TR201810681T4 - Plastik mikroakışkan ayırma ve saptama platformları. - Google Patents

Abstract

Plastik elektroforez ayırma çipleri, saptama penceresinin ince bir plastik içerdiği ve saptama penceresinin her bir mikroakışkan kanalın bir saptama bölgesini içerdiği çok sayıda mikroakışkan kanal ve bir saptama penceresinden oluşmaktadır. Bu gibi çipler, ince plastik saptama penceresindeki elektroforez çipindeki numunelerin saptanmasını sağlamak için destekte bir aralığın temin edilmesi şartıyla bir desteğe bağlanabilmektedir. Ayrıca, plastik elektroforez ayırma çipi üzerinde çok sayıda numunenin elektroforetik olarak ayırma ve saptama yöntemleri tarif edilmektedir.

Description

TARIFNAME PLASTIK MIKROAKISKAN AXIRMA VE SAPTAMA PLATFORMLARI Ilgili Basvurulara Çapraz Referans Numarali ABD Geçici Patent Basvurusu 35 U.S.C. 5119(e) ve 13 olan ABD Geçici Patent Basvurusu altinda basvurulmustur.

Bulusun Alani Bu bulus, nükleik asit sekanslama ve elektroforez ile lazer ile indüklenen floresanin saptanmasi ile parça boyutlandirma alanina iliskindir. Analiz, plastik elektroforez çipleri üzerinde gerçeklestirilir.

Bulusun Arka Plani 1970'lerde DNA sekanslama teknolojilerinin ortaya çikmasindan bu yana (Maxwn & Gilbert, 1977, Proc Natl Acad Sci ABD 74: 5463-5467), bu teknolojileri kullanan çok çesitli uygulamalar gelistirilmistir. Paralel olarak, DNA sekanslama yapmak için giderek daha sofistike aletler tanitilmistir. Örnegin, 1986'da, Applied Biosystems Sanger sekanslama yöntemiyle üretilen DNA parçalarinin ayrilmasina dayanan otomatik bir DNA sekanslama pazarlamistir; DNA parçalari bir dizi dört floresan boya ile etiketlenmis ve kilcal elektrofonez ile ayrilmistir Sanger sekanslama son otuz yildir en çok kullanilan sekanslama teknolojisi olmustur. Son zamanlarda, çesitli yeni sekasnlama teknolojileri ve ilgili aletler gelistirilmis ve gelistirilmeye devam etmektedir. “Yeni nesil" yöntemlere atifta bulunulmustur (Metzker, 2005, Genome Research pirosekanslama, ligasyon ile sekanslama ve tek molekül sekanslama yer alir. Yeni nesil sekanslama teknolojilerine yönelik arastirmayi yürüten baslica amaç, genel olarak yüksek verimli genomik sekanslama yapmak 've özellikle eksiksiz bir genom dizisi elde etme maliyetini düsürmektir. Yeni nesil teknolojilerin baz çifti basina maliyeti bazi durumlarda Sanger sekanslamadan daha az olsa da, tüm bu yöntemler (Sanger dahil) maliyetlidir ve ciddi zaman, isçilik ve laboratuvar ekipmani gerektirir.

Verilen bir genomdan çok büyük miktarlarda sekans verilerinin elde edilmesine yönelik mevcut vurgu, nispeten küçük miktarlarda genomik sekansin hizli bir sekilde elde edilmesinin degerini olumsuz hale getiremez. Örnegin, birçok yaygin insan hastaligi, 1000'den fazla DNA sekansi bazinda, tam bir insan genomunun üretilmesi için gerekli olandan daha az büyüklük siralarina dayanarak teshis edilebilir. Benzer sekilde, boyutlarinin kesin belirlenmesi kisa tandem tekrar analizi ile üretilen 20'den az spesifik DNA parçasi dizilimi belirli bir bireyi tanimlamak için yeterlidir.

Belli bir insan, hayvan ya da patojen genomunun bir alt kümesinin hizli tanimlanmasi (nükleik asit sekanslama ya da parça boyutlandirmasi) olarak tanimlanan odaklanmis nükleik asit analizine izin verecek olan aletlerin ve teknolojilerin gelistirilmesi için giderilmemis bir ihtiyaç söz konusudur.

Odaklanmis nükleik asit analizi, son kullanicilarin neredeyse gerçek zamanli klinik, adli veya diger kararlari almalarini saglayacaktir. Uygulamaya bagli olarak, odaklanmis nükleik asit analizi, hastane laboratuvarlari, doktor ofisleri, yatak basi veya sahada adli veya çevresel uygulamalar söz konusu oldugunda, çesitli ortamlarda gerçeklestirilebilir.

Nükleik asit (DNA ve RNA) sekanslama ile ilgili olarak, klinik uygulamalar bakteriyel, fungal ve viral hastaliklarin (organizmalarin ilaç direnç profillerinin belirlenmesi de dahil olmak. üzere), kanserin (kemoterapötik rejimlere karsi duyarliligin belirlenmesi dahil) ve kalitsal ve diger yaygin hastaliklarin (ilaçlara cevap vermenin belirlenmesi dahil) teshisini kapsamaktadir. Odaklanmis nükleik asit dizilimi ayrica farmakogenomik analiz ve belirli adli uygulamalar için uygundur (örnegin, mitokondriyal DNA sekanslama dahil).

Nükleik asit parça boyutlandirmasi açisindan, adli ve klinik uygulamalarda odaklanmis nükleik asit analizi kullanilabilir. Örnegin, bir insan kimlikleme türü, kisa. bir tandem. tekrar (STR) analizine dayanmaktadir (Edwards ve ark., l991, Am J Hum Genet 49 (4) 746: 756). STR analizinde, belirli sayida kisa tandem tekrarlari içeren belirli genomik bölgeleri çogaltmak için bir dizi Öncüller kullanilir. Ortaya çikan bantlarin boyutlari, nükleik asit parça boyutlandirmasi (tipik olarak kilcal elektroforez kullanilarak) ile belirlenir ve STR aleller dizisinin her bir üyesinin büyüklügü bir bireyi benzersiz olarak tanimlanir. STR tipleme, insan adli genetik kimlikleme için dünya çapinda bir standart haline gelmistir ve bir bireyin ve ayni zamanda bireyin genetik akrabalarinin tanimlanmasini saglayan tek biyometrik teknolojidir. Klinik uygulamalarda, nükleik asit parça boyutlandirmasi, belirli bir bozuklugu teshis etmek için kullanilabilir (ör., karakteristik bir delesyon veya insersiyonu arastirmak veya Friedreich ataksisinde oldugu gibi nükleotid tekrar bölgelerinin büyüklügünü belirlemek (Pandolfo, M., 2006, Methods Mol) . Med 126: l97-2l6 ). Parça boyutlandirmasi, enfeksiyöz ajanlarin tanimlanmasi için de yararlidir; DNA parmak izi patojen teshisinde kullanilabilir.

Odaklanmis nükleik asit analizinin uygulamalari, yukarida açiklananlarla sinirli degildir. Odakli nükleik asit analizi, hem sekanslama heni de parça boyutlandirma yoluyla klinik 've çevresel numunelerde biyolojik silah ajanlarini tanimlamak için kullanilabilir. Veterinerlik ve gida test uygulamalari da yukarida açiklananlari yansitmaktadir. Yaris ati yetistirme ve izleme, hayvancilik ve evcil hayvan kimliklendirme gibi veteriner tanimlama uygulamalari da bu bulusun kullanim kapsamindadir. Odaklanmis nükleik asit analizi arastirma uygulamalari çoktur. Kisacasi, odaklanmis nükleik asit analizi, çesitli endüstrileri dramatik bir sekilde dönüstürme potansiyeline sahiptir.

Mevcut yüksek verimli kilcal tabanli sekanslayicilar ve yeni nesil sekanslayicilar, odaklanmis nükleik asit analizini zamaninda ve uygun maliyetli bir sekilde gerçeklestirememektedir. Bu teknolojiler tarafindan aranan ölçek ekonomileri, çok büyük miktarda sekans verileri elde etme ve analiz etme maliyetlerini azaltarak yönlendirilir.

Rutin kullanimlara yönelmek için odaklanmis nükleik asit analizi yapabilen cihaz ve sistemler, belirli "ideal" özellik ve niteliklere sahip olacak sekilde tasarlanmalidirlar. Özellikle, aletler` ve sistemler mümkün olan en kisa sürede eyleme geçirilebilir verilerin üretilmesine izin vermek için sonuçlari hizli bir sekilde (birkaç dakika içinde) üretmelidir. Kullanimlari kolay olmali ve reaktifler ve sarf malzemeleri ucuz olmalidir. Ek olarak, bazi uygulamalar için tek kullanimlik olarak nükleik asit ayirmalarinin yapilmasi yararlidir; bu, numune kontaminasyon olasiligini önemli ölçüde azaltir. Bu özelliklere ulasmak için polimer bazli biyoçipler, ayirma substratlari olarak cam ve silikon gibi diger malzemelere göre daha uygundur. üzerinde DNA parçalarinin boyutlandirilmasina yönelik bir girisimde bulunulmustur ve HaeIII kisitlama parçalarinin @X174 RF DNA'sinin ayrilmasi gösterilmistir. Ayirmalar, tek seritli çiplerde tek. numunelerle gerçeklestirilmistir, ancak yine de zayif Çözünürlük ayrimlari ve zayif duyarlilik sergilenmistir.

