TARIFNAME YENI LACTIPLANTIBACILL US PLANTAR UM SUSUNUN KOLON KANSERI, RAHIMAGZI KANSERI VE MEME KANSERININ ÖNLENMESI VE/VEYA TEDAVISINDE KULLANIMI Teknik Alan Bu bulus, insan diskisindan izole edilen Lactiplantibacillus plantaruni MK55 (L. plantarum MK55) susunun özelliklerini ve bu susun CT-26 ve HCT-116 kolon kanseri, HeLa rahimagzi kanseri ve MDA-MB-231 meme kanserinin tedavisi ve/veya önlenmesinde gida takviyesi ve/veya farmasötik olarak kullanimini açiklamaktadir. Bulus ayrica L. plantarum MK55"den izole edilmis bir gen dizisini ve bu dizinin fonksiyonlarini da açiklamaktadir. Bilinen Teknik Probiyotikler, belirli miktarda alindigi zaman sagliga faydali etkiler saglayan canli mikroorganizmalar olarak tanimlanmaktadir. Uzun yillardan beri sürdürülen yogun çalismalar sonucunda pek çok yararli özellikler tasiyan mikroorganizma belirlenmis olmakla birlikte, ticari olarak üretimine izin verilen sinirli sayida mikroorganizma bulunmaktadir. Probiyotikler, insan sagligini gelistirmesinde gida takviyesi olarak kullaniminin yani sira, hayvanlarda yem takviyesi olarak da kullanilmaktadir. Bu dogrultuda bulusun ilgili oldugu alan biyoteknolojik üretim yapan sanayi koludur. Bulusun, farkli hücre hatlarinda yapilan in vitro deneyler sonucunda antikanser etkisinin kanitlanmasi ile kanser tedavisinde kullanilan geleneksel yöntemlere bir alternatif olmasi beklenmektedir. Bu açidan degerlendirildiginde bulus, ilaç/farrnasötik olabilme potansiyeli gösterdiginden farrnakoloji alaniyla da Ülkemizde probiyotiklerin özelliklerini kapsamli olarak inceleyen çalismalar bulunmakla birlikte ülkemiz kaynaklarindan elde edilmis probiyotik mikroorganizmalarin ticari olarak yerli üretimi henüz bulunmamaktadir. Yurt disinda üretim yapan bazi firmalarin ürünleri arasinda, Natures Supreme (Probiotic SB), Saiiofi (Enterogermina), NBL (Probiotic Gold) Zade Vital (Probiyotik Reforma) ve The Lifeco (Probiyotik Karisimi) bulunmaktadir. Saglik açisindan yararli diger etkilerinin yani sira probiyotiklerin antikanser etki göstermeleri de onlarin üstün özelliklerinden biri olarak kabul edilir, Kanser, dünyada her geçen gün artan en önemli saglik sorunlarindan biri olarak görülmektedir. Dünya çapinda kanser tüm ölümlerin yaklasik %13 7ünü olusturdugundan baslica ölüm nedeni olarak görülmektedir. Kanser hastalarinda uygulanan tedavi seçenekleri ise genellikle kemoterapi, radyoterapi ve cerrahi yöntemlerle sinirlanmistir, ancak bu tedavi yöntemleri hastadaki tümörlü bölgeyi kontrol altina alip, yayilmasini önlerken bir yandan da ciddi yan etkilere yol açmaktadir. Bu nedenle son yillarda arastirmacilar yan etkileri daha az ve antikanser özellikte dogal madde arayisina girmislerdir. Bu açidan probiyotik mikroorganizmalarin faydali etkileri dikkat çekmistir, ancak probiyotiklerin antikanser özellikleriyle ilgili yapilmis Bulus, probiyotiklerin antikanser etki gösterebilme özelliginden yararlanilarak özellikle ülkemizde (Türkiye'de) sik görülen kolon, rahimagzi ve meme kanserinde antikanser etkisinin belirleninesi amaciyla yapilmistir. Bulusun probiyotiklerin antikanser etkileri konusundaki bilgi açiginin kapatilmasinda yararli olacagi düsünülmektedir. Bulus ile ilgili Türk Patent ve Marka Kurumu ile yurtdisi patent ofisleri veri tabanlarinda yapilan arastirmalar sonucunda asagidaki bilinen teknik dokümanlara rastlanmistir. TR2018/20329 numarali "Probiyotik içeren besin bilesimi" baslikli Türk patent tesciline konu bulus, Bifidobacterium breve, sindirilemeyen iki farkli sakkarit (A ve B) içeren, istege bagli olarak Lactobacillus ile kombine edilen bir bilesim ve söz konusu bilesimin, gastrointestinal bozukluk. immun bozukluk ve/veya endokrin bozuklugun tedavi edilmesi ve/veya önlenmesine yönelik olarak kullanimini açiklamaktadir. Bu basvuruda, immün bozukluklarin tedavi edilmesi ve önlenmesi amacina yönelik bizim bulusumuzdan farkli olarak baska bir probiyotik bakteri susu (burada B. breve suslari, saglikli insan sütü ile beslenen bebeklerin feçesinden izole edilenlerdir) ve söz konusu susu içeren bir bilesim açiklanmistir. Bulus amaçlari benzer olsa da, buluslarin çözümünde kullanilan teknik unsurlarin farkli oldugu görülmektedir. Bulusta istege bagli olarak B. breve°nin Lactobacillus paracasei ile kombine edilebilecegi bilgisi olsa da kullanilan sus bu basvuru konusundan farklidir. Söz konusu bulusta insan diskisindan izole edilen ve yeni bir sus olan L. plantaruni MK55°e dair yönlendirici bir bilgi bulunmamaktadir. TR 2012/01867 numarali " Anne sütünden elde edilen yeni Lactobacillus probiyotik bakteri suslari gelistirilmesi" baslikli Türk patent tesciline konu bulusta, anne sütü ve bebek gaita örneklerinden bakteri Lactobacillus casei suslari izole edilip potansiyel probiyotik verimlilikleri karakterize edilmistir. TR2001/01699 numarali "Urogenital enfeksiyonlarin önlenmesi ve