TARIFNAME çOK ASAMALI MIKRO VE BIYOLOJIK PARÇACIK MANIPÜLASYONU IçIN çOK KATMAN LI ENTEGRE AKUSTOFORETIK MIKRO AKISKAN CIHAZ Bulusun Ilgili Oldugu Teknik Alan Bulus; mikro ve/veya biyolojik parçaciklara uygulanacak olan entegre halde iki veya daha fazla asamali operasyonlarin, en az iki tanesinde akustoforez yöntemi kullanilarak tek bir mikroakiskan sistem içerisinde gerçeklestirilebildigi bir entegre akustoforetik mikroakiskan cihaz (EAMC) ile ilgilidir. Teknigin Bilinen Durumu Mikroakiskan sistemler genel olarak laboratuvar ortaminda yapilan biyolojik ve kimyasal islemlerin daha düsük maliyetle, daha hizli ve çogu zaman daha hassas yapilabilmesine olanak veren teknolojilerdir. Mikroakiskan sistemlerde gerçeklestirilen birçok uygulamada, mikrokanallar içerisinde biyoparçaciklarin hareketlerinin kontrol edilebilmesi gerekmektedir. Bu sistemler, genellikle kimya, biyoloji ve tip gibi yasam bilimlerinde kullanilmaktadir ve minyatür toplam analiz sistemleri (pTAS) veya yonga- üstü laboratuvar (lab-on-a-chip/LOC) Olarak da adlandirilmaktadir. LOC sistemleri, karmasik kimyasal yönetim ve analiz sistemlerini sadece milimetre veya santimetre boyutunda bir yonga üzerine entegre edebilen ve elektronik ve Optik algilama sistemleriyle etkilesime girebilen mikroakiskan platformlardir. Bu mikroakiskan yongalar sayesinde fiziksel etkilesimleri, kimyasal tepkimeleri ve biyolojik Olaylari birkaç milimetrelik veya santimetrelik bir yonga ile incelemek ve detayli analiz etmek mümkün olmaktadir. Ayrica; mikroakiskan teknolojisi, numune ve kimyasal ajan tüketimini azaltmakta, deney sürelerini kisaltmakta ve bu islemler için yapilan harcamalari düsürmektedir. Küçük hacimde örneklerin yeterliligi sayesinde ise; mikroakiskan teknolojisi, sadece birkaç santimetrekare büyüklügündeki tek bir çipte birçok laboratuvar protokolleri bir araya getirilebildiginden, bilinen laboratuvar tekniklerine iyi bir alternatif olusturmaktadir. Mikroakiskan sistemler kan hücresi ayristirilmasi, patojen/toksin belirleme, biyokimyasal ölçümler, kimyasal sentez, genetik analiz, ilaç taramasi, elektrokromatografi, yonga-üstü-organ gibi birçok uygulamada yaygin olarak kullanilmaktadir. Mikroakiskan yongalar silisyum, cam ya da polimer malzemeler (polidimetilsiloksan/PDMS, polimetil metakrilathMMA vb.) kullanilarak mikro imalat teknikleriyle üretilebilmektedir. Literatürde mikrokanallarda mikro ve biyolojik parçaciklarin manipülasyonu için hidrodinamik, elektrokinetik, akustik, manyetik ve optik olmak üzere birçok fakli yöntem önerilmistir [1]. Bu yöntemlerin çesitli avantajlari ve dezavantajlari bulunmaktadir. Özellikle klinik uygulamalarda kullanilan analizlerde, farkli proseslerin ayni mikro akiskan yonga üzerinde entegre ve yüksek sayida biyolojik parçacigin proses edecek sekilde olmasi önemlidir. Dolaysiyla, analizin makul sürelerde tamamlanmasi için sistemdeki islem hacminin (birim zamanda proses edilen parçacik sayisi) yüksek olmasi gerekmektedir. Bu kriteri en iyi saglayan seçeneklerden bir tanesi akustik dalgalari mikro ve biyolojik parçaciklarin manipülasyonunda kullanan akustoforez yöntemidir. Bu yöntem, mikroakiskan yonga üzerinde yaratilan akustik dalgalarin mikrokanal içerisinde duragan dalga olusturmasiyla parçaciklar üzerinde akustik basinç ile kuvvet olusturulmasi prensibine dayanmaktadir. Parçaciklari kanal duvarlarindan merkeze dogru iten kuvvet, akustik radyasyon kuvvetidir. Bu kuvvetlerin büyüklügü parçaciklarin boyutlarina, yogunluguna ve sikistirilabilirligine göre degismektedir. Farkli boyutlardaki veya türdeki parçaciklara uygulanan kuvvetler degiskenlik göstereceginden dolayi parçaciklar farkli konumlara hareket edebilirler. Kullanilacak akustik dalganin dalga boyu ve genligi mikroakiskan yonganin geometrik özellikleri ile ilgilidir. Yonga malzemesi akustik dalgalarin iletilebilmesi için önemli bir faktördür. Literatürdeki çalismalarda akustik sönümü düsük olmasi sebebiyle silisyum ve cam yongalar siklikla kullanilmaktadir. Akustoforetik mikroakiskan cihazlar hedeflenen bir operasyon için (parçacik ayirma veya odaklama vb.) tasarlandiginda, her ne kadar yonga kalinligi ve genisligi milimetre (mm) mertebesinde olabilse de operasyonun basarisi için boyu onlarca santimetre (cm) olabilmektedir. Dolayisiyla, ayni mikroakiskan sistem üzerinde iki veya daha fazla operasyon hedeflendigi zaman yonganin boyu makul seviyelerde olamamaktadir. Ayni zamanda akustik sönümü düsük malzemeden üretilen mikroakiskan yongalar. akustik dalgalari çok iyi iletmesi sebebiyle iki operasyon için tasarlanan akustoforez prensibine dayali bir mikroakiskan yonga içine tüm ünitelerde de ayni akustik frekansinin kullanilmasi gerekmektedir. Ayni frekansin kullanilmamasi, farkli üniteler için kullanilacak farkli frekanslarin girisim yaparak akustoforetik cihazin operasyonunu olumsuz yönde etkilemesine sebep olabilmektedir. Teknigin bilinen durumunda, farkli manipülasyon kaynaklarinin beraber çalistirilmasi birçok farkli kombinasyonda gösterilmistir. Örnegin; akustik kuvvetler ile dielektrik kuvvetlerin [2], optik kuvvetler ile akustik ya da dielektrik