Ayrica, sistem sadece tek bir florofordan gelen emisyonu STR boyutlandirmasi için 16 akiskan izolasyonlu ayirma seridinden olusan akrilik çiplerin kullanimini bildirmistir, ancak bu yaklasim ayni zamanda zayif çözünürlük gücü ve düsük duyarlilik sergilemistir. Bu düsük sistem hassasiyeti, 16 seritli eszamanli ayirma ve saptama gerçeklestirilirken alelik merdivenlerin (adli analizde kesinlikle gerekli olan iç boyutlandirma standartlari) saptanmasini engellemistir.

Sistemin sinyal/gürültü oranini arttirmaya yönelik bir girisimi temsil eden 2 Hz'lik bir tarama oraninin kullanilmasi, hem. güç hem de hassasligin çözülmesine neden olmustur. Sonuç olarak, sistem sadece tek bir florofordan gelen emisyonu saptayabilmistir. Shi (Elektroferez 24 (19-20): numunede, tek seritli plastik ayirma cihazlarinda 2- ve 4- renk ayirma ve saptama oldugunu bildirmistir. 4.5 cm'lik kanalin tek bir baz çözünürlügü sagladigi rapor edilirken, gerçekte çözünürlük, bir baz çifti arasindaki aralikli alellerin ortaya çikmasiyla kanitlandigi gibi zayiftir (THOl 9.3 ve 10 alellerinin doruk-koyak orani bire yaklasir)- Bu çalismada 4,5 cm'lik cihazlara kiyasla daha yüksek çözünürlük elde etmek için daha uzun ayirma kanallari olan cihazlar (6, ve 18 cm) kullanilmistir. 10 ve 18 cm uzunlugundaki cihazlarin çözünürlügü, çözelti için optimize edilmis eleme matrisleri bilesimleri kullanildiginda, cihazlarin ayrilmasi nedeniyle sinirlandirilmistir.

Pratikte, plastiklerin, nükleik asit sekanslama ve parça boyutlandirmasi için tasarlanan biyoçiplerde kullanim için birkaç ana engel olusturdugu bulunmustur. Plastik malzemelerin otofloresansi, 450 ila 800 nm arasi görünür araliktaki dalga boylarinin saptanmasina engel olur (Piruska, 2005, Lab Chip 5 Bu dalga boylari Sanger sekanslama ve STR boyutlandirma için ticari kitlerde kullanilir. Ayrica, mevcut plastik Cihazlar, yaygin olarak kullanilan substratlara düsük baglanma güçlerine ve yaygin olarak kullanilan eleme matrisleri ile düsük performans sonuçlarina sahiptir. Son olarak, kanalin iç yüzeyleri eleme matrisleri ve DNA numuneleri ile elektro- ozmotik akis ve DNA-duvar etkilesimleri nedeniyle zayif 3564).

Buna göre, yüksek çözünürlükte ve yüksek bir sinyal/gürültü oraniyla odaklanmis nükleik asit analizi yapabilen, ucuz, çok seritli bir plastik biyoçip için ciddi bir giderilmemis ihtiyaç söz konusudur.

Bulusun Özeti Bu bulus, yüksek çözünürlükte odaklanmis nükleik asit analizi yapabilen ve yüksek bir sinyal/gürültü oranina ve bu gibi çipleri kullanma yöntemlerine sahip, ucuz, çok seritli plastik biyoçipler saglamaktadir.

Bulus, istem 1'e göre bir aparat ile tanimlanmaktadir. Söz konusu aparatin diger yönleri, istemler 2-15'te tanimlanmaktadir.

Bu bulusun özel olarak tercih edilen uygulamalari, tercih edilen belirli uygulamalarin ve istemlerin daha ayrintili açiklamasindan anlasilacaktir.

Sekillerin Kisa Açiklamasi Sekil 1, bulusun çesitli uygulamalarina göre bir mikroakiskan ayirma ve saptama çipini göstermektedir.

Sekil 2, bulusun çesitli uygulamalarina göre bir mikroakiskan ayirma ve saptama çipi olusturmak için kullanilabilen ayri destek ve çip katmanlarini göstermektedir.

Sekil 3, bulusun çesitli uygulamalarina göre bir mikroakiskan ayirma ve saptama çipi olusturmak için kullanilabilen ayri cihaz katmanlarini göstermektedir.

Sekil 4, bulusun çesitli uygulamalarina göre bir mikroakiskan ayirma ve saptama çipinin anot kisminin genisletilmis bir görünümünü göstermektedir.

Sekil 5, bulusun çesitli uygulamalarina göre enjeksiyon kanallarina sahip bir* mikroakiskan ayirma ve saptama çipini göstermektedir.

Sekil 6, bulusun çesitli uygulamalarina göre bir mikroakiskan ayirma ve saptama çipinin sematik bir diyagramidir.

Sekil 7, kabartma için kullanilan yigini göstermektedir.

Sekil 8, bir 3/8 "kalin akrilik levhadan (GE Plastik), (üstten) üst görünüsten, alttan (yan görünüs) CNC freze ile imal edilen bir çip destegini göstermektedir.

Sekil 9, tipik cam ayirma çiplerine kiyasla plastik çipin düsük otofloresansini gösteren bir floresans spektrumudur; (a) Montajli plastik çip (Pchip2); (b) Montajli plastik çip (Pchip1); (o) sadece plastik örtü katmansi; (d) 1,4 um kalinliginda cam çip; (e) 0,7 um kalinliginda cam çip; (f) sadece plastik substrat.

Sekil 10, 5 renkli etiketli bir kitten (ABI AmpFlSTR. Ili- tifiler kiti) allelik merdiven için alel olarak adlandirilan bir profildir; yukaridan asagiya dogru: mavi, yesil, sari, kirmizi, turuncu dedektör sinyalleri.

Sekil 11, 9947A insan genomik DNA'si için alel olarak adlandirilan STR profilidir, yukaridan asagiya dogru: mavi, yesil, sari, kirmizi, turuncu detektör sinyalleri; Tam profil, 1.0 ng DNA sablonunda elde edilir.

Sekil 12, 480 bp'ye kadar tek baz çözünürlügün 480 bp'ye kadar oldugunu gösteren R> 0.4 ile çözünürlügü göstermektedir; yukaridan asagiya dogru: mavi, yesil, sari, kirmizi, turuncu dedektör sinyalleri.

Sekil 13, 1 nükleotid ile ayrilan 2 alelin (THOl 9.3 ve 10) çözünürlügünü göstermektedir.

Sekil 14, pGEM parçasinin bir DNA sekanslama analizidir; yukaridan asagiya dogru: mavi, yesil, sari ve kirmizi dedektör sinyalleri.

Sekil 15, bir pGEM parçasinin bir DNA sekanslama. analizini gösteren bir bilesik dört baz çiftidir.

Sekil 16, destek (üst) ve çip (alt) katmanlari gösteren dogrudan elektrokinetik numune enjeksiyonu için bir çip tasariminin ayrik sematik diyagramidir.

Bulusun Detayli Açiklamasi Bulus, nükleik asit türlerinin l baz çifti kadar farkli boyutta ve en az 1.0 ng DNA. sablonu konsantrasyon seviyelerinde ayirma kapasitesine sahip plastik ayirma çipleri saglamaktadir.

STR analizi için analiz edilecek en düsük numune örnegi, çok sayida PCR reaksiyonundan önce, nükleik asit sablonu 800 az, 50 kopyadan az, 30 kopyadan az 10 kopyadan az veya 1 kopya nükleik asit sablonundan olusmaktadir. Sekanslama için analiz edilecek. en düsük konsantrasyon numunesi, Sanger sekanslama reaksiyonuna girdi olarak 0.5 pmol'den daha az, 0.1 pmol'den daha az, 0.01 pmol'den daha az bir nükleik asit sablonu içermektedir.

Burada kullanildigi sekliyle "enjeksiyon kanali" ifadesi, bir numunenin kesistigi mikroakiskan kanal ile kesismesine izin veren “kesisen bir kanal" anlamina gelmektedir. Kesisen kanal, tek bir çapraz kanal, tek bir T-baglanti veya bir ofset çift T baglanti konfigürasyonunda olabilir.

Burada kullanildigi sekliyle "sivi iletisimi" ifadesi, bir sivinin iki bölüm, bilesen veya bölge arasinda akabilecegi sekilde birlesen, bir siviyi içeren iki bölüme veya diger bilesenlere veya bölgelere karsilik gelmektedir. Bu nedenle, arasinda bir mikroakiskan kanal ile birbirine baglanabilir, böylece bir akiskan iki oda arasinda serbestçe akabilir. Bu tür mikroakiskan kanallar istege bagli olarak bölmeler arasindaki sivi iletisimini engellemek ve/veya kontrol etmek için kapatilabilen veya tikanabilen bir veya daha fazla valf içerebilir.

Burada kullanildigi sekliyle "floresan boya" ifadesi, bir isik kaynagi ile uyarim üzerine, 380 - 850 nm dalga boyuna sahip isik yayan boya anlamina gelmektedir. Tercihen, boya yaklasik 450 - 800 nm arasinda bir dalga boyuna sahip olan isik yayar; daha tercihen, boya yaklasik 495 - 775 nm arasinda bir dalga boyuna sahip olan isik yayar.

Burada kullanildigi sekliyle "otofloresans" terimi, isik isinlamasi altinda ilgili florofor disindaki maddeler tarafindan üretilen floresan anlamina gelir.

