TARIFNAME SARS-CoV-2 VIRUSUNE KARSI KULLANILMAK UZERE, HIZLI, KAPSAYICI VE YUKSEK DOZDA INAKTIF Asi URETIMINE YONELIK BIR Y`ONTEM Teknik Alan Bulus, SARS-CoV-Z'nin neden oldugu COVID-19 salgininda kullanilmak üzere, hizli, kapsayici ve yüksek dozda inaktif asi üretimi için gelistirilmis ve optimize edilmis bir yöntem ile ilgilidir. Teknigin Bilinen Durumu SARS-CoV-Z'nin neden oldugu COVID-19 salgini, küresel ekonominin yani sira insan sagligina da büyük zarar veren, benzeri görülmemis bir kriz yaratmistir. Söz konusu virüsün yeni olmasi nedeniyle piyasada hiçbir koronavirüs asisi bulunmamaktadir. Ayni zamanda, bu asilar için henüz büyük Ölçekli üretim kapasitesi de mevcut degildir. Bu nedenle, bahsedilen virüse karsi asi gelistirme süreçlerinin ve kapasitelerinin dogru sekilde insa edilmesi gerekmektedir. Virüs popülasyonda salgin olusturdugunda SARS-CoV-2 asilari, morbidite ve mortaliteyi azaltmak için oldukça önemli hale gelmistir. Son on yildir, gerek bilim camiasi gerekse asi endüstrisinden H1N1 influenza, Ebola, Zika ve SARS-CoV-Z salginlarina acil ve etkili çözüm üretmeleri beklenmektedir. Bu noktada rekombinant, DNA, RNA ve peptit asilari gibi asi formlarina kiyasla inaktive asilar; daha kolay, hizli ve tek seferde yüksek dozda üretilebilir olmasi nedeniyle önem teskil etmektedir. inaktif asilar, bagisiklik sisteminin istilaci virüs partikülleri ile karsilastiklarindakine benzer bir antijenik sunum gerçeklestirirler. inaktif asi üretiminde bagisiklama açisindan etkili ve güvenli bir sonuç elde etmek için dikkat edilmesi gereken yönteme dayali basamaklar mevcuttur. 1. Teknik alanda, asi inaktiflestirme sürecinde kullanilabilen farkli yöntemler mevcuttur. Formaldehit veya ß-propiolakton gibi kimyasal modifikasyonlarin yani sira, ultraviyole radyasyon veya gama radyasyon ile birlikte fiziksel manipülasyonlar tercih edilebilmektedir. Ayrica görünür darbeli ultrashort lazer ve düsük enerjili elektron isinlamasi gibi yeni yaklasimlar da mevcuttur. Asi inaktiflestirme sürecinde kimyasal modifikasyonlar, saflastirma gerekliligi nedeniyle zaman alan yöntemler olmakla birlikte toksisite ile iliskili dezavantaja sahiptirler. Ayrica viral yapida degisikliklere de neden olabilmekte ve son ürün eldesinde saflastirma gerekliligi nedeniyle ürün kaybi da g'ozlenmektedir. Ultraviyole radyasyon, yapisal degisikliklerle birlikte düsük penetrasyon özelligi ile dikkat çekmektedir. Yeni yaklasimlardan emin olmak için ise konvansiyonel yöntemlere kiyasla yeterli veri toplanmasi gerekmektedir. 2. Tüm viral asilar, korumaya çalistiklari virüse benzeyen materyaller içerir. Bu, bagisiklik sistemini bir yanit olusturmaya ve gerçek bir viral enfeksiyonla karsilasirsa kullanilmaya hazir antikorlar üretmeye yönlendirir. Ancak virüsün asi ile indüklenen antikorlarin tanimadigi virüsün mutasyona ugramis versiyonlaridir. Anlamli oranda bir bagisiklama için toplumdaki genetik varyasyonu kapsayan bir asi profili olusturmak gerekir. Asinin temsil ettigi genetik varyasyon az ise toplumsal immünitenin tetiklenmesi istenilen oranda olmayacaktir. Bu nedenle bir veya birden fazla inaktif viral sus üretimi ve seçimi ve bu seçimin birden fazla mutasyon ile desteklenmesi, viral asilarin üretilmesi için 'önemli bir mekanizma olmaya devam etmektedir. 3. Laboratuvar ortaminda yüksek miktarda (bulk) üretim yapilirken farkli varyasyonlar olusabilmektedir. RNA'ya bagli RNA polimerazin düsük duyarliligindan dolayi, RNA virüsleri replikasyon sirasinda her zaman bir varyant havuzu üretir. Bu fenomen, virüsün hizli evrimi için potansiyel saglar, ancak virüs stabilitesi üzerinde zararli etkileri olan mutasyonlarin büyük bir kismini da olusturur. Artan virüs karmasikligi, popülasyonun virülans derecesinde zayiflamaya neden olabilir. Bu nedenle, bireysel varyantlarin karakterizasyonu, yeni nesil daha etkili ve daha güvenli asilarin tasarlanmasi için faydali bilgiler saglayabilir. Bu anlamda, teknik alanda, SARS-CoV-2 virüsüne karsi kullanilmak üzere, hizli, kapsayici ve yüksek dozda inaktif asi üretmime ihtiyaç duyulmaktadir. Sonuç olarak yukarida anlatilan olumsuzluklardan dolayi ve mevcut çözümlerin konu hakkindaki yetersizligi nedeniyle ilgili teknik alanda bir gelistirme yapilmasi gerekli kilinmistir. Bulusun Kisa Açiklamasi Mevcut bulus, yukarida bahsedilen gereksinimleri karsilayan, tüm dezavantajlari ortadan kaldiran ve ilave bazi avantajlar getiren, SARS-CoV-2 virüsüne karsi kullanilmak üzere, inaktif asi üretim yöntemi ile ilgilidir. Bulusun öncelikli amaci, çift doz (fraksiyone) gama irradiasyon (25 kGy/tek doz) ile hem inaktiflestirme hem de sterilizasyon basamaginin gerçeklestirildigi bir inaktif asi üretim yöntemi ortaya koymaktir. Gama irradiasyon ile hem donuk ürün isinlanabilmekte, böylelikle serbest radikal olusumu engellendigi için toksisite riski azalmakta, hem de viral protein yapisindaki olasi degisiklik riski azaltilmaktadir. Fonksiyonel viral yapilar korundugu için hem B hücre hem de T hücre yanitlari da tetiklenmektedir. Birinci doz isinlama ile canli ve enfektif virüs içeren ham ürün inaktif virüs içeren ara ürüne dönüstürülür. Böylelikle siseleme öncesinde hem çevre hem de personel korunmus olur. Siseleme (flakonlama) ve liyofilizasyon sonrasi gerçeklestirilen ikinci doz isinlama ise son ürün sterilizasyonu ve olasi replikant virüs varligini tümüyle ortadan kaldirmak amaciyla yapilmaktadir. Ayrica kimyasal yolla inaktiflestirme yöntemlerinden farkli olarak, izolasyon ve purifikasyon sürecine gereksinim duyulmamaktadir. Bu da ürün miktarinin korunmasi anlamina gelmektedir. Ozetle, fraksiyone (2 asamali) gama irradiasyon ile inaktivasyon ve sterilite elde edilirken, son ürün virüs yapisinda daha az hasar meydana gelmektedir. Bulusun bir diger amaci, tasima ve depolama asamalarindaki olasi problemleri ortadan kaldirmak ve istenilen stabiliteyi saglamak amaciyla donuk ham ürünün gama irradiasyon ile inaktif forma dönüstürülmesinden sonra eritilerek siselenme ve liyofilize edilme islem adimlarini içeren bir üretim yöntemi gerçeklestirmektir. Liyofilizasyon (dondurarak kurutma); kuru, aktif, uzun raf ömrüne sahip ve kolayca çözülebilen bir ürün elde etmek amaciyla dondurma ve kurutma islemlerinin faydalarini bir araya getiren bir islem olarak ifade edilmektedir. Liyofilizasyon isiya duyarli biyolojik materyallerin korunmasi için önem teskil etmektedir. Bulusa konu olan üretim yönteminde, donuk ham ürün gama irradiasyon ile inaktif forma dönüstürüldükten sonra eritilerek (immünite olusturabilen viral kopya- partikül sayisi/200 pl) siselenir ve liyofilize edilir. Liyofilize formulasyonlar daha iyi stabilite avantaji ile birlikte, tasima ve depolama sirasinda da kolay idare