TARIFNAME TEK ZINCIRLI KONJUGE POLIMER NOKTA ÜRETIMI VE BIYOLOJIK PROB OLARAK KULLANILMASI Bulusun Ilgili Oldugu Teknik Alan Bulus, nano-faz ayrimi lyöntemi ile tek Zincirli konjuge polimer noktalarn üretilmesi ve biyolojik prOb olarak kullan Tinas _ile ilgilidir. Bulusla Ilgili Teknigin Bilinen Durumu (Önceki Teknik) Günümüzde konjuge polimer nanoparçaciklar ve polimer noktalar (Pdot) in vitro, in vivo görüntüleme ve teshis kabiliyeti gibi birçok uygulamada kullanülnaktad IL Konjuge polimer nanoparçac Elarîl (30 nm) aksine, daha küçük çaptaki (<10 nm) tek Zincirli konjuge polimer noktalar daha büyük sönüm katsayßÇdaha yüksek fotolüminesans kuantum verimi, parlakltk, fotostabilite ve kolloidal stabilite göstermektedir. Foto fiziksel özellikleri nedeniyle biyolojik uygulamalarda, tek Zincirli konjuge polimer noktalar, konjuge polimer nanoparçaciklara göre belirgin avantajlar göstermektedir. Örnegin, nm"den küçük çapli polimer noktalar kalaballlt ve ksltilanmsi hücre içi bosluga erisebilmekte ve hücre-içi özellikleri etiketlemek için biyo-isaret olarak kullanHnda daha etkili olmaktad II. Konjuge polimer nanoparçac Eklar ve polimer nokta üretimi için genel olarak mini emülsiyon ve tekrar (yeniden) çöktürrne yöntemleri kullan [[rnaktad E. Mini emülsiyon teknigi, temel olarak yag fazidaki polimerlerin su fazEia transferi olarak karakterize edilmektedir. Mini emülsiyon tekniginde polimer, su ile karßmayan bir organik fazda çözülmekte ve sonras Eida uygun yüzey aktif maddeleri içeren su içerisinde dagiihnaktadji Karsm, polimer çözeltisinin küçük damlactklaanL içeren stabil mini emülsiyonlar olusturmak için ultrasonikasyon yöntemi kullanilarak hizla kar sit n lmaktadir. Son islem olarak da organik çözücü, suda stabil polimer nanoparçac k dispersiyonu üretmek için buharlastTiImaktad E. Mini einülsiyon tekniginde elde edilen polimer noktalarîi boyutlarT genellikle tekrar (yeniden) çöktürme yönteminde elde edilen polimer noktalarEi boyutlarEidan daha büyük olmaktad E. Tekrar (yeniden) çöktürme tekniginde ise; hidrofobik konjuge polimer, polimer için iyi bir çözücü (good solvent) içerisinde çözülmekte ve iyi çözücü ile karßabilen zayüi bir çözücü (poor solvent) ile karsitiihnaktadn Nihai karisim, sonikatör kullanlarak nanoparçactkt partiküllerinin olusumuna yardlmcl olmak için kuvvetli bir sekilde karlStlrtllmaktadln. Suda daglabilen nanoparçaclklar iyi çözücünün ortamdan uzaklastlnllmasl ile üretilmektedir. Söz konusu tekrar (yeniden) çöktürme yönteminde genel olarak iyi çözücü olarak tetrahidrofuran (THF) kullanllmaktadlr. Bunun nedeni su ile karlsiabilen bir çözücü olmasl ive düsük kaynama noktas Ela sahip oldugundan kolayca uçurulabilmesidir. Tekrar (yeniden) çöktürme teknigi ile gerçeklestirilen örnek uygulamada; Konjuge polimer, tetrahidrofuran (THF) içerisinde çözülmekte ve % stok çözelti elde edilmektedir. Polimer solüsyonundan 1 mL alikot al @makta hemen 10 ml deiyonize suya eklenip 1 dakika kuvvetlice sonike edilmektedir. THF, çözelti ortamidan N2 gaz :yoluyla uzaklastEÜInakta ve 80 OC'lik sEaklÜî uygulanarak 10 ppm'ye konsantre edilmektedir ve 200 nm`lik filtreden süzülmektedir. Modifiye tekrar (yeniden) çöktürme teknigi örnek uygulamasnda ise; Konjuge polimer tetrahidrofuran (THF) içerisinde çözülmekte ve 1 mg/mL stok çözelti elde edilmektedir. Kopoliiner de THF