TW200303758A - Somatostatin analog and uses thereof - Google Patents

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200303758 ⑴ 玖、發明說明 (發明說明應敘明：發明所屬之技術 一 、，先則技術内谷、貫施方式及圖式簡單說明） 發明背景 生長抑制素（SRIF)是一 疋 種由Brazeau等人發現的 tetradecapeptide ,對於腦垂 眭嗌β田 玉租、胰械及胃腸道等組織的分泌 過程具有強大的抑制作田, , 也可做為中樞神經系統的神經 調節物質。SRIF這4b抑制从从丄仏 、

—仰制性的生物效應是透過一系列的G 蛋白聯結受體所引發’目前已界定出五種亞型斷丨至 SSTRo)。這五種亞型對内生的瓣配體都有類似的親和性 ，但在不同組織中則有不π认八& ，不冋的刀佈。SRIF與這五種不同受 體（SSTR)亞型的親和性都相同常強。 SRIF具有不同的效果，包括調節荷爾蒙的釋放，如生長 激素、升糖素、胰島素、澱粉不溶素和神經傳導素等。其 中一些效果與它和特定队汀受體的結合有關。例如對生長 激素的抑制疋出於生長抑制素第二型受體（下稱「sstr_2 」（Raynor，et al·，Molecular Pharmacol. 43:838(1993); Lloyd，et al” Am· J· Physiol. 268:G102 (1995)) ’對胰島素的抑制則是出於生長抑 制素第五型受體（下稱「SSTR-5」）（Coy，et al· 197:366-371 (1993)) 。第二型與第五型的活化與抑制表生激素有開，特別是分 泌GH的腺瘤（肢端肥大症）和分泌tsH的腺瘤。若第二型活 化而非第五型’則可治療泌乳激素的分泌腺瘤。 如專業人員早已熟知，SRIF和類似物可以用來治療多種 不同疾病及（或）症狀，其中一些可治療的疾病（或）症狀列 舉如下：庫欣式症候群（參見Clark, R.V. et al，Clin Res. ρ·943Α，1 990);促生殖腺素腫（參見 Ambrosi Β·, et al.，Acta 200303758 (2) 發明說明續頁

Endocr. (Copenh.) 122? 569-576, 1990)；副甲狀腺機能亢進（參 見 Miller，D·，et al·，Canad· Med. Ass· J·，Vol· 145, ρρ· 227-228, 1991); 畸型性骨炎（參見 Palmieri，G.M.A·，et al·，J. of Bone and Mineral Research，7，（Suppl. 1)，p. S240 (Abs. 591)，1992) ; VIPoma(參見 Koberstein, B., et al., Gastroenterology, 2B.? 295-301，1990及Christensen, C. ，Acta Chir. Scand. 111，541-543, 1989);胰島母細胞瘤和高胰島 素症（參見 Laron, Z·，Israel J· Med· Sci·，26., No· 1，1-2，1990，Wilson， D. C·，Irish J· MecL Sci.，m，No· 1，31-32，1989及Micic，D.，et al·， Digestion，M，Suppl· 1.70. Abs. 193，1990);胃激素瘤（參見Bauer，F.E·， et al., Europ. J. Pharmacol., 183· 55 1990) ; Zollinger-Ellison症候群（參 見Mozell，E·，et al·，Surg. Gynec. Obstet·，170· 476-484，1990);與愛滋 病及他症狀有關的過度分泌性腹瀉（由愛滋病引起請見Cello, J.P.，et al.， Gastroenterology，98，No· 5，Part 2，Suppl·，A 163 1990 ;由異位性分泌 請見Alhindawi，R.，et al·，Can· J· Surg·，11，139-142，1990 ;腸移植與宿 主疾病請見Bianco J·A.，et al·，Transplantation，49，1194-1195，1990 ;與 化療有關的腹厲請見Petrelli，N·，et al.，Proc. Amer. Soc. Clin. Oncol.， Vol· 10, P 138, Abstr· No· 417 1991);大腸急躁症候群（參見O’Donnell， L.J.D·，et al·，Aliment· Pharmacol· Therap.，Vol· 4·，177-181, 1990);胰 臟炎（參見Tulassay，Z·，et al·，Gastroenterology, 98, No. 5, Part 2, Suppl·， A238，1990);克隆氏病（#lFedorak，R.N.，etal.，Can.J· Gastroenterology, i，No· 2, 53-57, 1989);全身性硬化症（參見Soudah，H·， et al., Gastroenterology, No. 5, Part 2, Suppl., A129, 1990)；甲狀腺 癌（參見Modigliani, E.，et al·，Ann，Endocr· (Paris)，說 483-488, 1989); 牛皮癬（參見Camisa，C·，et al·，Cleveland Clinic J· Med·，12, No. 1，71- 200303758 (3) 發明説殮續頁 76，1990);低金壓（參見Hoeldtke，R.D·，et al·，Arch· Phys. Med· Rehabil·， 处，895-898，1988及Kooner，J.S·，et al·，Brit· J. Clin· Pharmacol·, 28, 735P-736P，1989);恐慌症（參見 Abelson，Ji.，etal.，Clin· Psychopharmacol·，Id，128-132，1990);硬皮病（參見 Soudah，H·，et al·， Clin· Res·，Vol· 39, p. 303A，1991);小腸阻塞（參見Nott，D.M·，et al.，Brit J. Surg·，Vol. 77, ρ· A691，1990);食道胃酸逆流異常（參見Branch，M.S·， et al·，Gastroenterology, Vol. 100, No. 5, Part 2 Suppl·，p. A425，1991); 十二指腸胃逆流（參見Hasler, W·，et al.，Gastroenterology，Vol. 100，No. 5, Part 2 Suppl·，p. A448，1991);葛瑞夫氏症（參見Chang, T.C·，et al·， Brit· Med. J·，304, p. 158，1992);多囊性卵巢疾病（參見Prelevic，G.M.， et al·，Metabolism Clinical and Experimental，41，Suppl. 2，pp 76-79, 1992);上消化道出血（參見Jenkins, S.A.，et al.，Gut.，33, pp. 404-407, 1992及 Arrigoni，A.，et al·，American Journal of Gastroenterology，87, p. 1311，（abs. 275)，1992);胰臟假囊腫及腹水（參見Hartley，J.E.，et al·, J· Roy· Soc· Med·，85，pp. 107-108，1992);血癌（參見 Santini，et al·，78, (Suppl· 1)，ρ· 429A (Abs· 1708)，1991);腦膜瘤