saglamaktadirlar. Bulusun bir diger amaci, pasajlar arasi olusabilecek mutasyonlarin belirlenmesini ve daha etkili, güvenli asi elde edilmesini saglayan bir yöntem gerçeklestirmektedir. Pasajlar arasi olusabilecek mutasyonlar virüs susunun virülans derecesinde zayiflamaya neden olabilmektedir. Bu nedenle, bulus konusu yöntemde, çok katli flasklarda kültüre edilen ve yüksek miktarda üretilen virüs izolatlarinin birim hacminin %50'si her pasajda dondurulmus ve olasi mutasyonlari belirlemek amaciyla genom analizi için örnek verilmistir. Son ürün hazirlanirken dondurulan ham ara ürünler havuzlanmistir. Böylelikle pasajlar arasi bireysel varyantlarin havuzlama öncesi karakterizasyonu yapilarak daha etkili ve daha güvenli bir asi tasarimi için son ürün olusturulmustur. Bulus konusu yöntemde, inaktif asi formu için uygun izolat degerlendirilirken viral genom sekanslama yapilmis ve varyant listesi olusturulmustur. Yapilan analizlerde viral genom dizisi ile %95'ten büyük oranda örtüsen datalar, çalismak için güvenilir kabul edilmistir. Ozellikle inaktif asi üretiminde kullanilan örnekte tespit edilen D614G, spike proteininde meydana gelen bir mutasyon olmakla birlikte hastaligin agresif seyretmesiyle iliskili bir varyanttir. Bu varyant enfektivite ve mortalite artisi saglayan sus olmasi nedeniyle tercih edilmistir. Ayrica, söz konusu yönteme yönelik uygulamalarda, hastalardan alinan klinik anlam tasimasi için örnek seçimi, uygun transfer solüsyonu içine alinmasi, Iaboratuvara ulastirilmasi ve gerektiginde uygun kosullarda saklanmasi ile ilgili kurallara uyulmasi son derece önem arz etmektedir. Bahsedilen islemlerin uygun oldugu örneklerde, kontaminasyon oranlari daha az olmakta ve basarili bir izolasyon süreci baslatilabilmektedir. Bu amaçla, söz konusu yönteme yönelik yapilan çalisamalarda, COVlD-19 hastasindan viral yükün en yogun oldugu 7. günde alinan nazofarengeal ve orofaringeal sürüntü örnekleri transfer solüsyonu (%3 PSA içeren DMEM HG (fenol kirmizisi içermeyen» içerisinde 2-8 derecede 1 saat bekletilerek kontaminasyon riski engellenirken ürünün stabilitesi de korunmustur. Bulusun yapisal ve karakteristik özellikleri ve tüm avantajlari asagida verilen sekiller ve bu sekillere atiflar yapilmak suretiyle yazilan detayli açiklama sayesinde daha net olarak anlasilacaktir ve bu nedenle degerlendirmenin de bu sekiller ve detayli açiklama göz önüne alinarak yapilmasi gerekmektedir. Bulusun Anlasilmasina Yardimci Olacak Sekiller Sekil 1*de bulus konusu fraksiyone inaktif SARS-COV-2 asisi üretim yönteminin islem adimlari verilmektedir. Sekil 2'de bulus konusu yönteme yönelik çalismalarda, elde edilen Acibadem Labcell koronavirüs izolatinin Vero hücresi içinde transmisyon elektron mikroskopi (TEM) görüntüsü verilmektedir. Sekil Saida Acibadem Labcell virüs izolati kopya sayisi (Nanosight), Sekil 3b'de Acibadem Labcell koronavirüs izolatinin negative boyama ile taramali elektron mikroskopi (SEM) görüntüsü verilmektedir. Sekil 4ide Acibadem Labcell virüs izolati TCID50 degeri verilmektedir. Sekil 4A, gerçek zamanli Vero hücre analizi ile SARS-COV-Z inkübasyonu sonrasi normalize hücre indeks degerlerini (72 saat), Sekil 48 farkli titrelerde SARS-COV-2 inkübasyonu sonrasi normalize Vero hücre indeks degerlerini göstermektedir. Sekil 5'te Acibadem Labcell koronavirüs izolati proteome analizi verilmektedir. Sekil 6=da Acibadem Labcell koronavirüs izolati genom analizi verilmektedir. Sekil 7'de Acibadem Labcell virüs izolati genom sekansinin Türkiye'den GISAIDe girisi yapilan tüm sekanslar arasindaki yerlesimi verilmektedir. Bulusun Detayli Açiklamasi Bu detayli açiklamada bulus konusu yöntem sadece konunun daha iyi anlasilmasina yönelik olarak ve hiçbir sinirlayioi etki olusturmayacak sekilde açiklanmaktadir. Bulus, SARS-CoV-2 virüsüne yönelik kullanilmak üzere, inaktif asi üretmek üzere bir yöntem ile ilgilidir. Sekil 1*de söz konusu üretim yönteminin islem adimlari verilmektedir. Buna göre, ilk etapta, Sars-CoV-2 izolasyonu ve kültürü yapilmaktadir. Bu amaçla, COVlD-19 hastalarindan nazofarengeal ve orofaringeal sürüntü örnekleri alinmaktadir. Söz konusu sürüntü örnekleri, tercihen hastaligin 7. gününde alinmaktadir. Çünkü, 7. gün, viral yükün en yogun oldugu gündür. Alinan sürüntü örnekleri, viral stabilliteyi saglama ve kontaminasyon riskini önlemek amaciyla transfer solüsyonuna eklenmektedir. Bulus konusu yöntemde kullanilan transfer solüsyonu, %3 peniIisin-streptomisin-amfoterisin B (PSA) içeren DMEM HG (fenol kirmizisi içermeyen)'dir. Ornegin, transfer solüsyonu içerisine transferinin saglanmasi asamasinda sicaklik 2-8 °C sicaklik araligindadir. Transfer edilen ürün, vero hücreleri üzerine eklenmeden önce tercihen 1 saat 4 "C'de inkübe olmalidir. Bu durum, antimikrobiyal etkinligin ortaya çikmasi için önemlidir. COVID- 19 nükleik asit tayini için söz konusu transfer solüsyonundan tercihen 100 pl örnek kültürü islemine tercihen 96 kuyucuklu plaka ile baslanmaktadir. Plakanin 1. sütunu hariç: her kuyucuga tercihen 50 pl DMEM HG (w/o fenol kirmizisi) eklenmektedir. 96 kuyucuklu plakanin 1. sütununa tercihen 100 pl virüs örnegi eklenmekte ve 50 pl=yi alinarak 2. sütundan 12. sütuna kadar seri dilüsyon yaparak dagitilmaktadir. Her bir kuyucuga 100 pl DMEM HG (% 4 FBS, % 2 PSA w/o fenol kirmizisi) içerisinde süspanse edilmis 25 x 103 vero hücresi eklenmektedir. Bu anlamda, kuyucuk basina 25000 vero hücresi/100 pl olacak sekilde ekim yapilmaktadir. Ardindan, 96 saat boyunca tercihen 37°C'de, %5 COz'de inkübasyon uygulanmaktadir. Söz konusu 96 saatin sonunda her bir kuyucuk, pipet ucu ile kazilmakta ve örnekler 15 mLiIik falkon tüpe toplanmaktadir. Tüp içerigi tercihen +4°C ve 300 @de 5 dakika santrifüj edilmektedir. Bu asamada, süpernatant toplanmakta, DMEM HG (%2 FBS, %1 PSA w/o fenol kirmizisi) ile 20 mL'ye tamamlanmaktadir. Bir sonraki islem adiminda, %90 konfluent vero hücresi ekili 24 kuyucuklu plaka kullanilmaktadir. Her bir kuyucuk 1ier mL DMEM HG (%2 PSA w/o fenol kirmizisi) ile yikanmaktadir. Söz konusu plakanin, ilk 5 sütununa 20 mL*ye tamamlanan virüs örnegi dagitilmaktadir. 6. sütunda ise her bir kuyucuga 1ier mL DMEM HG (%2 FBS, %1 PSA wi'o fenol kirmizisi) eklenerek kontrol grubu olusturulmaktadir. Ardindan, ?2 saat boyunca tercihen 37°C'de, %5 C0: 'de inkübasyon uygulanmaktadir. 72 saatin sonunda her bir kuyucuk pipet ucu ile kazilarak, örnekler 50 mlrlik falkon tüpe toplanmaktadir. Tüp içerigi tercihen +4°C ve 300 @de 5 dakika santrifüj edilmektedir. Bu asamada, süpernatant toplanmakta, DMEM-HG (%2 FBS, %1 PSA wfo fenol kirmizisi) ile tercihen 40 mL'ye tamamlanmaktadir. sonra, her bir flask ile yikanmaktadir. 