kuvvetlerin [3, 4], manyetik kuvvetler ile dielektrik kuvvetlerin [5] ve hidrodinamik ile dielektrik kuvvetlerin [6] kombinasyonlari farkli uygulamalar için bulunmaktadir. Akustik dalgalar son yillarda mikro ölçekte parçaciklarin ayrimi, odaklanmasi, yakalanip ve biriktirilmesi gibi görevlerde kuvvet kaynagi olarak sikça kullanilmis ve birçok uygulama alaninda basarili ve avantajli oldugu gösterilmistir [7-13]. Birden fazla akustik islemi, ayri ayri yongalar üzerinde gerçeklestiren P. Ohlsson vd. [14] akustik dalgalari kullanarak zenginlestirme ve yakalama islemleri için akustik iki ayri yonga kullanmislardir. Ancak; bu sistemin de dezavantajlari bulunmakta olup, bunlar; (i) test edilecek örneklerin hacminin yongalar arasi tasimanin plastik hortum ile saglaniyor olmasindan dolayi, gereginden fazla yol almasi, bu sebeple çökme, yapisma gibi istenmeyen durumlarla karsilasma riskinin olusmasi; (ii) ayri yongalar, yongalar arasi plastik hortum baglantilari hem görüntüleme islemini zorlastirmasi hem de kalabalik bir ortam olusturmasidir. Ayrica, tek yonga üzerinde farkli frekanslarda akustik uygulama yapilmak istendiginde ya frekans katlari kullanilmakta ya birbirinden çok uzak frekanslar etki için seçilmekte ya da yonganin boyu uzatilmaktadir [15-17]. Bunun en büyük nedeni de, uygulanan akustikfrekanslarin birbirine karisarak yapilmak istenen islemi bozmasini engellemektir. Literatürde üzerinde tek islem yapilan bir akustoforetik cihazin boyutlari boyu 5-20 cm araliginda, eni 5-20 cm araliginda ve yüksekligi 1-2 mm olacak sekilde üretilmektedir tip akustik sönümü düsük malzemeler genelde sert, kirilgan ve ince malzemelerdir (cam, silisyum, kaynasik silika, kuartz, silisyum karbür vb.). Birden çok islemin bir akustoforetik cihaz üzerinde yapildigi örneklerde, farkli islemlerin yapilacagi istasyonlar arasinda akustik dalga geçisini azaltmak için uzun yongalarin arka arkaya dizilmek zorunda kaldigi seri mimaride olan örnekler mevcuttur [14]. Bu durumda, genisligi ve kalinligi boyuna oranla küçük olan boyu 50 cm"leri bulabilen, kirilmadan paketlenmesi, tasinmasi ve ticarilestirilmesi zor laboratuvar prototipleri ortaya çikmaktadir. Ayrica tek yöndeki uzun kanallar çökme, yapisma gibi sorunlari ortaya çikarabilmektedir. Mikroakiskan sistemlerde mikro ve/veya biyolojik parçaciklara uygulanacak olan entegre halde iki veya daha fazla asamali operasyonlarin gerçeklestirilmesi için mevcut teknikteki çözümlerin yetersizligi ve dezavantajlari sebebiyle, mikro ve/veya biyolojik parçaciklara uygulanacak iki veya daha fazla islemin tek sistem içerisinde gerçeklestirilebilmesi için bir gelistirme yapilmasi gerekli kilinmistir. Bulusun Kisa Açiklamasi ve Amaçlari Mevcut bulusta, çok katmanli yapiya sahip bir akustoforetik mikroakiskan cihaz açiklanmaktadir. Bulusa konu cihaz ile, mikro ve/veya biyolojik parçaciklara entegre halde iki veya daha fazla islem tek sistem içerisinde uygulanabilmektedir. Bulusun bir amaci, mikro ve/veya biyolojik parçaciklara uygulanacak olan entegre halde iki veya daha fazla asamali operasyonlarin tek bir cihazda gerçeklestirilmesidir. Bulusa konu cihazda, içerdigi en az iki akustoforetik manipülasyon yapilabilen katman ve bu katmanlar arasinda yer alan yalitim katmani sayesinde en az iki islem entegre bir sekilde gerçeklestirilebilmektedir. Kullanilan akustik sönümlü malzemeden mamul yalitim katmani sayesinde, frekanslar arasi girisimler engellenmekte, böylece her yonganin islemi için yongalar arasi bozucu etkiler minimuma indirgenmektedir. Bulusun en önemli amaci, birden fazla manipülasyon tekniginin tek bir mikro akiskan cihaz içerisinde gerçeklestirilmesidir. Bulusa konu cihazda en az iki farkli biyoparçacik manipülasyon teknigi akustik bir biyoparçacik manipülasyon teknigi ayni anda uygulanabilmektedir. Katmanli bir yapiya sahip olan bulusa konu mikro akiskan cihazda katmanlarin arasinda akustik olarak yalitkan görevi görecek olan polimer bir malzeme bulunmakta ve bu da her bir katmanda farkli bir akustik frekans ile çalisan bir mikro akiskan ünitenin yerlestirilmesine olanak vermektedir. Bulusun bir diger amaci, mikro ve/veya biyolojik parçaciklara birden fazla islem uygulanmasi durumunda mevcut teknikte ortaya çikan çökme, yapisma, tasima gibi sorunlarin minimuma indirilmesidir. Bulusa konu cihazin katmanli yapisi sayesinde; kalabalik test ortami basitlestirilmekte, birden fazla islem yapilmasi için yonga boyunun uzatilmasina gerek kalmamakta ve bu sayede de yonga uzunlugundan kaynaklanan çökme, yapisma, tasima gibi sorunlar minimuma indirilmektedir. Sekillerin Açiklamasi Sekil 1: Iki katmandan olusan EMACinin kesit görünümü. Sekil 2: Ayirma ve zenginlestirme ünitelerinde olusan ortalama akustik basinç degerleri; A) polimer katmanli EAMC, B) polimer katmansiz EAMC. Bulusu Olusturan UnsurlarinlKisimlarin/Parçalarin Tanimlari Sekilde yer alan parça ve kisimlar numaralandirilmis olup, her bir numaranin karsiligi asagida verilmektedir: 1. Yonga Mikrokanal Piezoelektrik eyleyici Akis yolu deligi Yalitim katmani Bulusun Ayrintili Açiklamasi Bulus; entegre halde iki veya daha fazla asamali mikro