TARIFNAME TEK TÜPTE HIZLI VE Y_Üi_(SEK_ KAI:ITEDE GENOMIK_VlEYA HÜ_CRE_ DISI DNA IZOLASYONU içiN BIR YONTEM VE BUNA ILISKIN BIR KIT Teknik Alan Bulus, tek hücre süspansiyonu halinde bulunan ve hücre disi DNA barindiran biyolojik materyallerden ön hazirlik gerektirmeksizin kisa süre içerisinde yüksek kalitede DNA izolasyonunun gerçeklestirilmesine imkân taniyan bir yöntem ve bu yöntemin hizli ve basit bir biçimde uygulanmasini saglayan bir ürün veya kit ile ilgilidir. Daha belirgin olarak mevcut bulus, DNA izolasyonu öncesinde gereken hücre lizati ya da homojenat hazirlama adimlarini optimize edilmis solüsyonlar ile tek bir tüp içerisinde gerçeklestirerek silika matris araciligiyla DNA izolasyonu yapilmasina imkân veren bir yöntemle ilgilidir. Teknigin Bilinen Durumu DNA izolasyonu, özel olarak gelistirilmis tekniklerle hücrelerdeki DNA molekülünün açiga çikarilmasi islemi olarak bilinmektedir. DNA izolasyonu; moleküler immünoloji, adli tip, moleküler genetik, moleküler mikrobiyoloji, veterinerlik, bitki gibi birçok alanda tani ve arastirma çalismalarinda kullanilan moleküler testleri gerçeklestirmek üzere gerekli bir ön adimdir. islemin gerçeklestirilmesi için hücre duvarinin (membran) parçalanmasi, DNA protein kompleksinin çözünmesi ve moleküllerden ayrilmasi gerekmektedir. Söz konusu DNA; kan, kemik iligi agiz çalkanti suyu gibi, hücrelerin tek hücre süspansiyonu halinde bulundugu materyallerden ya da çesitli yöntemlerle tek hücre süspansiyonu haline getirilmis solid doku ve diger biyolojik örneklerden elde edilmek istendiginde ilk islem, hücre membranlarinin yikilmasi ve DNAiyi da barindiran hücre içeriginin solüsyona salinmasidir. Bu yikim genellikle mekanik, enzimatik ya da alkali lizisi, amonyum hidroklorid kullanimi, hipotonik lizis gibi kimyasal yollarla gerçeklestirilmekte ve DNA izolasyon sürecinin disinda tamamlanmasi gerekmektedir. Kan, kemik iligi gibi süspansiyonlarin kullanilmasi durumunda, hücre membrani yikimina ek olarak hemoglobin barindiran eritrositlerin ortamdan uzaklastirilmasi pür DNA izolasyonu için çok önemli bir adimdir. Eritrosit lizis asamasi zahmetli olmamakla birlikte çekirdekli hücrelerin kaybedilmemesi için genellikle kimyasal yöntem kullanilarak saglanmaktadir. Bu islem, santrifügasyon asamalari ile birlikte en az 40 dakikalik bir zaman almaktadir. Hazirlik ve test islemlerinin süresi, öncelikle rutin hizmet veren ve acil sonuç vermesi beklenen laboratuvarlarda olmak üzere; moleküler testleri gerçeklestiren, hedefi her zaman en iyi ve en dogruyu en kisa sürede yakalamak olan tüm DNA izolasyonunda, bir diger önemli islem ise, nükleik asitler zarar görmeden ortamdaki protein ve saglanmaktadir. Ancak hali hazirda; eritrositlerin uzaklastirilmasi, membranlarin parçalanmasi ve sunulmamaktadir. DNA izolasyonu için kullanilan en klasik yöntem; proteinaz K gibi enzimleri de kullanarak, fenol- kloroform yöntemi ile DNA'nin izole edilmesidir. Islem sonucunda iyi kalitede DNA izole edilmesine karsin, yöntem oldukça uzun sürede gerçeklestirilmektedir. Bunun sonucunda da laboratuvarda çalisan personeller insan sagligina zararli kimyasallara uzun süreli maruz kalmaktadir. Ilgili yöntem, pratik olmamasinin yani sira islemi uygulayanlarin sagliklari için zarar teskil etmektedir. DNA izolasyon yöntemlerinin bazilarinda ise proteinlerin DNA'dan uzaklastirilabilmesi için yüksek sicakliklarda isitma yöntemi kullanilmaktadir. Bu yöntem ise, Islem adimlarini artiran ve ek süre gerektiren bir asamadir. Bilinen yöntemlerle; izolasyon islemi sirasinda insan sagligini tehdit etmeden, zaman tasarrufu saglanarak DNA'nin zedelenmeden pür olarak elde edilmesi gerçeklestiriIememektedir. Bu durum, DNA izolasyonu öncesinde uygulanmasi gereken hücre lizati (hücrenin yikimi) ya da homojenat islemi (organ ya da dokularin çok küçük parçalara ayrilmasi) ön süreç adimlarini kisaltabilecek bir yöntem gereksinimi oldugunu göstermektedir. WOO238758 nolu patent dokümaninda "Lysate Clearance and Nucleic Acid lsolation Using Silanized Silica Matrices" baslikli bir çözümden bahsedilmektedir. Ilgili yöntem, hedef nükleik asit izolasyonu gerçeklestirilirken siyalize silika matrikslerinin kullanilmasina iliskindir. Bu yöntemde, siyalize silika matrislerin DNA baglama gücünün daha yüksek oldugu iddia edilmektedir. Ancak yöntem, hücre lizati ön hazirlik asamasini gerektirmekte ve DNA elde etme süresini, Iizat asamasini yok sayarak tanimlamaktadir. U85057426 nolu patent dokümaninda uzun zincirli nükleik asitlerin, nükleik asitler ve diger materyalleri içeren çözeltilerdeki diger maddelerden ayrilmasina imkân veren bir yöntemden bahsedilmektedir. Yöntem, nükleik asitlerin bir nükleik asit içeren çözeltide poröz (delikli) matris üzerine sabitlenmesini, poröz matrisin digerini ayirmak için yikanmasini, uzun zincirli nükleik asitlerden gelen maddeler ve sabit uzun zincirli nükleik