TARIFNAME EKSTRASELLÜLER MATRIKS BILESENLERINDEN KOLAJENIN ELDE EDILME YÖNTEMI Bulusun Ilgili Oldugu Alan Bulus; saglik', gida, kozmetik ve tibbi malzeme sektörlerinde kullanllabilen kolajenin kuzu ayag _içerisindeki ekstrasellüler matriks bilesenlerinden elde edilme yöntemi ile ilgilidir. Bulusla ilgili Teknigin Bilinen Durumu (Önceki Teknik) Ekstrasellüler matriks (ESM), hücreler arasD bosluklar: dolduran ve hücreleri birbirine baglayan, çogu protein, hormon, proteoglikan ve büyüme faktörlerini içeren, hücrelerin özel fonksiyonlarü gerçeklestirebilmesi için hücre içi sinyalleme yollari ile etkilesimlerini saglayan, kompleks ve dinamik bir yapim Sklüîla bag doku olarak adlandmtlan ESM, kikîtdak ve kemikte fazla miktarda bulunur. Kolajen, ESM"nin önemli bir kßmiüolusturan temel ekstrasellüler matriks bilesenlerinden biridir. Kolajen özellikleri, hammaddeye ve ekstraksiyon kosullarlna bagll !olarak degismektedir. En çok kullanilan ekstraksiyon yöntemleri klasik ekstraksiyon yöntemleri olan kolajenin nötr tuzlu çözeltileri, asit çözeltileri ve enzimlerin eklendigi asit çözeltilerindeki çözünürlügüne dayanmaktadi Klasik ekstraksiyon yöntemi ile gerek kullanilan çözgen miktarmm gerek ekstraksiyon sürelerinin uzun oldugu görülmektedir. Kolajenin fonksiyonel özellikleri, elde edildigi hammaddenin islem kosullariia bag] Eblarak degismektedir. Bu nedenle yüksek verim ve en iyi kolajen özelliklerini elde etmek için hammaddeye uygun kosullarîi belirlenmesi önemlidir. Teknigin bilinen durumunda, kolajen ekstraksiyonunda genellikle asit hidroliz islemi ya da enzimatik hidroliz yöntemlerinin kullanEdEgEgörülmektedir. Son yüilarda yap [Ban çalgmalar, bu yöntemlerle birlikte ultrason kullanîhmi ekstraksiyon verimini artirmada etkili oldugunu göstermistir. Ultrason teknolojisi, sürdürülebilir "yesil" kimyasl hedefine ulasmada önemli bir rol oynamaktad It Bununla beraber diger yöntemlere göre güvenli, ucuz, tekrarlanabilir ve çevre dostu olmasl !gibi pek çok avantaja sahiptir. Kolajen ekstraksiyonunda ultrason kullanühîile çal @malarrsîiîllîiîi Bu durum, ultrasonun enzim aktivitesi üzerindeki etkisini ve diger yöntemlerle birlikte kullanEnEiEi yararlarElü degerlendirmek için yeni çalßmalari gereksinimini ortaya çEkarrnaktadm Bununla birlikte, önceki teknikte kolajen ekstraksiyon yöntemleri ile ekstraksiyon gerçeklesmesinde ekstraksiyon süreleri ve dolayßgila enerji tüketimi de oldukça fazladE Bulusun KEa Aç Rlamas Eve Amaçlar 3 Mevcut bulus yukarlda bahsedilen gereksinimleri kars Dayan, tüm dezavantajlarl ortadan kaldîan ve ilave bazT avantajlar getiren, kuzu ayagTliçerisindeki ekstrasellüler matriks bilesenlerinden kolaj enin elde edilme yöntemi ile ilgilidir. Bulusun öncelikli amac: yenilikçi ve çevre dostu bir yöntem gelistirilerek geleneksel ekstraksiyon yöntemlerinde kullanEIan 24 saat ve üzeri uygulamalar yerine 6 saat islem süresinin ardmdan ultrases isleminin de uygulanmasgtla kolajenin elde edilme süresinin kßalt Jtnas &1 Et saglanmas El 1. Bulusun amacjkuzu ayaklarEat [klarîlîl degerlendirilerek yüksek verimde, safl [Eta ve katma degeri yüksek kolajen üretiminin gerçeklesmesidir. Ürün saflgjve kalitesinin arttEEmas Eida ultrason uygulamas [etkili bir yöntem olarak görülmektedir. Kolajen ekstraksiyonu ile ilgili gerçeklestirilen çallstmalarda ultrason uygulamas n n kolajen yaptstlnln korunarak ürün özelliklerinini iyilestirdigi görülmüstür. Bulus ekstraksiyon yöntemi, asit ve enzimatik hidroliz yöntemlerinine ek olarak ultrason uygulamas ?da içermektedir. Bulus yöntemi ile hayvansal yan ürün olan kuzu ayaklarmdan, teknikte bilinen yöntemlere kgtasla daha kßa ekstraksiyon sürelerinde katma degeri yüksek kolajen üretimi gerçeklestirilmistir. Kuzu ayaklarEiEi degerlendirilerek en önemli biyomateryallerden biri olarak kabul edilen kolajenin elde