Burada kullanildigi sekliyle "esas olarak floresans isigi yaymayan" ifadesi, arka plan floresan sinyalini (örnegin, kati veya çözelti) referans alinan nesneden (Örnegin, 500 - 800 nm arasinda) isik isinlamasina maruz birakildiginda (450 - 500 nm arasindaki bir veya daha fazla dalga boyu, özellikle 488 nm lazer isimasi), 0.7 um kalinliginda borofloat camdan olusan geleneksel cam mikroakiskan cihazlardan daha düsük bir arka plan seviyesine sahip oldugunu ifade eder.

Burada kullanildigi sekliyle "norbornen bazli polimerler" terimi, norbornen içeren monomerlerin teknikte uzman kisilerce bilinen yöntemlere göre halka açma metatez polimerizasyonuna göre polimerize edildigi bir norbornen parçasini içeren en az bir monomerden hazirlanan bir polimer anlamina gelir. (bkz., ve 5,342,909).

Burada kullanildigi sekliyle "poli (metil metakrilat) veya Limacrylm, R-Cast m, Perspex m, Plazcryl m, Acrylex m, Acryl W T& Acrylplast TM Altuglas “2 Polycast T“ ve Lucite TM ticari anlatilan polimerlerin yani sira, metil metakrilat sentetik polimerlerini ifade eder. ylm, R-Castm, Perspexm, Plazcrylm, Acrylexm, ACryl- item, ACrylplastm, Altuglasm, PolycastTM and Lucitem, as well as those polymers described in US Patent Nos. 5,561,208, Burada kullanildigi sekliyle "polikarbonat" terimi, bir karbonik asit ve glikol veya bir divalent fenolden olusan bir polyester anlamina gelir. Bu tür glikollerin veya iki degerlikli fenollerin örnekleri, p-ksilolil glikol, 2,2-bis (4-oksifenil) propan, bis (4-oksifenil) metan, l,l-bis (4- oksifenil) etan, l,l-bis(oksifenil) bütan, l,l-bis (oksifenil) siklohekzan, 2,2-bis (oksifenil) butan ve bunlarla sinirli olmamak kaydiyla bunlarin karisimlari, Calibre m, Makrolon m, Panlite m, Makroclear m, Cyrolon m, Lexan W ve Tuffak m ticari adlari altinda satilanlardir.

Burada kullanildigi sekliyle "nükleik asit" terimi, tek ve çift iplikli DNA ve RNA'yi ve ayrica modifiye edilmis bazlar, sekerler ve omurgalar içeren herhangi bir alternatif nükleik asit formunu kapsamaktadir. "Nükleik asit" teriminin, bunlarla sinirli olmamak üzere, tek veya çift iplikli DNA veya RNA (ve kismen tek iplikli veya kismen çift iplikli olabilen formlari), CDNA, aptamerler, peptit nükleik asitler ("PNA"), 2'-5 'DNA (DNA'nin A konformasyonuna uyan bir taban araligina sahip olan kisaltilmis bir omurgaya sahip bir sentetik malzeme; 2'-5' DNA, normalde B formda DNA ile hibridlenmeyecektir ancak RNA ile kolayca hibridlenir) ve kilitli nükleik asitler ("LNA") içerdigi anlasilmalidir.

Nükleik asit analoglari, baz esleme özelliklerinin benzer veya gelistirilmis baglanmasina, hibridizasyonuna sahip bilinen dogal nükleotid analoglarini içerir. Pürin ve pirimidinlerin sinirli olmamakla birlikte, azirid-inilsitozin, 4- asetilsitozin, 5-florourasil, 5-bromorasil, 5- karboksimetilaminometil-Z-tioürasil, 5 -karboksi- metilaminometilülazil, inosin, N6-izopenten-ladenin, 1- metiladenin, 1-metilpseudourasil, 1-metilguanin, l- metilinosin, 2,2-dimetilguanin, 2-metiladenin, 2-metilguan, 3- metilsitosin, 5-metilsitozin, NÖ-metiladenin, 7-metilguanin, 5- metilaminometilülaz, 5-metoksiaminometil-2-tioürasil, beta-D- mannosilkueosin, 5-metoksiurasil, 2-metiltiyo-N-6- izopentenilasin, urasil-S-oksiasetik asit metilester, psödourasil, keozin, 2-tiyositozin, 5-metil-2-tioürasi1, 2- tioürasil, 4-tioürasi1, S-metilürasil, urasil-5-oksiasetik asit ve 2,6-diaminopürin içermektedir. Bulus tarafindan saglanan DNA omurgasi analoglari arasinda fosfodiester, fosforotioat, fosforoditioat, metilfosfonat, fosforamidat, alkil fosfotriester, sülfamat, 3'-tioasetal, metil enin (metilimino), 3'-N-karbamat, morfolino karbamat ve peptit nükleik (PNAlar), ABD Patenti 6,664,057'de tartisildigi gibi metilfosfonat baglari veya alternatif metilfosfonat ve fosfodiester baglari (Strauss-Soukup, 1997, Biyokimya 36: 8692-8698) ve benzilfosfonat baglari; F. Eckstein, IRL Press tarafindan Oxford University Press'de (1991) düzenlenen bir PRATIK YAKLASIM OLIGONÜKLEOTIDLER VE ANALOGLAR; Antisens Stratejileri, New York Bilimler Akademisi Kronolojik Kaydi, Cilt ; Milligan, Uygulamalari (. Baserga and Denhardt (NYAS Research and Applications (. Buradaki nükleik asitler, hücrelerden çikarilabilir veya teknikte uzman kisilerce bilinen herhangi bir yola göre sentetik olarak hazirlanabilir; örnegin, nükleik asitler, baska kaynaklarin yani sira, kimyasal olarak sentezlenebilir veya yazilabilir veya CDNA veya mRNA'dan tersine yazilabilir.

Burada kullanildigi sekliyle "geçis" terimi, malzemenin üst ve alt yüzeyleri arasindaki akiskan baglantiya izin vermek için kati bir malzemeden olusturulmus bir geçis deligi anlamina Bulusun çesitli uygulamalarina göre örnek bir elektroforez çipi, Sekil 1'de gösterilmektedir. Çip (100), bir anot kismi (101), bir katot kismi (102) ve anot ve katot kisimlari arasinda bir merkez kisim (103) içermektedir. Katot kismi, en az bir birinci giris (104) ve anot kismi en az bir ikinci giris (105) içermektedir. Merkez kisim, bir mikroakiskan kanal (106) ve bir saptama penceresi (107) içerir, her bir mikroakiskan kanal bir ayirma bölgesine ve bir saptama bölgesine sahiptir; burada her bir mikroakiskan kanal, en az bir birinci giris araciligiyla ve en az bir ikinci giris ile sivi iletisimindedir. Çok sayida mikroakiskan kanal, esas olarak ayni düzlemdedir ve orta kisim içinde birbiriyle kesismez. Her bir mikroakiskan kanal, örnegin uyarim ve/Veya saptamanin gerçeklesebilecegi bir kisima sahiptir. Çok sayida mikroakiskan kanalin uyarim ve saptama kisimlarini kapsayan alan, saptama penceresi olarak bilinir ve bu pencere, ince bir plastik içerir.

Burada kullanilan "ince plastik" ifadesi, referans alinan malzemenin (en küçük boyutu) l mm'den küçük, 750 um'den küçük, um'den küçük, 200 um'den küçük veya 100 um'den küçük olan bir plastigi içerdigi veya referans alinan nalzemenin 25 - 2000 300 um veya 25 - 200 um arasinda degisen bir kalinliga sahip olan bir plastik içerdigi anlamina gelmektedir. Çipin, saptama penceresinde ince olacak sekilde tasarlanmasina ragmen, çipin saptama bölgesinin disinda kalan kisimlari, ayni kalinlikta veya saptama bölgesininkinden daha büyük bir kalinlikta olabilir.

Sekil 1'deki çip, dört mikroakiskan kanala sahipligi göstermek amaciyla gösterilmektedir, ancak bu açiklama, sinirlayici olmayi amaçlamamaktadir, daha ziyade, teknikte uzman bir kisi bir' kanal ve iki veya daha fazla kanal içeren çipler dahil çipin mikroakiskan kanallarin alternatif sayilarini içerebilecegini kolayca anlayacaktir. Burada kullanilan sekiz veya daha fazla, 16 veya daha fazla, 32 veya daha fazla, 512 veya daha fazla veya 1024 veya daha fazla anlamina gelir Çip (250), Sekil 3'te gösterildigi gibi bir substrat katmanindan (360) ve bir örtü katmanindan (370) olusur.

Substrat katmanina çok sayida oluk (361) motiflenmistir.