asitlerin poröz matristen çikarilmasini içermektedir. Dolayisiyla burada, DNA izolasyonu öncesinde uygulanmasi gereken hücre lizati ya da homojenat islemi ön süreç adimlari gerçeklestirilmeksizin tek bir tüp içerisinde silika matris araciligiyla DNA izolasyonu yapilmasina yönelik bir çözüm sunulmamaktadir. US4298500 nolu patent dokümaninda bir biyolojik hedef materyali bir ortamdaki diger maddelerden izole etmek ve gelismis analiz için yeterli safliga sahip izole edilmis bir malzemenin üretilmesine iliskin yöntemlerden bahsedilmektedir. Ancak söz konusu dokümanda hücre süspansiyonu halinde bulunan örnekler ve hücre disi (hücre disi) DNA barindiran sivilardan yüksek kalitede DNA izolasyonunun eritrosit ve hücre Iizisine gerek kalmaksizin kisa süre içerisinde gerçeklestirilmesine imkân taniyan bir yöntemden bahsedilmemektedir. Sonuç olarak, önceki teknik çözümlerin zamandan tasarruf saglayamamalari, islem maliyetlerini arttirmalari ve çözümün yayginlasmasina engel olmalari nedeniyle daha az maliyet ve kisa zamanda yüksek kaliteli DNA izolasyonu gerçeklestirilmesine duyulan ihtiyaç mevcut bulusun ortaya çikmasina neden olmustur. Bulusun Amaci ve Kisa Açiklamasi Bulusun amaci hücre süspansiyonu halinde bulunan örnekler ve hücre disi DNA barindiran örneklerden yüksek kalitede DNA izolasyonunun homojenat ve hücre Iizisine gerek kalmaksizin kisa süre içerisinde gerçeklestirilmesine imkân taniyan bir yöntem ve kit ortaya koymaktir. Bulusun bir baska amaci, DNA izolasyonu öncesinde uygulanmasi gereken hücre Iizati ya da homojenat islemi ön süreç adimlari gerçeklestirilmeksizin silika matris ile DNA izolasyonu yapilmasina imkân veren bir yöntem ortaya koymaktir. Bulusun bir baska amaci; eritrositlerin uzaklastirilmasi, membranlarin parçalanmasi ve lipid ve proteinlere yönelik islemlerin tek bir tüp içinde meydana gelen reaksiyonlarla gerçeklestirilerek DNA*nin zedelenmeden pür olarak elde edilmesi ve zaman tasarrufu saglanmasidir. Bulusun bir baska amaci; tek tüpünün içerigiyle, hücre barindirmayan serbest DNA (cell free DNA) içeren solüsyonlardaki DNA'larin toplanmasi ve bahsedilen solüsyonlardaki proteinlerin uzaklastirilmasini da etkin bir sekilde saglamasi sayesinde tek bir tüp ile birden fazla alana hizmet edebilecek çabuk, pratik ve pür DNA izolasyonunu saglamasidir. Bulusun bir baska amaci; proteinlerin parçalanmasi, islenmemis silika matris ile DNA baglanmasi, proteinlerin ortamdan uzaklastirilmasi, yikama islemlerinin gerçeklestirilmesi, DNA çökeltme islemlerinin gerçeklestirilmesi, DNA eritme ve elde edilme islemlerini içeren bir DNA izolasyon yöntemi ve bunu gerçeklestiren bir kit ortaya koymaktir. Bulusun bir baska amaci; DNA izolasyonu için rahatlikla kullanilabilecek çok yönlü bir yöntem ortaya koymaktir. Sekillerin Kisa Açiklamasi Sekil 1 de bulus konusu kit ile izole edilip dilüe edilerek %2.5'Iik agaroz jel elektroforezinde yürütülen bes adet DNA örnegi verilmektedir. Sekil 2'de bulus konusu kit ile izole edilen DNA'Iardan amplifiye edilen HLA-A, B, C ve DR ürünleri verilmektedir. Her bir lokus için karisim tüpünde bulunan pozitif kontrol amplifikasyonu yükleme kuyularina yakin olarak görülmektedir. Sekil 3'de Kimerizm çalismasi için dört alici ve bir vericinin D58818 gen ekspresyonlari gösterilmistir. Bulusun Detayli Açiklamasi Mevcut bulus, DNA izolasyonu öncesinde uygulanmasi gereken hücre Iizati ya da homojenat islemi ön süreç adimlarina ihtiyaç duyulmadan tek bir tüp içerisinde silika matris araciligiyla DNA izolasyonu yapilmasina imkân veren bir yöntem ve kit (ürün) sunmaktadir. DNA izolasyon yöntemiyle tam kan, izole Iökosit, kemik iligi, agiz çalkanti suyu, lenf bezi, dalak, karaciger, biyopsi materyalleri, kemik gibi biyolojik materyallerin yani sira bakteri türleri, mantar türleri gibi mikroorganizmalardan da yüksek kalitede DNA elde edilmektedir. Ayrica, bitkilerden de basari ile genomik DNA elde edilebilmektedir. Diger önceki teknik DNA izolasyon yöntemlerine göre bulus konusu yöntemin üstün oldugu önemli bir özellik bulus konusu yöntemde kullanilan solüsyon sivilari ile ortamda bulunan hücreye sahip olmayan DNA'Iarin (cell free DNA) baglanarak hizli ve pratik bir sekilde izolasyonlarinin gerçeklestirilebiImesidir. Bu sayede serum ve idrar örneklerinden de DNA izole edilerek PCR (Polimeraz Zincir Reaksiyonu) reaksiyonlarinda ve diger moleküler çalismalarda kullanilabilmektedir. Ayrica bulus konusu yöntem DNA izolasyon islemlerinin tek bir mikro santrifüj tüpü içinde gerçeklestirilerek mevcutta bulunan çalismalara göre daha yüksek kalite ve miktarda DNA elde edilmesini saglamaktadir. Hem hücre içi genomik hem de hücreye sahip olmayan sistemlerde sivi faza yayilmis DNA izolasyonu yöntemin birçok alanda güvenilir bir sekilde kullanimini saglamaktadir. Bulus konusu yöntemin uygulanmasina iliskin ürün (kit); her bir DNA izolasyonu için silika matris ve