Clin· Endocr· Metab·，74，ρρ· 543-547，1992);及癌症惡病質（參見 Bartlett，D.L.，et al·，Surg. Forum·，42, ρρ· 14-16, 1991) 〇 肢端肥大患者對於目前臨床的SRIF激動劑（octreotide和 lanreotide)產生的各種敏感反應早已受S1!重視。（Ann Intern Med. 117:711-718 (1992) ； 3J Clin Endocrinol Metab 71:391-397 (1990)) 。患者對於長效型的octreotide或lanreotide的反應有改善 (Flogstad AK, et al. 1997, J Clin Endocrinol Metab. 82:23-28; Caron P, et al·，1997, J Clin Endocrinol Metab. 82:18-22)。在這些報告中，70- 200303758 (4) 奋明嵚齒硪頁 80%肢端肥大症患者的病情可以由這些長效型的SRIF激動 劑控制。但這些數據其實有偏見，因為所挑選的病人從先 前投予octreotide的統計控制已知會有反應。如果排除這些 事先挑選，最近的研究顯示，約有50-60%接受慢釋型 lanreotide的患者會達到2.5 pg/L以下的GH平均值（al-Maskari M, et al.，1996，Clin Endocrinol (Oxf)。45:415-421)。因此，大約 有40-50%的肢端肥大症患者在目前的s激動劑治療中 僅獲得部分或不佳的控制。 在十七個急性投予octreotide或SRIF的後肢端肥大症病 例中，有三例無法抑制GH或僅有少量的抑制效果’原 因是 S 受體量的流失（Ikuyama S，et al，1985 J Clin Endocrinol Metab. 61:666-67; Reubi JC, Landolt AM, 1989, J Clin Endocrinol Metab. 68:844-850)。但這些SRIF受體的流失並不常見，也無法充 分解釋octreotibe和lanreotide在活體内產生部分的壓抑GH效 果。在隨後針對3 7例分泌GH腫瘤的研究中’ S受體的密度 與octreotide在活體抑制GH的效果並沒有多少關聯（Bertherat J· et al. 1993, J Clin Endocrinol Metab 77:1577-1583)。對於octreotide或 lanreotide為何在某些肢端肥大症患者具有抑制GH的部分 效果，另一項解釋假說是來自5 SSTR亞型的界定（Patel YC， SrikantCB, 1994, Endocrinology. 135:2814-2817)。在來源各異的人 體腫瘤中，前人曾描述SSTR亞·型表達的特定模式（Eden PA, Taylor JE. 1993, Life Sci. 53:85-90; Schaer JC，et al·，1997, Int J Cancer， 70:530-537)。在分泌GH的腺瘤中，已經界定出SSTR2和SSTR5 mRNA—貫性的表達模式（Greenman Y，Melmed S· 1994，J Clin 200303758 (5) 發明說明續頁

Endocrinol Metab. 78:398-403; Greenman Y, Melmed S. 1994. J Clin

Endocrinol Metab. 79:724-729; Miller GM, et al.? 1995, J Clin

Endocrinol Metab. 4:1386-1392; Murabe H， et al. 1996， J Neuroendocrinol. 8:605-610; Nielsen S. et al. 1998, J Clin Endocrinol

Metab. 83:2997-3000; Panetta R, Patel YC. 1995, Life Sci, 56:333-342; Reubi JC，et al·，1994, Cancer Res· 54:3455-3459)。先前的研究已顯 示利用視SSTR2的激動劑可以抑制GH的分泌。然而，在十 五例分泌GH的腫瘤中，親SSTR5的激動劑也能顯著抑制七 例的 GH 分泌（Jaquet P，et al· 2000，J Clin Endocrinol Metab. 85:781-792)，在七例分泌GH的腫瘤中有六例獲得顯著抑制（Shimon 1, et al., 1997, J Clin Invest. 100:2386-2392; Shimon 1, et al. 1997, J Clin Invest. 4:789-798) o 這些數據意味SSTR5亞型能抑制某些腫瘤中的GH分泌 。我們的研究使用分子式（I)的雙特異親SSTR2和SSTR5化合 物，證實了這種假說。確實，當腫瘤只對親SSTR2的類似 物有反應時’這種化合物並無法像octreotide—樣產生抑制 GH釋放的額外效用。然而，如果腫瘤對SSTR2和SSTR5激動 劑有同樣反應，分子式（I)化合物對於壓抑GH和PRL分泌的 效果就遠勝於octreotide。比較分子式（I)化合物和SRIF-14對 於抑制GH分泌的劑量反應，顯示這種化合物更能透過 SSTR2和SSTR5亞型的活化模仿夭然SRIF的效果。

我們的數據顯示，分泌GH的腺瘤中有兩種腫瘤。第一 類對於視SRIF-14和SSTR2的激動劑具有高度敏感性。這些腫 瘤具有SSTR2 mRNA的最南表達，octreotide也能發揮抑制GH