40 mL'ye tamamlanan virüs örnegi, söz konusu iki T-75 flaska dagitilmaktadir. Ardindan, saatin sonunda flask içerigi, pipet ucu ile kazilmakta ve örnekler 50 ml=lik falkon tüpe toplanmaktadir. Tüp içerigi tercihen +4°C ve 300 G*de 5 dakika santrifüj edilmektedir. Bu asamada, süpernatant toplanmakta, 10 mL, 2 adet 4ml olacak sekilde 5'lik vial (stok numune), 2 adet 1ml olacak sekilde 21ik vial (sahit numune) olmak üzere porsiyonlanarak, daha sonra kalite kontrol analizlerinde kullanilmak üzere tercihen -80 "Cide çift paketleme ile dondurulmaktadir. Kalan süpernatant, DMEM HG (%2 FBS, %1 PSA w/o fenol kirmizisi) ile 60 mL=ye tamamlanmaktadir. sonra, her bir flask 15ier mL DMEM HG (%2 PSA w/o fenol kirmizisi) ile yikanmaktadir. 60 mL'ye tamamlanan virüs örnegi, 2 adet T-175 flaska dagitilmaktadir. 72 saat boyunca tercihen 37"C'de, %5 C02'de inkübasyon uygulanmaktadir. 72. saatin sonunda flask içerigi pipet ile kazilmakta, örnekler 50 mL=Iik falkon tüpe toplanmaktadir. Tüp içerigi tercihen +4 "C ve 300 @de 5 dakika santrifüj edilmektedir. Bu asamada, süpernatant toplanmakta, 10 mL; 2 adet 4ml olacak sekilde Silik vial (stok numune), 2 adet 1mI olacak sekilde 2*Iik vial (sahit numune) olmak üzere porsiyonlayarak daha sonra kalite kontrol analizlerinde kullanilmak üzere tercihen -80 "C'de çift paketleme ile dondurulmaktadir. Kalan süpernatant, DMEM HG (%2 FBS, %1 PSA w/o fenol kirmizisi) ile 100 erye tamamlanmaktadir. sonra her bir flask 25'er mL DMEM HG (%2 PSA wi'o fenol kirmizisi) ile yikanmaktadir. 100 mL'ye tamamlanan virüs örnegi, 2 adet T-300 flaska dagitilmaktadir. Ardindan, 72 saat boyunca tercihen 37 °C'de, %5 C02'de inkübasyon uygulanmaktadir. 72. saatin sonunda flask içerigi, pipet ile kazilmakta, örnekler 50 ml'lik falkon tüplere toplanmaktadir. Tüp içerigi, tercihen +4 °C'de ve 300 @de 5 dakika santrifuj edilmektedir. Bu asamada, süpernatant toplanmakta, 10 mL; 2 adet 4mI olacak sekilde 5'Iik vial (stok numune), 2 adet 1mI olacak sekilde 2'Iik vial (sahit numune) olmak üzere porsiyonlanarak daha sonra kalite kontrol analizlerinde kullanilmak üzere, tercihen -80 *Ilde çift paketleme ile dondurulmaktadir. Kalan süpernatant, DMEM HG (%2 FBS, %1 PSA w/o fenol kirmizisi) ile 200 mL'ye tamamlanmaktadir. sonra, her bir flask ile yikanmaktadir. 200 mL'ye tamamlanan virüs örnegi, 4 adet T-300 flaska dagitilmaktadir. 72 saat boyunca tercihen 37 "C'de, %5 C02'de inkübasyon uygulanmaktadir. 72. saatin sonunda flask içerigi, pipet ile kazilmakta, örnekler 50 mL'Iik falkon tüplere toplanmaktadir. Tüp içerigi; tercihen +4 °C ve 300 @de 5 dakika santritüj edilmektedir. Bu asamada, süpernatant toplanmakta, 10 mL; 2 adet 4ml olacak sekilde 5ilik vial (stok numune), 2 adet 1ml olacak sekilde 2*Iik vial (sahit numune) olmak üzere porsiyonlanarak daha sonra kalite kontrol analizlerinde kullanilmak üzere, tercihen -80 °Crde çift paketleme ile dondurulmaktadir. Kalan süpernatant, DMEM HG (%2 FBS, %1 PSA w/o fenol kirmizisi) ile 400 mL=ye tamamlanmaktad ir. konfluent ulastiginda besiyeri içerigi uzaklastirilmaktadir. Her bir flask, 50iser mL DMEM HG (%2 PSA w/o fenol kirmizisi) ile yikanmaktadir. DMEM HG (%2 FBS, %1 PSA w/o fenol kirmizisi) ile 400 mL*ye tamamlanan virüs Örnegi, 4 adet çok katli flaska dagitilmaktadir. 72 saat boyunca tercihen 37°C'de, %5 COg'de inkübasyon uygulanmaktadir. 72. saatin sonunda flask içerigi, 50 mL'Iik falkon tüplere toplanmaktadir. Tüp içerigi, tercihen +4 C ve 300 @de 5 dakika santrifüj edilmektedir. Süpernatant toplanarak, yaklasik 400 mL solüsyon elde edilmektedir. Bahsedilen süpernatantin 200 mL'si tercihen 45um'lik filtreden geçirilmektedir. Tercihen mlilik virüs çözeltisi, Amicon Ultra 100,000 kDa NMWL santrifüj konsantratörlerine ilave olarak santrifüj edilmektedir. Bu sayede, virüsün konsantre edilmesi saglanmaktadir. Santrifüj sonrasi, elde edilen konsantre, 10 mL'Iik enjektör yardimiyla toplanmaktadir. 0,5 ml örnek, testler ve üretim için stok olarak ayrilmakta ve izotonik solüsyonla 5 ml*e dilüe edilerek, 5 adet 2*Iik vialde alikotlanarak tercihen -80 °C*de dondurulmaktadir. Geri kalan miktar ise 55Iik kriyoviallere alikotlanarak tercihen -80 °C'de dondurulmaktadir. Farkli zamanlarda alikotlama islemi, olasi genom varyasyonunun karakterizasyonu ve havuz içerigininin belirlenmesi adina önem tasimaktadir. Kalan diger ile 800 mL*ye tamamlanmaktadir. %90 konfluent vero hücresi ekili 8 adet çok katli flaskin besiyeri içerigi uzaklastirildiktan sonra, her bir flask, 50*ser mL DMEM HG (%2 PSA w/o tenol kirmizisi) ile yikanmaktadir. 800 mL'ye tamamlanan virüs örnegi, 8 adet çok katli flaska dagitilmaktadir. 72 saat boyunca tercihen 37°C'de, %5 COz'de inkübasyon uygulanmaktadir. 72 saatin sonunda flask içerigi, 50 mL=Iik falkon tüplere toplanmaktadir. Bahsedilen tüp içerigi, tercihen, +4 °C ve 300 @de 5 dakika santrifüj edilmektedir. Bu asamada, süpernatantin 400 mL'si 45um=lik filtreden geçirilmektedir. 15 ml'lik virüs çözeltisi Amicon Ultra 100,000 kDa NMWL santrifüj konsantratörlerine ilave edilmekte ve edilmektedir. Santrifüj sonrasi elde edilen konsantre, 10 mL'Iik enjektör yardimiyla toplanmaktadir. 0,5 ml örnek ise testler ve üretim için stok olarak ayrilip izotonik solüsyonla 5 ml'e dilüe edilmekte, 5 adet 2'Iik vialde alikotlanarak tercihen -80 "C'de dondurulmaktadir. Geri kalan miktar, 5*Iik kriyoviallere alikotlanarak tercihen -80 °C'de dondurulmaktadir. Kalan diger 400 ml süpernatant, DMEM HG (%2 FBS, %1 PSA w/o fenol kirmizisi) ile 1600 mL'ye tamamlanmaktadir. sonra, her bir flask, 50iser mL DMEM HG (%2 PSA w/o fenol kirmizisi) ile yikanmaktadir. 1600 mL'ye tamamlanan virüs örnegi, 16 adet çok katli flaska dagitilmaktadir. 72 saat boyunca 37°C'de, %5 C02'de inkübasyon yapilmaktadir. 72. saatin sonunda flask içerigi 50 ml'lik falkon tüplere toplanmaktadir. Bu asamada, söz konusu tüpün içerigi, tercihen filtreden geçirildikten sonra, tercihen 15 ml virüs çözeltisi, Amicon Ultra 100,000 kDa NMWL santrifüj konsantratörlerine ilave edilmekte ve 19-25 °C sicaklik araliginda 2500 konsantre, 10 mL'Iik enjektör yardimiyla toplanmaktadir. 0,5 ml örnek ise, testler ve alikotlanarak tercihen -80 cOde dondurulmaktadir. Geri kalan miktar ise, 5*Iik kriyoviallere alikotlanarak tercihen -80 @de dondurulmaktadir. Kalan diger 800 ml süpernatant, DMEM HG (%2 FBS, %1 PSA w/o fenol kirmizisi) ile 3200 mL'ye tamamlanmaktadir. sonra, her bir flask, 50'ser mL DMEM HG (%2 PSA w/o fenol kirmizisi) ile yikanmaktadir. 3200 mL'ye tamamlanan virüs örnegi, söz konusu 32 adet çok katli flaska dagitilmaktadir. 72 saat boyunca 37°C'de, %5 COZ'de inkübasyon uygulanmaktadir. 