TW200424203A - Treatment of neurodegenerative diseases - Google Patents

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2004242 03 玖、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於一種使受測對象增加活化星細胞數目的方 法’包含辨識受測對象已罹患或存在發展成神經退化疾病的風 險’及挺供受測對象有效劑篁之Am腺芬酸受體刺激物。 【先前技術】 漢丁頓舞蹈症（Himtingt〇n，s disease)是一種體染色體顯性 (autosomal dominant)的神經退化疾病，其致病原因是

Huntingtin(Htt)基因第一表現子上出現多餘的cag三核：¾:酸序 列重複片段。Htt蛋白質表現廣泛存在於腦及其他組織中，然而， 只有某些特定的神經細胞（包含腦啡肽之紋狀神經元 (enkephalin-positive striatal neurons))容易因突變的 Hu 基因上多 餘的CAG重覆片段而受到損害。a^-R腺苷酸受體(A2a-R)具有 防止多種細胞凋亡（apoptosis)的能力，係大量存在於對Htt/聚楚氨 醯胺（poly(Q)n)敏感且含腦啡肽之紋狀神經元中。 【發明内容】 本發明係關於一種使用Aza腺苷酸受體刺激物來治療神經退 化疾病（例如··漢丁頓舞蹈症）的方法。 在一方面，本發明之特徵係為一種使受測對象增加活化星細 胞（astrocyte)(例如··表現神經膠質纖維酸性蛋白（giiai fibrillary acidic protein)之星細胞）數目的方法，係包含辨識受測對象已罹患 神經退化疾病或存在發展成神經退化疾病的風險，並提供受測對 象有效劑量之A〗a腺苷酸受體刺激物（ag〇nist)。A2a腺苷酸受體刺 激物是一種能增加Aza腺苷酸受體基因表現或提高A2a腺苷酸受 體蛋白質活性的化合物；A〗a腺菩酸受體刺激物係包含，例如： CGS21680，ATL_146e，ATL_193 及 5N-乙基甲醯胺腺苷酸 2004242 03 (5N-enthylcarboxamide-adenosine，NECA)，該刺激物能經由腹腔 注射或紋狀體（intrastriatal)注射而提供。 另一方面，本發明之特徵係為一種處理神經退化疾病之方 法；該方法包含辨識受測對象已罹患神經退化疾病或存在發展成 神經退化疾病的風險，並提供受測對象有效劑量之CGS21680。 本發明亦關於一種組裝產品，係包含一容器；一有效量之 CGS21680 ;及一附於容器之說明，該說明指出提供CGS21680於 治療已罹患神經退化疾病或存在發展成神經退化疾病風險的受 測對象。 本發明之特徵進一步包含一種辨識用於治療神經退化疾病 之Am腺苷酸受體刺激物的方法，其係包含：將表現a2A腺苷酸 受體之星細胞與Asa腺苷酸受體刺激物接觸；及決定星細胞的活 化狀態’其中星細胞在刺激物存在下的活化狀態顯示該刺激物係 為治療神經退化疾病之候選者。 本發明之一個或多個實施態樣係詳述如下，本發明之特色、 目的及優點皆描述於實施方式及申請專利範圍中。 【實施方式】 本發明係根據一項超出預期的發現，A2A_R選擇性刺激物 CGS21680(CGS)能有效改善漢丁頓舞蹈症小鼠模型（R6/2)的數種 漢丁頓舞蹈症主要病徵。如下列實施例所示，每日提供Cgs給7 週大的HD小鼠能抑制小鼠持續性之動作能力退化（pr〇gressive locomotor deterioration)，減少紋狀體内膽鹼（ch〇lin)濃度（由體内 質子局部磁振頻譜（W-MRS)量測）之增加情形，及減緩^小鼠的 大腦萎縮；並且，CGS治療能顯著增進活化星細胞之數目。二次 免疫染色分析顯示大部分活化星細胞包含'MR，此一結果指出 CGS能藉由刺激Am-R來活化星細胞。隨著前述活化星細胞數量 增加而發生的症狀改善現象指出：活化的星細胞能幫助改善漢丁 2004242 03 頓舞蹈症。 因此’本發明提供一種使用a2A腺苷酸受體刺激物來治療神 經退化疾病的方法，及一種辨識可治療神經退化疾病之化合物的 方法。

Am腺答酸受體刺激物係可自市面上購得，及根據下面描述 的方法或其他本技術領域中所習知的方法來鑑定。候選的化合物 (例如·蛋白質、胜肽、擬胜肽（peptid〇mimetics )，苦胺酸胺基 取代的陽離子募聚合物（peptoid)，抗體，小分子或其他藥物）係 可使用任何本技術領域中所習知的組合資料庫方法 (combinatodal library method)來獲得，這些資料庫包含：胜肽資 料庫、peptoid資料庫（官能化胜肽分子資料庫，但具有一新的能 抵抗酵素分解的非胜肽骨幹）、空間定位（spatially addressable)平 行固相或液相資料庫、藉由逆迴旋（deconvolution)或親和層析法 獲得的合成資料庫及”一顆粒一化合物（one-bead one-compound)’’ 資料庫，請參閱 Zuckermann et al.(1994)J· Med. Chem· 37:2678-2685;及 Lam(1997) Anticancer Drug Des· 12:145。 在本技術領域中有數種合成分子資料庫的方法，例如，於下 列文獻中所描述的方法：DeWitt etal. (1993) PNAS USA 90:6909; Erb et al. (1994) PNAS USA 91:11422; Zuckermann et al. (1994) J.

