TH73376B - กระบวนการสำหรับการรวมโครโมโซมและการทดแทนลำดับ DNA ใน Clostridia - Google Patents

Abstract

DC60 (28/12/50) การประดิษฐ์นี้เกี่ยวข้องกับวิธีการใหม่สำหรับทดแทนหรือลบลำดับ DNA ใน Clostridia ที่มีประสิทธิภาพสูง ดำเนินการง่าย และใช้ได้ที่ระดับอุตสาหกรรม วิธีการนี้มีประโยชน์ ในการดัดแปลงโลคัสทางพันธุกรรมใน Clostridia ในลักษณะที่เป็นงานประจำ วิธีการนี้อาศัยพาหะ ที่ลอกแบบได้ที่มียีนของตัวทำเครื่องหมายอย่างน้อยสองยีน การประดิษฐ์นี้เกี่ยวข้องกับิธีการใหม่สำหรับทดแทนหรือลบลำดับ DNA ใน Clostridia ที่มีประสิทธิภาพสูง ดำเนินการง่าย และใช้ได้ที่ระดับอุตสาหกรรม วิธีการนี้มีประโยชน์ ในการดัดแปลงโลคัสทางพันธุกรรมใน Clostridia ในลักษณะที่เป็นงานประจำ วิธีการนี้อาศัยพาหะ ที่ลอกแบบได้ที่มียีนของตัวทำเครื่องหมายอย่างน้อยสองยีน

Claims (2)

ข้อถือสิทธฺ์ (ทั้งหมด) ซึ่งจะไม่ปรากฏบนหน้าประกาศโฆษณา :------20/07/2561------(OCR) หน้า 1 ของจำนวน 4 หน้า ข้อถือสิทธิ 1.กระบวนการสำหรับทดแทนลำดับ DNA เป้าหมายโดยการรคอมไบน์แบบ โฮโมโลกัสใน Clostridia ที่ประกอบรวมด้วย : -การเปลี่ยนแปลงพันธุกรรมของสายพันธุ์ดังกล่าวด้วยพาหะที่ประกอบรวมด้วย : -จุดเริ่มด้นของการลอกแบบที่สามารถทำให้เกิดการลอกแบบของพาหะ ใน Clostridia และ -คาสเซตต์ทดแทนที่ประกอบรวมด้วย ยีนของตัวทำเครื่องหมายที่หนึ่งที่ถูก ล้อม โดยสองลำดับที่โฮโมโลกัสกับบริเวณที่คัดเลือกไว้รอบลำดับ DNA เป้าหมายที่เปิดโอกาสให้ เกิดการรีคอมไบน์ของคาสเซตต์ และ -ยีนของตัวทำเครื่องหมายที่สอง -การเลือกสายพันธุ์ที่มีคาสเซตต์ดังกล่าว ที่มีการแสดงออกของยีนของตัวทำ เครื่องหมายที่หนึ่งรวมอยู่ในยีโนมของสายพันธุ์เหล่านั้น -การเลือกสายพันธุ์ที่ขจัดพาหะดังกล่าวออกแล้ว ที่ไม่มีการแสดงออกของยีน ของตัวทำเครื่องหมายที่สอง ซึ่งยีนของตัวทำเครื่องหมายที่สองคือ ตัวทำเครื่องหมายที่ทำให้เลือกได้แบบกลับดัน 2.กระบวนการตามที่กำหนดไว้ในข้อถือสิทธิที่ 1 ซึ่งตัวทำเครื่องหมายที่ทำให้ เลือกได้แบบกลับดัน คือยีนที่ทำให้การออกฤทธิ์ของยีนที่ไม่จำเป็นที่ไม่มีอยู่หรือถูกลบไปกลับคืนมา 3.กระบวนการตามที่กำหนดไว้ในข้อถือสิทธิที่ 2 ซึ่งตัวทำเครื่องหมายที่ทำให้ เลือกได้แบบกลับดันคือยีน upp 4.