tedavisi için agizdan lactobakilus uygulamasi" baslikli Türk Patent tesciline konu bulus, saglikli bir ürogenital floranin kurulmasi ve korunmasi için laktobasil ve/veya bifidobakteri gibi diger probiyotik organizmalarin oral yoldan verilmesi için yöntemler ve kompozisyonlari açiklamaktadir. TW yayin numarali "Probiotic composition for preventing, improving or alleviating pancreatic cancer and application thereot" baslikli patent tesciline konu bulus, özellikle pankreas kanserinin tedavisi ve önlenmesi için Lactobacillus paracasei GMNL-l33 (Biological Resource Center (BCRC) of the Food Industry Development Research Institute, No. 331 Food Road, Hsinchu, Taiwan da tevdi edilmis) içeren bir probiyotik kompozisyonun kullanimini açiklamaktadir. U yayin numarali "Probiotic prevention and treatment of colon cancer" baslikli Amerikan patent tesciline konu bulus, kolon kanserinin tedavisi ve önlenmesine yönelik bir yöntemi açiklamaktadir. Buradaki yöntem bir polisakkarit verilmesini içermektedir. Tarifname incelendiginde bu polisakkaritin B, fragilis bakterisinden izole edildigi görülmektedir. Bulusun teknik amacinin ayni olmasi ve teknik alanlarin benzer olmasina karsin, teknikteki soruna bulunan çözümler bu basvuru konusu bulustan farkli olmaktadir. Basvuru konusu bu bulusta insan diskisindan izole edilmis yeni bir sus olan L. plantarum MKSS'in kolon kanseri, rahimagzi kanseri ve meme kanserinin önlenmesinde/tedavisinde kullanimi açiklanmistir. Bu amaçla yapilan in vivo ve in vitro çalismalar da bunu göstermektedir. CN yayin numarali Çin patent tesciline konu bulus, kanserin önlenmesi için probiyotik medikal bir solüsyonu açiklamaktadir. Bizim bulusumuzda spesifik olarak kolon kanseri, rahimagzi kanseri ve meme kanserinin önlenmesi/tedavisinde etkili olan L. plantarum"un insan diskisiiidan izole edilmis yeni bir susu açiklanmistir. W yayin numarali "New probiotic strain of Lactobacillus brevis" baslikli Uluslararasi patent basvurusuna konu bulusta, Meksika içeceginden (pulque) izole edilmis ve antikanser özellikler sergileyen yeni bir L. brevis probiyotik susu ve ayrica adi geçen susu içeren kompozisyonlar açiklanmistir. Bu basvuruda, bilinen teknikteki sorunlarin üstesinden gelmek ve alternatif bir çözüm olusturmak amaciyla yeni bir L. plantarum susu (MK55) izole edilmis ve bu susa ait spesifik gen dizilerinin kolon, rahimagzi ve meme kanserinin önlenmesindeki ve/veya tedavisindeki üstün etkisi gösterilmistir. Bulus sahibinin gerçeklestirdigi çalismalar bu üstün teknik etkiyi ispatlamaktadir. Bu bulus ile L. plantaruin MK55°in Öncelikle üstün probiyotik özellikleri belirlenmis, daha sonra difeniltetrazolyum-bromür (MTT) ve tripan mavi boyasi ile hücre canlilik testi yapilarak in vitro olarak CT-26 kolon kanseri hücre hattinda tümör baskilayici özelligi belirlenmistir. Daha sonra L. plantarum MK55 susu tümör hücreleri enjekte edilmis farelere uygulanarak kanser hücrelerinin kontrolsüz çogalmasini engelleyebildigi in vivo olarak da gözlenmistir. Elde edilen bulgularin ümit verici olmasi nedeniyle ek olarak farkli hücre hatlari ve farkli teknikler kullanilarak susun antikanser etkisi ve bu etkinin kaynagini olusturabilecek kanser metastazi ile ilgili bazi proteinlerin ekspresyonlari incelenmistir. Bu patent basvurusunda tüm bulgulara ve fonksiyonlari saglayan gen dizisine yer verilmistir. U yayin numarali "Probiotic composition for preventing, improving or alleviating pancreatic cancer and application thereof " baslikli Amerika patent tesciline konu bulusta L. paracasei' ve L. reuteri`yi de içeren probiyotik bakterilerden olusan karisimin pankreas kanserini önemli derecede önledigi ve bazi belirtileri hafiflettigi belirlenmistir. Bu bulusta probiyotik takviyesini takiben, farelerde pankreastaki kanser hücrelerinin azalisi immünohistokimyasal boyama ile görüntülenmistir. Ayni zamanda probiyotik uygulamasi sonrasinda kanser metastazi ile ilgili bazi proteinlerin (N-Cad, Viinentin, Snail-l ve ZEB) ekspresyonlari incelenmistir. Bulusun gerçeklesmesinde benzer amaçlar olmasina ragmen, bizim bulusumuzda metastazin belirlemesinde yara iyilestirme ve invazyon deneylerinin yapilmasi ve farkli proteinlerin ekspresyonlarinin incelenmesi açisindan iki çalisma farklilik göstermektedir. Bulusun ilgili oldugu teknik alan yasam bilimleridir. Bulusa konu olan L. plaiitarum MK55 hücre içeriginin antikanser etkisi benzer bazi çalismalar ile kiyaslandiginda bulusun orijinal ve üstün teknik etkiye (tedavi edici etki) sahip oldugunu göstermektedir. Bharti Vd. (2015)"nin (Bharti, V., Mehta, A., Singh, S., J ain, N., Ahirwal, L. Cytotoxicity of live Whole cell, heat killed cell and cell free extract of Lactobacillus strain in u-87 human glioblastoma cell line MCP-7 meme kanseri hücre hattina karsi sitotoksik etkileri karsilastirilmistir. Probiyotik suslarin, canli, isil