ve/veya biyolojik parçacik manipülasyonuna dayali operasyonunun en az iki tanesinin akustoforez yöntemi kullanilarak tek bir mikro akiskan sistem içerisinde gerçeklestirilebildigi bir entegre akustoforetik mikro akiskan cihaz (EAMC) ile ilgilidir. Bulus konusu entegre akustoforetik mikro akiskan cihaz (EAMC); akustoforetik manipülasyon yapilabilen en az iki katman, akustoforetik manipülasyon yapilabilen katmanlar arasinda bir yalitim katmani (8), cihazin dis katmanlarinda numunenin cihaza yüklenmesini saglayan en az bir giris (5) ve numunenin cihazdan alinmasini saglayan en az bir çikis (6), katmanlar arasinda geçisi saglamak için en az bir akis yolu deligi (7) içermektedir. Bahsi geçen akustoforetik manipülasyon yapilabilen her bir katman; üzerinde kimyasal asindirma ve/veya mekanik isleme ile açilmis olan ve içerisinde mikro ve/veya biyolojik (hücre, bakteri, virüs vb.) parçacik bulunan sivilarin akmasi için mikrokanal (3) içeren, düsük akustik sönümlü malzemeden mamul bir yonga (1), yonga (1) içinde bir tarafi açik bir sekilde duran mikrokanaldaki (3) akis yolunun üzerini kapatarak mikrokanal yapisini olusturan, ayni zamanda sivi içindeki akustik dalgalari da yansitmada kullanilan akustik sönümü düsük bir malzemeden üretilen kapak (2), mikro ve/veya biyolojik parçaciklari ayirmada kullanilan akustik dalgalari üreten piezoelektrik eyleyici (4) içermektedir. Sekil 1'de bulusun bir uygulamasi olan iki katmanli akustoforetik mikro akiskan cihazin (EAMC) kesin görünümü verilmektedir. Her katmanda yonga (1), kapak (2) ve piezoelektrik eyleyicinin (4) Sekil 1'de gösterildigi sirada olmasi gerekliligi yoktur, bu üç bilesen ihtiyaca göre farkli siralamalarda dizilebilir. Örnegin yonga (1) üstte, kapak (2) altta veya tam tersi olabilir. Bulusta yonganin (1) mamul oldugu düsük akustik sönümlü malzeme; cam, silisyum, kaynasik silika, kuartz veya silisyum karbürden seçilebilir. Bulusun bir uygulamasinda kapak (2) yongaya yapistirilmaktadir. Bu yapistirma islemi kimyasal yapistiricilar ile (siyanakrilat vb.) ile gerçeklestirilebilir ya da kimi çip malzemeleri için yüzey plazma islemi ile aktif hale getirilerek cama tutturulabilir. Mikro ve/veya biyolojik (hücre, bakteri, virüs vb.) parçacik bulunan sivi, yonga (1) ile kapak (2) arasinda kalan mikrokanal (3) içerisinde akmakta ve akustik dalgalar yonga (1) içinde ilerleyerek mikrokanal (3) içerisindeki parçaciklari etkilemektedir. Piezoelektrik eyleyici (4) geometrik ihtiyaçlara göre yonganin (1) ya da kapagin (2) üstüne kimyasal yapistiricilar ile yapistirilabilir ya da çip/kapak ile piezoelektrik eyleyici arasina akustik dalga iletimini saglayan iletim sivisi (ultrasonik jel vb.) uygulanarak yonganin ya da çipin üzerine yapistirmadan yerlestirilebilir. Mikro ve/veya biyolojik parçaciklar giristen (5) cihaza yüklenir ve en az bir çikistan (6) alinir. Akis yolu deligi (7), katmanlar arasinda parçaciklari içeren sivinin geçisi için hem yonga hem yalitim katmaninin üzerinde delik açilmasi suretiyle olusturulmaktadir. Yalitim katmani (8), polimer malzemelerden (epoksi, çift tarafli bant, polidimetilsiloksan (PDMS) vb.) mamul edilmektedir. Cihazdaki katmanlarin her birinde farkli islemler gerçeklestirilebilmektedir. Bu islemlerden bazilari; parçaciklarin kanal içinde bir konuma yönlendirilmesi, ayrilmasi, zenginlestirme (konsantrasyon), saflastirma, karistirilmasi, kavitasyon ile parçalanmasi vb. olarak tanimlanabilir. Bu islemlerin etkin olarak gerçeklestirilebilmesi için, farkli kanal genislikleri ve rezonans frekans kanal genisligine bagli olmasi dolayisiyla farkli frekansta akustik dalga gereklidir. Ancak, her bir katman akustik olarak düsük sönümlü malzemelerden yapildigi için çok katmanli yapiya sahip bulusa konu cihazda bir katmandaki akustik dalgalar diger katmanlara geçerek yayilabilir. Bu durum farkli frekanslarda tahrik edilen diger katmanlardaki islemlerin gerçeklestirilmesini olumsuz etkileyebilir. Bu nedenden dolayi akustik dalgalarin yalitimini saglamak amaciyla her katmanin arasina akustik sönümü yüksek malzemeden olusan bir yalitim katmani (8) kullanilmaktadir. Uygulamanin ihtiyacina göre katman sayisi gerekli görüldügü kadar arttirilabilir. Her bir katman dikey eksende (z-ekseni) üst üste olacak sekilde konumlandirilmaktadir. Bulusun katmanli yapisi sayesinde, akustoforetik cihazlarda boyut oranlari daha dengeli, kalinligi arttigi için kirilmaya daha dayanakli, güvenli üretime imkân veren, paketleme ve tasima olanagi taniyan bir cihaz elde edilmektedir. Bulusun bir uygulamasinda, cihaz akustoforetik manipülasyon yapilabilen en az iki katmana ek olarak, en az bir elektrik/manyetik/optik/hidrodinamik manipülasyon yapilabilen katman içerebilir. Elektriksel manipülasyon yapabilen katmanda mikrokanala elektrotlar yerlestirilebilmektedir. Manyetik manipülasyon yapabilen katmanda mikrokanalin dis kismina veya cihazin dis kismina miknatislar yerlestirilebilmektedir. Optik manipülasyon yapabilen katmanda mikrokanalin dis kismina veya cihazin dis kismina isik kaynagi yerlestirilebilmektedir. Hidrodinamik manipülasyon yapabilen katmanda stratejik noktalarinda