กระบวนการตามที่กำหนดไว้ในข้อถือสิทธิข้อหนึ่งข้อใดของข้อถือสิทธิที่ 1 ถึง 3 ซึ่งพาหะประกอบด้วย ตัวทำเครื่องหมายที่สามที่ทำให้สามารถทำการคัดเลือกเชิงลบของ สายพันธุ์ที่ขจัดพาหะดังกล่าวออกแล้ว 5.กระบวนการตามที่กำหนดไว้ในข้อถือสิทธิข้อหนึ่งข้อใดของข้อถือสิทธิที่ 1 ถึง 4 ซึ่งพาหะถูกขจัดออกโดยการย่อยด้วยเอนโดนิวคลีเอส 6.กระบวนการตามที่กำหนดไว้ในข้อถือสิทธิที่ 5 ซึ่งพาหะมีลำดับ DNA ที่เอนโด นิวคลีเอสที่ใช้ตัดรู้จัก และในขณะเดียวดันเป็นลำดับที่ไม่มีอยู่ในยีโนมของสายพันธุ์ Clostridium ที่ใช้ 7.กระบวนการตามที่กำหนดไว้ในข้อถือสิทธิที่ 5หรือ 6ซึ่งสายพันธุ Clostridium ที่ใช้มีเอนโดนิวคลีเอสอย่างน้อยที่สุดหนึ่งชนิดอยู่บนยีโนมของเชื้อนั้น หน้า 2 ของจำนวน 4 หน้า เอนโดนิวคลีเอสนั้นจำเพาะ สำหรับบริเวณตัดที่มีอยู่ในพาหะ โดยที่อาจเลือกให้ถูกทำให้แสดงออก ภายใต้การควบคุมของโปรโมเตอร์ที่เหนี่ยวนำได้ 8. กระบวนการตามที่กำหนดไว้ในข้อถือสิทธิข้อหนึ่งข้อใดของข้อถือสิทธิที่ 1 ถึง 7 ซึ่งยีนของตัวทำเครื่องหมายที่หนึ่งคือยีนของความต้านทานยาปฏิชีวนะ 9. กระบวนการตามที่กำหนดไว้ในข้อถือสิทธิข้อหนึ่งข้อใดของข้อถือสิทธิที่ 1 ถึง 8 ซึ่งยีนของตัวทำเครื่องหมายที่หนึ่งถูกล้อม โดยบริเวณเป้าหมายที่เป็นรีคอมบิเนสสองบริเวณ 1 0. กระบวนการตามที่กำหนดไว้ในข้อถือสิทธิที่ 9 ซึ่งยีนของตัวทำเครื่องหมาย ที่หนึ่งถูกขจัดออก โดยการออกฤทธิ์ของรีคอมบิเนสหลังจากเหตุการณ์ของการรีคอมไบน์แบบ โฮโมโลกัสเกิดขึ้นแล้ว 1 1. กระบวนการตามที่กำหนดไว้ในข้อถือสิทธิข้อหนึ่งข้อใดของข้อถือสิทธิ 9 หรือ 10 ซึ่งรีคอมบิเนสดังกล่าว ถูกทำให้แสดงออก โดยยีนที่นำมาโดยพาหะที่สองที่ถูกส่งเข้าไป ในสายพันธุ์นั้น 1 2.กระบวนการตามที่กำหนดไว้ในข้อถือสิทธิข้อหนึ่งข้อใดของข้อถือสิทธิที่ 9ถึง 11 ซึ่งบริเวณเป้าหมายของรีคอมบิเนสดังกล่าวคือลำดับ FRT และรีคอมบิเนสดังกล่าว คือ FLP รีคอมบิเนส 1 3.กระบวนการตามที่กำหนดไว้ในข้อถือสิทธิข้อหนึ่งข้อใดของข้อถือสิทธิที่ 1ถึง 12 ซึ่งลำดับดังกล่าวที่โฮโมโลกัสลับบริเวณรอบลำดับ DNA เป้าหมายประกอบด้วยการ กลายพันธุ์ไม่เกินกว่า 10% ของคู่เบสที่ใช้สำหรับเหตุการณ์ของการรีคอมไบน์ 1 4.