islem uygulamasi ile öldürülmüs ve hücre içerigi olmak üzere farkli formlari kullanilarak MTT deneyi yapilmistir. Çalisma sonunda L. acidophilus ve L. plantarum"un hücre içeriginin 1000 ug/mL konsantrasyonlarda MCP-7 meme kanseri hücre hattinda hücre çogalmasini önledigi tespit edilmistir. Bibalan Vd. (2017)*nin (Bibalan, M. H., Eshaghi, M., Rohani, M., Esghaei, M., Darban- Sarokhalil, D., Pourshafie, M. R., Talebi, M. Isolates of Lactobacillus plantarum and L. reuteri display greater antiproliferative and antipathogenic activity than other Lactobacillus isolates. Journal of elde edilmis 13 laktobasil izolatinin HT-29 kolon kanseri hücre hattina karsi antiproliferatif etkisi incelenmistir. XTT deneyi sonucunda laktobasil suslarindan üç adedinin güçlü antiproliferatif etki gösterdigi tespit edilmistir. Görüldügü gibi bu çalismalarda genellikle bir ya da iki hücre hattina karsi laktik asit bakterilerinin antikanser etkisi üzerinde durulmustur. Bulus, L. plantarum MK55"in üç farkli hücre hattina karsi farkli yöntemler kullanilarak antikanser etkisinin belirlenmesine yönelik oldugundan orijinal ve teknik etki açisindan üstün kabul edilmektedir. Kanser hücrelerinde metastazin degerlendirilmesi için yapilan farkli çalismalarda da benzer sonuçlar elde edilmistir. Bununla ilgili olarak Shang vd. (2020) (Shang, F., Jiang, X., Wang, H., Chen, S., Wang, X., Liu, Y., Wang, G. The inhibitory effects of probiotics on colon cancer cells: In vitro aiid in çalismada CT-26 kolon kanseri hücre hatti üzerinde L. plantaruin"u da içeren probiyotik karisiminin hücre metastazina etkisi incelenmistir. Çalisma sonunda kontrol grubuna kiyasla, probiyotik karisim uygulanan hücre hattindaki yara daha az oranda kapanmistir. Bu sonuç da farkli hücre hatlari kullanilip, benzer etkiler olusturdugu için bulusu orijinal ve üstün kilmaktadir. Bulusun üstünlügünü gösteren bir diger çalisma gen ekspresyon analizidir. Bununla ilgili olarak 2B ve hatlarina uygulanan L. plantaruin MKSS hücre içeriginin gen düzeyinde etkisi 20 farkli genin ekspresyon düzeyine göre degerlendirilmistir. Yapilmis çalismalar incelendiginde ise 2B ve ?B olarak gelistirilen hücre hatlarinda probiyotiklerin gen ekspresyonundaki degisime etkisinin bir arada degerlendirildigi benzer bir çalisma bulunmadigi belirleninistir. Yapilmis benzer çalismalarda ise probiyotiklerin etkisi genellikle birkaç hücre hatti üzerinde incelenmis ve az sayida genin ekspresyon düzeyi arastirilmistir. Bulusun ortaya çikmasinda yapilan bir baska çalisma ise moleküler kenetlenme çalismalaridir. Günümüzde genellikle bitkisel kaynaklardan elde edilen metabolitlerin kanserle iliskili proteinlerle in silico ortamda baglanma enerjileri belirlenerek ilaç olarak kullanilabilme olanaklari arastirilmaktadir. Buna karsin probiyotikler ile ilgili yapilmis çalismalar sinirlidir. Bu nedenle bulusun antikanser etken madde olabilme potansiyelini belirlemeye yönelik moleküler kenetlenme çalismasi orijinaldir. Yukarida belirtildigi gibi çesitli laktik asit bakterilerinin farkli kanser hücre hatlarina etkilerini belirleyen çalismalar ve bazi patentler bulunmakla birlikte, laktik asit bakterilerinin (probiyotiklerin) üç farkli hücre hattina karsi farkli yöntemler kullanilarak antikanser etkisinin belirlendigi herhangi bir çalismaya rastlanmamistir. Bu nedenle MK55°e ait yeni belirlenen orijinal özelliklerin patent basvurusu ile degerlendirilmesi düsünülmüstür. Bulusun Anlatimi Bulusun temel amaci; insan orijinli (insan diskisindan izole edilmis), probiyotik özellikli, dogal, siiidirim sistemi kosullarinda Canli kalabilen, antibiyotiklere karsi dogal dirence sahip, proteolitik aktivite gösteren ve antioksidan aktivitesi yüksek yeni bir bakteri susunun kolon, rahimagzi ve meme kanserinin tedavi ve/veya önlenmesinde kullanilmasidir. Bulusa konu yeni bakteri susu, in vitro kosullarda kolon kanseri hücre hattinin (CT-26) baskilanmasini saglayabilecek özelliklere sahiptir. Bunun yani sira in vivo olarak bagirsak islevlerini düzenleme ve tümör olusumuna karsi bagisiklik sistemini gelistirme etkilerine sahiptir. Bakteri susu tamamen ülkemiz kaynaklari kullanilarak ve ülkemiz kosullarinda insan diskisindan izolasyonla elde edilmistir. Bulusun bir diger amaci, yukarida bilinen teknikte sayilan sorunlarin üstesinden gelmek amaci ile alternatif bir bakteri susu içeren kompozisyon (gida takviyesi) gelistirmektir. Bulus konusu L. plantarum MK55lin tasidigi özelliklerin üstünlügü ayni proje kapsaminda izole edilen diger suslarla (MK'ye ait verilerle kiyaslanmistir. Bulus konusu L. plantarum`un iilogenetik semasina bakildiginda; Bacteria; Firmicutes; Bacilli; Lactobacillales; Lactobacillaceae; Lactiplantibacillus; L. plantarum olarak siniflandirilmaktadir. L. plantarum türü diger türler arasinda probiyotik olma özellikleri açisindan en verimli olanlarindandir. Bu