1次，但較佳連續穿過介於2與20次；及 (b) 使用一 Y形構件混合藉此製得之該脂質體混合物與較 佳藉由一 0.2 // m之過濾器預先經消毒過濾的核酸分 子，其中連續流動速率為20-800 ml/min，較佳為 100-500 ml/min，脂質體-核酸電荷比率（+/-)為4-0.01， 較佳為2-0.1，最佳為1.5-0.5，且更佳為1.25-0.75。 29. 如請求項21或22之方法，其特徵在於該等脂複合體係在 無菌條件下製備。 30. —種由多種具有一介於250與600 nm之間的界定尺寸之 95081.doc 200524636 脂複合體組成之脂複合體混合物，該等脂複合體係由如 明求項1或2之脂質體與核酸分子的混合物組成，其特徵 在於該脂複合體混合物之多分散指數具有<〇5〇的值。 31. 一種可藉由如請求項2丨或22之方法獲得之脂複合體。 32. —種用於在一適宜之穩定劑存在下凍乾如請求31之脂複 合體之方法，其包含以下步驟： 〇)將該脂複合體混合物冷凍至^_5(rCt溫度； (b)在大約-20°C下將該脂複合體混合物乾燥至少35小時； (0在大約2(TC下將該脂複合體混合物後期乾燥至少1〇個 小時。 33. —種用於在一適宜之穩定劑存在下凍乾一脂複合體混合 物之方法，其包含以下步驟： (a) 以一大約src/min之降溫速率將該脂複合體混合物冷 凍至f50°C之溫度； (b) 在f 5CTC下將該脂複合體混合物培育至少2小時； (c) 以一大約S0.3t：/min之加熱速率將該脂複合體混合物 加熱至-20°C ; (d) 在大約-20°C下將該脂複合體混合物乾燥至少35小時； (e) 以一大約S0.44°C/min之加熱速率將該脂複合體混合物 自約-20°C加熱至約2(TC ; (f) 在約20°C下將該脂複合體混合物後期乾燥至少1〇小 時。 34. 如請求項32或33之方法’其特徵在於該乾燥係在一介於 0.025與0.05毫巴之間的壓力下進行。 95081.doc 200524636 35· —種可根據請求項32或33之方& <方法獲得之脂複合體凍乾 物。 3 6. —種如請求項3 1之脂複合體、如請求項3〇之脂複合體混 合物或如請求項3 5之脂複合體凍乾物作為或用於製備基 因治療中之一（多種）醫藥組合物的用途。 95081.doc