edilmesi, atm degerlendirmesi açßßdan da özellikle et endüstrisi için önem arz etmektedir. Bulus yöntemi ile ultrasonun kolaj en yapßjjzerine etkileri detaylEsekilde incelenmistir. Ticari kolajenlerin birçogu özellikle domuz gibi memeli hayvanlardan elde edildigi için, dini aç dan kullanlml tercih edilmemektedir. Bu kapsamda, kuzu ayaklari kullanllarak domuz kolajenine alternatif` olarak helal kolajen eldesi gerçeklestirilecektir. Bulus yöntemi kolajen kaynagüolarak kuzu ayagEiEi kullanîhjile sEiElEdegildir. Bulus yöntemi büyükbas, küçükbas veya kümes hayvanlarEiEi ayaklar: tendonlarj derileri veya soluk borularE tavuk sternumu veya ktkßdagü baltk derisi, pulu, yüzgeei veya kIÇEgDgibi hayvansal kaynakljçolajen hammaddeleri için de etkili sekilde kullan [[abilmektedir. Bulusu Aç tklayan Sekillerin Tan Bilar J Bulus konusu, ekstrasellüler matriks bilesenlerinden kolajenin elde edilme yöntemi ve elde edilen kolajenlerin karakteristik özelliklerinin daha iyi anlasTabilmesi için gerekli olan sekiller ve ilgili aç Elamalar asag Ilaki gibidir. Sekil 1: Kuzu ayagEia uygulanan ön islemlerin akß semasE Sekil 2: Kuzu ayaklarüdan kolaj en üretimi akß semasE Sekil 3: Farkljekstraksiyon kosullarßda elde edilen kolajen örneklerinin SDS-Page bantlarü uygulamasg Sekil 4: 20°C"de farklüiltrason sürelerinde elde edilen kolajenlerin FTIR spektrumlarü Sekil 5: 25°C'de farkli ultrason sürelerinde elde edilen kolajenlerin FTIR spektrumlarl Sekil 6: 30°C'de farkli ultrason sürelerinde elde edilen kolajenlerin FTIR spektrumlarl Sekil 7: Fark] lekstraksiyon kosullarlnda elde edilen kolajen örneklerinin SEM görüntüleri. Bulusun Ayr it JlJAç Rlamasj Bu detaylüaçtklamada kuzu ayaklarEidaki ekstrasellüler matriks bilesenlerinden kolajenin elde edilmesi için gerekli ön islemler ve ekstraksiyon islem basamaklarüsadece konunun daha iyi anlastllnasîla yönelik olarak ve hiçbir sEiElayEiD etki olusturmayacak sekilde aç klanmaktad E. Bulus kolaj en elde edilme yöntemi; a) Hayvansal kaynakllîkolajen hammaddelerinin temizlenmesi ve ö gütülmesi, b) Temizlenen ve boyutlarEküçültülen kolajen hammaddelerinin 1:20 (w/v) oranEida ve pH degeri 7.5 olan 0,05 M Tris-HCI içinde 50 dakika boyunca homoj enize edilmesi, d) Santrifüj sonrasl lallnan katl klsmln yag uzaklastlrma amaclyla oranda alimasü f) A1 man katükßînß dekalsifikasyon amac ßl'la oran îlda 0.5 M EDTA-2Na ile 4°C"de 6 saat boyunca karßtmüînasü h) Kolajen olmayan proteinlerin uzaklastßüinasE amac Ella kat: kßmß 1:10 (w/v) oran Ilda 0.1 M NaOH içinde 1 gece bekletilmesi, al imasü j) Ekstraksiyon islemine kadar karis m n -18°C'de muhafaza edilmesi k) Karlsllm 11 %01 pepsin (W/V) içeren oran nda %5" lik laktik asit ile 4°C3de 6 saat boyunca karldtln lInasl, l) Ardmdan 20-30°C sßakllk ve 20-60 dakika aras? sürede ultrasonik banyo içinde tutulmas 1 alimasü n) AlEian s ElEkEm El, proteinlerin çöktürülmesi amac Slla 1 gece boyunca 2.5 M NaCl ile muamele edilmesi, p) Fazla tuzun uzaklastlnhnas amac yla diyaliz edilmesi, q) Diyaliz sonunda örneklerin liyofilize edilmesi Islem ad Ehlar îl Eiçermektedir. Bahsi geçen hayvansal kaynaklEkolajen hammaddesi büyükbas, küçükbas veya kümes hayvanlarii ayaklar: tendonlarü derileri veya soluk borularj tavuk stemumu veya klkidagj balik derisi. pulu, yüzgeci veya kIÇgZblabilmektedir. Bulusta hayvansal kaynaklü kolaj en hammaddesi olarak kuzu ayagLtercih edilmistir. Yapilacak ön islemlerin etkin bir sekilde belirlenmesi için kuzu ayaklarlna bilesen analizleri yap`ltnlsltîii. Ön islem basamaklari l belirlenirken kuzu ayagl bilesimi göz önünde bulundurulmustur. Ön Islemler: (1) Kuzu ayaklar: kirletici maddelerin temizlenmesi amacgl'la yEkandÜltan sonra boyut küçültmesi amac @la endüstriyel ögütme makinesinde ögütülmüstür. (2) Temizlenen ve boyutlarüiüçültülen kuzu ayaklar] 1:20 (w/v) oranmda 0,05 