bakteriler yasadigi organizmalarin sindirim sistemini düzenler, patojenlerin gelisimini engeller, bagisiklik sistemini güçlendirir, yara iyilesmesini kolaylastirir ve tümör hücrelerinin gelisimini engeller. Bu amaçla saglikli insan diski örneklerinden izole edilen birçok mikroorganizma tarafimizdan degerlendirilmistir. Bulus için söz konusu mikroorganizma L. plantarum MK55 daha önce yapilan in vitro ve in vivo çalismalar ile bazi üstün probiyotik özellikleri belirlenmis bir sustur. Bulus olan L. plantarum MK55 susunun CT-26 ve HCT-l 16 kolon kanseri, HeLa rahimagzi kanseri ve MDA-MB-23l meme kanseri hücre hatlari üzerinde yapilan in vitro çalismalar ile de antiproliferatif etki gösterdigi belirlenmistir. Bulusta yer alan MK557in ülkemizde sik görülen üç kanser tipine ait hücre hatlarina karsi antikanser etki göstermesi ile ülkemiz insanlarinin kanser tedavisinde yararlanmasina fayda saglayacagina inanilmaktadir. Sekillerin Açiklanmasi Sekil 1: L. plantarum MK55°in mikroskobik görüntüsü Sekil 2: L. plantarum MK55"in düsük pH ve safra tuzu içeren besiyerlerinde gelisme durumu Sekil 3: MK55, MK45 ve MK73 suslarinin düsük pH ve safra tuzu içeren besiyerlerinde gelisme durumlari Sekil 4: L. plantarum MK55 ve diger suslarin asidik kosullarda (pH 3.5) canlilik durumlari Sekil 5: L. plantarum MK55 ve diger suslarin %03 safra tuzu içeren besiyerinde canlilik durumlari Sekil 6: L. plantarum MK55"in proteolitik aktivitesine ait görüntü Sekil 7: MK55, MK45 ve MK73 suslarinin antioksidan aktiviteleri (%) Sekil 8: MK55, MK45, MK73 ve LGG suslarinin antioksidan aktiviteleri (%) Sekil 9: L. plantarum MK55iin (IT-26 (kolon kanseri hücre hatti) gelismesini baskilama yetenegi Sekil 10: L. plantarum MK55 ve LGG"nin MTT ile belirlenen hücre baskilama yetenegi Sekil 11: Gruplara göre in vivo TNF -u ölçümleri (SK=Saglikli kontrol, HK=Hasta kontrol) (mg/L) Sekil 12: L. plantarum MK55'in in vivo TNF-a degerleri (mg/L) Sekil 13: L. plantarum MK55, LPS ve LGG'nin TNF-a degerleri (mg/L) Sekil 14: Gruplara göre in Vivo lFN-y ölçümleri (SK=Saglikli kontrol, HK=Hasta kontrol) (mg/L) Sekil 15: L. plantarum MK55"in in vivo lFN-y degerleri (ng/L) Sekil 16: L. plaiitarum MK55, ISA, LGG*, DER ve LGG**`nin lFN-y degerleri (ng/L) Sekil 17: Gruplara göre in Vivo lL-l 0 ölçümleri (SK:Saglikli kontrol, HK:Hasta kontrol) (pg/mL) Sekil 18: L. plantarum MK55ain in Vivo IL-lO degerleri (pg/mL) Sekil 19: L. plantarum MK55, LPS ve LGGlnin IL-lO degerleri (pg/InL) Sekil 20: L. plantarum MK555in in Vivo bagisiklik sistemi hücrelerine etkisi (%) Sekil 22A: L. plantarum MK55"in mikroskobik görüntüsü Sekil 22B: L. plantarum MK55°in parçalanmadan önce mikroskobik görüntüsü Sekil 22C: L. plantarum MK55`in parçalandiktan sonra mikroskobik görüntüsü Sekil 23A: HeLa rahimagzi kanseri hücre hattinin mikroskobik görüntüsü Sekil 23B: L. plantarum MK55 hücre içerigi uygulamasinda sonra HeLa rahimagzi kanseri hücre hattinin mikroskobik görüntüsü Sekil 24: L. plantaruni MK55 hücre içeriginin kanser hücre hatlarinda canliliga etkisi Sekil 25: L. plantaruni 5BL metaboliti uygulanan kanser hücre hatlarinda canlilik düzeyleri Sekil 26A : BB olarak gelistirilmis kanser hücre hatlarina ait deneysel görüntü Sekil 26B : 3B olarak gelistirilmis HeLa rahim agzi kanseri hücre hatti Sekil 26C : L. plantarum MK55 hücre içerigi uygulamasindan 24 saat sonra HeLa rahim agzi kanseri hücre hattinin görüntüsü Sekil 27A: Invazyon deneyi sonucunda HCT-116 kolon kanseri hücre hattinin mikroskobik görüntüsü Sekil 27B: Invazyon deneyinde L. plantarum MK55 hücre içerigi uygulanan HCT-116 kolon kaiiseri hücre hattinin mikroskobik görüntüsü Sekil 28: MK55 hücre içerigi uygulanan ZB ve 3B HCT-llÖ kolon kanseri hücre hatlarinin gen ekspresyonlarindaki degisim Sekil 29: MK55 hücre içerigi uygulanan 2B ve ?B HeLa rahimagzi kanseri hücre hatlarinin gen ekspresyonlarindaki degisim Sekil 30: MK55 hücre içerigi uygulanan 2B ve 3B MDA-MB-23l meme kanseri hücre hatlarinin gen ekspresyonlarindaki degisim Sekil 31: ACTB"nin SDS-PAGE"de bant profili Sekil 32: CASP3'ün SDS-PAGE"de bant profili Sekil 329deki Referans Numaralarinm Açiklanmasi Referans Açiklamasi Sl Kontrol (ZB) SZ L. plantarum MK-55 (ZB) S3 Kontrol (BB) S4 L. plantarum MK-55 (BB) Bulusun Detayli Anlatimi Günümüzde, ticari olarak kullanilan probiyotikler genellikle bagisiklik sistemi güçlendirici ve bagirsak mikrotlorasinin düzenlenmesi gibi durumlarda kullanilmaktadir. Yapilan çalismalar ile probiyotiklerin bu özellikleri disinda sagligi destekleyici pek çok üstün özelligi belirlenmistir. Probiyotiklerin antikanser etki göstermeleri de sinirli sayida çalismaya konu olmus önemli bir özelliktir. Bu bulusta L. plantarum MK55 hücre içeriginin üç farkli kanser hücre hatti (kolon, rahimagzi, meme kanseri) üzerine antikanser etkisi in vitro çalismalar ile belirlenmistir. Bu