Med. Chem. 37:2678; Cho et al. (1993) Science 261:1303; Carrell et aL (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2059; Carell et al. (1994)

Angew· Chem· Int· Ed· Engl. 33:2061;及 Gallop et al· (1994) J· Med· Chem. 37:1233 o 化合物資料庫可能存在於溶液中（例如：Houghten (1992) Biotechniques 13:412-421)、或顆粒上（Lam (1991) Nature 354:82-84)，晶片（Fodor (1993) Nature 364:555-556)、細菌（11.3· Patent No. 5,223,409)、孢子（U.S. Patent No. 5,223,409)、質體（Cull 2004242 03 et al· (1992) PNAS USA 89:1865-1869)或噬菌體（Scott and Smith (1990) Science 249:386-390; Devlin (1990) Science 249:404-406;

Cwirla et al· (1990) PNAS USA 87:6378-6382; Felici (1991) J. Mol·

Biol· 222:301-310;及 U.S· Patent No· 5,223,409)。 為了辨識系統中（細胞系統或無細胞系統）能增加A2A腺苷 酸受體之基因表現或蛋白質活性的化合物，係將系統與一候選化 合物接觸後與不存在該候選化合物的系統比較其A2A腺苦酸受體 之基因表現或蛋白質活性。在一細胞系統中，細胞可為天生就能 表現Aw腺甘酸受體基因的細胞’或經修飾後能表現重組核酸的 細胞’例如：將Am腺昝酸受體基因啟動子（proin〇ter)與一標識基 因（maker gene)的細胞融合，或將a2a腺苷酸受體基因編碼區域 (coding region)與一異源性(heterologous)啟動子融合。 基因表現量能由mRNA表現量或蛋白質表現量決定，量測組 織樣本或體液中mRNA表現量的方法已為本技術領域人士所熟 悉。為了量測mRNA表現量，可將細胞溶解，細胞溶解物中的 mRNA表現量或自細胞溶解物純化或半純化rna中的mRNA表 現量可藉數種方法來決定，其係包含，但不限於，使用可偵測的 已標記特定基因之DNA或RNA探針之雜交測定法（hybridizati〇n assays)，以及使用合適的具有基因專一性之寡聚核苷酸引子之定 量或半定量反轉錄聚合酶連鎖反應（RT-PCR)方法；或亦可使用定 置或半疋里之原位雜交分析法（in situ hybridization assay)，例如： 組織切片或非溶解細胞懸浮液，及可偵測（如螢光或酵素）的已標 。己DNA或RNA探針；其他用於定量mRNA的方法包含RNA保 護分析法（RPA)及基因表達系列分析（SAGE)。 、量測組織樣本或體液中蛋白質表現量的方法也是本技術領 域所熟悉的技術。許多量測方法使用可與特定目標蛋白質結合的 抗體（例如：單株抗體或多株抗體），在這些方法中，抗體本身或 2004242 03 與抗體結合之二次抗體具有可偵測並標記目標物之能力；或者也 可將抗體與生物素（biotin)連結，並標示（labeled)以可偵測之卵白 素（avidin)(與生物素結合的一種多肽）以偵測結合生物素之抗體 (biotinylated antibody)的存在。結合前述本技術領域所熟知的技 術（包含夕層二明治檢測法”(niulti-layer sandwich assays))能提高 這些方法的靈敏度。部分量測蛋白質之分析法（例如：酵素連結免 疫吸收分析（ELISA)或西方墨點法）能應用於體液或細胞溶解物， 其他分析法（如，免疫組織法或螢光流式細胞儀）則可應用於組織 切片或非溶解之細胞懸浮液。量測標記量的方法係根據標記物的 性質選擇，並且這些方法也已為本技術領域所熟悉；適當的標記 包含，但不限於，放射性同位素（如125卜13：^、35S、$或32P)、 酵素（例如：驗性碟酸酵素（alkaline phosphatase)、山葵過氧化酵 素（horseradish peroxidase)、冷光素（luciferase)、或 β-半乳糖酵素 (β-galactosidase)、螢光物質（例如：螢光素（fiuorescein)、羅單明 (rhodamine)、藻紅素(phycoerythrin)、綠色螢光蛋白（GFP)或藍色 螢光蛋白（BFP))或發光物質（例如：（^(1〇1：1^奈米粒子，由Quantum Dot Corporation, Palo Alto, CA所提供）；其他可應用的檢測法包 含定量免疫沈澱法（immunoprecipitation)或補體結合試驗 (complement fixation assay) ° A2A腺苷酸受體活性可藉由使用3H-CGS21680之放射性配體 結合分析（radioligand binding assay)來量測，或藉由量測刺激受體 所引起的細胞cAMP訊號來獲知（Chern et al. (1993) Mol. Pharm. 44:950-958) 〇 當候選化合物存在時，若A2A腺苷酸受體、重組基因或蛋白 質之基因表現量或蛋白質活性大於候選化合物不存在的情況，則 該候選化合物即可被認定為一 A2A腺苷酸受體刺激物。 為了證明a2A腺苷酸受體刺激物對治療神經退化疾病具有功 2004242 03 效，將能表現A 2 A腺苷酸受體之星細胞（在組織培養或動物模型中） 與A2a腺奋酸受體刺激物接觸，並判定星細胞的活化狀態。星細 胞的活化狀態可依前述方法量測星細胞的神經膠纖維酸性蛋白 (glial fibrillary acidic protein，GFAP)表現量而判定，例如：使用 北方墨點或西方墨點分析；換言之，若GFAP表現被測得，即表 示星細胞在刺激物存在的情況下被活化，，此一結果顯示該刺激 物係為治療神經退化疾病的候選化合物。 被治療神經退化疾病的受測對象可藉由前述方法量測受測 對象樣本的A2A腺苷酸受體基因表現量或蛋白質活性而被驗證。 若受測對象樣本之A2A腺苷酸受體基因表現量或蛋白質活性低於 正常人的樣本，則該受測對象係為施予有效量之a2A腺苷酸受體 刺激物之候選受測者。 名詞”治療（treating)”係定義為提供一化合物予罹患神經退化 疾病之受測對象，其目的在治癒、減輕、緩和、醫治、預防，或 改善失調、失調症狀、續發失調疾病體質或後天失調。”有效劑量” 係指能產生預期醫療效果之化合物劑量，例如：前述施予一受測 對象之劑量。 治療方法係以活體内（in vivo)或活體外（ex vivo)的方式施 行，可單獨或與其他藥物或治療方式合併使用。 在活體内治療方法中，係提供一具療效之化合物（例如：能增 加A2A腺苷酸受體之基因表現或蛋白質活性）給予受測對象。一般 而言，該化合物懸浮於一醫藥可接受之載體（例如：生理食鹽水）， 並以口服方式提供，或用靜脈注入、注射，或皮下、肌肉、鞘内、 腹膜内、直腸内、陰道内、鼻内、胃内、氣管内、肺内植入。為 了治療神經退化疾病，該化合物可直接運送至紋狀體，例如··藉 由紋狀體（intrastriatal)注射提供該化合物。 需求劑量係根據選擇的施藥路徑，配方性質，病人疾病性 2004242 03 質，受測對象的大小、重量、表面積、年齡或性別，其他被提供 的藥物，及醫師的判斷來決定。適當的劑量係在O.Ol — lOOmg/kg。 由於化合物種類的不同及提供路徑的相異功效，需求劑量具有很 大的調整範圍，例如：口服方式需要比靜脈注射更高的劑量。