hücre Iizati, protein ve Iipid uzaklastiricilari uygun konsantrasyonlarda içeren bir mikrosantrifüj tüpü (DNA-BM) ve yeterli miktarda üç adet solüsyon (DNA-Y1, DNA-Y2, DNA-Y3) içermektedir. Bulus konusu yönteme iliskin mikrosantrifüj tüpü olan DNA-BM mevcut örnek uygulamada 2 miliIitre sivi kapasitesindedir ve 900 mikrolitreye kadar miktardaki örnekten (kan veya DNA izole edilecek hücre süspansiyonu) yüksek kaliteli DNA izolasyonu saglar. Buna göre DNA-BM'in içeriginde Tris.HCI (pH 6.5), EDTA, NaCL, Guanidum Tiyosiyanat, Nonidet P 40, Tween-20, SDS, DTT, Triton X100, silika boncuk bulunan DNA baglama karisimi yer almaktadir. Birinci solüsyon olan DNA-Y1, DNA'nin proteinlerinden arindirilmasina yardimci bir solüsyon olarak hazirlanmaktadir. DNA-Y1; kaotik bir ajan olan guanidin tiyosiyanat, Tris.HCl, Triton X100, EDTA, ve DTT içermektedir. Ikinci solüsyon olan DNA-YZ, DNA çöktürülmesi için kullanilmaktadir. DNA-Y2 içerigi; Tris.HCI, NaCI, Üçüncü solüsyon olan DNA-YB ise pür etil alkoldür. DNA çöktürme ve alkol yikamasi islemlerini gerçeklestirmektedir. DNA elüsyonu için, Iaboratuvarlarin tercihlerinin farkli olabilmesi sebebiyle distile su ya da elüsyon tamponu gibi bir solüsyon saglanmamaktadir. Bulus konusu yöntem geregi solüsyon halinde ya da solüsyon haline getirilmis nükleusu bulunan hücrelerden; isi, enzim, yüksek tuz konsantrasyonu kullanilmaksizin tek bir tüp içerisinde meydana gelen islem adimlari asagidaki gibi gerçeklestirilmektedir; - Membran, hemoglobin ve diger proteinlerin parçalanmasi ile birlikte islenmemis silika matrisin DNA baglamasi, - Proteinlerin, Iipidlerin yikama islemleri ile ortamdan uzaklastirilmasi, - DNA çökeltme isleminin gerçeklestirilmesi, - DNA eritme ve elde edilmesidir. Öncelikle; kan, kemik iligi, agiz çalkanti suyu, idrar, vücut sivilari gibi içerisinde DNA barindirdigi düsünülen tüm diger sivilar, hücreye sahip olan (hücre içi genomik) ya da hücresi olmayan (hücre disi) biyolojik materyaller ile çalismaya baslanilmaktadir. Solid doku, biyopsi örnegi ya da parafin dokulardan, bitki ve kemiklerden DNA izole edilmek istendigi durumlarda ise bahsedilen örneklerin tek hücre süspansiyonu haline getirilmesi gerekmektedir. Bulus konusu yönteme iliskin bir uygulama örnegi asagidaki gibidir: Optimum sonuçlar için, yöntemde bahsedilen DNA-BM tüpüne 500 mikro litre kan, kemik iligi ya da hücre süspansiyonu aktarilmaktadir. Mevcut bulus, hücre disi DNA izolasyonu için kullanilmak istendiginde, DNA-BM tüp içerigi bir pipet ve benzeri materyal yardimi ile hücre disi DNA izole edilmek istenen sivinin (serum, idrar, diger vücut sivilari veya DNA bulasi oldugu düsünülen diger sivilar) istenen miktari (1-100 mililitre) içine aktarilmasiyla DNA baglanmaktadir. Basit bir santrifügasyon isleminin ardindan çökeltinin tekrar DNA-BM tüpü içerisine aktarilmasi ile yöntemin diger adimlarinin tatbik edilerek izolasyonun gerçeklesmesi saglanmaktadir. Izolasyon isleminin baslangicinda, örnek biyolojik materyallerin bulundugu tüpler güçlüce vortekslenerek (karistirilarak) oda sicakliginda 3 dakika inkübe edilmektedir. Santrifügasyon süresi mikro tüpler için 10000 rpm'de 10 saniye olarak uygulanmaktadir. Inkübasyon ve santrifügasyon islemlerinde kullanilan söz konusu rakamsal degerler kisitlayici nitelikte degildir. Optimum sonuç için gereken minimum degerler belirtilmistir. Tüpler ters çevrilerek, bir havlu kâgit ve benzeri materyal üzerinde birkaç kez hafifçe vurularak kalan sivi uzaklastirilmaktadir. Sivilardan elde edilecek DNA eldesi için DNA-BM içeriginin aktarildigi hücre dakika çevrilmekte ve süpernatan (üst sivi) dikkatle uzaklastirilmaktadir. Genomik ve hücre disi DNA barindiran DNA-BM tüpleri üzerine ilk yikama solüsyonu olan DNA- Y1'den 1 mililitre ilave edilip vortekslenerek izolasyonun diger adimina süratle geçilir. Her iki örnek tüpünde gerçeklesen islem sonucunda hücre membranlari parçalanmis; membran, hücre Iipid ve proteinleri bozularak uzaklastirilmis serbest DNA'Iar, silika matris tarafindan tutulmus olmaktadir. DNA*nin proteinlerinden arindirilmasi asamasinda kaotropik ajan olan guanidin tiyosiyanat, Tris.HCl, Triton X100, EDTA ve DTT içeren ve kit ile birlikte saglanan ilk solüsyon olan DNA-Y1 vasitasiyla yikama, karistirma ve 10000 rpm devir 10 saniyede santrifügasyon islemi yapilmaktadir. DNA-Y1 içerigi ile ikinci bir yikama yapilarak ayni islem bir kez daha tekrarlanmaktadir. Ardindan, bagli DNA'nin çöktürülmesi için tris baz, NaCI, isopropanol ve pür etanol içeren ikinci solüsyon olan DNA-YZ ile iki yikama daha gerçeklestirilmektedir. Santrifügasyon sonunda, hücreye sahip olan ve hücreye sahip olmayan DNA içerikli örneklerin bulundugu DNA-BM tüpleri ters çevrilerek süpernatanlari atilmaktadir. DNA çöktürülmesi, alkol yikamasi pür etil alkol içerikli üçüncü solüsyon olan DNA-YB ile saglanmaktadir. Santrifügasyon islemi ve süpernatanin