•10- 200303758 (6) 發明讀：明續頁 的最南效果。在第二類腫瘤中，SSTR2 mRNA的含量很低，

octreotide只能部份抑制gh的分泌。但是SRIF-14仍能抑制GH 的分泌’最高壓抑效果與第一類腫瘤很類似，但是濃度必 須為十倍。SSTR5 mRNA的高含量與化合物B對GH釋放的強 力抑制效果有關，遠比SSTR2類似物更有效。在這些腫瘤 中’分子式（I)的雙特異SSTR2和SSTR5化合物對GH分泌的壓 抑效果與天然的SRIF完全相同。因此在SSTR5/SSTR2比率高 而缺乏SSTR2亞型的腫瘤中，也許能透過SSTR5亞型來抑制 G Η的釋放。 與SRIF又體亞型活化有關的其他適應症，還包括抑制胰 島素及（或）升糖素，特別是糖尿病、血管病變、視網膜病 ㉖、增殖性視網膜病變、黎明現象和腎病；抑制胃酸分泌 (特別是消化性潰瘍），腸及皮膚與胰管及皮膚瘻管，傾倒 症候群’水瀉症候群，急性或慢性胰臟炎，以及胃腸荷爾 冢腫瘤，治療肝癌等癌症；抑制血管新生，治療炎性失調 (如關節炎）；慢性異體臟器排斥；血管修復；預防移植血 管和胃腸出血。 此外’以下的參考文獻也說明以某些生長抑制素類似物 對治上逃的適應症候；美國專利號碼4,853,371-抑制生長激 素、騰島素、升糖素和胰外分泌的分泌；美國專利號碼 ^147,836-動脈再狹窄；美國專利號碼5,411，943-肝細胞瘤； 美國專利號碼5,073,541-肺瘤；美國專利號碼5,5〇4,〇69_抑制 貫體腫瘤的加速增生；美國專利號碼5,688,418-延長胰臟細 胞的存活率：美國專利申請號碼08/089,410 (1993年7月9曰申 (7) (7)200303758

明）黑色素瘤，美國專利申請號碼〇8/854,94ι (1術年$月u 曰申咕）-體重減輕，美國專利申請號碼〇8/854,943…叨年$ 月13日申請胰島素抗阻和X症候群；美國專利申請號碼 〇S/855,3ll (I"7年5们3日申請）·高脂血症；美國專利申請號 碼〇8/44〇,〇61 (1995年5月12日申請卜泌乳素過高症；美國專^ 申請號碼08/852,221 (1997年5月7曰申請卜高乳促素血症和 ;必乳激素腺瘤，國際專利申請號碼pCT/US97/14154-纖維化。 最好使用能選擇特定SRIF受體亞型的類似物，或是亞型 能產生預定的生物反應，以減少與其他受體亞型互相作用 而導致不樂見的副作用。此外，由於天然SRIF的半衰期很 短，因此已開發出各種不同的SRIF類似物來治療肢端肥大 症（Raynor，et al·，Molecular Pharmacol. 43:838 (1993))。 發明摘要 本發明的一個層面是基於以下分子式（I)的縮氨酸：

D-Phe-c (Cys-Tyr(I)-D-Trp-Lys-Val-Cys)-Thr-NH2 J (I) 或是藥學上可接受之鹽。 分子式（I)化合物的使用效能與S相同。因此本發明的另 一層面是結合一個或多個人類生長抑制素亞型-1 ’ - 2，- 3 及-5之方法，對需要者投予分子式（1)化合物或藥學上可 接受之鹽。在理想情況下’該_分子式（I)化合物會選擇性 地與生長抑制素亞型受體—2和-5結合。 前述方法的較佳實例是引發生長抑制素激動劑的效果 ，對需要的患者投予分子式（1)化合物或藥學上可接受之 -12- 200303758

(8) 發明讀與續頁: V、X、V· / "VDw « 、、Cs ' Ί1 前述方法的更佳實例是針對需要的人體或其他動物，投 予分子式（I)化合物或藥學上可接受之鹽以治療某疾病或 症狀，而該疾病或症狀包括庫欣式症候群、膜臟假囊腫及 腹水、促生殖腺素腫、副甲狀腺機能亢進、畸型性骨炎、 VIPoma、胰島母細胞瘤、高胰島素症、胃激素瘤、 Zollinger-Ellison症候群、與愛滋病及其他症狀有關的過 度分泌性腹瀉、大腸急躁症候群、胰臟炎、克隆氏病、全 身性硬化症、曱狀腺癌、牛皮癬、低血壓、恐慌症、硬皮 病、食道胃酸逆流異常、小腸阻塞、十二指腸胃逆流、胃 食道逆流、葛瑞夫氏症、多囊性卵巢疾病、上消化道出血 、胰臟假囊腫、胰臟腹水、血癌、腦膜瘤、癌症惡病質、 肢端肥大症、動脈再狹窄、肝癌、肺癌、黑色素瘤、抑制 實體腫瘤快速增生、體重減輕、治療胰島素阻抗性、X症 候群、延長胰臟細胞存活率、纖維化、高脂血症、泌乳素 過高症和泌乳激素腺瘤、糖尿病神經性病變、黃斑部退化 、惡性病之高鈣血症、飯後肝門脈高壓，以及肝門脈高壓 的併發症。 前述方法的更佳實例是針對需要的人體或其他動物，投 予分子式（I)化合物或藥學上可接受之鹽以治療某疾病或 症狀，而該疾病或症狀是肢端肥大症。 前述方法的更佳實例是針對需要的人體或其他動物，投 予分子式（I)化合物或藥學上可接受之鹽以治療某疾病或 症狀，而該疾病或症狀是甲狀腺毒性眼球突出、無作用的

• 13 - 200303758 (9)

腦垂體腺瘤、血管新生、炎症和炎性疾病、類癌症候群、 類癌腫瘤、視網膜病變和黃斑部退化。 生長抑制素受體亞型的命名係根據IUPHAR之建議， SSTR-4代表最初由Bruno等人無性複製的受體，SSTR-5則代 表O’Carroll等人無性繁殖的受體。

除了以N結尾的氨基酸之外，本揭露書其他氨基酸的縮 寫式（例如分子式（I)中的D-Phe)均代表-NH-CH(R)-CO-的結構 ，而R在上述分子式是氨基酸的旁鏈（例如Ala的CH3)。對於 以N結尾的氨基酸，縮寫式代表（RiR^-N-CI^RhCO-的結構， 其中R代表氨基酸的旁鏈，而R1和R2則依此處定義。 一般氨基酸的縮寫式係根據IUPAC-IUB之建議。以下是 文中可能出現之氨基酸的縮寫式：