içerisinde çözülmekte ve polimer çözeltisi ile karlstlrllmaktadlr. Karlslmln son konsantrasyonu, polimerin 50 ug/mL ve kopolimerin 10 ug/mL olacak sekilde haz ilanmaktad E. Homojen bir karIslBr olusturmak için ultrasonikatör kullantlmaktad E. 5 mL kargii çözeltisi 10 mL deiyonize su içerisine banyo sonikatöründe eklenmektedir. THF çözelti ortammdan Nz gazjyoluyla uzaklastilrnaktadî 90 OC'lik sßaklfk uygulanarak 5 mL"ye konsantre edilmekte ve 0,2 mikronluk filtreden süzülmektedir. Iki asamaljtekrar (yeniden) çöktürme teknigi örnek uygulamas Eida ise; Konjuge polimer ve fonksiyonel polimer farklElTHF ortamEida inert atmosfer altEida gece boyunca karStEEarak çözünmektedir. Çözeltiler, çözünmeyen polimerin ayrümas Liçin 0,7 um'lik bir cam filtre ile süzülmektedir. Konjuge polimer ile fonksiyonel polimer karlslt nllmaktadln Karlsilm It son konsantrasyonu, konjuge poliinerin 1 ug/mL ve fonksiyonel polimerin 0,2 ug/mL olacak sekilde haz ülanmaktad lü Fark] `boyutlarda Pdotlar hazmlamak için karsün, slîas lýla hacimce konjuge polimerin ve fonksiyonel polimerin konsantrasyonu sEas @la 50 ug / mL ve 10 ug / mLTdir. Seyreltilmis çözeltinin 5mLssi 10 mL deiyonize su içerisine eklenmekte ve homojen bir çözelti olusturmak için ultrasonikatör kullanülnaktadm. Çözücü oranßß ani degisimi nanoparçack olusumunu saglamaktadi. Süspansiyon çözeltisi, 0,2 mm membran filtresi ile süzülmektedir. THF çözelti ortamEidan N2 gaz Dyoluyla uzaklastßmnakta, 90 0Ölü( sßaklü& uygulanarak 5 mL'ye konsantre edilmekte ve 0,2 mikronluk tiltreden süzülmektedir. Parlak ve biyouyumlu floresan problarLkonjuge polimer noktalar ile saglanabilmektedir. Bu durum güçlü bir it-konjugat tabanl ve yer degistiren elektronik yaplslna sahip olmaslndan kaynaklanmaktad n. Optik özelliklerinden dolayl çok uzun ylllardan beri konjuge polimer noktalar optoelektronik ve biyomedikal alanlar ?da s kl lila kullan hnaktad h. Teknigin bilinen durumunda konjuge polimer nanoparçaclklar ve polimer nokta üretimi için kullan `lan mini emülsiyon ve tekrar (yeniden) çöktürme tekniginde, THF gibi toksik organik çözücüler kullanllldEgEldan dolayübu solventler ile üretilen konjuge polimer nanoparçacüglar ve polimer noktalar biyolojik esalesensör (örnegim biyolojik prob) kullaninüiçin uygun olmamaktad î. doküman îlda tekrar (yeniden) çöktürme yöntemi kullan [Earak olusturulan polimer noktalardan ve ardLndan elde edilen polimer noktalarn yüzeyinin polielektrolitler ile kaplanarak kolloidal stabilitenin art nlllnas ndan bahsedilmektedir. Ayr da söz konusu tekniklerde, özellikle yüzey aktif maddelerin nanoparçaclklar ile gösterdigi yüksek ikincil etkilesimlerden dolayîsatlasthma prosesi sîaslhda kullanîan kimyasallardan nanoparçac klarîi uzaklastEHmasE zor oldugundan dolayÜ saf nanoparçac klar elde edilememektedir. Mini emülsiyon tekniginde, nanoparçacllîlarm bir araya gelip topaklanmasîljönlemek için yüzey aktif maddeler ve hidrofoplar (hidrofobik ajan) kullan [Imaktad E. Bu maddeler özellikle hücre çal :slmalar Eda canl 111 problemine sebep olabilmektedir. Mini emülsiyon ve tekrar (yeniden) çöktürme teknigi çoklu polimer zincirlerinin birlikte çökelmesine neden olmaktadLii Bu nedenle 30 I 500 nm yüksek boyut aralgnda parçac klar üretilmektedir. Polimer zincirlerin bir araya gelerek yüksek boyutta polimer parçaclklarl olusturmas lfloresans