uzaklastirilmasindan sonra bahsedilen hücreye sahip olan ve hücresi bulunmayan örneklere iliskin tüpler agzi açik olarak birakilarak alkolün uçmasi saglanmak suretiyle kurutulmaktadir. Bir isitici üzerine koyularak alkolün uçmasi hizlandirilmaktadir. DNA eldesi (elüsyon) için kullanilan örnek miktarlar ile uyumlu miktarda distile su veya tercihe bagli olarak elüsyon tamponu eklenip vorteksle karistirilarak 10 dakika 65 "C'de tutulabilmektedir. Son olarak süpernatandaki erimis haldeki DNA'Iar alinarak, DNA kalitesi için spektrofotometrik ölçümleri gerçeklestirilmektedir. Bulus konusu yöntemin ilk asamasi gerçeklestirildikten sonra herhangi bir asamada test adimlari durdurulabilmekte ve isleme sonraki günlerde devam edilebilmektedir. 65°C'daki inkübasyonlarin süresinin uzatilmasi elde edilen DNA miktarinin artmasini saglamaktadir. Bunun yani sira, DNA"Ii süpernatan alindiktan sonra ihtiyaç halinde silika matrisin üzerine tekrar elüsyon tamponu ilave edilerek bir miktar daha DNA elde edilebilmektedir. Söz konusu DNA izolasyon islemlerinin bilinen en güçlü DNA tutucu olan silika matrisle es zamanli yapilmasi, hizli ve yüksek kaliteli DNA eldesini saglamaktadir. Yöntem sayesinde, hücre barindirmayan serbest DNA içeren solüsyonlardaki DNA içeriklerinin de elde edilmesi ve bu solüsyonlardaki proteinlerin etkin bir sekilde uzaklastirilmasi da tek bir tüp içerisinde saglanmaktadir. Bahsedilen DNA izolasyon yöntemi ve kiti sayesinde çekirdekli hücrelerden ve hücreye sahip olmayan DNA barindiran sivilardan hizli ve güvenilir bir sekilde DNA izolasyonu gerçeklestirilmesi saglanmaktadir. Yöntem; hücre içi genomik ve hücre disi DNA izolasyonu ihtiyaci duyan biyoloji, moleküler biyoloji, mikrobiyoloji, immünogenetik, adli tip, ziraat, gida ve veterinerlik gibi çok sayida bilim ve hizmet alaninin faydalanabilecegi uygulama alanina sahiptir. Bulus konusu DNA izolasyon kiti ile farkli biyolojik materyallerden izole edilen DNA örneklerinin 2601280 NM spektrofotometrik ölçümleri ve DNA miktarlari Tablo 1 de örnek olarak sunulmaktadir. Bulus konusu kit ve yöntem Doku Tipleme ve Immünoloji Laboratuvarinda HLA doku tiplemesi için (SSP ve 880 yöntemleri ile) gelistirilmistir. Bu yöntemle izole edilen DNA'lar ile çok sayida HLA analizi yapilmistir. Ayrica kantitatif PCR çalismalarinda da basarili sonuçlar elde edilmistir. Laboratuvara saglanan otomatik DNA izolasyon cihazi, DNA kalitesindeki düsüklüge bagli amplifikasyon problemleri ve test tekrarlari nedeni ile terk edilmis ve manüel yöntem ile çalisilmalar sürdürülmüstür. Küçük bir örneklem grubunda örnek vermek gerekirse; 500 mikro litre kandan bu yöntem ile izole edilen DNA'lar arasindan rastgele seçilen 100 örnegin ortalama DNA indeksi (: 102±41 (min: 50 ; maksz300) olarak bulunmustur. Tablo 1 Bulus konusu DNA izolasyon kiti ile farkli biyolojik materyallerden Örneklerinin 260/280 NM spektrofotometrik ölçümleri ve DNA miktarlari izole edilen DNA ÖRNEK DNA INDEKSI MIKTAR DNA/PROTEIN ORANI (nglul) * Periferik kan 1,4-1,8 20-140 Kemik iligi 1,4-1,8 Belirlenmedi Biyopsi örnegi (böbrek) 1,7 Belirlenmedi Yanak mukoza kazintisi 1,6 Belirlenmedi 4 tel saçin kökü 1,1 3,8 Lam üzerine damlatilmis ve kurutulmus 1 1,8 37 Tezgah üzerine damlatilmis ve kurutulmus 1,5 38 1 damla (10-15 ul) kari kazintisi Parafin blok (dalak) 1,4 57 Gram (-) bakteri 1,7 Belirlenmedi Morganella morganii 1,7 66 Staf. Epidermidis (2 örnek) 1,6-1,9 11-58 *: Miktar baslangiçta kullanilan çekirdekli hücre sayisina göre degiskenlik göstermektedir. **: Optimum PCR amplifikasyonu için degerin 1.3-1.8 araliginda kalmasi tercih edilmektedir. Indeksin 1,3'ün altinda olmasi protein bulasinin, göstermektedir. 2,2"nin üstünde olmasi RNA bulasinin oldugunu Bir diger örnek olarak; EBV ve örneklerden iki farkli yöntem ile DNA izole edilmesi ve EBV DNA amplifikasyon kopya sonuçlari ile karsilastirilmasi olup Tablo 2 de gösterilmektedir. Her iki örnekte de yüksek kaliteli ve kullanilan örnek miktarina göre yüksek miktarda DNA elde edilmistir. Amplifikasyon kopya sayisinin rutin sonuç verilen örneklere göre yüksekligi, DNA kalitesinin göstergesidir. Tablo 2 Bulus konusu yöntemin (DNA-BM) ve önceki teknik diger bir DNA izolasyon yönteminin iki örnege uygulanarak sonuçlarin karsilastirilmasi Örnek DNA Index Ngi'ul Karsilastirma DNA BM ile DNA/miktar Sonuç (2601280) Ampl Sonuç Bulus konusu yöntem ve kit ile izole edilip dilüe edilerek %25'lik agaroz jel elektroforezinde yürütülen bes adet DNA örnegi sekil 1 de verilmektedir. Ayni biçimde bulus konusu kit ile izole edilen DNA'Iardan amplifiye edilen HLA-A, B, C ve DR ürünleri Sekil 2'de verilmektedir. Her bir Iokus için karisim tüpünde bulunan pozitif kontrol amplifikasyonu yükleme kuyularina yakin olarak görülmektedir. Bir diger örnek sekil 3 te görüldügü gibi bulus konusu yöntemle (DNA-BM) elde edilen DNA'Iar ile kemik iligi alici, verici