M Tris-HCI (pH 7.5) içinde 50 dakika boyunca waring blender kullanülarak homojenize edilmistir. Islem sonunda karßîna 4°C"de 9000 rpm,de 25 dakika santrifüj uygulanmßtî. Santrifüj sonrasE katlßîn smadaki islem için al Elm Et 3. (3) Santriûij sonras jalElan katjkßîn, yag uzaklastmma amac &la 1:10 (w/v) oranda %50`lik etanol ile 3 saat boyunca muamele edilmistir. Islem sonunda karlslma 4°C"de 9000 rpm1de 20 dakika santrifüj uygulanarak kati k slm allnmlstlr. (4) Allnan katl lklslm, dekalsifikasyon amaclyla oran nda 0.5 M EDTA-ZNa ile santrifüj uygulanarak katEkßEi al Elm @t E. (5) Kolajen olmayan proteinlerin uzaklastmlnas lmac @ila katEkEEh l: 10 (W/v) oranîida 0.1 M NaOH içinde 1 gece bekletilmistir. Ard Eidan 4°C,de 9000 rpm"de 25 dakika santrifüj uygulanarak katEkßEh al Elm St E. (6) Ön islemi tamamlanmß kuzu ayaklarjekstraksiyon islemine kadar -18°C"de muhafaza edilmistir. Ekstraksiyon asamas nda kullanilan çözgenler ve oranlarl ile ultrason kosullar. bn denemeler sonucu belirlenmistir. Ultrason uygulamas lolarak 3 farkll s dakl lt ve süre denenmis; en yüksek kolaj en konsantrasyonunun çlktl gl parametrede üretimlere devam edilmistir. Ekstraksiyon asamas 3 (1) Ön islemler sonrasüörnekler ekstraksiyon islemi için %01 pepsin (w/v) içeren oran Ilda %5 " lik laktik asit ile 4°C"de 6 saat boyunca kar 31: EJIn Islt E. ultrasonik banyo (Bandelin Sonorex Digitec, Almanya) içinde ultrases (htz: 35 kHz; güç: 140/560 W) uygulanmlstlit (3) Ekstraksiyon islemi sonunda, karls'lm 4°C"de 9000 rpm7de 30 dakika santriiîij edilmistir. Santriûij sonunda sîl`k_slîn alîimßtî. (4) Alian sßlükßßi, proteinlerin çöktürülmesi amacglla 1 gece boyunca 2.5 M NaCl ile muamele edilmistir. (5) Çöktürme islemi sonrasgen son çökelti 4°C`de 9000 rpm"de 30 dakika santrifuj edilerek toplanmßti. (6) Fazla tuzun uzaklastmülnas Damac @la diyaliz islemi gerçeklestirilmistir. Örnekler, önce 24 saat boyunca 0.1 M laktik aside karsj sonrasEida 48 saat boyunca saf suya karsEdiyaliz edilmistir. (7) Diyaliz sonunda örnekler liyofilize edilerek analiz islemlerine kadar -18°Cide muhafaza edilmistir. konsantrasyonlarlna ulasllinlst n. Kolaj en konsantrasyonlarl Tablo l"de verilmistir. Tablo 1: Farklßkstraksiyon kosullarEida elde edilen örneklerin kolaj en konsantrasyonu Eksiralßiyun Kusulu Kulajeii içerigi (ug/uL) W-'tm-iii .sutunda farkli hartlcrli: isircllcncn gruplar uriisindaki fark istulislikscl açidan imcmlidirip` 0.05› Kolajen konsantrasyonunun en fazla oldugu ekstraksiyon kosulu 25°C-60dk ultrason uygulamas E(5061,75 ug/ul) olarak belirlenmistir. AynEsEaklEkta artan ultrason süresine baglü olarak kolajen konsantrasyonlarßda da arts gözlenmistir. Ancak yapîlîi bozulmamas :için 60 dakikalEEr sürenin üzerine çEErEünamasE gerekmektedir. 25°C sßakltkta farklüultrason sürelerinde elde edilen kolaj en örneklerinin en yüksek kolaj en konsantrasyonuna sahip oldugu görülmüstür. 25°C slcakll g n üzerindeki sldakl H ve sürelerde kolajen konsantrasyonunun azalmaya basladlg lgözlenmistir. Genel olarak ultrason süresinin, kolajen konsantrasyonunu söaklga göre daha fazla etkiledigi görülmektedir. Kolajen analizi sonuçlarîkuzu ayaklarlîilîl alternatif kolaj en kaynagEolarak kullan [[abilecegini göstermistir. Kolajen örneklerinin protein dagllühlarß: gösteren SDS-PAGE bantlarü ve alt birim bilesenleri Sekil 3°de gösterilmistir. Bu sekilde kolajen örneklerinin protein daglEnlarE görülmektedir. Protein jel elektroforez sonuçlarßda kolajen ile ilgili olmayan baska bir protein bandügörülmemis olmasjörnegin%90 satlülta oldugunu göstermektedir. Kolajeni olusturan a, [3 ve y zincirler sekil üzerinde gösterilmistir. Farkljekstraksiyon kosullarjaltüida üretilen tüm kolajenlerin, (11, (12, B ve y zincirlerinden olustugu gözlenmistir (~. Elektroforez sonuçlari farkllîekstraksiyon kosullarHaltîida üretilen