Mikroakiskan kanallara akiskan erisimi saglamak için örtü katmaninda bir dizi giris (yani delikler yoluyla) (371, 372) olusturulur ve bunlar çipin anot ve katot kisimlarinda mikroakiskan kanallarin uçlarinda bulunabilir. Alternatif olarak, ayni islevselligi elde etmek için örtü katmani yerine substrat katmaninda girisler olusturulabilir. Substrat katmaninin üst yüzeyi, mikroakiskan kanallari olusturmak için örtü katmaninin alt yüzeyi ile baglanir. Becker' ve Gartner tarafindan kapsamli olarak gözden geçirilen polimer bazli mikroakiskan sistemlerin imalati için teknikler: (Becker, Bu islemlerin herhangi bir sayisi burada tarif edilen plastik ayirma çipini imal etmek için kullanilabilir. Özellikle, mevcut plastik ayirma çipleri, üretilecek yapinin negatif bir ana kalibi ile ince termoplastik filmlerin sicak kabartmasiyla hazirlanabilir. Ana kalip, kati bir substratta hazirlanan cihazi kopya etmek için elektrikle sekillendirme kullanilarak hazirlanabilir. Kati substrat, teknikte uzman kisilerce bilinen standart fotolitografik ve kimyasal asindirma yöntemleri ile motiflenen cam katmanlar olabilir. Substrat ve örtü katmanlari isi ve basinç uygulamasiyla difüzyonla birlestirilir. Çipin substrati ve örtü katmanlari, bunlarla sinirli olmamak üzere, polietilen, poli (akrilatlar) (Örn., poli (metil metakrilat)), poli (karbonat)lar ve doymamis, kismen doymamis veya doymus siklik olefin polimerleri (COP) veya doymamis, kismen doymamis veya doymus siklik olefin kopolimerleri (COC) (örn., ZEONOR m, ZEONEX m veya TOFAS TM) de dahil olmak üzere çesitli plastik substratlardan olusturulabilir. Özellikle, COP ve COC, mevcut polimerler için, diger polimerler ile karsilastirildiginda görünür dalga boyu araliginda kendiliginden daha düsük otofloresans sergilediklerinden, avantajlidir.

Bu islemde kullanilan plastik substrat ve örtü katmanlarinin kalinligi, çipten otofloresansi en aza indirmek için ince tutulur. Plastik substrat ve örtü katmanlarinin her biri, bagimsiz olarak, 200 um'den daha az veya 100 um'den daha küçük bir kalinliga sahip olabilir; veya plastik substrat ve örtü katmanlarinin her biri bagimsiz olarak 25 - 200 um veya 25 - 100 um arasinda degisen bir kalinliga sahip olan bir plastik içerebilir.

Bir uygulamada, Sekil 2'de örneklendirildigi gibi, çip (250), bir anot kismi (202), bir katot kismi (203) ve bir üst kisim içeren bir üst ve alt yüzeye sahip bir destege (201), anot ve katot kisimlari arasindaki merkez kismin bir saptama penceresi (205) içerdigi, anot kisminin en az bir anot yuvasi (206) ve katot kisminin en az bir katot yuvasi (207) içerdigi merkez kismina (204) tutturulmustur. Çipin üst yüzeyi, geçis delikleri yukarida, destegin alt yüzeyi ile temas halindedir ve çip, destege sabit olarak baglanmistir. Bu çip, teknikte uzman kisilerce bilinen yöntemlere, örnegin, difüzyon baglama, çözücü baglama veya yapiskan baglamaya göre destege baglanabilir.

Destek katmani bunlarla sinirli olmamak üzere, polietilen, poli (akrilatlar) (örn., poli (metil metakrilat)), poli (karbonat)lar ve doymamis, kismen doymamis veya doymus siklik olefin polimerleri (COP) veya doymamis, kismen doymamis veya doymus siklik olefin kopolimerleri (COC) (örn., ZEONOR m, ZEONEX m veya TOPAS TM) de dahil olmak üzere çesitli plastik substratlardan olusturulabilir. Bu islemde kullanilan bir plastik destek katmanlarinin kalinligi, yapisal sertlik saglamak ve rezervuarlarda yeterli hacimde numune ve tamponlar saglamak için yeterince kalindir. Plastik destegin kalinligi 100 - 15.000 um arasinda degisecektir. Çok sayida mikroakiskan kanalin her biri en az 10 um, 50 um, sahip olabilir. Çok sayida mikroakiskan kanal en az 25 um, 50 olabilir. Her kanalin Inikrokanal enine kesiti, büyük ölçüde kare, dikdörtgen, daire, yarim daire, eliptik, üçgen veya trapezoidal çapraz kesitlere sahip olabilir. Teknikte uzman bir kisi, mikroakiskan kanallarin derinlik, genislik ve enine kesitte tekdüze olabilecegini veya olmayabilecegini ayirt edecektir. Çok sayidaki mikroakiskan kanalin (106) her biri bir ayirma kismini (108) ve bir saptama kismini (109) içerir. Ayirma - 25 cm arasinda bir ayirma uzunluguna sahip kanallara sahiptir. Ayirma uzunlugu, numune enjeksiyonu noktasi ile numune saptama noktasi arasindaki kanalin bir kismi olarak tanimlanir. Ayirma uzunlugu tipik olarak katot ve anot hazneleri arasinda uzanan ayirma kanalinin toplam uzunlugundan daha azdir. Çok sayida numunenin eszamanli analizi, her bir numunenin, burada açiklanan ayirma çiplerinden herhangi birine ayri bir ayirma kanali içinde enjekte edilmesi ve istiflenmesiyle gerçeklestirilebilir. Bir elektrik alanin ayirma kanali boyunca uygulanmasi, numunelerin, örnegin, kanalin üzerinde bulunan yüklere bagli olarak, ayirma kanalinin katot kismindan anot kismina veya anot kismindan katot kismina dogru teknikte uzman kisilerce bilindigi üzere geçisine neden olur. Numunenin bir eleme matrisi yoluyla tasinmasi, türleri büyüklük bazinda Ayrilan numuneler saptama penceresinden geçerken, numune içindeki her bir türe baglanmis boya etiketleri uyarilabilir ve sonuçta olusan flüoresans saptanabilir. Saptama penceresi, tipik olarak, kanallarin her birinin ayirma bölgesinin ucundaki çok sayida mikrokanalin her birinin saptama bölgesini üst üste getirir. Tipik olarak, çok sayidaki mikroakiskan kanalin her biri için saptama bölgesi büyük ölçüde kanallar boyunca ayni konumdadir, böylece saptama penceresi destegin orta kisminda tek bir konumda olabilir.

Ayni anda çoklu numune ayirma ve saptamayi mümkün kilmak için çoklu numune veya tampon yuvalarina birden fazla numunenin es zamanli olarak enjekte edilmesi için bir enjektör avantajli olarak çip ile donatilmistir. Bu tür enjektörler, örnegin, çok sayida numunenin bir numunesini çok sayida mikroakiskan kanalin bir mikroakiskan kanalina saglar. Enjektörler, numuneleri, teknikte uzman kisilerce bilinen herhangi bir yönteme göre, örnegin elektroforetik tasima, pnömatik çalistirma ya da bir igne ya da tüp ya da numuneyi ayirma kanalina baglayan kanal araciligiyla akiskan harekete geçirme yoluyla kanallara sokabilirler.

Bazi uygulamalarda, numuneler çipin katot hazneleri boyunca çipe yüklenebilir. Her bir numunenin bir enjeksiyon hacmi, teknikte uzman kisilerce bilinen yöntemlere göre katot yuvalarindan biri yoluyla sokulabilir. Örnegin, numune ayirma kanalinin ve/Veya ayirma kanalinin bir çapraz kanalinin ve numune yuvasindaki numunenin bir kisminin (yani enjeksiyon hacminin) ve numunenin ve atik yuvalarinin oldugu sekilde ayirma kanalina uygun sekilde yönlendirilmesi yoluyla enjekte edilebilir. Numune enjeksiyonunu takiben, her katot yuvasina ilave tampon çözeltisi eklenir; yuvadaki kalan numuneyi seyreltmek için yeterli hacim saglanabilir. Örnegin, katot yuvalarina, enjeksiyon hacminin en az yaklasik 5, 10, 25, 50 veya 100 kati olan bir tampon hacmi sokulur. Alternatif olarak, katot yuvalarina, hacminin yaklasik 5 - 100 kati, 5 - 50 kati veya 10 - 50 kati arasinda degisen bir tampon hacmi eklenir.

Diger uygulamalarda, çok sayidaki mikroakiskan kanalin her biri ayrica, numunelerin uygulanmasi için bir enjeksiyon kanali içerir. Örnegin, Sekil 4'e atifta bulunulmaktadir; burada gösterilen, katot kismini (401) ve merkez kismin (403) bitisik kismini gösteren bir çipin (400) genisletilmis bir görüntüsüdür.

Katot kismi, en az bir ikinci giris (405) ve merkez kismi çok sayida mikroakiskan kanallari (406) içermektedir. Her bir mikroakiskan kanal ayrica. çipin. katot kismi içinde, her` bir mikroakiskan kanal için bir numune (409) ve atik (410) yuvasini içeren bir enjeksiyon kanalini (408) içerir.

Enjeksiyon kanali, tek bir çapraz kanal (Sekil 4'te gösterildigi gibi), bir tek T-baglanti veya bir ofset çift T baglanti konfigürasyonunda olabilir. Bazi uygulamalarda, enjeksiyon kanali, numunenin enjeksiyon hacmini en aza indirgeyen, böylelikle ayirma çözünürlügünü arttiran bir ofset çift T baglanti konfigürasyonudur. Enjeksiyon kanalindan mikroakiskan kanalina bir numunenin enjeksiyonu, numune, atik, anot ve katot yuvalarindaki uygun potansiyellerin uygulanmasi yoluyla elektroforetik enjeksiyon dahil olmak üzere teknikte uzman kisilerce bilinen yöntemlere göre gerçeklestirilebilir.