bazi engellerin, daralan ve/veya genisleyen bölgelerin bulundugu özel tasarlanmis mikrokanal mimarisi bulunabilir. Bulusa konu cihaz; iki veya daha fazla mikroakiskan yonganin (1) dikey eksende (z- ekseni) montajiyla elde edilmekte, içerde olusturulan akisin yongalar (1) arasinda transferi saglanmaktadir. Bu cihazda, görev tanimlari farkli olan her bir yongada yapilacak islemler (parçaciklarin/hücrelerin kanalin belli bir bölümüne yönlendirilmesi, birbirinden ayrilmasi, konsantrasyonunun arttirilmasi, saflastirilmasi, parçalanmasi vb.) entegre bir biçimde ve es zamanli olarak katmanli bir mimaride gerçeklestirebilmektedir. Her bir katmanda kullanilan farkli genlikler ve frekanslardaki akustik dalgalarin karsilikli iletimini ve karismasini engellemek adina her bir yonga (1) katmani arasinda yalitim katmani (8) bulunmaktadir. Bu yalitim katmani sayesinde form faktörü ticari bir ürüne uygun, paketleme, tasima ve modüler üretime olanak taniyan bir akustoforez cihaz elde edilmektedir. Her bir katmanin boyu 5-20 cm araliginda, eni 1-10 cm araligindadir. Her bir yonganin yüksekligi 0.5-2 mm, her bir kapagin yüksekligi 0.5-2 mm olacak sekilde üretilmektedir. Bu boyutlar sayesinde, cihaz uzunlugundan kaynaklanan çökme, yapisma, tasima vb. problemler asgariye indirilmektedir. Bulusta, katmanlar arasina konulari akustik sönümü yüksek malzemeden mamul yalitim katmaninin (8), katmanlar arasinda akustik dalgalarin geçisini nasil etkiledigi sayisal benzetim yaklasimi ile incelenmistir. Sayisal benzetimde kullanilan yöntem sonlu elemanlar metodudur. Sayisal olarak modellenen sistem, iki katmandan olusmaktadir. Birinci katmanda (Sekil lide üst yongadaki kisim, üst katman, ayirma ünitesi) parçacik ayirma, ikinci katmanda (Sekil 1'de alt yongadaki kisim, alt katman, konsantrasyon ünitesi) ise ayrilan parçaciklarin konsantrasyonun arttirilmasi hedeflenmistir. Üst katmandaki ayirma ünitesi için kullanilan piezoelektrik eyleyici (4) 60 V potansiyel farki altinda 600-740 kHz frekans araliginda çalistirilmistir. Ayirmanin basarili olmasi için, mikrokanal içinde piezoelektrik eyleyici (4) ile olusturulan akustik basinç ve kuvvetin üstteki ayirma ünitesindeki (birinci/üst katman) degerinin yüksek olmasi gerekmektedir. Ancak, üst katmanda olusan akustik kuvvetin alt katmana (konsantrasyon ünitesine) yüksek seviyede iletilmesi istenmemektedir. Çünkü, konsantrasyon ünitesi ikinci piezoelektrik eyleyici (4) ile (Sekil 1'de alt katmandaki piezoelektrik eyleyici (4)) farkli bir frekansta tahrik edilmektedir ve üst katmandan gelen akustik dalgalar konsantrasyon islemine bozucu etki yaratabilmektedir. Dolayisiyla, üst piezoelektrik eyleyici tarafindan alt katmandaki (konsantrasyon) kanalda olusan akustik basinç ve kuvvetin ortalama genliginin, üst katmandaki (ayirma ünitesi) ortalama akustik basinç ve kuvvetin genligine oraninin düsük bir deger olmasi istenmektedir. Alt katmanda olusan akustik basinçlarin üst katmana oranla düsük olmasi aradaki polimer katmanin katmanlar arasi akustik iletimi azalttigini göstermektedir. Bulusa konu entegre akustoforetik mikro akiskan cihazin akustik simülasyonlari, akustoforetik manipülasyon yapilabilen silikondan mamul katmanlar arasinda bir polimerden mamul bir yalitim katmaninin (8) bulundugu ve bulunmadigi iki durum için gerçeklestirilmistir. Bu iki katmanli ünite üzerindeki sayisal benzetimler arada sönümleyici polimerden mamul yalitim katmani (8) olan ve olmayan bir sistem için yapilmis ve sonuçlar farkli frekanslarda Tablo 1'de verilmistir. Teorik olarak aradaki polimer katmanin akustik sönüm orani yüksek oldugu için ve polimer katman içinde dalga boylari kisa oldugu için, polimer malzeme içine giren akustik dalgalar polimer katman içinde yavaslamakta ve yüksek sönüme maruz kalmaktadir. Bu da alt katmana geçen akustik dalgalarin genliklerinin düsmesini gerektirmektedir. Tablo 1 görülebilecegi üzere teori ile sayisal benzetimin örtüstügünü göstermektedir. Arada yalitim katmani olan cihazda ortalama akustik basinç kuvvetin oranlari tüm frekanslarda katman olmayan sisteme göre daha düsük çikmistir. Bu da farkli frekanslarda iletimin sönümlü katman tarafindan yari yariya, binlerce kata kadar farkli degerlerde engellendigi görülmektedir. Ayrica, polimer katmanli sistem için sayisal benzetim sonuçlari polimer katman olmayan sisteme göre üst kanalda daha yüksek akustik basinç oldugunu göstermektedir. Bunun nedenin polimer katmanin alt katmana akustik enerji akisini düsürmesi ve bunun sonucunda üstteki katmanda basinçlarin yükseltmesi oldugu düsünülmektedir. Sayisal benzetimler farkli katmanlarda farkli islemlerin birbirinin çalisma performansini etkilemeden gerçeklesmesi için katmanlar arasina sönümü yüksek yalitim malzemesinin konulmasinin gerekliligini göstermistir. TR DESCRIPTION MULTI-LAYER INTEGRATED ACOUSTOPHORETIC MICROFLUIDIC DEVICE FOR MULTI-STAGE MICRO AND BIOLOGICAL PARTICLE MANIPULATION Technical Field to which the invention relates Invention; It is about an integrated acoustophoretic microfluidic device (EAMC) in which two or more integrated operations to be applied to micro and/or