用 藥劑量的變動可根據本技術領域中被瞭解的最佳標準經驗法則 來調整。利用適當的運送媒介（例如：高分子微粒或可植入裝置） 包覆藥物能增加運送效率，特別是以口服運送。 另外，一含有編碼Aza腺苷酸受體刺激物之核酸序列之募聚 核苷酸，係可視需要選擇性地藉由本技術領域中熟知的方法來施 予受測對象，例如：使用高分子、生物可降解微粒或微膠囊輸送 裝置。另一種達到攝取核酸的方法係使用標準程序製備的微脂粒 (liposome)。載體可單獨或與組織特異性（tissue_specific)抗體一起 載入運輸載具（delivery vehicle)。並且也可視需要選擇性地製備由 質體或其他藉由靜電力或共價鍵連結在聚_L-賴胺酸 (poly-L-lysine)之載體組成的分子共軛化合物，聚-L-賴胺酸與一 可與目標細胞上受體結合之配體（ligand)鍵結（Cristiano，et al. (1995) J· Mol. Med· 73:479)。再者，係可視需要選擇性地藉由本 技術領域所熟悉的組織特異性轉錄調節元件（transcrjpti〇；Qal regulatory elements ’ TRE)來標定特定組織。傳送，，裸露 DNA(naked DNA)”（換言之，不需運輸載具）到肌肉、皮内、皮下處係為另· 一種達到體内表現的方法。 在前述的聚核菩酸（Polynucleotide )中，編碼a2A腺苷酸受 體刺激物之核酸序列係與啟動子或增強子_啟動子組合相連結。增 強子（Enhancer)在時間、位置及程度上提供表現特異性，與啟動 子不同的是，增強子在距離轉錄起始處一段不等長度的位置時仍 然能起作用（在啟動子存在的情況下），增強子也能位於轉錄起始 位置之下游。 11 2004242 03 合適的表現載體包含質體和病毒載體，例如··泡疹病毒 (herpes viruses)、反轉錄病毒（retroviruses)、牛疫病毒（vaccinia viruses)、減毒牛痘疫苗（attenuated vaccinia viruses)、金絲雀痘病 毒（canary pox viruses)、腺病毒（adenoviruses)及腺病毒之相關病毒 (adeno-associated viruses) 0 如醫藥領域人士所熟知，病人所需之藥劑量係根據許多因素 決定，包含：病人體重、身體表面積、年齡、所施予藥物的特殊 性、性別、時間、給藥途徑、一般健康狀態以及是否有其他同時 施用之藥物。劑量可以改變，但施予聚核苷酸之較佳劑量係為 106-1012重複（copies)之聚核苷酸分子。如果需要，可重複施予該 劑量，給藥途徑可為前述之任何途徑。 以活體外方式治療受測對象之神經退化疾病可包含轉染 (transfecting)或轉導(transducing)可編碼A2a腺昝酸受體刺激物之 聚核苷酸至受測對象之細胞。另外，亦可設計載體，使其於活體 外轉染細胞，以便藉由同源重組（homologous recombination)的方 式，於細胞基因組中内源性A2A腺苷酸受體刺激物之轉錄起始位 置前插入一段新的、具活性的啟動子。此種可以”啟動（switch on)” 原本靜止的基因（silent gene)之方法已為本技術領域人士所熟 知。經挑選及放大該可表現所需量之A2A腺苷酸受體刺激物之細 胞後，將前述經轉染或轉導細胞送回受測對象體内。這些細胞可 為廣泛的種類，包含，但不限於，神經細胞（neural cells )'造血 細胞（hemopoietic cells )(例如：骨髓細胞（bone marrow cells )、 巨嗟細胞（macrophages )、單核白血球（monocytes )、樹突細胞 (dendritic cells )、T 細胞（T cells )或 B 細胞（B cells ))、纖維 細胞（fibroblasts )、上皮細胞（epithelial cells )、内皮細胞 (endothelial cells )、角質細胞（keratinocytes )或肌肉細胞（muscle cells )。前述經轉染或轉導細胞只要存活於受測對象體内即可作為 2004242 03 a2A腺苷酸受體刺激物之來源。 前述活體外方法之步驟係包含：從受測對象獲取細胞；培養 細胞；轉導表現載體於前述細胞；及維持細胞生長於可表現a2A 腺苷酸受體刺激物之適當環境。此方法係為分子生物技術領域人 士所熟知。轉導作用係可藉由任何活體外基因治療之標準方法實 施，包含：填酸約（calcium phosphate )、微脂粒感染（lipofection)、 電穿孔（electroporation)、病毒感染以及基因槍（biolistic)基因轉 殖，並可視需要選擇使用微脂粒（liposomes )或高分子微粒 (polymeric microparticles);細胞成功轉殖基因後，接著被篩選 出來以表現轉殖之基因，例如表現A2A腺苷酸受體刺激物；然後， 該成功轉殖基因之細胞以注入或植入方式送回到受測對象體内。 本發明之目的進一步包含一種套裝產品（packaged product)， 包含：一容器；一有效劑量之A2A腺苷酸受體刺激物；及一附於 容器之說明，該說明指出提供前述刺激物係用於治療已罹患神經 退化疾病或存在發展成神經退化疾病風險的受測對象。前述刺激 物可與醫藥可接受性之載體混合，係包含：一溶劑、一分散媒介 (dispersion medium )、一包覆外衣（coating )、一 抗細菌 (antibacterial )及抗霉菌（antifungal)試劑、及一等滲透壓之延 遲吸收試劑（absorption delaying agent )。 前述刺激物可使用傳統方法製成不同施藥途徑的藥劑配方 中，例如：可製成膠囊、密封凝膠(gel seal)或口服錠劑中；膠囊 可包含任何醫藥可接受之材料，例如：明膠（gelatin)或纖維素 (cellulose);錠劑可依照傳統的程序配製，係藉由壓縮一配體混 合物與一固態載體和一潤滑劑而製成，固態載體包含，例如：澱 粉（starch )和糖膨潤土（sugar bentonite);該化合物亦可以一含 有黏結劑（binder )(例如：乳糖（lactose )或甘露醇（mannitol))、 傳統常用的填充物及製鍵試劑（tableting agent)之硬殼旋劑或膠 13 2004242 03 囊形式施用。前述刺激物可經由非腸胃途徑服用，非腸胃藥劑形 式包括，例如：水溶液、等張性生理食鹽水、含5%葡萄糖之活 性試劑、或其他習知醫藥可接受之賦形劑（excipient)，環糊精 (cyclodextrins)或其他本技術領域所熟悉的助溶劑（s〇lubiHzing agent)可作為藥物賦形劑以運送治療藥劑。此外，前述刺激物可 更進一步經由大腦手術直接注入紋狀體。 刺激物的功效可經由活體内和活體外（in vitr〇)的方式評估， 例如：該刺激物可在活體外測試其增加腺苷酸受體基因表現 及蛋白負活性之月b力，在活體内研究中，可將該刺激物注射至一 動物體内（例如：一動物模型），並獲得其對神經退化疾病之功效。 根據前述結果，可決定適當的劑量範圍及藥物施用途徑。 下列實施例係僅用於說明本發明，非用於限制本說明書所揭 露之内容，任何熟習本技術領域的人士，皆可根據本說明書中揭 露之内容，進一步做任何可能的更動與潤飾以達到最大功效，所 有詳列於本說明書之著作係以全文引入作為參考資料。 材料舆方法 材料 CGS21680 係從 Research Biochemicals(Natick，MA，USA)獲 得。ZM241385 係購自 Tocris Cookson Inc.(Ellisville，MO, USA)。 