Mikroakiskan ayirma ve saptama çipinin alternatif bir uygulamasi, Sekil 5'te gösterilmektedir. Çip (500) bir anot kismi (501), bir katot kismi (502) ve bir merkez kisim (503) içermektedir. Katot kismi, her bir mikroakiskan kanal (506) için bir birinci giris (504) içerir ve anot kismi, her bir mikroakiskan kanal (506) için en az bir ikinci giris (505) içerir. Merkez kisim, bir mikroakiskan kanal (506) ve bir saptama penceresi (507) içerir, her bir mikroakiskan kanal bir ayirma bölgesine ve bir saptama bölgesine sahiptir; burada her bir mikroakiskan kanal, bir birinci giris araciligiyla ve bir ikinci giris ile sivi iletisimindedir. Çok sayida mikroakiskan kanal, esas olarak ayni düzlemdedir ve orta kisim içinde birbiriyle kesismez. Saptama penceresi ince bir plastik içerir ve her bir mikroakiskan kanalin saptama kismini üst üste Bu durumda, enjeksiyon kanallari, her bir mikroakiskan kanal için bir anot (ikinci) ve katot (ilk) lehine çikarilir. Her bir numunenin bir enjeksiyon hacmi, teknikte uzman kisilerce bilinen yöntemlere göre katot girislerinden biri yoluyla sokulabilir(yukarida). Numune enjeksiyonunu takiben, her bir katot tamponu yuvasina ilave tampon solüsyonu eklenir; yuvada kalan herhangi bir numunenin seyreltilmesi için yeterli hacim saglanmis, böylece uzun numune enjeksiyonundan gelen herhangi bir arka plan sinyaline aracilik edilmis ve saptama penceresinde gözlemlenen sinyal-gürültü oraninin iyilestirilmesi saglanmistir. Örnegin, katot yuvalarina, olan bir tampon hacmi sokulur. Alternatif olarak, anot yuvalarina, hacminin yaklasik 5 - lOO kati, 5 - 50 kati veya - 50 kati arasinda degisen bir tampon hacmi eklenir.

Mikroakiskan kanallardaki numunelerin elektroforetik olarak ayrilmasi, mikroçip üzerindeki mikrokanallar boyunca potansiyel bir farkin uygulanmasiyla saglanir. Mikrokanallarin uçlari boyunca, tipik olarak, katot yuvasi ve anot yuvasina bir katot ve anot yerlestirilerek, mikroakiskan kanalin ayirma kismi boyunca bir elektrik alanin olusturulmasi saglanabilir ve numunenin katot ucundan ayirma kismindan saptama kismina ve nihayetinde anotuna kadar hareket ettirilmesiyle (örn. nükleik asit) yüksek bir voltaj uygulanabilir. Verimli ayirma için gerekli elektrik alani genellikle 50 V m ila 600 V/cm arasindadir. Güç kaynagindaki voltaj, elektrotlar araciligiyla uygulanir ve elektrot ile eleme polimeri arasinda elektriksel temas saglamak için anot ve katot haznesinde bir tampon kullanilir.

Numune ayrimi için gerekli yüksek voltajlar, katot ve anot yuvalarinda bulunan tampon ile temas halinde olan elektrotlarla ayirma kanalina uygulanir. Tamponla temas halinde olan elektrotlarda bulunan yüksek voltajlar nedeniyle, tampon su molekülleri hidrolize olur, bu da OH, H+'ve Hz gazi olusumuna neden olur. Bu olusum, zamanla tamponun pH'sinde ve tampon içinde kabarciklarin olusumunda bir degisiklik ile sonuçlanir. Tamponun. pH degisimi, elektrot ve eleme matrisi arasinda temas saglamak için anot ve katot haznelerinde (örn., zayiflatilabilir. Tampon içinde olusturulan kabarciklar, kanali bloke eden eleme Katrisine tasinma egilimine sahiptir ve nükleik asitlerin zayif bir sekilde ayrilmasiyla sonuçlanir.

Elektrotta olusan kabarciklarin, asagidaki yöntemlerin bir ya da bir kombinasyonu kullanilarak kanala tasinmasi önlenebilir.

Ilk olarak, haznedeki elektrot kabarcik olusturma kaynagini (elektrot) kanallardaki erisim deliklerinden uzaklastirmak için yükseltilebilir.

Ikinci olarak, katot erisim deligi ve elektrotun ucu arasina bir cam firit, polimer firit veya polimer membran veya polimer filtre eklenebilir. Özellikle, katot erisim deligi ve elektrotun ucu arasinda bir polimer firit (ör., Polietereterketon, PEEK) eklenebilir.

Firit, membran veya filtre, iletken olmamak üzere seçilir ve elektrotta olusan kabarciklarin gözeneklerden geçmesini önleyen bir gözenek boyutuna sahiptir. Fritin, polimer membranin veya elektrot ile eleme matrisi arasindaki filtrenin eklenmesi sonucunda, elektroliz isleminden olusan kabarciklarin kanallara girmesi engellenir. Bu uygulama kanallardaki kabarcik blokajindan kaynaklanan arizalari azaltabilir ve/veya ortadan kaldirabilir. Çok sayida numuneden olusan eszamanli analiz için ayirma cihazlari elektriksel olarak baglanir, böylece ortak bir güç kaynagi birden fazla kanali ayni anda hareketlendirmek için kullanilabilir. Ayrica, çipin ve aletin fiziksel kisitlamalari genellikle tüm kanallarin uzunluk, derinlik ve genislik açisindan özdes bir fiziksel yerlesime sahip olmasina izin vermeyecektir. Çok sayida Hukroakiskan kanalin her biri için esas olarak özdes elektroforetik enjeksiyon ve ayirma kosullari elde etmek için, her bir cihazdaki her kanal bölümü esas olarak özdes dirençlere ve dolayisiyla elektrik alanlarina sahip olmalidir. Çok sayida mikroakiskan kanalin her biri arasindaki elektrik alanlarinin yaklasik %+/- 5'ten fazla farklilik göstermedigi, büyük ölçüde özdes bir elektrik alani, ayni anda çok sayida mikroakiskan kanalin her birinin uzunluk, genislik ve derinliklerinin ayarlanmasiyla kanallarin her bölümünün direncini ayarlamak için saglanabilir. Her bir bölümün direnci, R, asagidaki iliskiyle açiklanabilir: burada p dirençtir, l uzunluktur ve A kanalin kesit alanidir.

Ayirma çipi kanallarinin duvarinda bulunan yüzey yükleri, elektromosmoz ve numune-duvar etkilesimleri ile sonuçlanabilir. Bu etkiler, mikroakiskan kanallarin iç duvarlarina bir yüzey kaplamasi uygulanarak en aza indirilebilir. Bu yüzey kaplamalari ve modifikasyonlari, teknikte uzman kisilerce bilinen yöntemlerle gerçeklestirilebilir (örnegin, Ludwig ve Belder, 2003 Hidroksipropilmetilselüloz (HPMC), poli (etilen oksit) (PEO), poli (Vinil alkol) (PVA), polidimetil akrilamid (PDMA), poli (vinilpirolidinon), dimetilasrilamid (DEA), dieti-lakrilamid (DEA), poli (dietilasilamid) (PDEA) ve bunlarin PDMA: PDEA gibi karisimlari dahil yüzey modifikasyonu için çok sayida aday mevcuttur.

Ek olarak, elektroforetik uygulamalarda kullanim için, çok sayida mikroakiskan kanalin her biri avantajli olarak bir eleme matrisi ile doldurulur. Bu gibi eleme matrisleri, sinirlayici olmayan bir örnekte, örnegin, PVP: PAA, PDMA: PAA, PDEA: PAA, PDEA: PDMA: PAA dahil olmak üzere, bir dogrusal poliakrilamid (PAA), polidimetilasilamid (PDMA), polidietilasilamid (PDEA), polivinilpirolidinon (PVP) ve bunlarin karisimini içerebilir. Bazi uygulamalrda, eleme matrisi agirlikça %0.l - 50 poliakrilamid içerir. Bu eleme matrislerinin bir kismi ayrica dinamik kendinden kaplama özelligine de sahiptir. Bulusun elektroforetik ayirma çiplerinin bu uygulamalarini kullanarak uygulandigi gibi, nükleik asitler anottan katot ucuna bir eleme matrisi vasitasiyla elektroforetik olarak hareket eder ve burada boyut olarak ayrilir. Yukarida belirtildigi gibi, kanallarin iç duvarlari, elektromosmoz ve nükleik asit-duvar etkilesimlerinin etkisini en aza indirecek sekilde kaplanabilir. t2-tl AkMhwi+hwü Çözünürlük, özellikle burada elektroforetik çözünürlük, zaman içinde (ya da taban boyutu olarak) ayrilan iki tepe noktasinin kesin olarak ayrim yapabilme yetenegidir. Çözünürlük (R) asagidaki denklemle tanimlanir; burada t, nt zirvesinin tasinma zamanidir, hw, nth zirvesinin tam genisligi ve yari maksimumudur ve Ab, iki pik arasindaki temel sayi farkidir.

Tek baz çifti çözünürlügü, R'nin 0.4'ten büyük oldugu noktada tanimlanir. Görsel olarak, doruk koyak orani 0.7'den büyük oldugunda, iki pik birbirinden ayirt edilebilir. Yüksek çözünürlüge sahip olmak için hem R hem de doruk koyak gereksinimleri karsilanmalidir ve çözünürlük ayrica bir dizi parça boyutunun özelligi olarak düsünülebilir. STR analizindeki alellerin parça uzunluklari araligi, STR analizinde 90 ila 400 bp arasinda degismektedir 've kni parça boyutu araligindaki tekli baz çifti çözünürlügü gereklidir.