biological particles can be performed in a single microfluidic system, using the acoustophoresis method in at least two of them. State of the Art Microfluidic systems are technologies that generally allow biological and chemical processes performed in the laboratory environment to be carried out at a lower cost, faster and often more precisely. In many applications carried out in microfluidic systems, the movements of bioparticles within microchannels must be controlled. These systems are generally used in life sciences such as chemistry, biology and medicine and are also called miniature total analysis systems (pTAS) or laboratory-on-a-chip (LOC). LOC systems are microfluidic platforms that can integrate complex chemical management and analysis systems on a chip just millimeter or centimeter in size and interact with electronic and Optical sensing systems. Thanks to these microfluidic chips, it is possible to examine and analyze in detail physical interactions, chemical reactions and biological events with a chip of a few millimeters or centimeters. Moreover; Microfluidic technology reduces sample and chemical agent consumption, shortens experiment times and reduces expenses for these processes. Thanks to the sufficiency of small volumes of samples; Microfluidic technology represents a good alternative to known laboratory techniques, as many laboratory protocols can be combined on a single chip just a few square centimeters in size. Microfluidic systems are widely used in many applications such as blood cell separation, pathogen/toxin detection, biochemical measurements, chemical synthesis, genetic analysis, drug screening, electrochromatography, organ-on-chip. Microfluidic chips can be produced using microfabrication techniques using silicon, glass or polymer materials (polydimethylsiloxane/PDMS, polymethyl methacrylateMMA, etc.). Many different methods, including hydrodynamic, electrokinetic, acoustic, magnetic and optical, have been proposed in the literature for the manipulation of micro and biological particles in microchannels [1]. These methods have various advantages and disadvantages. Especially in analyzes used in clinical applications, it is important for different processes to be integrated on the same microfluidic chip and to process a high number of biological particles. Therefore, in order to complete the analysis in a reasonable time, the processing volume in the system (the number of particles processed per unit time) must be high. One of the options that best meets this criterion is the acoustophoresis method, which uses acoustic waves in the manipulation of micro and biological particles. This method is based on the principle of creating a force on the particles with acoustic pressure by creating a standing wave in the microchannel of the acoustic waves created on the microfluidic chip. The force that pushes the particles from the channel walls towards the center is the acoustic radiation force. The magnitude of these forces varies depending on the size, density and compressibility of the particles. Since the forces applied to particles of different sizes or types will vary, particles can move to different positions. The wavelength and amplitude of the acoustic wave to be used are related to the geometric properties of the microfluidic chip. Chip material is an important factor for the transmission of acoustic waves. In studies in the literature, silicon and glass chips are frequently used due to their low acoustic damping. When acoustophoretic microfluidic devices are designed for a targeted operation (particle separation or focusing, etc.), although the chip thickness and width can be in the order of millimeters (mm), the length can be tens of centimeters (cm) for the success of the operation. Therefore, when two or more operations are targeted on the same microfluidic system, the size of the chip cannot be at reasonable levels. At the same time, microfluidic chips produced from materials with low acoustic damping. Since it transmits acoustic waves very well, the same acoustic frequency must be used in all units in a microfluidic chip based on the principle of acoustophoresis designed for two operations. Not using the same frequency may cause interference from different frequencies used for different units, negatively affecting the operation of the acoustophoretic device. In the state of the art, working together of different manipulation sources has been demonstrated in many different combinations. For example; Combinations of acoustic forces and dielectric forces [2], optical forces and acoustic or dielectric forces [3, 4], magnetic forces and dielectric forces [5], and hydrodynamics and dielectric forces [6] exist for different applications. In recent years, acoustic waves have been frequently used as a power source in tasks such as separation, focusing, capture and accumulation of micro-scale particles, and have been shown to be successful and advantageous in many application areas [7-13]. Performing multiple acoustic processes on separate chips, P. Ohlsson et al. [14] used