amaçla saglikli insan diski örneklerinden izole edilen birçok mikroorganizma tarafimizdan degerlendirilmistir. Bulus için söz konusu mikroorganizma L. plantarum MK55°in yukarida bahsedilen probiyotik olma özelliklerini gösterdigi belirlenmistir. Ayrica tümör baskilama yetenegi açisindan in vitro ve in vivo degerlendirmeleri yapilmis ve olumlu sonuçlar elde edilmistir. Bulus konusu L. plantaruin MK55"in karakteristik özellikleri ve çalismada kullanilacak örneklerin hazirlanmasi, yapilan çalismanin metodolojisi ve çalisma sonuçlari asagida verilmektedir. Örneklerin t0planmasi, hazirlanmasi ve suslarin tanisi: -45 yas arasi 12 saglikli bireyden alinan diski örnekleri izolasyon materyali olarak kullanilmistir. Diski örnekleri alinirken, sindirim sistemi sorunlari olmayan, kronik bir hastaligi bulunmayan, kisa zaman zarfinda yasam tarzini ve diyetini degistirmemis, dönemsel hastalik geçirmeyen, sürekli kullandigi bir ilaç bulunmayan, probiyotik ürün kullanmayan, son 2 ay süresince antibiyotik kullanmamis, bagisiklik sistem rahatsizligi olmayan ve saglikli oldugu düsünülen bireyler seçilmistir. Diski örneklerinin ortasindan aseptik kosullarda numune alinarak steril fizyolojik tuzlu su ile homojen hale getirilmistir. Diski örneklerinden seri seyreltmeler (104-107) hazirlanmistir. Hazirlanan seyreltmelerden steril MRS kati besiyerine yayma kültür yöntemiyle ekim yapilmistir. Bu plaklar 37°Cide 48 saat inkübe edildikten sonra olusan koloniler incelenmis ve birbirinden farkli koloniler seçilerek, Gram boyama yapilmistir (Sekil 1). Gram tepkimesi (+) olan suslarin izolasyonu yapilmistir. Bunu takip eden satlastinna asamasinin ardindan katalaz tepkimesi (-) olan suslarin tanisi MALDI Biotyper (Bruker Daltonik, Germany) cihazi ile yapilmistir. Tek koloniden küçük bir miktar tahta çubuk ile plakaya sürülmüs ve üzerine 1 uL matriks solüsyonu (d-cyano-4-hydroxycinnamic acid in 50 acetonitrile/%2.5 trifuoroacetic acid, Bruker Daltonics, Bremen, Almanya) eklenmistir. Sistemle çalisirken lineer pozitif iyon modunda ve 1.700-1999 Da kütle araliginda, mikroorganizma tanimlama için optimize edilmis uygun yöntem ile çift ölçümler gerçeklestirilmistir. Her bir bakterinin tanimlamasi yaklasik 5 dakikalik bir süre içinde tainamlanmistir. Kültürler, -80°C'de %20 gliserol içeren MRS sivi besiyerinde kullanilincaya kadar muhafaza edilmistir. Diski kökenli izolatlar arasinda üstün probiyotik ve CT-26 kolon kaiiseri hücre hattina karsi antikanser özelliklere sahip olanlarin belirlenmesi amaciyla asagida verilen in vitro ve in Vivo denemeler yapilmistir. Düsük pH°ya ve safra tuzuna dayaniklilik testi: Yukarida belirtilen kosullarda muhafaza edilen ve tanisi yapilmis L. plantarum MK55 ve kiyaslama amaciyla kullanilacak diger laktik asit bakterileri (MK45, MK73) iki kez MRS (deMan, Rogosa, Sharp) sivi besiyerinde 37°C"de 16-18 saat gelistirilerek aktiflestirilmistir. Izolatlarin asit toleransini belirlemek için pH"si aseptik kosullarda 3.5`e ayarlanmis MRS sivi besiyerine aktif bakteri kültürlerinden %1 oraninda asilanmistir. Benzer sekilde %03 safra tuzu içeren ayni besiyerlerine de 650 nm dalga boyunda optik yogunluklarindaki degisim tespit edilinistir (Sekil 2, Sekil 3). Ayrica inkübasyonun baslangicinda ve sonunda alinan örneklerden seri seyreltmeleri hazirlanarak MRS kati besiyerine damla kültür yöntemiyle ekim yapilmistir. Bu Petri plaklari 37°C'de 48 saat inkübe edilerek gelisen koloniler sayilmistir (Sekil 4, Sekil 5). Sekil 4 ve 5'de görülen L. rhamnosus GG`ye ait düsük pH ve safra tuzu dayaniklilik sayim sonuçlari kiyaslama yapilabilmesi için farkli bir kaynaktan alinmistir (Mirlohi, M., Soleimanian-Zad, S., Dokhani, S., Sheikh-Zeinodin, M., Abghary, A. commercial probiotics by growth and survival studies, lraiiian Jouriial of Biotechiiology, 2009, ?(4), 233-240). Ekzopolisakkarit üretimi ve proteolitik aktivite belirlenmesi: EPS üretiminin belirlenmesi için skimmilk, sükroz, rutenyum kirmizisi ve agardan olusan kati besiyerine 18 saatlik aktif kültürlerden ekim yapilmistir. 37°C'de 48 saat inkübe edilen Petri plaklarinin yüzeyinde beyaz koloni olusumu EPS pozitif (+), pembe koloni olusumu negatif (-) olarak degerlendirilmistir. Koloni etrafinda seffaf zon 01usumu ise susun proteolitik aktivite gösterdigi seklinde degerlendirilmistir (Sekil 6). Antioksidan aktivitenin belirlenmesi: Suslarin antioksidan aktivitelerinin belirlenmesi için yöntemi kullanilmistir. Kültür süpernatanti ve hücre içerikleri elde edilip, örnekler DPPH yöntemi için hazir hale getirilmistir. l uM"lik DPPH çözeltisi (0.0394 g/ etanol ile hazirlanmistir. 