72. saatin sonunda flask içerigi, 50 mL*Iik falkon tüplere toplanmaktadir. Söz konusu tüp içerigi, tercihen +4°C ve 300 @de 5 dakika santrifüj edilmektedir. Süpernatantin tamami, vacuum 45um'lik filtreden geçirilmektedir. Tercihen 15 ml*lik virüs çözeltisi, Amicon Ultra 100,000 kDa NMWL santrifüj konsantratörlerine ilave edilmekte ve tercihen 19-25 "C sicaklik araliginda 2500 G*de 25 dakika boyunca frensiz olarak santrifüj edilmektedir. Santrifüj sonrasi elde edilen konsantre, 10 mL'Iik enjektör yardimiyla toplanmakta, 0,5 ml örnek ise testler ve üretim için stok olarak ayrilarak izotonik solüsyonla 5 ml=e dilüe edilip 5 adet 2'lik vialde alikotlanarak tercihen -80 cCide dondurulmaktadir. Geri kalan miktar ise, 5*lik kriyoviallere alikotlayarak tercihen -80 oC'de dondurulmaktadir. Bu asamaya kadar, alikotlanarak tercihen -80 °C'de dondurulup saklanan tüm konsantre virüs solüsyonunu, tercihen 25 C'de eritilmekte ve bahsedilen tüm örnekler birlestirilmektedir. Elde edilen volüm, oransal olarak 10 kat apirojenik distile su ile dilüe edilmektedir. Tercihen 15 ml solüsyonu, Amicon Ultra 100,000 kDa NMWL santrifüj boyunca frensiz olarak santrifüj edilmektedir. Konsantorde kalan yogun virüs çözeltisi, tekrar 10 kat apirojenik distile su ile dilüe edilmekte ve Amicon Ultra 100,000 kDa NIViWL santrifüj konsantratörlerinde tercihen 19- "C sicaklik araliginda 2500 @de 25 dakika boyunca frensiz olarak santrifüj edilmektedir. Konsant'orde kalan yogun virüs solüsyonundan 1 ml ayrilarak, apirojen distile su ile 10 kat dilüe edilmekte ve 0,5 mL 20 vial seklinde tercihen -80 "Eda dondurulmaktadir. Bu asamada, ara ürün kalite kontrol testleri uygulanabilmektedir. Bu testler; sterilite, mikoplazma, RT-PCR (titration), TCID50 (potency and tittation), SRID testi (identity), elektron mikroskopi, partikül sayisi, sekans analizi (degisken mutasyon analizi), proteom analizi, konak hücre proteini, konak hücre DNA'si ve termal stabilitedir. Geri kalan miktar, 50 mislik tüplere 35 ml olarak paylastirilarak, tercihen -80 cC'de dondurulmaktadir. inaktif viral ara ürünün hazirlanmasi için uygulanan islem adimlarinda ilk olarak, 5 adet falkon, sert plastik otoklav kabina dik pozisyonda sallanmayacak sekilde yerlestirilmektedir. Ortadaki bosluga, kaza aninda tüplerin çevre kirliligi olusturmasini engellemek üzere, saf formaldehit içeren ince cam flakonlar, sarsilmayacak sekilde yerlestirilmektedir. Kapak sikica kapatildiktan sonra, ürünün yerlestirildigi sert plastik otoklav kabi, çift biyogüvenlilik torbasinin içine yerlestirilmekte ve paketin saglamligi kontrol edilmektedir. Bir sonraki islem adiminda, sert polikarbonat transfer çantasi içine yerlestirilmekte ve çantanin içi, kuru buz ile doldurulmaktadir. Bu asamada, kilidin açilmayacak sekilde kitlendiginden emin olunmali, ürün evraklari ve çanta etiketi kontrol edilmelidir. Konsantre virüsün bulundugu tüpler, esit isinlanmayi saglamak için döner bir sistem kullanarak bir isinlama cihazi ile tercihen 2.5 mega rad (25 kilo gray) dozuyla isinlanmaktadir. Bu islem, fraksiyone 1. gama irradiasyondur ve viral protein yapisinin korunarak inaktivasyonun saglanmasi adina önem arz etmektedir. Isinlanma islemi sonrasi, isinlanan falkon tüplerden 1 tanesi hariç digerleri, tercihen -80 cC=de dondurulmakta ve saklamaya alinmaktadir. Geri kalan 1 adet 50 mL'Iik falkon tüpteki isinlanmis virüs solüsyonu, %0,3 HSA içeren apirojenik distile su ile 1x1011 kopya sayisi veya partikül sayisi/mL olacak sekilde dilüe edilmektedir. SRID testi için 20 adet 1 ml'lik flakon olusturulmakta ve tercihen -80 cCide dondurulmaktadir. Geri kalan ürün, 2 mL'Iik steril cam flakon içerisine 1'er mi olacak sekilde paylastirilmakta ( ve kapaklar kapatilmaktadir. Bu örneklerden rastgele seçilen 3 örnek ile replikatif kompetan koronavirüs çalisilmaktadir. Söz konusu örnekler, 2 saat boyunca tercihen -80 "C" de bekletilmekte ve ardindan edilmis flakonlarin kapaklari kapatilmakta ve etiketlenmektedir. Bahsedilen flakonlar, kirilmayacak sekilde tepsiye dizilmeli, ardindan polikarbonat transfer çantalarina yerlestirilmelidir. Çanta içi, kuru buz ile doldurulmakta, kilidi kilitlenmektedir. Ardindan çanta, sekonder paket ile korumaya alinmakta, çanta etiketini yapistirilmaktadir. Konsantre virüsün bulundugu tüpler, esit isinlanmayi saglamak için döner bir sistem kullanarak bir isinlama cihazi ile tercihen 2.5 mega rad (25 kilo gray) dozuyla isinlanmaktadir. Bu islem adimi, fraksiyone 2. gama irradiasyondur ve son ürün sterilizasyonu adina önem arz etmektedir. Toplam doz üzerinden toksisitenin azaltilmasi hedeflenmektedir. Donmus olarak gelen ürünler, tercihen +4 "C'de saklamanmaya alinmakta ve son ürün kalite kontrol geregi asagidaki listelenen testlere alinmaktadir: - Partikül sayimi - Konak hücre protein tayini - Konak hücre DNA tayini - Potency (SRID testi) - Termal stabilite - Ambalaj - Osmolarite - Replikatif kompetan koronavirüs - Elektron mikroskopi - Proteom analizi - Sterilite Tablo 1rde bulusa konu olan yönteme yönelik çalismalarda, Acibadem Labcell koronavirüs izolatinin variant bilgileri yer almaktadir. Sample ID Nucleoticle Gene Protein Nucleoti'de Variant type Amino acid change Conservation among pusi'tion change (ReffAlt) 5332 genomedaia [from (Bel/'Alti GISAIDJ 241 5' UTFi NA CIT norrcoding 7 50,52% 1230') ORFlab NspD CIT missense L-'l2F ?BAWAG 1A4`JS ORFlab RNAýdepe'ident (JT missense PSZSL ELUJVAG llNA Palymerase Acibadem law& uiii iab ItNA-depeadent c/i synünymuus Mizv ananas 25559 IV membran& C/T misss-use L13F Sil-45% glycoprcitein phosphoprotein phoaphoprotcin phosphoprotein Tablo 1. Acibadem Labcell koronavirüs izolati variant bilgileri Sekil Sa'da Acibadem Labcell virüs izolati kopya sayisi (Nanosight), Sekil 3b'de Acibadem Labcell koronavirüs izolatinin negative boyama ile taramali elektron mikroskopi (SEM) görüntüsü verilmektedir. Buna göre, inaktif Sars Cov-2 asisi OZG 38-61 partikül analizleri homojen bir yapi oldugu 272 milyon/ml partikül içerdigi ve inaktivasyon sonrasi ana yapilarin (Zarf /Spike) korundugu gözlenmektedir. Yukarida bahsedilen teknik problemleri çözmek ve detayli anlatimdan anlasilacak tüm avantajlari gerçeklestirmek üzere mevcut bulus; SARS-COV-2 virüsü için inaktif asi üretim yöntemi olup; Sars-CoV-2 virüsünün izolasyonunun ve kültürünün yapilmasi, Elde edilen virüs solüsyonunun konsantre edilmesi, Olasi genom varyasyonunun karakterizasyonu ve havuz içerigininin belirlenmesi adina farkli zamanlarda alikotlama isleminin uygulanmasi, Viral protein yapisinin korunarak inaktivasyonun saglanmasi adina, konsantre virüsün bulundugu tüplere, esit isinlanma saglanacak sekilde fraksiyone 1. gama irradiasyon uygulanmasi, Söz konusu fraksiyone 1. gama irradiasyon uygulamasi sonrasi, Iiyofilizasyon uygulanmasi, Son ürün sterilizasyonunu