two separate acoustic chips for the enhancement and capture processes using acoustic waves. However; This system also has disadvantages, which are; (i) the volume of the samples to be tested travels further than necessary due to the fact that the transportation between the chips is provided by a plastic hose, thus creating the risk of encountering undesirable situations such as collapse and sticking; (ii) Separate chips and plastic hose connections between chips make the imaging process difficult and create a crowded environment. Additionally, when it is desired to perform acoustic applications at different frequencies on a single chip, either frequency multiples are used, frequencies that are far away from each other are selected for effect, or the length of the chip is extended [15-17]. The biggest reason for this is to prevent the applied acoustic frequencies from interfering with each other and disrupting the intended process. In the literature, the dimensions of a single-processed acoustophoretic device are produced as 5-20 cm in length, 5-20 cm in width and 1-2 mm in height. Materials with low acoustic damping are generally hard, brittle and thin materials (glass, silicon, fused silica). , quartz, silicon carbide, etc.). In examples where multiple processes are performed on an acoustophoretic device, there are examples with serial architecture where long chips have to be lined up one after the other to reduce acoustic wave interference between stations where different operations will be performed [14]. In this case, laboratory prototypes whose width and thickness are small compared to their length, up to 50 cm in length, and which are difficult to package, transport and commercialize without breaking, emerge. In addition, long channels in one direction may cause problems such as collapse and adhesion. Micro and/or biological particles are allowed in microfluidic systems. Due to the inadequacy and disadvantages of the solutions in the current technique for the realization of integrated two or more stage operations to be applied, it has become necessary to make a development in order to perform two or more operations to be applied to micro and / or biological particles in a single system. Brief Description and Purposes of the Invention In the present invention An acoustophoretic microfluidic device with a multilayered structure is described. With the device of the invention, two or more processes can be applied in a single system, integrated to micro and/or biological particles. One purpose of the invention is to provide two or more integrated processes to be applied to micro and/or biological particles. It is the performance of more staged operations in a single device. In the device subject to the invention, at least two processes can be carried out in an integrated manner, thanks to the at least two layers that can be manipulated acoustophoretically and the insulation layer between these layers. Thanks to the insulation layer made of acoustically damped material used, inter-frequency interferences are prevented, thus minimizing inter-chip disruptive effects for the operation of each chip. The most important aim of the invention is to perform multiple manipulation techniques in a single microfluidic device. In the device subject to the invention, at least two different bioparticle manipulation techniques, including an acoustic bioparticle manipulation technique, can be applied simultaneously. In the microfluidic device of the invention, which has a layered structure, there is a polymer material between the layers that will act as an acoustic insulator, and this allows the placement of a microfluidic unit operating with a different acoustic frequency in each layer. Another aim of the invention is to minimize problems such as collapse, adhesion and migration that occur in the current technique when more than one process is applied to micro and/or biological particles. Thanks to the layered structure of the device subject to the invention; The crowded test environment is simplified, there is no need to extend the chip length to perform more than one operation, and thus, problems such as collapse, adhesion and migration caused by chip length are minimized. Explanation of Figures Figure 1: Cross-sectional view of EMAC consisting of two layers. Figure 2: Average acoustic pressure values in separation and enrichment units; A) EAMC with polymer layer, B) EAMC without polymer layer. Definitions of the Elements and Parts/Parts Constituting the Invention The parts and parts in the figure are numbered, and the equivalent of each number is given below: 1. Chip Microchannel Piezoelectric actuator Flow path hole Insulation layer Detailed Description of the Invention Invention; It relates to an integrated acoustophoretic microfluidic device (EAMC) in which two or more stages of micro and/or biological particle manipulation-based operation, at least two of which can be carried out in a single microfluidic system using the acoustophoresis method. Integrated acoustophoretic microfluidic device (EAMC) which