30 dakika karanlikta bekletilmis ve spektrofotometrede 517 nm"de etanole karsi Okumalari yapilmistir (Sekil 7). Suslarin antioksidan aktivitesi asagidaki formülle hesaplanmistir. Hesaplama: DPPH-Örnek x 100( 0/0 50 inhibisyon beklenir). LGG7ye ait DPPH yöntemi ile belirlenen antioksidan aktivite verileri farkli bir kaynaktan alinarak kiyaslama yapilmistir (Xing, J., Wang, G., Zhang, Q., Liu, X., Gu, Z., Zhang, H., Chen, Y. Q., Chen, W. Determining antioxidant activities of lactobaeilli cell-free supernatants by cellular antioxidant Antibiyotik duyarliliklarinin belirlenmesi: Kültürlerin yogunluklari McFarland ölçüm cihazi kullanilarak lie ayarlanmistir. Duyarlilik denemeleri disk difüzyon yöntemi kullanilarak gerçeklestirilmistir. Seçilen antibiyotik diskleri ampieillin (10 tig), U), streptomycin (10 ug), tetraeyeline (10 ug) ve vancomycin (30 ugýdir. Diskler 100 uL bakteri susu inoküle edilmis MRS agar besiyerine yerlestirilerek 37°C'de 24 saat inkübasyona birakilmistir. Daha sonra, disklerin çevresindeki inhibisyon zonlarinin çaplari ölçülmüstür. Sonuçlar (2 okuma ortalamasi) standart disk difüzyon yöntemine göre duyarli, orta düzeyde duyarli veya dirençli olarak Klinik ve Laboratuvar Standartlari Enstitüsü (CLSI) kilavuzlarina (CLSI 2016) göre degerlendirilmistir (Çizelge Çizelge 1. MK55, MK45 ve MK73 suslarinin antibiyotik duyarliliklari Mikroorganizma AMP C CN E K P S TE VA MK45 I R R R R R R 1 R MK73 S R R 1 R R R R R R = Resistant, dirençli; 1 = interrnediate, orta üzeyde dirençli; S = susceptible, duyarli; AMP=ampicillin B, C=chloramphenicol, CN=gentamicin, E=erythromycin, K=kanamycin, P=penicillin, S=streptomycin, TE=tetracycline, VA=vancomycin. Hücre kültürü ve mikroorganizmalarin hazirlanmasi: Kolon kanseri hücre hatti (CT-26) Dulbecco"s Modified Eagle's Minimal Essential Medium (DMEM) içerisinde çogaltilmistir. Besiyeri %10 fetal bovine serum (FBS) ve %5 penisilin/streptomisin eklenerek hazirlanmistir. Hücreler 37°Cade %5 CUZ içeren karbondioksit inldibatöründe gelistirilmistir. Laktobasil suslarinin 18 saatlik taze kültürleri üretilmistir. Kültür santrifüjlenip süpernatant ayrilmis ve besiyerine salinan bakteri metabolitlerinin antikanseroj enik etkisini belirleniek üzere saklanmistir. Pelet bir kere Phosphate-Buffered Saline (PBS) ile yikanarak her biri 108 hücre/mL olacak sekilde iki tüp hazirlanmistir. Tüplerden birindeki bakteri hücreleri Ultrasonik 1000 sonikatör kullanilarak 50 W'de buz içerisinde 30 dakikalik araliklar ile 3 kez 1 "er dakika boyunca kirilarak hücre içerigi açiga çikarilmistir. Bu sekilde hazirlanan hücre içerigi ve herhangi bir islem yapilmamis bütün haldeki hücreler antikanserojenik özelliklerini belirlemek üzere -80°C,de saklanmistir. MTT Testi: CT-26 hücreleri 96 kuyucuklu plakalara ekilip 37°C"de 24 saat %5 COz içeren karbondioksit inkübatöründe inkübe edilmistir. Bakteri, bakteri süpernatanti ve hücre içerigi bir gün önce hazirlanan 96 kuyucuklu plakadaki CT-26 hücreleri üzerine 4 paralelli olarak eklenmistir. Bu islem sonrasinda plakalar 37°C"de 48 saat bekletilmistir. Daha sonra kuyucuk basina 20 uL MTT (3-(4,5-dimetilthiazol- 2-il)-2,5-difeniltetrazolyum bromür) çözeltisi ilave edilmistir ve 37OC'de 4 saat süreyle bekletilmistir. Inkübasyon bitiminde kuyucuklara eklenmistir. Hafifçe çalkalanarak 5 dakika bekletilmistir. Bekleme süresi sonunda plakalar spektrofotometrede 540 nm/69O nm dalga boyunda okutulmustur (Sekil 9, Sekil 10). Her iki sekilde görülen LGG"nin Caco-2 ve HT- 29 hücre hatlarina ait MTT verileri karsilastirma yapabilmek için farkli bir kaynaktan alinmistir (Sadeghi-Aliabadi, H., Mohammadi, F., Fazeli, H., Mirlohi, M. Effects of Lactobacillus plantarum A7 with probiotic potentia] on colon cancer and normal cells proliferation in comparison With a TB dislama testi: inkübatöründe inkübe edilmistir. Bakteri, bakteri süpernatanti ve hücre içerigi bir gün önce hazirlanan 24 kuyucuklu plakadaki (IT-26 hücreleri üzerine eklenmistir. Çalisma paralel olarak gerçeklestirilmistir. Bu islem sonrasinda plakalar 37°C"de 48 saat inkübe edilmistir. Her bir örnek oraninda trypan blue ile boyanmistir. Thoma Lami ile sayim yapildiktan sonra sonuçlar asagidaki formüle göre hesaplanmis ve elde edilen veriler Çizelge 2'de verilmistir. Çizelge 2. TB ile canli hücre sayimi sonuçlari (%) Mikroorganizma TB (%) L. mucosae MK45 32.4 L. plantarum MK55 24.0 L. paracasei MK73 41.1 Balb/c cinsi, 8-10 haftalik, 32 adet erkek fare hayvan denemesinde kullanilmistir. Deneme deseni Çizelge 37de görülmektedir. Suslar her gün asagida belirtilen gruplara gavajla verilmistir. Çizelge 3. Deneme gruplari ve uygulamalar Gruplar Ilk Uygulama Ikinci Uygulama 1. grup (SK)* - - 2. grup MK55 (3 hafta boyunca her gün) CT-26 (3.hafta) 3. grup MK45 (3 hafta boyunca her gün) (IT-26 (3.hafta) 4. grup MK73 (3 hafta boyunca her gün) CT-26 (3.hafta) . grup CT-26 (Baslangiç) MK55 (4. hafta sonrasi her gün 3 hafta boyunca) 6. grup CT-26 (Baslangiç) MK45 (4. hafta sonrasi her gün 3 hafta boyunca) 7. grup CT-26 (Baslangiç) MK73 (4. hafta sonrasi her gün 3 hafta boyunca) 8. grup (HK)** CT-26 (Baslangiç) - *SK: Saglikli Kontrol grubu **HKz Hasta Kontrol grubu Uygulama süresi sona erdiginde bütün gruplardan doku ve kan örnekleri alinmistir. Asagida verilen analizler yapilmistir. ELISA yöntemi ile TNF-u, lFN-y ve lL-10 sitokin düzeyi belirlenmesi: Farelerden alinan kan örnekleri; sogutmali santrifüjde (+4°C), 2500 rpm'de 15 dakika süresince santrifüj edilerek plazma örnekleri elde edilmistir. Plazma örnekleri ELISA ile Mouse TNF-a (Sekil degerlendirmesi için kullanilmistir. Kit prosedürü: 1. Bütün çözeltiler, örnekler ve standartlar hazirlanir. 