กระบวนการตามที่กำหนดไว้ในข้อถือสิทธิข้อหนึ่งข้อใดของข้อถือสิทธิที่ 1 ถึง 13 ซึ่ง Clostridia ที่นำมาเปลี่ยนแปลงพันธุ์กรรมถูกลบยีนที่กำหนดรหัสเอนโดนิวคลีเอสที่ใช้ และ/หรือยีนที่กำหนดรหัส DNAse 1 5.กระบวนการตามที่กำหนดไว้ในข้อถือสิทธิข้อหนึ่งข้อใดของข้อถือสิทธิที่ 1 ถึง 14 ซึ่ง Clostridia ที่นำมาเปลี่ยนแปลงพันธุกรรมถูกลบยีน upp 1 6.กระบวนการตามที่กำหนดไว้ในข้อถือสิทธิข้อหนึ่งข้อใดของข้อถือสิทธิที่ 1 ถึง 15 ซึ่งสายพันธุ์ของ Clostridium เลือกได้จากบรรดาเชื้อต่อไปนี้คือ Clostridium acetobutylicum, Clostridium bejeirinckii, Clostridium saccharoperbutylacetomcum, Clostridium butylicum, Clostridium butyricum, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Clostridium sporogenes, Clostridium thermocellum, Clostridium saccharolyticum (ปัจจุบันนี้คือ Thermoanaerobacter saccharolytieum) Clostridium thermosufurogenes (ปัจจุบันนี้คือThermoanaerobacter thermosulfurogenes), Clostridium thermohydrosufuricum (ปัจจุบันนี้คือ Thermoanaerobacter ethanolicus) หน้า 3 ของจำนวน 4 หน้า 1 7.กระบวนการตามที่กำหนดไว้ในข้อถือสิทธิที่ 16 ซึ่งสายพันธุ์ของ Clostridium นั้นคือ Clostridium acetobutylicum และสายพันธุ์คือ (สูตร) cacl5 และ/หรือ (สูตร) upp 1 8.กระบวนการสำหรับการทดแทนยีนเป้าหมายสองยีนหรือมากกว่า โดยการ รีคอมไบน์แบบโฮโมโลกัสในสายพันธุ์ของ Clostriduim สายพันธุ์เดียวกัน ซึ่งกระบวนการตามที่ กำหนดไว้ในข้อถือสิทธิข้อหนึ่งข้อใดของข้อถือสิทธิที่ 1 ถึง 17 ได้รับการดำเนินการตามลำดับ สองครั้งหรือมากกว่า 1 9.พาหะเปลี่ยนแปลงพันธุกรรมสำหรับการทดแทนลำดับ DNA เป้าหมายโดยการ รีคอมไบน์แบบโฮโมโลกัสใน Clostridia ที่ประกอบรวมด้วย : -จุดเริ่มต้นของการลอกแบบที่สามารถทำให้เกิดการลอกแบบของพาหะ ใน Clostridia และ -คาสเซตต์ทดแทนที่ประกอบรวมด้วย ยีนของตัวทำเครื่องหมายที่หนึ่งที่ถูกล้อม โดยสองลำดับที่โฮโมโลกัสดับบริเวณที่คัดเลือกไว้รอบลำดับ DNA เป้าหมายที่เปิดโอกาสให้เกิดการ รีคอมไบน์ของคาสเซตต์ และ -ยีนของตัวทำเครื่องหมายที่สอง ซึ่งยีนของตัวทำเครื่องหมายที่สองคือ ตัวทำเครื่องหมายที่ทำให้เลือกได้แบบกลับกัน 2 0.