Cys= cysteine (副胱氨酸）

Lys= lysine;(離氨基酸）

Phe= phenylalanine;(苯氨基丙酸）

Thr= threonine (滋利氨基酸）

Trp= tryptophan;(胰化氨基酸）

Tyr= tyrosine (穌氣基酸）

Tyr(I)= 3-iodotyrosine

Val= valine (曱型氨基異戊酸） 文中使用的其他縮寫式還包_括： DBU, 1,8-diazabicyclo (5.4.0) undec-7-ene; DCM，dichloromethane (二氨甲烧）； DIC，dicyclohexylcarbodiimide (雙環己基碳化二亞胺）； -14- 200303758 (ίο) DIEA，diisopropylethylamine (二異丙基乙基胺）； DMF，dimethylformamide (二甲基甲醯胺）；

Fmoc, 9-Fluorenylmethoxycarbonyl MTBD, 1,3,4,6,7,8-Hexahydro-l-methyl-2H-pyrimido (1,2-a) pyrimidine; NPS, 2-nitrophenylsulfonyl;

TBTU, O-Benzotri-azol-l-yl-N^^'jN^tetramethyluronium tetrafluoroborate;以及 TFA，trifluoroacetic acid (三氣乙酸） 本發明的化合物或藥學上可接受之鹽，可以透過口服、 非口服（例如肌肉内、腹膜内、靜脈内或皮下注射或植入） 、鼻、陰道、直腸、舌下或局部管道投予，根據各種投予 管道與藥學上可接受的適當載體配製。

口服的固體劑型包括膠囊、錠劑、丸、粉、粒等。在這 些固體劑型中，活性化合物至少會與一種藥學上可接受的 惰性載體摻合，如蔗糖、乳糖或澱粉。這些劑型在一般情 形下也可以包含惰性稀釋劑之外的其他物質，如硬酯酸鎂 等潤滑劑。膠囊、錠劑及藥丸的劑型也可能包含緩衝劑。 錠劑和藥丸亦可添加腸溶衣。 口服的液態劑型包括藥學上可接受的乳劑、溶劑、懸液 、糖漿、含有專業人員常用之惰性稀釋液（如水）的萬能藥 。除了這些惰性稀釋劑外，藥品成分也可以包括佐藥，例 如濕潤劑、乳化劑和懸浮劑，以及加甜、加味和芳香劑。 本發明對非口服劑型的製法包括無菌的水性或非水性 -15 - 200303758 (Π) 發明說明續頁: 溶液、懸浮或乳劑。非水性溶劑或載體包括丙二醇、聚乙 二醇、橄欖油和玉米油等蔬菜油、凝膠和注射式有機酯類 ，如油酸乙酯等。這些劑型也可以包含用於保存、濕潤、 乳化和散播的佐藥。它們可由過濾細菌的濾網過濾，或加 入消毒劑，或以照射或加熱等方式做無菌消毒；亦可以做 成無菌固態形式，在使用前溶於無菌水或無菌注射式媒介

經陰道或直腸投予的形式最好是栓劑，除了活性成分外 還可添加可可油或栓蠟的輔藥。 經鼻或舌下投予的形式最好以專業人員熟知的標準輔 藥來製造。

本發明之活性成分的劑量或許相異，但是活性成分必須 要有一定含量以製成適當的劑型。所選·的劑型會依預定的 療效、投予路徑以及治療持續時間而定。一般來說，對於 人體和其他動物（如哺乳類）的每日劑量為體重的25 pg/公 斤/曰至100 mg/公斤/日之間，可分單次或多次投予，以獲 得預定的療效。 一般劑量最好介於每曰體重的250 pg/公斤/曰至5.0 mg/公 斤/曰，可分單次或多次投予。 此外，本發明的化合物或藥學上可接受之鹽，可以如下 列專利所述，採取延長釋放型的形式投予。在這些配方中 ，14天或28天的緩釋型較好。美國專利號碼5,672,659介紹 包含縮氨酸和聚酯的延釋型。美國專利號碼5,595,760介紹 包含縮氨酸和膠狀的延釋型。美國專利號碼5,821，221介紹 -16- 200303758 發明說明锋頁: t ΛιΛ.>·ν ΜιΟλ^ 、ir (12) 包含縮氨酸和幾丁聚醣的聚合釋放型。美國專利號碼 5,916,883介紹包含縮氨酸和環狀糊精的延釋型。國際專利 申請號碼 PCT/US99/01180(出版號 WO 99/38536，1999年8月 5 日） 則介紹包含縮氨酸的吸收性延釋型。上述各項專利和專利 申請的内容一併附於此以做參考。

使用立即或延長釋放形式要根據適應症的類型而定。如 果適應症屬於急性或超急性失調，以立即釋放型來治療較 好。反之，在預防性或長期治療中，延長釋放型則更適合。 本發明的詳細說明 專業人員可根據本文的描述充分發揮本發明的效用。以 下的特定實例只做為舉例，並非限制本發明的完整範圍。 合成 本發明的化合物（例如分子式（I)化合物等），可以（亦曾） 在 Rink Amide MBHA樹脂合成，（4-(2’，4’-dimethyoxyphenyl-Fmoc-

aminomethyl)-phenoxyacetamido-norleucyl-MBHA resin)，採取標準 的Fmoc化學固態協定與三氟乙酸（TFA)/水/triisopropylsilane (TIPS)(90%/8.5%/1.5%)混合物結合。縮氨酸在4%的醋酸溶液 中加入含有1.5等量碘的甲醇溶液（20 mg/mL甲醇）環化，然 後以C18矽柱的製備性高效能液相層析儀（HPLC)純化，以 acetonitrile/0.1%TFA和水/0.1%TFA的缓衝液洗提。利用分析性 HPLC和質譜儀評估同質性。· 合成酸氨酸所使用的Fmoc保護氨基酸是購自Nova Biochem(加州聖地牙哥）的Fmoc-ThΓ(OtBu)-OH，Fmoc-Cys(Acm)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-D-Trp-OH5 Fmoc-D-Phe- •17- 200303758 (13) 發；明說明讀頁 OH; Fmoc-3-iodo-Tyr-OH則是購自 Advanced ChemTech(肯塔基州 路易維爾市）。 範例 1: D-Phe-c(Cys-Tyr(I)-D-Trp-Lys-Val-Cys)-Thr-NH2 使 2.0公克的 Rink Amide MBHA樹脂（0·65 mmole/g)(MidWest Bio-Tech，印第安那州 Fishers)在 N，N-dimethylformamide (DMF) 膨脹三次，每次十分鐘，然後在DMF中以25% piperidine處理 2X約十分鐘，再以DMF洗滌。之後在樹脂加上Fmoc-Thi:

(OtBu)-OH (3eq., 1.548 g), 2-(1 H-benzotriazole- l-yl)-l5l,3?3- tetramethyluronium tetrafluoroborate (TBTU) (1.236g)， N-hydroxybnzotriazole (HOBt)(0.589 g)，DIEA (0.891 mL)和 DMF (11 mL)。將混合物在室溫下搖動1小時。對預定縮氨酸的其他 Fmoc氨基酸重複上述去保護基和聯結步驟。完成Fmoc組中 最後一個氨基酸Fmoc-D-Phe的去保護基步驟後，以DMF和 二氣甲烷（DCM)洗滌樹脂，然後在真空中乾燥。

在分裂步驟中，將乾燥樹脂在室溫下浸於TFA/水/TIPS

(54 mL/5. 1 mL/0.9 mL)2小時。樹脂經過濾後以5 mL的TFA

清洗，在減壓狀態下濃縮過濾液。在殘留物加入2 0 0 mL 乙醚，沈澱物濾除後以乙醚清洗，在真空下乾燥。將該粗 製的線性縮氨酸溶於6 0 0 m L的4 %醋酸水性溶液’然後徐 徐加入12.95 mL的甲醇碘溶液（20 mg I2/mL甲醇）。在45°C 中攪動溶液3 0分鐘，然後降至·室溫，以2 %的硫化硫酸納 水性溶液冷卻。將該溶液置於備製性HPLC (C 18枉）純化。 圓柱以緩衝液A(水中加入0.1% TFA)和緩衝液B (〇.l%TFA加 入20%水和80%氰甲烷）洗提。以分析性HPLC檢查分餾物 -18 - 200303758 (14) 將含有純縮氨酸的分餾物匯整後凍乾，共取得589 mg純度 大於99%的預定縮氨酸。M.W.計算值=1172.2，M.W.(MS-ES) 1171.4。 分子式（I)化合物由上述方法合成與離析而成。然而專 業人員亦知道，合成分子式（I)化合物之類的縮氨酸亦可 以由幾種已知合成法獲得，如此處列舉的參考文獻所描述 無性繁殖之人類生長抑制素受體的機能表達 含有人類生長抑制素受體的共因無性繁殖（hSSTR-Ι至 hSSTRo)(Yamada, Y., et al. al.? pr〇c. Natl. Acad. Sci. USA. 1992, 89，25 1-255; Yasuda，K·，et al·，J Biol. Chem· 1992, 267, 20422-20428; Yamada，Y·，et al·，Mol. Pharmacol· 1992，42，2136-2142; Rohrer，L·，et al.，Proc. Natl· Acad. Sci. USA· 1993, 90, 4196-4200·) 承蒙芝加哥大學的Graeme I. Bell博士概然提供。hSSTR-1， hSSTR-2，hSSTR-3，hSSTR-4 和 hSSTR-5 cDNAs則分離成 1.5-kb

Psti-Xmnl片段，1.7-kb BamHI-Hindlll片段，2.0-kb Ncol-Hindlll 片段，1.4-kb Nhel-Ndel片段，以及 1.2-kb Hindlll-Xbal片段，每 個片段都含有全長受體的完整基因譯碼區。這些片段再轉 殖成哺乳動物表達質體pCMV5中相應的限制酵素區，由人 類巨細胞病毒（CMV)激動劑順流而下，以產生表達載體 pCMV5/hSSTR-l， pCMV5/hS'STR-2? pCMV5/hSSTR-3, pCMV5/hSSTR-4和pCMV5/hSSTR-5。添加帶有新黴素哺乳動 物細胞選擇性標記的質體pRSV-neo (American Type Culture Collection，馬里蘭州Rockville)，以轉染至CHO-K1細胞。 -19- 200303758 (15) I發明說明續頁 受體表達和轉染 轉染是以磷酸妈的方式達成。將CH0-K1細胞置於補充 1 0%胎牛血清的α基本培養基（α_ΜΕΜ; Gibco)中，利用磷酸 鈣沈澱完成每個表達質體的轉染。由補充5〇〇 μ§ mL·1 geneticin (G418;Gibco)的α-ΜΕΜ中選出遺傳了表達質體的 轉殖體。以玻環轉殖法挑出獨立的C Η Ο - Κ 1轉殖體，然後 在培養基於選定的媒介中擴展。由分離的轉殖體製成細胞 膜，初步判定 hSSTR表達會與(f〇r SSTR-2)結合。 放射性配基結合測定 在冰冷的Tris-HCl (50 mM)中，從相應CH〇_Ki細胞的組織均 質物（Polytron設定6，1 5秒）中取出五種細胞的細胞膜，離 心（39000 g，2x10分鐘）後在新鮮的緩衝再懸浮。最終顆粒再 懸浮於Tris-HCl(10 mM)以做測定。細胞膜的量液吸管以〇 〇5 nMCmUTyrn-SRIF和（mI)MK-678 (2型）進行溫育（置於 37。(：下 30 分鐘），置於含有 BSA (10 mg mL·1)，MgCl2 (5 mM)，Trasylol (200 klU mL 丨）’枯草菌素（0.02mgmL])*phenylmethanesulfonylfluoride (0.02 mg mL·1)的50 nM HEPES (pH 7·4)。最終測定量為 〇·3 mL， 以Brandel快速過濾模組從預先浸在0.3% poly (e t h y 1 e n i m i n e)的G F / C濾器迅速過濾，以結束溫育。然後 以量液吸管的冷緩衝液（3 X 5 mL)清洗每根試管和濾器。 特定結合是由結合的放射性配基總數減去在1 . 〇 μΜ S RIF結合的數量得出。以下的總放射性配基結合及非特 定結合（nsb)值是以這些測定系統得出：hSSTR-1，7000 -20· 200303758 (16) cpm總數與 3500 cpm nsb ; hSSTR-2，9000 cpm總數與 1000 cpm nsb ; hSSTR-3, 8000 cpm總數與 1000 cpm nsb ; hSSTR-4, 6000 cpm 總數與 3500 cpm nsb ;以及hSSTR-5，7500 cpm總數與 3500 cpm nsb。五個受體亞型各自的結合親和性以Ki值士SEM (nM)表 示。得自分子式（I)化合物的Ki值請見表二。 患者 十位年齡在26-62歲 '具有大腺瘤的末端肥大症患者（ 三男七女）接受了本項研究。在治療前先記錄他們的内分 泌狀態及腦垂體腺瘤的神經放射線特性。GH基準含量是 在早晨8時至9時間像掃描顯示，腫瘤的最大直徑為1 1至4 2 mm。SRIF激動劑的敏感性以一次注射〇ctreotide(Sandostatin， Novartis，瑞士Basel)的急性測試評估。對於somatostatin類似 物的敏感性，是以注射octreotide 2-6小時後GH由基準值降至 G Η平均值的百分比表示。根據測試結果，認定五·位患者 對octreotide有完全反應（GH抑制平均值，79士7%)，另五位 患者則有部分反應（GH抑制平均值33土6 %)。所有患者均接 受經蝶竇手術。每位患者的臨床内分泌和腫瘤狀態的摘要 請見表一。 荷爾蒙測定 GH和PRL皆以市面上的免疫放射測定套件來測量