saglamak adina, konsantre virüsün bulundugu tüplere, esit isinlanma saglanacak sekilde, fraksiyone 2. gama irradiasyon uygulanmasi islem adimlarini içermesi ile ilgilidir. TR DESCRIPTION A METHOD FOR THE PRODUCTION OF A FAST, COMPREHENSIVE AND HIGH DOSE INACTIVE VACCINE FOR USE AGAINST THE SARS-CoV-2 VIRUS. It relates to a developed and optimized method for the production of high-dose inactive vaccines. State of the Art The COVID-19 epidemic caused by SARS-CoV-Z has created an unprecedented crisis that has caused great damage to human health as well as the global economy. Since the virus in question is new, there is no coronavirus vaccine on the market. At the same time, large-scale production capacity for these vaccines is not yet available. Therefore, vaccine development processes and capacities against the mentioned virus need to be constructed correctly. SARS-CoV-2 vaccines have become very important to reduce morbidity and mortality when the virus causes an epidemic in the population. For the last decade, both the scientific community and the vaccine industry have been expected to produce urgent and effective solutions to the H1N1 influenza, Ebola, Zika and SARS-CoV-Z epidemics. At this point, compared to vaccine forms such as recombinant, DNA, RNA and peptide vaccines, inactivated vaccines; It is important because it is easier, faster and can be produced in high doses at once. Inactivated vaccines provide an antigenic presentation similar to that of the immune system when it encounters invading virus particles. There are method-based steps that need to be taken into consideration in order to obtain an effective and safe result in terms of immunization in the production of inactive vaccines. 1. In the technical field, there are different methods that can be used in the vaccine inactivation process. In addition to chemical modifications such as formaldehyde or ß-propiolactone, physical manipulations with ultraviolet radiation or gamma radiation may be preferred. There are also new approaches such as visible pulsed ultrashort laser and low-energy electron irradiation. Chemical modifications in the vaccine inactivation process are time-consuming methods due to the need for purification, but they have the disadvantage of toxicity. It may also cause changes in the viral structure and product loss is also observed due to the need for purification in obtaining the final product. Ultraviolet radiation attracts attention with its low penetration properties along with structural changes. To be confident about new approaches, sufficient data must be collected compared to conventional methods. 2. All viral vaccines contain materials that resemble the virus they are trying to protect. This prompts the immune system to mount a response and produce antibodies ready to be used if it encounters an actual viral infection. However, they are mutated versions of the virus that are not recognized by vaccine-induced antibodies. For significant immunization, it is necessary to create a vaccine profile that covers the genetic variation in the population. If the genetic variation represented by the vaccine is low, the triggering of herd immunity will not be at the desired rate. Therefore, the production and selection of one or more inactive viral strains and the support of this selection by multiple mutations remains an important mechanism for the production of viral vaccines. 3. Different variations may occur when producing large quantities (bulk) in a laboratory environment. Because of the low sensitivity of the RNA-dependent RNA polymerase, RNA viruses always produce a pool of variants during replication. This phenomenon provides the potential for rapid evolution of the virus, but also accounts for a large proportion of mutations that have detrimental effects on virus stability. Increasing virus complexity may lead to a weakening of the virulence of the population. Therefore, characterization of individual variants may provide useful information for designing the next generation of more effective and safer vaccines. In this sense, in the technical field, there is a need to produce rapid, comprehensive and high-dose inactive vaccines to be used against the SARS-CoV-2 virus. As a result, due to the negativities described above and the inadequacy of existing solutions on the subject, it has become necessary to make a development in the relevant technical field. Brief Description of the Invention The present invention relates to an inactive vaccine production method for use against the SARS-CoV-2 virus, which meets the above-mentioned requirements, eliminates all disadvantages and brings some additional advantages. The primary aim of the invention is to introduce an inactive vaccine production method in which both inactivation and sterilization steps are carried out with double dose (fractionated) gamma irradiation (25 kGy/single dose). With gamma irradiation, the frozen product can be irradiated, thus reducing the risk of toxicity as free radical formation is prevented and the risk of possible changes in the viral protein structure is reduced. Since functional viral structures are preserved, both B cell and T cell responses are triggered. With the first dose of irradiation, the raw product containing live and infective virus is converted into the intermediate product containing inactive virus. In this way, both the environment and personnel are protected before bottling. The second dose of irradiation, which is performed after bottling (vialing) and lyophilization, is performed for the purpose of final product sterilization and to completely eliminate the possible presence of replicant virus. Additionally, unlike chemical inactivation methods, there is no need for an isolation and purification process. This means preserving the amount of product. In summary, while inactivation and sterility are achieved with fractionated (2-stage) gamma irradiation, less damage occurs to the final product virus structure. Another aim of the invention is to realize a production method that includes the process steps of melting, bottling and lyophilizing the frozen raw product after converting it into inactive form by gamma irradiation, in order to eliminate possible problems in the transportation and storage stages and to ensure the desired stability. Lyophilization (freeze drying); It is expressed as a process that combines the benefits of freezing and drying processes in order to obtain a product that is dry, active, has a long shelf life and is easily soluble. Lyophilization is important for the preservation of heat-sensitive biological materials. In the production method of the