พาหะตามข้อถือสิทธิที่ 19 ที่ซึ่งตัวทำเครื่องหมายที่ทำให้เลือกได้แบบกลับกัน คือยีนที่ทำให้การออกฤทธิ์ของยีนที่ไม่จำเป็นที่ไม่มีอยู่หรือถูกลบไปกลับคืนมา 2 1.พาหะตามข้อถือสิทธิที่ 20 ซึ่งตัวทำเครื่องหมายที่ทำให้เลือกได้แบบกลับกันคือ ยีน upp 2 2.พาหะตามข้อถือสิทธิข้อหนึ่งข้อใดของข้อถือสิทธิที่ 19ถึง21ซึ่งพาหะประกอบ รวมด้วย ตัวทำเครื่องหมายที่สามที่ทำให้สามารถทำการคัดเลือกเชิงลบของสายพันธุ์ที่ขจัดพาหะ ดังกล่าวออกแล้ว 2 3.พาหะตามข้อถือสิทธิข้อหนึ่งข้อใดของข้อถือสิทธิที่ 19 ถึง 22 ซึ่งพาหะมีลำดับ DNA ที่เอนโดนิวคลีเอสที่ใช้ตัดรู้จัก และในขณะเดียวกันเป็นลำดับที่ไม่มีอยู่ในยีโนมของสายพันธุ์ Clostridium ที่ใช้ 2 4.พาหะตามข้อถือสิทธิข้อหนึ่งข้อใดของข้อถือสิทธิที่ 19 ถึง 23 ซึ่งยีนของตัวทำ เครื่องหมายที่หนึ่งคือยีนของความต้านทานยาปฏิชีวนะ 2 5. พาหะตามข้อถือสิทธิข้อหนึ่งข้อใดของข้อถือสิทธิที่ 19ถึง24ซึ่งยีนของตัวทำ เครื่องหมายที่หนึ่งถูกล้อมโดยบริเวณเป้าหมายที่เป็นรีคอมบิเนสสองบริเวณ หน้า 4 ของจำนวน 4 หน้า 2 6. พาหะตามข้อถือสิทธิที่ 25 ซึ่งบริเวณเป้าหมายของรีคอมบิเนสดังกล่าวคือลำดับ FRT และรีคอมบิเนสดังกล่าวคือ FLPรีคอมบิเนส ------------ 1. กระบวนการสำหรับทดแทนลำดับ DNA เป้าหมายโดยการรีคอมไบน์แบบ โฮโมโลกัสใน Clostridia ที่ประกอบด้วย : - การเปลี่ยนแปลงพันธุกรรมของสายพันธุ์ดังกล่าวด้วยพาหะที่ประกอบด้วย : - จุดเริ่มต้นของการลอกแบบที่สามารถทำให้เกิดการลอกแบบของพาหะ ใน Clostridia และ - คาสเซตต์ทดแทนที่ประกอบด้วย ยีนของตัวทำเครื่องหมายที่หนึ่งที่ถูกล้อม โดยสองลำดับที่โฮโมโลกัสกับบริเวณที่คัดเลือกไว้รอบลำดับ DNA เป้าหมายที่เปิดโอกาสให้เกิดการ รีคอมไบน์ของคาสเซตต์ และ - ยีนของตัวทำเครื่องหมายที่สอง - การเลือกสายพันธุ์ที่มีคาสเซตต์ดังกล่าว ที่มีการแสดงออกของยีนของตัวทำ เครื่องหมายที่หนึ่งรวมอยู่ในยีโนมของสายพันธุ์เหล่านั้น - การเลือกสายพันธุ์ที่ขจัดพาหะดังกล่าวออกแล้ว ที่ไม่มีการแสดงออกของยีน ของตัวทำเครื่องหมายที่สอง 2. กระบวนการตามที่กำหนดไว้ในข้อถือสิทธิที่ 1 ซึ่งยีนของตัวทำเครื่องหมาย ที่สองคือ ยีนของความต้านทานยาปฏิชีวนะ 