ve nakil sonrasi alici örneklerinde Kimerizm çalismasi sonuçlaridir. Bu yöntemle alicidan, vericiden ve nakil sonrasi kemik iligi alicisindan alinan kanlardan izole edilen HEX, ROX, TAMRA, TPOX, VWA, THO1 genleri basari ile ampliye edilmis ve karsilastirmalar yapilmistir. Sekil 3 te örnek olarak dört alici ve bir vericinin D58818 gen ekspresyonlari gösterilmistir. Amplifikasyonlarin netligi, DNA kalitesinin göstergesi olarak degerlendirilebilir. TR TR TR DESCRIPTION A METHOD FOR FAST AND FAST-SHIPPED GENOMIC_VLEYA EXTERNAL-CELL DNA ISOLATION IN A SINGLE TUBE AND A RELATED KIT Technical Field The invention provides high quality DNA isolation in a short time without the need for preliminary preparation from biological materials in the form of single cell suspensions containing extracellular DNA. More specifically, the present invention relates to a method that allows the application of DNA and a product or kit that enables the application of this method quickly and simply, by performing the necessary cell lysate or homogenate preparation steps before DNA isolation in a single tube with optimized solutions. Known Status of the Technique DNA isolation is known as the process of revealing the DNA molecule in cells using specially developed techniques. It is a necessary preliminary step to perform molecular tests used in diagnostic and research studies. To carry out the process, the cell wall (membrane) must be broken down, the DNA protein complex must be dissolved and separated from the molecules. The DNA in question; When it is desired to obtain cells from materials such as blood, bone marrow, mouthwash, where cells are in single cell suspension, or from solid tissue and other biological samples that have been turned into single cell suspension by various methods, the first process is to destroy the cell membranes and release the cell content, including DNA, into the solution. This destruction is generally carried out by mechanical, enzymatic or chemical means such as alkaline lysis, use of ammonium hydrochloride, hypotonic lysis and must be completed outside the DNA isolation process. In case of using suspensions such as blood and bone marrow, removing erythrocytes containing hemoglobin from the environment in addition to cell membrane destruction is a very important step for pure DNA isolation. Although the erythrocyte lysis step is not laborious, it is usually achieved using chemical methods to prevent loss of nucleated cells. This process takes at least 40 minutes including the centrifugation steps. The duration of the preparation and testing processes is primarily in laboratories that provide routine services and are expected to provide urgent results; Another important process in all DNA isolation, which performs molecular tests and whose goal is always to capture the best and most accurate in the shortest time, is the protein and protein in the environment without damaging the nucleic acids. However, currently; removal of erythrocytes, disintegration of membranes and not presented. The most classical method used for DNA isolation; It is the isolation of DNA by the phenol-chloroform method, using enzymes such as proteinase K. Although good quality DNA is isolated as a result of the process, the method takes a very long time. As a result, personnel working in the laboratory are exposed to chemicals harmful to human health for a long time. In addition to being impractical, the relevant method is harmful to the health of those who perform the procedure. In some DNA isolation methods, heating at high temperatures is used to remove proteins from DNA. This method is a step that increases the processing steps and requires additional time. By known methods; During the isolation process, it is not possible to obtain pure DNA without damaging it by saving time and without threatening human health. This shows that there is a need for a method that can shorten the preliminary process steps of cell lysate (destruction of the cell) or homogenate process (separation of organs or tissues into very small pieces) that must be applied before DNA isolation. In the patent document numbered WOO238758, a solution titled "Lysate Clearance and Nucleic Acid Isolation Using Silanized Silica Matrices" is mentioned. The relevant method relates to the use of sialyzed silica matrices when performing target nucleic acid isolation. In this method, it is claimed that sialyzed silica matrices have higher DNA binding power. However, the method requires a cell lysate preliminary preparation step and defines the DNA acquisition time by ignoring the lysate step. In the patent document no. U85057426, a method that allows the separation of long-chain nucleic acids from other substances in solutions containing nucleic acids and other materials is mentioned. The method involves fixing nucleic acids on a