is the subject of the invention; At least two layers that allow acoustophoretic manipulation, an insulating layer (8) between the layers that allow acoustophoretic manipulation, at least one input (5) on the outer layers of the device that allows the sample to be loaded into the device, and at least one output (6) that allows the sample to be taken from the device, passage between layers. It contains at least one flow path hole (7) to ensure Each layer where the aforementioned acoustophoretic manipulation can be performed; A chip (1) made of low acoustic damping material, which has been opened by chemical etching and/or mechanical processing and contains a microchannel (3) for the flow of liquids containing micro and/or biological particles (cells, bacteria, viruses, etc.), chip (1) The cover (2), which is made of a material with low acoustic damping, which forms the microchannel structure by covering the flow path in the microchannel (3), which is open on one side, and is also used to reflect acoustic waves in the liquid, and is used to separate micro and/or biological particles. It contains a piezoelectric actuator (4) that produces acoustic waves. Figure 1 shows the final view of the two-layer acoustophoretic microfluidic device (EAMC), which is an application of the invention. There is no requirement for the chip (1), cover (2) and piezoelectric actuator (4) to be in the order shown in Figure 1 in each layer; these three components can be arranged in different orders according to need. For example, the chip (1) may be at the top, the cover (2) may be at the bottom, or vice versa. In the invention, the low acoustic damping material from which the chip (1) is made; It can be selected from glass, silicon, fused silica, quartz or silicon carbide. In one embodiment of the invention, the cover (2) is glued to the chip. This bonding process can be achieved with chemical adhesives (cyanacrylate, etc.) or, for some chip materials, the surface can be activated by plasma treatment and attached to the glass. The liquid containing micro and/or biological particles (cells, bacteria, viruses, etc.) flows in the microchannel (3) between the chip (1) and the cover (2) and the acoustic waves move through the chip (1) and destroy the particles in the microchannel (3). It affects. Piezoelectric actuator (4) can be adhered to the chip (1) or cover (2) with chemical adhesives according to geometric needs, or a transmission fluid (ultrasonic gel, etc.) that provides acoustic wave transmission is applied between the chip/cover and the piezoelectric actuator and applied onto the chip or chip. Can be placed without gluing. Micro and/or biological particles are loaded into the device from the entrance (5) and taken from at least one output (6). The flow path hole (7) is formed by opening a hole on both the chip and the insulation layer for the passage of the liquid containing particles between the layers. The insulation layer (8) is made of polymer materials (epoxy, double-sided tape, polydimethylsiloxane (PDMS), etc.). Different operations can be performed on each of the layers in the device. Some of these transactions; Directing the particles to a position within the channel, separation, enrichment (concentration), purification, mixing, fragmentation by cavitation, etc. can be defined as . In order to perform these processes effectively, different channel widths and acoustic waves of different frequencies are required, since the resonance frequency depends on the channel width. However, since each layer is made of acoustically low damping materials, acoustic waves in one layer can spread to other layers in the device subject to the invention, which has a multi-layer structure. This may negatively affect the performance of operations in other layers that are driven at different frequencies. For this reason, an insulation layer (8) consisting of material with high acoustic damping is used between each layer to ensure the insulation of acoustic waves. The number of layers can be increased as deemed necessary depending on the needs of the application. Each layer is positioned on top of each other on the vertical axis (z-axis). Thanks to the layered structure of the invention, a device with more balanced dimensional ratios in acoustophoretic devices, more resistant to breakage due to its increased thickness, allowing safe production and allowing packaging and transportation is obtained. In an embodiment of the invention, the device may include at least one layer capable of electrical/magnetic/optical/hydrodynamic manipulation, in addition to at least two layers capable of acoustophoretic manipulation. Electrodes can be placed in the microchannel in the layer that can perform electrical manipulation. In the layer that can perform magnetic manipulation, magnets can be placed on the outside of the microchannel or on the outside of the device. In the optical manipulation layer, a light source can be placed on the outside of the microchannel or on the outside of the device. In the layer capable of hydrodynamic manipulation, there