動物及藥物施用 來自 Jackson Laboratories(Bar Harbor，Me，USA)的雄性 R6/2 小鼠與同窩出生之控制組小鼠，與雌性控制組小鼠（B6CBAFI/J) 交配，其後代利用PCR基因定性分析（PCRgenotyping)自鼠尾 組織萃取基因組DNA ( genomic DNA)，利用兩段位於轉移基因 ( transgene ) 上的弓| 子 (primer)(5，-ATGAAGGCCTTCGAGTCCCTCAAGTCCTTC-3， ， 2004242 03 5，-CTCACGGTCGGTGCAGCGGCTCCTCAGC-3，）來確保該段 CAG片段保持在約150個重複長度（Hogan et al. (1994)Ιικ Manipulating the mouse embryo: a laboratory manual, Ed 2. Cold Spring Harbor，NY，Cold Spring Harbor Laboratory) 〇 動物以每 12 小時白天/黑夜的循環模式養在生醫科學動物養殖中心（Institute of Biomedical Sciences Animal Care Facility)。動物實驗係遵循美 國國家衛生院綱領（National Institutes of Health Guidelines)在 Institutional Animal Care and Use Committee of IBMS, Academia Sinica.所認證的規範與步驟下進行。 腺苷酸環化醇素檢測（Adenylyl cyclase，AC assay) 腺苷酸環化酵素(Adenylyl cyclase，AC)活性係使用習知檢測 方法檢測（Chern et al. (1993) Mol. Pharmacol· 44:950-958)。簡述 如下，先以超音波震盪紋狀體組織，然後以50,000g離心前述震 盪後的均質產物（homogenate ) 30分鐘，並收集P1膜碎片。AC 活性檢測係在37°C下與400微升之反應混合物作用10分鐘，前 述反應混合物包含1毫莫耳濃度（mM)之三磷酸腺苷（ATP)， 1〇〇毫莫耳濃度氣化鈉（NaCl)，50毫莫耳濃度N-2-羥乙基對二 氮己環（Hepes)，0.2毫莫耳濃度EGTA，0.5毫莫耳濃度3-異丁基 -1-甲基黃嘌吟（3-isobutyl-l-methylxanthine)，6毫莫耳濃度氣化鎮 (MgC12)，1微莫耳濃度（"M)鳥嘌呤三磷酸(GTP)，及20微克（// g)之膜蛋白；加入0.6毫升（ml) 10%三氣乙酸（TCA)以終止反應； cAMP 藉由 Dowex 色層分析儀（Sigma，St. Louis，MO, USA)分離， 並使用習知方法檢測（Chern et al· (1993) Mol. Pharmacol. 44:950-958)。40微克之内的膜蛋白，其酵素活性在30分鐘之内 維持線性關係。 行動能力（Locomotor activity ) 在注射後24小時，如文獻所述量測行動能力10分鐘 15 2004242 03 (Lee et al. (1992) Chin· J. Physiol· 35:317-336)。簡言之，將動物 置於一具有16x16水平感測器之行動監視器中（Coulbourn Instrument，Allentown，PA，USA)，這些感測器係用於定位動物之 平面位置，行動能力係藉由每10毫秒（ms)於X-Y平面上記錄到 的光束打斷之全部次數來量測。 體内質子定位磁譜分析Oh-mrs) 利用水合氣酸（chloral hydrate)(4.〇88毫克/10克，腹腔注射） 麻醉動物，以一具有500 us内6.5G/cm主動遮蔽梯度（active shielding gradient )之動物體内顯像儀（Biospec 4.7T spectrometer) 量測。小鼠置於一具有頭部固定器之俯臥位置，一 20公分鳥籠 狀線圈用於提供RF射頻電波刺激訊號，一直徑2cm之表面線圈 直接置於頭部上方以接收訊號，欲使用1H-MRS量測的紋狀體上 方之欲測目標容積（volume of interest，VOI)係依據冠切擴散加權 影像（coronal diffusion-weighted image)來選擇，該冠切擴散加權 影像係使用脈衝梯度迴聲擴散方法（pulse gradient spin-echo diffusion method)，其重複時間（repetition time，TR)為 1500 毫秒， 迴聲時間（echo time，TE)為62毫秒，可見區3公分x 3公分， 切片厚度為1毫米，b值1300秒/平方毫米，平均數2，一 256 X 128矩陣零填滿至256 X 156。擴散敏感梯度在重調焦距脈衝波 (refocusing pulse)之前或之後應用於讀取X方向。使用連續三次化 學位移選擇性激勵（chemical shift selective saturation，CHESS)脈 衝來抑水，然後使用點解析波譜(PRESS)序列來定位3.5 x 3.5 x 3.5立方毫米（mm3)紋狀體波譜體積像素（voxel)，光譜寬（spectral width, sw) 4000 赫茲（Hz )，TR : 3.5 秒（s )，TE : 136 毫秒， 平均訊號256，及全掃瞄時間8分32秒。辨識NAA、膽鹼（Cho) 及肌酐（Cr)的波峰區面積，統計分析紋狀體代謝物與肌酐兩者關 係比率。 16 2004242 03 大腦組織製備 使用戊基巴比特魯納（sodium pentobarbital)(100微克/克） 深度麻醉動物，使溶於〇·1莫耳濃度之磷酸鹽緩衝液(ΡΒ，ρΗ7·4) 之4%多聚甲酸（paraformaidehyde )灌注心臟，小心取出大腦’ 以4%多聚甲醛/〇el莫耳濃度之pb後固定2-5小時，之後浸於 30%甘油（溶於〇β1莫耳濃度pb)中，使用冷凍組織切片機 (CM3050, Leica Microsystems Nussloch GmbH, Nussloch, Germany) 將組織切成20微米厚度。 免疫組織化學染色（Immunohistochemistry ) 單抗原免疫組織化學染色係使用卵白素-生物素-過氧化酶 (avidin-biiotin-peroxidase)之複合物方法，係敘述於 Lin et al· (1998) FEBS Lett· 436:92-98。簡述如下，於4°C下依序將自由懸 浮碎片培養在多株抗-GFAP抗血清（polyclonal anti-GFAP antiserum (稀釋倍數 l:l〇〇〇，購自 Sigma, St· Louis，MO, USA))中 36-48小時後，與生物素接合山羊抗兔子免疫球蛋白 (biotinconjugated goat anti-rabbit IgG (稀釋倍數 1:500，Vector Laboratories，Burlingame，CA，US A))培養兩小時，之後再與卵白 素-生物素-過氧化酶複合物培養2小時，在每次更換培養物質的 中間，以0.1莫耳濃度之PB沖洗三次。然後將碎片培養在含 0.02% 3，3-二氨基苯聯胺(DAB)和0.08%硫酸銨鎳的0·1莫耳濃 度之ΡΒ中。加入過氧化氫（Η202)至最後濃度為0.0024%以使 免疫染色顯影。接著，進行二次免疫螢光染色，在4°C下將碎片 培養在兔子多株抗A2A-R抗體（稀釋倍數1:1000)與老鼠單株GFAP 抗體（稀釋倍數 1:1000, Sigma，St· Louis, MO, USA)混合物中 36_48 小時，接著培養於二次抗體混合物2小時，該二次抗體混合物包 含稀釋倍數1:500之FITC連結之山羊抗兔子免疫球蛋白 (FITC-conjugated goat anti-rabbit IgG) (Cappel™ Research, 17 2004242 03