invention, the frozen raw product is converted into inactive form by gamma irradiation, then melted (number of viral copies-particles capable of creating immunity/200 pl) and bottled and lyophilized. Lyophilized formulations have the advantage of better stability and provide easy handling during transportation and storage. Another aim of the invention is to provide a method that enables the determination of mutations that may occur between passages and the obtaining of a more effective and safe vaccine. Mutations that may occur between passages may cause a weakening in the virulence of the virus strain. Therefore, in the method of the invention, 50% of the unit volume of virus isolates cultured in multilayer flasks and produced in high quantities was frozen at each passage and a sample was given for genome analysis in order to determine possible mutations. While the final product was being prepared, the frozen raw intermediate products were pooled. Thus, by characterization of individual variants across passages before pooling, the final product was created for a more effective and safer vaccine design. In the method of the invention, while evaluating the isolate suitable for the inactive vaccine form, viral genome sequencing was performed and a variant list was created. In the analyses, data that overlapped more than 95% with the viral genome sequence were considered reliable for study. D614G, which was detected especially in the sample used in the production of inactive vaccine, is a mutation occurring in the spike protein and is a variant associated with the aggressive course of the disease. This variant was preferred because it is the strain that increases infectivity and mortality. In addition, in the applications of the method in question, it is extremely important to comply with the rules regarding the selection of samples taken from patients, placing them in the appropriate transfer solution, transporting them to the laboratory and storing them under appropriate conditions when necessary, in order for them to have clinical significance. In samples where the mentioned processes are appropriate, contamination rates are lower and a successful isolation process can be initiated. For this purpose, in the studies conducted on the method in question, nasopharyngeal and oropharyngeal swab samples taken from the COVLD-19 patient on the 7th day, when the viral load was most intense, were kept in transfer solution (DMEM HG containing 3% PSA (without phenol red) at 2-8 degrees for 1 hour. While the risk of contamination is prevented, the stability of the product is preserved. The structural and characteristic features and all the advantages of the invention will be understood more clearly thanks to the figures given below and the detailed explanation written by making references to these figures, and therefore the evaluation of the invention should be made by taking these figures and detailed explanation into consideration. Figures to Help Understanding Figure 1 shows the process steps of the fractionated inactive SARS-COV-2 vaccine production method of the invention. Figure 2 shows the transmission electron microscopy (TEM) image of the Acibadem Labcell coronavirus isolate obtained in the Vero cell in the studies on the method of the invention. is given. Figure Saida Acibadem Labcell virus isolate copy number (Nanosight), Figure 3b shows the scanning electron microscopy (SEM) image of Acibadem Labcell coronavirus isolate with negative staining. Figure 4 shows the TCID50 value of Acibadem Labcell virus isolate. Figure 4A shows the normalized cell index values after SARS-COV-Z incubation (72 hours) with real-time Vero cell analysis, and Figure 48 shows the normalized Vero cell index values after SARS-COV-2 incubation with different titers. Figure 5 shows the proteome analysis of Acibadem Labcell coronavirus isolate. Figure 6 shows the genome analysis of Acibadem Labcell coronavirus isolate. Figure 7 shows the placement of the Acibadem Labcell virus isolate genome sequence among all sequences entered in GISAAID from Turkey. Detailed Description of the Invention In this detailed explanation, the method of the invention is explained only for a better understanding of the subject and in a way that does not create any limiting effect. The invention relates to a method to produce an inactive vaccine for use against the SARS-CoV-2 virus. Figure 1* gives the process steps of the production method in question. Accordingly, in the first stage, Sars-CoV-2 isolation and culture are performed. For this purpose, nasopharyngeal and oropharyngeal swab samples are taken from COVlD-19 patients. The swab samples in question are preferably taken on the 7th day of the disease. Because the 7th day is the day when the viral load is most intense. The swab samples taken are added to the transfer solution to ensure viral stability and prevent the risk of contamination. The transfer solution used in the method of the invention is DMEM HG (without phenol red) containing 3% penicine-streptomycin-amphotericin B (PSA). For example, during the transfer phase into the transfer solution, the temperature is in the range of 2-8 °C. The transferred product should preferably be incubated for 1 hour at 4 °C before adding it onto vero cells. This is important for the antimicrobial activity to occur. For COVID-19 nucleic acid determination, 100 pl of the transfer solution in question is preferably added to the sample culture process, preferably in a 96-well method. Except for the 1st column of the plate: 50 pl of DMEM HG (w/o phenol red) is preferably added to the 1st column of the 96-well plate, and 50 pl is taken from the 2nd column to the 12th column. 25 x 103 vero cells suspended in 100 pl DMEM HG (4% FBS, 2% PSA w/o phenol red) are added to each well. In this sense, 25000 vero cells/100 pl per well. Then, incubation is performed for 96 hours, preferably at 37°C and 5% CO2. At the end of the 96 hours, each well is scraped with a pipette tip and the samples are collected into a 15 mL falcon tube. The tube content is preferably centrifuged at +4°C and 300 °C for 5 minutes. At this stage, the supernatant is collected and made up to 20 mL with DMEM HG (2% FBS, 1% PSA w/o phenol red). In the next processing step, a 24-well plate seeded with 90% confluent vero cells is used. Each well is washed with 1 mL of DMEM HG (2% PSA w/o phenol red). 