siddeti, parlakllk, kuantum verimi gibi fotof'iziksel özelliklerinin azalmasîia sebep olmaktadh Aerca polimer parçaclklarlîi prob olarak kullanhnaslîiçin konjuge polimer parçacklarîi organel ve nükleus gibi hücre yapEIarEiEl içine girebilmesi gerekmekte bu nedenle de parçaelk boyutlarîlîi 10 nm altiida olmas: gereksinimi bulunmaktad i. AyrBa mini emülsiyon ve tekrar (yeniden) çöktürme yöntemlerinde ortam kosullarüs Eaklügj kar Et ima h& :I parçacik boyutunu etkilediginden dolay Etekrarlanabilirlik zor olmaktad E. Bulusun K Sa Aç klamasl ye Amaçlari \ Mevcut bulus, yukarLda bahsedilen gereksinimleri kars layan, dezavantajlardortadan kaldLran ve ilave bazl avantajlar getiren, tek Zincirli konjuge polimer noktalarln üretilmesi ve biyolojik prob olarak kullan lmasl ile ilgilidir. Bulus tek zincirli konjuge polimer noktalar, nano-faz ayrîhryöntemi ile üretilmektedir. Bulus tek zincirli konjuge polimer nokta üretim yönteminde biyolojik esasl' Sensör kullanlml | açslîldan küftllayßlîolan organik çözücüler (THF Vb.) kullan llnamaktadî. Bulusta, polimer noktalar sadece su, etilen glikol, etilen karbonat veya propilen karbonat ve bezer yap Elaki tüm organik çözücüler kullanührak haz Elanmßtî Bu çözücüler FDA (Food and Drug Administration) tarafmdan onaylD çözücüler olup teknigin bilinen durumunda kullanEan organik çözücüler (THF vb.) gibi toksik özelligi bulunmamaktad E. Bulus polimer nokta üretim yöntemi; Mini emülsiyon tekniginde kullanlan yüzey aktif maddelere ve hidrofoplara (hidrofobik ajan) olan ihtiyac Ebrtadan kald Emaktad m. Bulus ile elde edilen tek zincirli konjuge polimer noktalarm hidrodinamik çapL3,6 nm'dir (Sekil 4) ve parçac k boyutunun tekrarlanabilirligi yüksek olmaktadln. Yapllan hesaplamalar ile 3,6 nm kullan lan konjuge polimerin jirasyon çapi lile örtüsmektedir. Bulusta verilen organik çözücüler konjuge polimerin iyi çözücüsü oldugundan nano-faz ayüma yöntemi ile tek zincirli polimer içeren noktalar elde edilebilmektedir. Bu sebeple konjuge polimerin iyi çözücüsü içinde çözünmesi ve zayill` çözücüsü tarafßdan nano-faz ayrEnEiEi saglanmasüher denemede polimer zincirinin jirasyon çapEia denk boyutlarda polimer nokta üretilerek tekrarlanabilirlik saglanabilmektedir. Bulus polimer nokta üretiminde tekrar (yeniden) çöktürme yöntemlerinde gibi iyi çözücünün ortamdan uzaklast ihlas :gerekmemektedin Bulus polimer nokta üretim yönteminde herhangi bir satlastLijrna islemine gerek duyulmamakla birlikte kolay ve basit bir yöntemle yüksek safllkta polimer nokta üretimini saglamaktad ri. Bulusu Aç Rlayan Sekillerin Tan îiilarFl Bu bulusla gelistirilen, tek zincirli konjuge polimer noktalarEiIi ve üretim metodunun daha iyi anlas [Ihbilmesi için haz Elanan sekiller asag Ela aç Eklanmaktad m. Sekil 1: Tek Zincirli Konjuge Polimer Noktalari Üretim SemasE Sekil 2: Tek Zincirli Konjuge Polimer Noktalar& Konfokal Floresans Mikroskop Görüntüleri (ölçek çubuguzlûmm) A görüntüsünde elde edilen 4 farkli polimer noktalarm yüksek büyütmedeki konfokal floresans mikroskop görüntüleri olan a, b, c ve d görüntüleri elde edilmistir. Sekil 3: Tek Zincirli Konjuge Polimer Noktalarm Hepatosellüler Karsinom (A) ve Saglfklî Karaciger (B) Hücresine Uygulanmas Sonras Mikroskop Görüntüleri Sekil 4: Nanofaz ayima yöntemi ile hazlîllanmß polimer noktalarm dinamik Elli saçllmasî yöntemi ile elde edilmis