Durham，NC，USA)之0.1%正常山羊血清與稀釋倍數l:l〇〇〇 Alixa 568-連結之山羊抗老鼠免疫球蛋白（Alexa 568-conjugated goat antimouse IgG)(Molecular Probes Inc，Eugene，OR，USA)。碎片接 著以0.1莫耳濃度PBS沖洗數次，然後以含50%甘油之〇·ΐ莫耳 濃度 PB固定於玻片上，以雷射共軛焦顯微鏡（Bio-Rad， MRC-1000, Hercules，CA，USA)分析二次免疫染色樣本結果，除去 一抗會導致免疫螢光染色的喪失。 艘視學（stereology )與定量 從新紋狀體（neostriatum )頭端（rostral )至前聯合（anterior commissure)(耳間（interaural) 5.34mm/前囪（bregma) 1.54mm 至耳間3.7mm/前囪0.1mm)連續冠切組織切片以定義紋狀體萎縮 (atrophy)及側腦室（lateral ventricle)之擴大處。紋狀體及側 腦室的所有區域皆使用NIH Image 1.62 Nissl影像軟體來量測，並 且GFAP染色之切片係藉由計算顯微攝影定義區域内的相同種類 細胞來定量，該顯微攝影照片係透相位差（phase contrast )顯微 鏡拍攝。 結果 在先前的文獻中提及刺激A2A-R能保護PC12細胞免於凋亡 及挽救因抑制促分裂原活化蛋白激酶（MAPK)訊號傳遞路徑所造 成的 NGF 誘導神經生長障礙(Huang et al· (2001)J· Biol. Chem· 276:13838-13846，及 Cheng et al· (2002)J. Biol. Chem· 277:33930-33942)。紋狀體之γ-氨基丁酸神經細胞（GABAergic neurons)在HD病變過程中會嚴重退化，A2a_R即位於該神經細胞 上，因此刺激A2A-R使其在HD病變中產生神經保護作用是可能 的。紋狀體A2A-R之表現在HD病變過程中明顯降低，而此一現 象可能歸因於γ-氨基丁酸神經細胞之喪失（Ferre et al· (1993) J· 18 2004242 03