20 mL of the virus sample is distributed into the first 5 columns of the plate in question. In the 6th column, a control group is created by adding 1 mL of DMEM HG (2% FBS, 1% PSA with phenol red) to each well. Next, ? Incubation is performed for 2 hours, preferably at 37°C, 5% CO. At the end of 72 hours, each well is scraped with a pipette tip and the samples are collected in a 50 ml falcon tube. The tube content is preferably centrifuged at +4°C and 300 °C for 5 minutes. At this stage, the supernatant is collected and preferably made up to 40 mL with DMEM-HG (2% FBS, 1% PSA wfo phenol red). is then washed with each flask. The virus sample, completed to 40 mL, is distributed into the two T-75 flasks. Then, at the end of the hour, the contents of the flask are scraped with the pipette tip and the samples are collected into a 50 ml falcon tube. The tube content is preferably centrifuged at +4°C and 300 G* for 5 minutes. At this stage, the supernatant is collected, 10 mL is portioned into 2 4ml 5 vials (stock samples), 2 1ml 21 vials (witness samples) and preferably -80" Cide to be used later in quality control analyses. The remaining supernatant is made up to 60 mL with DMEM HG (2% FBS, 1% PSA w/o phenol red) and then each flask is filled with 15 mL of DMEM HG (2% PSA w/o phenol red). The virus sample, completed to 60 mL, is distributed into 2 T-175 flasks and incubated for 72 hours, preferably at 37°C and 5% CO2. At the end of the 72nd hour, the contents of the flask are scraped with a pipette and the samples are collected into a 50 mL falcon tube. The content of the tube is preferably centrifuged at +4 "C and 300 °C for 5 minutes. At this stage, the supernatant is collected, 10 mL; 2 4ml Silent vials (stock sample), 2 1mI 2*Light vials (witness sample). It is divided into portions and then frozen in double packaging, preferably at -80 °C, to be used in quality control analyses. The remaining supernatant is made up to 100 ml with DMEM HG (2% FBS, 1% PSA w/o phenol red). Then each flask is washed with 25 mL of DMEM HG (2% PSA with phenol red). The virus sample, made up to 100 mL, is distributed into 2 T-300 flasks. Then, incubation is applied for 72 hours, preferably at 37 °C, 5% CO2. At the end of the 72nd hour, the contents of the flask are scraped with a pipette and the samples are collected into 50 ml falcon tubes. The tube content is centrifuged for 5 minutes, preferably at +4 °C and 300 °C. At this stage, the supernatant is collected, 10 mL; It is portioned into 2 5-millimeter vials (stock samples), and 2 1-mI 2-piece vials (stock samples) and then frozen in double packaging, preferably at -80 °C, to be used in quality control analyses. The remaining supernatant is made up to 200 mL with DMEM HG (2% FBS, 1% PSA w/o phenol red). is then washed with each flask. The virus sample, filled to 200 mL, is distributed into 4 T-300 flasks. Incubation is performed for 72 hours, preferably at 37 °C and 5% CO2. At the end of the 72nd hour, the contents of the flask are scraped with a pipette and the samples are collected into 50 mL falcon tubes. Tube content; It is preferably centrifuged at +4 °C and 300 @ for 5 minutes. At this stage, the supernatant is collected, 10 mL; It is portioned into 2 5-ml vials (stock samples), 2 1-ml 2x vials (stock samples), and then frozen in double packaging, preferably at -80 °C, to be used in quality control analyses. The remaining supernatant is made up to 400 mL with DMEM HG (2% FBS, 1% PSA w/o phenol red). When it reaches confluent, the medium content is removed. Each flask is washed with 50 mL of DMEM HG (2% PSA w/o phenol red). The virus sample, completed to 400 mL with DMEM HG (2% FBS, 1% PSA w/o phenol red), is distributed into 4 multilayer flasks. Incubation is preferably applied at 37°C, 5% COg for 72 hours. At the end of the 72nd hour, the flask contents are collected into 50 mL falcon tubes. The tube content is centrifuged for 5 minutes, preferably at +4 C and 300 °C. By collecting the supernatant, approximately 400 mL of solution is obtained. 200 mL of said supernatant is preferably passed through a 45um filter. Preferably, the mllis virus solution is additionally centrifuged in Amicon Ultra 100,000 kDa NMWL centrifugal concentrators. In this way, the virus is concentrated. After centrifugation, the resulting concentrate is collected with the help of a 10 mL syringe. 0.5 ml of the sample is reserved as stock for tests and production and is diluted to 5 ml with isotonic solution, aliquoted into 5 2x vials and frozen preferably at -80 °C. The remaining amount is aliquoted into 55 cm cryovials and frozen preferably at -80 °C. Aliquoting at different times is important for the characterization of possible genome variation and determination of the pool content. The remainder is completed to 800 mL. After removing the medium content of 8 multilayer flasks with 90% confluent vero cells, each flask is washed with 50 mL DMEM HG (2% PSA w/o tenol red). The virus sample, filled to 800 mL, is distributed into 8 multilayer flasks. Incubation is preferably applied at 37°C, 5% CO2 for 72 hours. At the end of 72 hours, the flask contents are collected into 50 mL=light falcon tubes. The said tube content is preferably centrifuged for 5 minutes at +4 °C and 300 °C. At this stage, 400 mL of the supernatant is passed through a 45µm filter. 15 ml of virus solution is added to Amicon Ultra 100,000 kDa NMWL centrifugal concentrators. The concentrate obtained after centrifugation is collected with the help of a 10 mL syringe. 0.5 ml of the sample is reserved as stock for tests and production, diluted to 5 ml with isotonic solution, aliquoted into 5 2x vials and frozen preferably at -80 °C. The remaining amount is aliquoted into 5x cryovials and preferably at -80°C. The remaining 400 ml of supernatant is made up to 1600 mL with DMEM HG (2% FBS, 1% PSA w/o phenol red), then each flask is filled with 50 mL of DMEM HG (2% PSA w/o). /o phenol red). The virus sample, completed to 1600 mL, is distributed into 16 multilayer flasks and incubated at 37°C, 5% CO2 for 72 hours. At this stage, after the content of the tube in question is filtered, preferably 15 ml of virus solution is added to Amicon Ultra 100,000 kDa NMWL centrifugal concentrators and 2500 concentrates are collected with the help of a 10 mL syringe at a temperature range of 19-25 °C. 0.5 ml sample is tested and aliquoted and frozen preferably at -80 °C. The remaining amount is aliquoted into 5*cryovials and frozen preferably at -80 °C. The remaining 800 ml of supernatant is made up to 3200 mL with DMEM HG (2% FBS, 1% PSA w/o phenol red). Then, each flask is washed with 50 mL of DMEM HG (2% PSA w/o phenol red). The virus sample, completed to 3200 mL, is distributed into these 32 multilayer flasks. Incubation is performed at 37°C, 5% COZ for 72 hours. At the end of the 72nd hour, the flask contents are collected into 50 mL falcon tubes. The content of the tube in question is centrifuged for 5 minutes, preferably at +4°C and 300 °C. The entire supernatant is passed through a vacuum 45um filter. Preferably, 15 ml of virus solution is added to Amicon Ultra 100,000 kDa NMWL centrifugal concentrators and centrifuged without brakes for 25 minutes at 2500 G, preferably in the temperature range of 19-25 °C. The concentrate obtained after centrifugation is injected with the help of a 10 mL syringe. 