tüm kolajenlerin yap Tsal bütünlügünü korudugunu ve Tip 1 kolajenin [al(1)]2 (120)] kuzu ayagEkolajeninin ana bileseni oldugunu göstermistir. FarlesBaklk ve sürelerde elde edilen kolajen örneklerinin FTIR spektrumlarßekil 4, 5 ve 6"da gösterilmektedir. Tüm kolajen örneklerinin FTIR spektrumunda karakteristik olan amit A, amit B, amit 1, amit aralEgIlda CH2 bükülmesi gözlenmistir. Amit III bandjle "1450-1454 cm""" bandîaras îldaki dalga say E E yogunluk oranLdLn, l'e yakLn olmasi kolajenin üçlü sarmal yapLsLnLn bozulmadLgLnl_ göstermektedir. Tüm kolajen örnekleri için bu oran 1.17 olarak bulunmustur. Fark] lsldakllk ve sürelerde uygulanan ultrason isleminin, kolajen yaplslna zarar vermedigi FTIR sonuçlarl ile desteklenmistir. Kolajen örneklerinin yüzey morfolojisi ve parçaclll boyutlarü taramalEelektron mikroskobu ile belirlenmistir. SEM görüntüleri 5000)( büyütme ile al ßmßtß. F arklj ekstraksiyon kosullarida elde edilen kolajen örneklerinin SEM görüntüleri Sekil 7 "de verilmistir. Kolajen örneklerinin yüzey morfolojileri ve mikroyap Iarjincelendiginde, tüm örneklerin lifli ve gözenekli yapgza sahip oldugu görülmektedir. Kolajen örneklerinin ortalama lif çapüiß 0.1~O.9 um aralEgEida degistigi görülmüstür. Ultrason söaklgjve süresine bagliblarak bazÜ farklllklar gözlenmistir. 20°C5deki kolajen örneklerinde daha düzenli ve belirgin lif yaplslLl görülürken s dakl k artt kça, daha düzensiz, pürüzlü ve küçük gözeneklere sahip süngerimsi yap` lgözlenmistir. Sldakllgln ve artan ultrason sürelerinin kolajen yaplsllnl `etkiledigi açlk sekilde görülmektedir. En uygun sonuçlar gerek istenilen kolajen yastITSekil 7: A3) gerekse konsantrasyon göz Önüne al mdîgîida 20°C ve 60 dk. ekstraksiyon kosullarmda elde edilmistir. Iç içe geçmis tabakalar arasßdaki bosluk, kolajene gözeneklilik kazandimaktadi. Spiral benzeri görünümdeki lifler, teknikte bildirildigi gibi, birbirine baglanmß bir tabaka olarak gözlenmistir. Gözeneklilik, gözeneklerin büyüklügü ve malzeme yüzey alanü biyo malzemelerin biyomedikal açîlan önemli parametreleri olarak kabul edilmektedir. Kuzu ayag ndan elde edilen kolajendeki homojen ve düzenli ag yapleLJ ilaç tasgzmLolarak kolajeni elverisli hale getirmektedir. TR TR TR DESCRIPTION METHOD OF OBTAINING COLLAGEN FROM EXTRACELLULAR MATRIX COMPONENTS Field to which the invention relates: It is related to the method of obtaining collagen, which can be used in the health, food, cosmetics and medical material sectors, from the extracellular matrix components in lamb's feet. State of the Art Regarding the Invention (Prior Art) Extracellular matrix (ESM), a complex that fills the spaces between cells and connects cells to each other, contains most proteins, hormones, proteoglycans and growth factors, and enables cells to interact with intracellular signaling pathways to perform special functions. and a dynamic structure ESM, called sclula connective tissue, is found in large amounts in cartilage and bone. Collagen is one of the basic extracellular matrix components that constitute an important part of ESM. Collagen properties vary depending on the raw material and extraction conditions. The most used extraction methods are based on the solubility of collagen in neutral salt solutions, acid solutions and acid solutions to which enzymes are added, which are classical extraction methods. Classical With the extraction method, it is seen that both the amount of solvent used and the extraction times are long. The functional properties of collagen vary depending on the processing conditions of the raw material from which it is obtained. Therefore, it is important to determine the appropriate conditions for the raw material in order to obtain high efficiency and the best collagen properties. In the known state of the technique, Acid hydrolysis