(Immunotech，法國馬賽）。正常的GH值範圍為0.2-2.4 pg/L ;正常的PRL值範圍在女性為le24 pg/]L，男性則為1-17 p^g/L ° 經過乙醇-酸萃取後，以 Nichols Institute Diagnostics 的 IGF-1 RIA奪件做 i 装 igF - 1 測定（加州 San Juan Capistrano)。 200303758 (17) 發明辑每續頁] * K f v^ 知 r· s, 偵測SSTRs 使用S V總R N A離析系統（p r 〇 m e g a C 〇 r p ·，法國里昂）從 每個腫瘤30-60 mg的組織中萃取總RN A，然後以3 0 U不含 核糖核酸臃的去氧核糖核酸晦1 (Roche，德國曼海姆）處理 。按照廠商指示以 lpg hexamers (Pharmacia Biotech，法國 奧塞）和Moloney鼠類血癌病毒竹轉錄晦，使總RNA反轉錄 成互補的DNA。利用對PCR反應的進展產生正比讀數的 5f-exonuclease (Taq Man)測定來量化SSTRsmRNA(Perkin-Elmer, 1 995 (Taq Man TM)探針設計、合成和純化。FOSTER City: Applied Biosystems)0 SSTR2和 SSTR5 mRNA的反應狀況 、所用的引子，以及定量計算的詳情都曾有專文描述 (Jaquet P，et al. 2000，J Clin Endocrinol Metab. 85:78 1 -792) 〇 結果的表達為每 picograms 的 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)有若干 picograms 的 SSTR。 細胞培養研究 手術中取出的各個腫瘤以機械和酵素方式進行分離。根 據腫瘤而定，各取得4 - 9 0 X 1 06個分離細胞。腫瘤細胞最 初在補充10% FCS的DMEM中培養三天。等到第三天，細 胞在多格培養皿清洗並以2 X 104細胞/每格的密度裝盤 (Costar 3524, Brumath，France)，培養皿如前述覆以牛内皮角膜 細胞的細胞外基質（Jaquet P，et ai·，1985，Horm Res· 22:153-163) 。等細胞在第5 - 8天依附於基質後（根據培養而定），除去 介質，替換成補充2% FCS、抗生素、運鐵蛋白和砸的DMEM (Jaquet P，et al.，1985，Horm Res· 22:153-163)。在八小時之間對 200303758 (18) 發明說明讀頁: 第5-8天的培養物測量各種劑量的SRIF-14、octreotide、一種 親SSTR2化合物（化合物A)、一種親SSTR5化合物（化合物B) ，以及SSTR2和SSTR5選定的分子式（I)化合物對於抑制gh 和PRL分泌的效果。每種藥物濃度都接受四次測試。 產品 SRIF-14 是購自 Sigma (法國 Saint-Quentin Fallavier)。 octreotide由Novartis供應（瑞士 Basel)。化合物A與B貝是由 Biomeasure，Inc.提供（麻省 Milford)。天然 SRIF和 SRIF類似物 溶入含有0.1%純化血清白蛋白的〇.〇1 mol/L醋酸（Life Technologies，Inc.，法國 Cergy-Pontoise)。將藥物以 10° mol/L 的溶液存放於攝氏-8 0 °C下。每項實驗都會從新的量液吸 管準備新鮮的工作藥液。 統計數字 實驗結果會以平均值d： SEM表示。兩個無配對組的統計 意義由M a η η - W h i t n e y測試判定。採取S p e a r m a η次序關聯 ，以便在不表明依賴性的情況下衡量兩組變量的關聯。在 所有測試中，小於0.0 5則視為有意義。 200303758 (19) 發明月續頁 表1 : SSTR2和SSTR5 mRNAs在肢端肥大症患者的臨床特性 及RT-PCR定量 病歷 年齡腫瘤大小 ’ PRL IGF-1 SSTR亞型1 號碼性別（歲）（mm)a 基準 octreotide下e^g/L) (ug/L) SSTR2 SSTR5