Sekanslama analizi için parça boyutlari 1200 bp'ye kadar degisir. Serit basina uzun okuma uzunluklari ve veri verimi elde etme yetenegi, kismen çipin tek bir baz çifti çözünürlügü üretebilecegi aralik ile belirlenir.

Bir optik saptama sistemi için saptama limiti, sinyal gürültü oranina (SNR) göre tanimlanmaktadir. Bu oran, sinyalin bozulmasina yol açan sinyal gücünün gürültü gücüne orani (gürültü gücünün standart sapmasi) olarak tanimlanir. Yüksek bir SNR, bir sinyalin mevcut oldugu daha yüksek bir kesinlik gösterir. Bir sinyal-gürültü orani 3, genellikle, bir sinyalin varligini güvenli bir sekilde tanimlamak için kabul edilebilir olarak tanimlanir (Gilder, 2007, J Forensic Sci. 52 (l): 97). 52(l): 97).

Bir nükleik asit örnegindeki birçok nükleik asit türünün analiz edilmesi ve saptanmasi sirasinda, çipin saptama penceresindeki plastikten otofloresans, floresans arka planina kuvvetle destekte bulunur. Bulusun elektroforetik ayirma çiplerinin avantajli bir özelligi, plastikten arka plan floresansini en aza indirmek için ince bir saptama penceresinin kullanilmasidir. Bu arka plan seviyesi, mikroakiskan ayirma çiplerinin üretilmesi için yaygin olarak kullanilan bir substrat olan borofloatß ile karsilastirilmistir. Ince bir plastik pencere kullanimiyla, analiz için floresan etiketli parçalar üreten PCR isleminde en sablon nükleik asit kopyasi saptanabilir. Sekanslama reaksiyonu için. minimuni 0.5 pmol, 0.1 pmol, 0.01 pmol veya 0.001 pmol nükleik asit sablonu da saptanabilir. Çip Uygulamalarini Ayirma ve Saptama Bulusun çesitli yönlerinin uygulanmasi, hem nükleik asit tanimlama hem de sekanslama için genis ölçüde uzanmaktadir.

Insan kimliklendirmedeki kullanim örnekleri, örnegin askeri kontrol noktalarinda, sinirlarda ve limanlarda, havaalanlarinda ve kitlesel felaket bölgelerinde kimlik saptama gibi, adli tip ve iç güvenligi içermektedir. Yaris ati yetistirme ve izleme, hayvancilik ve evcil hayvan kimliklendirme gibi veteriner tanimlama uygulamalari da açiklanan elektroforetik çiplerin kullanim alanlari kapsamindadir.

Ayrica, bu bulusun aletleri saglamlastirilabilir ve böylece sonuçlarin gerçek zamanli olarak kullanilabilecegi alanda çalistirilabilir. Bu nedenle, araçlar askeri kontrol noktalarinda, sinirlarda ve limanlarda, havalimanlarinda ve kitlesel kaza yerlerinde kullanilabilir.

Teknigin nükleik asit sekanslama uygulanmasi dört alana ayrilabilir: örnegin, bakteriyel enfeksiyonlar ve antikor duyarliliklari, viral enfeksiyonlar (tanimlama ve ilaç direnci profili), genetik hastaliklar, kompleks bozukluklar (astim, kalp hastaligi, diyabet) ve farmakogenomikler dahil olmak üzere insan klinik teshisleri, veteriner klinik teshisleri; yeniden sekanslama ve bitirme dahil olmak üzere arastirma sekanslama; örnegin B. anthracis ve Ebola virüsü saptama dahil olmak üzere biyolojik silahlar madde tanimlamasi; ve gida güvenligi. Bazi örnekler asagidaki gibidir.

HIV'li bir hastaya ilaç direnci testi yapilmalidir. Bugün, direnis olusturmak haftalar sürebilir. Bu süre zarfinda ilaca dirençli bir sus alinabilir- Hasta hekimin ofisinde beklerken 1-2 saat içinde cevap verebilecek bir cihaz ve sisteme karsi giderilmemis bir ihtiyaç söz konusudur. Bulusa göre bir elektroforetik ayirma çipinin kullanilmasi, sik ilaç direnci izlemesine, anti-viral ajanlarin daha klinik ve maliyet etkin kullanimina ve daha iyi hasta sonuçlarina olanak tanir.

Bakteriyemisi olan bir hasta sok halindedir. Günümüzde, etken maddenin antibiyotiklere ve bunlarin özdeslerine dirençli olup olmadigini belirlemek günler sürebilir. Bu arada, hasta, hastaya ciddi yan etkilere neden olabilen ve günümüzde yaygin olan antibakteriyel direncin artmasina katkida bulunan genis spektrumlu antibiyotiklerle tedavi edilmelidir. Ek olarak, bu tür tedaviler yetersiz olabilir. Bulusa göre bir elektroforetik ayirma çipinin kullanilmasi, 1-2 saat içinde patojenin antibiyotik direnç profilinin tanimlanmasina izin verir, bu da daha etkili, hedeflenmis tedaviye, antibiyotik toksisitelerinde azalmaya ve daha iyi hasta sonuçlarina yol açar. Hastaya ve halk sagligina faydalari karsiliksizdir.

Kanserli bir hasta ameliyat olmaktadir. Günümüzde, hasta ameliyat masasinda iken bir tümör örnegi patolojiye alinmaktadir. Basit histopatoloji suslarinin sonuçlarina dayanarak, cerrahin ne kadar agresif olmasi gerektigine dair bir karar verilir. Bulusa göre bir elektroforetik ayirma çipinin kullanilmasi, histopatolojinin yerini kanserin bir saatten daha kisa sürede kesin bir nükleik asit ile teshisin almasina neden olabilir, bu da daha iyi bir cerrahi kararin alinmasina olanak saglayabilir. Asagidaki Örnekler, bulusun özel uygulamalarini ve bunlarin çesitli kullanimlarini açiklamaktadir. Sadece açiklama amaciyla verilmislerdir ve bulusu sinirlayici olarak düsünülmemelidir. Örnekler Çip Tasarimi ve Elektroferez Örnek 1A: Çip Tasarimi Bulusun cihazlarinin özel bir uygulamasinin sematik bir diyagrami, Sekil 6'da gösterilmektedir. Bu mikroakiskan cihaz, her biri çift T çapraz enjektörlü 16 mikrokanaldan olusmaktadir. Kanalin enine kesit boyutu (90 um genisliginde ve 40 um derinliginde) ve anot ile çapraz enjektör arasindaki kanalin uzunlugu (25 cm) tüm kanallar için esittir. Kanallarin her biri için ayirma› uzunluklari (kesisme ve uyarim/saptama penceresi arasindaki mesafe) 16 ila 20 cm 'uzunlugu arasinda degismektediri Katot yuva ile enjektör arasindaki kanallarin enine kesit alani, tüni dirençlerin ve dolayisiyla katot ve kesisme arasindaki elektrik alanlarinin egilim altinda esas olarak esit olacak sekilde ayarlanmistir. Bu, numunelerin maruz kaldigi ayirma kanalindan bagimsiz olarak, numunelerin yasadigi elektrik alanlarinin ayni olmasini saglamistir.

Tüm kanallarin kesisme gerilimleri esas olarak aynidir. Numune enjeksiyonu için örnek giris ve numune atik kollari 2.5 mm uzunlugundadir. Her iki kanal arasindaki mesafe 500 um'dir. Örnek lB: Çip ve Destek imalati Çip, sicak kabartma, giris delikleri olusturmak için delme ve kanallarin sizdirmaz hale getirilmesi için difüzyon ile sekillendirilmistir. Örnek camda fotolitografi ile kimyasal bir` islak asindirma islemi kullanilarak imal edilmistir. Bu cam Örnek daha sonra cam örneginin negatif bir kopyasini üretmek için elektrik ile sekillendirme yoluyla bir nikel- kobalt kabartma aleti imal etmek için kullanilmistir. Substrar olarak Zenor m -1420R film (5 "x 2" boyutunda ve 188 um kalinliginda) katmanlar kullanilmistir. Bu katmanlarda sondaj ile katot, anot, numune ve atik erisim delikleri olusturulmustur. Bunu, kabartma aleti üzerindeki çip tasarimi özelliklerini substrata sicak kabartma ile kaplama izlemistir.

Kabartma, Sekil 7'de gösterildigi gibi yigini isitilmis bir hidrolik preste 15 dakika 135 °C'de ve 1250 psi kompresif basincinda yerlestirerek gerçeklestirilmistir. Yigin, 1250 psi basinç altinda tutulmustur ve birakilmadan önce 38 °C'ye sogumaya birakilmistir. Bu çipin norbornen monomerlerini içeren ince termoplastik polimerler ile üretilmesi, uyarim ve saptama penceresinde düsük bir arka plan floresani ile sonuçlanmistir. Yüksek bag kuvvetli difüzyon baginin elde edilmesi, yüksek viskoziteli eleme matrislerinin kullanilmasina olanak saglamistir.

Substratin difüzyonla birlestirilmesi, bir substratin üzerine bir Zenor m -1420R filmin (5 "X 2" boyutunda ve 188 um kalinliginda) hizalanmasi ve bu yiginin isiya ve basinca tabi tutulmasiyla basarilmistir. Film katmanlari arasinda hiç bir yapistirici uygulanmamistir; baglanma tamamen isi ve basinç ile gerçeklestirilmistir. Çipin son kalinligi yaklasik 376 um idi. Bu yöntemle üretilen. ayirma. çipleri test edilmistir' ve basarisizliktan önce en az 830 psi basinç dayanabilecegi gösterilmistir.