parçacEEt boyut dag ÜJEhE Bulusu Olusturan Unsurlarlii/Kldlmlar n/Parçalarln Tan mlar l Bu bulusla gelistirilen tek Zincirli konjuge polimer noktalaanLn üretim metodunun daha iyi aç klanabilmesi için örnek olarak verilen süreç için hazlrtlanan sekillerde yer alan parçalar/ka mlar/unsurlar ayri layrl lnumaralandlrllmls olup her bir numaranîn açlklamasl l asag _da verilmektedir. l: Konjuge katyonik polielektrolit 2: Konjuge katyonik polielektrolitin iyi çözücüsü 3: Konjuge katyonik polielektrolitin zay El çözücüsü 4: Tek Zincirli polimer nokta çözeltisi Bulusun Ayr ittllH Açlklamasl l Bu detaylEaçEklamada, bulus konusu tek Zincirli konjuge polimer nokta üretim yöntemi, sadece konunun daha iyi anlasLlrnasLna yönelik olarak ve hiçbir sLnLrlachl_ etki olusturmayacak sekilde aç klanmaktadlit Bulus, konjuge katyonik polielektrolitlerin iyi çözücüsü ve zay il çözücüsü aras nda olusan hîlîiano faz ay ini File elde edilen tek Zincirli konjuge polimer noktalarii üretim yöntemi ile Bulus tek Zincirli konjuge polimer noktalari üretim yöntemi genel olarak; o Kullanlan çözücülerden gelebilecek kirlilikleri önlemek amacßila tercihe bagllîolarak konjuge katyonik polielektrolitin iyi çözücüsü ve zay Il çözücüsünün süzülmesi, - Konjuge katyonik polielektrolitin etilen glikol veya karbonat esasll iyi çözücüsü içerisinde El Ijhrak çözülmesi, o Katyonik konjuge polielektrolit çözeltisinin konjuge polielektrolitin zayEf çözücü olan su içerisine ilave edilmesi, o Elde edilen ve tek zincirli polimer nokta çözeltisinin karTsthmasI - Tek zincirli polimer nokta çözeltisinin elde edilmesi Bulus tek zincirli konjuge polimer nokta üretiminde polimer olarak yapßida en az bir katyonik pendant grubu içeren konjuge katyonik polielektrolitler kullanElînaktadm` Bulusta tercihen konjuge katyonik polielektrolit olarak politiyofen ve türevi polimerler kullan Jînaktad 1. Daha tercihen bulusta konjuge katyonik polielektrolit olarak, poly[1,4-dimethyl-1-(3-((2,4,5- trimethylthiophen-3-yl)oxy)propyl)piperazin- 1 -ium brornide kullanilmaktadir. Bulusta poly[l ,4-dimethyl-1-(3-((2,4,5-trimethylthiophen-3-yl)oxy)pr0pyl)piperazin-1-ium bromide" ri iyi çözücüsü olan etilen glikol ve zay fi çözücüsü olan su arasinda olusan hizli nano-faz ayrEnD ile katyonik tek zincirli polimer içeren konjuge polimer noktalar olusmaktad Il. Bulusta hElJnano-faz ayrEnEolusturabilecek tüm iyi ve zayIi çözücü sistemlerinde tek zincirli konjuge polimer nokta üretimi gerçeklestirilebilmektedir. Bulusta konjuge polielektrolitin iyi çözücüsü olarak glikol veya karbonat esasljçözücüler kullanüinaktadî Bulusta konjuge polielektrolitin iyi çözücüsü olarak etilen glikol, etilen karbonat veya propilen karbonat; konjuge polielektrolitin zayEEi çözücüsü olarak ise su kullan [[maktad E. Konjuge polielektrolitler, elektron delokalizasyonunu saglayan n-konjuge ana omurga ve çözünme davranisini belirleyen iyonik pendant gruplar ile karakterize edilen organik yari iletkenlerdir. Konjuge polielektrolitin iyi çözücü ile etkilesimi zayif çözücü ile olan etkilesiminden entropik olarak istemli oldugundan konjuge polielektrolit içerigi zengin olan iyi çözücü, zayEflçözücü içerisinde hâl :bir nano-faz ayrBiEblusturmaktad m. Böylece polimer nokta olarak iyi çözücü ile sarJInS tek konjuge polielektrolit zinciri iyi çözücü içerisindeki kolloidal stabilitesi zay