or enzymatic hydrolysis methods are generally used in collagen extraction.Recent studies have shown that the use of ultrasound together with these methods is effective in increasing the extraction efficiency. Ultrasound technology plays an important role in achieving the goal of sustainable "green" chemistry. However, it has many advantages over other methods, such as being safe, cheap, reproducible and environmentally friendly. Studies using ultrasound in collagen extraction @malarrsîiîllîiîi This situation reveals the need for new studies to evaluate the effect of ultrasound on enzyme activity and the benefits of using it together with other methods. However, in the previous technique, extraction times and therefore energy consumption are quite high in the extraction with collagen extraction methods. Description Home Objectives 3 The present invention relates to a method of obtaining collage from the extracellular matrix components in lamb's feet, which meets the above-mentioned requirements, eliminates all disadvantages and brings some additional advantages. The primary purpose of the invention: by developing an innovative and environmentally friendly method, by applying the ultrasound process after a 6-hour processing time, instead of the 24-hour or more applications used in traditional extraction methods, the time to obtain collagen is shortened. It is the production of collagen with high purity, eta and added value. Ultrasound application is seen as an effective method to increase product purity and quality. Studies on collagen extraction have shown that ultrasound application preserves collagen adhesion and improves product properties. The invention extraction method includes ultrasound application in addition to acid and enzymatic hydrolysis methods. With the invention method, high value-added collagen production has been achieved from lamb feet, which is an animal by-product, in shorter extraction times with kgstone compared to the methods known in the art. Obtaining collagen, which is considered one of the most important biomaterials, by evaluating lamb feet is especially important for the meat industry in terms of atm evaluation. With the invention method, the effects of ultrasound on collage structure have been examined in detail. Since most commercial collagens are obtained from mammals, especially pigs, they are not preferred for religious purposes. In this context, halal collagen will be produced as an alternative to pig collagen by using lamb feet. The method of the invention is not suitable for using lamb's feet as a source of collagen. The invention method can also be used effectively for collagen raw materials of animal origin, such as cattle, sheep or poultry feet: tendons, skin or tracheas, chicken sternum or mountain fish skin, scales, fins or fish. Description of the Drawings Explaining the Invention: The drawings and related drawings necessary for a better understanding of the subject of the invention, the method of obtaining collagen from extracellular matrix components and the characteristic features of the obtained collagens are as follows. Figure 1: Flow diagram of pre-treatments applied to lamb feet Figure 2: Flow diagram of collage production from lamb feet Figure 3: Application of SDS-Page bands of collagen samples obtained under different extraction conditions Figure 4: FTIR spectra of collagens obtained at different ultrasound times at 20°C Figure 5: FTIR spectra of collagens obtained at 25°C at different ultrasound times. Figure 6: FTIR spectra of collagens obtained at 30°C at different ultrasound times. Figure 7: SEM images of collagen samples obtained at different extraction conditions. In this detailed explanation, the pre-treatments and extraction process steps required to obtain collagen from the