12 3 4567891 AAAAAAAAAA 男女女男女女男女女女 3 94202 3 960 5 3 4 3 4 6 5 3 2 3 11 11 1(91) 11 1171 371 555 15 22 4(82) 17 885 366 744 13 109 26 (76) 12 881 153 129 15 141 36 (75) 2 1010 127 130 39 47 12 (75) 17 1008 93 75 22 5 3(40) 18 63 ND ND 25 26 15.8(39) 19 1100 19 262 18 13 8.2(37) 17 1187 20 4866 38 141 100 (29) 63 740 59 3745 42 195 151 (23) 30 849 2 210 a. 腫瘤最大直徑以MRI評估。 b. SSTR2和SSTR5 mRNA在每個腺瘤的表達如上，結果以 每 picograms GAPDH mRNA有多少 picogram 的 SSTR mRNA 表 示。 . c. GH平均值是在急性施以octreotide (200 pg，sc)後2-6小 時判定。括號内為抑制百分比與GH基準值之比。 N D代表未做。 1號和3號病例曾在一項先前研究發表（Jaquet，P·，et al.，J. Clin Endocrinol Metab. 85:781-792) 〇 表2 : SRIF-14和生長抑制素類似物的人類生長抑制素受體亞 型具體性

SSTR結合親和性(1C处nmol/L 化合物 hSSTRl hSSTR2 hSSTR3 hSSTR4 hSSTR5 Somatostatin-14 1.95 0.25 1.2 1.7 1.4 Octreotide 1140 0.6 34.5 7030 7 -24- 200303758 發明說：明讀頁

Lanreotide 2129 0.7 98 1826 12.7 化合物A 6016 0.19 26.8 3897 9.8 化合物B 12 28 5.5 36 0.42 分子式(I) 1020 0.29 133 >1000 0.67 放射性 配基結合測 定數據到 表達人類SSTR (hSSTR)亞 型的轉染CHO-K1細胞膜。 octreotide敏感性與SSTR2和SSTR5亞型mRNA在肢端肥大症表 達的關聯 SRIF-14在試管内抑制GH的程度與SSTR2 mRNA的表達 程度有高度關聯（Jaquet P，et al· 2000，J Clin Endocrinol Metab· 85 :7 8 1-792)。在目前系列中，由急性octreotide測試所 評估的抑制GH程度也與SSTR2 mRNA的表達密切相關。 (P<0.009 ;表 1) 〇 在五例（A1-A5)對octreotide高度敏感的腺瘤中，SSTR2的 表達平均值為222士61 pg/pg GAPDH。在五例對octreotide有部 分反應的患者中，對其中四人（A7-A10)做同樣的分析， SSTR2 mRNA表達平均值更低（25士 12 pg/pg GAPDH)。在五位 對octreotide有反應之患者的腺瘤中，SSTR5 mRNA的表達程 度相等（SSTR2/SSTR5 mRNA比率，0.9士0.3)。反之，在四位 對octreotide有部分反應之患者的腺瘤中，SSTR2 mRNA含量 很低，卻有高度的SSTR5 mRNA表達（227 1 土 1197 pg/pg GAPDH)。因此這些數據顯示了 mRNA在分泌GH之腫瘤中 的兩種表達模式。對octreotide敏感的腺瘤同樣表達出SSTR2 和SSTR5 mRNA ；對octreotide反應不佳的腺瘤則會流失 -25- 200303758 (21)

SSTR2 mRNA，而且 S STR5 比 S STR2 mRNA 高出 3 0 倍。 親SSTR2及親SSTR5激動劑對GH分泌的效用 在本系列實驗中，檢驗1CT13-10·8 mol/L濃度的SRIF-14、親 SSTR2化合物（化合物A)、親SSTR5化合物（化合物B)抑制 GH釋放的劑量反應。在十個腺瘤細胞培養中，發現對 SSTR2與SSTR5類似物有兩種反應模式。在五個對octreotide 敏感的腫瘤（A1-A5)培養中，親SSTR2化合物（化合物A)在 0.1 nmol/L濃度中（EC50為 3土2 pmol/L)產生 41士7%的抑制 GH 平均最大值。SRIF-14也產生抑制GH分泌的類似劑量反應 。反之，親SSTR5化合物（化合物B)在10 nmol/L (EC5G=800士350 pmol/L)濃度才產生最大的抑制GH效果。化合 物A與化合物B之所以有此差異，是源於化合物B的結合親 和性，因為化合物B雖親SSTR5，但在高濃度時作用卻類 似微弱的SSTR2激動劑。因此，對octreotide有充分反應之患 者的腫瘤細胞中，生長抑制素壓抑GH的效果只能透過 SSTR2亞型發揮。至於對octreotide只有部分反應（A6-A10)的 分泌GH腫瘤中，SRIF-14和親SSTR5激動劑（化合物B)都可以 達到抑制GH的最高效果。在這五個腺瘤細胞培養中，化 合物A的效庇比化合物B略低（最高壓抑G Η值分別為3 1 士 5 % 和38土7%)。化合物Β與化合物Α的EC5G值分別為25士13和47士 18 pmol/L。這些數據顯示，對octreotide有部分反應的腫瘤細胞 中，SRIF抑制GH的效果可以透過SSTR5和SSTR2亞型達成。 分子式（I)化合物與0ctre〇tide在octreotide敏感及部分敏感腫 瘤中之比較 -26- 200303758 (22) 發明叙明續頁 在五個對octreotide敏感、而且透過SSTR2亞型來抑制GH 的腫瘤中，檢查10·3-10·8 mol/L的SSTR2加SSTR5-選定的分子 式（I)化合物和octreotide抑制GH分泌的效果。兩者對於抑制 GH分泌的劑量反應曲線彼此平行（ec5〇 = 3土3且55土 15 pmol/L)。在nanomolar濃度下，分子式（I)化合物和octreotide; 抑制GH的平均最大值分別為44土5%和36土7%。這些結果顯

示’若透過SSTR2亞型來抑制GH分泌，天然的SRIF和分子 式（I)化合物具有類似的效果。基於SSTR2的結合親合性， 分子式（I)化合物的效力比octreotide稍強。