Sekil 8, 3/8 "kalinliginda bir akrilik levhadan (GE Plastik) CNC freze ile imal edilen bir` çip destegini göstermektedir. Çip destegi üç ana bölümden olusmaktadir: katot yuvasi, orta kisim ve anot yuvasi. Katot levhasi, katot yuvasini, numune ve atik yuvalarini ve hizalama deliklerini içerir. Anot levhasi, anot yuvasi. ve hizalama deliklerini içermektedir. Hem katot levhasi hem de anot levhasi, elektroforez için numune enjeksiyonu ve tampon hacmi için yeterli numune hacmini temin etmek üzere 3/8” kalinligindadir. Merkez kisim 0.04" kalinligindadir ve mikrokanallarda lazerle uyarilan floresan saptama için "saptama penceresi"olarak bir açikliga sahiptir.

Bu konfigürasyonda, ayirma çipinden gelen otofloresans yaklasik 376 um kalinliginda substrat tarafindan domine edilir. Ayirma çipi, çift tarafli basinca duyarli yapistirici ile çip destegine baglanmistir. Yapistirici, ayirma tamponlarina ve eleme matrislerine etkisiz olacak sekilde seçilmistir. Destek ve ayirma çipi basinca duyarli epoksi ile tutturulmustur. Uyarim ve saptama alanindaki plastigin kalinligi, bu bölgedeki tasiyici üzerinde bir salter olusturularak en aza indirilmistir.

Zenor m - l420R'nin optik emisyon spektrumu, floresan boyalarla sinirli floresans saptamasina sahip 570 nm'de Raman emisyon pikine sahiptir. Sekil 9, tipik cam ayirma çiplerine (Cam 1.4 um ve Cam 0.7 um) kiyasla plastik çipin (PChipl ve PChpZ) düsük otofloresansini göstermektedir. Plastik çipin düsük otofloresansi, bir COP polimeri seçerek ve saptama alanindaki cihazin kalinligini en aza indirerek ve cihazi ince filmlerle imal ederek elde edilmistir. Örnek lC: Yüzey modifikasyonu ve eleme matrisi Yüzey modifikasyonu, baslangiçta mikro-kanalli yüzeyleri deiyonize su ile, ardindan 1 M NaOH ile ön islemden geçirerek gerçeklestirilmistir. Kanallardan akiskanlari uzaklastirmak için bir azot basma uygulanmistir. Yüzey isleminden sonra, kanallar boyunca %0.l (a/h) hidroksipropilmetilselüloz (HPMC) solüsyonu dökülmüstür ve ardindan oda sicakliginda gece boyunca inkübasyon yapilmistir. Kanal içerisindeki akiskanlari uzaklastirmak için kanallardan akan yüksek saflikta azot kullanilmistir.

Bu deneyler için kullanilan eleme matrisi, 7M Urea ve 1x TTE (Amresco) tamponu içinde %4 lineer poliakrilamid (LPA) olmustur. Örnek 1D: Elektroforez STR boyutlandirma Elektroforetik ayirma ve nükleik asit analizinin analizi Genebench-FX T” 100 Serisi (Network. Biosystems, Inc., Wobum, MA) üzerinde gerçeklestirilmistir. Bu cihaz, çip ve cihaz arasinda iyi görsel, elektriksel ve termal baglanti saglamak için plastik ayirma çipini ve çip destegini kabul edecek sekilde yapilandirilmistir. Isleni boyunca haznenin sicakligi 50 oC'de tutulmustur.

DNA boyutlandirma deneyleri için insan genomik DNA, ABI AmpFISTR kiti (Applied Biosystems Inc., Foster City, CA) ile güçlendirilmistir. PCR. ürünü ( 0.3 mL boyutlandirma standardi. ve 10 nüi formamid ile karistirilmisve analiz için numune yuvalarina yüklenmistir. Analiz, anot kuyusunda 3900 V potansiyel farki uygulayarak ve katot yuvasini topraklayarak, örnek uygulamadan önce 6 dakika 156 V/cm'de gerçeklestirilen ön elektroforezden olusmaktaydi. DNA numuneleri, 18 saniye boyunca 350 V/cm'lik bir elektrik alani uygulanarak, ardindan numune ve atik yuvalari boyunca 350 V/cm'lik bir elektrik alani uygulanarak ve ayni anda katot ve anot yuvalarinda 15.6' V/cm'lik bir elektrik alani uygulanarak 1,2 dakikalik bir çift yük uygulanarak tanitilmistir. Numune enjeksiyonundan sonra, elektroforetik DNA ayrimi, katot. ve anot yuvasi boyunca 156 V/cm'lik bir elektrik alani uygulanarak, 40 dakika boyunca 800 V'luk bir geri çekme voltaji korunarak gerçeklestirilmistir.

DNA sekanslama deneyleri için, M13 plazmidi GE Amershani DY- Enamic m ET boya sonlandirici dizi sekanslama kiti (GE Healthcare) ile siklus halinde dizilmistir, etanol çökeltilmistir ve 10 mL deiyonize su içinde yeniden süspanse edilmistir. Ayirma, anot kuyusunda 3900 V' potansiyel farki uygulayarak ve katot yuvasini topraklayarak, örnek uygulamadan önce 6 dakika 156 V/cm'de gerçeklestirilen bir ön elektroforezden olusmaktaydi. DNA örnegi, 60 saniye boyunca 350 V/cm'lik bir elektrik alani uygulanarak tanitilmistir.

Numune enjeksiyonundan sonra, elektroforetik DNA ayrimi 60 dakika boyunca 400 V'luk bir geri çekme voltaji korunarak katot ve anot yuvasi boyunca 156 V/cm'lik bir elektrik alani uygulanarak gerçeklestirilmistir. DNA ayirma çözünürlügü, Peakfit®'den pik bilgisinin (pik araligi ve pik genisligi) çikarilmasiyla hesaplanmistir.

Plastik çipte 16 seritte eszamanli olarak basarili bir sekilde ayirma gerçeklestirilmistir. Sekil 10, 5 renkli etiketli bir kitten (ABI AmpFlSTR Identifiler kiti) alelik nerdiveni için allel denilen profili göstermektedir. Bu sonuçlar, bulusun cihazlarinin bir plastik çipte 5 renk ile ayrilabildigini ve sadece bir baz çiftine (THO 1, allel 9.3 ve 10) esdeger bir mesafe ile aralanmis olanlar dahil alelleri açikça çözebildigini göstermistir. Sekil 11, 9947A insan genomik DNA'si için STR adi verilen bir alleli göstermektedir, bu da tam bir profilin 1.0 ng DNA sablonunda elde edildigini göstermektedir. Sekil 12, 480 bp'ye kadar tek baz çözünürlügünü gösteren 480 bp'ye kadar R> 0,4 ile çözünürlügü göstermektedir. Sekil 13, 1 nükleotit ile aralanmis 2 alleli göstererek bu çözünürlügün açik bir sekilde belirsizlik olmadan çözülebildigini göstermektedir. Sekil 14 ve 15, tek baz çifti çözünürlüklerini gösteren bir DNA sekanslama profilini göstermektedir.

Elektrokinetik enjeksiyon plastik çip Örnek 2A: Çip Tasarimi Bulusun elektroforetik ayirma çiplerinin baska bir yapilandirmasi, ayirma için tek bir kanal kullanir. Her numune elektrokinetik numune enjeksiyonu ile bir ayirma kanalina sokulur. Bu alternatif yaklasim, küçük numune hacimlerinin kullanilmasina ve ayirma isleminde önemli bir sadelestirmeye izin verir. Elektrokinetik numune enjeksiyonu için çip tasariminin sematik bir diyagrami, Sekil l6'daki destek ve ayirma çip bölümlerini gösteren ayrik bir görüntüyü göstermektedir. Cihaz, ayirma uzunlugunda etkili 20 cm olan 16 mikrokanaldan olusur. Her kanalin her bir ucunda bir giris deligi vardir. Kanallar 90 um genisliginde ve 40 um derinligindedir. Örnek 2B: Cihaz Imalati Sekil 16'daki cihaz, yukaridaki bölümde tarif edilen prosedür izlenerek imal edilir. Özet olarak, 188 um'lik bir kalinliga sahip bir COP filminde (Zeonor m -1420R) giris delikleri (çap olarak ]_ mm) olusturulmaktadir. Kanal desenleri (genislik 90 um ve derinlik 40 um) daha sonra sicak kabartma ile olusturulur. COP (Zeonor m -1420R) bir kapak, kanallari kapatmak için alt katmanya difüzyonla baglanir. Örnek 2C: Elektroferez Cihaz, yukaridaki bölümde açiklandigi gibi kanallara bir yüzey modifikasyonu uygulanarak ayirma için hazirlanir. Bunu kanallarin bir eleme matrisi ile doldurulmasi takip eder.

Numuneler numune/katot haznesine yüklenir. Negatif yüklü DNA'yi ayirma kanalina enjekte etmek için elektrotlar yoluyla numuneye bir enjeksiyon alani uygulanir. Kanallara DNA enjeksiyonu yapildiktan sonra, numune/katot rezervuarina numunenin hacminin 10 kati hacminde tampon (IX TTE; Ameresco) eklenir. DNA'yi ayirma kanalinin altindan enjeksiyon tapasindan ayirmak için katot ve anot boyunca bir elektrik alani uygulanir. Ekleme, numune/katottaki numuneyi seyreltmek için görev yapar ve tamponu yüklemeden önce numuneyi çikarmaya gerek. yoktur. Ayirma. ve algilama, bir Genebench-FX TM Series lOO cihazinda gerçeklestirilir ve veri analizi, önceki örneklerde açiklanan yazilim ile gerçeklestirilir.