extracellular matrix components of lamb's feet are explained only for a better understanding of the subject and in a way that will not create any effect. , b) Homogenizing the cleaned and size-reduced collagen raw materials in 0.05 M Tris-HCl with a 1:20 (w/v) ratio and pH value of 7.5 for 50 minutes, d) After centrifugation, the solid part used is aliquoted for oil removal. ) A1 man katükßînß decalcification purpose ßl ratio îlda mixed with 0.5 M EDTA-2Na at 4°C for 6 hours. keeping it in it for 1 night, taking it j) Keeping the mixture at -18°C until the extraction process k) Mixing 11 with 5% lactic acid containing 01% pepsin (W/V) for 6 hours at 4°C. karldtln lInasl, l) Then 20-30°C temperature and 20-60 minutes? keeping it in an ultrasonic bath for 1 period of time n) AlEian s ElEkEm El, treating it with 2.5 M NaCl for 1 night for the purpose of precipitation of proteins, p) Dialysing it to remove excess salt, q) Lyophilizing the samples at the end of dialysis Process ad Ehlar îl E. . The mentioned animal sourced collagen raw material is the feet of cattle, sheep or poultry: tendons, skin or trachea, chicken stem or fish skin. It may have scales, fins or wings. In the invention, lamb's foot was preferred as the raw material of the collage of animal origin. In order to effectively determine the pre-treatments to be made, component analyzes were carried out on lamb feet. Lamb's foot composition was taken into consideration when determining the pre-processing steps. Preliminary Processes: (1) Lamb feet: after being cleaned with a grinder to remove contaminants, they were ground in an industrial grinding machine for size reduction. (2) Cleaned and reduced-sized lamb feet were homogenized in 0.05 M Tris-HCl (pH 7.5) at a ratio of 1:20 (w/v) for 50 minutes using a waring blender. At the end of the process, the face was centrifuged at 9000 rpm for 25 minutes at 4°C. After centrifugation, take Elm Et 3. (3) After the centrifuge, the mixture was added for the purpose of oil removal at a ratio of 1:10 (w/v). It was treated with 50% ethanol for 3 hours. At the end of the process, the mixture was centrifuged at 9000 rpm for 20 minutes at 4°C and the solid fraction was collected. (4) The collected solid mixture was centrifuged with 0.5 M EDTA-ZNa for decalcification purposes. (5) Removal of non-collagenous proteins was carried out in 0.1 M NaOH at a ratio of 1:10 (W/v). It was kept for 1 night. Afterwards, centrifugation was applied for 25 minutes at 9000 rpm at 4°C and katEkßEh al Elm St E. (6) Pre-processed lamb feet were stored at -18°C until extraction. Solvents and their ratios used in the extraction stage and ultrasound conditions. It was determined as a result of many experiments. Three different temperatures, durations and durations were tried as ultrasound application; Production continued at the highest parameter, reflecting the highest collage density. Extraction step 3 (1) Samples after pre-treatments: ratio containing 01% pepsin (w/v) for extraction process Ilda with 5% lactic acid at 4°C for 6 hours 31: EJIn Wet E. ultrasonic bath (Bandelin Sonorex (3) At the end of the extraction process, the mixture was centrifuged at 9000 rpm at 4°C for 30 minutes. At the end of the centrifuge, silt was collected. 