Neurosci. 13:5402-5406, Saudou et al. (1998) Cell 95:55 -66, and Glass et al. (2000) Neuroscience 97:505-519)，因此在 HD 基因轉 殖小鼠模型（R6/2)中，紋狀體A2A-R是否仍保持功能首先被研究。 R6/2小鼠具有啟動子及含144個CAG重複片斷之人類Htt基因 表現子l(exon 1)，並在9-11週表現出HD病徵(例如：運動神經 協調性退化）(Mangiarine et al· (1996) Cell 87:493 ·506)。在 R6/2 小鼠9週大時，發現紋狀體A2a-R蛋白質的量顯著減少了，這個 結果與先前的研究相符合（Luthi-Carter et al· (2002) Hum. Mol. Genet· 11:1927-1937)。令人意外的是，受A2A-R刺激物所活化的 AC活性在正常及R6/2小鼠身上非常相似，這個發現再次證實了 Varani 等人先前的觀察報告（((2001) FASEB J. 15:1245-1247): Varani發現A2a-R的訊號在過度表現具CAG重複片段之Htt基因 的紋狀體細胞中會異常放大，此外，連續兩週對R6/2小鼠每曰注 射CGS對A2A-R蛋白質表現量或其活性不會有顯著的影響。 選擇之A2A-R刺激物（CGS)對R6/2小鼠之治療效果檢測如 下，從R6/2小鼠7週大開始，持續五週每日腹腔注射CGS(5微 克/克）或載體溶劑，施予載體溶劑的R6/2小鼠為對照組。在施予 藥物2週後，腹腔注射CGS之R6/2小鼠的行動能力退化現象獲 得顯著改善，而對照組小鼠行動能力持續退化。CGS改善R6/2 小鼠行動能力的效果可因提供A2A-R選擇性對抗藥物 (antagonist)(ZM241385，7.5 微克/克，Palmer et al,(1995) Mol. Pharmacol. 8:970-974)而被阻礙，此一結果顯示CGS的效果係由 Am-R所調控，相對的’ R6/2小鼠在滾輪運動（rotarod performance)測試表現的運動協調能力並沒有受到CGS的影響。 為了監測神經化學的改變，注射CGS或用載體溶劑之R6/2 小鼠在9週大時使用 W-MRS分析，乙醯天門東酸 (N-acetylaspartate，NAA)做為神經標示，NAA濃度的減少反應出 19 2004242 03 軸索（axonal)官能退化及/或喪失。對照組r6/2小氣的NAA/肌 酐（creaine)比例遠低於正常小鼠，顯示R6/2小鼠有嚴重的神經損 害。R6/2小鼠之NAA/肌肝比率的減少不受長期提供cgs之影變 (分別為0.67 + 0.02與0·69 + 0.02, p = 0.691)。取而代之的，服 用CGS徹底改變R6/2小鼠升高的膽驗/肌酐比率（分別為1.74 + 0.12與1.44 + 0.08, p = 0.023)，R6/2小鼠的膽鹼/肌酐比率遠高 於野生型小鼠。此種含膽鹼化合物的增加現象記述於其他外傷藥 物中（Waters et al· (2002) Biochem· Pharmacol· 64:67-77)。膽驗含 量的改變可能影響到細胞膜含膽鹼磷酸脂的組成（例如：脫脂酸填 脂膽驗(lysophosphatidylcholine) ， 填 脂膽驗 (phosphatidylcholine))，並改變電生理活性，如文獻中在其他細胞 種類所觀察到的相同現象（Pu and Masland (1984) J Neurosci. 4:1559-1576，及 Shander et al· (1996) J. Mol· Cell· Cardiol· 28:743-753)。有趣的，多種電生理性質均發生改變，包含：去極 化靜止膜電位及R6/2小鼠動作電位的改變（Klapstein et al· (2001) J· Neurophysiol· 86:2667-2677)。長期提供 CGS 可能藉由減少 R6/2 小鼠較高的膽鹼含量使其含量跟野生型小鼠相似，而轉變已改變 的神經特性。 或者，較高膽鹼含量可能反映出細胞種類的改變。由於膽鹼 高度集中於神經膠細胞（Urenjak et al. (1993) J. Neurosci. 13:981 -989)，對照組R6/2小鼠大腦中膽鹼/肌酐比率的上升可能 是由於神經膠細胞的增加。此一假設特別引起學者的關注，因為 膠樣變性（gliosis )被發現存在人類HD病人的大腦中（Lange etal. (1976) J. Neurol· Sci· 28:401-425)。神經膠數目係使用 Nissl 染色 技術決定。與先前在HD病人大腦中的發現一致，R6/2小鼠皮質 (cortex)中全部神經膠數目與野生型小鼠相較增加了將近50%。 相對的，在野生型和R6/2小鼠的紋狀體中，神經膠數目沒有發現 20 2004242 03 在統汁上有意義的差異。無論如何，長期提供CGS不會影響R6/2 小鼠的神經膠數目。因此，R6/2小鼠紋狀體的膽鹼/肌酐比率上 升並不疋由神經膠數目改變而造成，其膽驗/肌酐比率可因長期提 供CGS而減少。神經膠細胞中占最大多數的星細胞數目也可藉由 使用抗星細胞標示之抗體（神經膠纖維酸性蛋白質，glialfibrill^y acidic protein，GFAP)將大腦切片染色而計算。當觀察到R6/2小鼠 行動肖b力明顯退北時，12週大的R6/2小鼠紋狀體内之GFAP陽 性細胞只略高於野生型小鼠，令人意外的是，慢性施予CGS能顯 著增加紋狀體及皮質内的活化星細胞數目，其增加數目達到8 倍。同時在R6/2小鼠身上施予A2a-R選擇性對抗藥物（ZM)及CGS 能減少由CGS所誘導增加的紋狀體内活化星細胞數目，使活化星 細胞數目（43 + 8/mm2, η = 4)低於對照組R6/2小鼠大腦之星細胞 數（68 + 13/mm2, η= 5)，此一現象表示A2a_r可能參與R6/2小鼠 星細胞的活化。二次免疫化學分析顯示多數提供Cgs的HD小鼠 之星細胞包含内生的A^-R，因此，長期提供CGS能活化星細胞 很有可能是由於直接刺激a2a-r所引起。 因為添加ZM會降低提供CGS之R6/2小鼠行動能力的改善 效果及活化星細胞增加數目’星細胞也許能在HD小鼠身上發揮 保護效用’如之前數個疾病模型所報導的結果（vilaetal (2〇〇1)