對於五例（A6-A 10)對octreotide只有部分反應的腫瘤，也在 股瘤細胞培養中檢驗分子式（I)化合物和octreotide抑制GH 分泌的劑量反應。octreotide對於抑制GH分泌的劑量反應模 式（EC5Q=200土 145 pmol/L)與分子式（I)化合物（EC5G=50士33 pmol/L) 有顯著差異。分子式（I)化合物在1 〇 η Μ的濃度時，比濃度 相同的octreotide更有抑制GH的效果（44土5%比26士7% ; Ρ<0·014)。這些結果顯示，在分泌GH且對親SSTR2和SSTR5 激動劑都有反應的腫瘤中（對octreotide有部分反應者），雙 選擇的分子式（I)化合物激動劑比親SSTR2的藥物（如 octreotide)更能抑制 GH。 分子式（I)化合物與聯用親SSTR2和親SSTR5激動劑之比較 在五個對SSTR2和SSTR5激動劑同樣敏感的腺瘤細胞培 養中（對octreotide有部分反應者），比較分子式（I)化合物和 聯用等劑量的SSTR2激動劑（化合物A)與SSTR5激動劑（化 合物B)對於抑制G Η分泌的劑量反應。兩者抑制G Η的效果 -27- 200303758 _ (23) 發3月讀為錢寅 極為類似（44土5%)，兩種治療抑制GH分泌的劑量反應彼此 平行。鑒於SSTR2和SSTR5亞型各自的IC5(3值，聯用化合物 A與化合物B來抑制G Η的分泌要比雙選擇激動劑的分子 式（I)化合物略佳。 分子式（I)化合物與octreotide對PRL分泌的效用 把PRL和GH分泌到五個腫瘤細胞培養（Al，A2，A7，A9 及A10)的介質中，發現SRIF-14和不同的SRIF類似物對所有 腫瘤都產生抑制PRL分泌的劑量反應。若增加SRIF-14和親 SSTR5化合物（化合物B)的濃度，仍會產生抑制PRL分泌的 類似劑量反應。親SSTR2化合物（化合物A)對於抑制PRL 分泌只有部分效果（化合物A和化合物B抑制PRL的平均 最大值各為34士5%和52士6%)。與octreotide相比，雙特異的分 子式（I)化合物更能抑制PRL分泌。10 mmol/L的分子式（I) 化合物與octreotide抑制PRL的平均最大值各為51土5%和 34士7% (P<0.045)。在分泌GH或PRL的腫瘤中，這些結果顯 示親SSTR5化合物或雙特異SSTR2和SSTR5化合物抑制 PRL的效果要比只有親SSTR2的激動劑來得強。 儘管揭露書已對本發明做出詳盡描述，然而上述說明只 做為範例參考，並非侷限發明的範圍。專利主張亦包括其 他層面、優勢及修正^本文引述的每一參考文獻也一併附 於此做為參考。 、 -28-

Claims (1)

1. 200303758 拾、申讀專利範圍 1 . 一種式（I)化合物， D-Phe-c (Cys-Tyr(I)-D-Trp-Lys-Val-Cys)-Thr-NH2， (I) 或藥學上可接受之鹽。 2. —種結合一或多種人類生長抑制素亞型受體-1，-2，-3 和-5之方法，其包含對需要接受者投予根據申請專利範 圍第1項的化合物或藥學上可接受之鹽。 3 . —種引發生長抑制素激動劑效果之方法，其包含對需要 接受者投予根據申請專利範圍第1項的化合物或藥學上 可接受之鹽。 4. 一種治療所需的人體或其他動物之疾病或症狀之方法 ，其包含投予根據申請專利範圍第1項的化合物或藥學 上可接受之鹽，其中該疾病或症狀係選自由庫欣式症候 群、促生殖腺素腫、副曱狀腺機能亢進、畸型性骨炎、 VIPoma、胰島母細胞瘤、高胰島素症、胃激素瘤、 Zollinger-Ellison症候群、過度分泌性腹；:寫、大腸急躁症 候群、胰臟炎、克隆氏病、全身性硬化症、甲狀腺癌、 牛皮癬、低血壓、恐慌症、硬皮病、小腸阻塞、食道胃 酸逆流異常、十二指腸胃逆流、葛瑞夫氏症、多囊性卵 巢疾病、上消化道出血、胰臟假囊腫、胰臟腹水、血癌 、腦膜瘤、癌症惡病質、肢端肥大症、肝癌、肺癌、黑 色素瘤、抑制實體腫瘤快速增生、體重減輕、治療胰島 素阻抗性、X症候群、延長胰臟細胞存活率、纖維化、 200303758 申請專利範g續頁 高脂血症、泌乳素過高症、泌乳激素腺瘤、糖尿病神經 性病變、黃斑部退化、惡性病之高鈣血症、飯後肝門脈 高壓，以及肝門脈高壓的併發症所組成之群。 5 .根據申請專利範圍第4項之方法，其中該疾病或症狀為 肢端肥大症。 6 . —種治療需要的人體或其他動物疾病或症狀之方法，其 包含投予根據申請專利範圍第1項的化合物或藥學上可 接受之鹽，其中該疾病或症狀係選自由曱狀腺毒性眼球 突出、無作用的腦垂體腺瘤、血管新生、炎症和炎性疾 病、類癌症候群、類癌腫瘤、視網膜病變和黃斑部退化 所組成之群。 7 .根據申請專利範圍第4項之方法，其中過度分泌性腹瀉 係與愛滋病、胃泌素釋放縮氨酸、腸移植與宿主疾病或 化學療法有關。 8 .根據申請專利範圍第3項之方法，其中該生長抑制素激 動劑的效用包含抑制生長激素的分泌。 9. 根據申請專利範圍第3項之方法，其中該生長抑制素激 動劑的效用包含抑制泌乳激素的分泌。 10. 根據申請專利範圍第2項之方法，其中該式（I)化合物會 選擇性地與生長抑制素亞型受體-2和〇結合。 200303758 陸、（一）、本案指定代表圖為：第__圖 (二）、本代表圖之元件代表符號簡單說明··

   柒、本案若有化學式時，請揭示最能顯示發明特徵的化學式： D-Phe-c (Cys-Tyr(I)-D-Trp-Lys-Val-Cys)-Thr-NH2 5 (I)