4) Alian sßlükßßi was treated with 2.5 M NaCl for 1 night in order to precipitate the proteins. (5) After the precipitation process, the final precipitate was collected by centrifuging for 30 minutes at 9000 rpm at 4°C. (6) Dialysis was carried out to remove excess salt. The samples were first dialyzed against 0.1 M lactic acid for 24 hours and then against pure water for 48 hours. (7) At the end of dialysis, the samples were lyophilized and stored at -18°C until analysis. reach their concentrations. Collagen density concentrations are given in Table 1. Table 1: Collagen concentration of samples obtained under different extraction conditions. Ekşiralßiyun Kusulu Kulajeii content (ug/uL) The extraction condition with the highest collagen concentration was determined as 25°C-60 min ultrasound application (5061.75 ug/ul). Likewise, an increase in collagen concentrations was observed due to increasing ultrasound time. However, in order to avoid structural deterioration, it should not exceed 60 minutes. It was observed that the collagen samples obtained at different ultrasound durations at 25°C had the highest collagen concentration. It was observed that the collagen concentration began to decrease at temperatures and times above 25°C. In general, it is seen that the ultrasound duration affects the collagen concentration more than the humidity. Collagen analysis results have shown that lambsfoot can be used as an alternative collagen source. SDS-PAGE bands showing protein distributions and subunit components of collagen samples are shown in Figure 3. In this figure, protein distributions of collagen samples can be seen. The fact that no other protein band not related to collagen was seen in the protein gel electrophoresis results shows that the sample is 90% pure. The a, [3 and y chains that make up collagen are shown in the figure. It has been observed that all collagens produced under different extraction conditions consist of (11, (12), B and y chains (~. Electrophoresis results show that all collagens produced under different extraction conditions maintain their structural integrity and that Type 1 collagen [al(1)]2 (120)] is the main component of lamb's foot collagen. FTIR spectra of the collagen samples obtained at different times and times are shown in Figures 4, 5 and 6. CH2 bending was observed in the amide A, amide B, amide 1 and amide ranges, which is characteristic in the FTIR spectra of all collagen samples. Amide III banded with "1450- The fact that the wave number E E density ratio between the bands of 1454 cm""" is close to 1 shows that the triple helix structure of the collagen is not damaged. This ratio was found to be 1.17 for all collagen samples. FTIR results showed that the ultrasound process applied at the difference in wetness and duration did not damage the collagen structure. The surface morphology and particle sizes of collagen samples were determined by scanning electron microscopy. SEM images were taken at a magnification of 5000). SEM images of collagen samples obtained under different extraction conditions are given in Figure 7. When the surface morphologies and microstructure of the collagen samples are examined, it is seen that all samples have fibrous and porous adhesives. The average fiber diameter of the collagen samples is 0.1. ~0.9 um spacing has been observed to vary. Some differences have been observed depending on the ultrasound temperature and duration. While a more regular and distinct fiber structure was observed in the collagen samples at 20°C, as the temperature increased, a more irregular, rough and spongy structure with small pores was observed. It is clearly seen that increasing ultrasound durations affect the collagen structure. The most optimal results were obtained at 20°C and 60 min extraction conditions, regardless of both the desired collagen mass (Figure 7: A3) and the concentration. The space between the intertwined layers gives porosity to the collagen. Fibers with a spiral-like appearance were observed as an interconnected layer, as reported in the art. Porosity, pore size and material surface area are considered important parameters of biomaterials for biomedical purposes. The homogeneous and regular network structure in the collagen obtained from lamb's feet makes collagen suitable for drug delivery. TR TR TR