porous (holey) matrix in a solution containing a nucleic acid, washing the porous matrix to separate the other, removing substances from long-chain nucleic acids and fixed long-chain nucleic acids from the porous matrix. Therefore, a solution for DNA isolation via silica matrix in a single tube without performing the cell lysate or homogenate pre-process steps that must be applied before DNA isolation is not presented here. Patent document number US4298500 describes methods for isolating a biological target material from other substances in an environment and producing an isolated material of sufficient purity for advanced analysis. However, in the document in question, there is no mention of a method that allows high quality DNA isolation from samples in cell suspension and fluids containing extracellular DNA in a short time without the need for erythrocyte and cell imaging. As a result, the need for high-quality DNA isolation at less cost and in a short time has led to the current invention, as previous technical solutions were unable to save time, increased processing costs, and prevented the solution from becoming widespread. Purpose and Brief Description of the Invention The purpose of the invention is to introduce a method and kit that allows high quality DNA isolation from samples in cell suspension and samples containing extracellular DNA in a short time without the need for homogenate and cell imaging. Another aim of the invention is to introduce a method that allows DNA isolation with silica matrix without carrying out the preliminary process steps of cell culture or homogenate process, which must be applied before DNA isolation. Another purpose of the invention; The removal of erythrocytes, the disruption of membranes, and the processes related to lipids and proteins are carried out with reactions occurring in a single tube, thus obtaining pure DNA without damage and saving time. Another purpose of the invention; It provides quick, practical and pure DNA isolation that can serve more than one area with a single tube, thanks to the collection of DNA in solutions containing cell-free DNA (cell-free DNA) with the content of its single tube and the effective removal of proteins in the said solutions. Another purpose of the invention; The aim is to present a DNA isolation method and a kit that includes the processes of breaking down proteins, binding DNA with raw silica matrix, removing proteins from the environment, performing washing processes, performing DNA precipitation processes, melting and obtaining DNA. Another purpose of the invention; It aims to present a versatile method that can be easily used for DNA isolation. Brief Description of the Figures Figure 1 shows five DNA samples isolated and diluted with the kit of the invention and carried out in 2.5% agarose gel electrophoresis. Figure 2 shows the HLA-A, B, C and DR products amplified from DNA isolated with the kit of the invention. Positive control amplification in the mixture tube for each locus is seen close to the loading wells. Figure 3 shows the D58818 gene expressions of four recipients and one donor for the Chimerism study. Detailed Description of the Invention The present invention offers a method and kit (product) that allows DNA isolation through silica matrix in a single tube without the need for pre-process steps of cell sample or homogenate process, which must be applied before DNA isolation. With the DNA isolation method, high quality DNA is obtained from biological materials such as whole blood, isolated leukocytes, bone marrow, mouthwash, lymph node, spleen, liver, biopsy materials, bone, as well as microorganisms such as bacterial species and fungal species. Additionally, genomic DNA can be successfully obtained from plants. An important feature that makes the method of the invention superior to other prior art DNA isolation methods is that the solution liquids used in the method of the invention can be used to isolate non-cell DNA (cell-free DNA) in the environment quickly and practically. In this way, DNA can be isolated from serum and urine samples and used in PCR (Polymerase Chain Reaction) reactions and other molecular studies. In addition, the method of the invention enables DNA isolation processes to be carried out in a single microcentrifuge tube, resulting in higher quality and quantity of DNA compared to existing studies. Isolation of DNA spread into the liquid phase in both intracellular genomic and non-cellular systems enables the method to be used reliably in many areas. The product (kit) for the application of the method subject to the invention; For each DNA isolation, it contains a microcentrifuge tube (DNA-BM) containing silica matrix and cell fluid, protein and lipid scavengers at appropriate concentrations, and a sufficient amount of three solutions (DNA-Y1, DNA-Y2, DNA-Y3). DNA-BM, the microcentrifuge tube for the method of the invention, has a liquid capacity of 2 milliliters in the current sample application and provides high quality DNA isolation from up to 900 microliters of sample (blood or cell suspension to be isolated). Accordingly, DNA-BM contains a DNA binding mixture containing Tris.HCl (pH 6.5), EDTA, NaCL, Guanidum Thiocyanate, Nonidet P 40, Tween-20, SDS, DTT, Triton X100 and silica beads. The first solution, DNA-Y1, is prepared as a solution that helps purify DNA from its proteins. DNA-Y1; It contains guanidine thiocyanate, a chaotic agent, Tris.HCl, Triton X100, EDTA, and DTT. The second solution, DNA-YZ, is used for DNA precipitation. DNA-Y2 content; Tris.HCl, NaCl, and the third solution, DNA-YB, is pure ethyl alcohol. It performs DNA precipitation and alcohol washing processes. For DNA elution, a solution such as distilled water or elution buffer is not provided due to different laboratories' preferences. In accordance with the method of the invention, cells with nuclei in solution or in solution; The processing steps, which occur in a single tube without the use of heat, enzymes or high salt concentrations, are carried out as follows; - DNA binding of the untreated silica matrix along with the disintegration of the membrane, hemoglobin and other proteins, - Removal of proteins and lipids from the environment by washing processes, - Carrying out the DNA precipitation process, - Melting and obtaining DNA. Firstly; The study begins with all other fluids thought to contain DNA, such as blood, bone marrow, mouthwash, urine, body fluids, and biological materials that have cells (intracellular genomics) or do not have cells (extracellular). In cases where DNA is desired to be isolated from solid tissue, biopsy sample or paraffin tissues, plants and bones, the said samples must be turned into a single cell suspension. An application example of the method of the invention is as follows: For optimum results, 500 micro liters of blood, bone marrow or cell suspension is transferred to the DNA-BM tube mentioned in the method. When the present invention is intended to be used for extracellular DNA isolation, the content of the DNA-BM tube is mixed with the help of a pipette or similar material to add the desired amount (1 ml) of the liquid (serum, urine, other body fluids or other fluids thought to be contaminated with DNA) from which extracellular DNA is desired to be isolated. -100 milliliters) and DNA is bound. Following a simple centrifugation process, the sediment is transferred back into the DNA-BM tube and the isolation is achieved by applying the other steps of the method. At the beginning of the isolation process, the tubes containing the sample biological materials are vigorously vortexed (mixed) and incubated at room temperature for 3 minutes. Centrifugation time is 10 seconds at 10000 rpm for micro tubes. The numerical values used in incubation and centrifugation processes are not restrictive. The minimum values required for optimum results are specified. The remaining liquid is removed by turning the tubes upside down and tapping them several times on a paper towel or similar material. To obtain DNA from liquids, the cell into which the DNA-BM content is transferred is rotated for a minute and the supernatant (supernatant) is carefully removed. 1 milliliter of DNA-Y1, which is the first washing solution, is added to the DNA-BM tubes containing genomic and extracellular DNA and vortexed, and the next step of the isolation is quickly carried out. As a result of the process in both sample tubes, cell membranes were disrupted; Free DNAs, which are removed by disrupting the membrane, cell lipids and proteins, are retained by the silica matrix. In the phase of purifying DNA from its proteins, washing, mixing and centrifugation at 10000 rpm for 10 seconds are performed with DNA-Y1, which is the first solution provided with the kit and contains the chaotropic agent guanidine thiocyanate, Tris.HCl, Triton X100, EDTA and DTT. The same process is repeated once again by performing a second wash with DNA-Y1 content. Then, two more washes are performed with the second solution, DNA-YZ, containing tris base, NaCl, isopropanol and pure ethanol to precipitate the bound DNA. At the end of centrifugation, the DNA-BM tubes containing DNA containing samples with and without cells are inverted and the supernatants are discarded. DNA precipitation and alcohol washing are achieved with the third solution containing pure ethyl alcohol, DNA-YB. After the centrifugation process and removal of the supernatant, the tubes for the samples with and without the mentioned cells are dried by leaving the mouth open and allowing the alcohol to evaporate. The evaporation of the alcohol is accelerated by placing it on a heater. An amount of