0.5 ml of the sample is collected as stock for tests and production, diluted to 5 ml with isotonic solution and aliquoted into 5 2-millimeter vials, preferably frozen at -80 cC. The remaining amount is aliquoted into 5x cryovials and preferably frozen at -80 oC. Until this stage, the entire concentrated virus solution, which has been aliquoted and stored preferably at -80 °C, is thawed, preferably at 25 °C, and all the aforementioned samples are diluted proportionally with 10 times apyrogenic distilled water. Preferably 15 ml solution, amicon ultra 100,000 kda NMWL centrifugal without brakes is centrifugal, the remaining 10 coat of apirogenic distilled water and the amicon ultra-niiviwl centrifugal concentrators in the 19-C-s. It is centrifuged for 25 minutes without brakes. 1 ml of the concentrated virus solution remaining in the concentrate is separated, diluted 10 times with non-pyrogenic distilled water and 0.5 mL is frozen in 20 vials, preferably at -80 °C. At this stage, intermediate product quality control tests can be applied. These tests; sterility, mycoplasma. , RT-PCR (titration), TCID50 (potency and tittation), SRID test (identity), electron microscopy, particle number, sequence analysis (variable mutation analysis), proteome analysis, host cell protein, host cell DNA and thermal stability. The remaining amount is divided into 50-ml tubes and frozen preferably at -80 cC. In the process steps applied to prepare the inactive viral intermediate, 5 falcones are placed in the middle space of the hard plastic autoclave cabinet in an upright position. In order to prevent the tubes from causing environmental pollution in the event of an accident, thin glass vials containing pure formaldehyde are placed in a way that they cannot be shaken. After the lid is tightly closed, the hard plastic autoclave container in which the product is placed is placed inside the double biosafety bag and the integrity of the package is checked. In the next processing step, it is placed into a hard polycarbonate transfer bag and the inside of the bag is filled with dry ice. At this stage, it should be ensured that the lock is locked so that it cannot be opened, and the product documents and bag tag should be checked. The tubes containing the concentrated virus are irradiated with an irradiation device, preferably with a dose of 2.5 mega rad (25 kilo gray), using a rotating system to ensure equal irradiation. This process is fractionated 1st gamma irradiation and is important to ensure inactivation by preserving the viral protein structure. After the irradiation process, all but one of the irradiated falcon tubes are frozen and stored, preferably at -80 cC. The remaining irradiated virus solution in one 50 mL falcon tube is diluted with apyrogenic distilled water containing 0.3% HSA to 1x1011 copy number or particle number/mL. For the SRID test, 20 1 ml vials are created and preferably frozen at -80 cC. The remaining product is distributed 1 ml into a 2 mL sterile glass vial (and the lids are closed. Replicative competent coronavirus is studied with 3 randomly selected samples from these samples. These samples are preferably kept at -80 "C" for 2 hours. The lids of the vials are closed and labeled. The mentioned vials should be placed on the tray in a way that they will not be broken, then they should be placed in polycarbonate transfer bags. The inside of the bag is filled with dry ice and the bag is then protected with a secondary package and the bag label is attached. The tubes are irradiated with an irradiation device using a rotating system to ensure equal irradiation. This process step is fractionated 2nd gamma irradiation and is important for reducing toxicity over the total dose. Products arriving frozen are preferably stored at +4 "C and the final product is subjected to the tests listed below as part of quality control: - Particle counting - Host cell protein determination - Host cell DNA determination - Potency (SRID test) - Thermal stability - Packaging - Osmolarity - Replicative competent coronavirus - Electron microscopy - Proteome analysis - Sterility Table 1 contains the variant information of the Acibadem Labcell coronavirus isolate in the studies on the method that is the subject of the invention. Sample ID Nucleoticle Gene Protein Variant type Amino acid change Conservation among pusi'tion change (ReffAlt) 5332 genomedaia [from (Bel/'Alti GISAIDJ 241 5' UTFi NA CIT norrcoding 7 50,52% 1230') ORFlab NspD CIT missense L-'l2F ? BAWAG 1A4`JS ORFlab RNAýdepe'ident (JT missense PSZSL ELUJVAG llNA Palymerase Acibadem law& uiii iab ItNA-depeadent c/i synünymuus Mizv ananas 25559 IV membrane& C/T misss-use L13F Sil-45% glycoprcitein phosphoprotein phoaphoprotcin phosphoprotein Table 1. Acibadem Labcell coronavirus isolate variant information is shown in Figure Right, copy number (Nanosight) of Acibadem Labcell virus isolate, and scanning electron microscopy (SEM) image of Acibadem Labcell coronavirus isolate with negative staining is shown in Figure 3b. Accordingly, inactive Sars Cov-2 vaccine OZG 38. -61 particle analysis shows that it has a homogeneous structure, contains 272 million/ml particles, and the main structures (Envelope / Spike) are preserved after inactivation. The current invention is for the SARS-COV-2 virus to solve the technical problems mentioned above and realize all the advantages that can be understood from the detailed explanation. It is an inactive vaccine production method; isolating and culturing the Sars-CoV-2 virus, concentrating the resulting virus solution, applying the aliquoting process at different times in order to characterize the possible genome variation and determining the pool content, and containing the concentrated virus in order to ensure inactivation by preserving the viral protein structure. Applying fractionated 1st gamma irradiation to the tubes to ensure equal irradiation, Applying lyophilization after the fractionated 1st gamma irradiation application, Applying fractionated 2nd gamma irradiation to the tubes containing the concentrated virus to ensure equal irradiation in order to ensure final product sterilization. It is about the content. TR