3. กระบวนการตามที่กำหนดไว้ในข้อถือสิทธิที่ 1 ซึ่งยีนของตัวทำเครื่องหมาย ที่สองคือ ตัวทำเครื่องหมายที่ทำให้เลือกได้แบบกลับกัน 4. กระบวนการตามที่กำหนดไว้ในข้อถือสิทธิที่ 3 ซึ่งตัวทำเครื่องหมายที่ทำให้ เลือกได้แบบกลับกัน คือยีนที่ทำให้การออกฤทธิ์ของยีนที่ไม่จำเป็นที่ไม่มีอยู่หรือถูกลบไปกลับคืนมา 5. กระบวนการตามที่กำหนดไว้ในข้อถือสิทธิที่ 4 ซึ่งตัวทำเครื่องหมายที่ทำให้แยก ได้แบบกลับกันคือยีน upp 6. กระบวนการตามที่กำหนดไว้ในข้อถือสิทธิข้อหนึ่งข้อใดของข้อถือสิทธิที่ 1 ถึง 5 ซึ่งพาหะประกอบด้วย ตัวทำเครื่องหมายที่สามที่ทำให้สามารถทำการคัดเลือกเชิงลบของ สายพันธุ์ที่ขจัดพาหะดังกล่าวออกแล้ว 7. กระบวนการตามที่กำหนดไว้ในข้อถือสิทธิข้อหนึ่งข้อใดของข้อถือสิทธิที่ 1 ถึง 6 ซึ่งพาหะถูกขจัดออกโดยการย่อยด้วยเอนโดนิวคลีเอส 8. กระบวนการตามที่กำหนดไว้ในข้อถือสิทธิที่ 7 ซึ่งพาหะมีลำดับ DNA ที่เอนโด นิวคลีเอสที่ใช้ตัดรู้จัก และในขณะเดียวกันเป็นลำดับที่ไม่มีอยู่ในยีโนมของสายพันธุ์ Clostridium ที่ใช้ 9. กระบวนการตามที่กำหนดไว้ในข้อถือสิทธิที่ 7 หรือ 8 ซึ่งสายพันธุ์ Clostridium ที่ใช้มีเอนโดนิวคลีเอสอย่างน้อยหนึ่งชนิดอยู่บนยีโนมของเชื้อนั้น เอนโดนิวคลีเอส นั้นจำเพาะ สำหรับบริเวณตัดที่มีอยู่ในพาหะ โดยที่อาจเลือกให้ถูกทำให้แสดงออกภายใต้การควบคุม ของโปรโมเตอร์ที่เหนี่ยวนำได้ 1 0. กระบวนการตามที่กำหนดไว้ในข้อถือสิทธิข้อหนึ่งข้อใดของข้อถือสิทธิที่ 1 ถึง 9 ซึ่งยีนของตัวทำเครื่องหมายที่หนึ่งคือยีนของความต้านทานยาปฏิชีวนะ 1 1. กระบวนการตามที่กำหนดไว้ในข้อถือสิทธิข้อหนึ่งข้อใดของข้อถือสิทธิที่ 1 ถึง 10 ซึ่งยีนของตัวทำเครื่องหมายที่หนึ่งถูกล้อม โดยบริเวณเป้าหมายที่เป็นรีคอมบิเนสสองบริเวณ 1 2. กระบวนการตามที่กำหนดไว้ในข้อถือสิทธิที่ 11 ซึ่งยีนของตัวทำเครื่องหมาย ที่หนึ่งถูกขจัดออก โดยการออกฤทธิ์ของรีคอมบิเนสหลังจากเหตุการณ์ของการรีคอมไบน์แบบ โฮโมโลกัสเกิดขึ้นแล้ว 1 3. กระบวนการตามที่กำหนดไว้ในข้อถือสิทธิข้อหนึ่งข้อใดของข้อถือสิทธิที่ 11 หรือ 12 ซึ่งรีคอมบิเนสดังกล่าว ถูกทำให้แสดงออก โดยยีนที่นำมาโดยพาหะที่สองที่ถูกส่งเข้าไป ในสายพันธุ์นั้น 1 