Cum Opin· Neurol· 14:483-489)。營養因子，包含由星細胞所釋放 的因子（例如：神經膠質細胞神經營養因子，纖毛神經營養因子）， 在HD動物模型中具有保護神經的能力（Rudge et al. (1992) Eur· J·

Neurosci· 4:459-471，Alberch et al· (2002) Brain Res. Bull· 57:817-822，及 Mittoux et al. (2002) J. Neurosci. 22:4478-4486)。長期提供CGS的改善效用可能是藉由調控星細胞 竹生營養支持物（astrocyte-based trophic support)所產生。或者， 神經膠細胞可能藉由清除毒性化合物來保護神經，例如：神經膠 21 2004242 03 細胞可藉由麩氨酸(glutamate)運輸體有效清除麩氨酸，麩氨酸是 造成激活毒性（excitotoxicity)的主要原因。提升cAMP含量能在初 代星細胞培養時向上調控（up-regulate)麩氨酸運輸體的表現 (Gochenauer and Robinson (2001) J· Neurochem· 78:276-286)。在 R6/2小鼠的大腦中，麩氨酸運輸體的表現及活性皆降低了，顯示 麵氨酸運作已被擾亂（Lievens et al. (2001) Neurobiol. Dis. 8:807-821，and Behrens et al· (2002) Brain 125:1908-1922)。因為 A2A-R的活化能提高cAMP量，慢性提供CGS可能增加麩氨酸運 輸體的表現（Gochenauer and Robinson (2001) J. Neurochem. 78:276-286)並於其後藉由幫助移除突觸楚氨酸而減緩神經退化 之惡化。 漢丁頓舞蹈症的另一主特徵是紋狀體萎縮。在3至13週的 R6/2小鼠中，能觀察到顯著的紋狀體萎縮（Ferrante et al. (2000) J. Neurosci· 2〇:4389_4397)。長期提供CGS能減輕12週小鼠腦室變 大的症狀（對照組及提供CGS之R6/2小鼠分別為1.63 + 0.14及 091 + 0.14 平方宅米，p < 〇.〇〇1，n= 5)。 刺激A^-R在許多不同種類的細胞中能保護細胞免於死亡。 在本發明的研究中，長期提供CGS能對數種HD重要症狀（例如： 行動能力退化，含膽鹼化合物之增加，及腦室變大）提供保護效 用。Popoli 及其研究夥伴（(2002) J. Neurosci. 22:1967-1975)的報告 指出，低劑量的A^-R對抗藥物（SCH58261)會減輕HD激毒活性 大鼠模型中喹啉酸(QA)引起的激活毒性。藉由未知的機制，妨礙 A2a-R能調控一般大鼠紋狀體中的麵氨酸流出（c〇rsi et al. (2000)Neuroreport 11:2591 -2595)，此一結果可能歸因於 SCH58261 在QA損害動物身上的良好影響。然而，我們仍必須指出，即使 漢丁頓舞蹈症QA損害激毒活性模型與漢丁頓舞蹈症病人有許多 相似的神經病理特徵，表現具有重複CAG片段之Htt突變基因能 2004242 03 獲得野生型動物所欠缺的新功能及特徵已經被確立（功能獲得 (gain of function )， Rubinsztein (2002) Trends Genet. 18:202-209)，例如：表現Htt突變基因的R6/2小鼠會抵抗（或較 不敏感）由QA、海人草酸(kainic acid)或3-氮丙酸3-nitropropionic acid，3NP)所造成的毒性（Hansson et al· (1999) Proc· Natl· Acad. Sci. USA 96:8727-8732, Hickey and Morton (2000) J· Neurochem· 75:2163-2171, Morton and Leavens (2000) Brain Res. Bull. 52:51-59)。並且，在過度表現突變Htt的細胞中，G蛋白偶合受 體（例如：A2A-R)之電生理性質及訊號轉導的重大改變已報導於文 獻中（Klapstein et al· (2001) J. Neurophysiol· 86:266 7-2677，及 Varani et al· (2001) FASEB J· 15:1245-1247)。損害特殊神經群組 或表現具CAG重複片段之Htt突變基因之HD模型的藥物反應相 當不同。在本發明的研究中，長期提供CGS至基因轉殖小鼠模型 (R6/2)上能藉由A2A-R路徑幫助改善漢丁頓舞蹈症；相對的，長 期腹腔注射CGS在野生型小鼠上不會引起可偵測之膽鹼/肌酐表 現程度之改變，野生型小鼠之活化星細胞數目也同樣不會受到長 期提供CGS的影響。很明顯的，在R6/2和野生型動物身上施予 Aza-R刺激引起不同的生理反應。因此，a2A-R刺激物和對抗藥 物在不同方法建立的動物模型上可能存在不同的功效。 在本發明的研究中也注意到某些HD病徵(例如：滚輪運動表 現降低，NAA濃度下降）以現行的CGS施藥途徑無法改善。CGS 無法影響這些病徵可能歸因於這些病徵在HD病程早期就已確 立，R6/2小鼠的滾輪運動表現已被證明在4至6週時顯著下降， 已降低的運動協調能力會維持在一穩定程度直到小鼠11週大時 (Ferrante et al· (2000) J. Neurosci· 20:4389-4397)。同樣地，在小 鼠4週時觀察到紋狀體NAA量的顯著減少（Jenkinsetal· (2000) J.