2. Hazirlanan Örnekler, standartlar ve ELISA çözeltileri 96 kuyucuklu plakaya belirtilen miktarlarda eklenir. 37°C,de 60 dakika bekletilir. 3. Bes kere yikama yapilir ve kromojen çözeltileri A ve B eklenir. 37°C`de 10 dakika bekletilir. 4. Reaksiyonun sonlandirilmasi için stop çözeltisi eklenir. . Plazma örneklerindeki antikor seviyesine bagli olarak farkli yogunlukta sari renk meydana 6. Absorbanslar 10 dakika içinde ELISA okuyucu kullanilarak 460 nmide okunur. 7. Hazirlanan standart kurve esas alinarak standart egri denklemi ile hesaplama yapilir. Yukarida belirtildigi sekilde saptanan TNF-(I, IFN-y ve IL-lO sonuçlari arastirmada kullanilan farkli suslar ile kendi içerisinde degerlendirilmistir. Bunun yani sira kiyaslama amaciyla LGG"nin ELISA ile TNF-Ct (Sekil 13) ve lL-10 (Sekil 19) verilerinin degerlendirildigi farkli bir kaynaktan da faydalanilmistir (Pefia, J. A., Versalovic, J. Lactobacillus rhamnosus GG decreases TNF-d production in lipopolysaccharide-activated murine macrophages by a contact-independent mechanism. Cellular Microbiology, verileri kiyaslama amaciyla asagida verilen kaynaktan alinmistir (Pohjavuori, E., Viljanen, M., Korpela, R., Kuitunen, M., Tiittanen, M., Vaarala, O., Savilahti, E. Laetobacillus GG effect in inereasing lFN- gamma production in infants With cow`s milk allergy. The Journal of Allergy and Clinical Akim sitometri ile NK, CD8, CD3 ve Mac-3 düzeylerinin belirlenmesi: Akim sitometri ile NKl, CDSa, CD3 ve Mac-3 düzeylerini belirleyebilmek amaciyla farelerden alinan dalaklardan lenfosit izolasyonu gerçeklestirilmistir. Bu islem için; 1. Dalak fizyolojik tuzlu su ile yikanir. 2. Içinde 20 InL RPMI-1640 besiyeri olan Petri kabina alinarak bistüri vasitasiyla parçalanir veya 3. Islem sonunda Petri içindeki RPMI besiyeri, pastör pipeti yardimiyla partikülleri almadan dikkatlice çekilerek 10 mL'lik etilen diamin tetra asetik asit (EDTA) içeren tüpe alinir ve renk degisimine bakilir. Rengi sararirsa hücreler ölü demektir. Renk sararmamissa bos bir polipropilen tüpe alinir. Bos tüpe alinan numunenin üzerine 5 ml PBS solüsyonu eklenir. 3991:" Süre bitiminde tüpler santritüjden alinir ve tüplerin orta kisminda olusan lenfosit tabakasi pastör pipeti yardimiyla baska bir tüpe aktarilir. 8. Alinan lenfositler PBS ile bir kere yikanir ve akim sitometri antikor boyamalarinin yapilacagi tüplere belirtilen miktarlarda paylastirilir. Izole edilen 25"er uL lenfosit örnekleri ile 10"ar pL monoklonal antikor kullanilarak yüzey boyamalari yapilmistir. Bu sekilde hazirlanan örnekler 25°Clde 30 dakika karanlikta inkübe edilmistir. Akim sitometri cihazi (BD FACSCanto Il Flow Cytometer, New Jersey, USA) kalibre edildikten (BD FACSDivaTM CS&T Bead Lot, New Jersey, USA) sonra örnekler cihaza verilmistir. Analiz bölgesinde negatif izotipik kontrolün Iloresanindan (Kirmizi-PE ve Yesil-FITC) daha yogun Iloresan gösterenlerin toplam popülasyon içerisindeki yüzdelerinin (ilgili antijeni tasiyan hücre yüzdesi) saptanmasi yoluyla sonuçlar degerlendirilmistir (Sekil 23). Immünofloresan degerlendirme: Alinan kolon dokulari. 4 gflOO mL paraformaldehit ile 1 gün fikse edildikten sonra %20 sükroz ile 1 gün yikanmis ve kriomatriks ile dondurularak kriomikrotomda 5 pm"lik seri kesitler süperfrost lamlara alinmistir. Metanol/aseton karisiminda 5 dakika tutulduktan sonra 3 kez soguk PBS ile yikanmistir. 1 saat inkübe edilmistir. Ardindan primer antikor l pg/mL Ki67 ile +4°C7de 1 gece inkübe edilmistir. Soguk PBS ile yikamanin ardindan Sekonder Ab. 1/400 oraninda oda sicakliginda 30 dakika uygulanmistir. PBS ile tekrar yikanmis ve DAPI"li kapatma medyumu (Vector Lab) ile kapatilarak Iloresan mikroskopta incelenip, fotograflanmistir (Sekil 21). Daha Önce farkli arastirmacilar tarafindan LGG kullanilarak yapilmis benzer bir deneysel Çalisma saptanamadigindan bu çalismada izole edilen farkli suslar kendi arasinda kiyaslanmistir. Bulusta sadece probiyotik olma özellikleri bulunmamaktadir. Bu özelligin yani sira, bulus konusu yeni bakteri susunun ayni zamanda hem in vitro (laboratuvar denemeleri) hem de in vivo (fare denemeleri) olarak tümör baskilama yetenegi degerlendirilmistir. Bu degerlendirme için; fare deney gruplari Özenle planlanmis ve bulusun uygulamalari yapilmistir. Fare