4. กระบวนการตามที่กำหนดไว้ในข้อถือสิทธิข้อหนึ่งข้อใดของข้อถือสิทธิที่ 11 ถึง 13 ซึ่งบริเวณเป้าหมายของรีคอมบิเนสดังกล่าวคือลำดับ FRT และรีคอมบิเนสดังกล่าว คือ FLP รีคอมบิเนส 1 5. กระบวนการตามที่กำหนดไว้ในข้อถือสิทธิข้อหนึ่งข้อใดของข้อถือสิทธิที่ 1 ถึง 14 ซึ่งลำดับดังกล่าวที่โฮโมโลกัสกับบริเวณรอบลำดับ DNA เป้าหมายประกอบด้วยการ กลายพันธุ์ไม่เกินกว่า 10% ของคู่เบสที่ใช้สำหรับเหตุการณ์ของการรีคอมไบน์ 1 6. กระบวนการตามที่กำหนดไว้ในข้อถือสิทธิข้อหนึ่งข้อใดของข้อถือสิทธิที่ 1 ถึง 15 ซึ่ง Clostridia ที่นำมาเปลี่ยนแปลงพันธุกรรมถูกลบยีนที่กำหนดรหัสเอนโดนิวคลีเอสที่ใช้ตัด 1 7. กระบวนการตามที่กำหนดไว้ในข้อถือสิทธิข้อหนึ่งข้อใดของข้อถือสิทธิที่ 1 ถึง 16 ซึ่ง Clostridia ที่นำมาเปลี่ยนแปลงพันธุกรรมถูกลบยีนที่กำหนดรหัส DNAse 1 8. กระบวนการตามที่กำหนดไว้ในข้อถือสิทธิข้อหนึ่งข้อใดของข้อถือสิทธิที่ 1 ถึง 17 ซึ่ง Clostridia ที่นำมาเปลี่ยนแปลงพันธุกรรมถูกลบยีน upp 1 9. กระบวนการตามที่กำหนดไว้ในข้อถือสิทธิข้อหนึ่งข้อใดของข้อถือสิทธิที่ 1 ถึง 18 ซึ่งสายพันธุ์ของ Clostridium เลือกได้จากบรรดาเชื้อต่อไปนี้คือ Clostridium acetobutylicum, Clostridium bejeirinckii, Clostridium saccharoperbutyl acetomcum, Clostridium butylicum, Clostridium butylicum, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Clostridium sporogenes, Clostridium thermocellum, Clostridium saccharolyticum (ปัจจุบันนี้คือ Thermoanaerobacter saccharolytieum) Clostridium thermosufurogenes (ปัจจุบันนี้คือ Thermoanaerobacter thermosulfurogenes), Clostridium thermohydrosufuricum (ปัจจุบันนี้คือ Thermoanaerobacter ethanolicus) 2 0. กระบวนการตามที่กำหนดไว้ในข้อถือสิทธิที่ 19 ซึ่งสายพันธุ์ของ Clostridium นั้นคือ Clostridium acetobutylicum 2 1. กระบวนการตามที่กำหนดไว้ในข้อถือสิทธิที่ 20 ซึ่งสายพันธุ์ของ Clostridium acetobutylicum ที่นำมาเปลี่ยนแปลงพันธุกรรมคือ (สูตร) cac 15 2 2. กระบวนการตามที่กำหนดไว้ในข้อถือสิทธิที่ 20 ซึ่งสายพันธุ์ของ Clostridium acetobutylicum ที่นำมาเปลี่ยนแปลงพันธุกรรมคือ (สูตร) upp 2 