distilled water or optionally elution buffer compatible with the sample amounts used for DNA elution can be added and mixed by vortex and kept at 65 °C for 10 minutes. Finally, the dissolved DNA in the supernatant is taken and spectrophotometric measurements are carried out for DNA quality. Invention After the first stage of the method is carried out, the testing steps can be stopped at any stage and the process can be continued in the following days. In addition, extending the incubation period at 65 ° C allows the amount of DNA obtained to be increased. Some more DNA can be obtained by adding elution buffer. Performing the DNA isolation processes simultaneously with silica matrix, the strongest known DNA retainer, ensures fast and high-quality DNA extraction. Thanks to the method, the DNA contents of solutions containing free DNA that do not contain cells can be obtained and the proteins in these solutions can be effectively removed in a single tube. Thanks to the mentioned DNA isolation method and kit, DNA isolation can be achieved quickly and reliably from nucleated cells and non-cell-containing DNA-containing liquids. Method; It has an application area that can benefit from many science and service fields such as biology, molecular biology, microbiology, immunogenetics, forensic medicine, agriculture, food and veterinary medicine that need intracellular genomic and extracellular DNA isolation. 2601280 NM spectrophotometric measurements and DNA amounts of DNA samples isolated from different biological materials with the DNA isolation kit of the invention are presented as examples in Table 1. The kit and method of the invention were developed for HLA tissue typing (with SSP and 880 methods) in the Tissue Typing and Immunology Laboratory. Many HLA analyzes have been performed with DNAs isolated by this method. Successful results were also obtained in quantitative PCR studies. The automatic DNA isolation device provided to the laboratory was abandoned due to amplification problems and test repetitions due to low DNA quality, and studies were continued with the manual method. To give an example in a small sample group; The average DNA index of 100 samples randomly selected among the DNAs isolated by this method from 500 micro liters of blood was found to be (: 102±41 (min: 50; maxz300). Table 1 260/280 of samples from different biological materials with the DNA isolation kit of the invention NM spectrophotometric measurements and DNA amounts isolated DNA SAMPLE DNA INDEX AMOUNT DNA/PROTEIN RATIO (nglul) * Peripheral blood 1.4-1.8 20-140 Bone marrow 1.4-1.8 Not determined Biopsy sample (kidney) 1, 7 Not determined Cheek mucosa scraping 1.6 Not determined Root of 4 strands of hair 1.1 3.8 Dropped on a slide and dried 1 1.8 37 Dropped on a bench and dried 1.5 38 1 drop (10-15 ul) scraping from the snow Paraffin block (spleen) 1.4 57 Gram (-) bacteria 1.7 Not determined Morganella morganii 1.7 66 Staph. Epidermidis (2 samples) 1.6-1.9 11-58 *: The amount varies depending on the number of nucleated cells used initially. **: For optimum PCR amplification, it is preferred that the value remain in the range of 1.3-1.8. An index below 1.3 indicates protein contamination. It is above 2.2" indicating RNA contamination. As another example; isolating EBV and DNA from samples with two different methods and comparing the EBV DNA amplification copy results are shown in Table 2. Both samples are of high quality and according to the amount of sample used. A high amount of DNA was obtained. The high number of amplification copies compared to the samples with routine results is an indicator of DNA quality. Table 2 Comparison of the results of the method of the invention (DNA-BM) and another prior art DNA isolation method applied to two samples. Sample DNA Index Ngi'ul Comparison. DNA BM with DNA/amount Result (2601280) Ampl Result Five DNA samples isolated and diluted with the method and kit of the invention and carried out in 25% agarose gel electrophoresis are given in Figure 1. Likewise, the DNAs isolated with the kit of the invention. The amplified HLA-A, B, C and DR products are shown in Figure 2. The positive control amplification in the mixture tube for each Iocus is seen close to the loading wells. Another example, as seen in Figure 3, is the results of the Chimerism study in bone marrow recipient, donor and post-transplant recipient samples with DNA obtained by the method of the invention (DNA-BM). With this method, HEX, ROX, TAMRA, TPOX, VWA, THO1 genes isolated from blood taken from the recipient, donor and post-transplant bone marrow recipient were successfully amplified and comparisons were made. Figure 3 shows the D58818 gene expressions of four recipients and one donor as an example. The clarity of amplifications can be evaluated as an indicator of DNA quality.TR TR TR