Il çözücü ile korunmaktad E. Bulusun tercih edilen bir uygulamas :Sekil "1 de gösterilmektedir. Sekil l"e göre bulus tek zincirli konjuge polimer noktalarîi üretim yöntemi; o Konjuge katyonik polielektrolitin iyi çözücüsü (2) ve zayîi çözücüsünün (3) süzülmesi tercihen; 0,1-0,45 um selüloz asetat filtresi ile, daha tercihen 0.2 um selüloz asetat filtresi süzülmesi ve N2 gaz geçirilmesi, o Konjuge katyonik polielektrolitin (1) iyi çözücüsü (2) içerisinde 20-50°C sEaklüg aralgîida ve 200-400 rpm hEEida kargtiîarak çözülmesi ve katyonik konjuge polielektrolit çözeltisi elde edilmesi, o Nihai solüsyon konsantrasyonu 4,6)(10'3 ile 2 )(l()'2 mM aralEgElda olacak sekilde katyonik konjuge polielektrolit çözeltisinin konjuge polielektrolitin zayEtl çözücü (3) içerisine ilave edilmesi, o Elde edilen çözeltinin 300-600 rpm araltgiida karTstEflmasCl 0 Tek zincirli polimer nokta çözeltisinin (4) elde edilmesi Bulus ile üretilen polimer noktalar hepatosellüler karsinom ve saglEülEkaraciger hücresine uygulanmß ve karaciger hücrelerinin çekirdeginde seçici birikme gösterdigi konfokal mikroskobu kullantlarak elde edilen görüntüler ile kanîlanmßtî (Sekil 3). Hücre alt: görüntüleme probu olarak tek zincirli konjuge polimer noktalaan birikimini degerlendirmek için, hepatosellüler karsinoin ve saglklj karaciger hücreleri kullanmnßtî Tek zincirli konjuge polimer noktalarLû hepatosellüler karsinom hücrelerinin Çekirdeginde lokalize oldugunu gösterirken, sagllkll l karaciger hücrelerinin sitoplazmaslnda ve çekirdegin çevresinde biriktigini göstermistir. Çekirdegin sitoplazmaya göre floresan yogunluk oranl hepatosellüler karsinoin (Sekil 3A) ve sagltklîlkaraciger hücrelerine (Sekil 3B) kWasla yedi kat daha büyük bir yogunluk göstermektedir. Bu sonuç, hücre altübölgedeki tek zincirli konjuge polimer noktalar& birikim profilinin, hücre tipine önemli ölçüde baglEoldugunu göstermektedir ve tek zincirli konjuge polimer noktalar, hepatosellüler karsinom hücrelerinin çekirdeklerinde seçici olarak birikme egilimindedir. Etilen glikol ve tris EDTA (TE) tamponu (su ile hazlrtlanmlStln), 0,2 um selüloz asetat filtresi ile süzülinekte ve katyonik konjuge polielektrolit çözülmeden önce N2 gazTgeçirilmektedir. 0,5 mg katyonik konjuge polielektrolit (poly[l,4-dimethyl-l-(3-((2,4,5-trimethylthiophen-3- yl)oxy)propyl)piperazin-l-ium bromide]), 1 mL etilen glikol içinde çözülmekte ve 1,4 mM katyonik konjuge polielektrolit çözeltisi elde edilmektedir. tamponuna (pH 7.4) 50 uL hacimli katyonik konjuge polielektrolit çözeltisi ilave edilerek vorteks ile kuvvetlice karßtmli ve böylece 4,6›(10'3 mM tek Zincirli polimer nokta çözeltisi haz ulan Ji Bu örnek bulus uygulamas Lnda katyonik konjuge polielektrolit lüminesans probun temel bilesenidir. Etilen glikoln iyi çözücü olarak, su ise zay Il çözücü olarak kullanllmlstlrt Etilen karbonat ve su, 0,2 um selüloz asetat filtresi ile süzülmekte ve katyonik konjuge polielektrolit çözülmeden önce N2 gaz :geçirilmektedin 1 H-imidazol-3-yum bromür]), l mL etilen karbonat içinde çözülmekte ve 1,5 mM katyonik konjuge polielektrolit çözeltisi elde edilmektedir. 1,5 mL suya 50 uL hacimli katyonik konjuge polielektrolit çözeltisi ilave edilerek 5x10"3 mM tek zincirli polimer nokta çözeltisi haz nlanmakta ve vorteks ile kuvvetlice karlstlrllrnaktadlr. saçilma siddeti 3.6 nm TR TR