3. กระบวนการตามที่กำหนดไว้ในข้อถือสิทธิที่ 20 ซึ่งสายพันธุ์ของ Clostridium acetobutylicum ที่นำมาเปลี่ยนแปลงพันธุกรรมคือ (สูตร) cac 15 (สูตร) upp 2 4. กระบวนการสำหรับการทดแทนยีนเป้าหมายสองยีนหรือมากกว่า โดยการ รีคอมไบน์แบโฮโมโลกัสในสายพันธุ์ของ Clostridium สายพันธุ์เดียวกัน ซึ่งกระบวนการตามที่ กำหนดไว้ในข้อถือสิทธิข้อหนึ่งข้อใดของข้อถือสิทธิที่ 1 ถึง 23 ได้รับการดำเนินการตามลำดับ สองครั้งหรือมากกว่า 2 5. พาหะที่มีการเปลี่ยนแปลงพันธุกรรมสำหรับการทดแทนลำดับ DNA เป้าหมาย โดยการรีคอมไบน์แบบโฮโมโลกัสใน Clostridia ซึ่งประกอบด้วย - จุดเริ่มต้นของการลอกรหัสที่ทำให้มีการลอกรหัสของมันใน Clostridia และ - คาสเซตทดแทนที่ประกอบด้วย ยีนของตัวทำเครื่องหมายที่หนึ่งที่ถูกล้อมด้วยสองลำดับ ที่โฮโมโลกัสกับบริเวณที่เลือกไว้ที่อยู่รอบลำดับ DNA เป้าหมาย ที่ทำให้สามารถเกิดการรีคอมไบน์ ของคาสเซตต์นั้น และ - ยีนของตัวทำเครื่องหมายที่สอง โดยที่ยีนของตัวทำเครื่องหมายที่สองเป็นตัวทำเครื่องหมายที่ทำให้เลือกได้ในแบบ กลับกัน 2 6. พาหะตามข้อถือสิทธิที่ 25 โดยที่ตัวทำเครื่องหมายที่ทำให้เลือกได้ในแบบ กลับกันเป็นยีนที่ทำให้การออกฤทธิ์ของยีนที่ไม่จำเป็นที่ไม่มีหรือถูกลบไปกลับคืนมาใหม่ 2 7. พาหะตามข้อถือสิทธิที่ 26 โดยที่ตัวทำเครื่องหมายที่ทำให้เลือกได้ในแบบ กลับกันคือยีน upp 2 8. พาหะตามข้อถือสิทธิที่ 25 หรือ 27 ข้อใดข้อหนึ่งโดยที่พาหะประกอบด้วยตัวทำ เครื่องหมายที่สามที่ทำให้สามารถทำการคัดเลือกในเชิงลบของสายพันธุ์ซึ่งได้ขจัดพาหะดังกล่าวออก 2 9. พาหะตามข้อถือสิทธิที่ 25 หรือ 28 ข้อใดข้อหนึ่งโดยที่มันเป็นที่อยู่ของลำดับ DNA ที่เอนโดนิวคลีเอสที่ใช้ตัดรู้จัก และที่ในขณะเดียวกันไม่มีอยู่ในยีโนมของสายพันธุ์ Clostridium ที่ใช้ 3 0. พาหะตามข้อถือสิทธิที่ 25 หรือ 29 ข้อใดข้อหนึ่งโดยที่ยีนของตัวทำเครื่องหมายที่ หนึ่งเป็นยีนของความต้านทานยาปฏิชีวนะ 3

1. พาหะตามข้อถือสิทธิที่ 25 หรือ 30 ข้อใดข้อหนึ่งโดยที่ยีนของตัวทำเครื่องหมายที่ หนึ่งถูกล้อมโดยเป้าหมายของรีคอมบิเนสสองบริเวณ 3

2. พาหะตามข้อถือสิทธิที่ 31 โดยที่บริเวณเป้าหมายของรีคอมบิเนสดังกล่าวเป็น ลำดับ FRT และรีคอมบิเนสดังกล่าวเป็น FLP รีคอมบิเนส