DNA sekanslama DNA sekanslama analizi için, DNA sablonu, SpeedSTAR HS (Takara, Madison, WI) ü] / mL): 0.025, Hizli Tampon l: 1x, dNTP'ler: 0.25 um, Primer (ileri): 250n ki ve Primer (ters): 250 nM PCR enziminden olusan bir reaksiyon karisiminda amplifiye edilir. Istenilen bir sablon DNA seviyesi karisima eklenir. Reaksiyon karisimina toplam 10 mL hacim DI su veya TE tamponu (Tris lO um veya EDTA 0.1 mm) eklenir. Üreticinin önerilen protokollerini takiben PCR reaksiyon karisiminin termal döngüsü, 95 C'de 60 saniyelik sicak baslatma aktivasyonundan, 30 döngü denatürasyondan, tavlama ve °C'de 5-10 saniye/kbp) ve 72 °C'de 60 saniyelik bir son uzatmadan olusmaktadir.

Tüm PCR ürünü, imalatçilarin protokolünü takiben 30K MWCO UF filtresi (Pall, East Hills, NY) kullanilarak temizlenir. DI su içerisindeki DNA'dan olusan temizlenmis ürün, ya seyreltme ya da bütün halinde, sekanslama reaksiyonu için sablon olarak uygulanir. PCR sablonunun döngü sekanslamasi, asagidaki reaksiyon karisimi ile yari kuvvet reaksiyonunda DYEnamic m ET Terminatör Çevrim Dizileme Kiti (GE Amersham Biosciences) kullanilarak yapilmstir. Sekanslama Premiksi: 4 mL, Seyreltme Tamponu: 4 mL, Primer (lOum): 5 pmol.

DNA sablonu, siralama reaksiyon karisimina eklenmistir.

Reaksiyon karisimina toplam 20 mL haciHi DI su eklenmistir. Üreticinin tavsiye edilen döngü protokollerini takiben, kullanilan döngü kosulu otuz döngüden (95 °C'de 20 saniye, 50 °C'de 15 saniye, 60 °C'de 60 saniyeden) olusmaktadir.

Sekanslama reaksiyonu karisimi, etanol ile çökeltilerek temizlenir. Çöken. ürün. 13 mL DI su içinde yeniden. süspanse edilmis ve ayirma ve saptama için örnek olarak kullanilmistir.

STR analizi için amplifikasyon, asagidaki reaksiyon karisimina sahip 10 nüi reaksiyonlarda gerçeklestirilir: PCR enzim SpeedSTAR` HS (Takara, Madison, WI) (U / InL): 0.0315, Hizli Tampon l: 1x, Primer seti: 2 ml , Hizli Tampon l: IX, dNTP'ler: 200 um, Primer (ileri/Geri): AmpFlSTR Profiler T& COFiler m veya Identifiler TM'den (Applied Biosystems, Foster City, CA) 2 m L. PCR enzyme SpeedSTAR HS (Takara, Madison, WI) Döngü protokolü, 95 °C'de 60 saniyelik bir sicak baslatma aktivasyonunu ve ardindan 28 döngü denatürasyon, tavlama ve 60 saniyelik bir son uzatma içeren enzim imalatçilari kosullarini takip eder. PCR ürünü ayirma ve saptama için örnek olarak kullanilir. Alternatif olarak, PCR ürünü ayrica saflastirilabilir ve ayirma ve saptama için örnek olarak kullanilabilir.

Anlatilan açiklamanin, bulusun bazi özel uygulamalarini vurguladigi ve buna esdeger tüm modifikasyonlarin veya alternatiflerin ekteki istemlerin kapsami içinde oldugu anlasilmalidir.

Claims (3)

1. ISTEMLER L Substrat katmaninin çok sayida olugu ve substrat katmanindan birini içerdigi ve örtü katmaninin bir dizi açik delik içerdigi; substrat katmaninin bir üst yüzeyi ve örtü katmaninin bir taban yüzeyinin birçok mikroakiskan kanali olusturmak üzere birbirine baglandigi, söz konusu kanallarin bir ayirma bölgesinin ucunda bir saptama bölgesine sahip olan, substrat katmaninin ve örtü katmaninin her birinin ince bir plastik polietilen, bir poli (akrilat), bir poli (karbonat), doymamis, kismen doymamis veya doymus bir siklik olefin polimer (COP), doymamis, kismen doymamis veya doymus siklik olefin kopolimeri (COC) veya esasen 450 ila 500 nm arasindaki bir dalga boyunda uyarildiginda 500 ila 800 nm arasinda bir dalga boyuna sahip olan isigi floresanlamayan bir norbornen termopolimer içerdigi bir substrat katmani (360) ve bir örtü katmanina (370) sahip bir elektroforez ayirma çipini (250) içeren bir aparat olup, özelligi; substrat katmaninin ve örtü katmaninin her birinin bagimsiz olarak 200 um'den daha küçük bir kalinliga sahip olmasi; ve çipe sabit sekilde baglanmis bir plastik destegin (201), söz konusu destegin en az bir anot kismi (206) ile bir anot yuvasina (202), en az bir katot kismi (207) ile bir katot bir orta kisim (204) arasinda, orta kismin, plastik destegindeki bir salterden imal edilen bir saptama penceresine (205) sahip olmasi ve saptama kisminda toplam plastik kalinliginin 400 um'den az olacak sekilde çok sayida mikroakiskan kanalin her birinin saptama kismiyla üst üste binmesidir.
2. 2. Istem l'e göre aparat olup, özelligi; ince plastik filmin bir norbornen termopolimer olmasidir.
3. 3. Isteni l'e göre aparat olup, özelligi; çipin ince plastik filminin doymamis, kismen doymamis veya doymus siklik olefin polimeri (COP) olmasidir. Istem l'e göre aparat olup, özelligi; plastik destegin polietilen, bir poli (akrilat), bir poli (karbonat), doymamis, kismen doymamis veya doymus bir siklik olefin polimeri (COP), doymamis, kismen doymamis veya doymus bir siklik olefin kopolimer (COC) veya bir norbornen termopolimer içermesidir. Istem 3'e göre aparat olup, özelligi; plastik destegin bir akrilik katmandan yapilmasidir. Istem l'e göre bir aparat olup, özelligi; saptama penceresi, destegin merkez kisminda tek bir konumda olacak sekilde çok sayida mikroakiskan kanalin her birinin saptama kisminin, her bir kanal boyunca esas olarak ayni konumda olmasidir. Istem l'e göre aparat olup, özelligi; birden fazla mikroakiskan kanalin her birinin 2 cm ila 50 cm arasinda bir ayirma uzunluguna sahip olmasidir. Istem. l'e göre aparat olup, özelligi; birden, fazla mikroakiskan kanalin her birinin ayrica bir enjeksiyon kanali içermesidir. Istem 3'e göre bir aparat olup, özelligi ince plastigin esas olarak 570 nm'de bir dalga boyuna sahip floresan isigi yaymamasidir. Isteni l'e göre aparat olup, özelligi; parça boyutlandirma uygulamalari için üretilen› bir nükleik, asit numunesindeki birçok nükleik asit türünün PCR amplifikasyonu için bir nükleik asit sablonunun tek bir kopyasi ile baslayan 3'ten daha büyük gürültü sinyali ile saptanabilmesidir. Istem l'e göre aparat olup, özelligi; DNA sekanslama uygulamasi için üretilen bir nükleik asit numunesindeki birçok nükleik asit türünün, PCR amplifikasyonu için bir DNA sablonunun tek bir kopyasi ile baslayarak 3'ten daha büyük bir gürültü sinyali ile saptanabilmesidir. Istem l'e göre aparat olup, özelligi; birden fazla mikroakiskan kanalin her birinin, tercihen yüzey kaplamasinin hidroksipropilmetilselüloz (HPMA), poli (etilen oksit) (PEO), poli (vinil alkol) (PVA), poli (dimetil akrilamid) (PDMA), poli (vinilpirolidinon), dimetilakrilamid (DMA), dietilakrilatid DEA, poli (dietilakrilamid) ve bunlarin karisimlarinin oldugu bir yüzey kaplamasini da içermesidir. Istem l'e göre aparat olup, özelligi; birden fazla mikroakiskan kanalin her birinin, tercihen eleme matrisinin tercihen dogrusal veya çapraz bagli bir poli (N, N-dialki- lakrilamid), dogrusal poliakrilamid, polidimetil-akrilamid, polivinilpirolidinon, ya da bunlarin. kombinasyonlari, daha tercihen, eleme matrisinin agirlikça %1-50 poliakrilamid içerdigi bir eleme matrisini içermesidir. Istem l'e göre aparat olup, özelligi; ayrica her bir katot yuvasi ve her bir mikroakiskan kanal arasinda gözenekli bir katman içermesidir; burada gözenekli katman, her bir mikroakiskan kanal içine katot yuvalarindan gaz kabarciklarinin geçisini büyük ölçüde engelleme kapasitesine sahiptir. Isteni 14'e göre aparat olup, özelligi; gözenekli katmanin bir cam frit, bir polimer frit, bir polimer membran veya bir polimer filtre içermesidir.