may be a specially designed microchannel architecture with some obstacles, narrowing and/or expanding regions at strategic points. The device subject to the invention; It is obtained by assembling two or more microfluidic chips (1) on the vertical axis (z-axis), and the flow created inside is transferred between the chips (1). In this device, the operations to be performed on each chip with different task definitions (directing particles/cells to a certain part of the channel, separating them from each other, increasing their concentration, purification, fragmentation, etc.) can be carried out in an integrated manner and simultaneously in a layered architecture. There is an insulation layer (8) between each chip (1) layer in order to prevent the mutual transmission and interference of acoustic waves of different amplitudes and frequencies used in each layer. Thanks to this insulation layer, an acoustophoresis device whose form factor is suitable for a commercial product and allows packaging, transportation and modular production is obtained. The length of each layer is between 5-20 cm and the width is between 1-10 cm. It is produced in such a way that the height of each chip is 0.5-2 mm and the height of each cover is 0.5-2 mm. Thanks to these dimensions, there is no risk of collapse, sticking, carrying, etc. caused by the length of the device. problems are minimized. In the invention, how the insulation layer (8), made of material with high acoustic damping, affects the passage of acoustic waves between the layers has been examined with a numerical simulation approach. The method used in numerical simulation is the finite element method. The numerically modeled system consists of two layers. In the first layer (the part in the upper chip in Figure 1, upper layer, separation unit) it is aimed to separate the particles, and in the second layer (the part in the lower chip in Figure 1, the lower layer, the concentration unit) it is aimed to increase the concentration of the separated particles. The piezoelectric actuator (4) used for the separation unit on the upper layer was operated in the frequency range of 600-740 kHz under 60 V potential difference. In order for the separation to be successful, the acoustic pressure and force created by the piezoelectric actuator (4) in the microchannel must be high in the upper separation unit (first/top layer). However, it is not desired that the acoustic force occurring in the upper layer be transmitted to the lower layer (concentration unit) at a high level. Because, the concentration unit is driven at a different frequency by the second piezoelectric actuator (4) (the piezoelectric actuator (4) in the lower layer in Figure 1) and the acoustic waves coming from the upper layer may have a disruptive effect on the concentration process. Therefore, the ratio of the average amplitude of the acoustic pressure and force created by the upper piezoelectric actuator in the lower layer (concentration) channel to the average acoustic pressure and force amplitude in the upper layer (separation unit) is desired to be low. The fact that the acoustic pressures in the lower layer are lower compared to the upper layer shows that the polymer layer in between reduces the acoustic transmission between layers. Acoustic simulations of the integrated acoustophoretic microfluidic device subject to the invention have been carried out for two cases, with and without an insulating layer (8) made of a polymer between the silicone layers that can be performed acoustophoretic manipulation. Numerical simulations on this two-layer unit were made for a system with and without an insulating layer (8) made of damping polymer, and the results are given in Table 1 at different frequencies. Theoretically, since the acoustic damping rate of the intervening polymer layer is high and the wavelengths are short in the polymer layer, acoustic waves entering the polymer material slow down in the polymer layer and are subject to high damping. This requires the amplitude of the acoustic waves passing into the lower layer to decrease. As can be seen in Table 1, it shows that the theory and numerical simulation overlap. In the device with an insulating layer in between, the average acoustic pressure force ratios were lower at all frequencies than in the system without a layer. This shows that the transmission at different frequencies is blocked by the damped layer at different values, from half to thousands of times. Moreover, numerical simulation results for the system with polymer layers show that there is higher acoustic pressure in the upper channel compared to the system without polymer layers. It is thought that the reason for this is that the polymer layer reduces the acoustic energy flow to the lower layer and, as a result, increases the pressures in the upper layer. Numerical simulations have shown that it is necessary to place high damping insulation material between the layers in order for different processes to occur in different layers without affecting each other's operating performance. TR