denemelerinde de olumlu sonuçlar elde edilmistir. Yapilan çalismalarin tüm basamaklari yukarida açiklanmis, çalisma sonuçlari da verilen grafiklerle ispatlanmistir. Bu açidan söz konusu izole edilen yeni susun ve bu susa ait gen dizilerinin teknik etkisinin bilinen teknikteri açik bir sekilde çikarilamayacagi ve yapilan in vitro ve in vivo çalismalar sirasinda saptanan probiyotik aktivitesinin yani sira tümör baskilama etkisi sayesinde bulus niteliginde oldugu düsünülmektedir. Bulusun bilinen teknikten daha üstün yani olarak belirtilen probiyotik olma özelligini saglamasi ve sindirim sistemi kosullarina dayanmasi özelligi; L. plantarum MK55"in düsük leya ve safra tuzlarina dayanikliligi diger suslarla karsilastirilarak verilmistir. L. plantarum MK55"in ekzopolisakkarit üretimi ve proteolitik aktivitesi özellikleri degerlendirildiginde; susun EPS üretimi uygulanan yöntemle belirlenememis olmasina ragmen proteolitik aktiviteye sahip oldugu saptanmistir. Proteolitik aktiviteyle biyoaktii` peptitler açiga çikmaktadir. Biyoaktif` peptitlerin tümör baskilayici etkilerinin oldugu gösterilmistir. Biyoaktif peptitler programlanmis hücre ölümünün yolagim aktiflestirerek tümör hücrelerini baskilayabilmektedir. L. plantarum MK55'in antioksidan aktivitesinin tümör baskilama yetenegi ile baglantili olabilecegi sonucuna varilmistir. L. plantarum MKSSSIn bir diger özelligi antibiyotik direncine sahip olmasidir. Çesitli hastaliklarin tedavisinde kullanilabilecek antibiyotiklerden birçoguna direnci bulunmaktadir. Böylece hastalara antibiyotik verildiginde MK55 canliligini koruyabildiginden saglik üzerine olumlu etkilerini sürdürmesi mümkün olabilecektir. MTT ve TB deneyleri in vitro olarak yapilmis olup, söz konusu bulusun tümör baskilama yeteneginin belirlenmesinde rol oynamislardir. TNF-a, IFN-y ve lL-lO sitokin düzeylerine ve NK, CD8, CD3 ve Mac-3 düzeylerine bakildiginda in vivo olarak bulusun bagisiklik sistemini güçlendirme ve tümör baskilama özelligi gösterdigi görülmüstür. Bulusun Ki67 ekspresyonuna etkisi degerlendirildiginde, in vivo olarak kolon dokusunda tümör baskilama yetenegi görülmektedir. Benign ve malign birçok hücrenin Ki-67 ile boyandigi çogalmasina rastlanmamis ve Ki-67 boyamasi negatif olarak izlenmistir. MK45 ve MK73 gruplarinda nispeten hücre çogalmasi yani Ki-67 ile boyanan hücreler var olmasina ragmen, bunlarin miktar olarak hasta kontrol grubundan daha az oldugu görülmektedir. Üstün probiyotik ve antikanser özelliklere sahip oldugu belirlenen MKSS susunun herhangi bir kültür koleksiyonunda bulunmayan ve daha önce diger arastirmacilar tarafindan izole edilmemis yeni bir mikroorganizma oldugunun ispatlanmasi amaciyla hizmet alimiyla asagida ayrintilari verilen yöntemlerle tüm genom dizisi belirlenmistir. Tüm Genom Dizileme Yöntemi: DNA Izolasyonu ve Kalite Kontrol: Izole edilmis DNA'lara ait kalite kontrol islemlerinde spektrofotometrik ve florometrik yöntemler kullanilarak, miktar ve saflik tayini yapilmistir, Ölçümlerde NanoDrop ve Qubit 1.8260/230 belirlenmistir. Kütüphane Hazirligi ve Dizileme: Kütüphane hazirlik basamaginda Nextera DNA Flex Library Prep Kitl (illumina) kullanilmistir. Kütüphane hazirlik sürecinde sirasiyla fragmentasyon, index/barkod dizilerinin eklenmesi, amplifîkasyon ve pürifikasyon islemleri üretici firmanin kit yönergeleri takip edilerek gerçeklestirilmistir. Dizileme çalismasinda illumina NextSeq 550 (illumina) yeni nesil dizileme platformu ve uygun reaktiileri kullanilmistir. Bu basamakta Örnek basi ~2 milyon çift yönlü (paired- end) 2 x 150 bp'lik okuma elde edilmesi planlanmistir. Bu deney tasarimina göre örnek basina ~1.2 Gb veri çiktisi ile genom boyu ortalama ~150x okuma derinligi elde edilmesi planlanmistir. Biyoinformatîk Analiz: Okuma isleminden sonra elde edilen verilerin kalite kontrolü yapilmistir. Çalismada bu amaçla FASTQC programi kullanilmistir. Dizileme sürecinde F astqc okuma verilerindeki düsük kalitedeki baz Okumalari sonraki analiz basamaklarinda sapmalara neden olmamasi için okumalardan kirpilmistir. Kalite filtreleri ve kirpma islemleri için Trimmomatic kullanilmistir. Kirpma sonrasi hizalama islemlerinde Burrows-Wheeler Aligner ile güncel genom dizisine (Lactiplantibacillus plantarum WCFSl, GCAý hizalama yapilmistir. Hizalama sonrasinda, kalite kontrol verilerine göre filtreleme islemleri Samtools programi ile gerçeklestirilmistir. Analiz kapsaminda realignment ile in/del bölgelerindeki hizalama düzeltmelerinin yapilmasi, DNA dizilerinin kalite skor degerlerinin yeniden kalibre edilmesi, düzenlenmis dizilerdeki varyasyonlar için parametre optimizasyonlarinin yapilmasi, elde edilen varyasyon listesi için annotasyon islemi tamamlanmasi, varyasyon listeleri strand bias durumuna göre üst limit (%20) alinarak filtrelenmesi, tespit edilen varyasyon yüzdesine göre güvenilir olmayan ( TR TR