Neurochem. 74:2108-2119)。在本發明的研究中，在R6/2小鼠7 2004242 03 ，大時長狀供CGS，CGS錢輪運録現㈣低NAA濃度上 2發生效用可能是由於在提供⑽之前已發生不可逆的神經 貝。。因此，在更早的週數(例如· 4週)提供CGS或許能進一步 ^本發明中所觀察到的CGS保護作用，並很可能提供_種有用 、属丁頓舞蹈症治療方法。 其他實施態樣 在本說明書中所揭露的所有特徵都可能與其他方法結合，本 "、明書中所揭露的每—個特徵都可能選擇性的以相同、相等或相 、的特徵所取代，因此，除了特別顯著的特徵之外，所有的本 說明書所揭露的特徵僅是相等的基因序列或相似特徵中的一個 例子。 根據本說明書所揭露的内容，任何熟習本技術領域之人士皆 可基與本發明之特色，在不脫離本發明精神與目的下，對本發明 做不同的更動與修飾，使其適用於不同的情況與對象，因此，其 他實施態樣也包含在本發明之申請專利範圍内。

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Claims (1)

1. 2004242 03 拾、申請專利範圍： 1· 一種增加受測對象之活化星細胞數目的方法，包含： 辨識受測對象已罹患神經退化疾病或存在發展成神經退 疾病之風險；及 匕 提供一有效劑量之Am-腺苷酸受體刺激物給受測對象。 2·如申請專利範圍第1項所述之方法，其中前述神經退化疾病係 丁頓舞蹈症。 ’' 、、 3·如申請專利範圍第2項所述之方法，其中前述Aza-腺苷酸受體 激物係為CGS21680。 | 1 4·如申請專利範圍第3項所述之方法，其中前述八2^腺苷酸受體 激物係經由腹腔注射提供給受測對象。 1 5.如申請專利範圍第3項所述之方法，其中前述、腺答酸受 激物係經由紋狀體注射提供給受測對象。 6.如申請專利_第i賴狀方法，其帽述A2a料酸 激物係為CGS21680。 ⑼ 7. 如申請專利範圍第6項所述之方法，其中前述A2a-腺答酸受體 激物係經由腹腔注射提供給受測對象。 、 8. 如申請專利範圍第6項所述之方法，其中前述&腺菩酸受㈣ 激物係經由紋狀體注射提供給受測對象。 ’ 9. 一種處理神經退化疾病的方法，包含： 辨識受測對象已罹患神料或存在舰成神 化疾病之風險；及 提供一有效劑量之CGS2168〇給受測對象。 10.如申請專利範㈣9項所述之方法，其中前述CGS21_係經 由腹腔注射提供給受測對象。 11·如申，月專利範圍第9項所述之方法，其中前述CGS2168〇係經 由紋狀體注射提供給受測對象。 2004242 03 12·如申睛專利範圍第9項所械夕古 漢丁頓舞蹈症。 、斤达之方法，其中前述神經退化疾病係為 由腹W月1利範圍第12項所述之方法’其中前述cgs2i_係經 由腹腔庄射k供給受測對象。 妳λ奸1二專利範圍第12項所述之方法，其中前述cgs2i68〇係 、，里由、、文狀體注射提供給受測對象。 15· —組裝之產品，包含·· 一容器； 一有效劑量之CGS21680 ;及 16.如^專利範圍第15項所述之組裝之產品，其 CGS2刪係經由腹腔注射提供給受測對象。Μ视出 申月專矛JI已圍第15項所述之 係經由紋狀體注射提供給受測對象。 兄彻 疾病係=3=第15項所述之組裝之產品，其巾前述神經退化 仪如申請專利範圍第18項所述之組裝之產品 CGS2麵係經由腹心射提供給受測對象。中此隱出 20.如申請專利範圍第18項所述之組裝之產品 CGS2酬係經由紋狀體注射提供給受_ I中此娜出 方法，包用於/〇療神經退化疾病《^腺答酸受體刺激物的 物；及使表現A2a腺誓酸受體之星細胞接觸Α2Α腺誓酸受體刺激 決定星細胞的活化狀態，其中星細胞 化狀態顯補舰物係為治療神經退化錢之候選Γ的 2004242 03 22.如申請範圍第21項所述之辨識用於治療神經退化疾病之A2A 腺苷酸受體刺激物的方法，其中前述神經退化疾病係為漢丁頓舞 蹈症。

   27 2004242 03 柒、指定代表圖： (一) 本案指定代表圖為：第（）圖。 (二) 本代表圖之元件代表符號簡單說明: 無

   捌、本案若有化學式時，請揭示最能顯示發明特徵的化學式： 無

   4 2004242 03

   發明專利說明書 (本說明書格式、順序及粗體字，請勿任意更動，※記號部分請勿填寫） ※申請案號： ※申請日期： ※丨PC分類： 壹、 發明名稱：（中文/英文） 神經退化疾病之治療/Treatment of neurodegenerative diseases 貳、 申請人··（共1人） 姓名或名稱：（中文/英文）（簽章） 中央研究院/Academia Sinica 代表人：（中文/英文）（簽章）李遠哲 住居所或營業所地址：（中文/英文） 台北市研究院路二段 128 號/ No.128, Sec. 2, Academia Rd.，Taipei City, Taiwan (R.O.C·) 國籍：（中文/英文）中華民國/R.O.C. 電話/傳真/手機·· e-mail ： 參、 發明人：（共2人） 姓名··（中文/英文） 1·陳儀莊/CHERN，YIJUANG 2·李宜釗/LEE，YICHAO 住居所地址··（中文/英文） 1·台北市南港區研究院路二段61巷4弄17號1樓/17-1F，Alley 4, Lane 61，Section 2, Academy Rd，Nankang，Taipei，11529, Taiwan 2·台北市内湖區洲子街 196 號 8 樓/8F，No. 196, Zhou Z St.，Neihu，Taipei, Taiwan 114, R.O.C. 國籍：（中文/英文） 1· 2皆中華民國/R.O.C. 2004242 03 伍、中文發明摘要： 本發明係關於一種使受測對象增加活化星細胞數目的方法， 包含辨識受測對象已罹患神經退化疾病或存在發展成神經退化 疾病的風險’及提供受測對象有效劑量之aza腺答酸受體刺激 物。本發明並揭露一種治療神經退化疾病之方法、一種用於治療 已罹患神經退化疾病或存在發展成神經退化疾病風險的受測對 象的組裝產品，及一種辨識用於治療神經退化疾病之A2A腺苷酸 受體刺激物的方法。 陸、英文發明摘要： A method of increasing the number of activated astrocytes in a subject. The method involves identifying a subject suffering from or being at risk for developing a neurodegenerative disease and administering to the subject an effective amount of an agonist of the A2A-adenosine receptor. Also disclosed are a method of treating a neurodegenerative disease, a packaged product for treating a subject suffering from or being at risk for developing a neurodegenerative disease，and a method of identifying an agonist of the A2A-^denosine receptor for treating a neurodegenerative disease.